Məlumat

EtBr niyə əks istiqamətə miqrasiya edir?

EtBr niyə əks istiqamətə miqrasiya edir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

DNT-nin mənfi elektrikə malik olduğu üçün müsbət elektroda doğru qaçacağını bilirdik. onda niyə EtBr DNT-nin əks istiqamətinə miqrasiya edir? onlar müsbət elektrik var, çünki?


Etidium bromid özü neytral yükdədir, lakin sulu mühitdə müsbət iondur və DNT mənfi yüklü olduğundan və müsbət elektroda doğru hərəkət etdiyi üçün DNT-nin əksinə mənfi elektroda doğru hərəkət edir.

İş ondadır ki, bunun o qədər də əhəmiyyəti yoxdur. EtBr əlavə edilmiş gel hazırlasanız və ya elektroforez tamponuna EtBr əlavə etsəniz, nümunənizi daxil etdiyiniz və ya geli işə saldığınız an dərhal interkalasiya etməyə başlayacaq. Elektrik cərəyanı tətbiq edildiyi anda, EtBr həqiqətən mənfi elektroda doğru miqrasiya etməyə başlayacaq, lakin müəyyən bir miqdar artıq DNT-yə daxil olmuşdu və yalnız DNT-yə bağlandıqda UV altında görünəcək. Nəzərə alın ki, EtBr daha kiçik bir molekuldur və gelə asanlıqla nüfuz edir, lakin bəzilərini taparsa, DNT baza cütləri arasında sıxışaraq qalacaq.

Bununla belə, şərhçilərdən birinin qeyd etdiyi kimi, əgər nümunələriniz əks tərəfə keçibsə, yəqin ki, kabelləri dəyişmisiniz. Elektrodun yükü elektrik cərəyanı mənbəyinin tətbiq etdiyi yükdən asılıdır və kabelləri səhv etsəniz, nümunələri əks istiqamətə doğru hərəkət etdirəcəksiniz.


Elektroforez zamanı mənfi yüklü anionlar anod elektroduna doğru miqrasiya edir. Eynilə, müsbət yüklü kationlar elektroforezdə katod elektroduna doğru miqrasiya edirlər. Heç bir xalis yükü olmayan neytral molekullar yükləmə quyularında hərəkətsiz qalacaqlar. Sulu tamponda molekulun xalis yükü həm molekulyar quruluşdan, həm də tamponun pH-dan asılıdır. Əgər bütün bu faktlarla razısınızsa, deməli öz sualınıza cavab vermiş olursunuz.


DNT fraqmentlərinin ayrılması üçün agaroz gel elektroforezi

Agaroz gel elektroforezi 100 bp ilə 25 kb(1) arasında dəyişən ölçülərdə DNT fraqmentlərini ayırmağın ən effektiv üsuludur. Agaroza dəniz yosunu Gelidium və Gracilaria cinsindən təcrid olunub və təkrarlanan agarobioz (L- və D-qalaktoza) alt bölmələrindən ibarətdir(2). Jelləşmə zamanı agaroz polimerləri qeyri-kovalent şəkildə birləşir və məsamə ölçüləri gelin molekulyar süzmə xassələrini təyin edən bağlamalar şəbəkəsi yaradır. Agaroz gel elektroforezinin istifadəsi DNT-nin ayrılmasını inqilab etdi. Agaroz gellərinin qəbulundan əvvəl, DNT ilk növbədə saxaroza sıxlığının gradient sentrifuqasından istifadə edərək ayrılmışdır ki, bu da yalnız ölçüsün təqribini təmin etmişdir. Agaroz gel elektroforezindən istifadə edərək DNT-ni ayırmaq üçün DNT geldə əvvəlcədən tökmə quyularına yüklənir və cərəyan tətbiq olunur. DNT (və RNT) molekulunun fosfat onurğası mənfi yüklüdür, buna görə də elektrik sahəsinə yerləşdirildikdə DNT fraqmentləri müsbət yüklü anoda köçəcək. DNT vahid kütlə/yük nisbətinə malik olduğundan, DNT molekulları agaroza gel daxilində ölçülərinə görə elə bir nümunə ilə ayrılır ki, qət edilən məsafə onun molekulyar çəkisinin logu ilə tərs mütənasib olsun(3). Agaroz gel vasitəsilə DNT hərəkəti üçün aparıcı model "qərəzli reptasiya"dır ki, bununla da aparıcı kənar irəliləyir və molekulun qalan hissəsini dartıb aparır(4). DNT molekulunun gel vasitəsilə miqrasiya sürəti aşağıdakılarla müəyyən edilir: 1) DNT molekulunun ölçüsü 2) agaroza konsentrasiyası 3) DNT uyğunluğu(5) 4) tətbiq olunan gərginlik, 5) etidium bromidin olması, 6) növü agaroza və 7) elektroforez tamponu. Ayrıldıqdan sonra DNT molekulları müvafiq boya ilə boyandıqdan sonra UV işığı altında görüntülənə bilər. Bu protokola əməl etməklə tələbələr aşağıdakıları bacarmalıdırlar: DNT fraqmentlərinin gel matrisdə ayrılması mexanizmini başa düşmək DNT molekulunun konformasiyasının gel matrisi vasitəsilə onun hərəkətliliyini necə müəyyənləşdirəcəyini başa düşmək Ehtiyaclarına uyğun konsentrasiyalı agaroza məhlulunu müəyyən etmək Hazırlamaq DNT nümunələrinin elektroforezi üçün agaroz geli Gel elektroforez aparatını və enerji təchizatını qurun DNT fraqmentlərinin ayrılması üçün uyğun gərginliyi seçin Etidium bromidin DNT zolaqlarının vizuallaşdırılmasına imkan verən mexanizmi anlayın Ayrılmış DNT fraqmentlərinin ölçülərini müəyyənləşdirin.


1. Nuklein turşusu nümunələrinin ardıcıllığı və konformasiyası

Elektroforezin əsas prinsipləri nuklein turşusu nümunələrinin müxtəlif ölçülərdə olduqda fərqli hərəkət sürətinə malik olmasını nəzərdə tutur. Bununla belə, eyni sayda nukleotid, lakin müxtəlif ardıcıllıq tərkibi və konformasiyası olan nuklein turşuları elektroforez zamanı fərqli hərəkətliliyə malik ola bilər (Şəkil 1).

  • Ardıcıllıq: AT ilə zəngin DNT eyni ölçülü GC ilə zəngin DNT-dən daha yavaş miqrasiya edə bilər, xüsusən də yüksək ayırdetməli elektroforezdə. Eynilə, təxminən hər 10 bp-də 4-6 adenozin təkrarlanan DNT molekulları (əyri DNT adlanır) xüsusilə poliakrilamid gellərində qeyri-müntəzəm miqrasiya edəcəklər [1,2]. Onların anomal miqrasiyası, ehtimal ki, molekulyar konformasiyaya təsir edən ardıcıllıq tərkibi ilə bağlıdır.
  • Uyğunluq: Dairəvi və xəttiləşdirilmiş plazmidlər kimi eyni ardıcıllıqla, lakin müxtəlif konformasiyalı DNT molekullarının miqrasiyası gel məsamələrindən keçərkən hər bir konformasiyanın yığcamlığından təsirlənir. Çox yığcam superburulmuş molekullar ən sürətli miqrasiya edir, sonra çevik xətti və açıq dairəvi molekullar (Şəkil 1). Bu diferensial miqrasiya, təcrid olunduqdan sonra plazmid DNT-nin bütövlüyünü araşdırmaq üçün istifadə oluna bilər, çünki bütöv plazmid DNT-nin genin həddindən artıq ifadəsi üçün məməli hüceyrələrinin transfeksiyası kimi tətbiqlərdə arzuolunandır.

Şəkil 1. Müxtəlif konformasiyalarda eyni DNT-nin elektroforetik miqrasiyası. (A) Dairəvi, xətti və super qıvrılmış plazmid DNT-nin elektroforezi. (B) Rahat dairəvi, xətti və super qıvrılmış plazmid DNT-nin uyğunlaşması. Nicked plazmidlər rahat, açıq dairəvi konformasiyaya sahibdirlər və ən çox həcmi tuturlar, gel vasitəsilə ən yavaş miqrasiya edirlər. Xəttiləşdirilmiş plazmidlər geldən bir qədər yüksək sürətlə hərəkət edir, bütövlükdə, super qıvrılmış plazmidlər ən yığcamdır, ən sürətli miqrasiya edirlər.


Anafaza zamanı xromosomların hərəkəti (diaqramla)

Nüvə bölünməsi və ya mitoz zamanı xromosomların strukturunda və görünüşündə mütərəqqi dəyişiklik baş verir.

Mitoz davamlı proses olsa da (şək. 20-20 və 20-21), rahatlıq üçün adətən dörd əsas mərhələyə bölünür: profilaktika, metafaza, anafaza və telofaza.

Mitozun birinci mərhələsi olan profaza xromosomların kondensasiyası, nüvələrin və nüvə zərfinin yox olması və milin mikrotubullarının əmələ gəlməsi ilə xarakterizə olunur. Əgər profilaktikadan əvvəl hüceyrədə sentriol varsa, ikinci sentriol əmələ gəlir, mil əmələ gələn kimi iki sentriol bir-birindən ayrılır.

Xromosomlar mütərəqqi qısalma və qalınlaşma nəticəsində işıq mikroskopiyası ilə fərqlənir və nəticədə sentromerdə və ya kinetoxorda bir yerdə saxlanılan iki bacı xromatiddən ibarət qövs görünür. Qardaş xromatidlər hüceyrə dövrünün interfazası zamanı xromosom DNT-nin təkrarlanmasının məhsullarıdır.

Profazanın sonuna doğru (bəzən prometafaz da deyilir) mil hüceyrədə diametrik olaraq bir-birinə əks yerləşdirilmiş iki qütb arasında uzanır və xromosomlar milin mərkəzinə doğru miqrasiya edir. Metafazada hər bir xromosomun sentromerləri ekvator plitəsi adlanan müstəvidə milin ortasında düzləşir.

Bu zaman sentromerlər mil lifləri ilə əlaqələndirilir. Mil liflərinin bəziləri heç bir xromosomla assosiasiya yaratmır və birbaşa bir qütbdən digərinə uzanır. Sentromerlər dublikasiya olunur ki, hər bir xromatid müstəqil bir xromosoma çevrilir və iki qütbdən birinə bağlı bir mil lifinə bağlanır.

Anafazanın başlanğıcı xromosomların milin əks qütblərinə doğru hərəkəti ilə xarakterizə olunur. Anafaza zamanı sitokinez adlanan proses başlayır və hüceyrəni iki yarıya bölür və bununla da xromosomların iki tamamlayıcısını fiziki olaraq ayırır. Sitokinez mitozun sonrakı mərhələlərində baş verən nüvə bölünməsindən fərqlidir, lakin tez-tez sinxronlaşdırılır. Mitozun telofaza adlanan son mərhələsində xromosomlar milin qütblərinə çatır və dekondensasiyaya başlayır. Telofazada nüvəlilər xromosomları əhatə edən yeni nüvə zərfi kimi yenidən meydana çıxır.

Anafaza zamanı xromosomların hərəkəti:

Mitozun anafazasında hər bir xromosomun sentromeri xromosomların qolları geridə qalaraq milin iki qütbündən birinə doğru irəliləyir (şək. 20-21). Bu tənzimləmə xromosomların milin qütblərinə doğru çəkildiyini göstərir. Bir neçə ildir ki, bir çox müstəntiqlər bu hərəkətə cavabdeh olan mexanizmin xarakterini müəyyən etməyə çalışıblar.

Təklif olunan müxtəlif modellər arasında:

(2) Sürüşən sitoplazmatik filament modeli və

(3) Dinamik tarazlıq modeli.

Mikrotubul modeli ilk dəfə 1960-cı illərin sonunda J. R. Mcintosh tərəfindən təklif edilmişdir. Makintoshun fikrincə, mikrotubullar milin qütblərindən içəriyə doğru uzanır və hüceyrənin mərkəzində üst-üstə düşür. Anafaza zamanı mikrotubullar üst-üstə düşmə bölgəsində bir-birinin yanından sürüşərək hüceyrəni genişləndirir və qütbləri bir-birindən uzaqlaşdırır.

Mikroborucuqların üst-üstə düşən uclarının bir-birinin yanından sürüşməsi ilə eyni zamanda sentromerləri qütblərə birləşdirən digər mikroborucuqlar da qütblərdə sökülür. Nəticədə bu mikrotubulların ümumi uzunluğu azalır və xromosomlar qütblərə yaxınlaşır. Mikrotubulların sürüşməsinin hüceyrə hərəkətinin digər formalarında, məsələn, kirpiklərin və bayraqların döyülməsində iştirak etdiyi bilindiyi üçün bu model tamamilə inandırıcıdır. Ancaq görünür, bu, tam hekayə deyil.

1974-cü ildə A. Forer mildə aktin mikrofilamentlərinin olduğunu göstərdi və sonralar miozin filamentlərinin də mövcud olduğu göstərildi. Bu, xromosomların hərəkətinə səbəb olan aktin və miyozin filamentlərinin bir-birinin yanından sürüşməsi olduğu fikrini irəli sürdü.

Mikrotubulların rolu xromosomların quraşdırıldığı struktur çərçivə kimi xidmət etmək roluna endirilmişdir. Sitoplazmatik filamentlərin hərəkətləri anafaza başlayana və mili iki qütbdə mikrotubullar parçalanmağa başlayana qədər xromosomların müvafiq hərəkəti ilə əks olunmur. Əslində, mikrotubulların qütblərdə sökülməsi xromosomları aktin və miozinin sürüşməsinə cavab olaraq hərəkət etmək üçün azad edir.

1967-ci ildə S. Inoue tərəfindən təklif edilən dinamik tarazlıq modelinə əsasən, mil liflərini təşkil edən mikrotubullar mikrotubul alt bölmələri hovuzu ilə dinamik tarazlıqdadır. Milin bir qütbündən digərinə uzanan, lakin birləşdirilmiş xromosomları olmayan liflərə yeni alt bölmələrin əlavə edilməsi qütblərarası məsafənin artmasına xidmət edir, eyni zamanda alt bölmələrin ya qütb uclarından, ya da sentromeradan çıxarılması. digər mil liflərinin ucları onları qısaltmağa və xromosomları qütblərə yaxınlaşdırmağa xidmət edir.

Bu sonuncu anlayışı dəstəkləyən biokimyəvi dəlillərə əlavə olaraq, anafaza zamanı xromosomların milin qütblərinə doğru hərəkətinin kirpiklərin və flagellaların döyünmə hərəkətləri və əzələ hüceyrələrinin daralması ilə müqayisədə nisbi olaraq yavaş bir proses olduğunun qəbul edilməsidir. Həqiqətən də, anafaza hərəkəti filamentlərin axını və ya alt hissələrin itirilməsi ilə böyüdüyü və ya qısaldığı sürətə3 daha çox yaxın olan sürətlə baş verir.

Əvvəlki müzakirədən aydın olur ki, mitozun anafazası zamanı xromosomların hərəkətini izah etməyə çalışan bir neçə fərqli model müstəqil müşahidələrlə dəstəklənir. Bu o demək deyil ki, faktiki mexanizm bütün modellərin bəzi birləşmələrini əhatə edə bilməz.


Anafazada Xromosom Hərəkəti | Hüceyrə biologiyası

Xromosomlar həm mitoz, həm də meioz zamanı bir sıra yönəldilmiş hərəkətlərdə iştirak edirlər. Anafazada bacı xromatidlərin/homoloqların ayrılması ilə tarazlıq pozulur, xromosomlar təxminən 1 pm/dəq sürətlə qütblərə doğru hərəkət edir.

Hidrodinamik analizlə hesablanmışdır ki, təxminən 10-11 din qüvvəsi lazımdır və ekvatordan xromosomun qütbünə bütün yerdəyişmə təxminən 30 ATP molekulunun istifadəsini tələb edir.

Xromosomların hərəkəti hadisələri:

Xromosom hərəkətlərinin bir qədər təfərrüatlı şəkildə tədqiq edildiyi mitoz zamanı aşağıdakı hadisələr müşahidə edilmişdir. Prometafazada xro&şimatid cütü əvvəlcə mil qütbünə çəkilir, sonra milin mərkəzinə doğru miqrasiya edir.

Anafazanın başlanğıcında xromatidlər ayrılır və yavaş-yavaş mil qütblərinə doğru miqrasiya edirlər (şək. 5.18). Xromosomların anafaza hərəkəti iki fərqli prosesdən ibarətdir - Anafaza A və Anafaza B.

Anafaza A (erkən anafaza) kinetoxora (fasiləsiz mikrotubullar) ilə əlaqəli mikrotubulların qısaldılmasını əhatə edir.

Anafaza B (gec anafaza) qütblərə (davamlı mikrotubullar) çatmaq üçün bütün mil liflərinin təxminən ikiqat uzunluğa qədər uzanmasını və uzanmasını əhatə edir.

Kinetochore, xromosomun ilkin daralma yerində yerləşən trilaminar boşqab kimi bir quruluşdur. Xro&şimosomlar qütblərə doğru hərəkət etməzdən əvvəl kinetokor vasitəsilə mikrotubullarla birləşirlər. Mikrotubul və kinetoxor arasında əlaqə yanal olaraq baş verir və sonra qütb əlavəsinə çevrilir (Şəkil 5.19).

Kinetoxorun mikrotubulların uclarına bağlanmış passiv bir quruluş olduğu güman edilir, mikrotubullar isə anafazada xro-şimosomal hərəkət zamanı qısaldılır. Bu qısaltma və utancaqlıq sökülmə və ya polimerləşmə ilə bağlı ola bilər.

Kinetoxor-mil qütb cazibələri xromosomların hərəkəti ilə nəticələnir ki, iki xromatid ayrıldıqda de-polimerləşmə səbəbindən avtomatik və utancaq şəkildə qütblərə doğru hərəkət edirlər. Kinetokorları daşıyan kəsikli mil lifləri büzülür və xromosomları qütblərə doğru çəkir, davamlı liflər isə uzanır və qütbləri bir-birindən ayırır.

Milin qütb bölgəsinin çıxarılması xromosomların hərəkətinə təsir edir, mil liflərinin çıxarılması isə xromosomların qütbə doğru hərəkətinə təsir göstərmir. Bu tapıntılar onu göstərir ki, kinetoxor bölgəsi daha çox bunun üçün hərəkətverici qüvvəni təmin edən anafaziya hərəkətindən məsuldur.

Xromosomların hərəkət mexanizmi:

Xromosomun hərəkətinin molekulyar mexanizmini bir-biri ilə təfsir etməyə bir neçə fərziyyə cəhd edilmişdir (Şəkil 5.20).

Osterqrin (1949) dinamik tarazlıq fərziyyəsini irəli sürdü ki, burada xromosomların hərəkəti üçün mikro və şittubulların poli&şimerləşməsi və de-polimerləşməsi hadisələri birbaşa cavabdehdir. Bu fərziyyəyə görə (GTP hidrolizindən) ayrılan enerji anafaza zamanı xromosomların hərəkətini idarə etmək üçün kifayətdir.

Bu fərziyyə mikrotubulların kinetoxora möhkəm bağlandığını, qütb uclarının isə sökülmədən azad olduğunu irəli sürür. Bu ankraj-translokasiya sistemində hərəkətverici qüvvə mikrotubulların qütbləşmiş yığılması-sökülməsi ilə təmin ediləcəkdir.

Sürüşən fərziyyəyə görə, mil mikrotubulları yığılır və sökülür, lakin hərəkətverici qüvvə xromosomları hərəkət etdirmək üçün birbaşa yaradılmır. Bu fərziyyə, mikro və şitubulların yanal qarşılıqlı təsirinin flagelladakı dineinə bənzər bir rol oynaya biləcəyini irəli sürür.

Bir çox müşahidələr, aktin və miyozin kimi zülaldan istifadə etdikdən sonra, mili aktinin miyozin və ya dineinin mikrotubullarla qarşılıqlı təsirinin hərəkətverici qüvvəni təmin edə biləcəyini, istiqamət isə mikrotubullar tərəfindən təmin olunduğunu irəli sürdü.

Motor zülalının rolu:

Bu yaxınlarda iki pro&şitein, yəni kinetokor ilə assosiasiya olunan kinesin və sitoplazmik dineyinin (Şəkil 5.21) dinamik strukturlar olduğu göstərilmişdir. Bu zülalların yaratdığı qüvvələr əks istiqamətdədir - biri qütbə doğru, digəri isə ondan uzaqdır.

Sitoplazmik dinein qütb koğuş hərəkətlərində iştirak edə bilər, kinesin isə konqres zamanı mərkəzə doğru tərs hərəkətdə iştirak edə bilər. Bu zülalların hər ikisi daha böyük ailələrin üzvləridir və mikrotubula əsaslanan hərəkətlər müxtəlif motor zülallarını tələb edir, onların funksiyalarının başlaması üçün hədəf alınmalı və aktivləşdirilməlidir.

Kinesin ATPase fəaliyyətinə malik olan iki başlı motor sahəsinə malikdir və beləliklə, ATP-nin hidrolizi ilə hərəkəti kataliz edir. Dynein ağır zəncirlər və müxtəlif köməkçi alt bölmələr istehsal edən qüvvədən ibarətdir.

Fosforilasiya və defosforilasiyanın rolu:

Xromosomların hərəkəti üçün cəlb olunan qüvvələrə dair son araşdırmalar, təcrid olunmuş xromosomların və mikro və şitubulların birləşməsini əhatə edən in vitro üsullardan istifadə edərək tədqiq edilmişdir. Göstərilmişdir ki, mikrotubullar kinetoxorlarla əlaqələndirilir və ATP mövcud olduqda mənfi sonluğa (qütbün istiqaməti) doğru hərəkət edir.

Antikor (antiofosfat) texnikasından istifadə edərək, tiofosfat qrupu kinetoxorda yerləşə bilər ki, bu, kinetohorun zülal komponentinin fosforlaşmasının əslində xromosomların hərəkət və utancaqlıq istiqamətinin dəyişməsinə səbəb olduğunu göstərir.

Təklif olunur ki, həm kinaz, həm də fos&şifataza kinetoxora ilə əlaqəli ola bilər və iki motor zülalı (dinein və kinesin) əks&şisit istiqamətlərində qüvvələrin inkişafında iştirak edir (şək. 5.22).

Göstərilmişdir ki, iki ATPazın diferensial fosfo və şirilləşməsi və defosforilasiyası (kinazla asanlaşdırılan fosforlaşma və fosfataz tərəfindən asanlaşdırılan defosforilasiya) xromosomun hərəkətini və utanmasını dəstəkləmək üçün unikal tarazlıq yaradır. Mənfi son motor fəaliyyəti kine­tochore-də yerləşən dynein tərəfindən verilsə də, artı son motor fəaliyyəti kinesin kimi bəzi digər zülallara görə ola bilər.

Mikrotubulların de-polimerləşməsi və polimerləşməsinin rolu:

Fosforlaşma və de-fosforlaşma ilə yanaşı, kinetoxorda polimerləşmə və de-polimerləşmə nəticəsində mikrotubullar böyüyür və kiçilir. Bu fenomen hüceyrə bölünməsi zamanı motor fəaliyyətinin və mikroborucuqların dinamikasının və şpris qütbündən uzaqda və ona doğru koordinasiya olunduğunu göstərir.

Mikrotubulların de-polimerləşməsini və şizizasiyasını izah etmək üçün iki model təklif edilmişdir:

(i) Pac-man modeli (mikrotubullar kinetokor ucunda çeynənilir)

(ii) Qütb palatası axını modeli (mikrotubullar qütblərdə depolimerizasiya olunur) (Şəkil 5.23).


Hansı mənfi fototropizm nümunəsidir?

Fototropizm nümunələri Bitki kökləri də cazibə qüvvəsinə cavab olaraq böyümə olan qravitropizm nümayiş etdirir. Günəbaxanlar müsbət fototropizmin gözəl nümunəsidir, çünki onların gövdələri nəinki özlərinə doğru əyilir işıq lakin çiçəkləri də günəş işığına çevrilir.

İkincisi, müsbət fototropizm və mənfi fototropizm hər növdən bir misal vermək nə deməkdir? Hər növdən bir nümunə verin. Cavab: Müsbət fototropizm bir stimula (işığa) cavab olaraq bitki hissəsinin hərəkətidir. Bir bitkinin gövdəsi böyüyür və işığa doğru əyilir müsbət fototropizm kökün torpağın içərisində işıqdan uzaqlaşması isə bir misal of mənfi fototropizm.

Bunu nəzərə alaraq, mənfi Fototropizm bitkidə harada baş verir?

nəticələri indiki araşdırma bunu deməyə əsas verir mənfi fototropizm baş verə bilər auxin və ya auksin siqnalının səviyyəsi olduqda edir minimal səviyyəyə endirildi və bu mənfi fototropizmdir birtərəfli mavi işıq şüalanmasına bazal reaksiya bitki eksenel orqanlar.

Mənfi fototropik nədir?

Fototropizm işıq stimuluna cavab olaraq orqanizmin böyüməsidir. İşıq mənbəyinə doğru böyümə müsbət adlanır fototropizm, işıqdan uzaq böyümə isə adlanır mənfi fototropizm (skototropizm).


Bu liflər haradan gəldi?

Sitoskeletin ehtimal ki, mənşəyi bakterial və/və ya arxaeal mənşəlidir. Bakterial sistemlərdə həm aktinin, həm də tubulinin qədim qohumları var. Bakteriyalarda MreB zülalının və ParM zülalının Aktinin erkən əcdadları olduğuna inanılır. MreB, hüceyrə formasını qorumaqda və Plazmid (DNT) bölünməsində ParM funksiyalarını yerinə yetirir. Bakteriyalardakı FtsZ zülalı sitokinezdə fəaliyyət göstərir, o, GTPazdır, kortəbii olaraq filamentlər əmələ gətirir və tubulinin qədim forması olduğu ehtimal edilir. Bu tapıntılar, ökaryotik sitoskeletin bakteriya dünyasından qaynaqlandığı hipotezini dəstəkləyir.


Niyə mənim kiçik bandım çox zəifdir? Genomik PCR işləmir! - Sadəcə bəzi siçanları genotipləşdirməyə çalışırıq. (01/04/2006)

Ağlımın sonundayam və hər cür məsləhəti yüksək qiymətləndirirəm. Siçan genotipləmə PCR protokolunu işə salmağa çalışıram. Siçanlar və protokol çox hörmətli bir genetik laboratoriyasından gəlir - amma protokolu işə sala bilmirəm' Mən molekulyar bioloq deyiləm, amma bunu etmək üçün bacardığım qədər çox şey öyrənməyə çalışıram iş.

Etdiklərimin xülasəsi budur:
Qiagen dəstindən istifadə edərək DNT hasilatı - başqaları bu dəsti istifadə etmiş və sevirlər ki, siçanları inkişaf etdirən laboratoriya dəst olmadan K həzmlərini və fenol/xloroform ekstraksiyalarını qoruyur.
DNT, PCR, PCR primer alikotları üçün avtoklav boruları.
PCR aktivdir

300-900 ng siçan genomik DNT.
Protokolun işlənib hazırlandığı laboratoriyada təsvir olunduğu kimi eyni təchizatçıların eyni PCR reagentlərindən istifadə edin: Promega-dan adi Taq, Invitrogen Buffer E (xüsusi Mg2+ konsentrasiyası və pH-a malikdir ki, bu da onların da ən azı bir növ problemi olduğunu söyləyir& #33), DMSO, əlavə Mg2+ və s.
Ümumi rxn həcmi: 25 ul.
Buz üzərində rxns qurun, son anda Taq əlavə edin və PCR-ə başlayın.
Termosiklinq şərtləri: 1 dövr: 2 dəq @ 94C 35-38 dövr: 30 san @ 94C, 30 san @ 60C, 1 dəq @ 72C sonra 4C.
PCR məhsullarını 1,5% agaroza gel üzərində işlədin, hər dəfə təzə hazırlanmış LB Buferindən (Faster Better Media) istifadə edərək hazırlanmış və işə salın. Mən adətən gelə 25-50 ug EtBr əlavə edirəm.
(Və mən həmişə əlcək geyinirəm və mən diqqətli və təcrübəli pipetterəm.)

Mən 3 primerdən istifadə edirəm: 1 WT siçanları üçün, 1 KO siçanları üçün və 1 ümumi primer. Ümumi primer digər 2 primerdən (0,3 ul, 100 uM) iki dəfə konsentrasiyadadır.

Axtardığım şey: KO bandı: 600 bp. WT diapazonu: 400 bp. Mən nəsil olaraq hər bir genotipdə normal nisbətlərə malik olan heterozigot siçanları cütləşdirirəm. Beləliklə, mən bir KO qrupu görməliyəm

Əvəzində güclü və alovlu bir KO (yuxarı) qrupu görürəm

Siçanlarımın 75%-i və siçanlarımın ən çox 1/8-dən 1/4-ə qədər zəifləmiş WT (aşağı) zolağı. Mən daha yaxşı reaksiyalar aldım *bir dəfə* və bir neçə aydın hets və WT siçanı müəyyən etdim - baxmayaraq ki, WT bandı bəzi siçanlarda rahatlıq üçün hələ də bir qədər zəif idi. Ancaq eyni və yeni DNT-dən istifadə etdiyimdən bəri reaksiyalarımın bu qədər yaxşı getməsinə heç vaxt nail ola bilməmişəm.

Bu nöqtədə, bildiyim hər şeyi sınamışam. Mən yumşalma tempini 47-60C arasında dəyişməyə çalışdım - aşağı templərdə bəzi qeyri-spesifik zolaqlar əldə etdim, lakin təəccüblü odur ki, daha parlaq WT bandı deyil. Mən WT primer konsentrasiyasını 2x & amp 10x artırmağa çalışdım - bu, sadəcə olaraq KO bandımı zəiflətdi. Mən bir dəfədən çox hər şeyin yeni borularını sınamışam. Protokolu robot qolu olan Stratagene PCR maşınında və adi Perkin-Elmer maşınında sınamışam - fərq yoxdur. Mən daha çox DNT istifadə etməyə çalışdım - bu, lentlər yox olana və yaxma və bəlkə də meqa-kb bantla əvəzlənənə qədər kömək edir.

1,2 ug DNT və ya daha çox. 94C, 60C və 72C-də vaxtları 30 saniyə uzatmağa çalışdım - fərq yoxdur. Mən daha çox EtBr əlavə etməyə və daha uzun şəkillər çəkməyə çalışmışam - bu, məhdud dərəcədə kömək edir, amma həqiqətən qrup orada deyil, mən daha çox fon əldə edirəm.

Mən nəyi səhv edirəm? Bu işi görmək üçün nə edə bilərəm. İstənilən kömək yüksək qiymətləndiriləcək!

Bunlar sadəcə təxminlərdir, lakin yoxlamaq üçün bəzi şeylər:

* Primer və DNT üçün boruları avtoklavladığınızı deyəndə nə demək istədiyinizə əmin deyildim. Doldurmazdan əvvəl onları avtoklavladığınızı və ya primerlərinizi avtoklavladığınızı nəzərdə tutursunuz? Ümumiyyətlə, mən borularımla heç nə etmirəm -- onlar təmizdir və əgər sizə həqiqətən steril (nadir) ehtiyacınız varsa, onları steril ala bilərsiniz. Avtoklavlar çarpaz çirklənməyə səbəb olur.

* Qruplarınız EtBr-in gelinizdən miqrasiyası səbəbindən yox ola bilər. Bunu jelinizi bufer + EtBr-də boyayaraq və ya gel qutunuzdakı müsbət bufer quyusuna EtBr əlavə etməklə yoxlaya bilərsiniz. EtBr mənfi elektroda doğru miqrasiya edir (DNT-dən əks istiqamətdə) və qısa uzunluqlu zolaqları aradan qaldıra bilər.

* Hansı Qiagen dəstindən istifadə etdiyinizi demirsiniz. Güman edirəm ki, bu, plazmidləri deyil, genomik DNT hazırlamaq üçündür.
Mən özüm prot K və fenol/xloroformu qəbul edəcəyəm.

Cavabınız üçün çox sağ olun.

--------
* Primer və DNT üçün boruları avtoklavladığınızı deyəndə nə demək istədiyinizə əmin deyildim. Doldurmazdan əvvəl onları avtoklavladığınızı və ya primerlərinizi avtoklavladığınızı nəzərdə tutursunuz? Ümumiyyətlə, mən borularımla heç nə etmirəm -- onlar təmizdir və əgər sizə həqiqətən steril (nadir) ehtiyacınız varsa, onları steril ala bilərsiniz. Avtoklavlar çarpaz çirklənməyə səbəb olur.
--------

Mən borularımı doldurmazdan əvvəl avtoklavlamışam. Avtoklavlama boruları haqqında müxtəlif insanlarla apardığım müzakirələrdən fikirlər çox fərqli görünür. Potensial çarpaz çirklənmə məsələsini ilk qeyd edən sizsiniz. Digərləri boruları mütləq avtoklavla (potensial orqanizmləri aradan qaldırın), digərləri isə mütləq boruları avtoklavlamamağı (boruları bükə bilər) dedilər. Aydındır ki, etməmək o qədər də pis ola bilməz, çünki özünüz də daxil olmaqla, bir çox insan bunu etməməyə and içir!

---------
* Qruplarınız EtBr-in gelinizdən miqrasiyası səbəbindən yox ola bilər. Bunu jelinizi bufer + EtBr-də boyayaraq və ya gel qutunuzdakı müsbət bufer quyusuna EtBr əlavə etməklə yoxlaya bilərsiniz. EtBr mənfi elektroda doğru miqrasiya edir (DNT-dən əks istiqamətdə) və qısa uzunluqlu zolaqları aradan qaldıra bilər.
---------

Mən bunun çox aktual bir məqam ola biləcəyindən şübhələnirəm - təşəkkür edirəm!

--------
* Hansı Qiagen dəstindən istifadə etdiyinizi demirsiniz. Güman edirəm ki, bu, plazmidləri deyil, genomik DNT hazırlamaq üçündür.
--------

Bəli, o, heyvan toxumalarından genomik DNT hazırlamaq üçündür.

Dəstəyinizə və yazmağa vaxt ayırdığınıza görə bir daha çox sağ olun. Mən bunu həqiqətən yüksək qiymətləndirirəm.


Bakterial burulğanın yaranması izah edilir

Bir damla suda olan bakteriyalar kortəbii olaraq iki istiqamətli burulğan əmələ gətirir, damcı mərkəzinə yaxın olan bakteriyalar kənara yaxın yerdə üzən bakteriyaların əks istiqamətində üzür. Yeni bir təcrübə ilə təsdiqlənmiş yeni kompüter simulyasiyaları bu burulğanın necə meydana gəldiyini izah edir.

Bir dəstə zaman B. subtilis Bakteriyalar bir damla su içində qalsa, çox qəribə bir şey baş verir. Bütün bu fərdi üzgüçülərin xaotik hərəkəti kortəbii olaraq fırlanan burulğana çevrilir, damcıların xarici kənarındakı bakteriyalar bir istiqamətdə, içəridəkilər isə əks istiqamətdə hərəkət edir.

Braun Universiteti və Kembric Universitetinin tədqiqatçıları ilk dəfə olaraq ikili hərəkətli burulğanın necə əmələ gəldiyini izah ediblər. Tədqiqatçılar kompüter modelləşdirmə və ağıllı təcrübədən istifadə edərək, bütün bu kiçik üzgüçülərin yaratdığı maye axınının bu qəribə iki tərəfli hərəkəti izah etdiyini göstərir.

Araşdırma nəşr olunur Milli Elmlər Akademiyasının Materialları.

Kembricdəki Raymond Qoldşteynin laboratoriyasında Hugo Wioland və başqaları ilk dəfə 2013-cü ildə fenomeni eksperimental olaraq nümayiş etdirdilər. Lakin o zaman sistemin dinamikası - xüsusilə də iki istiqamətli hərəkət - tam başa düşülməmişdi. İndi Brown Mühəndislik Məktəbində postdoktorluq tədqiqatçısı və nəzəri modelləşdirmə üzrə mütəxəssis olan Enkeleida Luşi keçən il Kembricdə təqaüddə olarkən bu problem haqqında düşünməyə başladı.

"Bunlar çox sadə orqanizmlərdir" dedi Luşi. "Onlar şüurlu olaraq hara gedəcəklərinə və necə təşkil ediləcəyinə qərar vermirlər. Dinamikanın əksəriyyəti bir-biri ilə toqquşmalar və sərhədlər kimi fiziki mexanizmlər sayəsində baş verir. Ancaq ikili hərəkətlə nə baş verdiyini izah etmək üçün intuitiv bir yol yox idi. burulğan. Bu, çox müəmmalı idi."

Bu fenomeni təkrar etməyə çalışan ilkin model, ayrı-ayrı bakteriyalar arasındakı mexaniki qarşılıqlı təsirlərə diqqət yetirdi. Həmin simulyasiyalar göstərdi ki, təsadüfi trayektoriyalarda üzən fərdlər məhdud dairəvi məkanda bir-birinə çarpmağa başlayanda, dairəvi sərhədə nisbətən bir-birlərini eyni bucaqla istiqamətləndirməyə meyllidirlər. Bu, koordinasiyalı bir hərəkətin necə başladığını izah etməyə kömək edir, lakin dairənin xaricinə doğru olan şəxslərin niyə içəridəkilərdən əks istiqamətdə hərəkət etdiyini izah edə bilməz.

Görünür, fenomenin bu hissəsi maye axını məsələsidir.

"Bu bakteriyalar cəmi bir neçə mikrometr uzunluğundadır" dedi Luşi. "Bu miqyasda, onlara maye axını çox özlü hiss edir -- bizim havada və ya hətta suda gördüyümüzdən çox fərqlidir. Təsiri ondan ibarətdir ki, bakteriyaların etdiyi hər hansı hərəkət axının pozulmasına səbəb olur. qonşular."

Beləliklə, Lushi və onun həmkarları, bakteriyaların üzdüyü zaman yaranan maye axınlarını ehtiva edən kompüter simulyasiyasını inkişaf etdirdilər. B. subtilis flagella adlanan xırda tıxac kimi əlavələri çevirərək üzmək. Bayraqlı dəstə mayeyə qarşı itələyir, bu da bakteriyaları irəli aparır və mayeni əks istiqamətə itələyir.

Luşi həmin dinamikanı öz simulyasiyasına daxil edəndə ikitərəfli hərəkətin mənbəyi aydın oldu. Simulyasiya göstərdi ki, bakteriyaların hamısı eyni istiqamətə baxaraq düzülməyə meyllidirlər. Lakin dairənin kənarında üzən fərdlər mayedə üzdükləri istiqamətdən əks istiqamətdə bir axın yaratdılar. Dairənin içərisinə doğru olan bakteriyalar bu axına qarşı üzmək məcburiyyətində qalırlar, lakin tam ayaqlaşa bilmirlər. Onlar axınla eyni istiqamətdə -- çöldəki üzgüçülərin əks istiqamətində hərəkət edirlər.

Modeli təsdiqləmək üçün tədqiqatçılar bakteriyaların hansı istiqamətə yönəldiyini müəyyən etmək üçün bakteriya gövdəsi və flagella üzərində rəngli boyalardan istifadə edərək həqiqi bakteriyalarla təcrübə qurdular. Təcrübə göstərdi ki, bütün bakteriyalar həqiqətən də eyni istiqamətdə üzməyə çalışırlar. Ancaq ortada olanlar, görünür, kənarda yaranan maye axını ilə geri çəkildi. Modelin proqnozlaşdırdığı kimi oldu.

"Bu, çox sadə bir modeldir," Luşi dedi, "amma sonda bu fenomeni çox yaxşı əks etdirir. Bu, göstərdi ki, mayedə asılı vəziyyətdə olan mikrobların hər hansı bir tədqiqi həmin mayenin hərəkətinə məhəl qoymamalıdır -- bunun üzərində mühüm təsirlər ola bilər. mikroblar."

Bəs niyə su damcısındakı bakteriyaların qəribə hərəkətini öyrənmək lazımdır?

"Biz təbiəti anlamaq istəyirik ki, burada müstəqil ayrı-ayrı bölmələrin kollektiv şəkildə təşkil olunması ilə bağlı çoxsaylı insidentlər baş verir - bu bakterial burulğan yalnız bir nümunədir" dedi Luşi. "Ancaq həmçinin, nəticədə bakteriya koloniyalarına nəzarət etmək istəyə bilərik, məsələn, onların yayılmasını məhdudlaşdırmaq. Onların necə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu və kollektiv şəkildə necə hərəkət etdiyini nə qədər çox başa düşsək, onların hərəkətinə nəzarət etmək üçün bir o qədər yaxşı yollar hazırlaya bilərik."


Southern Blotting: Nəzəriyyə və Təcrübə

Gel əvvəlcədən müalicə

DNT-nin geldən membrana köçürülməsi

Ləkələmə və ya köçürmə proseduru ilk dəfə 1975-ci ildə təsvir olunduğundan və Şəkil 2-də göstərildiyindən mahiyyətcə dəyişməyib. Əsasən, gel transfer tamponu (yüksək duz məhlulu). Membran gelin üzərinə qoyulur, ardınca daha çox filtr kağızı, böyük bir yığın kağız dəsmal və nəhayət, dərslik kimi ağır bir obyekt qoyulur.

Cənub köçürmə aparatı. As the buffer travels up the filter paper wick through the layers of filter paper, gel, membrane and paper towels, the DNA is deposited from the gel to the membrane. The weight (say, a textbook) ensures that all of the layers remain in close contact during the transfer process.

There have been several modifications of the original blotting procedure described by Southern. These modified procedures attempt to decrease the transfer time and increase the efficiency of transfer. One procedure involves setting the transfer apparatus upside down so the gel is on the top. This downward capillary transfer aided by gravity, in addition to being faster than the conventional procedure, does not place excessive pressure on the gel, and thus there is no possibility of crushing it. Another modification, electroblotting, involves using an electrophoresis apparatus to mobilize the DNA from the gel on to the membrane. Vacuum blotting uses vacuum pressure to draw the transfer buffer through the gel.

DNA hybridization

Before hybridization is carried out, the membrane is treated with a blocking agent to prevent nonspecific association of probe with the membrane. A variety of polymeric inert agents, such as skim milk powder, Denhardt's reagent (a mixture of Ficoll, polyvinylpyrrolidone and bovine serum albumin), denatured fragmented salmon sperm DNA or heparin can be used to bind the unused DNA binding sites on the membrane. Skim milk powder and Denhardt's reagent are two most commonly used blocking agents. Skim milk powder is the cheapest and easiest to use, whereas Denhardt's reagent can more effectively block nylon membranes.

Aşkarlama


Videoya baxın: ETBR (Yanvar 2023).