Məlumat

6.5: Polimeraza Zəncirvari Reaksiya (PZR) - Biologiya

6.5: Polimeraza Zəncirvari Reaksiya (PZR) - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Baxış-icmal

DNT replikasiyası aşağıdakı xüsusiyyətlərə malik olan DNT polimeraza fermenti tərəfindən həyata keçirilir:

  1. DNT polimeraza oliqonukleotidin uzanmasını kataliz edir 5'→3' istiqaməti. Əks istiqamətə gedə bilməz.
  2. A DNT şablonu (yəni tək zəncirli oliqonukleotid) tələb olunur. Bu, təkrarlanan məlumatdır (Watson-Crick baza cütləşməsi vasitəsilə). Əgər siz DNT dupleksinin "hiss" zəncirini təkrarlamaq istəyirsinizsə, onda şablon antihissə zənciridir. DNT kovalent olmayan qüvvələr tərəfindən bir yerdə saxlanılan dupleks olduğundan, istilik (və ya qələvi) denaturasiya ilə dupleksin zəncirlərini ayıra bilərik (və müvafiq şablon əldə edə bilərik).
  3. DNT polimeraza yalnız bir uzantı verə bilər mövcud oliqonukleotid, replikasiyaya başlaya bilməz. Beləliklə, şablona əlavə olaraq, DNT polimeraza bir primer oliqonukleotid tələb edir. DNT polimeraza primeri 5'-də uzadır.3' istiqaməti.
  4. Yeni yaranan oliqonukleotidə daxil olan nukleotidlər olmalıdır nukleozid trifosfatlar (yəni dNTP-lər). Fosfat anhidrid bağlarının hidrolizində ayrılan enerji kovalent bağların əmələ gəlməsində (a-fosfatın artan oliqonukleotidin fosfodiester onurğasına daxil edilməsi) istifadə olunur.
  5. Baxmayaraq ki, DNT polimerazları 5'-də uzadılmasını katalizləyir.3' istiqaməti, bəzilərinin qabiliyyəti var "sübut oxumaq". "Dəlil oxu" bazanın yanlış uyğunlaşmasını tanımaq və yanlış bazanın ehtiyat nüsxəsini çıxarmaq və aksiz etmək və sonra davam etmək qabiliyyətidir.

Şəkil 6.5.1: DNT sintezi

  • PCR bir in vitro olan DNT bölgəsinin gücləndirilməsi üçün texnika məlum ardıcıllığın iki bölgəsi arasında.
  • PCR gücləndirilməsi oliqonukleotid primerlərindən istifadə etməklə əldə edilir. Bunlar adətən qısa, tək zəncirli oliqonukleotidlərdir xarici bölgələri tamamlayır məlum ardıcıllıqla.

Şəkil 6.5.2: PCR gücləndirilməsi

Oliqonukleotidlər kimi xidmət edir astarlar DNT polimeraza üçün və valideyn DNT dupleksinin denatürasiya olunmuş zəncirlərinin hər biri şablon.

Bu, ana şablon zəncirlərini tamamlayan yeni DNT zəncirlərinin sintezi ilə nəticələnir.

Addımlar:

  1. Şablonun denaturasiyası
  2. Astarın yumşaldılması
  3. Astar uzantısı

təşkil edir PCR gücləndirmə metodologiyasında vahid "dövr".

  • Hər sikldən sonra yeni sintez edilmiş DNT zəncirləri ola bilər şablon kimi xidmət edir növbəti dövrədə (PZR primerləri adətən şablon DNT-yə əhəmiyyətli molyar artıqlıqda əlavə olunur)

Hər bir PCR dövrünün sonunda məhsulların xülasəsi:

Şəkil 6.5.3: PCR məhsulları

İstədiyiniz PCR məhsulu a olacaq müəyyən edilmiş uzunluqlu fraqmentin dupleksi. Sual olunur: nə qədər istehsal ediləcək?

· Gözlənilən gücləndirmə İstənilən müəyyən edilmiş uzunluq məhsulunun orijinal şablon konsentrasiyasına münasibətdə 'x' beləliklə düsturla təmsil oluna bilər:

[(2n - (n + 1)) - (n + 1)] x

və ya

(2n - 2(n + 1))

(bu, tez-tez sadə bir qayda olaraq qısaldılır gücləndirmə: (2n - 2n) x)

· Bu düsturun təfsiri ondan ibarətdir ki

  • Verilmiş dövr sayı üçün 'n' biz '2 edirikn x' cəmi mümkün duplekslər
  • Verilmiş dövrlər üçün '2(n+1) (və ya bizim təxminimizdə 2n) x' dupleksləri olacaq ki, onlar ya orijinal şablondan, ya da müəyyən olmayan uzunluqlu fraqmentdən və müəyyən uzunluqlu fraqmentdən ( və arzuolunmaz məhsulu təmsil edir)
  • Beləliklə, istədiyiniz məhsulun ümumi konsentrasiyası (PZR primerləri ilə müəyyən edilmiş uzunluqlu duplekslər) olacaq.
    (2n - 2(n+1)) x (burada x orijinal dupleksin konsentrasiyasıdır)

Nəzəri gücləndirmə dəyəri praktikada heç vaxt əldə edilmir. Bunun baş verməsinə bir sıra amillər mane olur, o cümlədən:

1. Reannealing üçün primerlərlə tamamlayıcı qız tellərinin rəqabəti (yəni, iki qız telinin yenidən qızdırılması gücləndirilmə ilə nəticələnmir).

2. Xüsusilə sonrakı dövrlərdə istilik denaturasiyası səbəbindən ferment aktivliyinin itirilməsi

3. Termal denatürasiya olmasa belə, sonrakı dövrlərdə molar hədəfin artıq olması səbəbindən fermentin miqdarı məhdudlaşdırılır (yəni 25-30 sikldən sonra çoxlu primerlərin uzadılması lazımdır)

4. Mümkün ikinci yerin astarının tavlanması və qeyri-məhsuldar astarlanması

Termal dövriyyə parametrləri

Termal dövriyyə parametrləri uğurlu PCR təcrübəsi üçün vacibdir. PCR-nin hər bir dövründə vacib addımlara aşağıdakılar daxildir:

1. şablonun denaturasiyası (adətən ən yüksək temperaturda - 100°C-də aparılır)

2. primerlərin yumşaldılması (temperatur primerin ərimə temperaturu əsasında seçilir)

3. primerlərin uzadılması (istifadə olunan polimeraza üçün optimal şəkildə yerinə yetirilir)

Hər dövr üçün təmsil olunan temperatur profili aşağıdakı kimi görünə bilər:

Şəkil 6.5.4: Termal velosiped

Tamponlar və MgCl2 PCR reaksiyalarında

PCR üçün tipik reaksiya tamponu belə bir şey ola bilər:

  • 10 mM Tris, pH 8.3
  • 50 mM KCl
  • 1,5 mM MgCl2
  • 0,01% jelatin
  • MgCl2 son reaksiya qarışığında konsentrasiya adətən 0,5 ilə 5,0 mM arasında olur və optimal konsentrasiya empirik olaraq müəyyən edilir (adətən 1,0 - 1,5 mM arasında). Mg2+ ionları:
    • dNTP-nin birləşdirilməsi üçün vacib olan dNTP ilə həll olunan bir kompleks meydana gətirir
    • polimeraz fəaliyyətini stimullaşdırır
    • primer/şablon qarşılıqlı təsirinin Tm-ni (ərimə temperaturu) artırmaq (yəni dupleks qarşılıqlı əlaqəni sabitləşdirməyə xidmət edir)

Ümumiyyətlə,

  • aşağı Mg2+ aşağı məhsuldarlığa (və ya məhsulun olmamasına) gətirib çıxarır və
  • yüksək Mg2+ qeyri-spesifik məhsulların yığılmasına gətirib çıxarır (yanlış emal).

PCR üçün polimerazların seçimi

  • PCR-in inkişafına imkan verən mühüm nailiyyətlərdən biri termostabil polimerazaların mövcudluğu idi.
  • Bu, əvvəlcə əlavə edilmiş fermentin 100 °C-yə yaxınlaşan temperatur dövrlərində sağ qalmasına imkan verdi.
  • PCR-də istifadə olunan DNT polimerazalarının xüsusiyyətləri

Taq/Amplitaq®

Vent™

Deep Vent™

Pfu

Tth

ULTma

95 °C yarım ömrü

40 dəq

400 dəq

1380 dəq

>120 dəq

20 dəq

>50 dəq

Uzatma dərəcəsi (nt/san)

75

>80

?

60

>33

?

Nəticə bitir

3' A

>95% küt

>95% küt

küt

3' A

küt

Strand yerdəyişməsi

+

+

5'®3' exo

+

+

3'®5' exo

+

+

+

+

Astarlar

Astar dizaynı

  • Ümumiyyətlə, istifadə olunan astarların uzunluğu 20 - 30 merdir. Bu, praktiki yumşalma temperaturlarını (termostabil polimerazanın ən aktiv olduğu yüksək temperatur rejimi) təmin edir.
  • Primerlər çoxəsaslı ardıcıllıqların uzanmasından (məsələn, poly dG) və ya təkrarlanan motivlərdən qaçmalıdır - bunlar şablonda uyğun olmayan registrlə hibridləşə bilər.
  • Şablonla hibridləşmənin qarşısını alan primerdə ikincil strukturun yaranmasının qarşısını almaq üçün tərs təkrar ardıcıllıqlardan qaçınmaq lazımdır.
  • Primerlər arasında hibridləşmənin qarşısını almaq üçün PCR-də istifadə edilən digər primerləri tamamlayan ardıcıllıqlardan qaçınmaq lazımdır (xüsusilə də 3' sonu primerdən)
  • Mümkünsə, astarın 3' ucu uzadılacaq ucun tavlanmasını artırmaq üçün G, C əsasları ilə zəngin olmalıdır.
  • Astarlar arasındakı məsafə 10 Kb-dən az olmalıdır. Tipik olaraq, primerlər bir-birindən ~3 Kb-dən çox uzandıqda məhsuldarlığın əhəmiyyətli dərəcədə azalması müşahidə olunur.

Astarların ərimə temperaturu (Tm).

  • Primer hibridləşməsinin Tm-i müxtəlif düsturlardan istifadə etməklə hesablana bilər. Ən çox istifadə olunan formula:

(1) Tm = [(A+T qalıqlarının sayı) x 2 °C] + [(G+C qalıqlarının sayı) x 4 °C]

  • Nümunələr Tm hesablamalar

G

A

T

C

Tm

15 mer

3

5

2

5

46

20 mer

6

5

4

5

62

30 mer

8

6

8

8

92

Əgər yumşalma temperaturu çox yüksəkdirsə, primerlər tavlanmayacaq. Çox aşağı olarsa, səhv işləmə nəzərdə tutulan primer bağlama yerinə oxşar DNT ardıcıllığına malik yerlərdə baş verə bilər

PCR təcrübəsinin təhlili

  • 25-30 dövr ümumidir
  • Əsas məhsul 5' və 3' ucları iki PCR primeri ilə müəyyən edilən dupleks DNT molekulu olmalıdır.
  • Bununla belə, başqa məhsullar da istehsal oluna bilər. Bunlar tez-tez ikincil astarlama sahələrinin məhsullarını (yanlış emal) və ya polimerazın yanlış birləşmə səhvlərini əks etdirir.
  • Beləliklə, PCR məhsulu heterojen ola bilər və ayrılmalı və təhlil edilməlidir
  • Agaroza gel elektroforezi, etidium bromid boyanması ilə birlikdə, PCR məhsullarını ayırmaq və təhlil etmək üçün ən çox yayılmış üsuldur

Nuklein turşularının gücləndirilməsi

Multipleks polimeraza zəncirvari reaksiya

Multipleks PCR-də müxtəlif hədəflərin gücləndirilməsi üçün nəzərdə tutulmuş iki və ya daha çox primer dəsti eyni PCR reaksiyasına daxil edilir. Bu texnikadan istifadə etməklə, klinik nümunədə birdən çox hədəf ardıcıllığı tək boruda gücləndirilə bilər. PCR-nin praktik istifadəsinə əlavə olaraq, bu texnika vaxta və səyə qənaət edə bilər. Multipleks reaksiyalarında istifadə olunan primerlər eyni yumşalma temperaturlarına malik olmaq üçün diqqətlə seçilməlidir və bir-birini tamamlamamalıdır. Amplikonun ölçüləri gel elektroforezi ilə görüntüləndikdə fərqli zolaqlar yaratmaq üçün kifayət qədər fərqli olmalıdır. Multipleks PCR ya bir şablon daxilində spesifik bölgələri gücləndirmək üçün bir neçə primer dəstindən istifadə edən tək şablonlu PCR reaksiyasında, ya da eyni reaksiya borusunda bir neçə şablon və bir neçə primer dəstindən istifadə edən çoxşablonlu PCR reaksiyasında tərtib edilə bilər (Şəkil 9.6). ). Multipleks PCR-nin istifadəsi bir nümunədə iki, üç və ya daha çox patogeni eyni vaxtda aşkar etmək üçün xərcləri və vaxtı azalda bilsə də, multipleks PCR inkişaf etdirmək üçün daha mürəkkəbdir və çox vaxt tək primerli PCR-dən daha az həssasdır. Multipleks PCR-nin üstünlüyü ondan ibarətdir ki, bir sıra primerlər daxili nəzarət kimi istifadə oluna bilər ki, biz yalançı müsbət və ya neqativlərin olma ehtimalını aradan qaldıra bilək. Bundan əlavə, multipleks PCR bahalı polimeraza və şablona qənaət edə bilər.

Şəkil 9.6. Multipleks PCR icmalı.


Nə üçün Taq PCR-də istifadə olunur?

Taq polimeraza -nin istiliyədavamlı formasıdır DNT polimeraz üçün lazım olan yüksək temperaturlara məruz qaldıqdan sonra fəaliyyət göstərə bilər PCR. Digər polimerazlar yüksək temperaturlara məruz qalır istifadə olunur içində polimeraz zəncirvari reaksiya (PCR) denatürasiyaya uğrayacaq və qeyri-funksional olacaq.

Həm də sual oluna bilər ki, niyə Taq DNT polimerazanın kəşfi PCR-nin inkişafı üçün vacib idi? Taq polimeraza, ilk istiliyə davamlıdır DNT polimeraz üçün PCR, idi kəşf etdi 1966-cı ildə. PCR çevrilmişdir DNT gücləndirilməsi, prosesi sürətli və səmərəli edir. Bu klonlaşdırmada inqilab edəcək, DNT sınaq, məhkəmə ekspertizası və tibb dizaynı.

O zaman nə üçün Thermus aquaticus PCR-də istifadə olunur?

Məhz bu xassə sayəsində Taq polimerazı belə vacib bir əmtəə edir. DNT polimerazasında tapıldı Thermus aquaticus çox yüksək temperaturda belə sabit qalır. Bu sabitliyə görə ola bilər istifadə olunur kimi tanınan prosesdə polimeraz zəncirvari reaksiyavə ya PCR.


Biologiya elmlərində intizamı kəşfin qızıl əsrlərinə aparan texnoloji irəliləyişlər olmuşdur. Məsələn, mikrobiologiya sahəsi Anton van Leeuwenhoek mikroskopunun meydana çıxması ilə transformasiya olundu və bu, elm adamlarına ilk dəfə prokaryotları vizuallaşdırmağa imkan verdi. Polimeraza zəncirvari reaksiyasının (PZR) inkişafı biologiyada saysız-hesabsız alt fənləri əhatə edən təsiri ilə molekulyar elmin gedişatını dəyişdirən yeniliklərdən biridir. Nəzəri proses Keppe və iş yoldaşları tərəfindən 1971-ci ildə təsvir edilmişdir, lakin tam PCR proseduru 1985-ci ildə Cetus Korporasiyasında olarkən Kari Mullis tərəfindən təsvir edilənə və eksperimental olaraq tətbiq olunana qədər daha 14 il keçdi. bakteriyadan termal sabit DNT polimeraza Thermus aquaticus, nəticədə adı Taq DNT polimeraza.

PCR, yalnız az miqdarda başlanğıc materialdan (yəni, DNT şablonu və ya hədəf ardıcıllığından) müəyyən bir DNT seqmentinin (yəni amplikon) kifayət qədər ehtiyatını yarada bilən güclü gücləndirmə texnikasıdır. Sadə və ümumiyyətlə problemsiz olsa da, reaksiyanı çətinləşdirən tələlər var ki, bu da saxta nəticələr verir. PCR uğursuz olduqda, agaroz gellərində bir nərdivan və ya lent kimi görünən müxtəlif ölçülü bir çox qeyri-spesifik DNT məhsullarına səbəb ola bilər. Bəzən məhsullar ümumiyyətlə əmələ gəlmir. Başqa bir potensial problem, mutasiyalar amplikonlara təsadüfən daxil edildikdə baş verir, nəticədə PCR məhsullarının heterojen populyasiyası yaranır. Problem(ləri) sıralamaq və həll etmək üçün səbr və diqqətli problemlərin aradan qaldırılmasından istifadə edilmədikdə PCR uğursuzluqları sinir bozucu ola bilər. Bu protokol PCR-nin əsas prinsiplərini təsvir edir, əksər hədəf ardıcıllıqlarının gücləndirilməsi ilə nəticələnəcək metodologiyanı təmin edir və reaksiyanın optimallaşdırılması üçün strategiyaları təqdim edir. Bu PCR təlimatına əməl etməklə tələbələr aşağıdakıları bacarmalıdırlar:

  • Adi PCR təcrübəsi üçün reaksiyalar və istilik dövriyyəsi şərtləri qurun
  • Müxtəlif reaksiya komponentlərinin funksiyasını və onların PCR təcrübəsinə ümumi təsirini anlayın
  • İstənilən DNT şablonu üçün PCR təcrübəsini dizayn edin və optimallaşdırın
  • Uğursuz PCR təcrübələrində problemləri həll edin

Səth modifikasiyası vasitəsilə qrafen oksidi ilə polimeraza zəncirvari reaksiyasının spesifikliyinin artırılması: zvitterionik polimer müxtəlif yüklü digər polimerlərdən üstündür.

1 Biomateriallar Departamenti, Materiallar Kolleci, 2 Hüceyrə Stress Biologiyasının Dövlət Əsas Laboratoriyası, Həyat Elmləri Məktəbi, 3 Fizika Departamenti, Biomimetika və Yumşaq Maddə Tədqiqat İnstitutu, Xiamen Universiteti, Xiamen, Çin Xalq Respublikası

*Bu müəlliflər bu işə bərabər töhfə vermişlər

Xülasə: Ölçü, reduksiya dərəcəsi və yük kimi müxtəlif səth xüsusiyyətlərinə malik qrafen oksidləri (GO) hazırlanır və onların polimeraza zəncirvari reaksiyasının (PZR) spesifikliyinə təsiri araşdırılır. Bu araşdırmada biz PZR-in spesifikliyini artırmaqda böyük ölçüyə və yüksək reduksiya dərəcəsinə malik GO-nun kiçik və azaldılmamış GO-dan üstün olduğunu nümayiş etdiririk. GO-nu dəyişdirmək üçün mənfi yüklü poliakrilik turşu (PAA), müsbət yüklü poliakrilamid (PAM), neytral polietilen qlikol (PEG) və zvitterion polimer poli(sulfobetain) (pSB) istifadə olunur. PCR spesifikliyini artırmaq qabiliyyəti aşağıdakı ardıcıllıqla artır: GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Beləliklə, zvitterionik polimerlə modifikasiya olunmuş GO PZR-in spesifikliyini artırmaqda müxtəlif yüklərə malik olan digər GO törəmələrindən üstündür. GO törəmələri həmçinin qan genomik DNT-ni şablon kimi istifadə edərək insan mitoxondrial DNT-nin gücləndirilməsi üçün PCR-nin spesifikliyini artırmaq üçün uğurla istifadə olunur. Polimerlər və polimerlər arasındakı qarşılıqlı əlaqəni aydınlaşdırmaq üçün molekulyar dinamika simulyasiyaları və molekulyar yerləşdirmə aparılır. Pfu DNT polimeraza. Məlumatlarımız göstərir ki, GO ölçüsü, azalma dərəcəsi və səth yükü PCR-in spesifikliyinə təsir göstərir. Nəticələrimizə əsasən, zvitterionik polimerlə modifikasiya olunmuş GO PCR-in spesifikliyini artırmaq üçün səmərəli əlavə kimi istifadə edilə bilər.

Açar sözlər: PCR əlavəsi, yük, pSB, Pfu DNT polimeraz

Polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) molekulyar biologiyada ən çox yayılmış və yaxşı işlənmiş vasitələrdən biridir. 1,2 DNT zəncirində müəyyən bir bölgənin sürətli və seçici gücləndirilməsi ilə milyardlarla DNT nüsxəsini çıxarmaq qabiliyyətinə görə, genlərin gücləndirilməsi, molekulyar klonlaşdırma və xəstəliklərin diaqnostikasında geniş tətbiq sahəsinə malikdir. 3 Əsas PCR adətən aşağıdakı beş komponenti tələb edir: 1) hədəf DNT bölgəsini ehtiva edən DNT şablonu, 2) DNT sintezini başlatmaq üçün iki primer, 3) DNT sintezini kataliz etmək üçün termostabil DNT polimeraza, 4) deoksinukleozid trifosfatlar (dNTPs, bina) yeni DNT zəncirinin blokları) və 5) ikivalent kationlar (adətən Mg 2+ ) daxil olmaqla bufer. 4 Çox vaxt uğurlu PCR əldə etmək üçün vaxt aparan optimallaşdırma prosesi tələb oluna bilər, ilk növbədə genomik DNT-dən amplifikasiya tələb olunarsa.

Primer təmizliyi və ardıcıllığı, şablon DNT-nin saflığı, Mg 2+ konsentrasiyası, yumşalma temperaturu və PCR qarışığına tez-tez daxil edilən dimetil sulfoksid (DMSO) kimi digər əlavələr kimi bir çox amillər PCR-in spesifikliyinə təsir edəcək. . 5,6 Adətən, şablon DNT-nin konsentrasiyası çox aşağı olduqda və ya DNT şablonunun strukturu GC ilə zəngin gen və ya məməli genomik DNT kimi çox mürəkkəb olduqda, PCR-nin spesifikliyi çox aşağı ola bilər. İki ayrı primer dəstindən istifadə etməklə iç içə PCR, tavlama temperaturu tədricən azalan toxunma PCR və reaksiya qarışığı yuxarıdakı temperatura çatana qədər DNT polimerazı və ya primerləri saxlayaraq isti başlanğıc PCR kimi PCR-in spesifikliyini artırmaq üçün müxtəlif strategiyalar hazırlanmışdır. primerin şablona qeyri-spesifik bağlanması üçün hədd. 4 Bununla belə, primer dizaynının optimallaşdırılması, PCR dövriyyəsi şərtləri və yumşalma temperaturları və PCR komponentlərinin konsentrasiyalarının tənzimlənməsi uzun və məyusedici proseslərdir. PZR-in spesifikliyini artırmaq üçün DMSO, qliserin, betain, formamid və iribuynuzlu serum albumin (BSA) kimi bir neçə kiçik molekul əlavələr kimi istifadə edilmişdir. 7,8 Onları tək və ya kombinasiyada istifadə etmək PCR spesifikliyinin artırılmasına zəmanət vermir. Beləliklə, bu əlavələrin təsiri gözlənilməzdir. Buna görə də, PCR-in spesifikliyini artırmaq üçün yeni əlavələrin tapılması problem olaraq qalır.

Son illərdə PCR sistemində metal nanohissəciklər, yarımkeçirici kvant nöqtələri, karbon nanomaterialları və polimer nanohissəciklər daxil olmaqla nanomateryallardan istifadə edilmişdir. 9󈝿 Nanomateriallar tez-tez unikal fiziki və kimyəvi xüsusiyyətlərə malikdirlər, məsələn, makroskopik materiallardan çox fərqlənən böyük səth-həcm nisbətindən yaranan səth effekti. Nanomateryalların PCR-ə təsiri əsasən PCR komponentləri və nanomateryallar arasında güclü qarşılıqlı təsirdən asılıdır. 20 Bununla belə, müxtəlif tədqiqat qruplarından ziddiyyətli nəticələr əldə edilmişdir. 21󈞅 Buna görə də, müxtəlif səth xüsusiyyətlərinə malik nanomaterialların PCR-ə təsiri hələ də aydın deyil və müvafiq mexanizmi anlamaq üçün daha sistemli və dərin araşdırmalar lazımdır.

Əvvəlki araşdırmamız göstərdi ki, azaldılmış qrafen oksidi (RGO) PCR-nin spesifikliyini əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdıra bilər. 19 Bununla belə, RGO-nun səthində funksional qrupların çatışmazlığı səbəbindən suda zəif həll olur, bu da RGO-nun sonrakı tətbiqinə mane olur. RGO ilə müqayisədə qrafen oksid (GO) təbəqəsində çoxlu hidroksil, epoksi və karboksil qrupları var ki, bu da GO-nun yüksək polaritesi və hidrofilliyi ilə nəticələnir.Beləliklə, GO hidrofilikdir və suda yaxşı səpələnə bilər. GO-nun əlavə səth modifikasiyası GO-nu bəzi yeni səth xüsusiyyətləri ilə təmin edə bilər. 26󈞋 Bu tədqiqatda GO mənfi yüklü karboksil-sonlu poliakrilik turşu (PAA), müsbət yüklü amin-sonlu poliakrilamid (PAM), neytral polietilen qlikol (PEG) və ya zwitterion polimer poli(sulfobetain) (pSB) ilə dəyişdirilmişdir. Bundan əlavə, ölçü, azalma dərəcəsi və səth modifikasiyası kimi müxtəlif səth xüsusiyyətləri ilə GO-nun PCR spesifikliyinə təsirini araşdırdıq. PZR-in spesifikliyini artırmaqda böyük və RGO-nun kiçik və qeyri-RGO-dan üstün olduğunu gördük. GO-nun səth yükü də aşağıdakı ardıcıllıqla PCR-nin spesifikliyinə təsir etdi: GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Polimerlə modifikasiya olunmuş GO üçün zwitterion pSB-nin neytral və mənfi və müsbət yüklü polimerlərlə müqayisədə PCR-in spesifikliyini artırmaqda üstün olduğu aşkar edilmişdir. Müxtəlif səth yükləri olan bu GO törəmələri şablon kimi qan genomik DNT istifadə edərək mitoxondrial DNT-nin gücləndirilməsində əlavələr kimi uğurla istifadə edilmişdir. Nəticələrimizə əsasən, biz təklif edirik ki, GO törəmələri klinik nümunələrdən əldə edilən aşağı bolluqlu DNT-nin PCR spesifikliyini də artıra bilər. Molekulyar dinamika simulyasiyaları və molekulyar birləşmə daha sonra polimerlər və polimerlər arasındakı qarşılıqlı əlaqəni araşdırmaq üçün istifadə olunur. Pfu Spesifikliyin artırılması mexanizmini anlamaq üçün DNT polimeraza. Tədqiqat nəticələrimiz son nəticədə GO-nun biotibbi sahələrdə tətbiqini inkişaf etdirə bilər.

Təbii qrafit tozu (320 mesh, Alfa, 99%) Tianjin Guangfu Chemical Agent Co., Ltd.-dən (Tianjin, Çin Xalq Respublikası) alınıb. NaNO3, KMnO4, K3PO4 (99%), L-lizin (98'37), ninhidrin (97'37) və H2O2 Guoyao Co., Ltd.-dən (Şanxay, Çin Xalq Respublikası) alınmışdır. Akril turşusu (AA), akrilamid (AM), H2BELƏ Kİ4, HCl, hidrazin hidrat (80%), etanol, NaHCO3, NaOH, Mg2BELƏ Kİ4 (99%), metil-qırmızı və natrium borat Xilong Chemical-dan (Quançjou, Çin Xalq Respublikası) alınmışdır. Kalium peroksülfat Dahao Nanhong Industrial Co., Ltd.-dən (Şantou, Çin Xalq Respublikası) alınıb. mPEG-NH2 Kaizheng Biotech Development Co., Ltd.-dən (Pekin, Çin Xalq Respublikası) alınıb. 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroxlorid (EDC, 98%) Ələddin Sənaye Korporasiyasından (Şanxay, Çin Xalq Respublikası) alınmışdır. BSA (98%) və [2-(metakriloiloksi)etil] dimetil-(3-sulfopropil) ammonium hidroksid (SB, 98%) Sigma-Aldrich-dən alınmışdır. İstifadə olunan bütün reagentlər xüsusi qeyd olunanlar istisna olmaqla, analitik-reagent dərəcəli idi. Dializ borusu (8 000 󈝺,000 MWCO) Solarbio Life Sciences şirkətindən (Pekin, Çin Xalq Respublikası) alınıb. pET-32a plazmid DNT Çin Xalq Respublikası, Şanxay, Noveqan şəhərindən alınıb. The Pfu polimeraza, dNTP, 10' bufer, 0,22 '956 m filtr, agaroza, qliserin, Luria-Bertani bulyonu, etidium bromid (EB), DNT markeri, DNT yükləmə buferi, susuz CaCl2, PCR boruları, 50× TAE buferi və ampisilin Sangon Biotech Co., Ltd.-dən (Şanxay, Çin Xalq Respublikası) alınıb. Primerlər Sangon Biotech Co., Ltd. tərəfindən sintez edilmişdir (Cədvəl S1). PZR məhsulları Sangon Biotech Co., Ltd tərəfindən sıralanıb. Mini Plazmid Kit TIANGEN Biotech Co., Ltd.-dən (Pekin, Çin Xalq Respublikası) alınıb. High Pure PCR Şablon Hazırlama Kiti Roche Ltd.-dən (Almaniya) alınıb. Bütün təcrübələrdə deionlaşdırılmış sudan istifadə edilmişdir.

GO və onun törəmələrinin sintezi

GO əvvəlki metodumuza uyğun olaraq sintez edilmişdir. 32,33 Əvvəlcə 2,0 q qrafit tozu və 1,0 q NaNO3 46 mL 98'H-yə əlavə edildi2BELƏ Kİ4 buz vannasında, sonra isə 6,0 q KMnO4 güclü qarışdırmaqla qarışığa yavaş-yavaş əlavə edildi. Qarışıq davamlı olaraq buz banyosunda 2 saat qarışdırıldı və 35 ° C-də 30 dəqiqə su banyosuna qoyuldu. Sonra tədricən 92 ml su əlavə edildi və temperatur 95ºC-ə qaldırıldı. Məhlul 3 saat qarışdırılır. Nəhayət, 400 mL su əlavə edildi və 6 mL 30'H2O2 reaksiyaya düşdü. Otaq temperaturuna qədər soyuduqdan sonra qarışıq süzülür və 1:10 HCl (həcm nisbəti) ilə yuyulur, sonra turşunun çıxarılması üçün su ilə təkrar yuyulur. Filtr tortu daha sonra qrafit oksidi əldə etmək üçün suya səpələnmişdir. Qrafit oksidin GO-ya qədər aşındırılması 500 Vt-da 3 saat ultrasəslə əldə edildi. Aqreqat 10 dəqiqə ərzində 4000 rpm-də sentrifuqalama ilə çıxarıldı. Supernatant toplandı və qalıq duzları çıxarmaq üçün 1 həftə suda dializ edildi.

Kiçik GO (S-GO) və böyük GO (L-GO) ədəbiyyata uyğun olaraq hazırlanmışdır. 34 Dializ edilmiş GO məhlulu 10 saat ərzində sonikləşdirildi, ardınca 20 dəqiqə ərzində 12,000 rpm-də sentrifuqasiya edildi. Supernatant S-GO olaraq toplandı. Aqreqat yenidən suda disperse edildi və 2000 rpm-də 10 dəqiqə sentrifuqa edildi. Supernatant L-GO olaraq toplandı. RGO ammonyakda hidrazin hidratla azaldılmış GO-dan hazırlanmışdır. Dörd boyunlu kolbaya cəmi 50 mL 1 mq ml 𕒵 GO yükləndi və sonra 6 μL 80’lik hidrazin hidrat və 100 ‘956L 28’37 ammonium hidroksid əlavə edildi. Hərtərəfli qarışdırıldıqdan sonra məhlul 1 saat ərzində 95ºC-də yağ banyosunda qızdırılıb. Supernatant toplandı və suda bir həftə dializ edildi. Daha yüksək reduksiya dərəcəsi olan RGO-nun başqa bir nümunəsi 42 μL 80% hidrazin hidrat və 700μL 28’37 ammonium hidroksid əlavə etməklə hazırlanmışdır.

GO-PAA və GO-PAM əvvəlki protokolumuza uyğun olaraq hazırlanmışdır. 35 Əvvəlcə 1 mL 1 g mL 'AA monomeri otaq temperaturunda güclü qarışdırmaqla 50 mL 1 mg mL 'GO məhluluna əlavə edildi. 30 dəqiqə azotla təmizləmə altında, 80 mq (NH4)2S2O8 əlavə edildi və yağ vannasında 3 saat 70ºC-də qızdırıldı. Otaq temperaturuna qədər soyuduqdan sonra 200 mL su əlavə edildi və 1 saat sonikasiya edildi, sonra sərbəst PAA-nı çıxarmaq üçün bir həftə dializ aparıldı. 30 dəqiqə ərzində 4000 rpm-də sentrifuqadan sonra supernatant GO-PAA kimi toplandı. AA monomerinin AM və ya SB monomeri ilə əvəz edilməsi istisna olmaqla, GO-PAM və GO-pSB oxşar şəkildə hazırlanmışdır. GO-pSB hazırlanması üçün təşəbbüskar kimi kalium peroksülfat istifadə edildi və reaksiya qarışığı 15 saat ərzində 70°C-də qızdırıldı.

GO-PEG ədəbiyyata uyğun olaraq hazırlanmışdır. 36 Əvvəlcə 10 mL 3 M NaOH 20 mL 2 mq mL 𕒵 GO məhlulu ilə qarışdırıldı və 3 saat ərzində ultrasəs edildi. Sonra məhlulu pH 7-yə neytrallaşdırmaq üçün 10'HCl əlavə edildi. Qarışıq süzüldü və su ilə yuyuldu. Sonra filtr tortu 40 mL suya səpildi. Cəmi 80 mq mPEG-NH2 məhlulun içinə əlavə edildi və 5 dəqiqə sonikləşdirildi. Sonra 20 mq EDC əlavə edildi və daha 30 dəqiqə sonikləşdirildi, ardınca 60 mq EDC əlavə edildi və bir gecədə qarışdırıldı. Supernatant toplandı və artıq mPEG-NH-ni çıxarmaq üçün suda bir həftə dializ edildi2. 4000 rpm-də 30 dəqiqə sentrifuqadan sonra supernatant GO-PEG kimi toplandı.

GO və onun törəmələrinin xarakteristikası

Atom qüvvəsi mikroskopiyası (AFM) şəkilləri Nanoscope Multimode 8 (Veeco Instruments Inc., ABŞ) istifadə edərək havada vurma rejimində əldə edilmişdir. UV-nin udma spektrləri TU-1901 UV-Vis spektrometrindən (Pekin Purkinje General Instrument, Çin Xalq Respublikası) istifadə edilməklə əldə edilmişdir. Fourier transform infraqırmızı (FTIR) spektrləri Nicolet iS10 spektrometrində (Thermo Scientific, ABŞ) qeydə alınıb. Cu Kα radiasiya ilə təchiz olunmuş toz rentgen difraksiya (XRD) sistemi (Ultima IV Riqaku, Yaponiya)λ ɣ.542 Å) materialların kristalloqrafik strukturlarını xarakterizə etmək üçün istifadə edilmişdir. X-ray fotoelektron spektroskopiyası (XPS) spektrləri Phi Quantum 2000 rentgen fotoelektron spektrometrində (PHI, ABŞ) qeydə alınıb. Termal qravimetrik analiz (TGA) SDT-Q600-də (TA Instruments, ABŞ) azot atmosferi altında 10°176C dəq 𕒵 qızdırma sürətində aparılmışdır. Zeta potensialları Malvern Nano-ZS (Malvern Instruments, Co., UK) ilə ölçüldü. RGO səthində karboksil və hidroksil qruplarının tərkibini müəyyən etmək üçün Boehm titrləmələri 37 aparılmışdır. Bağlayıcı yaxınlığı Pfu GO və RGO ilə polimeraza izotermik titrasiya kalorimetrləri (NANO ITC TA Instruments) ilə 25ºC-də tədqiq edilmişdir. Pfu polimeraza müxtəlif karboksil tərkibli GO və RGO ilə titrlənmişdir (müvafiq olaraq 8,39', 7,28' və 5,43'). Nümunə hüceyrəsi 0,12 μg mL 𕒵 ilə dolduruldu. Pfu polimeraz və istinad hüceyrəsi su ilə dolduruldu. Hər bir təcrübədə 50 μL 100 μg mL 𕒵 RGO şprislə götürüldü və 200 saniyə bərabər fasilələrlə nümunə hüceyrəsinə əlavə edildi. Hər əlavədən sonra istilik dəyişiklikləri ölçülür. Qrafen üçün kalorimetrik məlumatlar–Pfu polimeraza bağlanması NANO ITC üçün NanoAnalyze proqramından istifadə etməklə təhlil edilmişdir.

PCR və agaroz gel elektroforezi

PCR üçün şablon kimi pET-32a plazmidi istifadə edilmişdir. Aşağıdakı komponentlər PCR-in birinci mərhələsində qarışdırıldı: 2 mM Mg 2'43, dNTP (hər biri 0,2 mM), primer F1 (0,4 '956M), primer R1 (0,4 '956M) olan 1'215 PCR tamponu ( Cədvəl S1), plazmid DNT (0,5 ng μL 𕒵 ) və Pfu polimeraza (0,1 U μL 𕒵 ). PZR sisteminə GO və ya onun müxtəlif konsentrasiyalı törəmələri əlavə edilmişdir. Hər bir nümunə su ilə 25 μL olan son həcmə qədər hazırlanmışdır. İkinci raund PCR-də eyni reaksiya şəraiti təyin edildi, istisna olmaqla, plazmid DNT-ni şablon kimi əvəz etmək üçün 0,5 μL PCR məhsulu istifadə edildi. PCR şərtləri Cədvəl S2-də təsvir edilmişdir.

Tədqiqat Xiamen Universitetinin Tibb Kollecinin Etika Komitəsi tərəfindən təsdiqlənib. Yazılı məlumatlı razılıq verən sağlam könüllülərdən qan nümunələri toplandı. İnsan genomik DNT-si Yüksək Saf PCR Şablon Hazırlama Kitindən istifadə edərək təcrid edilmişdir. Plazmid DNT yerinə cəmi 20 ng μL 𕒵 DNT əlavə edildi. F2 və R2 primerləri (Cədvəl S1) insan mitoxondrial DNT-nin bir fraqmentini gücləndirmək üçün istifadə edilmişdir. PCR komponentləri yuxarıdakı kimi idi, yalnız plazmid DNT 2,5 μL genomik DNT ilə əvəz edilmişdir. İkinci və ya üçüncü raund PCR-də genomik DNT əvəzinə şablon kimi 2,5 μL son dövr PZR məhsulu istifadə edilmişdir. PCR şərtləri Cədvəl S2-də verilmişdir. PCR-lər T3 termocyclerda (Biometra, Almaniya) yerinə yetirildi. PZR məhsulları 30 dəqiqə ərzində 1,5'agaroz geldə elektroforasiya edilmiş, 0,5 '956 q mL '87221 EB ilə boyanmış və Gel Doc XR sistemindən (Bio-Rad, ABŞ) istifadə edərək təhlil edilmişdir. PCR məhsulunun zolağının flüoresan intensivliyi Image Lab proqramının optik sıxlıq analizi modulu ilə təhlil edilmişdir.

Siliko simulyasiyasında Pfu polimeraza-polimerin qarşılıqlı təsiri

Polimerlər və polimerlər arasında mümkün qarşılıqlı əlaqəni öyrənmək üçün molekulyar dinamika simulyasiyalarından və molekulyar birləşmədən istifadə edilmişdir. Pfu polimeraza. PAA, PAM və pSB-nin ionlaşdırılmış formaları bütün dok və simulyasiyalarda istifadə edilmişdir (Şəkil S1). Molekulyar dinamika simulyasiyaları Kimyəvi Simulyasiya üçün Qroningen Maşınından (GROMACS 5.0.4) istifadə edilməklə həyata keçirilmişdir. 38 DNT polimeraza üçün CHARMM36 güc sahəsi 39 və həlledici üçün sadə nöqtə yüklü su istifadə edilmişdir. Hər bir polimer zülal kompleksi simulyasiya qutusuna (14吊吊 nm) yerləşdirildi və həlledici ilə dolduruldu. PAA və PAM müvafiq olaraq 󔽎e və 70e xalis ödənişlərə malikdir. PEG və pSB neytraldır. Pfu polimerazın 𕒸e xalis yükü var. Sistemin xalis yüklərini neytrallaşdırmaq üçün Na + və Cl − ionları əlavə edildi. Hər bir müstəqil simulyasiyada polimer zülalın ətrafında təsadüfi bir yerə yerləşdirildi. Dinamikadan əvvəl struktur ən dik eniş alqoritmindən istifadə edərək enerjinin minimuma endirilməsi yolu ilə rahatlaşdırılırdı. Sistemi tarazlaşdırmaq üçün 100 ps NVT simulyasiyası və ardınca 100 ps NPT simulyasiyası həyata keçirilib. Sistemin temperaturu 345 K (72º176C) səviyyəsində saxlanıldı, bu da uzunluq temperaturu üçün Pfu polimeraza. Elektrostatik qarşılıqlı təsirlər hamar Particle Mesh Ewald metodundan istifadə edərək idarə edilmişdir. Simulyasiya edilmiş molekullardakı bütün bağlar Xətti Məhdud Həlledici ilə istinad dəyərlərinə məhdudlaşdırıldı. Coul Qısa Menzilli enerjilər tarazlığa çatdıqdan sonra hesablanmışdır.

DNT polimerazasında mümkün aktiv sahələri hesablamaq üçün Site Finder Molecular Operating Environment (2012.10) tərəfindən həyata keçirilmişdir. 40 Dok simulyasiyasının məqsədi liqandlar və arasında qarşılıqlı təsirləri hesablamaq və qiymətləndirməkdir Pfu defolt güc sahəsi parametrləri ilə AutoDockVina 1.1.2 proqram təminatından istifadə edərək polimeraza. 41 Hər birində 10 sayt olan beş müstəqil dok simulyasiyası Pfu sınaq üçün polimeraz, hər bir polimer zülal sistemi üçün həyata keçirilmişdir.

GO və onun törəmələrinin hazırlanması və xarakteristikası

Şəkil 1 S-GO, L-GO, GO-PAA, GO-PEG, GO-PAM və GO-pSB-nin hazırlanmasını nümayiş etdirir. GO dəyişdirilmiş Hummers üsulu ilə təbii qrafitdən sintez edilmişdir. 32,33 S-GO və L-GO yüksək sürətli sentrifuqa texnologiyası ilə hazırlanmışdır. AFM şəkilləri göstərdi ki, S-GO (50 nm) orta ölçüsü L-GO (500 nm) ilə müqayisədə çox kiçik, qalınlığı isə hər iki nümunə üçün ≥1260,9 nm olub (Şəkil S2). Nəticə göstərir ki, həm S-GO, həm də L-GO eyni qalınlığa malik monolaylı təbəqələrdir. 42 Beləliklə, biz sonuncu təcrübələrdə GO qalınlığının PCR spesifikliyinə təsirini istisna edə bilərik. Polimerin GO səthinə aşılanması qalınlığın 1𔃁 nm-ə qədər artması ilə nəticələndi (Şəkil S2C–F). Boem titrləmələri göstərdi ki, S-GO və L-GO-nun karboksil qruplarının miqdarı müvafiq olaraq 9,01% və 8,17% idi. S-GO daha böyük səth-həcm nisbətinə görə daha çox karboksil qruplarına sahib idi. S-GO-nun (󔼵,1۪,6 mV) zeta potensialı L-GO-dan (󔼫,6۪,8 mV) aşağı idi, bu o deməkdir ki, S-GO-da karboksil qruplarının tərkibi bundan yüksəkdir. L-GO və nəticə Boehm titrləmələrinin nəticələrinə uyğundur.

Şəkil 1 GO və onun törəmələrinin hazırlanması.
Qeydlər: (A) S-GO və L-GO-nun hazırlanması. (B) Dörd GO törəməsinin hazırlanması. Şəkillər suda müxtəlif GO və GO törəmələrinin rəngini göstərir. (C) PAA, PAM, PEG və pSB-nin molekulyar düsturları.
İxtisarlar: EDC, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroxlorid GO, qrafen oksidləri L-GO, böyük GO PAA, poliakrilik turşu PAM, poliakrilamid PEG, polietilen qlikol pSB, poli(sulfobetain) S-GO, kiçik GO.

GO-PAA, GO-PAM və GO-pSB müvafiq olaraq GO səthində AA, AM və SB monomerlərinin sərbəst radikal polimerləşməsi ilə hazırlanmışdır. Digər tərəfdən, mPEG-NH2 karbodiimid-katalizli amid əmələ gəlməsi yolu ilə GO-da karboksil qruplarına konyuqasiya edilmişdir. Bütün nümunələri səciyyələndirmək üçün ultrabənövşəyi görünən (UV's) spektrləri (Şəkil S3), FTIR spektrləri (Şəkil S4), XRD spektrləri (Şəkil S5) və XPS spektrləri (Şəkil S6) istifadə edilmiş və Əlavə materiallarda verilmişdir. Bütün bu səciyyələndirmələr PAA, PAM, PEG və pSB-nin GO-da uğurla peyvənd olunduğunu göstərdi. GO, GO-PAA, GO-PAM, GO-PEG və GO-pSB-nin TGA-sı Şəkil S7-də göstərilmişdir. 8.39% karboksil tərkibli GO-nun TGA-sı iki kütləvi itki bölgəsini nümayiş etdirir. °C temperaturda ilk çəki itkisi adsorbsiya edilmiş suyun itirilməsi ilə əlaqədardır. 180ºC və 230ºC arasında ikinci çəki itkisi GO-da karboksil, epoksid və hidroksil qrupları kimi oksigen tərkibli funksional qrupların parçalanması ilə əlaqədardır. Qrafenin çəki itkisi karboksilin miqdarının azalması ilə azalır (Şəkil S7A). GO ilə müqayisədə GO törəmələrinin ikinci çəki itkisi daha yüksək temperaturda baş verir ki, bu da əsasən polimer zəncirinin parçalanması nəticəsində baş verir. Çəki itirmə faizini hesablayaraq, PAA, PAM, PEG və pSB-nin hesablanmış məzmunu müvafiq olaraq 43,48%, 40,96%, 42,53% və 38,70% olmuşdur (Cədvəl S3). Bu polimer modifikasiya edilmiş GO-lar oxşar polimer tərkibinə malikdir. Beləliklə, biz sonuncu təcrübələrdə polimer tərkibinin PCR spesifikliyinə təsirini istisna edə bilərik.

GO və RGO-nun zeta potensialları müvafiq olaraq 󔼯,1۪,5 mV və 󔼗,6۪,3 mV idi, bu da GO-nun RGO-dan daha sabit olduğunu göstərir. GO səthinə polimerlər peyvənd edildikdən sonra GO-PAA-nın (󔼶.9۪.9 mV) zeta potensialı PAA-da COO −-nin mənfi yükü səbəbindən daha mənfi oldu. GO-PAM-ın zeta potensialı müsbət yüklü NH səbəbiylə 󔼠,1۫,2 mV-ə yüksəldi.3 PAM-da +. GO-PEG (󔼫,7۪,8 mV) və GO-pSB (󔼜,4۪,9 mV) mənfi potensialı, PEG neytral polimer və pSB olmasına baxmayaraq, GO səthindəki COO − qruplarından qaynaqlanır. zwitterion polimer idi (Cədvəllər S4 və S5).

GO ölçüsünün PCR-ə təsiri

Ümumi bir PCR prosesi təkrarlanan temperatur dəyişikliyinin 25 󈞊 dövrünü əhatə edir. Tipik bir PCR dövrü aşağıdakı üç mərhələdən ibarətdir: 1) şablon DNT-nin denatürasiyası, 2) iki sintetik primerin şablon DNT-yə bağlanması və 3) termostabil DNT polimeraza ilə katalizləşən bağlı primerlərin uzadılması. 5 PCR hədəf geni eksponent olaraq çoxalda bilsə də, qeyri-spesifik gücləndirmə problem olaraq qalır. Xüsusilə çox dövrəli PCR-də reaksiyaya girməyən ilkin DNT şablonu və primerlər reaksiyanı pozur və qeyri-spesifik məhsulların yığılmasına səbəb olur. 43 İlkin tədqiqatlarda biz PCR gücləndirilməsinin şablonu kimi pET-32a plazmidindən istifadə etdik. Optimal şablon konsentrasiyası ardıcıl seyreltmə təcrübələri ilə müəyyən edilmişdir (Şəkil S8). Cəmi 0,5 ng μL 𕒵 plazmid birinci raund PCR-də optimal şablon konsentrasiyası hesab edildi və birinci tur PZR məhsulunun 0,5 μL-i ikinci tur PCR-də optimal şablon konsentrasiyası idi. Müxtəlif ölçülü GO-nun (S-GO və L-GO) iki PCR raunduna təsiri araşdırıldı. Birinci tur PCR-də 689 bp hədəf zolağının intensivliyi GO konsentrasiyasının artması ilə azalır, bu reaksiyanın yüksək konsentrasiyada həm S-GO, həm də L-GO tərəfindən inhibə edildiyini göstərir (4.8 μg mL 𕒵) S-GO və L-GO Şəkil 2A üçün 6,4 μg mL 𕒵–C). İkinci raund PCR-də şablon kimi birinci turun PCR məhsulu istifadə edilmişdir.PZR məhsulu təkcə hədəf məhsulu deyil, həm də reaksiyaya girməmiş ilkin DNT şablonunu, primerləri və qeyri-spesifik məhsulları ehtiva etdiyinə görə, bu maddələr ikinci raund PCR-ni pozacaq və qeyri-spesifik məhsulların yığılmasına səbəb olacaq və GO olmadan aşkar yaxma zolaqlarına gətirib çıxaracaq (Şəkil 2D). və E). Lakin, S-GO və ya L-GO əlavə etdikdən sonra yaxma zolaqları yox oldu. S-GO və L-GO konsentrasiyasının artması ilə qeyri-spesifik məhsullar azalmışdır. L-GO S-GO-dan daha yaxşı təsir göstərdi, çünki o, PCR-in spesifikliyini artırmaq üçün daha geniş effektiv konsentrasiya diapazonuna malik idi (S-GO üçün 1,6𔃁,2 μg mL 𕒵 0,8𔃂,8 μg-a qarşı) L-GO Cədvəl S6 üçün mL 𕒵).

Şəkil 2 Müxtəlif ölçülü GO-nun birinci və ikinci tur PCR-lərə təsiri.
Qeydlər: M: DNT markeri. (A) Birinci tur PCR-də S-GO. (B) Birinci raund PCR-də L-GO. (C) Birinci turda PZR-də GO-nun müxtəlif konsentrasiyalarında PCR zolağının intensivliyi. (D) İkinci tur PCR-də S-GO. (E.) İkinci tur PCR-də L-GO. (F) İkinci tur PCR-də GO-nun müxtəlif konsentrasiyalarında PCR zolağının intensivliyi. 1-ci zolaqlarda GO konsentrasiyası 0 μg mL 𕒵 , 0,8 μg mL 𕒵 , 1,6 μg mL 𕒵 , 3,2 μg mL ͍ , ͫ 𕒵 , 6,4 μg mL 𕒵 və 8,0 μg mL 𕒵 .
İxtisarlar: GO-lar, qrafen oksidləri L-GO, böyük GO PCR-lər, polimeraza zəncirvari reaksiyalar S-GO, kiçik GO.

Müşahidə olunan GO konsentrasiyası effekti üçün iş hipotezimiz aşağıdakı kimidir. GO konsentrasiyası aşağı olduqda, müsbət yüklü adsorbsiya miqdarı Pfu mənfi yüklü GO səthində polimeraza və Mg 2+ nisbətən yüksək idi. Daha sonra DNT şablonu, primerlər və dNTP-lər kimi mənfi yüklü molekullar müsbət yüklü tərəfindən cəzb olunur. Pfu GO səthində polimeraza. Beləliklə, uyğunsuzluq ehtimalı azalır və PCR spesifikliyi yaxşılaşır. Bununla belə, GO konsentrasiyasını daha da artırdıqda, PZR sistemində mənfi yüklənmiş GO miqdarı artır, buna görə də müsbət yüklü adsorbsiya edilmiş məbləğ Pfu polimeraza və Mg 2+ tək GO səthində azalır. Üstəlik, GO-nun həddindən artıq mənfi yükləri mənfi yüklü primerləri və dNTP-ləri dəf edəcək, bu da PCR-nin yatırılmasına səbəb olacaqdır. GO-nun zeta potensialını və onun qarışığını ölçdük Pfu suda polimeraza (Cədvəl S4). S-GO-nun zeta potensialı 󔼵,1۪,6 mV-dən 󔼩,2۪,9 mV-ə, L-GO-nun zeta potensialı isə 󔼫,6۪,8 mV-dən 󔽏,8‥,11mV-ə yüksəldi. , S-GO və arasında daha güclü elektrostatik qarşılıqlı əlaqəni təsdiqləyir Pfu polimeraza L-GO ilə müqayisədə və Pfu polimeraza. Oxşar tendensiya PCR buferində əldə edilir (Cədvəl S5). Nəticə S-GO-da (9.01%) mənfi yüklü karboksil qruplarının L-GO-dan (8.17%) daha yüksək olması ilə əlaqələndirilir. Buna görə də, S-GO, L-GO-dan (6,4 €956 q mL 𕒵 ) daha aşağı konsentrasiyada (1,6 μ q mL 𕒵 ) və L-GO PCR-in spesifikliyini artırmaq üçün daha geniş konsentrasiya diapazonuna malikdir. .

GO azalma dərəcəsinin PCR-ə təsiri

Biz ammiakda reduksiyaedici kimi hidrazindən istifadə edərək RGO hazırladıq. Boehm titrasiyası və TGA (Şəkil S7A) göstərdi ki, azalmadan sonra karboksil tərkibi 8,39'dan 5,43'ə qədər azalıb. Zeta potensialları azaldıqdan sonra 󔼯,1۪,5 mV-dən 󔼗,6۪,3 mV-ə qədər artırıldı. Birinci tur PCR-də GO və RGO konsentrasiyalarının artması ilə zolaqların intensivliyi azalmışdır (Şəkil 3A–D). Eyni zamanda, GO-da karboksil qruplarının tərkibinin azalması ilə inhibə effekti azalmışdır. İkinci tur PCR-də aşkar yaxma zolaqları meydana çıxdı və GO və RGO konsentrasiyalarının artması ilə azaldı. GO (8,39%), RGO (7,28%) və RGO (5,43%) üçün PCR-nin optimal spesifikliyi üçün effektiv konsentrasiya diapazonu 0,8𔃁,2 μg mL 𕒵 , 3,2𔃂,8-dir. μg mL 𕒵 və 0,8𔃄,4 μg mL 𕒵 . GO-da karboksil tərkibinin azalması ilə PCR-nin spesifikliyi artır və PCR-də inhibə təsiri azalır, bu da GO-dakı karboksil qruplarının PCR-ə əhəmiyyətli təsir göstərdiyini göstərir. RGO-nun GO-dan daha az mənfi yükü var, nəticədə mənfi yüklənmiş PCR komponentləri ilə daha az elektrostatik itələmə yaranır. Bundan əlavə, nukleobazların halqa strukturları ilə RGO-nun poliaromatik karbohidrogen strukturu arasında daha güclü π-stacking qarşılıqlı əlaqəsi, RGO-nun DNT zəncirləri ilə GO-nun DNT-dən daha çox yaxınlığına gətirib çıxarır. RGO GO-dan daha mükəmməl altıbucaqlı qəfəsə malikdir, beləliklə, daha güclü hidrofobik və π-stacking qarşılıqlı təsirlərə malikdir. Pfu polimeraz ilə GO daha Pfu polimeraza. The Pfu polimeraza 26 fenilalanin, 47 tirozin və 11 triptofan daxil olmaqla 775 amin turşusundan ibarətdir ki, bütün bu molekullarda benzol halqaları var. Bu aromatik amin turşularının zəngin qeyri-qütblü benzolları π–π qarşılıqlı əlaqə yolu ilə qrafen vərəqinə güclü şəkildə bağlana bilir. 44 Buna görə də, RGO mənfi yüklü PCR komponentləri ilə daha az elektrostatik itələmə və DNT şablonu ilə daha yüksək yaxınlıq səbəbindən PCR-in spesifikliyini artırmaqda GO-dan üstündür. Pfu polimeraza. Müsbət yüklülər arasında elektrostatik udma Pfu polimeraza və RGO arasındakıdan daha kiçikdir Pfu polimeraza və daha çox mənfi yüklərlə GO və hidrofobik qarşılıqlı təsir fermentin RGO-ya adsorbsiyasının hərəkətverici qüvvəsidir. 45 Beləliklə, RGO ilə daha güclü yaxınlıq var Pfu GO-dan daha çox polimeraza. Bu nəticə izotermik titrasiya kalorimetriyası (ITC) analizi ilə daha da təsdiqləndi (Cədvəl S7 və Şəkil S9). Dissosiasiya sabitləri (Kd) qrafen üçün–Pfu polimeraza qarşılıqlı təsiri GO (8,39' karboksil), RGO (7,28' karboksil) və RGO (5,43' karboksil) üçün müvafiq olaraq 12,3 mol 𕒹 , 10,5 mol 𕒹 və 3,96 mol 𕒹 olmuşdur. Gibbsin sərbəst enerji dəyişməsinin mənfi dəyərləri (ΔG) ilə qrafenin kortəbii bağlanmasını təsdiqlədi Pfu polimeraza. 46,47 Nə qədər çox RGO (5,43%) ən aşağı idi Kd və daha çox mənfi ΔG dəyərlər, RGO və arasında daha yüksək yaxınlığı göstərir Pfu GO və arasında polimeraz Pfu polimeraza.

Şəkil 3 GO azalma dərəcəsinin PCR-ə təsiri.
Qeydlər: (A) Birinci tur PCR-də GO (8.93%). (B) Birinci raund PCR-də RGO (7.28%). (C) Birinci raund PCR-də RGO (5.43%). (D) Birinci raund PCR-də GO və RGO-nun müxtəlif konsentrasiyalarında PCR zolağının intensivliyi. (E.) İkinci tur PCR-də GO (8.93%). (F) İkinci tur PCR-də RGO (7.28%). (G) İkinci tur PCR-də RGO (5.43%). (H) İkinci turda PZR-də GO və RGO-nun müxtəlif konsentrasiyalarında PCR zolağının intensivliyi. M: DNT markeri. Faizlər GO və RGO-da TGA və Boehm titrasiyası ilə müəyyən edilən karboksil qruplarının tərkibini göstərir. 1𔃅-ci zolaqlarda GO və RGO-nun konsentrasiyası 0 μg mL 𕒵 , 0,8 μg mL 𕒵 , 1,6 μg mL 𕒵 , 3,2 μgmL, μgmL & #956g ml 𕒵 , 6,4 μg mL 𕒵 və 8,0 μg mL 𕒵 .
İxtisarlar: GO, qrafen oksidi RGO, azaldılmış qrafen oksidi PCR, polimeraza zəncirvari reaksiya TGA, termal qravimetrik analiz.

GO səthinin modifikasiyasının PCR-ə təsiri

GO səthinin modifikasiyasının PCR spesifikliyinə təsirini daha da araşdırmaq üçün biz GO-nu mənfi yüklü PAA, müsbət yüklü PAM, neytral PEG və zwitterionik pSB ilə dəyişdirdik. Birinci tur PCR-də bütün nümunələr üçün yaxma zolaqları tapılmadı, bu da PCR-nin yaxşı spesifikliyini göstərir (Şəkil 4A–E). İkinci tur PZR-də əlavələrsiz nəzarət təcrübələrində qeyri-spesifik yaxma meydana çıxdı, lakin GO törəmələrinin konsentrasiyası artdıqca yaxmalar azaldı və bu, bütün GO törəmələri ilə dəstəklənən PCR sistemlərində PCR-nin spesifikliyinin gücləndiyini göstərir. GO-PAA, GO-PAM və GO-PEG ilə müqayisədə GO-pSB daha az yaxma zolaqlarına (Şəkil 4F–J) və daha geniş effektiv konsentrasiya diapazonuna (9,6󈞄,0 μg mL 𕒵 Cədvəl S6) malikdir. GO-pSB digər polimer modifikasiya edilmiş GO-lara nisbətən PCR-in spesifikliyini yaxşılaşdırmaq üçün daha yaxşı performansa malikdir. PCR spesifikliyini artırmaq qabiliyyəti aşağıdakı ardıcıllıqla artır: GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Nəticələr göstərir ki, GO-pSB PCR-in spesifikliyini artırmaqda digər polimerlə modifikasiya olunmuş GO-lardan üstündür. Cədvəl S6 ikinci tur PCR nəticələrinə əsasən GO, RGO, polimerlə modifikasiya olunmuş GO və dörd polimerin PCR-nin optimal spesifikliyi üçün effektiv konsentrasiya diapazonunu müqayisə edir. RGO ilə müqayisədə GO-pSB daha yaxşı həll qabiliyyətinə malikdir. Eyni zamanda, GO və RGO-dan daha geniş effektiv konsentrasiya diapazonuna malikdir.

Şəkil 4 GO törəmələrinin birinci və ikinci tur PCR-lərə təsiri.
Qeydlər: M: DNT markeri. 1𔃆 in () zolaqlarında GO törəməsinin konsentrasiyasıA), (B), (F) və (G) 0 μg ml 𕒵 , 0,8 μg mL 𕒵 , 1,6 μg mL 𕒵 , 3,2 μg mL 𕒵 , 4,8 μg mL 𕒵 , 4,8 μ q mL 𕒵 ` 956 q ml 𕒵 , 8,0 μ q mL 𕒵 , 9,6 μ q mL 𕒵 . GO törəməsinin 1𔃄 in (C), (D), (H) və (Mən), 0 μg mL 𕒵 , 4,8 μg mL 𕒵 , 9,6 μg mL 𕒵 , 14,4 μg mL 𕒵 , 19,2glmL 𕒵 , 19,2 ̬ ͼ . #956g mL 𕒵 , müvafiq olaraq. GO törəmələrində PAA, PAM, PEG və pSB-nin məzmunu müvafiq olaraq 43.48%, 40.96%, 42.53% və 38.70%-dir. (E.) 1-ci dövrədə PZR-də GO törəmələrinin müxtəlif konsentrasiyalarında PCR zolağının intensivliyi. (J) 2-ci raund PCR-də GO törəmələrinin müxtəlif konsentrasiyalarında PCR zolağının intensivliyi.
İxtisarlar: GO, qrafen oksid PAA, poliakrilik turşu PAM, poliakrilamid PCR, polimeraza zəncirvari reaksiyalar PEG, polietilen qlikol pSB, poli(sulfobetain).

PCR-nin spesifikliyinin artırılmasının polimerlərdən deyil, polimerlə modifikasiya olunmuş GO-lardan nəticələndiyini təsdiqləmək üçün çılpaq polimerlərin GO olmadan PCR spesifikliyinə təsirini araşdırdıq. GO törəmələrinin TGA məlumatlarına əsasən hesablanmış polimer miqdarı PCR sisteminə əlavə edilmişdir. Nəticələr bantda heç bir dəyişiklik olmadığını göstərir (Şəkil S10). Yalnız polimerin konsentrasiyası mililitrdə mikroqramdan mililitrdə milliqrama qədər ɭ,000 dəfə artırıldıqda, PCR-in spesifikliyi yaxşılaşdırıla bilər (Şəkil S11). Bu nəticələr göstərir ki, PCR spesifikliyinin artırılması çılpaq polimerlərdən deyil, polimerlə modifikasiya olunmuş GO-dan gəlir. Əvvəlki nəticələrə əsasən, GO PCR spesifikliyində yaxşı gücləndirici deyil. Beləliklə, GO törəməsi ilə PZR-in spesifikliyinin artırılması GO və polimerlərin birləşməsi və ya sinerji təsiri ilə əlaqələndirilir.

Şəkil 5 göstərir ki, GO və ya GO törəmələrinin yüksək konsentrasiyalarında idarəetmə zolaqları (1-ci zolaq) maneə törədilir. olub olmadığını yoxlamaq üçün Pfu polimeraza GO və onun törəmələrinin səthlərinə adsorbsiya edilir, BSA artıq GO və GO törəmələri tərəfindən inhibə edilən PCR sisteminə əlavə edilmişdir. BSA əlavə edildikdən sonra bütün PCR-lər bərpa olunur və BSA-nın artan konsentrasiyası ilə bandın intensivliyi artır. Nəticə BSA-nın GO və onun törəmələrinin səthində rəqabət qabiliyyətli adsorbsiyasına aiddir. Beləliklə, adsorbsiya olunur Pfu polimeraza məhlula buraxıldı, nəticədə PCR bərpa edildi. Nəticələr göstərir ki, GO və ya GO törəmələri və arasında güclü qarşılıqlı əlaqə var Pfu polimeraza. Biz həmçinin GO və onun törəmələrini inkubasiya etdik Pfu polimerazın kifayət qədər udulmasını təmin etmək üçün buzda 1 saat Pfu GO və ya onun törəmələri ilə polimeraza. Sonra digər PCR komponentlərini əlavə etdik və PCR-ləri həyata keçirdik. Şəkil S12 adsorbsiyasından sonra effektiv PCR-ni təsdiqləyir Pfu GO və ya onun törəmələrində polimeraza.

Şəkil 5 BSA-nın GO və onun törəmələri tərəfindən inhibə edilən PCR-ə təsiri.
Qeydlər: M: DNT markeri. (A) GO (9,6 μg mL 𕒵 ), (B) GO-PAA (4.8 μg mL 𕒵 ), (C) GO-PAM (8.0 μg mL 𕒵 ). (D) GO-PEG (24.0 μg mL 𕒵 ) və (E.) GO-pSB (24.0 μg mL 𕒵 ). 1-ci zolaqlarda BSA-nın konsentrasiyası müvafiq olaraq 0 μg mL 𕒵 , 2,0 μg mL 𕒵 , 20,0 μg mL 𕒵 və 200,0 Ϛg mL, müvafiq olaraq μg m2-dir.
İxtisarlar: BSA, mal zərdabında albumin GO, qrafen oksid PAA, poliakrilik turşu PAM, poliakrilamid PCR, polimeraza zəncirvari reaksiya PEG, polietilen qlikol pSB, poli(sulfobetain).

GO törəməsinin konsentrasiyası daha da artırıldıqda PCR inhibə edildi (Şəkil 4). Hər bir GO vərəqi müsbət yüklü adsorbsiya edə bilər Pfu polimeraza və ya Mg 2+ böyük səth sahəsinə və çoxlu mənfi yüklü karboksil qruplarına görə. GO törəməsinin konsentrasiyasının artırılması adsorbsiya miqdarını azaldacaq Pfu polimeraza və Mg 2+ tək GO vərəqində, nəticədə daha az PCR səmərəliliyi. PCR sisteminə artıq Mg 2+ əlavə edildikdə, daha çox Mg 2+ mənfi yüklü GO törəmələrində daha çox adsorbsiya olunacaq. Pfu PCR-ni bərpa etmək üçün polimeraza. Şəkil 6 göstərir ki, inhibe edilmiş zolaqlar 1𔃀 mM Mg 2+ əlavə edildikdən sonra bərpa olunur. Buna görə də, nəticələr daha da göstərir ki, əgər PCR inhibə olunacaq Pfu polimeraza və Mg 2+ tək GO törəməsinin azalması ilə adsorbsiya olunur.

Şəkil 6 Mg 2+ konsentrasiyasının GO və onun törəmələrinin köməyi ilə PCR-ə təsiri.
Qeydlər: M: DNT markeri. (A) GO (9,6 μg mL 𕒵 ). (B) GO-PAA (4.8 μg mL 𕒵 ). (C) GO-PAM (8.0 μg mL 𕒵 ). (D) GO-PEG (24.0 μg mL 𕒵 ). (E.) GO-pSB (24.0 μg mL 𕒵 ). 1𔃂-cü zolaqlarda əlavə edilmiş Mg 2+ konsentrasiyası müvafiq olaraq 0 mM, 0,4 mM, 1,0 mM və 2,0 mM-dir (orijinal 2 mM Mg 2+ daxil edilməyib).
İxtisarlar: GO, qrafen oksidi PAA, poliakrilik turşu PAM, poliakrilamid PCR, polimeraza zəncirvari reaksiya PEG, polietilen qlikol pSB, poli(sulfobetain).

Pfu polimeraza korrektə oxuma fəaliyyətinə malikdir və onun yerinə istifadə edilə bilər Taq DNT sintezinin daha yüksək sədaqətini yerinə yetirmək üçün polimeraza. GO və ya onun törəmələrinin PCR-nin etibarlılığına təsir edib-etmədiyini təsdiqləmək üçün GO və onun törəmələri olmadıqda və ya mövcud olduqda bütün PCR məhsulları ardıcıllıqla sıralandı. Məlumatlar təsdiqləyir ki, GO və onun törəmələri etibarlılığa heç bir təsir göstərmir Pfu polimeraza (Şəkil S13). Nəticələr daha sonra göstərir ki, PCR-in spesifikliyi və etibarlılığı artır Pfu GO törəmələrinin iştirakı ilə polimeraza zəmanət verilir.

Klinik nümunələrdə tətbiq

Nəhayət, mürəkkəb klinik nümunələri gücləndirmək üçün PCR-nin spesifikliyini artırmaq üçün GO törəmələri də istifadə edilmişdir. Şablon kimi insan qanının genomik DNT-si istifadə edilmişdir. Mitoxondrial DNT-nin 324 bp fraqmenti gücləndirildi. Birinci və ikinci raund PCR-lərdə bütün nümunələr üçün yaxma zolaqları müşahidə olunmur, lakin GO törəməsi olmayan ikinci dövrə PCR üçün hədəf zolağı GO törəmələri olan nümunədən daha zəifdir (Şəkil 7). Üçüncü raund PCR-də GO törəməsi olmayan PCR üçün güclü yaxma zolağı var və hədəf zolağı əhəmiyyətsiz olur. Bununla belə, hədəf zolaqları hələ də GO törəmələrinin mövcudluğunda aşağı qeyri-spesifik məhsullarla diqqət çəkir. Buna görə də, GO törəmələri mürəkkəb klinik nümunələri gücləndirmək üçün PCR-nin spesifikliyini artırır. Nəticələr göstərir ki, GO törəmələri klinik molekulyar diaqnostikada potensial tətbiqlərə malik ola bilər.

Şəkil 7 Klinik nümunələri gücləndirmək üçün GO törəmələrinin tətbiqi.
Qeydlər: Şablon klinik nümunələrdən əldə edilən insan qanı genomik DNT-dən mitoxondrial DNT-dir. M: DNT marker 1: birinci tur PCR 2: ikinci tur PCR 3: üçüncü tur PCR C: GO törəmələri olmayan nəzarət təcrübələri. GO-PAA, GO-PAM, GO-PEG və GO-pSB konsentrasiyaları 0,6 μg mL 𕒵 , 2,4 μg mL 𕒵 , 4,8 μg mL 𕒵 və 1952-dir. ml 𕒵 , müvafiq olaraq.
İxtisarlar: GO, qrafen oksidi PAA, poliakrilik turşu PAM, poliakrilamid PCR, polimeraza zəncirvari reaksiya PEG, polietilen qlikol pSB, poli(sulfobetain).

Polimeraz və polimer arasında qarşılıqlı təsirin simulyasiyası

Polimeraz və polimerlə modifikasiya olunmuş GO arasındakı qarşılıqlı əlaqəni birbaşa simulyasiya etmək çox çətindir. Beləliklə, polimer və polimer arasındakı mümkün qarşılıqlı əlaqəni öyrənmək üçün molekulyar dinamikanın simulyasiyası və molekulyar yerləşdirmə istifadə edilmişdir. Pfu sadələşdirmə üçün GO-ya laqeyd yanaşdıqda polimeraza. Pfu polimeraza aşağıdakı beş sahəni ehtiva edir: N-terminal (qalıqlar 1� və 327�), ekzonükleaza (131�), xurma (369� və 501�), barmaqlar (4151-ci domenlər) və 589�) (Şəkil S14). Düzəltmə və polimerləşmə mexanizmi eksonükleaz domeninin döngəsi (144�) ilə baş barmaq sahəsinin müsbət yüklü kənarı arasındakı qarşılıqlı təsirlərdən əlaqələndirilir. 48 Molekulyar birləşmə göstərdi ki, polimerlərin bağlanma yerləri dok hesablamaları ilə eksonukleaza, baş barmaq, xurma və barmaqlar domenində yerləşir (Şəkil S14). Bağlayıcı yaxınlıqlar aşağıdakı ardıcıllıqla azalıb: PAA > PAM > PEG > pSB (Cədvəl S8). Coul Qısa Menzilli enerjilər 10 ns tarazlıq zamanı geniş şəkildə dəyişdi və Ӱ ns-dən sonra sabit səviyyəyə çatdı (Şəkil S15A və B). Coul Qısa Menzilli enerji analizi PAA və arasında güclü elektrostatik qarşılıqlı əlaqənin olduğunu göstərir Pfu (𕒶,248𫐳 kJ mol 𕒵 ). Coul qısa məsafəli enerjisi Pfu-PAM �𫏓 kJ mol 𕒵 , halbuki PEG və pSB ilə demək olar ki, heç bir elektrostatik qarşılıqlı əlaqə yoxdur. Pfu (Cədvəl S9). Bu sıra PCR nəticələrinə uyğundur (Şəkil S11). Solventlə əlçatan səth sahəsi (SASA) bir həlledici üçün əlçatan olan bir biomolekulun səth sahəsidir. SASA-ların Pfu-PEG və Pfu-pSB 10 ns-də demək olar ki, ekvivalentdir (Şəkil S15C), PEG və pSB-nin fermentin substrat bağlanmasına oxşar təsir göstərdiyini göstərir. PEG-in minimum məsafəsi və Pfu geniş diapazonda dalğalanır, PEG-in pSB-dən daha yüksək elastikliyini göstərir (Şəkil S15D).Həlledicinin məcmu paylanması PEG ətrafında həlledici molekulun dipol sahəsinin pSB-dən çox böyük olduğunu göstərir (Şəkil S15E və F), bu da PEG və pSB-nin həlledici və zülalın müxtəlif səviyyələrdə təsir etdiyini göstərir. Molekulyar dinamika simulyasiyaları göstərdi ki Pfu–PAA kompleksi (PAA: aşağıda qəhvəyi zolaq Pfu) ardınca ən güclü qarşılıqlı təsirə malik idi Pfu–PAM kompleksi (PAM: aşağıda mavi zolaq Pfu) (Şəkil 8A və B). Qarşılıqlı təsir elektrostatik və hidrofobik qarşılıqlı təsirlər və van der Waals qüvvəsi olacaqdır. Aydındır ki, arasında birbaşa qarşılıqlı əlaqə yoxdur Pfu polimeraza və PEG, və Pfu polimeraza və pSB (Şəkil 8C və D). Bu nəticələr Coul Qısa Menzilli enerji analizinə uyğundur. Molekulyar dinamikanın simulyasiyası və molekulyar birləşmənin nəticələri ağlabatandır, çünki PEG zülal adsorbsiyasını azalda bilər, 49 və zwitterionik polimer PEG-dən daha yaxşı protein adsorbsiyasını azaltmaq qabiliyyətinə malikdir. 50 Polimerlərin bağlanma yaxınlıqları Pfu polimeraza (Cədvəl S8) də nəticəni dəstəkləyir.

Şəkil 8 MD ilə qarşılıqlı əlaqənin simulyasiyaları Pfu PAA ilə polimeraza (A), PAM (B), PEG (C) və pSB (D).
İxtisarlar: MD, molekulyar dinamika PAA, poliakril turşusu PAM, poliakrilamid PEG, polietilen qlikol pSB, poli(sulfobetain).

Aralarındakı qarşılıqlı əlaqədən başqa Pfu polimeraza və polimer, mənfi yüklü GO və müsbət yüklü Pfu polimeraza həmçinin güclü elektrostatik, hidrofobik və π–π stacking qarşılıqlı təsirlərə malikdir. PEG və pSB adsorbsiyasının azalması səbəbindən bu qarşılıqlı təsirləri azaldacaq Pfu polimeraza. Beləliklə, GO-PEG və GO-pSB eksperimental nəticələrə uyğun gələn GO-PAA və GO-PAM-dan daha geniş konsentrasiya diapazonunda PCR-ni maneə törətmir (Şəkil 4). Bir az müsbət yüklüdür Pfu polimeraza hələ də GO-PEG və GO-pSB-də mənfi yüklü GO tərəfindən adsorbsiya olunur, baxmayaraq ki, PEG və pSB onun adsorbsiyasını azaldır. Beləliklə, PZR-in spesifikliyi GO törəməsi ilə dəstəklənən PCR ilə də gücləndirilir. Buna görə də, bu nəticələr bu GO törəmələrinin PCR-in spesifikliyini artıra biləcəyini daha da təsdiqləyir.

Fərqli ölçülər, azalma dərəcələri və səth dəyişiklikləri ilə GO-nun PCR spesifikliyinə təsirini araşdırdıq. Nəticələr göstərir ki, L-GO və RGO PCR spesifikliyini artırmaqda S-GO və qeyri-RGO-dan üstündür. GO törəmələri üçün PCR spesifikliyini artırmaq qabiliyyəti aşağıdakı ardıcıllıqla artır: GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Tədqiqatımız göstərir ki, həm GO, həm də onun səth xüsusiyyətləri PCR-in spesifikliyinə təsir göstərir. GO törəmələri klinik molekulyar diaqnostikada PCR-nin spesifikliyini artırmaq üçün effektiv əlavələr kimi istifadə edilə bilər.

Bu tədqiqat Milli Əsas Araşdırma 973 Layihəsi (2014CB932004) və Çin Xalq Respublikasının Milli Təbiət Elmləri Fondu (31371005, 81571764 və 81171453) tərəfindən dəstəklənir. Simulyasiyadakı təklifinə görə Xiamen Universitetinin Həyat Elmləri Məktəbinin Hüceyrə Stress Biologiyasının Dövlət Əsas Laboratoriyasından professor Zhiliang Ji-yə təşəkkür edirik. Biz İsrailin Weizmann Elm İnstitutunun doktoru Yoav Peleqə mehriban məsləhətinə və dilə yenidən baxdığına görə təşəkkür edirik. Biz həmçinin professor Chuanliu Wu və onun doktorantı Yaqi Chen-ə bütün İTC ölçmələrində göstərdikləri yardıma görə təşəkkür edirik.

Bütün müəlliflər məlumatların təhlilinə, layihənin hazırlanmasına və məqalənin tənqidi şəkildə nəzərdən keçirilməsinə töhfə vermiş və işin bütün aspektləri üçün cavabdeh olmağa razıdırlar.

Müəlliflər bu işdə maraqların toqquşması barədə məlumat vermirlər.

Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Oraq hüceyrəli anemiyanın diaqnozu üçün b-globin genomik ardıcıllığının enzimatik gücləndirilməsi və məhdudlaşdırma sahəsinin təhlili. Elm. 1985230(4732):1350�.

Markus R, Robert Q, Hans-Jörg W, Hans L, Marie-Laure Y, Sylvia K. PCR üçün səmərəli və iqtisadi gücləndirici qarışıq. Biochem Biophys Res Commun. 2006347(3):747�.

Zhang L, Cui XF, Schmitt K, Hubert R, Navidi W, Arnheim N. Tək bir hüceyrədən bütün genomun gücləndirilməsi: genetik analiz üçün təsirlər. Proc Natl Acad Sci U S A. 199289(13):5847�.

Michael RG, Joseph S. Fəsil 7: polimeraza zəncirvari reaksiya. Molekulyar Klonlaşdırma: Laboratoriya Təlimatı. Dördüncü nəşr. Michael RG, Joseph S, redaktorlar New York, NY: Cold Spring Harbor 2012:455�.

Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. DNT-nin primer yönümlü enzimatik gücləndirilməsi. Elm. 1988239(4839):487�.

Chakrabarti R, Schutt CE. Aşağı molekulyar ağırlıqlı sulfonlarla PCR gücləndirilməsinin gücləndirilməsi. Gen. 2001274(1𔃀):293�.

Ely J, Reeves-Daniel A, Campbell M, Campbell ML, Kohler S, Stone WH. Maqnezium ionunun konsentrasiyası və PCR gücləndirmə şərtlərinin növlər arası PCR-ə təsiri. Biotexnika. 199825(1):38󈞖.

Henke W, Herdel K, Jung K, Schnorret D, Loening SA. Betain GC ilə zəngin DNT ardıcıllığının PCR gücləndirilməsini yaxşılaşdırır. Nuklein turşuları Res. 199725(19):3957�.

Li H, Huang J, Lv J və başqaları. Nanohissəciklərin PCR: spesifikliyi artırılmış nanoqolla yardımlı PCR. Angew Chem Int Ed Engl. 200544(32):5100�.

Khaliq A, Sonawane PJ, Sasi BK, et al. TiO ilə polimeraza zəncirvari reaksiyasının səmərəliliyinin artırılması2 nanohissəciklər: gücləndirilmiş istilik keçiriciliyinin mühüm rolu. Nanotexnologiya. 201021(25):255704.

Nie L, Gao L, Yan X, Wang T. Plazmid DNT-nin təmizlənməsi, polimeraza zəncirvari reaksiyası və çatdırılması üçün funksionallaşdırılmış tetrapoda bənzər ZnO nanostrukturları. Nanotexnologiya. 200618(1):015101.

Zhang ZZ, Wang MC, An HJ. Karbon nanotozunun sulu suspenziyası polimeraza zəncirvari reaksiyasının effektivliyini artırır. Nanotexnologiya. 200718(35):355706.

Abdul KR, Kafafi R, Hamzah MS, Waleed FF. Qrafen nanoflaklarından istifadə edərək polimeraza zəncirvari reaksiyasının səmərəliliyinin artırılması. Nanotexnologiya. 201223(45):455106.

Wang L, Zhu Y, Jiang Y, et al. Polimeraza zəncirvari reaksiyada kvant nöqtələrinin təsiri. J Phys Chem B. 2009113(21):7637�.

Chen J, Cao X, Guo R və s. Dendrimerin tutduğu qızıl nanohissəciklərə əsaslanan yüksək effektiv polimeraza zəncirvari reaksiya gücləndiricisi. Analitik. 2012137(1):223�.

Wang H, Wang L, Yuan L, Yang W, Brash JL, Chen H. Silikon nanotellərin polimeraza zəncirvari reaksiyasına inhibitor təsiri. Nanotexnologiya. 201223(36):365101.

Yang W, Shen C, Ji Q, et al. Qida saxlama materialı gümüş nanohissəcikləri DNT replikasiyasının etibarlılığına mane olur və DNT ilə bağlanır. Nanotexnologiya. 200920(8):085102.

Ding K, Wang N, Yan Q, Guan W. Nanomaterialların polimeraza zəncirvari reaksiyasına təsiri. Curr Nanosci. 20139(3):415�.

Jia J, Sun LP, Hu N, Huang GM, Weng J. Graphene polimeraza zəncirvari reaksiyasının spesifikliyini artırır. Kiçik. 20128(13):2011�.

Pan D, Mi L, Huang Q, Hu J, Fan C. Nano PCR ilə genetik analiz. Integr Biol. 20124(10):1155�.

Ma L, He S, Huang J, Cao L, Yang F, Li L. Kvant nöqtə səthinin mülkiyyətindən çox, kvant nöqtəsinin özü ilə PCR-nin spesifikliyini və məhsuldarlığını maksimuma çatdırmaq. Biokimya. 200991(8):969�.

Bai Y, Cui Y, Paoli GC, Shi C, Wang D, Shi X. Nanohissəciklər PCR-ə ilk növbədə PCR komponentləri ilə səthi qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə təsir göstərir: əsas model kimi aminlə dəyişdirilmiş silisiumla örtülmüş maqnit nanohissəciklərdən istifadə etməklə. ACS Tətbiq Mater İnterfeysləri. 20157(24):13142�.

Cao X, Shen M, Zhang X, Hu J, Wang J, Shi X. Polimeraza zəncirvari reaksiyasının təkmilləşdirilməsinə dendrimerlə tutulmuş qızıl nanohissəciklərin səthi funksional qruplarının təsiri. Elektroforez. 201233(16):2598�.

Cao X, Chen J, Wen S, Peng C, Shen M, Shi X. Polietileniminlə modifikasiya edilmiş çoxdivarlı karbon nanoborucuqlarının səth yükünün polimeraza zəncirvari reaksiyasının yaxşılaşdırılmasına təsiri. Nanoölçülü. 20113:1741�.

Tong W, Cao X, Wen S, et al. Polietilenimin əsaslı törəmələrdən və hibrid nanokompozitlərdən istifadə etməklə polimeraza zəncirvari reaksiyasının spesifikliyinin və səmərəliliyinin artırılması. Int J Nanomedicine. 20127:1069�.

Kuila T, Bose S, Mishra AK, Khanraa P, Kimc NH, Lee JH. Qrafenin kimyəvi funksionallaşdırılması və onun tətbiqləri. Prog Mater Sci. 201257(7):1061�.

Li C, Yang Y, Wu D, Li T, Yin Y, Li G. Biomarkerlərin çox rəngli aşkarlanması üçün fermentlə əlaqəli immunosorbent analizinin təkmilləşdirilməsi. Kimya Elmi. 20167:3011�.

Huang Y, Li H, Fan Q, Wang L, Wang Y, Li G. İnsan toxumasının transqlutaminaz 2-nin çoxfunksiyalı nanokatalizator əsaslı ultrahəssas aşkarlanması. Biosens Bioelektron. 201683(15):85󈟆.

Gao T, Yang D, Ning L, Lei L, Ye Z, Li G. 2D nanosheets üzərində ultra incə və yaxşı dağılmış gümüş nanokristallar: sintez və elektrokimyəvi kataliz və biosensinq üçün çoxfunksiyalı material kimi tətbiqi. Nanoölçülü. 20146(24):14828�.

Gao T, Liu F, Yang D, Yu Y, Wang Z, Li G. Elektrod səthində selektiv biomimetik səthin yığılması: biosensing üçün nano-interfeys dizaynı. Anal Kimya. 201587(11):5683�.

Chen H, Ruckenstein E. Elektrolit məhlulunda nanopore ehtiva edən nanomembrana: molekulyar dinamika yanaşması. J Phys Chem Lett. 20145(17):2979�.

Yang Q, Wang Z, Weng J. Qrafen oksidi ilə tetiklenen təbii tripeptid glutatyonun öz-özünə yığılması. Yumşaq Maddə. 20128:9855�.

Dong J, Weng J, Dai L, Dong J, Weng J, Dai L. Qrafenin poliin aşağı kritik həll temperaturuna təsiri(N.-izopropilakrilamid). Karbon N Y. 201352:326�.

Khan U, O’Neill A, Porwal H, Peter M, Navaz K, Coleman JN. Nəzarət edilən sentrifuqalama ilə disperslənmiş, aşınmış qrafen lopalarının ölçü seçimi. Karbon N Y. 201250(2):470�.

Dong J, Ding J, Weng J, Dai L. Qrafen qrafen üzərində aşılanmış poli (akrilamid-ko-akrilik turşu) forma yaddaşını gücləndirir. Macromol Rapid Commun. 201334(8):659�.

Liu Z, Robinson JT, Sun X, Dai H. Suda həll olunmayan xərçəng dərmanlarının çatdırılması üçün PEGylated nanographene oksidi. J Am Chem Soc. 2008130(33):10876�.

Boehm HP, Diehl E, Heck W, Sappok R. Karbonun səth oksidləri. Angew Chem Int Ed Engl. 19643(10):669�.

Van Der Spoel D, Lindahl E, Hess B, Groenhof G, Mark AE, Berendsen HJC. GROMACS: sürətli, çevik və pulsuz. J Comput Chem. 200526(16):1701�.

Huang J, MacKerell AD. CHARMM36 bütün atom əlavə zülal qüvvə sahəsi: NMR məlumatlarının müqayisəsinə əsaslanan doğrulama. J Comput Chem. 201334(25):2135�.

Vilar S, Cozza G, Moro S. Dərman kimyası və molekulyar əməliyyat mühiti (MOE): QSAR-ın tətbiqi və dərman kəşfinə molekulyar birləşmə. Curr Top Med Chem. 20088(18):1555�.

Trott O, Olson AJ. AutoDock Vina: yeni hesablama funksiyası, səmərəli optimallaşdırma və çox iş parçacığı ilə docking sürətini və dəqiqliyini təkmilləşdirmək. J Comput Chem. 201031(2):455�.

Lu C, Yang H, Zhu C, Chen X, Chen G. Biomolekulları hiss etmək üçün qrafen platforması. Angew Chem. 2009121(26):4879�.

Pan J, Li H, Cao X və başqaları. Nanoqızıl yardımlı çox dairəvi polimeraza zəncirvari reaksiya (PCR). J Nanosci Nanotexnol. 20077(12):4428�.

Guan G, Zhang S, Liu S, et al. Protein keçid metalı dikalkogenidlərinin qat-qat aşınmasına səbəb olur. J Am Chem Soc. 2015137(19):6152�.

Zhang Y, Zhang J, Huang X, Zhou X, Wu H, Guo S. Hidrofobik qarşılıqlı təsir vasitəsilə qrafen oksidinin enzim konjugatlarının yığılması. Kiçik. 20128(1):154�.

Chervenak MC, Toone EJ. Üst-üstə düşən karbohidrat bağlayan liqand xüsusiyyətləri ilə lektinlərin bağlanmasının kalorimetrik təhlili. Biokimya. 199534(16):5685�.

Cooper A. Zülal qatlanması və liqand bağlanmasında istilik tutumu təsirləri: biomolekulyar termodinamikada suyun rolunun yenidən qiymətləndirilməsi. Biophys Chem. 2005115(2𔃁):89󈟍.

Kim S, Kim D, Kim J, Kangd L, Cho H. Kristal quruluşu Pfu, yüksək sədaqətli DNT polimerazadan Pyrococcus furiosus. Int J Biol Macromol. 200842(4):356�.

Gooth NW, Hlady V. Protein adsorbsiyasının azalması üçün polietilen qlikolun iki səthi gradienti. Surf Innov. 20153(3):172�.

Keefe AJ, Jiang SY. Poli(zwitterion) zülal konjuqatları bağlanma yaxınlığı və ya bioaktivliyini itirmədən artan sabitlik təklif edir. Nat Chem. 20124(1):59󈞫.

/>Bu iş Dove Medical Press Limited tərəfindən nəşr olunub və lisenziyalaşdırılıb. Bu lisenziyanın tam şərtləri https://www.dovepress.com/terms.php saytında mövcuddur və Creative Commons Attribution - Qeyri Kommersiya (portlaşdırılmamış, v3.0) Lisenziyasını özündə birləşdirir. İşə daxil olmaqla siz Şərtləri qəbul edirsiniz. Əsərin qeyri-kommersiya məqsədli istifadəsinə Dove Medical Press Limited-dən hər hansı əlavə icazə olmadan icazə verilir, bu şərtlə ki, iş lazımi şəkildə aid edilsin. Bu işin kommersiya istifadəsinə icazə üçün Şərtlərimizin 4.2 və 5-ci bəndlərinə baxın.

© Copyright 2021 &öküz Dove Press Ltd maffey.com tərəfindən &bull proqram təminatının inkişafı və Adhesion tərəfindən bull Web Design

Burada dərc olunan bütün məqalələrdə ifadə olunan fikirlər konkret müəllif(lər)in fikirləridir və Dove Medical Press Ltd və ya onun hər hansı əməkdaşının fikirlərini əks etdirmir.

Dove Medical Press, Informa PLC-nin Akademik Nəşriyyat Bölməsi olan Taylor & Francis Group-un bir hissəsidir.
Müəlliflik hüququ 2017 Informa PLC. Bütün hüquqlar qorunur. Bu sayt qeydiyyatdan keçmiş ofisi 5 Howick Place, London SW1P 1WG olan Informa PLC (“Informa”) şirkətinə məxsusdur və idarə olunur. İngiltərə və Uelsdə qeydiyyatdan keçib. Nömrə 3099067. Böyük Britaniya ƏDV Qrupu: GB 365 4626 36

Veb saytımızın ziyarətçilərinə və qeydiyyatdan keçmiş istifadəçilərə onların fərdi seçimlərinə uyğunlaşdırılmış xidmət təqdim etmək üçün biz ziyarətçi trafikini təhlil etmək və məzmunu fərdiləşdirmək üçün kukilərdən istifadə edirik. Məxfilik Siyasətimizi oxuyaraq kukilərdən istifadəmiz haqqında öyrənə bilərsiniz. Biz həmçinin daxili məqsədlər və biznes tərəfdaşlarımızla məlumat mübadiləsi üçün ziyarətçilərimiz və qeydiyyatdan keçmiş istifadəçilərimizlə bağlı məlumatları saxlayırıq. Məxfilik Siyasətimizi oxumaqla hansı məlumatlarınızı saxladığımız, onların necə işləndiyi, kiminlə paylaşıldığı və məlumatlarınızın silinməsi hüququnuz haqqında öyrənə bilərsiniz.

Əgər kukilərdən istifadəmizlə və Məxfilik Siyasətimizin məzmunu ilə razılaşırsınızsa, lütfən, 'qəbul et' düyməsini basın.


İçindəkilər

Polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) xüsusi DNT seqmentlərini bir neçə miqyasda gücləndirmək üçün istifadə edilən molekulyar biologiya üsuludur. DNT-nin spesifik seqmentləri üç proses, denatürasiya, yumşalma və uzadılma üzərində gücləndirilir - burada primerlər bağlanmazdan və polimeraza nukleotidləri şablon zəncirinə uyğunlaşdırana qədər temperaturu otaq temperaturundan optimal səviyyəyə qaldırmaqla DNT zəncirləri ayrılır. Aşağı temperaturda bir qədər aktiv olan DNT polimerazından istifadə edir. [1] Adi PCR-də reaksiya qarışığı otaq temperaturunda tamamlanır və DNT polimeraza aktivliyinə görə primerlər primer dimerləri yarada və ya qeyri-spesifik olaraq DNT-yə bağlana bilər. PCR proseduru zamanı DNT polimeraza DNT-nin istənilən parçasını bağlı primerlərlə genişləndirərək hədəf məhsulları, həm də məhsuldarlığı azaldan qeyri-spesifik məhsullar yaradır. İsti başlanğıc PCR-də reagentlərin bir hissəsi qarışıq xüsusi yumşalma temperaturuna qədər qızdırılana qədər ayrı saxlanılır. Bu, yumşalma müddətini azaldır, bu da öz növbəsində qeyri-spesifik DNT genişlənməsi ehtimalını və denatürasiyadan əvvəl qeyri-spesifik primer bağlanmasının təsirini azaldır. [6] [5]

Ənənəvi PCR-də optimal yumşalma temperaturundan (50-65 °C) aşağı olan aşağı temperaturlar, primerlərin nuklein turşusu ilə qeyri-spesifik şəkildə bağlanacağı qeyri-spesifik gücləndirmələr kimi hədəfdən kənar dəyişikliklərlə nəticələnir. [5] Qarışıqda həddindən artıq olan bu qeyri-spesifik primer kompleksləri primer dimer və yanlış astarlama kimi əlavə məhsulların sintezinin səbəbidir. [10] Səhv astarlama gücləndirmə üçün hədəf ardıcıllıqla aktiv rəqabət apararaq PCR gücləndirilməsinin effektivliyini əhəmiyyətli dərəcədə maneə törədir və azaldır. Eynilə, primer dimerləri əldə edilən nüsxə sayı gücləndirmələrinin miqdarını azaldan komplekslər əmələ gətirir. [10] Bu, optimal temperaturlara çatana qədər primer uzantılarının bloklanmasına imkan verən isti başlanğıc PCR tətbiq etməklə idarə oluna bilər. [2]

İsti başlanğıc PCR-də mühüm reagentlərin (məsələn, DNT polimeraza və maqnezium kofaktorları) fiziki ayırma və ya kimyəvi modifikasiyalar vasitəsilə optimal temperaturlar təmin olunana qədər PCR qarışığında reaksiya verməsinin qarşısı alınır. [5] [2] İsti başlanğıc PCR, həmçinin Taq polimerazı inhibə edildikdə/inaktivləşdirildikdə və ya onun əlavə edilməsi deoksiribonukleotid trifosfat modifikasiyaları vasitəsilə və ya qəfəsləmə və ikincil struktur manipulyasiyası vasitəsilə primerləri dəyişdirərək optimal yumşalma temperaturlarına qədər gecikdikdə baş verə bilər.

Reaksiya qarışığında DNT çatışmazlığı (>10 4 nüsxə), DNT şablonunun çox mürəkkəb olduğu və ya PCR-də bir neçə cüt oliqonukleotid primerinin olduğu hallarda isti başlanğıc PCR çox vaxt ənənəvi PCR-dən fərqli olaraq daha yaxşı yanaşmadır. [3]

İsti başlanğıc PCR, məhsul itkisini minimuma endirmək üçün qeyri-spesifik bağlanmanın qarşısını almaq üçün daha aşağı temperaturda DNT polimerazının uzanmasının qarşısını alan bir üsuldur. İsti başlanğıc PCR, PCR-nin qızdırma mərhələlərinə qədər məhdudlaşdırıcı reagentlər vasitəsilə qeyri-spesifik bağlanmanın miqdarını azaldır – reaksiyada Taq DNT polimerazını məhdudlaşdırmaqla reaksiyanı erkən məhdudlaşdırır. Qeyri-spesifik bağlanma tez-tez primer dimerlərə və yanlış astarlanmış/yalançı astarlanmış hədəflərə gətirib çıxarır. [11] Bunlar dəyişdirilmiş üsullarla düzəldilə bilər, məsələn:

Taq DNT polimerazının inaktivasiyası/inhibisyonu

Anti Taq DNT polimeraza anticisimləri ilə kompleksləşdirilmiş fermentlə əlaqəli antikorlar/Taq DNT polimeraza:

Fermentlə əlaqəli antikorlar Taq DNT polimerazını təsirsiz hala gətirir. Antikorlar polimeraza bağlanır və bağlanır, aşağı temperaturda baş verə biləcək erkən DNT gücləndirilməsinin qarşısını alır. Optimal yumşalma temperaturu təmin edildikdən sonra antikorlar deqradasiyaya və dissosiasiyaya başlayacaq, Taq DNT polimerazını reaksiyaya buraxacaq və gücləndirmə prosesinin başlamasına imkan verəcək. [2] [12] Platinum Taq DNT polimeraza və AccuStart Taq DNT polimeraza (hər ikisi müvafiq olaraq Life Technology və Quanta BioSciences-də Ayoub Rashtchian tərəfindən hazırlanmışdır) kommersiya baxımından mövcud olan antikor əsaslı qaynar başlanğıc Taq DNT polimerazlarının nümunələridir. Bu Taq DNT polimerazaları Taq DNT polimerazasına xas olan monoklonal antikorların qarışığı ilə əvvəlcədən mürəkkəbləşir. [13]

Taq DNT polimerazı ilə PCR komponentlərinin qalan hissəsi arasında temperaturdan asılı olan mum muncuqları tərəfindən fiziki maneə yaradılır. Temperatur 70 °C-dən yuxarı qalxdıqdan sonra, birinci dövrədə denaturasiya mərhələsi zamanı mum muncuq əriyir və Taq DNT polimerazının maneəni keçərək reaksiyaya buraxılmasına imkan verir - gücləndirmə prosesinə başlayır. Daha sonra mum təbəqəsi gücləndirmə mərhələsində reaksiya qarışığının yuxarısına doğru hərəkət edərək daha sonra buxar maneəsi kimi çıxış edir. [2]

Yüksək spesifik oliqonukleotidlər:

Oliqonukleotidlər asanlıqla bağlanan nuklein turşusunun qısa polimerləridir. Aptamerlər kimi yüksək spesifik oliqonukleotidlər daha aşağı temperaturda Taq DNT polimeraza bağlanaraq onu qarışıqda qeyri-aktiv edir. Yalnız yüksək temperaturda oliqonukleotidlər Taq-dan ayrılaraq reaksiya verməyə imkan verəcəkdir. [5]

Bunlar isti başlanğıc PCR üçün ən təsirli üsullardır, fermentlə əlaqəli antikorlar və xüsusilə yüksək spesifik oliqonukleotid üsulları daha qısa inaktivasiya müddəti tələb edən prosedurlar zamanı ən uyğundur. [14] Bununla belə, digər üsulların həyata keçirildiyi məlumdur, məsələn:

Taq DNT polimerazının gec əlavə edilməsi Edit

Komponentlər buz üzərində qarışdırılarkən PCR maşını əvvəlcədən qızdırılır və optimal temperatura çatdıqdan sonra dərhal PCR maşınına yerləşdirilir. Bu, tələb olunan istiləşmə prosesini aradan qaldıracaq, primerlərin qeyri-spesifik tavlanmasını azaldacaq və qarışıqdakı hər hansı buraxılmış qoşalaşmış primerlərin ayrılmasını təmin edəcək. [15]

Dondurma, mum muncuqları kimi fiziki ayrılma forması kimi çıxış edir. Tərkibində primerlər, şablon zəncir, su və deoksiribonukleotid trifosfat (dNTP) olan reaksiya qarışığı Taq polimerazdan əvvəl dondurulur və qalan PCR komponentləri dondurulmuş qarışığın üzərinə əlavə edilir. Bu, qeyri-spesifik bağlamanın qarşısını alır. [15]

Reaksiya qarışığındakı PCR komponentləri Taq əlavə edilmədən hazırlanır və qızdırılır. Taq yalnız optimal temperatura çatdıqdan sonra qarışığa daxil edilir. Bununla belə, bu üsul ən az etibarlıdır və komponentlərin çirklənməsinə səbəb ola bilər. [15]

Başqa bir üsul, qoruyucu qrup vasitəsilə nukleotid əsaslarını dəyişdirən deoksiribonukleotid trifosfat vasitəçiliyi ilə qaynar başlanğıc PCR-dir.

Deoksiribonukleotid trifosfat (dNTP) dəyişiklikləri Redaktə edin

İsti başlanğıc dNTP kimyəvi cəhətdən dəyişdirilə bilər ki, 3 əsas terminalda istiliyə həssas qoruyucu qrup daxil olsun. Bu modifikasiya optimal temperatura çatana qədər nukleotidlərin Taq polimeraza ilə qarşılıqlı əlaqədə olmasının qarşısını alacaq və buna görə də istilik aktivləşdirmə mərhələsi zamanı qoruyucu qrup çıxarılacaq. İsti başlanğıc dNTP, dA, dT, dC və dG təbii nukleotidləri əvəz edir. [16] [17] Dörd dəyişdirilmiş nukleotidin hamısından istifadə etmək tövsiyə olunur, lakin əvvəlki tədqiqatlar göstərir ki, təbii nukleotidin bir və ya ikisini dəyişdirilmiş dNTP-lərlə əvəz etmək qeyri-spesifik gücləndirmənin baş verməməsini təmin etmək üçün kifayətdir. [16] [17] Nuklein turşusunun digər kimyəvi modifikasiyası, primerlərin maraq şablonuna hibridləşməsinə mane olan istiliklə dönən kovalent modifikasiyadan keçir. Quanozin amin qrupu dG əmələ gətirmək üçün qlioksalla qarşılıqlı əlaqədə olur. [18]

Dəyişdirilmiş primerlər Redaktə edin

Müəyyən ikinci dərəcəli quruluş primerlərin funksiyalarına mane ola bilər. Məsələn, saç sancağı quruluşuna malik oliqonukleotidlər primer kimi effektiv fəaliyyət göstərə bilməzlər. Bununla belə, reaksiya qarışığını tavlama temperaturuna qədər qızdırdıqdan sonra primer uyğunlaşma dəyişikliyinə məruz qalacaq və bunun əvəzinə primerin xətti struktur meydana gətirməsinə imkan verəcək, bu da primerin hədəf seqmentə yapışmasına və PCR-ə başlamasına imkan verəcək. [19] [20]

Fotokimyəvi olaraq çıxarıla bilən qəfəslər:

Fotokimyəvi cəhətdən çıxarıla bilən qoruyucu qrup olan qəfəs qrupu, məsələn, qəfəsli timidin fosforamiditləri, oliqonukleotid primerinə daxil edilmişdir. Bu, UV şüalanmasının (365 nm) istifadəsi ilə primerin funksiyasını aktivləşdirməyə və söndürməyə imkan verir. Buna görə də, primerlər tavlama temperaturuna çatdıqdan sonra aktivləşdirilə bilər. [21]

Maqneziumun idarə olunan əlavəsi Edit

Maqnezium PCR-də tələb olunur və Taq polimeraza maqneziumdan asılı olduğu üçün ko-faktor kimi çıxış edir. [22] Maqnezium və fosfatın konsentrasiyasının standart tampon reagentlərinə artırılması maqnezium çöküntüsü yaradır və istilik dövriyyəsi mərhələsinə qədər DNT polimeraza üçün maqnezium olmadığından reaksiya üçün isti başlanğıcı təmin edir. Termal dövriyyə zamanı maqnezium yenidən məhlulda həll olunacaq və polimerazın normal işləməsinə imkan verən istifadə üçün əlçatan olacaq. [23]

İsti başlanğıc PCR daha az rəftar tələb etməsi və çirklənmə riskini azaltması baxımından üstündür. İsti başlanğıc PCR ya kimyəvi cəhətdən dəyişdirilə bilər, ya da prosedura fərqli üstünlüklər verən antikor əsaslı ola bilər. Kimyəvi modifikasiya edilmiş isti başlanğıc PCR-də prosedur otaq temperaturu altında aparıla bilər və PCR prosesi başlamazdan əvvəl primerlərin bir-birinə bağlanmasının qarşısını almaqla, eləcə də qeyri-spesifik astarlamanı məhdudlaşdırmaqla primer-dimerlərin əmələ gəlməsini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır. Eynilə, isti başlanğıc PCR, aşağı homologiyaya malik olan şablon ardıcıllıqlarına primerlərin bağlanmasını maneə törədir və bu, yanlış işləməyə səbəb olur. O, həmçinin sərt şərtlərə görə spesifikliyi və həssaslığı yaxşılaşdıra, həmçinin hədəf fraqmentin məhsul məhsuldarlığını artıra bilər. [5] Antikor əsaslı isti başlanğıc PCR-də polimeraza velosiped prosesi zamanı ilkin denatürasiya pilləsindən sonra aktivləşdirilir və buna görə də tələb olunan vaxt azalır. Bu da yüksək spesifikliyə gətirib çıxarır. [14]

Üstünlükləri ilə yanaşı, isti başlanğıc PCR də metodu tətbiq etməzdən əvvəl nəzərə alınmalı olan məhdudiyyətlərə malikdir. İsti başlanğıc PCR, adi PCR-dən fərqli olaraq daha uzun müddət istilik əlavə edilməsini tələb edir, buna görə də şablon DNT zədələnməyə daha həssasdır. Artan isitmə vaxtı həm də o deməkdir ki, prosedur bir boru, tək tamponlu tərs transkripsiya-PCR metodu kimi müəyyən prosedurlara uyğun gəlmir ki, bu da əks transkripsiya addımından keçmək üçün daha aşağı temperatur tələb edir. [12] Kimyəvi modifikasiya edilmiş isti başlanğıc PCR-də, ilk növbədə, polimerazanın aktivləşməsi üçün tələb olunan reaktivləşmə müddətinin əhəmiyyətli dərəcədə artması və ikincisi, hədəf DNT şablonunun uzunluğu çox uzun olması səbəbindən DNT-nin gücləndirilməsi prosesinə mənfi təsir göstərə bilər. [14] Antikor əsaslı prosedurlarda hər bir ferment fərqli antikor tələb edir və buna görə də proseduru yerinə yetirmək üçün xərc daha yüksəkdir [15]


DNT Polimeraza Seçim Cədvəli

Aşağıdakı cədvəldə polimeraza seçərkən nəzərə alınmalı olan xüsusiyyətlər verilmişdir. Bu xüsusiyyətlər reaksiya şəraitindən asılı ola bildiyinə görə, müəyyən bir tətbiqdə istifadə etməzdən əvvəl əsas istinadlara müraciət edilməlidir.

PCR polimerazları 3&prime&ndash>5&prime Exonuclease Sədaqət 5&prime&ndash>3&prime Exonuclease Strand yerdəyişməsi Nik Tərcümə RNT primerini genişləndirin Nikdən genişlənmə dU Tolerantlıq Nəticə Sonları Populyar Formatlar Mövcuddur Proqramlar
Yüksək Dəqiqlik PCR
Q5 ® Yüksək Dəqiqlik DNT Polimerazı ++++ 280x Taq Yox _ Yox Yox Yox Yox Küt Q5 ® Yüksək Dəqiqlik DNT Polimerazası Ultra yüksək dəqiqlikli PCR, uzunmüddətli PCR, zülal ifadəsi və ya gen analizi üçün in vitro materialdan klonlaşdırma, klonlaşdırma və ardıcıllıqla SNP analizi, sahəyə yönəldilmiş mutagenez
Q5 ® Hot Start Yüksək Dəqiqlik DNT Polimerazası
Q5 ® Yüksək Dəqiqlik DNT Polimeraz 2x Master Mix
Q5 ® High-Fidelity Hot Start DNT Polimerase 2x Master Mix
NEBNext ® Ultra&trade II Q5 ® Master Mix NGS kitabxanasına hazırlıq
Q5U ® Hot Start Yüksək Dəqiqlik DNT Polimerazası ++++ Yox _ Yox Yox Yox Bəli Küt Q5U ® Hot Start Yüksək Dəqiqlik DNT Polimerazası İSTİFADƏÇİ klonlaması, bisulfit çevrilmiş və ya deaminasiya edilmiş DNT substratlarının yüksək dəqiqliklə gücləndirilməsi, ötürülmənin qarşısının alınması
NEBNext Q5U ® Master Mix
Phusion ® Yüksək Dəqiqlik DNT Polimerazı* ++++ 39 b -50x c Taq Yox _ Yox Yox Yox Yox Küt Phusion ® Yüksək Dəqiqlik DNT Polimerazı Yüksək dəqiqlikli PCR, klonlama
Phusion ® HF Bufer ilə Yüksək Sədaqətli PCR Master Mix
Phusion ® GC Buferi ilə Yüksək Sədaqətli PCR Master Mix
Phusion ® Hot Start Flex DNT Polimerase
Phusion ® Hot Start Flex 2X Master Mix
Rutin PCR
BirTaq ® DNT polimeraza ++ 2x Bəli _ j Bəli Yox Bəli Bəli 3'A/Blunt BirTaq ® DNT polimeraza Rutin PCR, koloniya PZR, genotip skrininqi
BirTaq ® Hot Start DNT Polimerase
BirTaq ® və BirTaq ® Hot Start 2x Master Mixes
BirTaq ® Tez Yükləmə DNT Polimerazası
BirTaq ® Quick-Load ® 2X Master Mix
Taq DNT polimeraza _ 1x Bəli _ j Bəli Yox Bəli Bəli 3'A TaqThermopol Bufer ilə DNT Polimeraz Rutin PCR
İsti başlanğıc TaqDNT polimeraza
Taq və İsti başlanğıc Taq 2X Master Mix
Sürətli yükləmə Taq 2X Master Mix
Multipleks PCR 5X Master Mix Multipleks son nöqtə PCR
Xüsusi PCR
LongAmp ® Taq DNT polimeraza ++ 2x Bəli _i Bəli Yox Bəli Bəli 3'A/Blunt LongAmp ® Taq DNT polimeraza Mürəkkəb və sadə şablonlar üçün uzun müddətli PCR
LongAmp ® İsti başlanğıc Taq DNT polimeraza
LongAmp ® Taq 2X Master Mix
LongAmp ® İsti başlanğıc Taq 2X Master Mix
Hemo KlenTaq _ Yox _ Yox Yox Yox Bəli 3'A Hemo KlenTaq Birbaşa qan PCR
Epimark ® İsti başlanğıc Taq DNT polimeraza _ Bəli _ j Bəli Yox Bəli Bəli 3'A Epimark ® İsti başlanğıc Taq DNT polimeraza Bisulfit çevrilmiş DNT amplifikasiyası, AT zəngin şablonları
İzotermik gücləndirmə və tellərin yerdəyişməsi 3&prime&ndash>5&prime Exonuclease Səhv dərəcəsi (x 10 -6 )
5&prime&ndash>3&prime Exonuclease Strand yerdəyişməsi Nik Tərcümə RNT primerini genişləndirin Nikdən genişlənmə dU Tolerantlıq Nəticə Sonları Populyar Formatlar Mövcuddur Proqramlar
Bst DNT Polimeraz, Tam Uzunluq _ Bəli _ j
Bəli Bəli Bəli Bəli 3'A Bst DNT Polimeraz, Tam Uzunluq Nik tərcüməsi
Bst DNT Polimeraz, Böyük Fraqment _ Yox ++++ Yox Bəli Bəli Bəli 3'A Bst DNT Polimeraz, Böyük Fraqment İzotermik Gücləndirmə (LAMP, SDA) molekulyar diaqnostikası, sahə diaqnostikası
Bst 2.0 DNT polimeraza _ 62 (±5) e Yox ++++ Yox Bəli Bəli Bəli 3'A Bst 2.0 DNT polimeraza
Bst 2.0 WarmStart ® DNT Polimerase
UDG ilə WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix
WarmStart ® LAMP Kit (DNT və RNT)
WarmStart ® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNT və RNT)
Bst 3.0 DNT polimeraza _ 70 (±23) e Yox ++++ Yox Bəli Bəli Bəli 3'A Bst 3.0 DNT polimeraza
Bsu DNT Polimeraz, Böyük Fraqment _ Yox + Yox Bəli Bəli Bəli 3'A Bsu DNT Polimeraz, Böyük Fraqment İzotermik Gücləndirmə (RPA, SDA, RCA)
phi29 DNT polimeraza ++++ 5 i Yox + Yox Bəli Bəli k Bəli Küt phi29 DNT polimeraza WGA
DNT manipulyasiyası üçün polimerazlar 3&prime&ndash>5&prime Exonuclease Səhv dərəcəsi (x 10 -6 ) 5&prime&ndash>3&prime Exonuclease Strand yerdəyişməsi Nik Tərcümə RNT primerini genişləndirin Nikdən genişlənmə dU Tolerantlıq Nəticə Sonları Populyar Formatlar Mövcuddur Proqramlar
T7 DNT Polimeraz (dəyişdirilməmiş) ++++ 15 h Yox _ Yox Bəli Yox Küt T7 DNT Polimeraz (dəyişdirilməmiş)
Sulfolobus DNT Polimeraz IV _ Yox _ Yox 3'A Sulfolobus DNT Polimeraz IV Trans lezyon bypass
Terminator və ticarət DNT Polimeraz _ Yox + Yox Bəli Bəli Bəli 3'A Terminator və ticarət DNT Polimeraz Zəncir terminatoru
DNT Polimeraz I (E. coli) ++ 9 f Bəli _ j Bəli Bəli Bəli Bəli Küt DNT Polimeraz I (E. coli) İkinci zəncir sintezi, nik tərcüməsi
DNT Polimeraz I, Böyük (Klenow) Fragment' ++ 18 q Yox + Yox Bəli Bəli Bəli Küt DNT Polimeraz I, Böyük (Klenow) Fragment' Kütlənmə, primer uzantısı
Klenow Fragment (3&prime&rarr5&prime exo_) _ 100 q Yox +++ Yox Bəli Bəli Bəli 3'A Klenow Fragment (3&prime&rarr5&prime exo_) Bir quyruq, təsadüfi astarlama etiketi
T4 DNT polimeraza ++++ <1 f Yox _ Yox Bəli Yox Küt T4 DNT polimeraza Körtləmə
Köhnə polimerazlar 3&prime&ndash>5&prime Exonuclease Səhv dərəcəsi (x 10 -6 ) 5&prime&ndash>3&prime Exonuclease Strand yerdəyişməsi Nik Tərcümə RNT primerini genişləndirin Nikdən genişlənmə dU Tolerantlıq Nəticə Sonları Populyar Formatlar Mövcuddur Proqramlar
DNT Polimerazı çıxarın və qeyd edin ++ Yox + Yox Yox Bəli Yox Küt DNT Polimerazı çıxarın və qeyd edin
Vent ® (ekso&ndash) DNT Polimeraz _ Yox +++ Yox Yox Bəli Yox 3'A Vent ® (ekso&ndash) DNT Polimeraz
Dərin havalandırma və reg DNT polimeraza +++ Yox ++ Yox Yox Bəli Yox Küt Dərin havalandırma və reg DNT polimeraza
Deep Vent ® (exo&ndash) DNT Polimerase _ Yox +++ Yox Yox Bəli Yox 3'A Deep Vent ® (exo&ndash) DNT Polimerase

Deep Vent ® və Therminator&trade New England Biolabs, Inc-in ticarət nişanlarıdır.
Q5 ® , Q5U ® , LongAmp ® , BirTaq ® , Vent ® New England Biolabs, Inc şirkətinin qeydə alınmış ticarət nişanlarıdır.

* Müştərilərə bildiriş:
Phusion ® DNT Polimerase Finnzymes Oy tərəfindən hazırlanıb, hazırda Thermo Fisher Scientific-in bir hissəsidir. Bu məhsul New England Biolabs, Inc. tərəfindən Thermo Fisher Scientific ilə razılaşma əsasında və performans spesifikasiyası əsasında istehsal olunur.
Phusion ®, Thermo Fisher Scientific-in qeydə alınmış ticarət nişanıdır və mülkiyyətidir.


Təşəkkürlər

Bu iş qismən Çinin Elm və Texnologiya Nazirliyinin (No 2015CB553402 və No 2016YFC0206300 - TFZ No. 2017YFA0505200 - LL), Çin Milli Təbiət Elmləri Fondunun (No. 314705312, No. 314705312, No. və No.31711530153-dən TFZ No. 21532004-dən LL-ə qədər), Pekin Nova Proqramı (No. Z171100001117011 - TFZ), Tsinghua Universiteti Təşəbbüsünün Elmi Tədqiqat Proqramı (No. 20161080152), Elm Universiteti üçün Lifesinq Universiteti-Psikinq Universiteti (CLS) və Struktur Biologiya üçün Pekin Təkmil İnnovasiya Mərkəzi.


Əks transkripsiya polimeraza zəncirvari reaksiya (RT-PCR)

RT-PCR-də bir RNT populyasiyası əks transkripsiya (RT) ilə cDNT-yə çevrilir və sonra cDNT polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) ilə gücləndirilir (Şəkil 1). cDNA gücləndirmə addımı, hətta onların miqdarı məhdud olduqda və ya az bolluqda ifadə edildikdə belə, orijinal RNT növlərini daha da öyrənmək üçün imkanlar təmin edir. RT-PCR-nin ümumi tətbiqlərinə ifadə edilmiş genlərin aşkarlanması, transkript variantlarının araşdırılması və klonlaşdırma və ardıcıllıq üçün cDNA şablonlarının yaradılması daxildir.

Əks transkripsiya PCR gücləndirilməsi və aşağı axın təcrübələri üçün cDNA şablonları təmin etdiyi üçün bu, eksperimental uğur üçün ən kritik addımlardan biridir. Seçilmiş tərs transkriptaza, pozulmuş, daşıma inhibitorları olan və ya yüksək dərəcədə ikinci dərəcəli quruluşa malik olanlar kimi çətin RNT nümunələri ilə belə ən yüksək effektivliyi təklif etməlidir. (Ağ kağız:Mühəndisləşdirilmiş tərs transkriptaza)

RT-PCR həyata keçirərkən, bir addımlı və iki addımlı üsullar iki ümumi yanaşmadır, hər birinin öz üstünlükləri və mənfi cəhətləri var (Şəkil 2). Adından da göründüyü kimi, bir addımlı RT-PCR bir reaksiya borusunda birinci zəncirli cDNA sintezini (RT) və sonrakı PCR-ni birləşdirir. Bu reaksiya quraşdırma iş axını asanlaşdırır, dəyişkənliyi azaldır və mümkün çirklənməni minimuma endirir. Bir addımlı RT-PCR çoxlu sayda nümunələrin daha asan işlənməsinə imkan verir və onu yüksək məhsuldarlığa malik tətbiqlərə uyğun edir. Bununla belə, bir addımlı RT-PZR gücləndirmə üçün gen-spesifik primerlərdən istifadə edir və analizi hər RNT nümunəsi üçün bir neçə genlə məhdudlaşdırır. Reaksiya əks transkripsiya və gücləndirmə şərtləri arasında kompromis olduğundan, bir addımlı RT-PCR bəzi ssenarilərdə daha az həssas və daha az səmərəli ola bilər. Buna baxmayaraq, RT-PCR-də genə xüsusi primerin istifadəsi hədəf cDNA-nın məhsuldarlığını artırmağa və fon gücləndirilməsini minimuma endirməyə kömək edə bilər. (Ağ kağız:Təkmilləşdirilmiş bir addımlı RT-PCR sistemi)

İki mərhələli RT-PCR ilk zəncirli cDNT sintezindən (RT) başlayaraq, sonra əldə edilən cDNT-nin bir hissəsinin ayrı bir boruda PCR ilə gücləndirilməsi ilə başlayan iki ayrı reaksiyaya səbəb olur. Buna görə də, iki addımlı RT-PCR bir RNT nümunəsində çoxlu geni aşkar etmək üçün faydalıdır. RT və PCR reaksiyalarının ayrılması hər bir addım üçün reaksiya şəraitinin optimallaşdırılmasına, eləcə də əks transkripsiya primerləri (oliqo(dT) primerləri, təsadüfi heksamerlər və ya gen-spesifik primerlər) və PCR quraşdırması (məsələn, DNT polimeraz seçimi) ilə çevikliyə imkan verir. və PCR komponentləri). Bir addımlı RT-PZR ilə müqayisədə, iki addımlı RT-PCR-nin çatışmazlıqlarına uzadılmış iş axını, əlavə nümunələrin işlənməsi və emalı, çirklənmə və nəticələrin dəyişmə şansının artırılması üçün bir neçə addım daxildir.

Cədvəl 1. Bir addımlı və iki addımlı RT-PZR-in müqayisəsi

Bir addımlı RT-PCRİki mərhələli RT-PCR
QurmaqHəm əks transkripsiyanı, həm də PCR-ni dəstəkləyən şəraitdə birləşmiş reaksiyaƏks transkripsiya və PCR üçün optimallaşdırılmış reaksiyaları ayırın
AstarlarGen spesifik primerlərOliqo(dT), təsadüfi heksamerlər və ya gen-spesifik primerlərin seçimi
İdeal istifadəBir və ya iki genin yüksək məhsuldarlıq platformalarının təhliliÇoxlu genlərin təhlili
ÜstünlükRahat, yüksək məhsuldarlıqÇevik

1-addım və 2-addımlı RT-PCR

Bir addımlı və iki addımlı RT-PCR arasındakı fərqlər və tətbiqləriniz üçün bunlar arasında necə seçim etməyiniz haqqında öyrənin.

Yüksək spesifik bir addımlı RT-PCR nəticələrinə necə nail olmaq olar

Bir addımlı RT-PCR mexanizmi, onun çətinlikləri və onların aradan qaldırılması yolları haqqında məlumat əldə edin.

Daha ətraflı

Əlaqədar məhsullar


6.5: Polimeraza Zəncirvari Reaksiya (PZR) - Biologiya

Bu məzmuna baxmaq üçün J o VE -yə abunə olmaq lazımdır. Siz yalnız ilk 20 saniyəni görə biləcəksiniz.

JoVE video pleyeri HTML5 və Adobe Flash ilə uyğun gəlir. HTML5 və H.264 video codecini dəstəkləməyən köhnə brauzerlər hələ də Flash əsaslı video pleyerdən istifadə edəcəklər. Biz burada Flash-ın ən yeni versiyasını endirməyi tövsiyə edirik, lakin biz bütün 10 və yuxarı versiyaları dəstəkləyirik.

Bu kömək etmirsə, lütfən, bizə bildirin.

PCR, Polimeraza Zəncirvari Reaksiyasının məqsədi genetik ardıcıllığı gücləndirməkdir. Bu nümunədə, maraq doğuran bir gen təmizlənmiş DNT-dən gücləndiriləcəkdir. Gücləndirməni həyata keçirmək üçün yeni DNT-ni sintez etmək üçün bir polimeraza tələb olunur.

Bir primer, maraq geninə homologiyanı paylaşan qısa bir zəncirli DNT parçası da lazımdır. Nəhayət, yeni zəncir yaratmaq üçün Deoksinukleozid trifosfatlar və ya dNTP adlanan tək nukleotidlər istifadə olunur. PCR-də ilk addım DNT-ni denatürasiya edən qarışığı qızdırmaqdır.

Sonra, reaksiya soyudulur və primerlər homoloji bölgələrinə bağlanacaqlar. Reaksiya bağlandıqdan sonra polimeraza üçün optimal temperatura qədər qızdırılır. Daha sonra polimeraza primer DNT kompleksini tanıyır və məhluldakı dNTP-lərdən istifadə edərək yeni zəncirinin sintezinə başlayır.

Daha sonra reaksiya qızdırılır və əlavə dövrlərdə təsvir olunduğu kimi davam edir. Üçüncü sikldən sonra genin səkkiz ümumi nüsxəsi var. Dördüncü dövrədən sonra 16 nüsxə.

Və beşinci dövr, 32 nüsxə. Dövrlərin sayı eksponent olaraq artmağa davam edəcək. 30 dövrədən sonra cəmi bir milyard nüsxə var.

15.14: PCR

Baxış

Polimeraza zəncirvari reaksiya və ya PCR, DNT seqmentlərinin surətini çıxarmaq üçün geniş istifadə olunan bir texnikadır. Eksponensial gücləndirmə sayəsində PCR bir neçə saat ərzində milyonlarla və ya milyardlarla DNT nüsxəsini çıxara bilər.PCR reaksiyasında, istiliyədavamlı DNT polimeraza fermenti termosikl adlanan avtomatlaşdırılmış maşın daxilində bir sıra temperatur dəyişiklikləri vasitəsilə orijinal DNT-ni gücləndirir.

PCR, Molekulyar Biologiyada inqilab edən çox yönlü bir üsuldur

Kary Mullis 1983-cü ildə PCR-ni inkişaf etdirdi və bunun üçün 1993-cü ildə Kimya üzrə Nobel Mükafatına layiq görüldü. DNT ardıcıllığının surətinin çıxarılmasının nisbətən sürətli, ucuz və dəqiq üsulu olan PCR molekulyar klonlaşdırma, gen mutagenezi, patogenin aşkarlanması, gen ifadə analizi, DNT kəmiyyətinin təyini və ardıcıllığı və genetik xəstəliklərin diaqnostikası da daxil olmaqla çoxsaylı tətbiqlər üçün əvəzsiz alətə çevrildi.

PCR reaksiya dövrü

PCR hüceyrələrdə baş verən təbii DNT replikasiya prosesini təqlid edir. Reaksiya qarışığına kopyalanacaq şablon DNT ardıcıllığı, primerlər adlanan bir cüt qısa DNT molekulu, deoksinukleotid trifosfatlar (dNTPs) adlanan sərbəst DNT tikinti blokları və xüsusi DNT polimeraza fermenti daxildir.

PCR yüksək temperaturda bir sıra addımları əhatə edir və belə temperaturlarda işləyən DNT polimeraza fermenti tələb olunur. Ən çox istifadə edilən DNT polimerazdır Taq polimeraza adını daşıyır Thermus aquaticus, polimerazın əvvəlcə təcrid olunduğu bakteriya. DNT polimeraza sıfırdan və ya de novo DNT molekulunu sintez edə bilmir. Əvəzində DNT polimeraza əlavə baza cütləşməsi vasitəsilə DNT şablonuna bağlanan primerlər adlanan qısa DNT molekullarına əlavə olunur. Primerlər DNT polimerazanın yeni dNTP-ləri birləşdirə biləcəyi pulsuz 3&rsquo hidroksil qrupu təmin edir. PCR-də dörd növ dNTP var, DNT molekulunda hər nukleotid üçün bir: dATP, dCTP, dGTP və dTTP.

Hər bir PCR dövrü üç mərhələdən ibarətdir: denatürasiya, yumşalma və DNT sintezi.

  1. Denatürasiya. PCR dövrü reaksiya qarışığının yüksək temperatura qızdırılması ilə başlanır, bu da DNT ikiqat spiralının iki zəncirinə ayrılmasına səbəb olur. Bu &ldquomelting&rdquo prosesi adətən 90°C&utancaq&utancaq&ndash100°C temperaturda baş verir.
  2. Qızartma. Reaksiya qarışığı tez soyudulur (adətən 50°C&ndash65°C-ə qədər), bu iki primerin şablon DNT zəncirlərindəki tamamlayıcı ardıcıllıqlarına bağlanmasına imkan verir.
  3. DNT sintezi (primer uzadılması). Reaksiya qarışığı yenidən qızdırılır, bu dəfə bir temperatura (adətən 60°C&ndash75°C) qızdırılır ki, bu da DNT polimeraza şablon zəncirindəki əsaslarla cütləşən dNTP-ləri əlavə edərək primerləri uzatmağa imkan verir.

Tipik bir PCR, termosikldə baş verən bu üç addımın 20-40 təkrar dövrünü əhatə edir. DNT molekullarının sayı hər dövrədə iki dəfə artdığından, DNT eksponent olaraq gücləndirilir.

PCR məhdudiyyətləri

Əgər alim genomun müəyyən bir hissəsini gücləndirmək istəyirsə, alim müvafiq primerləri tərtib etmək üçün hədəf DNT ardıcıllığının ən azı bir hissəsini bilməlidir. Digər potensial problem, qeyri-hədəf DNT-nin gücləndirilməsinə gətirib çıxaran, primerlərin qismən oxşar DNT ardıcıllığına qeyri-spesifik bağlanmasıdır. Bu problem reaksiya şəraitini optimallaşdırmaqla idarə oluna bilər. Yüksək həssas aşkarlama üsulu olan PCR həm də çirklənməyə qarşı həssasdır və hətta az miqdarda çirkləndirici DNT də yanlış nəticələrə səbəb ola bilər. PCR-də istifadə olunan DNT polimerazları səhvlərə meylli ola bilər. İlk bir neçə dövr ərzində bir mutasiya baş verərsə, gücləndirilmiş DNT-nin çoxu mutasiyanı daşıyacaqdır.

Qaribyan, Lilit və Nidhi Avaşia. &ldquoSadələşdirilmiş Tədqiqat Texnikaları: Polimeraza Zəncirvari Reaksiya (PZR).&rdquo Araşdırma Dermatologiyası Jurnalı 133, yox. 3 (Mart 2013): e6. [Mənbə]

Pray, Leslie A. &ldquoBiotexnologiya İnqilabı: PCR və İfadə edilmiş Genləri Klonlaşdırmaq üçün Əks Transkriptazın İstifadəsi.&rdquo Təbiət Təhsili 1, yox. 1 (2008): 94. [Mənbə]


Videoya baxın: تفاعل البلمرة المتسلسل PCR (Oktyabr 2022).