Məlumat

ITRAQ/TMT texnologiyasının elektroforezdən üstün cəhətləri nələrdir?

ITRAQ/TMT texnologiyasının elektroforezdən üstün cəhətləri nələrdir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hazırda proteomika tədqiqatı ilə bağlı kağız üzərində işləyirəm. Birinci kurs tələbələrinin təhsil zamanı yarana biləcək bir çox suallarını sadaladım. Hər kəs (laboratoriyada təcrübəniz əsasında) iTRAQ/TMT texnologiyasının və elektroforezin üstünlüklərini və mənfi cəhətlərini izah edə bilərmi? Hansı texnika daha yaxşıdır?


İnanıram ki, bu məqalə sizin sualınıza cavab verə bilər: Proteomika haqqında sual və cavablar (Q1-Q5). Burada deyilir ki, 2-DGE MALDI-TOF texnologiyası ilə birlikdə hazırlanmış zülal ayırma texnologiyasıdır. Nəzəriyyə olaraq, ümumi zülal izoelektrik nöqtə (IEF) və molekulyar çəki (SDS-PAGE) fərqi ilə bir-bir ayrıla bilər. Faktiki vəziyyət o qədər də ideal deyil, çünki az miqdarda olan zülal müvəffəqiyyətlə boyanıb görünə bilmir və zülal translasiyadan sonrakı modifikasiyadan sonra nəzəri mövqedən kənara çıxır. 2-DGE cəmi 1000-2000 zülal müəyyən edə bilər. 2-DE və DIGE kimi elektroforez əsaslı üsullarla müqayisədə iTRAQ/TMT yüksək ayırdetmə qabiliyyətinə malikdir. MtoZ Biolabs emal etdiyi hüceyrə nümunələrində ən çoxu 6000 zülal tapıb ki, onların əksəriyyəti kəmiyyət və keyfiyyət məlumatlarına malikdir. Üstəlik, onun iTRAQ yüksək axınına malikdir və eyni anda 8 nümunəyə qədər tamamlaya bilər. TMT texnologiyasından istifadə edilərsə, o, eyni vaxtda 10-a qədər nümunəni tamamlaya bilər ki, bu da çoxlu nümunələr arasında eyni vaxtda müqayisə və bioloji proseslərin dinamik aşkarlanması üçün xüsusilə əlverişlidir.


LTQ Orbitrapında iTRAQ-dan istifadə edərək yüksək dəqiqlikli kəmiyyət proteomikası: Hamının faydalarını birləşdirən yeni Kütləvi Spektrometrik Metod

Məqalə Baxışları 2008-ci ilin Noyabr ayından (həm PDF, həm də HTML) bütün qurumlar və fərdlər üzrə tam mətnli məqalə yükləmələrinin ƏQSƏ uyğun olan cəmidir. Bu göstəricilər son bir neçə günə olan istifadəni əks etdirmək üçün müntəzəm olaraq yenilənir.

Sitatlar Crossref tərəfindən hesablanmış və gündəlik yenilənən bu məqaləyə istinad edilən digər məqalələrin sayıdır. Crossref sitat sayları haqqında daha çox məlumat əldə edin.

Altmetrik Diqqət Pulu tədqiqat məqaləsinin onlayn olaraq aldığı diqqətin kəmiyyət ölçüsüdür. Pişi işarəsinə klikləməklə, altmetric.com saytında verilən məqalə üçün xal və sosial media varlığı haqqında əlavə təfərrüatlar olan bir səhifə yüklənəcək. Altmetrik Diqqət Hesabı və balın necə hesablanması haqqında daha çox məlumat əldə edin.


Mücərrəd

Bu tədqiqat iTRAQ 4-plex, iTRAQ 8-plex və TMT 6-plex reagentlərindən istifadə edərək texniki dublikatlarda və üçlüklərdə ümumi proteomun və diferensial şəkildə ifadə edilmiş zülal əhatəsinin dərinliyini və təkrar istehsal qabiliyyətini müqayisə etmək məqsədi daşıyırdı. Təhlil ona görə aparılmışdır ki, izobarik kütlə etiketinin təkrar istehsalının hərtərəfli müqayisəsi ədəbiyyatda geniş şəkildə bildirilməmişdir. Zülalların ən çox sayı 4-plex, ardınca 8-plex və sonra 6-plex reagentləri ilə müəyyən edilmişdir. Kəmiyyət təhlilləri göstərdi ki, 8-plex reagentlər və 6-plex reagentləri ilə müqayisədə 4-pleks reagentləri ilə daha çox diferensial şəkildə ifadə olunan zülallar müəyyən edilib. Replikatın təkrar istehsalı texniki dublikatlar üçün ≥69% və texniki üçlüklər üçün ≥57% olduğu müəyyən edilmişdir. Nəticələr göstərir ki, 4-plex təcrübə əvəzinə 8-plex və ya 6-plex təcrübənin aparılması müvafiq olaraq 26 və ya 39% daha az protein identifikasiyası ilə nəticələndi. 4-pleks spektrləri üç proqram aləti - ProteinPilot, Mascot və Proteome Discoverer ilə axtarıldıqda ən çox protein identifikasiyası Mascot ilə əldə edildi. Mənfi nəzarətlərin təhlili eksperimentlərin təkrar kimi aparılmasının vacibliyini nümayiş etdirdi. Ümumilikdə, bu tədqiqat iTRAQ 4-plex reagentlərindən istifadənin iTRAQ 8-plex və TMT 6-plex reagentləri ilə müqayisədə üstünlüklərini nümayiş etdirir, texniki dublikat və üçqat təkrar istehsal qabiliyyətinin təxminlərini təqdim edir və təkrar nümunələrin işlədilməsinin dəyərini vurğulayır.


Proteomika: Texnikalar

Aşağı məhsuldarlıq üsulları:

1. Antikor əsaslı üsullar

ELISA (fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi) və western blotting kimi üsullar zülalları müəyyən etmək və onların ifadə səviyyələrini ölçmək üçün xüsusi zülallara və ya epitoplara yönəlmiş antikorların mövcudluğuna əsaslanır.

2. Gel əsaslı üsullar

İki ölçülü gel elektroforezi (2DE və ya 2D-PAGE), ilk proteomik texnika, bir geldəki zülalları onların yükü (1-ci ölçü) və kütləsi (2-ci ölçü) əsasında ayırmaq üçün elektrik cərəyanından istifadə edir. Diferensial gel elektroforezi (DIGE) eyni gel üzərində iki-üç protein nümunələrinin eyni vaxtda müqayisəsinə imkan vermək üçün müxtəlif flüoresan boyalardan istifadə edən 2DE-nin dəyişdirilmiş formasıdır. Bu gel əsaslı üsullar, məsələn, kütləvi spektrometriya (MS) ilə əlavə təhlildən əvvəl zülalları ayırmaq üçün, həmçinin nisbi ifadə profili üçün istifadə olunur.

3. Xromatoqrafiyaya əsaslanan üsullar

Xromatoqrafiyaya əsaslanan üsullar zülalları hüceyrə lizatları kimi mürəkkəb bioloji qarışıqlardan ayırmaq və təmizləmək üçün istifadə edilə bilər. Məsələn, ion mübadiləsi xromatoqrafiyası zülalları yükə görə ayırır, ölçü istisna xromatoqrafiyası zülalları molekulyar ölçüsünə görə ayırır və yaxınlıq xromatoqrafiyası xüsusi yaxınlıq liqandları və onların hədəf zülalları arasında geri çevrilən qarşılıqlı təsirlərdən istifadə edir (məsələn, IgM və IgA-nın təmizlənməsi üçün lektinlərin istifadəsi molekullar). Bu üsullar maraq doğuran zülalları təmizləmək və müəyyən etmək, həmçinin məsələn, aşağı axın MS tərəfindən sonrakı analiz üçün zülalları hazırlamaq üçün istifadə edilə bilər. 8

Yüksək məhsuldarlıq üsulları:

1. Analitik, funksional və əks fazalı mikroarraylar


Plazma proteomikası ilə biomarker kəşfinə yenidən baxılması

Qanın kliniki analizi tibbdə ən geniş yayılmış diaqnostik prosedurdur və qan biomarkerləri xəstələri kateqoriyalara ayırmaq və müalicə qərarlarını dəstəkləmək üçün istifadə olunur. Bununla belə, mövcud biomarkerlər hərtərəfli deyil və çox vaxt spesifiklik yoxdur və yeniləri çox yavaş sürətlə inkişaf etdirilir. Bu icmalda təsvir olunduğu kimi, kütləvi spektrometriyaya (MS) əsaslanan proteomika bioloji tədqiqatlarda güclü bir texnologiyaya çevrildi və indi o, plazma proteomunun böyük dərinlikdə xarakterizə edilməsinə imkan verməyə hazırdır. Əvvəlki “üçbucaqlı strategiyalar” kiçik kohortlarda vahid biomarker namizədlərini aşkarlamağa yönəlmişdi, ardınca daha böyük doğrulama qruplarında klassik immunoanalizlər. Biz böyük kohortların proteom nümunələrinin sağlamlıq və xəstəlikdəki fenotipləri ilə əlaqəli olduğu "düzbucaqlı" plazma proteom profilləşdirmə strategiyasını təklif edirik. Bu cür anlayışların klinik praktikaya çevrilməsi diaqnostik qərarların qəbul edilməsinin bir neçə aspektinin yenidən qurulmasını tələb edəcək və biz bu istiqamətdə bəzi ilk addımları müzakirə edirik.

Giriş

İnsan fiziologiyasında qanın mərkəzi və inteqrasiyaedici rolu o deməkdir ki, o, fərdin vəziyyətinin və ya fenotipinin universal əksi olmalıdır. Onun hüceyrə komponentləri eritrositlər, trombositlər və limfositlərdir. Bütün komponentlər saxlanıldıqda maye hissə plazma və laxtalanma şəlaləsi aktivləşdikdə (qanın laxtalanması) zərdab adlanır. Sadəlik üçün biz "serum" deyil, "plazma" terminindən istifadə edəcəyik, çünki əksər nəticələr hər ikisinə aiddir.

Müxtəlif plazma komponentlərinin konsentrasiyası klinik praktikada müntəzəm olaraq müəyyən edilir. Bunlara elektrolitlər, kiçik molekullar, dərmanlar və zülallar daxildir. Plazma proteomunu təşkil edən zülalları üç müxtəlif sinifə bölmək olar (Şəkil 1A və B). Birincisi qanda funksional rolu olan bol zülalları ehtiva edir. Bunlara insan serum albumini (HSA, ümumi zülal kütləsinin təxminən yarısı) apolipoproteinləri daxildir, bunlar lipidlərin daşınmasında və homeostazda mühüm rol oynayan fitri immun cavabın kəskin faza zülalları və laxtalanma kaskadının zülallarıdır. İkinci sinif dövriyyədə xüsusi funksiyası olmayan toxuma sızması zülallarıdır. Nümunə olaraq qaraciyər xəstəliklərinin diaqnostikası üçün istifadə olunan aspartat aminotransferaza (ASAT) və alanin aminotransferaza (ALAT) kimi fermentləri, həmçinin ürək troponinləri kimi zülalların aşağı səviyyəli, toxuma spesifik izoformlarını göstərmək olar. Üçüncü sinif kiçik zülal hormonları (məsələn, insulin) və sitokinlər kimi siqnal molekullarıdır ki, onlar adətən sabit vəziyyətdə çox aşağı bolluğa malikdirlər və lazım olduqda tənzimlənir. Sitokin interleykin-6-nın (IL-6) ilkin səviyyələri 5 pq/ml təşkil edir və plazma proteomunun minimum 10 10 qat dinamik diapazonunu təşkil edir, ən çox yayılmış protein HSA-nın təxminən 50 mq konsentrasiyası ilə müqayisədə. ml.

Şəkil 1. Klinik şəraitdə qan əsaslı laboratoriya testi

Qəbul edilmiş istifadədə "biomarker normal bioloji proseslərin, patogen proseslərin göstəricisi və ya məruz qalma və ya müdaxiləyə cavab olaraq ölçülən müəyyən edilmiş bir xüsusiyyətdir" (FDA-NIH: Biomarker-Working-Group, 2016). Bu araşdırmanın məqsədi üçün biz zülal və ya protein modifikasiyasına əsaslanan biomarkerlərə xüsusi diqqət yetiririk. Bu mənada, 100-dən çox FDA tərəfindən təsdiqlənmiş və ya FDA tərəfindən təsdiqlənmiş klinik plazma və ya serum testləri, əsasən bol, funksional sinifdə (50%), ardınca toxuma sızması markerləri (25%), qalanlarına isə reseptor liqandları daxildir. , immunoqlobulinlər və aberran sekresiyalar (Anderson, 2010). Bunların əksəriyyəti onilliklərdir və yeni markerlərin indiki tətbiqi nisbəti ildə ikidən azdır (Anderson və b, 2013). Tipik bir test, bir hədəfə qarşı fermentativ analiz və ya immunoassaydan ibarətdir. Klinisyenler öz ekspert biliklərinə əsaslanaraq nəticələri digər xəstə məlumatları ilə birlikdə şərh edirlər. Bolluq nisbətləri yalnız xüsusi hallarda istifadə olunur. Nümunələr qaraciyər xəstəliyinin səbəblərini (De-Ritis) fərqləndirmək üçün ASAT/ALAT-ın 60 yaşlı De Ritis nisbətidir. və b, 1957) və ya preeklampsi diaqnozu üçün daha yeni sFlt-1/PlGF nisbəti (Levine) və b, 2004 ).

Enzimatik və antikor əsaslı üsullardan fərqli olaraq, kütləvi spektrometriya (MS) əsaslı proteomika zülalların ardıcıllıqla xüsusi həzmindən əldə edilən peptidlərin yüksək dəqiqlikli kütlə və parçalanma spektrlərini ölçür. Bu peptidlərin kütlələri və ardıcıllığı unikal olduğundan, proteomika mahiyyət etibarilə spesifikdir, kolorimetrik ferment testləri və immunoassaylarla daimi problemdir (Wild, 2013). Prinsipcə, MS əsaslı proteomika sistemdəki bütün zülalları - onun proteomunu təhlil edə bilər və bu mənada qərəzsiz və hipotezsizdir (Aebersold & Mann, 2016). Bundan əlavə, MS metodları zülallarda post-translational modifikasiyaları (PTM) aşkar etmək və ölçmək üçün idealdır. Bu PTM-lər həmçinin diabet kontekstində uzunmüddətli qlükoza məruz qalmasının oxunuşu kimi xidmət edən HbA1c səviyyələri kimi diaqnostik testlərin əsası ola bilər. Buna baxmayaraq, plazmada müntəzəm olaraq həyata keçirilən laboratoriya testlərinin heç biri kütləvi spektrometrik yanaşmalarla müəyyən edilmiş zülallara əsaslanmır və gündəlik analizdə MS indiyə qədər yalnız dərmanlar və metabolitlər kimi kiçik molekulların ölçülməsi üçün istifadə olunur (Vogeser & Seger, 2016) ).

Keçən illər ərzində MS əsaslı proteomikanın texnologiyası kəskin şəkildə təkmilləşdi və bu, hazırda zülalları əhatə edən bütün bioloji tədqiqatların əsasını təşkil edir (Cox & Mann, 2011 Altelaar & Heck, 2012 Richards və b, 2015 Zhang və b, 2016). Xüsusilə, onun performansı, biomarker tədqiqatları üçün maraqlı edən həssaslıq və dinamik diapazona çevrilmişdir. Bu araşdırma qanda zülalların kütləvi spektrometriya ilə müəyyən edilməsi perspektivlərinə yönəldiləcəkdir. Biz bu gün klinik diaqnostikada zülalların rolunu empirik olaraq qiymətləndirməklə başlayırıq və MS əsaslı proteomika ilə plazmada biomarkerləri tapmaq üçün əvvəlki cəhdlərə dair ədəbiyyatı hərtərəfli nəzərdən keçiririk. İndiyə qədər proteomik strategiyalar daha böyük kohortlarda hədəflənmiş yanaşmalarla izləniləcək bir neçə nümunənin geniş araşdırmalarını əhatə etmişdir. Texnologiyadakı son irəliləyişlərin indi dərin proteomların bir çox vaxt nöqtələri və yeni biomarkerlər və biomarker panelləri tapmaq perspektivi ilə iştirakçılar üçün ölçüldüyü yeni strategiyaya necə imkan verdiyini müzakirə edirik. İnanırıq ki, proteomika yaxın onillikdə klinik laboratoriyada instrumental rutinin bir hissəsinə çevriləcək və hətta yaxın gələcəkdə mövcud texnologiyaları aradan qaldıra bilər.

Klinik zülal əsaslı diaqnostikanın cari miqyası

Qan və bədən mayelərinin laboratoriya testləri xəstəliyin diaqnozu və ya təsdiqlənməsi, riskin proqnozlaşdırılması, proqnozun monitorinqi və müalicənin effektivliyinin qiymətləndirilməsi məqsədi daşıyır. Adətən belə hesab edilir ki, diaqnozların 70%-i qan testi ilə məlumatlandırılır, baxmayaraq ki, bu rəqəm yaxşı əsaslandırılmayıb. Münhen Universitet Xəstəxanasının Laboratoriya Tibb İnstitutunda xəstəxanaya yerləşdirmə zamanı müəyyən bir nöqtədə stasionar xəstələrin böyük əksəriyyəti üçün laboratoriya testləri təyin olunur (77% Şəkil 1C). Xəstəxananın poliklinikalarından birində müşahidə edilən xəstələrdə bu fraksiya daha kiçikdir (31% Şəkil 1D). Bu rəqəmlər göstərir ki, xəstəxanaya yerləşdirilən və adətən daha çox xəstə olan xəstələr ambulator xəstələrə nisbətən daha çox laboratoriya müayinələri alırlar. Tələb olunan analizlərin sayına əsasən, klinik rejimdə zülallar (təhlillərin 42%-i), sonra kiçik molekullar (35%) və hüceyrələr (17%) üstünlük təşkil edir (Şəkil 1E). Beləliklə, bu gün zülallar klinik praktikada ən çox analiz edilən laboratoriya analitləri sinfidir. Onu da qeyd edək ki, plazma zülallarının təyini üçün uyğun üsullar dünyada ən böyük paya malikdir in vitro diaqnostika.

Plazma zülalları üçün laboratoriya analizləri ya müəyyən plazma zülallarının fermentativ fəaliyyətlərindən istifadə etməklə klassik klinik kimyaya və ya antikor əsaslı immunoanalizlərə əsaslanır. Enzimatik analizlərin xərcləri yalnız sent diapazonundadır və onlar saatda 10 000-ə qədər test nəticəsini çatdırmaqla yüksək məhsuldarlığa malik avtomatlaşdırılmış analizatorlarda işləyir. Bunun əksinə olaraq, immunoanalizlər daha bahalıdır (adətən hər nümunə üçün bir neçə avro/dollar) və müvafiq avtomatlaşdırılmış analizatorların ötürmə qabiliyyəti təxminən 1000 test/saat təşkil edir. Böyük klinik kimya, eləcə də immunoassay əsaslı analizatorlar 100-dən çox müxtəlif analitik parametrlər üçün reagentlər daşıya bilər. İmmunoassayların əsas üstünlükləri fermentativ aktivliyi olmayan plazma zülallarına əlçatanlıq və əhəmiyyətli dərəcədə yüksək həssaslıq sayəsində daha yüksək dərəcədə çeviklikdir. Digər, kliniki əhəmiyyət kəsb edən məsələ laboratoriya testi üçün tələb olunan vaxtdır. Dərhal qərar qəbul etmə zərurəti ilə əlaqədar olaraq, fermentativ analizlərin və bir neçə immunoanalizlərin əksəriyyəti 10 dəqiqədən çox olmayan analiz vaxtlarına qədər kiçildilməlidir. Ümumiyyətlə, immunoassaylar fermentativ analizlərə nisbətən daha uzun vaxt tələb edir, lakin indiki avtomatlaşdırılmış immunoanalizlərin böyük əksəriyyəti 30 dəqiqədən çox vaxt tələb etmir.

Biomarker tədqiqatında MS əsaslı plazma proteomikasının sistematik nəzərdən keçirilməsi

Plazma zülalları artıq 1990-cı illərdə iki ölçülü gel elektroforezi ilə tədqiq edilmiş, bəzən ekssizləşdirilmiş ləkələrin MS müəyyən edilməsi ilə birlikdə. Bununla belə, bunlar ümumiyyətlə yalnız bir neçə onlarla zülal müəyyən etdi və MS əsaslı proteomikadan əvvəl olduğu üçün bu araşdırmada müzakirə edilmir. Plazmanın çox aşağı rezolyusiyaya malik MALDI spektrlərinə əsaslanan, lakin protein identifikasiyası olmayan (Petricoin) erkən xərçəng aşkarlanması iddiaları və b, 2002) əsaslandırılmamışdır (Baggerly və b, 2004) və bu texnologiyalar bu gün böyük ölçüdə tərk edilmişdir.

Plazma biomarkerinin tədqiqi ilə məşğul olan və MS əsaslı proteomikadan istifadə edən hərtərəfli nəşrlər toplusunu əldə etmək üçün biz “biomarker”, “plazma və ya serum”, “proteom”, “proteomika”, və “kütləvi spektrometriya”. Bu, 103-ü rəy olan 947 nəşrin ilkin siyahısını verdi. Biz daha sonra insan subyektləri ilə məşğul olmayan və ya plazma və ya zərdab daxil olmayan tədqiqatları çıxararaq 381 orijinal nəşri (Dataset EV1) buraxdıq.

Nəşrlər 2002-ci ildə çıxmağa başladı və 2005-ci ildə İnsan Proteom Təşkilatı (HUPO) tərəfindən plazma proteomuna dair xüsusi buraxılış dərc edildikdən sonra ildə maksimum 33-ə çatdı (Omenn). və b, 2005). Daha iki maksimum 2011 və 2014-cü illərdə ildə 39 və 43 nəşrlə meydana çıxdı, ardınca 2013-cü ildə 24-ə, 2016-cı ildə isə ildə cəmi 20 nəşrə düşdü (Şəkil 2A). Müşahidə olunan dinamika, hər il minlərlə nəşrdə əks olunan proteomikadan istifadə edən tədqiqatçıların getdikcə genişlənən icması ilə ziddiyyət təşkil edir və aydın yüksəliş tendensiyası var. Plazma proteom nəşrlərinin ümumi proteom nəşrlərinə nisbəti indi < 1% təşkil edir və azalmağa davam edir. Plazma biomarkerlərinə açıq tibbi ehtiyacı və MS əsaslı proteomikanın digər sahələrdə uğurunu nəzərə alsaq, bu, plazma proteomikası sahəsini nəyin geridə qoyduğu sualını doğurur.

Şəkil 2. Hərtərəfli ədəbiyyat icmalı

381 əsas nəşrin təxminən yarısı plazma analizində istifadə olunan iş axınının analitik təsvirləri ilə məşğul olub, qalanları isə fizioloji və ya patofizyoloji sualı araşdırıb (Şəkil 2B). Sonuncuların təxminən üçdə biri xərçəngə, ardınca ürək-damar xəstəliklərinə (CVD), insan biologiyası, iltihab, diabet və yoluxucu xəstəliklərə aid mövzular (Şəkil 2B). Aydındır ki, bu sıralama mövcud texnologiya ilə müvafiq dəyişikliklərin tapılma ehtimalını deyil, xəstəliklərə olan marağı əks etdirir. Tədqiqatların yalnız 47% -ində ilkin tapıntıların hər hansı bir təsdiqi var (Şəkil 2C). Halların yarısında (24%) bunlar klinik tədqiqatlarda adi təcrübə kimi müstəqil kohortla deyil, eyni nümunələrlə yerinə yetirilən sadə Qərb ləkələri və ya namizəd zülalların ELISA-ları idi. Yalnız 36 məqalə müstəqil olaraq təklif edilən potensial biomarkerləri təsdiqləmək üçün MS əsaslı proteomikadan istifadə etdi (Dataset EV1).

Plazmanın son dərəcə yüksək dinamik diapazonu hələ də LC-MS/MS ilə bir neçə yüzdən çox ən zəngin zülalın müəyyən edilməsini çətinləşdirir. Bu çətinliyi qismən dəf etmək üçün yüksək miqdarda plazma zülalları, ümumiyyətlə, ilk 1-dən 20-yə qədər zülallara qarşı yönəldilmiş immobilizasiya edilmiş antikorları olan sütunlar vasitəsilə tez-tez tükənir (Şəkil 2D). Bununla belə, bu antikorlar heç vaxt tam spesifik və bağlı zülallar deyil, məsələn, HSA kimi – özləri də bir neçə digər zülallara (Tu) yaxınlıq göstərirlər. və b, 2010 Bellei və b, 2011). Beləliklə, tükənmiş plazma nümunəsi orijinal proteomun kəmiyyət təmsilçisi deyil. Bu, xüsusilə "super tükənmə" (Qian və b, 2008) - bütün plazmaya qarşı qaldırılmış poliklonal antikorların geniş qarışığı - və ya plazma proteomunu qeyri-spesifik "normallaşdıran" heksamerik peptid qarışıqları olan muncuqlar (Thulasiraman) və b, 2005).Bundan əlavə, bu prosedurlar iş prosesinə dəyişkənlik və əlavə xərclər gətirir, ümumiyyətlə plazma zülallarının dəqiq miqdarının müəyyən edilməsinə mane olur. Buna görə də, onların istifadəsi hazırda kiçik kəşf layihələri ilə məhdudlaşır.

Dinamik diapazon və həssaslıq problemi ilə məşğul olmaq üçün ikinci strategiya zülal və ya peptid səviyyəsində müxtəlif yollarla həyata keçirilə bilən geniş plazma fraksiyasıdır. Bir neçə yüzdən bir neçə minə qədər zülal (Liu) müəyyən edilmiş birləşmiş tükənmə və geniş ayırma (yüzlərlə fraksiya) ilə plazma proteomunun dərindən əhatə olunmasına yönəlmiş bir sıra tədqiqatlar və b, 2006 Pan və b, 2011 Cao və b, 2012 Cole və b, 2013 Keşişyan və b, 2015 Lee və b, 2015). Qeyd edək ki, bir çox plazma proteom tədqiqatları MS əsaslı proteomikada standart halına gələn 1% peptid və zülal yalançı kəşf dərəcələrindən (FDR) daha az sərt statistik identifikasiya meyarlarından istifadə etməyə davam edir.

Fraksiyada gizli ötürmə qabiliyyətinin azalması multipleksləşdirmə ilə qismən bərpa edilə bilər. Məsələn, dörd ilə on arasında nümunə iTRAQ və ya TMT strategiyalarından istifadə etməklə birlikdə təhlil edilmişdir, burada nümunələr müxtəlif aşağı kütləli reportyor ionlarına səbəb olan kütləvi neytral etiketlərlə etiketlənir (Kolla və b, 2010 Çjou və b, 2012 Cominetti və b, 2016). Kəmiyyət təyini peptidlərin parçalanması və məruzəçi ionların nisbi nisbətlərinin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi ilə əldə edilir (Bantscheff və b, 2008). Prinsipcə cəlbedici olsa da, bu üsullar ümumiyyətlə eyni reportyor ion modelinə töhfə verən birgə təcrid olunmuş peptid növlərinin yaratdığı nisbət pozğunluğundan əziyyət çəkir (“nisbət sıxılma”). Çox aşağı səviyyəli zülalların və ya kiçik, lakin xəstəliyə uyğun dəyişiklikləri olanların tənzimlənməsi tamamilə gizlənə bilər. Ov tüfəngi proteomikasında süzülən peptidlər intensivliyə görə parçalanır (məlumatdan asılı əldə etmə), LC-MS/MS qaçışlarında itkin dəyərlərə səbəb ola bilən yarı stokastik proses. Bu yaxınlarda təqdim edilmiş məlumatdan asılı olmayan əldəetmə strategiyaları peptidləri daha ardıcıl şəkildə müəyyən edir (Picotti & Aebersold, 2012 Sajic və b, 2015). Bununla belə, onlar reportyor-ion əsaslı multipleksləşdirmə ilə uyğun gəlmir, çünki bir peptid qruplarının orta kəmiyyətini müəyyən etmək olardı.

Tədqiqatların təxminən 30%-də plazma nümunələri mövcud ölçmə vaxtı ərzində istənilən plazma proteom örtüyünə çatmaq üçün birləşdi. Bu yanaşma qrupdaxili fərqləri qurban verir və ayrı-ayrı nümunələrdə kənar və ya çirkləndirici zülallar bütün qrupu əyərək, qruplar arasında fərqli olan zülalların fərdi olaraq həqiqətən əhəmiyyətli olub olmadığını qiymətləndirməyi mümkünsüz edir.

Qismən alət vaxtına olan tələblərin nəticəsi olaraq, ümumiyyətlə, 20-30-dan çox nümunə təhlil edilmədi və yalnız bir neçəsi 500-ü keçdi (Garcia-Bailo). və b, 2012 Cominetti və b, 2016 Lee və b, 2017). Nümunələr daxilində ölçmə nöqtələrinin çoxluğunu nəzərə alsaq, bunlar kiçik nümunə nömrələridir. Müvafiq olaraq, əksər tədqiqatlar hallar və nəzarətlər arasında fərqlənən zülallar kimi müəyyən edilən bir neçə “potensial biomarker” təklif etmişdir. Bundan əlavə, bu namizədlərin çoxunun sözügedən xəstəliyin spesifik göstəriciləri olma ehtimalı azdır, çünki onlar ən yaxşı halda xəstəliyə dolayısı ilə əlaqəli olan bioloji kateqoriyalara aiddir və ya nümunənin hazırlanmasının ehtimal olunan artefaktlarıdır (məsələn, keratinlər və qırmızı qan hüceyrəsi zülalları) . Xülasə, proteomika texnologiyasında və eksperimental dizaynda məhdudiyyətlər bu günə qədər nəşr olunmuş ədəbiyyatda əsl biomarkerlərin müəyyən edilməsinə mane olmuşdur. Bildiyimizə görə, yeganə mümkün istisna OVA1 testidir ki, burada yüksək miqdarda plazma zülalları beta-2 makroqlobulin, apolipoprotein 1, serum transferrin və pre-albumin səviyyələri əvvəllər müəyyən edilmiş yumurtalıq xərçəngi markeri CA125 ilə birləşdirilir. dar, FDA tərəfindən təsdiqlənmiş göstərici (Rai və b, 2002 Zhang və b, 2004 ).

Üçbucaqlı MS əsaslı biomarker kəşfi və doğrulama strategiyası

Hipotezsiz MS əsaslı proteomikanın əsas üstünlüyü ondan ibarətdir ki, klassik biomarker tədqiqatında tək zülal ölçmələrindən tamamilə fərqli olaraq, potensial biomarkerlərin mümkün təbiəti və sayı ilə bağlı heç bir fərziyyəyə ehtiyac yoxdur. Konseptual olaraq, MS əsaslı proteomika hər bir xəstəlik üçün bütün mümkün fərziyyəyə əsaslanan biomarker tədqiqatlarını birləşdirir və bundan əlavə, potensial biomarkerlərin bir-biri ilə əlaqəsini müəyyənləşdirir. Təcrübədə, plazma proteomikasının çətinlikləri indiyə qədər böyük kohortlar üzərində dərin və kəmiyyət tədqiqatlarının qarşısını aldı. Bunun əvəzinə, fərdlərin sayının bir neçədən çoxa qədər artdığı, zülalların sayının yüzlərlə və ya minlərlədən bir neçəyə qədər azaldığı bir neçə mərhələdən ibarət biomarker kəşfi üçün mərhələli və ya “üçbucaqlı” strategiya müdafiə edilmişdir (Rifai və b, 2006 Şəkil 3A).

Şəkil 3. Plazma biomarker tədqiqatında mövcud paradiqmalar (“üçbucaqlı yanaşma”)

Plazmada hipotezsiz kəşf proteomikası üçün tipik iş axını aşağıdan yuxarı proteomikanın digər sahələrində istifadə olunana bənzəyir (Aebersold & Mann, 2016 Altelaar & Heck, 2012 Şəkil 3B). Qısaca desək, zülallar enzimatik olaraq peptidlərə həzm olunur və onlar elektrosprey ionlaşması ilə birləşdirilmiş yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyası (HPLC) ilə ayrılır. Peptid kütlələri və bolluqları tam MS taramalarında kütlə spektrometrində ölçülür, peptid parçalanmasının növbəti addımı isə peptidin identifikasiyası üçün MS/MS spektrlərini yaradır. Yaxşı qurulmuş proteomik proqram platformaları verilənlər bazası axtarışlarında peptidləri avtomatik və statistik şəkildə dəqiq müəyyənləşdirir və onların kəmiyyətini müəyyən edir (Cox & Mann, 2008 MacLean və b, 2010 Rost və b, 2014). Bundan əlavə, plazma HPLC sütunlarını asanlıqla bağlaya bilən lipidlər kimi qan komponentlərini ehtiva edir ki, bu da xüsusi peptid təmizləmə prosedurlarını tələb edir (Geyer) və b, 2016a).

Namizədin yoxlanılması üçün hədəflənmiş proteomika üçbucaqlı strategiyanın ikinci mərhələsidir (Şəkil 3C). Kəşf mərhələsində diferensial ifadəsi olan nisbətən az sayda zülal (adətən < 10) daha böyük və ideal müstəqil kohortda sınaqdan keçirilir. İmmunoanalizlər çox vaxt mövcud olmadığından, hədəflənmiş MS üsullarından istifadə edilə bilər. Bunlardan ən geniş yayılmışı “çox reaksiya monitorinqi”dir (MRM – bəzən tək və ya seçilmiş reaksiya monitorinqi də deyilir – SRM) (Picotti & Aebersold, 2012 Carr və b, 2014 Ebhardt və b, 2015). Hər bir zülal üçün uyğun peptidlər dəsti seçilir və MRM analizini təyin etmək üçün onların elüsyonu və parçalanma davranışı qiymətləndirilir. Təhlil zamanı kütlə spektrometri yalnız bu peptidlərin ayrılması zamanı davamlı olaraq fraqmentasiya etmək üçün proqramlaşdırılmışdır. Bir peptid üçün bir neçə fraqmentin monitorinqi ilə həssas və spesifik kəmiyyət təyini hətta aşağı ayırdetmə kütləsi spektrometrləri ilə də əldə edilə bilər. Doğrulama üçün MRM-nin ov tüfəngi proteomikası ilə müqayisədə üstünlüyü onun daha yüksək həssaslığı və ötürmə qabiliyyətidir. Laboratoriyalararası tədqiqatlar yaxşı reproduktivliyə nail olmuşdur (Addona və b, 2009 Abbatiello və b, 2015), lakin bildirilən həssaslıqlar adətən aşağı ng/ml konsentrasiya diapazonuna çatmır və praktiki olaraq əldə edilən multipleksləşdirmə imkanları onlarla peptidlə məhdudlaşır (Percy). və b, 2013 Şi və b, 2013 Oberbach və b, 2014 Wu və b, 2015). Buna baxmayaraq, iki son tədqiqat müvafiq olaraq 82 və 192 zülalın hədəfləndiyini bildirmişdir (Özcan və b, 2017 Percy və b, 2017). MRM-nin həssaslığı tükənmə və ya fraksiyalaşdırma ilə nümunənin daha geniş işlənməsi ilə aşağı ng/ml və ya hətta yüksək pg/ml diapazonlarına qədər yaxşılaşdırıla bilər (Burgess və b, 2014 Kim və b, 2015 Nie və b, 2017 ).

Mütləq və dəqiq kəmiyyət müəyyən etmək üçün daxili standartlar tələb olunur - ümumiyyətlə monitorinq edilən peptidlərin ağır izotop versiyaları. Sintezləşdirilmiş ağır peptidlər həzm edildikdən sonra əlavə edilir, protein həzminin dəyişkənliyi nəzərə alınmadığı üçün kəmiyyət qeyri-dəqiqlik mənbəyi yaradır. Bu, peptidin orijinal ardıcıllıq kontekstinə daxil edilməsi ilə həll edilə bilər, məsələn, SILAC-PrEST strategiyasında, burada hər bir maraq doğuran zülalın 150-dən 250-yə qədər amin turşusu uzanması, kəmiyyət göstəricisi ilə birləşdirilir, rekombinant ifadə edilir. ağır formada (Zeiler və b, 2012 Edfors və b, 2014 Geyer və b, 2016a).

Məqsədli üsullar zülalların və ya peptidlərin immuno-zənginləşdirilməsi ilə də birləşdirilə bilər. Məsələn, "sabit izotop standartları və anti-peptid antikorları tərəfindən tutulma" (SISCAPA) ilə spesifik peptidlər ağır etiketli həmkarları ilə birlikdə immuno-çökdürülür, ardınca sürətli MS əsaslı oxunur (Anderson və b, 2004 Rəzəvi və b, 2016). Bu, antikorların zənginləşdirmə imkanlarını MS-nin aşkarlanmasının spesifikliyi ilə birləşdirir, lakin analizlərin hazırlanması çətin və vaxt aparan ola bilər - sırf antikor əsaslı üsullarla müqayisədə üstünlüyü daraldır.

Üçbucaqlı strategiyanın son mərhələsi, onilliklər ərzində yetişmiş bir sahə olan immunoassaylarla yoxlamadır. Maksimum spesifiklik üçün adətən sendviç analizlərinə üstünlük verilir (Şəkil 3D). Onların hazırlanması bahalı və zəhmətli olsa da, yüksək həssaslıq və yüksək ötürmə qabiliyyətinə nail ola bilərlər. Hətta minlərlə iştirakçısı olan kohortlar bu texnologiya ilə sınaqdan keçirilə bilər, ancaq bir və ya bir neçə namizəd biomarker üçün. Bu cür böyük rəqəmlər təkcə nəzarət vasitələrinə qarşı deyil, həm də digər xəstəliklərə münasibətdə spesifikliyi müəyyən etmək üçün lazım ola bilər. Standart tələblərə adekvat statistik gücün və müstəqil populyasiyada təkrarlanmanın sığortalanması daxildir. Bu gün bu cür klinik tədqiqatlar yeni biomarkerlərin azlığını qismən izah edən bahalı çoxillik səylər ola bilər.

İmmunoanalizlər əsasən antigen-antikor tanınması ilə əlaqəli bəzi xas məhdudiyyətlərə malikdir. Bunlara çarpaz reaktivlik, trigliseridlər kimi fon molekulları tərəfindən müdaxilə və qeyri-xətti reaksiya (“çəngəl effekti”) daxildir (Hoofnagle & Wener, 2009 Wild, 2013). Bundan əlavə, bütün klinik əhəmiyyətli protein variantları antikor əsaslı analizlərlə asanlıqla tanınmır. Bu məhdudiyyətləri nəzərə alaraq, MS əsaslı metodlar ən azı bəzi genişmiqyaslı klinik sınaqlarda cəlbedici alternativlər ola bilər, lakin bu, bu gün mövcud olanlardan daha möhkəm, həssas və yüksək ötürmə qabiliyyəti texnologiyaları tələb edir.

Son on ildə proteomika icması keyfiyyət standartlarını müzakirə edən və tapıntıların statistik əhəmiyyətini, həmçinin potensial biomarkerlərin spesifikliyini və onların potensial klinik tətbiqini təmin edən adekvat kohortların seçilməsinin vacibliyini vurğulayan biomarkerlərin düzgün inkişafı üçün təlimatlar hazırlamışdır (Luque- Garcia & Neubert, 2007 Pauloviç və b, 2008 Mischak və b, 2010 Surinova və b, 2011 Konki və b, 2013 Parker & Borchers, 2014 Hoofnagle və b, 2016 ).

Təəccüblü deyil ki, üçbucaqlı strategiyanın ciddi tələbləri nəzərə alınmaqla, onun tam və uğurla tətbiq olunduğu az sayda hesabat var. Bu, həm də qismən üç fərqli texnologiyanın - ov tüfənginin proteomikası, hədəf proteomikası və immunoassay inkişafının iştirak etməsi ilə bağlı ola bilər. Bir çox nəşrlər sadəcə birinci mərhələni təsvir edir və ya onu yalnız eyni kohortda immunoassay yoxlanışı ilə birləşdirir (Dataset EV1).

Bir neçə nəfərdən çox iştirakçının iştirak etdiyi və müəyyən yoxlama ilə aparılan tədqiqatlar arasında maraq doğuran namizədlərin əksəriyyəti seçilmiş və Western blotting, ELISA və ya MRM analizləri həyata keçirmişdir. Nümunəvi nümunə Zhang tərəfindən aparılan araşdırmadır və b (2012) 10 kolorektal xərçəng xəstəsinin nəzarətə qarşı tükənmiş plazması iTRAQ ilə etiketləndi və fraksiyalaşdırıldı, bu da 72 zülalın müəyyən edilməsinə səbəb oldu. Bir neçə yuxarı və ya aşağı tənzimlənmiş zülallar arasında ORM2 419 fərddə ELISA tərəfindən təqib edildi. Bu zülal anadangəlmə immun sisteminin bir hissəsi olduğundan (digər iki yuxarı tənzimlənən namizəd kimi), onun xüsusi xərçəng markeri olması ehtimalı azdır. Başqa bir araşdırmada, super tükənmə, iTRAQ etiketlənməsi və fraksiyalaşdırma ürək-damar hadisələri və nəzarəti olan 751 xəstənin kəşf kohortunda 830 zülal müəyyən etdi və 50 birləşdirilmiş nümunəyə endirildi (Juhasz). və b, 2011). Məlum markerlər CRP və fibronektin namizədlər siyahısından seçilmiş və bu zülallara qarşı immunoanalizlər vasitəsilə orijinal kohortda əhəmiyyətli dərəcədə tənzimləndiyi aşkar edilmişdir. Ürək transplantasiyası tədqiqatında, əməliyyatdan əvvəl və sonra beş vaxt nöqtəsində 26 xəstənin tükənmiş və iTRAQ etiketli plazmasının təhlili cəmi 900-dən çox zülal (hər fərdi Cohen üçün 273) müəyyən etdi. və b, 2013). 43 nəfərdən ibarət qismən müstəqil təqib kohortunda beş orta bol proteinə qarşı MRM analizləri və ELISA-lar orqan rədd edilməsi üçün risk markerləri üçün hesablama xəttinin işlənib hazırlanmasına xidmət etmişdir. Potensial klinik faydaya yanaşmada döş xərçənginin siçan modelindən tükənmiş plazma 80 heyvandan ibarət müstəqil yoxlama kohortunda MRM analizləri üçün 88-i seçilən 1000-dən çox plazma zülalını müəyyən etməyə imkan verdi (Whiteaker). və b, 2011 ).

Düzbucaqlı biomarker strategiyası və plazma proteomunun profilləşdirilməsi

Son bir neçə ildə cəmiyyət MS əsaslı proteomikanın iş axınının bütün aspektlərini əhəmiyyətli dərəcədə təkmilləşdirdi. Nümunə hazırlamaqda zəhmət tələb edən, çoxmərhələli hazırlıq iş axınları minimum manipulyasiya addımları ilə möhkəm, tək flakonlu emal ilə əvəz edilmişdir. Bu da avtomatlaşdırmaya kömək edir və ötürmə qabiliyyətini artırır. MS alətlərinin həssaslığı və ardıcıllıq sürəti bir neçə dəfə yaxşılaşmışdır. Bütün LC-MS/MS sistemi daha möhkəm hala gəldi, baxmayaraq ki, bu, adi klinik tətbiq üçün lazım olandan hələ də uzaqdır. Nəhayət, nəticələrin bioinformatik təhlili indi statistik cəhətdən etibarlı və istifadəsi sadədir və MS nəticələrinin digər klassik klinik və əlavə “omiks” məlumatlarının geniş spektri ilə korrelyasiyasını getdikcə artırmağa imkan verir. Ən qabaqcıl MS-əsaslı proteomikanın gücünü nümayiş etdirən hüceyrə xətləri indi nisbətən qısa müddətdə, bəzən hətta heç bir fraksiya olmadan da müntəzəm olaraq 10.000-dən çox müxtəlif zülalın dərinliyinə qədər ölçülə bilər (Mann və b, 2013 Richards və b, 2015 Sharma və b, 2015 Bekker-Jensen və b, 2017 ).

Hüceyrə xətti və toxuma nümunələrində proteomikanın bu texnoloji tərəqqisini nəzərə alaraq, çox sayda nümunədə plazma proteomunu dərindən qiymətləndirəcək sürətli və avtomatlaşdırılmış iş axınının inkişaf etdirilməsinin mümkün olub olmadığını soruşduq (Geyer). və b, 2016a). Bunun daha sonra mümkün qədər çox zülalın mümkün qədər çox fərd və şərait üçün ölçüldüyü "düzbucaqlı strategiya"nı təmin edəcəyini düşündük. Üçbucaqlı iş axınından fərqli olaraq, ilkin kəşf kohortu daha böyük olacaq, ideal olaraq yüzlərlə və ya minlərlə iştirakçını əhatə edəcək, nəticədə araşdırılan qrupları və ya şərtləri fərqləndirə biləcək hər hansı nümunələri aşkar etmək ehtimalı daha yüksək olacaqdır. Plazma proteomlarının bu daha böyük ilkin nömrələri statistik cəhətdən əhəmiyyətli, lakin bir qrup zülal ilə əlaqəli kiçik fərqlər və dəyişikliklərin aşkar edilməsinə imkan verəcəkdir. Təklif olunan düzbucaqlı strategiyada kəşf və təsdiqləmə kohortlarının hər ikisi ov tüfənginin proteomikası ilə böyük dərinlikdə ölçüləcəkdir. Bu, təsdiqləmənin kəşfdən asılılığını aradan qaldırır, yəni hər iki kohortun birlikdə təhlil oluna biləcəyi deməkdir (Şəkil 4A). Üstəlik, ayrı-ayrı kohortlara sahib olmaq, tədqiqata xas çaşqınlıqları aradan qaldırmağa imkan verir. Düzbucaqlı strategiyanın daha bir üstünlüyü, üçbucaqlı yanaşma ilə mümkün olmayan tək biomarker namizədlərinə əlavə olaraq, xüsusi sağlamlıq və ya xəstəlik vəziyyətləri üçün xarakterik olan zülal nümunələrini aşkar etmək və təsdiqləmək qabiliyyətidir.

Şəkil 4. Düzbucaqlı iş axını

Maraqlıdır ki, bir neçə il əvvəl genom boyu assosiasiya tədqiqatları (GWAS) üçün analoji konsepsiya dəyişikliyi baş verib. Bu sahədə tədqiqatçılar müəyyən etdilər ki, mümkün qədər çox nümunənin birgə təhlili ardıcıl boru kəmərindən (Skol) üstündür. və b, 2006). Proteomikada aşkar problem qısa müddətdə, ideal olaraq tükənmədən və möhkəm iş prosesində kifayət qədər proteomik dərinliyə nail olmaqdır. Yazı zamanı bu məqsədə nail olunmayıb, lakin texnoloji təkmilləşmələrin hazırkı sürəti onu yaxın gələcəkdə həyata keçirmək üçün vəd edir. Aşağıda bu ortaya çıxan yanaşmanın dörd nümunəsini müzakirə edirik.

Bunlardan birincisi, genetik fonun plazma zülallarının səviyyələrinə təsirini müəyyən etmək üçün 36 monoziqot və 22 dizigotik əkiz cütlük kohortu araşdırdı (Liu və b, 2015). Müəlliflər tükənmiş, fraksiyalaşdırılmış və birləşdirilmiş nümunələrdən istifadə edərək spektral kitabxana yaratdılar və onların nümunələrini məlumatdan müstəqil əldəetmə (DIA) ilə ölçdülər. Daha sonra məlumatdan asılı olmayan rejimdə 35 dəqiqəlik gradientlərlə cəmi 232 plazma nümunəsi ölçüldü ki, bu da 1904 peptidin və 342 zülalın ardıcıl kəmiyyətinin müəyyən edilməsinə gətirib çıxardı. Maraqlıdır ki, zülal səviyyələri fərdlər arasında nisbətən sabit idi. Bundan əlavə, bəzi zülalların səviyyələrinin genetik nəzarət altında olması üçün aydın göstəricilər var idi. Məsələn, "immun reaksiya" və "qan laxtalanması" ilə əlaqəli proseslər irsi xarakter daşıyırdı, halbuki "hormon reaksiyası" ilə əlaqəli proseslər yox idi. Öncül tədqiqat olmasına baxmayaraq, təhlil edilən plazma proteomlarının sayı qoyulan tədqiqat sualının ümumiliyi baxımından nisbətən kiçik idi. Ümumiyyətlə, genetik tədqiqatlar klinik proteomikada daha yüksək məhsuldarlığa ehtiyacı göstərən incə irsi təsirləri aşkar etmək üçün minlərlə iştirakçını müntəzəm olaraq araşdırır.

Malmström və b (2016) inyeksiya yolu ilə siçanlarda sepsisə səbəb oldu S. pyogenes və onların plazma proteomlarını tükənməyən, fraksiyalaşdırılmamış nümunələrdə üç vaxt nöqtəsi vasitəsilə izlədilər. Məlumatdan asılı olmayan identifikasiyaları dəstəkləmək, həmçinin toxuma zədələnməsi zülallarının mənşəyini müəyyən etmək üçün müxtəlif siçan toxumalarından ibarət kitabxana istifadə edilmişdir. Bu şəkildə, 2 saatlıq qaçışlar orta hesabla 786 siçan zülalının kəmiyyətini müəyyənləşdirdi, baxmayaraq ki, kompleks DIA MS/MS spektrlərində peptid identikliklərini çıxarmaq üçün müvafiq FDR meyarlarının hələ də müzakirə olunduğunu qeyd etmək lazımdır (Nesvizhskii). və b, 2007 Bruderer və b, 2017 Rosenberger və b, 2017). Plazma zülallarının bir neçə gözlənilən kateqoriyası sepsis zamanı artdı, həmçinin damar sisteminin zədələnməsi ilə əlaqəli bəzi markerlər. Dəyişikliklərin bəziləri patogenə qarşı immunitet sisteminin səfərbərliyi ilə bağlı idi, digərləri isə ciddi şəkildə təsirlənmiş heyvanlarda nekrozla əlaqəli idi.

“Plazma proteomunun profilləşdirilməsi” adlanan iş prosesində biz bir barmaq çubuğundan (Geyer) cəmi 1 μl tükənməmiş plazmanın sürətli və möhkəm analizinə diqqət yetirdik. və b, 2016a). Ümumi qradiyentin müddəti cəmi 20 dəqiqə idi ki, bu da plazma proteomunun analitik, intra-analiz, intra-individual və fərdlərarası variasiyasının geniş tədqiqinə imkan verdi. 300 plazma zülalının kəmiyyətinə əsaslanaraq, təxminən 50 FDA tərəfindən təsdiqlənmiş biomarkerlər etiketsiz kəmiyyət təyini ilə əhatə olundu (CV < 20%). Nümunələrin geniş spektrinin sürətli təhlili həmçinin qırmızı qan hüceyrələrinin lizisini sübut edən nümunələri, nümunələrin qeyri-adekvat istifadəsi səbəbindən laxtalanma kaskadının qismən aktivləşməsini və keratinlər kimi ekzogen çirklənmələri olan nümunələri aydın şəkildə təsnif edən müxtəlif keyfiyyət markerləri dəstlərini aşkar etdi. Bu tədqiqat plazma proteomunun məlumat məzmununun faydalı icmalını təqdim etsə də, əhatə dairəsinin dərinliyi aşağı səviyyəli, tənzimləyici plazma zülallarını həll etmək üçün hələ kifayət deyildi. Fraksiyanın bir addımı təxminən 1000 zülaldan ibarət kəmiyyət plazma proteomunu, o cümlədən məlumat konsentrasiyası < 10 ng/ml olan 183 zülal əldə etdi, lakin hər nümunə üçün daha uzun ölçmə vaxtları bahasına.

Plazma proteomunun profilinin iş axınının təkmilləşdirilmiş versiyası kilo itkisi tədqiqatında təxminən 1300 plazma proteom nümunəsinin robotik hazırlanmasına və ölçülməsinə imkan verdi (Geyer). və b, 2016b). Fərdlərin dördqat analizi çəki itirmək və bir il ərzində çəki saxlamaqla orta hesabla 437 zülalın dinamikasını ələ keçirdi. Kilo itkisinin özü 93 əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmiş zülal ilə insan plazma proteomuna geniş təsir göstərmişdir. Kəmiyyət fərqləri çox vaxt kiçik, lakin fizioloji cəhətdən mənalı idi, məsələn, adipositlər tərəfindən ifraz olunan SERPINF1 faktorunun 16% azalması. Fərdlərin 1 il ərzində orta hesabla 12% arıqladıqları uzunlamasına tədqiqat dizaynı plazma proteomunun uzunmüddətli dinamikasını tutmağa və onu fərdlər arasında sabit olan zülallara təsnif etməyə imkan verdi. Çox protein nümunələri lipid homeostaz sistemini (apolipoprotein ailəsi), aşağı səviyyəli iltihabı və insulin müqavimətini əks etdirir. Bu nümunələr, fərdi müalicə və həyat tərzi tövsiyələri üçün potensial olaraq açılan fərdi səviyyədə kilo itkisinin faydalarını ölçdü.

Birlikdə, bu tədqiqatlar həm də eninə kəsiyi tədqiqat dizaynlarına nisbətən uzununa üstünlüklərini vurğulayır, çünki plazma proteomu müxtəlif fərdlər arasında olduğundan zamanla bir fərddə daha sabit olmağa meyllidir. Bundan əlavə, onlar oxşardırlar ki, onlar daha az qərəzli boşalmamış plazmadan istifadə edirlər və müəyyən bir analiz müddətində bir çox zülalları müəyyən edirlər (20 zülal/dəq.).

Nə qədər zülalın örtülməsi ilə bağlı suala gəlincə, biz tapdıq ki, tükənməmiş plazmada 1500-dən çox zülaldan ibarət proteomik dərinlik, qaraciyər əsaslı lipoprotein reseptorları kimi toxuma sızması zülallarını əhatə etməyə imkan verir və hazırda mövcud olan texnoloji imkanlar daxilindədir. inkişaf etmişdir. İlk 300 ən çox zəngin zülal arasında hər dördüncü zülal biomarkerdir, sonrakı 1200 zülalda isə yalnız hər 25-ci zülaldır (Şəkil 5). Olmadığı kimi a priori biomarkerlərin əyri bolluq paylanmasına malik olmasının səbəbi, bu, bir çox biomarkerlərin hələ də tapılacağını göstərir. İnanırıq ki, düzbucaqlı strategiyadan istifadə edərək plazma proteomunun profilinin yaradılmasının əsl vədi onun hələ biomarkerlər kimi qəbul edilməmiş zülalları və zülal nümunələrini kəşf edə bilməsidir. Əsas LC-MS/MS texnologiyasındakı eksponensial artım, bütün dünyada laboratoriyalarda qeydə alınan plazma proteom məlumat dəstlərinin sayında uyğun artımı stimullaşdıracaq. Bu, çoxlu klinik tədqiqatlar və fərdləri əhatə edən plazma proteomları və onların dinamikası haqqında geniş məlumat bazası yaradacaq. Bu cür məlumatlar daha sonra proteom dövlətlərini xəstəliklər, risklər, müalicələr və həyat tərzi də daxil olmaqla geniş müxtəliflikdə "təzyiqlər"lə birləşdirən bilik bazası yaratmaq üçün birləşdirilə bilər. Ən azı, bu yanaşma aşkar edildiyi xüsusi kontekstdən əlavə, müəyyən biomarkerlər dəstinin iştirak etdiyi bütün müxtəlif şərtləri aşkar edəcəkdir. Xəstəlik şərtləri arasında proteomun üst-üstə düşməsi onların arasında ümumi cəhətləri aşkar edə bilər (Şəkil 4B, yuxarı panel). Daha sonra fərdin plazma proteom profili və onun dinamikası qlobal bilik bazası ilə müqayisə edilərək şərh edilə bilər. Bu, birgə xəstəlikləri aradan qaldırmaq və müalicəyə rəhbərlik etmək və effektivliyə nəzarət etmək üçün istifadə edilə bilər (Şəkil 4B, aşağı panel).

Şəkil 5. Bolluq diapazonunda biomarkerlərin paylanması

Proteomik biomarker kəşf boru kəmərinin standartlaşdırılması

Bazara daxil olan biomarkerlərin hazırkı çatışmazlığının müxtəlif texniki, elmi və siyasi aspektlərin nəticəsi ola bilər, o cümlədən uyğunsuz tənzimləmə standartları və analitik etibarlılıq və klinik faydalılıq üçün dəlillərin olmaması (Hayes) və b, 2013). Bu çətinliklərin öhdəsindən gəlmək üçün biomarkerlərin inkişafı üçün sistematik boru kəmərləri müdafiə edilmişdir (Pavlou və b, 2013 Daffy və b, 2015). Biomarkerin kəşfinin üçbucaqlıdan düzbucaqlı strategiyasına keçməsi kontekstində aşağıdakı prinsipləri nəzərə almaq xüsusilə vacib olacaqdır.

(1) Analitik performans xüsusiyyətləri: Analitik etibarlılıq biomarkerin dəqiq və etibarlı ölçülməsini təmin etmək üçün testin qabiliyyətidir. Plazma proteomikası metodologiyasının analitik etibarlılığının müəyyən edilməsi əsas olacaqdır, çünki eyni metod çox vaxt kəşfdən tətbiqə qədər davam edəcəkdir. Analitik etibarlılığı müəyyən etmək üçün ətraflı standartlar Klinik və Laboratoriya Standartları İnstitutu (CLSI) (www.clsi.org) tərəfindən hazırlanmışdır. İcmal Grant və Hoofnagle (2014) və Jennings-də tapıla bilər. və b (2009). Bu standartların bəziləri ABŞ Qida və Dərman İdarəsi (FDA) tərəfindən tanınıb və gətirilmək üçün qəbul edilib. in vitro bazara diaqnostik test (https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfstandards/search.cfm). FDA standartlarına uyğun tam analitik doğrulama ilə başlamaq biomarkerin aşkar edilməsində qadağanedici ola bilsə də, daşıma, dəqiqlik, dəqiqlik, analitik həssaslıq, analitik spesifiklik və kəmiyyət həddi kimi əsas meyarlardan ən azı bəziləri sınaqdan keçirilməlidir. erkən. Bu, düzbucaqlı strategiya kontekstində müdafiə etdiyimiz şeyə uyğundur və həm də resurslara qənaət etmək marağındadır, çünki biomarkerin kəşfindən sonrakı addım biomarkerin yoxlanılmasıdır, burada analitik etibarlılıq məcburidir.

(2) Klinik performans xüsusiyyətləri: Klinik etibarlılıq xəstələrin əlaqəli xəstəlikləri və klinik vəziyyətləri ilə əlaqədardır və təhlilin hədəf aldığı analitlərin düzgün ölçülməsinə yönəlmiş analitik etibarlılıqdan fərqlidir. Beynəlxalq Standartlar Təşkilatına (ISO) 15189 və ISO 17025-ə uyğun olaraq, doğrulama “xüsusi təyinatlı istifadə və ya tətbiq üçün tələblərin yerinə yetirildiyini obyektiv sübutların təqdim edilməsi ilə təsdiq etməkdir”. Buna görə də, klinik performansın yaradılması biomarkerin doğrulama mərhələsində əsas məqsəddir. Klinik performans xüsusiyyətlərinə (i) sağlam görünən fərdlərin kohortlarının ölçülməsi yolu ilə normal istinad diapazonlarının müəyyən edilməsi, (ii) xəstəliyə tutulmuş və müsbət test edilmiş şəxslərin nisbəti kimi müəyyən edilən klinik həssaslığın müəyyən edilməsi və (iii) klinik spesifikliyin müəyyən edilməsi daxildir. , bu, mənfi test edilmiş xəstəliksiz şəxslərin nisbəti kimi müəyyən edilir. Qəbuledici əməliyyat xarakteristikasının (ROC) qrafikləri kimi əldə edilmiş statistik məlumatlar biomarkerlərin klinik performansının qiymətləndirilməsində xüsusilə faydalıdır (Zweig & Campbell, 1993 Obuchowski və b, 2004 ).

(3) Tədqiqatın dizaynı və pre-analitika: Diqqətli tədqiqat dizaynı və yaxşı nəzarət edilən analitik öncəsi şərtlər biomarker tədqiqatı zamanı istənilən vaxt əsas tələblərdir. Tədqiqatın dizaynına gəldikdə, biomarker tərəfindən həll edilməli olan klinik sualın və tibbi ehtiyacın aydın şəkildə müəyyən edilməsi məcburidir. Biomarker tədqiqatlarında ümumi problem ondan ibarətdir ki, hadisələrdən və nəzarətlərdən nümunələr müstəqil şəkildə toplanıb və yaş, etnik mənsubiyyət, cins və qəsdən qərəzliliyə səbəb ola biləcək və ya olmaya bilən digər amillərə uyğun gəlmir (Duffy). və b, 2015). Qərəzliliyə qarşı metodlara Xəstəliklərin Beynəlxalq Statistik Təsnifatı (http://apps.who.int/classifications/icd10/browse/2016/en) kimi sistematik təsnifatlardan istifadə etməklə düzgün tədqiqat dizaynı, həmçinin iştirakçıların dəqiq və dərin klinik fenotipləşdirilməsi daxildir. ya da insan fenomeni ontologiyası (Kohler və b, 2017). Beləliklə, bir insanın bir neçə xəstəlik vəziyyəti varsa, bu düzgün şəkildə hesablana bilər. Nümunələrin toplanması da vacibdir və bütün nümunələrə (hallar və nəzarətlər daxil olmaqla) qan götürülməsindən analitik mərhələyə qədər bərabər şəkildə baxılması vacibdir. Bir çox biomarker tədqiqatlarında digər kritik addım biobankinqdir. ELISA istifadə edərkən, zülal əsaslı biomarkerlərin 3 ay ərzində saxlanması üçün -80°C və ya daha aşağı temperatur tələb olunduğunu aşkar etdik (Zander və b, 2014). Daha uzun müddətlər üçün nümunənin dayanıqlığı yalnız zəif tədqiq edilmişdir. Bununla belə, təcrübəmizə görə, ov tüfəngi proteomikası nümunə tarixçəsinin dəyişməsinə yüksək dözümlüdür, çünki qorunub saxlanılmalı olan zülal epitopları yoxdur və hətta sonradan yaranan proteolitik peptidlərin əksəriyyəti dəyişməz qaldığı müddətcə zülalın qismən deqradasiyası dözümlü ola bilər.

Klinik tətbiqə gedən yol

Plazma proteomikasında mövcud irəliləyiş tədqiqat və klinika üçün maraqlı yeni yollar açır. Yuxarıda göstərilən bütün ehtiyat tədbirləri nəzərə alınmaqla, qeyd olunan yanaşmaların yeni protein əsaslı biomarkerlərin kəşfinə gətirib çıxaracağı ehtimalı nə qədərdir? Və gələcəyin proteomik biomarkeri necə görünəcək? Bu kontekstdə əsas mövzu müəyyən bir xəstəlik vəziyyətinin və ya riskin mövcudluğu və yoxluğu, başqa sözlə, onun klinik performansı arasında fərq qoymaq üçün biomarkerin ayrı-seçkilik gücüdür. Hal-hazırda istifadə olunan yüksək spesifikliyə və yüksək həssaslığa malik biomarkerlərə misal olaraq kardiyomiyositlərdə xüsusi olaraq ifadə olunan struktur zülalları olan və buna görə də miokard zədələnməsi üçün yüksək spesifik olan ürək troponinlərini göstərmək olar. Bu səbəbdən, ürək troponinləri hətta miokard infarktının universal tərifinə daxil edilmişdir (Roffi və b, 2016 ).

Çox güman ki, proteomik yanaşmalar, ən azı müəyyən xəstəliklər üçün oxşar performansa malik əlavə biomarkerlərin müəyyən edilməsində uğur qazanacaq. Əslində, bilməliyik ki, bu gün istifadə edilən biomarkerlərin əksəriyyəti ya çoxludur, ya da məlum patofizyoloji kontekstdən qaynaqlanır. Düşüncə təcrübəsi olaraq, biz biomarkerlərin sayının yüksək bolluq diapazonunda olan zülalların sayına nisbətən aşağı bolluq zülal diapazonuna nisbətini ekstrapolyasiya etdik ki, bu da müvafiq texnologiya ilə əldə edilə bilən bir neçə yüz yeni biomarkerin potensialını göstərir ( Şəkil 5). Tədqiq olunan xəstəliyin əvvəllər məlum olmayan patofiziologiyası ilə əlaqəli əhəmiyyətli sayda vuruşun olduğu GWAS-a bənzər olaraq (Holdt & Teupser, 2013 Manolio, 2013), çox güman ki, radarın altında gizlənmiş yeni markerlər. əvvəlki strategiyalar, yeni sistematik proteomik yanaşmalarla müəyyən ediləcək. Bu biomarkerlər təkcə diaqnostikada deyil, həm də terapiyada xəstəliyin patofiziologiyası haqqında anlayışımızı yaxşılaşdırmaq potensialına malik ola bilər. Bununla belə, qeyd edin ki, müəyyən edilmiş biomarkerlər həmişə xəstəliyin patofiziologiyasında birbaşa iştirak edə bilməz, lakin yalnız onunla əlaqəli ola bilər.

İnsan genomu ICD kodu ilə təsnif edilən 14500-dən çox xəstəliyə qarşı olan 20.000-ə yaxın protein kodlaşdıran genləri kodlayır. Bu, bir gen və ya zülalın hər bir xəstəlik vəziyyəti ilə əlaqəli olduğunu təsəvvür etməyi konseptual olaraq çətinləşdirir, çünki biomarkerləri tapmaq üçün mövcud səylərdə tez-tez nəzərdə tutulur. Əksinə, çoxlu markerlər üçün böyük kohortları ekranlaşdırmağa imkan verən düzbucaqlı strategiya, xüsusi sağlamlıq və ya xəstəlik vəziyyətləri üçün xarakterik olan zülal nümunələrini aşkar etmək və təsdiqləmək üçün böyük vəd verir. Həqiqətən də, çox markerli birləşmələr tək markerlərlə müqayisədə daha yüksək spesifiklik və həssaslığa nail ola bilər və omik məlumatlardan dəqiq marker kombinasiyalarını seçmək üçün ilk alətlər işlənib hazırlanmışdır (Mazzara və b, 2017). Bununla belə, mövcud olanlarla birləşən yeni biomarkerlərin ümumi problemi odur ki, onlar tez-tez yalnız cüzi təsnifat təkmilləşdirmələrinə gətirib çıxarır, xüsusən də yaxşı performans göstərənlərə əlavə olunduqda (Pencina) və b, 2010). Ümumi və intuitiv fərziyyələrin əksinə olaraq, proqnozlaşdırıcılar arasında korrelyasiya (xüsusilə mənfi korrelyasiya) ayrı-seçkilik üçün faydalı ola biləcəyi göstərilmişdir (Demler və b, 2013). Bu sahədə daha çox tədqiqata aydın şəkildə zəmanət verilir və yeni proteomika texnologiyaları müvafiq statistik metodların təsdiqi üçün tələb olunan məlumatları təmin edəcəkdir.

Nəhayət, bu markerlər klinik şəraitdə necə tətbiq olunacaq? Biz vəziyyətdən asılı olmayaraq bütün plazma proteomunun dərindən ölçülməsinə üstünlük veririk, çünki bu, ən dolğun məlumatı təmin edir. Zamanla, hətta sağlam subyektlərdən də faydalı şəkildə əldə edilə bilən uzununa plazma proteom profilinə əlavə olunur. Yuxarıda qeyd edildiyi kimi, plazma zülal səviyyələri ümumiyyətlə sabitdir, lakin insana xasdır, əhaliyə əsaslanan kəsmə dəyərləri əvəzinə fərdi spesifik şərhə imkan verir. Bundan əlavə, bir çox xəstə qruplarında birgə xəstəliklər istisna deyil, qaydadır. Bunlar, fərdi ELISA testlərinin ardıcıllığı ilə deyil, plazma proteomik profili kimi ümumi diaqnostik testlə daha asan və iqtisadi cəhətdən həll edilir. Buna baxmayaraq, universal testin məqsədəuyğun olmadığı bir çox vəziyyətlər ola bilər, çünki o, təsadüfən digər şərtləri aşkar edə bilər. Bənzər problemlər genom ardıcıllığı və ya təxəyyül üsulları kimi digər texnologiyalarla da yaranır, burada fərdlər çox az edə biləcəkləri meyllər haqqında öyrənmək istəməyə bilər. Bu hallarda və ümumiyyətlə, həddindən artıq diaqnoz riskindən qaçınmaq üçün (Hofmann & Welch, 2017), klinisyenler xüsusi bir xəstəlik kontekstinə diqqət yetirən daha yönəlmiş xarakterli plazma proteomikası testlərinə üstünlük verə bilərlər. Bu, bütün proteomu deyil, bir zülal panelini hədəf alan yuxarıda qeyd olunan MS üsulları ilə həyata keçirilə bilər.

Bütün proteom diaqnostik testləri və ya panel əsaslı testlər üçün həkimlərin çoxölçülü məlumatlarla necə məşğul olacağı sualı yaranır. Şəkil 6A, əsasən klinik biliyə və intuisiyaya əsaslanan qərar qəbul etmə prosesinə inteqrasiya olunmuş cari tək/oliqo biomarker diaqnostikasını göstərir. Yeni biomarkerlər aydın şəkildə daha yaxşı məlumatlı klinik qərarlar vəd edir, eyni zamanda insanın təfsir qabiliyyətini aşan nümunələr yaratmaq riskini nəzərdə tutur (Şəkil 6B). Bu problemin həlli bir çox biomarkerlərin kəmiyyət panelinə alqoritmik birləşməsi ola bilər, ola bilsin ki, kliniki metaməlumatlar ilə birləşsin ki, bu da klinik qərarların qəbuluna əhəmiyyətli dərəcədə kömək edə bilər (Şəkil 6C). “Dərin öyrənmə” və “böyük məlumat” sahəsində sürətli inkişafı nəzərə alsaq, bu birləşmənin güclü və görünməmiş assosiasiyalar təmin edə biləcəyini görmək çox maraqlı olacaq. Qeyd edək ki, bu gün klinik praktikada artıq çox parametrli ballar mövcuddur. Məsələn, Child-Pugh skoru və Framingham Risk Score hər biri onilliklər ərzində müvafiq olaraq qaraciyər xəstəliyinin və ürək-damar müalicəsinin müalicəsində klinisistin qərarına kömək etmək üçün bir neçə qan dəyərini xəstə məlumatları ilə birləşdirmişdir. Bu, həm də plazma proteomikasının sübuta əsaslanan tibbi təcrübəyə necə qəbul oluna biləcəyini təklif edir, çoxlu parametrlər və parametr birləşmələri nəzərə alınmaqla böyük bir problemdir ki, bunların hamısı ayrı-ayrı klinik sınaqlarla təsdiq edilə bilməz. Praqmatik bir alternativ, həkimlərin təsadüfi olaraq proteomik məlumatı və əlaqəli qərar dəstəyini əldə etdikləri sınaqlar hazırlamaq ola bilər. Bundan sonra xəstənin nəticələrində əhəmiyyətli bir faydanın olub olmadığını müəyyən etmək asan olardı.

Şəkil 6. Klinik qərarlarda proteomik məlumatların həyata keçirilməsi

Nəticələr

Laboratoriya təbabətində mövcud təcrübənin təhlili göstərir ki, müalicə qərarlarının əksəriyyəti qan testləri əsasında verilir və zülal ölçmələri bu gün də onların arasında ən qabarıqdır. Hər il milyonlarla insan tərəfindən uğurla həyata keçirilməsinə baxmayaraq, bu analizlər demək olar ki, həmişə fərdi zülallara qarşı yönəldilir və yeni zülal testlərinin tətbiqi sürəti bir qədər yavaşladı.

MS-əsaslı proteomika, tək biomarkerlər deyil, zülal nümunələri müvafiq oxunuş ola biləcəyi çoxlu və yüksək spesifik ölçmələr üçün potensiala malikdir. Ədəbiyyata baxışımız göstərdi ki, keçmiş səylər plazma proteomunun böyük analitik problemləri ilə dayandırılıb, bu, yalnız indi maraqlı texnoloji inkişaflara yol verir. Biz iddia edirik ki, kəşf və təsdiqləmə prosesinin bütün mərhələlərində çoxlu sayda şərtlərin və iştirakçıların təhlili klinik əhəmiyyətə malik olan biomarker panelləri istehsal etmək potensialına malikdir. Müəyyən şəraitdə zülal modellərindəki dəyişikliklər haqqında geniş məlumat bazaları ilə birləşdirildikdə, belə bir plazma proteomunun profilləşdirilməsi strategiyası prinsipcə bu bədən mayesinin bütün məlumat məzmunundan istifadə edə bilər.

Bu vizyonu reallaşdırmaq üçün ötürmə qabiliyyətinin, proteomun əhatə dairəsinin dərinliyinin, möhkəmliyin və əsas iş axınının əlçatanlığının daha da təkmilləşdirilməsi çox vacibdir. Bundan əlavə, plazma proteomikası tərcümədən sonrakı dəyişikliklərin təhlilinə də genişləndirilə bilər. Eyni şəkildə, plazma metabolomikası da MS əsaslı iş axınlarından istifadə edir və gələcəkdə müntəzəm olaraq plazma proteomikası ilə inteqrasiya oluna bilər. Biz əminik ki, tələb olunan texnoloji inkişaflar zaman keçdikcə əldə edilə bilər və əldə ediləcəkdir. Proteomik məlumat daşqını həkim və səhiyyə sistemi üçün hərəkətə keçə bilən məlumatlara çevrilməli olduğu üçün ən azı bir çox problem konseptual və “siyasi” olacaq. Bu, iştirak edən bütün tərəfdaşlardan xüsusi və yorulmaz öhdəlik tələb edəcəkdir. İnanırıq ki, daha dəqiq və spesifik diaqnostika vədi bu cür səyləri kifayət qədər mükafatlandıracaqdır.


Nəticələr

Bitki artımının təhlili

Fidan mərhələsində kök kökləri (20 DAS, S1), qırılma mərhələsində (40 DAS, S2) və yetkin mərhələdə (90 DAS, S3) yığılmışdır (Şəkil 1A𠄼). 20 DAS-da kök kökü ağ idi və təzə kök çəkisi tumurcuq ağırlığından açıq şəkildə aşağı idi (Şəkil 1D). Kəsmə mərhələsində kök kökü səthdə narıncı rəng göstərməyə başladı və təzə tumurcuqların çəkisi xeyli yaxşılaşdı. Bu mərhələdə nə təzə kök çəkisi, nə də diametri əhəmiyyətli dəyişikliklər göstərməmişdir (Şəkil 1E). Sonrakı dövrdə kök sürətlə böyüdü və kök kökünün təzə çəkisi tumurcuqdan daha yüksək oldu (Şəkil 1D). Eyni zamanda, kök kökünün böyüməsi zamanı kök diametri əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 1E).

Şəkil 1. Üç inkişaf mərhələsində yerkökün morfoloji xüsusiyyətləri. (A𠄼) 20 DAS-da yerkökü ‘Karodagosun’ artım vəziyyəti (A), 40 DAS (B), və 90 DAS (C). Hər təsvirin sağ alt küncündəki qara xətlər 5 sm-i təmsil edir. (D) Üç inkişaf mərhələsində kök köklərinin təzə çəkisi. (E) Üç inkişaf mərhələsində yerkökü kök diametri. Fərqli kiçik hərflər əhəmiyyətli fərqləri göstərir P < 0,05.

Kök kökünün inkişafı zamanı anatomik dəyişiklikləri daha da araşdırmaq üçün Safranin-O/ Sürətli yaşıl rəngləmə müxtəlif bitki toxumalarının quruluşunu göstərmək üçün istifadə edilmişdir (Şəkil 2). Boyanma olduqda, lignified hüceyrə divarları qırmızıya çevrilə bilər. Şəkil 2A-da göstərildiyi kimi, cücərmə mərhələsində böyük ölçülü sərhəd hüceyrələri var idi. Bu mərhələdə phloem və protoxylem kiçik idi və lignification aşkar deyildi (Şəkil 2B). Bu hüceyrələrin sayının və ölçüsünün artması ilə kök kökləri qalınlaşmağa başladı. İkinci mərhələdə damar kambiumu davamlı olaraq bölünür. Ksilemdə çoxlu damarlar sıx şəkildə düzülmüşdü və hüceyrə divarının lignləşməsi əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 2C, D). Bundan sonra, kök inkişafının sonrakı mərhələsində (Şəkil 2E–G) ksilemdə damarların paylanması çox dəyişdi və bu, sıx düzülmək əvəzinə çoxluqlar şəklində yayılmağa başladı. Bu arada, bu dövrdə çoxlu sayda nişasta qranulları sürətlə yığıldı.

Şəkil 2. Mərhələ 1-dən kök köklərinin anatomik quruluşu (A, B), Mərhələ 2 (C,D) və Mərhələ 3 (E–G). BC, sərhəd hüceyrələri EP, epidermis PC, parenximal hüceyrə Ph, phellogen PP, ilkin floem Px, protoxylem SG, nişasta qranul VC, damar kambium Ve, damar. Böyütmə orijinal ölçüsündən 200 dəfə çoxdur (A𠄽) halbuki böyütmə 400 dəfədir (E–G).

Proteinin İdentifikasiyası və Kəmiyyəti

Bitişik mərhələlərdə kök köklərindən alınan zülalların təhlili üçün iTRAQ texnologiyasından istifadə edilmişdir. Ümumilikdə 2845 zülal aşkar edilib. Kök kökünün böyüməsi dövründə qırıcı mərhələdə (S2) və yetkin mərhələdə (S3) (Əlavə Material S2) müvafiq olaraq, cəmi 226 və 418 DEP müəyyən edilmişdir. Bundan əlavə, iki mərhələdə 118 DEP eyni vaxtda mövcud idi (Şəkil 3A).

Şəkil 3. Kök kökünün inkişafı boyunca protein səviyyəsində ümumi dəyişikliklər. (A) Müxtəlif inkişaf mərhələlərində ümumi və unikal şəkildə ifadə olunan zülalların sayını göstərən Venn diaqramı. Ovaldakı rəqəmlər faza-xüsusi zülalları, kəsişən iki ovaldakı nömrələr üst-üstə düşən zülalları ifadə edir. (B) Ardıcıl iki inkişaf mərhələsi arasında diferensial şəkildə ifadə olunan zülalların sayı. (C) Diferensial şəkildə ifadə olunan zülal logunun orta və maks/dəq dəyişiklikləri - iki ardıcıl inkişaf mərhələsi arasında dəyişiklik.

Şəkil 3B kök kökünün böyüməsi zamanı yuxarı və aşağı tənzimlənən zülalların sayını göstərir. Hər fazada yuxarı və aşağı tənzimlənən zülalların sayı oxşar idi. Bununla belə, yetkin mərhələdə DEP-lərin sayı kəsici mərhələdəkindən demək olar ki, iki dəfə çox idi. Eyni zamanda, DEP-lərin orta və minimum/maksimum dəyəri Şəkil 3C-də təsvir edilmişdir. Yetkin mərhələdə DEP-lərin dəyişən amplitudası nisbətən daha qabarıq idi.

Metabolik Prosesə Xüsusi Zülalların Təsnifatı

GO verilənlər bazasına əsaslanaraq, biz ardıcıl iki inkişaf mərhələsi arasında bütün DEP-lərin funksional annotasiyasını apardıq. Üç kateqoriyalı ən yaxşı 20 GO termini “bioloji proses”, “hüceyrə komponentləri”, “x2019” və “molekulyar funksiyalar”. P-dəyərlər Əlavə Şəkil S1, Əlavə Material S1-də göstərilmişdir. DEP-lərin əksəriyyəti iki dəstdə (S2/S1, S3/S2) “hüceyrə komponentləri” qrupunda zənginləşdirilmişdir. Eyni zamanda, bu qrupdakı GO terminlərinin böyük əksəriyyəti olduqca yaxın idi. Nümunə olaraq, ‘nucleus’ və ‘nucleolus’ həm S2/S1 (müvafiq olaraq 63 və 55 DEP) və S3/S2 (müvafiq olaraq 91 və 79 DEP)-də ən çox təmsil olunan GO şərtləri idi. Eyni hadisə ‘molekulyar funksiya’-da baş verdi. Bioloji proses üçün iki dəstin GO şərtləri arasında bəzi fərqlər var idi. Su məhrumiyyətinə �vab’’ və ‘nukleosom məclisi’ ən çox DEP-ləri müvafiq olaraq S2/S1 (19 DEP) və S3/S2 (28 DEP) ehtiva edir.

Bioloji yollar həmçinin KEGG verilənlər bazasından istifadə etməklə təhlil edilmişdir (Şəkil 4). İki dəstdə cəmi on iki yol ardıcıl idi. Onların arasında 'genetik məlumatların emalı, 'hüceyrə prosesi, 'enerji mübadiləsi, 'orqanizm sistemləri' (S2/41-də bütün yolların ən böyük nisbətini aldılar. müvafiq olaraq 22,3, 9,7 və 7,6%) və S3/S2 (müvafiq olaraq 31,6, 17,9, 10,4 və 10,2%). S3/S2-də ‘lipid metabolizması’, ‘terpenoidlərin və poliketidlərin metabolizması’ və ‘qlikan biosintezi və metabolizması’ yolları xüsusi olaraq aşkar edilmişdir.

Şəkil 4. Müxtəlif inkişaf mərhələlərində kök köklərindən müəyyən edilmiş DEP-lərin KEGG təsnifatı. (A) S1 və S2 arasında müəyyən edilmiş DEP-lərin KEGG təsnifatı. (B) S2 və S3 arasında müəyyən edilmiş DEP-lərin KEGG təsnifatı.

Kök Kökünün İnkişafı zamanı Zülalların Funksional Klasterlərinin Profilləri

Kök toxumasının proteomu ətli kökün böyüməsini və inkişafını müəyyən edir. Kök kökünün inkişafı zamanı müxtəlif zülalların müxtəlif ifadə səviyyələri müxtəlif fazalarda xüsusi funksiya və əhəmiyyəti vurğulayır. Şəkil 5-də göstərildiyi kimi, bəzi DEP-lər ehtimal olunan bioloji funksiyalarına görə qruplaşdırılmışdır. Kök kökünün inkişafı zamanı bir neçə patogenin (Şəkil 5B), stresslə əlaqəli (Şəkil 5C), zülalın deqradasiyası ilə əlaqəli (Şəkil 5K) və siqnal zülallarının (Şəkil 5L) ifadə səviyyələri yaxşılaşmağa davam etdi. Üzvi turşu mübadiləsində iştirak edən zülallara gəldikdə (Şəkil 5D), bu DEP-lərin əksəriyyəti S2-də aşağı tənzimlənmişdir. Əksinə, ifadə səviyyələri yetkinlik dövründə artım göstərmişdir. Nəticələr həmçinin uzanma faktorlarının (Şəkil 5G), antioksidant fermentlərin (Şəkil 5H), fotosintez və enerji ilə əlaqəli zülalların (Şəkil 5N) və nəqliyyat zülallarının (Şəkil 5O) ifadəsində azalma göstərdi. Bütövlükdə baxın, eyni funksiyaya malik fərqli zülallar fərqli meylləri ifadə etdi.

Şəkil 5. Müxtəlif inkişaf mərhələlərində protein ifadəsinin iyerarxik klaster analizi. İstilik xəritələri log2 zülalların nisbi bolluğu ilə yaradılmışdır. Hər bir zülal üçün qoşulma nömrəsi və zülal təsviri nümayiş etdirildi. Zülallar metabolik yollardakı rollarına görə qruplaşdırıldı. (A–O) Müxtəlif protein funksiyalarını təmsil edir.

Kökdə Ekspansin Zülallarının Müəyyənləşdirilməsi

Protein annotasiyasına əsasən, müxtəlif inkişaf mərhələlərində yerkökü köklərinin proteomik məlumatlarından iki ekspansin zülalı əldə edilmişdir. O cümlədən məlumat pI, protein Mw və s. Cədvəl 1-də verilmişdir. Bu iki ekspansin zülalının ifadə səviyyələri oxşar idi, əvvəlcə yüksəldi, sonra azaldı.

Cədvəl 1. Müəyyən edilmiş ekspansin zülallarının annotasiyası və ifadəsi.

Bu iki ekspansin zülalının genlərini müəyyən etmək üçün zülal ardıcıllığına uyğun olaraq klonlama primerləri hazırlanmışdır. İki DcEXP genlər, DcEXP20DcEXP22 RT-PCR ilə klonlandı və onların açıq oxu çərçivələri (ORF) müvafiq olaraq 261 və 262 amin turşularını kodlayan 786 bp və 789 bp idi (Əlavə Şəkil S2, Əlavə Material S1).

Ekspansinlərin əhəmiyyətini hərtərəfli araşdırmaq üçün yerkökü genomunda müxtəlif ekspansin genlərini yoxladıq. Yerkökü genomunun partlaması nəticəsində, cəmi 30 kök ekspansin geni müəyyən edilib. Bu genişlənmə genləri olaraq adlandırıldı DcEXP1-DcEXP30 əvvəlki nomenklaturanın işığında (Kende et al., 2004). İki diferensial şəkildə ifadə olunan ekspansin zülalına uyğun gələn genlər kimi şərh edildi DcEXP20 (Qoşulma Nömrəsi: g13058) və DcEXP22 (Qoşulma No.: g63815), müvafiq olaraq. Yerkökü ekspansinləri arasında təkamül əlaqəsini araşdırmaq üçün bütün ardıcıllıqlara əsaslanan filogenetik ağac qurmaq üçün qonşu-birləşmə (NJ) metodundan istifadə edilmişdir. Ərəbidopsis və yerkökü ekspansin zülalları (Şəkil 6 və Əlavə Şəkil S3, Əlavə Material S1). Bütün DcEXP-lər dörd alt ailəyə birləşdirildi: EXPA, EXPB, EXLA və EXLB. EXPA alt ailəsi 24 yerkökü ekspansindən ibarət ən böyük ölçüyə malik idi. Bununla belə, EXLA və EXLB alt ailəsinin müvafiq olaraq yalnız bir üzvü var idi. Eyni zamanda, hər ikisi EXPB ailəsinə aid olan differensial şəkildə ifadə olunan ekspansin zülallarını müəyyən etdi. Kökdəki 30 ekspansin uzunluğu 206 amin turşusu uzunluğunda idi. Fiziki-kimyəvi xassə analizinin nəticələri göstərdi ki, Mw 22,4 �,2 kDa aralığındadır. Onların pI 5.3 ilə 10.2 arasında dəyişdi (Əlavə Cədvəl S2, Əlavə Material S1). EXLB alt ailəsi xaric, genişlənənlərin çoxu var idi pI 7.0-dan yuxarı dəyərlər.

Şəkil 6. Kök ekspansin genlərinin filogenetik ağac və motiv kompozisiyaları.

Kökdə Ekspansin Amin Turşu Ardıcıllığının Struktur Təhlili

Havuçdakı 30 ekspansinin amin turşusu ardıcıllığı uyğunlaşdırıldı (Əlavə Şəkil S4, Əlavə Material S1). Eyni alt ailəyə aid olan zülalların amin turşusu ardıcıllığı daha yüksək oxşarlığa malikdir. Hər ikisi EXPB alt ailəsinə aid olan DcEXP20 və DcEXP22 arasında uyğunlaşdırılmış eynilik 74,6% təşkil edirdi. Ekspansin zülallarının əksəriyyətində 16 aminturşudan ibarət siqnal peptidi var idi. Bununla birlikdə, dörd zülal, DcEXP26, DcEXP29, DcEXP16 və DcEXP19 bir siqnal peptidinə malik deyildi (Əlavə Cədvəl S2, Əlavə Material S1). Siqnal peptidinin ardınca bir neçə qorunmuş amin turşusu qalıqları müəyyən edildi. EXPA və EXPB alt ailəsində, bütün ekspansinlər HFD motivini ehtiva edirdi, DcEXP11 və DcEXP10 istisna olmaqla, bunun əvəzinə müvafiq olaraq HFV və QFD motivi var. Ümumiyyətlə, həm DcEXPA və DcEXPB-də, həm də DcEXLA və DcEXLB altı arasında səkkiz konservləşdirilmiş sistein (Cys) qalığı müəyyən edilmişdir. Eyni zamanda, müvafiq olaraq 11, 21 və 14 qlisin (Gly) qorunub saxlanıldı (Əlavə Şəkil S4, Əlavə Material S1).

Zülallardakı motivlər və onların ətraflı motiv ardıcıllığı Şəkil 6-da sxematik şəkildə göstərilmişdir. EXPA alt ailəsindəki on zülal on motiv komponentinin hamısını bölüşür, digərlərində isə bir və ya iki motiv yox idi. Digər üç alt ailədəki motivlər EXPA-dakı motivlərdən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənirdi. EXPB alt ailəsinin üzvləri DcEXP19 istisna olmaqla, 4 motivini ehtiva edirdi. Bununla belə, EXLA və EXLB alt ailəsi müvafiq olaraq yalnız bir və ya iki motivə malikdir. Ümumiyyətlə, 4-cü motiv bütün ekspansinlərdə mövcud idi.

Yerkökü Kökünün Böyüməsi zamanı Ekspansin Genlərinin Transkriptom Əsaslı İdentifikasiyası

Laboratoriyamızdakı ilkin tədqiqatdan əldə edilən transkriptom məlumatlarının köməyi ilə (Wang və digərləri, 2015a), yerkökü kökünün böyüməsi zamanı genişlənmə genlərinin transkript səviyyələrini araşdırdıq. Transkriptom məlumatları vasitəsilə cəmi 26 ekspansin geni yoxlanıldı. Onların ifadə profillərini göstərmək üçün milyon başına kilobaza (RPKM) dəyərləri əsasında istilik xəritəsi çəkdik (Şəkil 7). Ekspansin genlərinin demək olar ki, yarısı ikinci mərhələdə ən yüksək ifadəyə malik idi. Bununla belə, varlığını tapa bilmədik DcEXP17DcEXP24 S2-də. Əksinə, DcEXP25 yalnız S1 və S3 əvəzinə S2-də mövcud idi.

Şəkil 7. Kök ekspansin genlərinin ifadə profilləri.

Kök Kökünün İnkişafı zamanı Ekspansin Genlərinin İfadə Profilinin Təhlili

Kök kökünün inkişafını tənzimləyən molekulyar mexanizmi araşdırmaq üçün on müxtəlif genlər, o cümlədən DcEXP20DcEXP22 ifadə təhlili üçün hər bir genişlənmə alt ailəsindən təsadüfi seçilmişdir (Şəkil 8). Hər bir genin nisbi ifadə səviyyəsi ifadəsinə əsasən hesablanmışdır DcEXP24 ən aşağı ifadə səviyyəsini saxlayan S1-də. istisna olmaqla DcEXP9, bütün ekspansin genləri S2-də ən yüksək ifadə səviyyələrini göstərdi. Bu genlər arasında ifadə səviyyəsi DcEXP29 S2-də S1-də olduğundan 30 dəfədən çox idi. Yetkin mərhələdə, ekspansin genlərinin ifadə profilləri ümumiyyətlə azaldı, bəziləri hətta birinci mərhələdən aşağı idi. Müxtəlif ekspansin genləri arasında aparılan müqayisələrin nəticələri göstərdi ki DcEXP20, DcEXP30, DcEXP13, və DcEXP22 daha yüksək ifadə səviyyələrini təmsil edirdi. iTRAQ-ın nəticələri ilə müqayisədə, diferensial şəkildə ifadə olunan iki ekspansin, DcEXP20 və DcEXP22, mRNT ifadəsi meylləri və zülal bolluğu arasında ardıcıl əlaqə nümayiş etdirdi. ifadə səviyyəsi arasında korrelyasiya əmsalı DcEXP20, DcEXP22 və digər ekspansin genləri Pearson analizi ilə təhlil edilmişdir (Cədvəl 2). ifadə profilləri DcEXP20DcEXP22 müvafiq olaraq səkkiz və altı ekspansin genləri ilə müsbət korrelyasiya edilmişdir.

Şəkil 8. 10 yerkökü ekspansin geninin nisbi ifadə səviyyələri. Fərqli kiçik hərflər əhəmiyyətli fərqləri göstərir P < 0,05.

Cədvəl 2. ifadə səviyyələri arasında korrelyasiya DcEXP20, DcEXP22, və digər ekspansin genləri.


Proteini necə ölçə bilərəm?

Kəmiyyət LC-MS üçün mövcud olan üsullar əsasən iki kateqoriyaya bölünür: (i) nisbi kəmiyyət müəyyənləşdirmə və (ii) sintetik stabil izotop etiketli standarta kalibrləmə yolu ilə peptid bolluğunun müəyyən edilməsi (Şəkil 1). Hazırda elmi ictimaiyyətin əksəriyyəti tədqiqat suallarına əvvəlki yanaşmanı tətbiq edir. Bununla belə, sonuncu xüsusilə klinik tətbiqlərdə getdikcə əhəmiyyətli rol oynamağa başlayır.

LC-MS tərəfindən kəşfə əsaslanan nisbi kəmiyyət tədqiqatçılara eyni vaxtda bir neçə nümunədə zülal bolluğundakı dəyişiklikləri müəyyən etməyə imkan verdi. Bernhard Kusterin dediyi kimi, “LC-MS çoxlu zülalları paralel olaraq və bilmək məcburiyyətində qalmadan ölçə bilməsi baxımından xüsusilə güclüdür. a priori hansı zülalları təhlil etmək istəyə bilər”. Fərdi bir zülalın funksiyasını və mürəkkəb bioloji sistem kontekstində zülalın başqaları ilə əlaqəsini həqiqətən dərk etmək üçün zülal bolluğunda əsas və ya standart sistemə nisbətən dəyişikliklər ölçülməlidir. Adından da göründüyü kimi, nisbi kəmiyyət müəyyən edilmiş vəziyyətlə zülalların miqdarının müqayisəsini nəzərdə tutur. yəni, B, C, D vəziyyətində nə qədər peptid (və ekstrapolyasiya ilə zülal) var və s. A. Kuster vəziyyətində eyni peptidin miqdarı ilə müqayisədə, “LC-MS həm də o mənada güclüdür ki, antikorları olmayan və ya keyfiyyətsiz olan zülallar üçün kəmiyyət analizləri hazırlana bilər”.

Daha geniş mənada, LC-MS ilə zülalların nisbi kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün əsasən iki yanaşma var. Bunlar: (i) etiketli və (ii) etiketsizdir. Əvvəlki kateqoriya bir proteomda peptidlərin/zülalların etiketlənməsi üçün iki vasitəyə bölünür. Məhz, ilkin olaraq 1999-cu ildə 3 yaradılmış və daha sonra SILAC şəklində tədqiqat cəmiyyəti tərəfindən daha geniş şəkildə qəbul edilən metabolik etiketləmə vasitəsilə (smasa isotope lilə itaət etmək atərkibindəki minoturşular cbütün mədəniyyət) 4 . Zülallar kimyəvi törəmə yolu ilə də dəyişdirilə bilər və bu cür yanaşmalar əhatə olunmuşdur isotop-coded aincəlik tags (ICAT) 5 , 18 O etiketləmə 6 , dimetil etiketləmə 7 , və izobar kütlə etiketləri, yəni, tandem meşşək tag (TMT) və iayıq tüçün ag relativ və atam quantitation (iTRAQ) 8,9 .

SILAC ilə bioloji nümunələr etiketlənir in vitro hədəf amin turşusunun ağır izotop versiyası ilə. Protein sintezi zamanı təbii olaraq meydana gələn amin turşusu daha ağır etiketli versiya ilə əvəz olunur. Müxtəlif eksperimental şəraitə (yüngül, orta və ya ağır mühitlərdə yetişdirilmiş) məruz qalan hüceyrələr daha sonra qarışdırıla bilər və bütün emal addımları birləşdirilmiş nümunədə yerinə yetirilə bilər (Şəkil 1, metabolik etiketləmə). Bu strategiya nümunənin hazırlanması zamanı baş verə biləcək hər hansı dəyişkənliyi nəzərəçarpacaq dərəcədə azaldır və daha dəqiq kəmiyyətin müəyyən üstünlüyünə malikdir. ilə məs., TMT reagentləri 8 , yüksək məhsuldarlıqlı multipleksləşdirilmiş zülalın miqdarına nail olmaq olar. LC-MS və proteomik məlumat proqramı ilə birləşdirildikdə, hazırda hüceyrələrdən, toxumalardan və ya bioloji mayelərdən əldə edilən 16-ya qədər müxtəlif nümunə eyni vaxtda təhlil edilə bilər, peptidlər/zülallar müəyyən edilir və peptidlərin/zülalların nisbi miqdarı hesablanır (Şəkil 1). , kimyəvi etiketləmə).

LC-MS tərəfindən etiketsiz kəmiyyət son zamanlarda populyarlıqda yenidən canlanma gördü. Cəmiyyətin bu yenilənmiş marağı, ilk növbədə, cari kütlə spektrometrlərinin təkmilləşdirilmiş kütləvi rezolyusiyasının, yeni HPLC sistemləri ilə təkmilləşdirilmiş saxlama müddətinin sabitliyinin və təkcə çoxsaylı xromatoqrafik izləri uyğunlaşdırmaqla yanaşı, həm də izlərdən çoxsaylı xüsusiyyətləri çıxara bilən təkmilləşdirilmiş məlumat təhlili alqoritmlərinin nəticəsi kimi inkişaf etmişdir. . Paralel olaraq, məlumatdan müstəqil əldəetmə (DIA) bütün proteomda dərin, etiketsiz nisbi zülal kəmiyyəti üçün güclü bir yanaşma kimi ortaya çıxdı. Bütövlükdə, etiketsiz kəmiyyət yanaşması həm SILAC, həm də TMT-yə çox sərfəli alternativdir və izotopik etiketlərdən istifadə etmədən çoxlu nümunələrdə zülal bolluğundakı dəyişiklikləri müqayisə etmək kimi əsas üstünlüyə malikdir. Nümunələr fərdi olaraq LC-MS tərəfindən təhlil edilir, bu aspekt yüzlərlə hətta minlərlə xəstə nümunələrindən ibarət kohortların təhlilində çox üstünlük təşkil edir.Mürəkkəb proqram alqoritmləri ilə bütün LC vaxt miqyasında unikal peptid ionlarına uyğun gələn siqnalları inteqrasiya etmək indi xeyli sadədir. Məlumatların LC-MS-dən sonra alınması, fərdi analizlər müqayisə edilə və bütün nümunələr üçün ümumi olan xromatoqrafik xüsusiyyətlər uyğunlaşdırıla bilər (Şəkil 1, etiketsiz). Etiketsiz LC-MS ilə proteom kəmiyyətinin əsas üstünlükləri qeyri-məhdud sayda nümunələri müqayisə etmək imkanı və bahalı etiketləmə strategiyalarının köhnəlməsidir. Bununla belə, böyük bir çatışmazlıq, LC-MS əldə etmə vaxtının artmasıdır (hər bir nümunə ardıcıl olaraq işlədildiyi üçün). Buna baxmayaraq, minlərlə klinik nümunəni təhlil etmək üçün tələb olunan vaxtı azaltmaq üçün çox sürətli və qısa LC gradientləri təmin edə bilən yeni sistemlər bazarda peyda olur.

LC-MS ilə zülalların miqdarının təyini üçün daxili standartlar kimi sabit izotop sintez edilmiş peptidlərdən istifadə konsepsiyası ilk dəfə Desiderio və Kai 10 tərəfindən irəli sürülüb (Şəkil 1, çivili standartlar). Bunlar təbii olaraq meydana gələn maraq doğuran peptidlərlə eyni amin turşusu ardıcıllığına malik olan sintetik triptik peptidlərdir. Sintezləşdirilmiş peptidlər molekulyar kütlədə kiçik artıma (6-10 Da) səbəb olan ən azı bir sabit izotop etiketli amin turşusunu ehtiva edir. Sintetik peptid ekvivalentinin "məlum" miqdarı proteomik həzmə daxil edilir və bütün nümunə LC-MS tərəfindən təhlil edilir. Doğma peptid və çivili peptid standartı xromatoqrafik olaraq kütlə spektrometrində birgə elüsiya və ionlaşacaq. The m/z iki peptiddən, lakin asanlıqla fərqləndirilə bilər. Çıxarılan ion xromatoqramlarından və hər iki peptid üçün əyri altındakı sahənin hesablanmasından pik nisbətləri müqayisə etməklə yerli peptidin miqdarının təxminini hesablamaq olar. Ümumi qəbul edilən tövsiyə hər zülal üçün minimum üç triptik peptid sintez etməkdir. Hər bir təcrübə üçün bir neçə zülalın miqdarı tələb olunarsa, qiymət tezliklə yüksəlir. Bundan əlavə, peptid standartlarının artırılması olduqca sadə bir yanaşma olsa da, protein səviyyəsini əks etdirmək üçün peptid bolluğunun kalibrlənməsi problem olaraq qalır 11. Bu çətinlikləri həll etmək üçün alternativ kalibrləmə üsulları təklif edilmişdir və bunlara aşağıdakılar daxildir: məs., bir nöqtəli ümumi istinad hovuzunun istifadəsi 12,13 .


3. QEYRİ İTKİNLİK

Luo və başqaları. [17] iTRAQ məlumat dəstlərində təsadüfi olmayan çatışmazlıqları özündə birləşdirən Bayes çərçivəsi vasitəsilə ANOVA modellərinin məhdudiyyətlərini aradan qaldırır. Onların modeli hesab edir ki, ölçülən peptid intensivliyi həm protein ifadə səviyyələri, həm də peptid spesifik təsirlərdən təsirlənir. Çoxsaylı eksperimentlərdə bu iki təsirin dəyərləri təsadüfi təsirlər kimi modelləşdirilir. Nümunə bir təcrübədə birdən çox teq ilə etiketləndikdə, müxtəlif izobarik teqlər üzrə variasiyalar da təsadüfi effektlər kimi modelləşdirilir. Peptid məlumatlarının qeyri-təsadüfi əskikliyi bir peptidin əskik olma ehtimalını bu peptidi istehsal edən zülalın ifadə səviyyəsi ilə əlaqələndirən logistik reqressiya ilə modelləşdirilmişdir. Bu model üçün uyğunlaşdırılmış Markov zənciri Monte Karlo metodu müxtəlif nümunələr üzrə nisbi ifadə səviyyələrini çıxarmaq üçün hazırlanmışdır.

3.1 Model

Biz çoxlu təcrübələrdən iTRAQ məlumatları üçün modelin təsvirinə və zülalların nisbi ifadə səviyyələrinin qiymətləndirilməsinə diqqət yetiririk. iTRAQ məlumatları çoxsaylı eksperimentlərdən əldə edildikdə, [17] Bayes iyerarxik modelindən istifadə edir, o mənada ki, model müşahidə olunan peptid intensivliklərini şərti paylanması gözlənilən zülal ifadə səviyyələrindən və peptid təsirlərindən asılı olan təsadüfi təsirlər kimi modelləşdirən müşahidə komponentinə malikdir. , və bu gözlənilən dəyərlərin paylanmasını müəyyən edən ikinci (ierarxik) komponent.

Luo et al. [17], etiketləmə təsirlərinin kvantil normallaşdırma kimi normallaşdırma üsulları ilə aradan qaldırıldığı güman edilir. Fərz edək ki, var S (𢙒) bioloji nümunələr tədqiq edilmişdir K (𢙒) təcrübələr. Çoxsaylı izobar teqlər eyni nümunəni bir təcrübədə etiketləyə bildiyi üçün icazə verin Ls ≥ 1 etiketləyən teqlərin sayını göstərir s-ci nümunə. Sonra ∑s Ls = M bir təcrübədə istifadə olunan izobar teqlərin sayıdır, 4-pleksli izobar reagentlərdən istifadə etdikdə 4-ə, 8-pleksli versiyada isə 8-ə bərabərdir. Fərz edək ki, var I nümunədəki zülallar və Ji üçün peptidlər ici protein. Üçün lnin etiketi sci nümunə ktəcrübə edək ykijsln üçün ölçülmüş müşahidə intensivliyinin log çevrilmiş dəyərini qeyd edin jth peptid ici protein nci spektr. Qeyd edək ki j kimi daha uyğun işarələnməlidir j(i) peptidlərin zülalların içərisində yerləşdiyini açıq şəkildə göstərmək üçün və l kimi qeyd edilməlidir l(s) göstərmək üçün lnin etiketli etiketi sci nümunə. Qeydi sadələşdirmək üçün mötərizələri buraxırıq. Peptidin ölçülən intensivliyi zülal ifadə səviyyəsindən və peptid təsirindən asılıdır. Qoy xkisl nin log çevrilmiş ifadə səviyyəsini ifadə edir ith protein silə ci nümunə lci etiketləmə etiketi kci təcrübə. Qoy zkij üçün log çevrilmiş peptid təsirini ifadə edir jinci peptid ici protein kci təcrübə. Luo və başqaları. [17] üçün əlavə model hesab olunur ykijsln (k = 1, …, K i = 1, …, I j = 1, …, Ji s = 1, …, S l = 1, …, Ls n = 1, …, N.kijsl):

orijinal miqyasda multiplikativ modelə uyğundur. (3), εkijsln orta 0 və dispersiya ilə müstəqil olaraq normal paylandığı güman edilir σ ε 2 : ε k i j s l n

3.1.1 Çatışmayan məlumat mexanizmi

[17]-də peptid çatışmazlığı üçün statistik model, postnatal ürək-damar funksiyası üçün Caveolae rollarının öyrənilməsindən əldə edilən verilənlər bazası üzərində aparılan araşdırma ilə əsaslandırılmışdır. Bu tədqiqatda, iki vəhşi tipli siçan və iki nokautlu Cav-1 siçanının zülal profillərinin hər təcrübədə dörd izobar etiketi ilə iTRAQ tərəfindən təhlil edildiyi üç təcrübə aparıldı. Luo və başqaları. [17] bir təcrübədə müşahidə edilən, lakin başqa bir təcrübədə əskik olan peptidlərin nisbətini tədqiq etdi və itkin ehtimal ilə peptid intensivliyi arasında mənfi korrelyasiya olduğunu aşkar etdi. Başqa sözlə, daha az bol peptidlərin yox olma ehtimalı daha yüksəkdir, çünki təhlil prosesinin məlumatdan asılı əldə edilməsi səbəbindən onları aşkar etmək daha çətindir. Peptidin itkin ehtimalı ilə logit miqyasında müşahidə olunan intensivlik arasında təxmini xətti əlaqənin olduğunu müşahidə edərək, Luo et al. [17] sadə logistik reqressiya modeli vasitəsilə itkin ehtimalı modelləşdirdi:

harada Ikijsln = 1 göstərir ki jinci peptid ith protein ölçülür kci təcrübə, the lnin nüsxəsi sci nümunə və nci spektr. Formula (4) peptid çatışmazlığı ehtimalının məntiqinin onun intensivliyindən xətti asılı olduğunu nəzərdə tutur. Bu gözlənilir b > 0, çünki daha aşağı intensivliyə malik peptidlərin yox olma ehtimalı daha yüksəkdir.

3.1.2 Əvvəllər

[17]-dəki Bayes iyerarxik çərçivəsi təcrübələr və nümunələr üzrə dəyişkənlikləri nəzərə alır və belə hesab edir ki, xkislzkij müxtəlif təcrübələr arasında müstəqil olaraq normal paylanır, yəni:

harada xislzij müvafiq olaraq çoxlu təcrübələr üzərində orta hesablanmış protein və peptid təsirlərini ifadə edir. Eyni nümunənin müxtəlif replikalarında (müxtəlif etiketlərlə etiketlənmiş) zülal ifadə səviyyələrinin də normal paylandığı güman edilir:

harada xedir ifadə səviyyəsini bildirir ici protein sci nümunə. Fərziyyələr (5)–(7) (3)-in ekvivalent formasına gətirib çıxarır:

N ( 0 , σ x 2 ) və e k i j z

N ( 0 , σ z 2 ) təcrübələr arasında təsadüfi təsirləri ifadə edir və e i s l t

N ( 0 , σ δ 2 ) eyni nümunənin çoxsaylı təkrarları arasında dəyişikliyi ifadə edir. Nümunə eksperimentdə unikal izobar etiketi ilə etiketləndikdə, nümunə daxilində təkrar variasiya komponenti yoxdur. Formula (8) qarışıq effektli modeldir. Modelin identifikasiyasını təmin etmək üçün məhdudiyyət xi1 = 0 əlavə olunur. Sonra xedir ifadə səviyyəsini bildirir ici protein sbirinci nümunəyə nisbətən ci nümunə.

Prinsiplərin ikinci səviyyəsi normal paylamalardır xedirzij:

İerarxik model dispersiya hiperparametrləri üçün prioritetlər kimi tərs qamma paylanmalarını qəbul etməklə tamamlanır: σ x − 2

Qamma ( γ 7, γ 8), burada γ1 və γ2 müvafiq olaraq qamma paylanmasının forma və miqyaslı parametrlərini ifadə etmək və fərz etmək a

N.(0, ν 2 ). Müvafiq parametrlərin posterior paylanması MCMC simulyasiyaları ilə simulyasiya edilir və diferensial şəkildə ifadə olunan zülallar posterior paylanmasının təhlili ilə müəyyən edilir. xedir.

3.2 ANOVA analizi ilə müqayisə

[17]-dəki bu Bayesian modeli ilə Hill et al tərəfindən təklif olunan ANOVA modeli arasındakı ən əhəmiyyətli fərq. [7] və Oberg et al. [19] odur ki, [17] iTRAQ məlumatlarında nəzərə alınmayan çatışmazlıqları aydın şəkildə modelləşdirmişdir. Oberg və başqaları. [19] məqalələrinin sonunda modelə uyğunlaşdırmaq üçün senzura mexanizmindən istifadənin təbii növbəti addım olacağını qeyd etdi. Məlumatı naməlum hədd dəyərində senzura etmək əvəzinə, [17] daha aşağı peptid intensivliyi üçün peptid çatışmazlığının daha yüksək ehtimalını modelləşdirdi. Bu iki üsul modelə daxil olan variasiyalar baxımından da bir-birindən fərqlənir. Eksperimental effekt və replikativ effekt (birdən çox etiket nümunəni etiketlədikdə) ANOVA modelindəki bütün zülallar üçün sabitlər hesab olunur. Bunun əksinə olaraq, [17] onları peptidlərə və (və ya) zülallara xas olan təsadüfi təsirlər kimi modelləşdirdi. Bundan əlavə, ANOVA təhlili etiketləmə effekti və etiketləmə ilə eksperimental effekt arasında qarşılıqlı əlaqə kimi əlavə effektləri əhatə edir. gj(i),s[17]-də modelləşdirilməyən. Etiketləmə effektinin daxil edilməsi təcrübə dizaynı ilə müəyyən edilir. Bir neçə təcrübədə eyni nümunələri etiketləmək üçün eyni etiketlərdən istifadə edildikdə, seçmə effekti ilə qarışdırıldığı üçün etiketləmə effekti müəyyən edilə bilməz. Birdən çox təcrübədə eyni nümunələri etiketləmək üçün fərqli etiketlərdən istifadə edildikdə etiketləmə effektinin daxil edilməsi mənalıdır. Etiketləmə və eksperimental effekt arasında qarşılıqlı əlaqə üçün gj(i),s, nəzəri cəhətdən onun modeldə olması məqsədəuyğun olsa da, qiymətləndirmədə böyük qeyri-müəyyənlik mövcuddur. gj(i),s hər bir nümunə üçün təkrarların sayının az olması (və ya təkrarların olmaması) səbəbindən.

Həm Bayes metodunda, həm də ANOVA analizində ümumi fərziyyə ondan ibarətdir ki, bütün peptid əsaslı müşahidələr bütöv zülalları dəqiq əks etdirir. Biz eyni və qeyri-identifikasiya peptidlərini paylaşan iki və ya daha çox zülalla nəticələnən homoloji genlərin mümkünlüyünə, həmçinin transkripsiyadan sonrakı dəyişikliklərin mümkünlüyünə məhəl qoymuruq. Baxmayaraq ki, (1) peptid təsirləri və müalicə arasında qarşılıqlı əlaqə (gj(i),s), [19]-un təhlilində çıxarılır. Bu termin də [17]-yə daxil edilməyib. Beləliklə, həm [17], həm də [19] müəyyən zülalların müxtəlif müalicələr altında nümunələr arasında diferensial ifadələrə malik olacağını güman edirlər, lakin zülal ifadəsindəki hər hansı dəyişiklik həmin zülalın bütün peptidlərinə eyni dərəcədə təsir edəcək.

3.3 Kütləvi spektrometriya məlumatlarında təsadüfi olmayan çatışmazlıqlar

Kütləvi spektrometriya məlumatları üçün hədəflənən model (Vanq və digərləri [31] tərəfindən təklif edilmişdir) bu yarımbölmədə təsvir edilmiş iTRAQ məlumatları üçün uyğunlaşdırılmamışdır. Lakin iTRAQ məlumatları MS/MS vasitəsilə təcrid olunmuş peptidləri işlətməklə əldə edildiyi üçün bu ehtimal modeli iTRAQ-da itkinliyi öyrənmək üçün alternativ üsul təqdim edir. Wang və başqaları. [31] qlobal normallaşma yolu ilə əvvəlcə MS profilləri arasında sistematik variasiya mənbələrini aradan qaldırmağı, sonra isə intensivlikdən asılı itkinliyi araşdırmağı və buraxılmış peptid intensivliklərini təyin etməyi təklif etdi.

3.3.1 Qlobal normallaşma

Qlobal normallaşmalarında [31] seçmə intensivliklərinin hamısının seçiləcək sabit amillə əlaqəli olduğunu fərz etdilər. Kütləvi spektrometriya məlumatlarında təsadüfi olmayan çatışmazlıqlar səbəbindən mümkün qərəzliliyin qarşısını almaq üçün Wang et al. yuxarıdan istifadə etməyi təklif etdi L yenidən ölçmək üçün hər bir nümunədə peptid intensivliyinin sifarişli statistikası (məsələn, medianlar) L istifadəçi tərəfindən müəyyən edilmiş parametrdir. Qoy K (K > 2) MS profillərinin sayı olsun. Müşahidə olunan intensivlikləri qeyd edin k-ci profil Y ( k ) = ( y 1 ( k ) , y 2 ( k ) , … , y n k ( k ) ), burada nk -də müəyyən edilmiş peptidlərin sayıdır k-ci profil. Verilmiş nömrə üçün L ( L < min ( < n k >k = 1 K ) ), əhali medianı belə müəyyən edilir

və normallaşdırılması üçün miqyaslama əmsalı k-ci profildir

3.3.2 Təsadüfi olmayan çatışmazlıqlar və təxminlər

Təsadüfi olmayan itkinliyi izah etmək üçün Wang et al. [31] bir nümunədə buraxılmış peptid intensivliyini digər nümunədə müşahidə olunan intensivliyin nisbəti ilə hər iki nümunədə müşahidə edilən digər peptidlərin intensivliyindən təxmin edilən miqyas əmsalına bölünməsini təklif etmişdir. Fərz edək ki, alətin aşkar edilə bilən minimum səviyyəsidir d. X j ( k ) nin həqiqi bolluğu olsun j-də peptid k-müşahidə olunan qiymətə uyğun gələn y j ( k ) profili. Bir profildə peptid ola bilər və ya olmaya da bilər. z j ( k ) varlığını göstərən gizli dəyişən olsun j-də peptid k-ci profil, z j ( k ) = 1 ilə j-ci peptiddə mövcuddur k-ci profil, əks halda z j ( k ) = 0. Onda z j ( k ) = 0 olarsa x j ( k ) = 0 . z i ( k ) = 1 olduqda f j ( k ) x i ( k ) sıxlıq funksiyası olsun, bizdə

I 0 ( · ) P ( z j ( k ) = 0 ) + f j ( k ) ( · ) P ( z j ( k ) = 1 ),

harada I0(·) sıfırda nöqtə kütləsini göstərir. (12) ilə, Wang et al. [31] bir peptidin həqiqi bolluğunun qarışıq paylanmasına malik olduğunu fərz etdi. Ehtimal P ( z j ( k ) = 0 ) ilə peptid mövcud deyil k-ci profil və bolluq sıfırdır. P ( z j ( k ) = 1 ) ehtimalı ilə peptid mövcuddur və bolluğun paylanması f j ( k ) ilə təsvir olunur.

İntensivlik səviyyəsinin buraxılmış dəyəri j-də mövcud olan peptid k-ci profil gözlənilən E ( x j ( k ) | y j ( k ) = 0 ) ilə hesablanır və bu kimi hesablanır

burada birinci bərabərlik E ( x j ( k ) | y j ( k ) = 0 , z j ( k ) = 0 ) = 0 olması ilə bağlıdır , ikinci bərabərlik isə ona görədir ki , zaman j-ci peptiddə mövcuddur k-ci profil ( z j ( k ) = 1 ) , heç bir siqnal aşkarlanmaması ( y j ( k ) = 0 ) aşağı intensivliyə ( x j ( k ) < d ) ekvivalentdir . (13)-də E ( x j ( k ) | x j ( k ) < d , z j ( k ) = 1 ) termini f j ( k ) və d müəyyən edilir və P d ( z j ( k ) = 1 | y j ( k ) = 0 ), ehtimalı j-ci peptiddə mövcuddur k-ci profil heç bir siqnal aşkar edilmədikdə, kimi hesablana bilər

burada üçüncü bərabərlik yerinə yetirilir, çünki P d ( yj ( k ) = 0 | zj ( k ) = 1 ) = P d ( xj ( k ) < d | zj ( k ) = 1 ) və P d ( yj ( k ) ) = 0 | zj ( k ) = 0 ) = 1 . (14)-də P d ( x j ( k ) < d | z j ( k ) = 1 ) termini sonuncu təyin edildikdə f j ( k ) sıxlıq funksiyasından əldə edilə bilər və

Beləliklə, şərti sıxlıq f j ( k ) və d müəyyən edilərsə, buraxılmış peptid intensivliyi (13)–(15) ilə hesablana bilər.

Minimum alətin aşkar edilə bilən səviyyə parametri d kimi işarələnən eyni alətdən bütün MS xam profillərində fon səs-küy səviyyəsi ilə qiymətləndirilir. d ̂ . Sonra aşkar edilə bilən səviyyə k-ci profildir d ̃ (k) = d ̂ /λ (k), burada λ (k) (11)-dəki normallaşma şkalası əmsalıdır. Wang və başqaları. [31] fərz edin

üçün müstəqil k = 1, 2, …, K. Bu, z j ( k ) = 1 , f j ( k ) olduqda x j ( k ) sıxlıq funksiyasının olduğu fərziyyəsinə bərabərdir. N.(λ (k) μj, (λ (k) σj) 2). Xüsusi halda ki, σj ≪ | d ̃ (k) − μj| və bioloji replikasiyalar mövcuddur, Wang et al. [31] aşağıdakı kimi çatışmayan ehtimal P d ( z j ( k ) = 1 | y j ( k ) = 0 ) və hesablanmış E ( X j ( k ) | y j ( k ) = 0 ) üçün qiymətləndiricilər təqdim etmişdir:

Hesablanmış məlumatlar zülalların qiymətləndirilməsi, qruplaşdırılması və diferensial zülal identifikasiyası kimi əlavə təhlil üçün istifadə olunur.

Wang et al tərəfindən təklif olunan model. [31] Luo və digərlərinin təklif etdiyi Bayesian modelindən fərqlənir. [17] aşağıdakı üç yolla. Birincisi, [31]-də müəyyən səviyyədən aşağı intensivliklər senzuraya məruz qalır və senzura parametri [17]-də fon səs-küy səviyyələri əsasında təxmin edilir, itkin ehtimalı potensial həqiqi intensivliklə əlaqələndirmək üçün logistik reqressiya modeli qurulur. Daha az bol peptidlərin əskik olma ehtimalının daha çox olduğunu müşahidə etməklə, [17]-də əskik olma ehtimalını peptid intensivliyi ilə əlaqələndirən modelə əsaslanan itkin mexanizm [31]-dəki senzura mexanizmindən daha ağlabatandır. İkincisi, [31] tək dəyər hesablama aparır və buraxılmış intensivlikləri gözlənilən dəyərlərlə təyin edir, [17] isə çoxlu hesablama aparır və buraxılmış dəyərlərin posterior paylanmalarını simulyasiya edir. Üçüncüsü, [31] iTRAQ təhlili üçün uyğunlaşdırılmayıb və [31]-dəki ideyanı iTRAQ məlumatlarına tətbiq edərkən variasiya mənbələri silinməlidir. [31]-in gücü daha kiçik hesablama yükündədir. Sıxlıq f j ( k ) göstərildikdə, buraxılmış peptid intensivliyi (13) düsturundan əldə edilən gözlənilən dəyərlə asanlıqla hesablana bilər.


2. Proteomika

Müxtəlif proteomik strategiyaları ümumiləşdirmədən əvvəl (Şəkil 1), bir neçə məqamı vurğulamaq lazımdır 4:

Hazırda heç bir proteomik texnologiya məməli proteomunun bütün mürəkkəbliyini həll edə bilməz.

Hər hansı bir proteomik texnika ilə daha çox zülallara qarşı qərəz var.

Ümumiyyətlə, nə qədər zülalın müəyyən edilə biləcəyi və onların nə qədər dəqiq ölçülə biləcəyi arasında bir mübadilə var.

İstər-istəməz, kəmiyyət peptid məlumatının zülal dəyişikliklərinə yayılması ilə məlumat itirilir.

Proteomik metodların müqayisəsi

Qısaltma. Tam ad və izahat. Üstünlüklər. Mənfi cəhətləri.
DİGE Fərqli gel elektroforez Protein səviyyəsində kəmiyyət Aşağı həssaslıq
Posttranslational modifikasiyaların və protein izoformlarının vizuallaşdırılması Yalnız diferensial şəkildə ifadə olunan zülallar MS/MS tərəfindən müəyyən edilir
Yaxşı kəmiyyət dəqiqliyi Çox yüksək və ya aşağı pI və ya Mw olan zülallar geldə həll olunmur
Gel-LC-MS/MS LC-MS/MS analizindən əvvəl SDS–PAGE ilə ayırma İstifadə rahatlığı Prefraksiya MS/MS analizi üçün vaxt tələblərini artırır
LC-MS/MS analizindən əvvəl prefraksiya həssaslığı artırır Peptid etiketi olmayan mürəkkəb qarışıqlarda zəif kəmiyyət dəqiqliyi
Proteolitik deqradasiyanın göstəricisi kimi “Pilləkənlər” Çox yüksək və ya aşağı Mw olan zülallar geldə həll olunmur
SILAC Hüceyrə mədəniyyətində amin turşuları ilə sabit izotop etiketlənməsi Minimum eksperimental variasiya Peptid səviyyəsində kəmiyyət
Əla kəmiyyət dəqiqliyi Mədəniyyətdə çoxalmayan hüceyrələr, yəni kardiyomiyositlər üçün uyğun deyil
Süzgəcdən keçirilmiş serum əlavələrini çoxaldan və dözümlü olan mədəniyyət hüceyrələri üçün istifadə asanlığı Heyvanların metabolik etiketlənməsi bahalıdır
iTRAQ, TMT etiketləri Peptidlərin izotopik etiketlənməsi Yaxşı kəmiyyət dəqiqliyi Peptid səviyyəsində kəmiyyət
Toxumalar və hüceyrə kulturaları ilə birlikdə istifadə edilə bilər Qarışıq MS/MS spektrləri müxtəlif peptidlərdən reportyor ionları ehtiva edəcək
Qısaltma. Tam ad və izahat. Üstünlüklər. Mənfi cəhətləri.
DİGE Fərqli gel elektroforez Protein səviyyəsində kəmiyyət Aşağı həssaslıq
Posttranslational modifikasiyaların və protein izoformlarının vizuallaşdırılması Yalnız diferensial şəkildə ifadə olunan zülallar MS/MS tərəfindən müəyyən edilir
Yaxşı kəmiyyət dəqiqliyi Çox yüksək və ya aşağı pI və ya Mw olan zülallar geldə həll olunmur
Gel-LC-MS/MS LC-MS/MS analizindən əvvəl SDS–PAGE ilə ayırma İstifadə rahatlığı Prefraksiya MS/MS analizi üçün vaxt tələblərini artırır
LC-MS/MS analizindən əvvəl prefraksiya həssaslığı artırır Peptid etiketi olmayan mürəkkəb qarışıqlarda zəif kəmiyyət dəqiqliyi
Proteolitik deqradasiyanın göstəricisi kimi “Pilləkənlər” Çox yüksək və ya aşağı Mw olan zülallar geldə həll olunmur
SILAC Hüceyrə mədəniyyətində amin turşuları ilə sabit izotop etiketlənməsi Minimum eksperimental variasiya Peptid səviyyəsində kəmiyyətin təyini
Əla kəmiyyət dəqiqliyi Mədəniyyətdə çoxalmayan hüceyrələr, yəni kardiyomiyositlər üçün uyğun deyil
Süzgəcdən keçirilmiş serum əlavələrini çoxaldan və dözümlü olan mədəniyyət hüceyrələri üçün istifadə asanlığı Heyvanların metabolik etiketlənməsi bahalıdır
iTRAQ, TMT etiketləri Peptidlərin izotopik etiketlənməsi Yaxşı kəmiyyət dəqiqliyi Peptid səviyyəsində kəmiyyət
Toxumalar və hüceyrə kulturaları ilə birlikdə istifadə edilə bilər Qarışıq MS/MS spektrləri müxtəlif peptidlərdən reportyor ionları ehtiva edəcək

Proteomik metodların müqayisəsi

Qısaltma. Tam ad və izahat. Üstünlüklər. Mənfi cəhətləri.
DİGE Fərqli gel elektroforez Protein səviyyəsində kəmiyyət Aşağı həssaslıq
Posttranslational modifikasiyaların və protein izoformlarının vizuallaşdırılması Yalnız diferensial şəkildə ifadə olunan zülallar MS/MS tərəfindən müəyyən edilir
Yaxşı kəmiyyət dəqiqliyi Çox yüksək və ya aşağı pI və ya Mw olan zülallar geldə həll olunmur
Gel-LC-MS/MS LC-MS/MS analizindən əvvəl SDS–PAGE ilə ayırma İstifadə rahatlığı Prefraksiya MS/MS analizi üçün vaxt tələblərini artırır
LC-MS/MS analizindən əvvəl prefraksiya həssaslığı artırır Peptid etiketi olmayan mürəkkəb qarışıqlarda zəif kəmiyyət dəqiqliyi
Proteolitik deqradasiyanın göstəricisi kimi “Pilləkənlər” Çox yüksək və ya aşağı Mw olan zülallar geldə həll olunmur
SILAC Hüceyrə mədəniyyətində amin turşuları ilə sabit izotop etiketlənməsi Minimum eksperimental variasiya Peptid səviyyəsində kəmiyyətin təyini
Əla kəmiyyət dəqiqliyi Mədəniyyətdə çoxalmayan hüceyrələr, yəni kardiyomiyositlər üçün uyğun deyil
Süzgəcdən keçirilmiş serum əlavələrini çoxaldan və dözümlü olan mədəniyyət hüceyrələri üçün istifadə asanlığı Heyvanların metabolik etiketlənməsi bahalıdır
iTRAQ, TMT etiketləri Peptidlərin izotopik etiketlənməsi Yaxşı kəmiyyət dəqiqliyi Peptid səviyyəsində kəmiyyətin təyini
Hüceyrə kulturaları ilə yanaşı toxumalarla da istifadə oluna bilər Qarışıq MS/MS spektrləri müxtəlif peptidlərdən reportyor ionları ehtiva edəcək
Qısaltma. Tam ad və izahat. Üstünlüklər. Mənfi cəhətləri.
DİGE Fərqli gel elektroforez Protein səviyyəsində kəmiyyət Aşağı həssaslıq
Posttranslational modifikasiyaların və protein izoformalarının vizuallaşdırılması Yalnız diferensial şəkildə ifadə olunan zülallar MS/MS tərəfindən müəyyən edilir
Yaxşı kəmiyyət dəqiqliyi Çox yüksək və ya aşağı pI və ya Mw olan zülallar geldə həll olunmur
Gel-LC-MS/MS LC-MS/MS analizindən əvvəl SDS–PAGE ilə ayırma İstifadə rahatlığı Prefraksiya MS/MS analizi üçün vaxt tələblərini artırır
LC-MS/MS analizindən əvvəl prefraksiya həssaslığı artırır Peptid etiketi olmayan mürəkkəb qarışıqlarda zəif kəmiyyət dəqiqliyi
Proteolitik deqradasiyanın göstəricisi kimi “Pilləkənlər” Çox yüksək və ya aşağı Mw olan zülallar geldə həll olunmur
SILAC Hüceyrə mədəniyyətində amin turşuları ilə sabit izotop etiketlənməsi Minimum eksperimental variasiya Peptid səviyyəsində kəmiyyət
Əla kəmiyyət dəqiqliyi Mədəniyyətdə çoxalmayan hüceyrələr, yəni kardiyomiyositlər üçün uyğun deyil
Süzgəcdən keçirilmiş serum əlavələrini çoxaldan və dözümlü olan mədəniyyət hüceyrələri üçün istifadə asanlığı Heyvanların metabolik etiketlənməsi bahalıdır
iTRAQ, TMT etiketləri Peptidlərin izotopik etiketlənməsi Yaxşı kəmiyyət dəqiqliyi Peptid səviyyəsində kəmiyyət
Toxumalar və hüceyrə kulturaları ilə birlikdə istifadə edilə bilər Qarışıq MS/MS spektrləri müxtəlif peptidlərdən reportyor ionları ehtiva edəcək

Proteomik yanaşmalar. Protein ekstraktları həzmdən əvvəl protein səviyyəsində və ya peptid səviyyəsində protein həzmindən sonra fraksiyalaşdırıla bilər. DIGE-də zülal ekstraktları 2-DE ilə ayrılmazdan əvvəl müxtəlif flüoresan boyalarla etiketlənir. SILAC üçün hüceyrələr ağır və ya yüngül amin turşularının daxil edilməsi ilə mədəniyyətdə metabolik olaraq etiketlənir. Alternativ olaraq, etiketləmə peptid səviyyəsində iTRAQ və ya TMT izobar etiketlərindən istifadə etməklə həyata keçirilir. Sonra peptidlər MS/MS tərəfindən təhlil edilir. 2-DE, ikiölçülü gel elektroforezi DIGE, fərq gel elektroforezi 1-DE, birölçülü gel elektroforezi SILAC, hüceyrə kulturasında amin turşuları ilə stabil izotop etiketi AA, amin turşusu iTRAQ, nisbi və mütləq kəmiyyət təyini üçün izobar etiketi TMT, tandem kütləvi etiket.

Proteomik yanaşmalar. Protein ekstraktları həzmdən əvvəl protein səviyyəsində və ya peptid səviyyəsində protein həzmindən sonra fraksiyalaşdırıla bilər. DIGE-də zülal ekstraktları 2-DE ilə ayrılmazdan əvvəl müxtəlif flüoresan boyalarla etiketlənir. SILAC üçün hüceyrələr ağır və ya yüngül amin turşularının daxil edilməsi ilə mədəniyyətdə metabolik olaraq etiketlənir. Alternativ olaraq, etiketləmə peptid səviyyəsində iTRAQ və ya TMT izobar etiketlərindən istifadə etməklə həyata keçirilir. Sonra peptidlər MS/MS tərəfindən təhlil edilir. 2-DE, ikiölçülü gel elektroforezi DIGE, fərq gel elektroforezi 1-DE, birölçülü gel elektroforezi SILAC, hüceyrə kulturasında amin turşuları ilə stabil izotop etiketi AA, amin turşusu iTRAQ, nisbi və mütləq kəmiyyət təyini üçün izobar etiketi TMT, tandem kütləvi etiket.

2.1 İki ölçülü gel elektroforezi

İki ölçülü gel elektroforezi (2-DE) zülalların izoelektrik nöqtəsi (pI) və molekulyar çəkisi (Mw) əsasında ayrılmasına imkan verir. 5 Birinci ölçü zülalların pI-yə görə ayrılmasını nəzərdə tutur. Zülal qarışığı immobilizasiya edilmiş pH gradienti olan bir zolağa yüklənir. Elektrik sahəsi tətbiq edildikdən sonra zülallar öz pI-lərinə köçürlər, burada zvitterion olurlar, yəni xalis yüklərini itirirlər və miqrasiyanı dayandırırlar (izoelektrik fokuslanma). İzoelektrik fokuslama tamamlandıqdan sonra, immobilizasiya olunmuş pH qradiyenti zolaqları ikinci ölçüdə ayrılmaq üçün geniş formatlı gellərə köçürülür, burada zülallar molekulyar kütlələrinə görə SDS-PAGE vasitəsilə həll olunur.

SDS–PAGE-dən fərqli olaraq, 2-DE gelləri proteomların kompleks xəritələrini yaradır və onlar diskret zülal “nöqtələri” kimi vizuallaşdırılır. pI və Mw müstəqil xüsusiyyətlər olduğundan, 2-DE gelləri SDS-PAGE-dən daha çox zülal həll edə bilər. Əhəmiyyətli odur ki, eyni zülal bir geldə bir neçə ləkədə ola bilər. pI və ya Mw-də dəyişikliklər post-translational modifikasiyaların, zülalların deqradasiyasının və ya protein izoformlarının mövcudluğunu göstərir. 6, 7 Zülal xüsusiyyətləri Coomassie və ya gümüş rəngləmə ilə vizuallaşdırılır və nümunələr arasında diferensial ifadə nisbi densitometrik kəmiyyət təyini ilə müəyyən edilir. Bununla belə, geldən gelə dəyişkənlik kəmiyyət dəqiqliyini məhdudlaşdıra və ifadədə kiçik fərqlərin aşkar edilməsini qadağan edə bilər.

Daha mürəkkəb 2-DE texnikası fərqli gel elektroforezidir (DIGE, Şəkil 2A). 8 DIGE, zülal ifadəsində nisbi fərqləri müəyyən etmək üçün zülal qarışıqlarının Cy-boyalarla flüoresan etiketlənməsini nəzərdə tutur. Birləşdirilmiş eksperimental nümunələrdən ibarət daxili standart bütün nümunələri təmsil edir. DIGE-nin aşkarlanmasının həssaslığı gümüşün boyanmasının 9 həssaslığı ilə müqayisə edilə bilər və boyalar pI və Mw üçün uyğunlaşdırılır. DIGE-nin adi 2-DE gelləri ilə müqayisədə əsas üstünlüyü ondan ibarətdir ki, nümunələr eyni geldə multipleksləşdirilə bilər, beləliklə, tələb olunan gellərin sayını azaldır və eksperimental variasiyanı məhdudlaşdırır. Daxili standartla istifadə edilən DIGE protein ifadəsində 10%-ə qədər olan fərqləri etibarlı şəkildə müəyyən edir. 10 Gellər xüsusi olaraq hər bir Cy-boyanın emissiya dalğa uzunluğunu ölçən flüoresan skanerdən istifadə edərək skan edilir. Kommersiya proqram paketləri protein xüsusiyyətlərinə uyğun gəlir və skan edilmiş gel şəkillərindən diferensial ifadəni hesablayır. Gellər arasında zülal səviyyələrinin normallaşdırılması protein nisbətlərini hər bir geldə birgə aşkar edilən daxili standartla müqayisə etməklə həyata keçirilir.

Gel əsaslı proteomika. Sıçan ürək proteomunun DIGE ilə müxtəlif immobilizasiya olunmuş pH gradientlərində ayrılması: pH 3-10 NL (A) və pH 4-7 (B). Ağ qutu dar pH gradientində eyni sahənin daha yaxşı həllini vurğulayır. (C) SDS–PAGE ilə altı hüceyrədənkənar qlikoproteinin Mw paylanması. Normal aorta toxuması (CON) ilə müqayisədə abdominal aorta anevrizmalarında (AAA) xarakterik “nərdivan” proteolizin göstəricisidir. Spektral saylardakı fərqlər rəng kodludur (qırmızı yüksək, mavi aşağı). (D) Sağlam aorta toxumalarının matriks metalloproteinaza-12 (MMP-12) ilə inkubasiyası, AAA-da müşahidə edildiyi kimi fibronektinin oxşar parçalanma modelinə səbəb oldu. Müqayisə üçün, matris metalloproteinazaları-9 (MMP-9) tərəfindən deqradasiya daha az ifadə edildi (Didangelosun icazəsi ilə təkrarlandı). və b. 15 ).

Gel əsaslı proteomika. Sıçan ürək proteomunun DIGE ilə müxtəlif immobilizasiya olunmuş pH gradientlərində ayrılması: pH 3-10 NL (A) və pH 4-7 (B). Ağ qutu dar pH gradientində eyni sahənin daha yaxşı həllini vurğulayır. (C) SDS–PAGE ilə altı hüceyrədənkənar qlikoproteinin Mw paylanması. Normal aorta toxuması (CON) ilə müqayisədə abdominal aorta anevrizmalarında (AAA) xarakterik “nərdivan” proteolizin göstəricisidir. Spektral saylardakı fərqlər rəng kodludur (qırmızı yüksək, mavi aşağı). (D) Sağlam aorta toxumalarının matriks metalloproteinaza-12 (MMP-12) ilə inkubasiyası, AAA-da müşahidə edildiyi kimi fibronektinin oxşar parçalanma modelinə səbəb oldu. Müqayisə üçün, matris metalloproteinazaları-9 (MMP-9) tərəfindən deqradasiya daha az ifadə edildi (Didangelosun icazəsi ilə təkrarlandı). və b. 15 ).

Digər proteomik üsullardan fərqli olaraq, 2-DE ilə kəmiyyət müəyyənləşdirmə peptid səviyyəsində deyil, zülal səviyyəsində həyata keçirilir və kəmiyyət təyini kütləvi spektrometriya (MS) ilə identifikasiyadan ayrılır. Gümüş rəngləmə MS üçün müvafiq ləkələrin kəsilməsini asanlaşdırmaq üçün gel üzərində protein xüsusiyyətlərini vizuallaşdırmaq üçün istifadə edilə bilər. Alternativ olaraq, ləkələr robotik ləkə seçicidən istifadə edərək birbaşa floresan gellərdən seçilir. Ləkələr daha sonra zülal identifikasiyasından əvvəl geldaxili triptik həzmə məruz qalır.

2-DE yanaşmasının əsas xəbərdarlıqlarından biri yüksək bol zülalların az bol zülalları maskalamasıdır. Bu, dar pH diapazonuna malik gradientlərdən istifadə etməklə qismən həll edilə bilər (Şəkil 2B). Bununla belə, birinci ölçüdə ayrılma, xüsusilə birinci ölçüdən ikinci ölçüyə keçid itkisiz deyil və çox böyük, kiçik və hidrofobik zülalların həlli çətin olaraq qalır.

2.2 Maye-xromatoqrafiya tandem kütlə spektrometriyası

Maye-xromatoqrafiya tandem kütlə spektrometriyası (LC-MS/MS) proteomikada mövcud qızıl standartdır. MS-nin əsas prinsipi kütlə-yük nisbətinin ölçülməsini əhatə edir (m/z) ionlaşmış peptid və onun parçalanma məhsulları. Proteinlər ilkin olaraq tripsin kimi fermentlər tərəfindən həzm olunur, peptid fraqmentləri əmələ gəlir ki, onları tərs fazalı LC ilə həll etmək və elektrosprey MS ilə ionlaşdırmaq daha asandır. 11 Hidrofobikliyindən asılı olaraq, peptidlər əks faza sütunundan fərqli vaxt nöqtələrində (tutma müddəti) ayrılır. LC-MS/MS-dən istifadə edən tipik iş axını, süzülən peptidlərin kütlələrini və intensivliyini qeyd etmək üçün müntəzəm sorğu taramasını əhatə edir. Sütundan ayrılan ən bol prekursor ionları parçalanma üçün seçilir (MS/MS). MS/MS məlumatlarından əldə edilən amin turşusu ardıcıllığı məlumatı zülalın identifikasiyasına imkan verir. Spektral saylar, ion intensivliyi və xromatoqrafik pik sahəsi kimi peptid parametrləri zülal bolluğu üçün kəmiyyət indeksini təmin edə bilər (etiketsiz kəmiyyət). 12 Kütləvi spektrometrik texnologiyanın çox yönlü olması MALDI-TOF-TOF, Q-TOF və Orbitrap kütlə analizatorları 13 olmaqla çoxsaylı müxtəlif kütlə spektrometrlərinin yaranmasına səbəb olmuşdur.

2.3 Gel-LC-MS/MS analizi

MS-dən əvvəl SDS-PAGE ilə əvvəlcədən fraksiyalaşdırma 2-DE ilə ayrıla bilməyən nümunələrin xarakteristikasında faydalı olduğunu sübut etdi. O, həmçinin az miqdarda zülallara qarşı qərəzliliyin yeganə ən böyük səbəbini - yüksək bol peptidlərin kütləvi spektrometrin iş dövründə üstünlük təşkil etməsi səbəbindən yaranan az bol peptidlərin nümunə götürülməsi zamanı yaranan stoxastik problemi aradan qaldırmağa kömək edir. Gel-LC-MS/MS analizi üçün zülallar SDS–PAGE ilə ayrılır, bütün gel zolağı bir sıra zolaqlara bölünür, bantlar boş gel parçaları buraxmadan kəsilir, tripsinlə həzm olunur və LC-MS/ Bantların hər birində MS analizi aparılır. 14, 15 Gel zolaqları zülalların qarışığı olduğundan, LC-nin ayrılması zülalın identifikasiyası və kəmiyyəti üçün vacibdir, yəni spektral hesablama ilə. 16 Spektral hesablama nisbi zülal bolluğunun kəmiyyətini təyin etmək üçün məşhur strategiya halına gəldi, lakin mürəkkəb qarışıqlar üçün daha az etibarlıdır. Ümumiyyətlə, zülal nə qədər çox olarsa, MS/MS tərəfindən bir o qədər çox aşkar edilir. Spektral saylar müəyyən bir zülala uyğun gələn MS/MS spektrlərinin sayından əldə edilir.

Gel-LC-MS/MS yanaşmasında zülalın yerli Mw-u haqqında məlumat saxlanılır. Əgər zülalın parçalanması triptik həzmdən əvvəl baş veribsə, peptidlər yerli zülalların gözlənilən Mw-dan aşağı olan gel seqmentlərində MS tərəfindən aşkar edilir (Şəkil 2C). Beləliklə, diferensial şəkildə ifadə olunan zülalların eyni gel zolaqları ilə məhdudlaşıb-məhdudlaşdırılmaması ilə bağlı yoxlama vacibdir. Əks halda, deqradasiyaya uğramış zülal SDS-PAGE-də xarakterik “nərdivanlara” görə yuxarı tənzimlənmiş görünə bilər (Şəkil 2D). Alternativ olaraq, zülal fraqmentləri çox kiçik ola bilər və aşkarlanmadan qaça bilər, çünki onlar bufer cəbhəsindən irəliləmişlər. Digər tərəfdən, proteolitik parçalanma məhsulları haqqında məlumat vacibdir və zülal səviyyəsində əvvəlcədən ayrılmadan triptik peptidləri təhlil edən adi ov tüfəngi proteomikasında itirilir.

2.4 Ov tüfənginin proteomikası

Gel əsaslı yanaşmalardan başqa, peptid bolluğuna əsaslanan protein ifadəsindəki fərqləri ölçmək üçün gelsiz üsullar mövcuddur. Bu ov tüfəngi proteomik üsulları proteoma daha dərindən mina edə bilsə də, nümunələr çox mürəkkəb olarsa, kəmiyyətin müəyyən edilməsi ilə bağlı problemlər yaranır. İonlaşma səmərəliliyindəki fərqlərə görə MS mahiyyətcə kəmiyyət deyil. Ən çox olan ionlar elektrosprey ionlaşması zamanı ən çox yükləri cəlb edəcək və aşağı səviyyəli peptidlərin ionlaşma ehtimalını azaldır. Yüksək bol peptidlərin birgə salınması nəticəsində yalan-müsbət zülal dəyişikliklərinin qarşısını almaq üçün etibarlı kəmiyyət üçün etiketləmə üsullarından istifadə edilməlidir. Populyar etiketləmə üsullarına nisbi və mütləq kəmiyyət təyini üçün izobarik işarələmə (iTRAQ), tandem kütlə etiketləri (TMT) və hüceyrə mədəniyyətində amin turşuları ilə sabit izotopların etiketlənməsi (SILAC) daxildir. 17 iTRAQ hal-hazırda dörd-pleks və səkkiz-plex olaraq mövcuddur və səkkizə qədər nümunənin nisbi kəmiyyətini müəyyən etməyə imkan verir, halbuki TMT və SILAC-ın etiketlənməsi müvafiq olaraq altı və üç nümunə ilə istifadə edilə bilər. 18 Bununla belə, peptidlər sadəcə surroqat ölçüdür və zülalların miqdarının təyini üçün həmişə etibarlı deyildir, məsələn, əgər onlar post-translational modifikasiyalara və ya proteolizə məruz qalırlarsa.

2.4.1 Hüceyrə kulturasında amin turşuları ilə stabil izotop etiketlənməsi

SILAC zülalları yüngül (məsələn, 12 C) və ağır izotoplarla (məsələn, 13 C) etiketləmək üçün radioaktiv olmayan izotop etiketlərindən istifadə edir. 18 Nümunələr eyni MS əməliyyatı zamanı multipleksləşdirilə və təhlil edilə bilər, bununla da eksperimental xətanı minimuma endirmək olar. 19 SILAC cütləri xromatoqrafiya zamanı birgə elüsiyaya məruz qalır, lakin ağır və yüngül izoformun müvafiq peptidləri xarakterik kütlə sürüşməsi ilə görünür. Hər bir zülalın nisbi miqdarı SILAC ilə işarələnmiş peptidlərin pik intensivliyindəki fərqlərlə hesablana bilər. Zülalların diferensial səviyyələrini ölçmək üçün SILAC-ın istifadəsi mədəniyyətdə hüceyrələrin istifadəsindən kənara çıxır. SILAC ilə etiketlənmiş siçanlar bütün zülalların demək olar ki, tam etiketlənməsi ilə təsvir edilmişdir, baxmayaraq ki, SILAC pəhrizi bahalıdır. 20 Metabolik etiketləmə həmçinin amin turşularının sintezi və alınması, zülalların yığılması və dövriyyənin kinetikası haqqında məlumatları təqdim edir.

2.4.2 Nisbi və mütləq kəmiyyət/tandem kütlə etiketləri üçün izobarik işarələmə

İnsan toxumasının istifadə edildiyi hallarda, iTRAQ və ya TMT LC-MS/MS tərəfindən diferensial ifadə tədqiqatları üçün klinik nümunələrin multipleksləşdirilməsi üçün seçimdir, 21, lakin bu üsullar xəbərdarlıqsız deyil. 22 (i) iTRAQ və TMT sisteminin SILAC ilə müqayisədə bir dezavantajı etiketləmənin peptid səviyyəsində həyata keçirilməsi və eksperimental prosesdə gec baş verməsidir.Etiketləmədən əvvəl zülallar əvvəlcə hüceyrələrdən və ya toxumalardan çıxarılır və peptidlərə həzm olunur. Bu, potensial dəyişkənlik mənbəyidir. (ii) SILAC-dan fərqli olaraq, kəmiyyət təyini MS səviyyəsində deyil, MS/MS səviyyəsində aparılır. Müxtəlif nümunələrdən alınan peptidlər eyniliyini saxlayır m/z etiketləmədən sonra nisbətlər (MS). Yalnız parçalanma (MS/MS) zamanı izobar kütlə etiketləri hər bir teq üçün bir izotopik əvəzetmə ilə müxtəlif reportyor ionlarını buraxır və hər bir fərdi nümunə üçün kəmiyyət məlumatı verir. iTRAQ eksperimentlərində tez-tez müşahidə olunan problem mürəkkəb fonun zülal qatının dəyişməsinin düzgün qiymətləndirilməməsinə səbəb ola bilməsidir. Prekursor ion seçimi zamanı parçalanma üçün seçilmiş kütlə pəncərəsində birdən çox peptid ola bilər. Belə qarışıq MS/MS spektrlərində müxtəlif zülalların peptidlərindən yaranan reportyor ionları kəmiyyətin müəyyən edilməsi üçün səhv olaraq birləşdirilir.

2.5 Zülalın identifikasiyası

“-omics” sahələrinin hər biri üçün dəqiq və əlçatan verilənlər bazalarına ehtiyac olsa da, proteomika bəlkə də bu resurslardan ən çox asılıdır. Zülalların identifikasiyası və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi texnologiyaları zülalların identifikasiyası və peptidlərin miqdarının müəyyən edilməsi üçün hərtərəfli məlumat bazalarına əsaslanır. Bu verilənlər bazaları bilavasitə sistem biologiyasının əhatə dairəsinə daxil deyil, lakin onlar sonuncu təhlillər üçün əsas yaradır, çünki bu verilənlər bazalarının saxlanması və saxlanması araşdırılan zülalların düzgün müəyyən edilməsi və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün çox vacibdir.

Funksional və ardıcıllığa əsaslanan verilənlər bazaları üçün UniProt ən əhatəli verilənlər bazalarından biridir. UniProt bir neçə təsnifatdan ibarətdir: Swiss-Prot və TrEMBL zülallar haqqında ardıcıllıq və funksional məlumatı, UniRef və UniParc ardıcıllığı və arxivləşdirilmiş ardıcıllıq qeydlərini və mövcud olduqda ədəbiyyat istinadları və çarpaz istinad verilənlər bazası kimi dəstəkləyici məlumatları ehtiva edir. 23 Mascot, SEQUEST və ya X!Tandem kimi proqramlar UniProt kimi ictimai verilənlər bazalarından əldə edilən FASTA zülal ardıcıllıqlarını axtarır. ' yerinə yetirdikdən sonrasilisiumda məlum ferment spesifikliyi ilə parçalanma, intensivliyi olan pik kütlə siyahıları (eksperimental məlumatlar) silisiumda-parçalanmış verilənlər bazası. Ana ion kütlələri verilənlər bazası ardıcıllığından əldə edilən kütlələrə qarşı skan edilir. Müəyyən bir kütləvi dözümlülük daxilində uyğunluq varsa, müşahidə olunan MS/MS spektrləri daha sonra nəzəri ardıcıllıqla əldə edilən ion seriyaları ilə müqayisə edilir. Burada açıq şəkildə əhatə olunmasa da, Noble və MacCoss 24-ün icmalı və şərhi bu metodologiyalar və texnikalar haqqında məlumat verir. Qiymətləndirmə alqoritmləri fərqli nəticələr verə bilər və geniş miqyaslı məlumat dəstlərində tək peptidli identifikasiyalara etibar yanlış identifikasiyaların potensial səbəbidir. Əksər proteomik tədqiqatlar yalnız ən azı iki unikal peptid olan identifikasiyaları bildirir və ya tək peptid identifikasiyası üçün MS/MS spektrlərini ehtiva edir.


Metodlar

Bitki materialı və nümunə götürmə

Bu tədqiqatda elit Çin qarğıdalı sortundan Denghai 661 (DH351/DH372) istifadə edilmişdir. Toxum Shandong Denghai Seeds Co., Ltd.-dən (Laizhou, Çin) əldə edilmişdir. Bitkilər qarğıdalı yetişdirmə mövsümündə Şandun Kənd Təsərrüfatı Universitetinin eksperimental fermasında yetişdirilib, Taian (36°10′E, 117°04′N), Çin. Eyni gündə çiçək açan bitkilər etiketlənərək süni şəkildə öz-özünə tozlandı. 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40 və 50 DAP-ın hər mərhələsində doqquz qulaq toplandı. Materialın vahidliyini artırmaq üçün hər sünbülün orta hissəsindən mayalanmış taxıllardan nümunə götürüldü. Hər bir mərhələ üçün, üç kobuktan bərabər sayda taxıl qarışdırılaraq üç nümunə hazırlanmışdır, nümunələr zülal çıxarılmasına qədər dərhal -80 °C-də saxlanılmışdır. Hər taxıl mərhələsində təzə çəki və quru çəki ölçülür. Daha əvvəl təsvir olunduğu kimi, ümumi nişastanın miqdarını və endosperm hüceyrələrinin sayını təyin etmək üçün müvafiq olaraq 10-50 DAP və 3-30 DAP olan taxıllar toplanmışdır [83].

Protein çıxarılması

Taxıl nümunələri məhluldan istifadə edərək maye azotda incə toz halına salındı ​​və toz 10% (h/v) trixloroasetik turşusu (TCA) olan əvvəlcədən soyudulmuş asetonda (−20 °C) 10 qat həcmdə dayandırıldı. Sonra homogenat hərtərəfli qarışdırıldıqdan sonra 2 saat ərzində -20 °C-də çökdürüldü. Sonra homogenat 20.000-də 30 dəqiqə sentrifuqa edildi g 4 ° C-də və supernatant diqqətlə çıxarıldı, qranul üç dəfə soyuq aseton ilə yuyuldu, 30 dəqiqə -20 ° C-də qaldı və sonra 20.000-də sentrifuqa edildi. g 4 ° C-də 30 dəqiqə. Nəticədə qranullar 8 M karbamid, 30 mM HEPES, 1 mM polivinilpolipirolidon (PMSF), 2 mM EDTA və 10 mM ditiotreitol (DTT) olan lizis tamponunda həll edildi və sonra 5 dəqiqə ərzində ultrasəs edildi. Həll edilmiş protein ekstraktı 20.000-də sentrifuqa edilmişdir g 4 °C-də 30 dəqiqə, supernatant toplandı və 10 mM DTT ilə 56 °C-də 1 saat azaldıldı və sonra qaranlıqda 1 saat ərzində 55 mM yodoasetamid (IAM) ilə alkilləşdirildi. Qarışıq 3 saat ərzində -20 °C-də 5 qat həcmdə soyuq asetonla çökdürüldü, sonra 20.000-də sentrifuqa edildi. g 30 dəq. Nəticə qranul 0,1 % SDS ilə 0,5 M trietilamonium bikarbonat (TEAB) tamponunda həll edildi, 5 dəqiqə ultrasonikləşdirildi və 20,000-də sentrifuqa edildi. g 30 dəq. Supernatant maye həzm üçün istifadə edildi və zülal konsentrasiyası standart olaraq BSA ilə Bradford analizindən (Bio-Rad, Hercules, CA, ABŞ) istifadə edilərək təyin edildi.

Məhlulun həzmində və iTRAQ etiketində

Hər bir nümunə üçün 3,3 μL tripsin (1 μg/μL) (Promega, Madison, WI, ABŞ) TEAB tamponunda 100 μg proteinə əlavə edildi və zülallar 37 °C-də 24 saat ərzində həzm olundu. Təzə bir alikot tripsin (1 μL) əlavə edildi və nümunə 12 saat ərzində yenidən həzm olundu. Çöküntü 30 μL 0,5 M TEAB-da həll edildi və 70 μL izopropanol ilə qarışdırıldı. Daha sonra həzm olunan peptidlər istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq iTRAQ reagentləri (AB SCIEX, Framingham, MA, ABŞ) ilə etiketləndi. 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40 və 50 DAP-dan alınmış taxıl nümunələri müvafiq olaraq iTRAQ reagentləri 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 və 121 ilə etiketlənmişdir. Üç müstəqil bioloji təcrübə aparıldı.

SCX və LC-MS/MS

Birləşdirilmiş peptidlər güclü kation mübadiləsində (SCX) A tamponunda (10 mM kalium fosfat monobazik (KH)) həll edildi.2PO4) 25% asetonitrildə, pH 2.8). Qarışıq fosfor turşusu istifadə edərək pH 3-ə uyğunlaşdırıldı və sonra silisium əsaslı SCX sütunu (250 × 4,6 mm, 5 μm, 100) ilə təchiz olunmuş yüksək performanslı maye xromatoqrafiya (HPLC) sistemindən (Shimadzu, Kyoto, Yaponiya) istifadə edərək fraksiyalaşdırıldı. Å, Phenomenex, Torrance, CA, ABŞ). Ümumilikdə, 36 fraksiya bufer B (10 mM KH) ilə 1 ml/dəq axın sürətində toplandı.2PO4 və 25% asetonitrildə 2 M kalium xlorid (KCl), pH 2.8) aşağıdakı gradientlə: 45 dəqiqə üçün 0 %, 1 dəqiqə üçün 0-5 %, 20 dəqiqə üçün 5–30 %, 5 dəqiqə üçün 30–50 % və 5 dəqiqə və 50-100 % 5 dəqiqə saxlanılır və 10 dəqiqə saxlanılır. Fraksiyalar istehsalçının göstərişlərinə əsasən təbəqə-X 33 μm PolyRevStage SPE (Phenomenex) ilə duzsuzlaşdırıldı və mərkəzdənqaçma sürəti ilə vakuum konsentratorunda liyofilləşdirildi. Sonra, hər bir qurudulmuş fraksiya borusuna 30 μL 0,1% qarışqa turşusu əlavə edildi və MALDI-TOF sınağı üçün Anchor-çip lövhəsinin hədəf quyusunda 0,1 μL yenidən həll olunmuş məhlul tapıldı. MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Almaniya) testindən sonra 36 fraksiya pik sahəsinə uyğun olaraq 16 son fraksiyaya birləşdirildi.

Kütləvi spektrometriya analizi Q-Exactive kütlə spektrometrinə (Thermo Fisher Scientific, MA, ABŞ) qoşulmuş Dionex Ultimate 3000 Nano LC sistemində aparılmışdır. Peptid qarışıqları Acclaim PePmap C18 tərs faza sütununa (75 μm × 2 sm, 3 μm, 100 Å, Thermo Scientific) yükləndi və əks fazalı C18 sütunu (75 μm × 10 sm, 5 μm, 30) ilə ayrıldı. , Agela Technologies) 300 nL/dəq axın sürətində 45 dəqiqə ərzində 0,1 % qarışqa turşusunda 5-80 % (h/v) asetonitrildən istifadə etməklə. Həlledici A suda 0,1% qarışqa turşusu idi. Tam kütləvi spektrometriya (MS) skanı (350-2000 m/z) müsbət ion rejimində 70.000 (200 m/z-də), AGC hədəf dəyəri 3-6, maksimum ion yığılma vaxtı ilə əldə edilmişdir. 50 ms, skan diapazonlarının sayı 1 və dinamik istisna 15 s. Peptidlər və peptid fraqmentləri haqqında məlumat m/z aşağıdakı şərtlərdən istifadə etməklə əldə edilmişdir: hər tam skandan sonra 20 fraqment faylı toplanmışdır (MS2 skanı), daha yüksək toqquşma enerjisi dissosiasiyası (HCD) parçalanması, 2 m/z izolyasiya pəncərəsi, tam skan 17,500 (200 m/z-də), mikro-skanlar 1, maksimum ion yığılma vaxtı 100 ms, normallaşdırılmış toqquşma enerjisi 28 eV və 1 % doldurulma nisbətində.

Məlumatların təhlili

Protein identifikasiyası üçün MS xammal sənədləri Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Fisher Scientific) ilə işlənmiş və daxili MASCOT proqramı 2.3.01 (Matrix Science, London, Böyük Britaniya) ilə axtarış edilmişdir. Əldə edilmiş MS/MS spektrləri avtomatik olaraq UniProt-a qarşı axtarıldı.Zeamays protein bazası (2014-cü ilin dekabrında 86.922 ardıcıllıq). Axtarış parametrləri aşağıdakı kimi idi: bir buraxılmış parçalanma ilə ferment kimi tripsin seçildi, sistein qalıqlarının karbamidometilləşməsinin sabit modifikasiyasına icazə verildi. metioninin miqdarı dəyişən modifikasiyalar kimi təyin olundu peptid tolerantlığı 15 ppm, MS/MS tolerantlığı isə 20 mmu olaraq təyin edildi. Protein identifikasiyası və kəmiyyət məlumatlarının təhlili üçün saxta kəşf dərəcəsi (FDR) ≤1 % olan ən azı bir unikal peptid tələb olunurdu.


Videoya baxın: Обзор геолокационной метки iTraq (Dekabr 2022).