Məlumat

Protein oliqomerizasiyasının işlənib hazırlandığı sənədlər

Protein oliqomerizasiyasının işlənib hazırlandığı sənədlər


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Məndə monomer rolunu oynayan bir zülal var, lakin in vivo olaraq nisbətən yüksək özünə yaxınlığı var (zülal üçün kodlaşdıran plazmidin keçici transfeksiyasından istifadə etməklə ölçülür), bu, zəhlətökəndir, çünki şərti öz-özünə assosiasiya yaratmağa çalışıram. FRB-FKBP w/rapamisin kimi. Zülalın öz-özünə yığılmasının aradan qaldırıldığı hər hansı sənəd varmı?

Mənim hazırkı yanaşmam zülal strukturunu müəyyən etmək üçün yivdən istifadə etmək və öz-özünə qarşılıqlı təsir sahələrini müəyyən etmək və həmin saytları mutasiya etmək üçün dok proqramından istifadə etməkdir.


G-protein ilə əlaqəli reseptorların oliqomerizasiyası və onun dərman kəşfi potensialı

İnsan genomu 1000-dən çox G-zülalla əlaqəli reseptorları (GPCR) kodlayır və bu zülalları ən böyük dərman hədəfləri sinfinə çevirir və bütün müasir dərmanların 50%-nin GPCR fəaliyyətini modullaşdırdığı təxmin edilmişdir. Bu reseptorların homo-oliqomerik və hetero-oliqomerik komplekslər meydana gətirməsinin son dərk edilməsinə baxmayaraq, GPCR-lərə yönəldilmiş praktiki olaraq bütün terapevtiklər bu reseptorların monomerik olduğunu güman edən analizlərdən istifadə etməklə hazırlanmışdır və GPCR biologiyasının bu mühüm aspekti əsasən GPCR-lərin axtarışı üçün sxemlərə daxil edilməmişdir. yeni terapevtiklər.

GPCR oliqomerlərinin nə qədər böyük olduğu və ya reseptorların bir neçə oliqomer vəziyyətdə mövcud olub-olmadığı bilinməsə də, düzgün formalaşmış oliqomerlərin yığılması hüceyrə səthinə düzgün hüceyrə daşınması üçün bir tələb kimi görünür. Özünün mutant və ya variant formaları olan reseptorun oliqomerləşməsi reseptorların ifadəsinin zəifləməsi ilə nəticələnə bilər və buna görə də potensial xəstəlik mexanizmi və ya reseptor funksiyasının hüceyrə özünütənzimləmə modulyasiyası vasitəsi ola bilər.

Ənənəvi olaraq, siqnalın gücləndirilməsi ümumiyyətlə reseptor səviyyəsində deyil, yalnız G proteini və ya effektor səviyyəsində baş verir. Bununla belə, həm homo-, həm də hetero-oligomerizasiya tək bir liqand molekulunun təsiri ilə bir çox reseptorun aktivləşdirilməsi yolu ilə siqnal gücləndirilməsi üçün bir vasitə təmin edə bilər.

GPCR hetero-oligomerizasiyası, tərkib reseptorlarından fərqli liqand bağlayan və siqnal xüsusiyyətlərinə malik olan reseptor komplekslərinin əmələ gəlməsi ilə nəticələnə bilər. Bu, yeni dərman hədəfləri yaratmaq üçün maraqlı potensiala malik olan GPCR biologiyasının yeni aspektini təmsil edir. Heteromerik qarşılıqlı təsirlər həm də tərkib reseptorlarından birinin fərdi xüsusiyyətlərini maskalaya bilər.

GPCR hetero-oligomerizasiyasının dəyişdirilmiş səviyyələri bəzi klinik xəstəliklərin molekulyar əsasını təşkil edə bilər.

GPCR oliqomer əmələ gəlməsinin dinamikası və tənzimlənməsi, yəni liqandların oliqomerlərin assosiasiyasını və ya dissosiasiyasını təşviq edib-etməmələri və ya əvvəlcədən əmələ gəlmiş oliqomerlərə bağlanıb oliqomer reseptor konformasiyasını dəyişdirmələri haqqında çox az şey məlumdur. Bununla belə, canlı hüceyrələrdə rezonans-enerji ötürülməsi təhlilləri agonistlərin yaratdığı oliqomerləşmənin baş verə biləcəyini göstərdi.

GPCR-lərin oliqomerik təbiətindən dimerik ligandları inkişaf etdirməklə dərmanları yaxşılaşdırmaq üçün istifadə edilə biləcəyinə dair sübutlar var. Bir neçə dimerik ligandın onların tərkib liqandları ilə müqayisədə artan yaxınlıq və dəyişdirilmiş potensiala malik olduğu göstərilmişdir, çünki potensial olaraq, dimerik ligandlar reseptorların dimerik konformasiyasını daha asan induksiya edə və ya sabitləşdirə bilər ki, bu da müəyyən bir şəkildə siqnal ötürülməsinin effektivliyini artırır.

GPCR-lər üçün müasir dərman kəşfi əsasən rekombinant hüceyrə xəttində ifadə edilən maraq doğuran tək GPCR-nin istifadəsinə əsaslanır. Gələcək qurğuşun birləşməsinin identifikasiyası üçün GPCR oliqomerizasiyasının mövcud anlayışı, hetero-oliqomerik reseptorların dərman namizədləri kimi birləşmələrin skrininqində yeni hədəflər kimi qəbul edilməsini tələb edir. Oliqomerləşmədən asılı funksiyaları tənzimləmək üçün bir vasitə kimi GPCR oliqomer formalaşmasını gücləndirə və ya poza bilən dərmanlar da araşdırılmalıdır.

GPCR oliqomerizasiyası haqqında indiyə qədər məlum olanları nəzərə alsaq, “yeni” müalicə üsullarının inkişafının “köhnə” dərmanlarla yeni rejimlər yaratmaq qədər sadə ola biləcəyi inandırıcıdır.

GPCR dördüncü strukturunun nəzərdən keçirilməsi, təkmilləşdirilmiş müalicələr üçün istifadə etmək potensialına baxmayaraq, dərman kəşfinin əsas axını düşüncəsinə nüfuz etmək üçün yavaş olmuşdur.


Giriş

Taşıyıcı oliqomerlərin əmələ gəlməsi bir sıra üsullarla, o cümlədən flüoresan rezonans enerji ötürülməsi (FRET) [1], çarpaz əlaqə [2], aşağı salınmalar [3] və ko-immunopresipitasiya [4], o cümlədən tədqiq edilmişdir. məsələn, ölçü-istisna xromatoqrafiyası–çoxbucaqlı işığın səpilməsi (SEC–MALS) [5] istifadə edərək biofiziki səciyyələndirmə. Bu cür yanaşmalar daşıyıcı oliqomerlərin əmələ gəlməsini effektiv şəkildə göstərsə də, dominant mutantlardan və yüksək ayırdetmə qabiliyyətinə malik struktur tədqiqatlardan istifadə edərək daha son araşdırmalar oliqomerləşmənin daşıyıcı alveri, funksiyası və funksiyasının tənzimlənməsi üçün dəqiq rolları haqqında anlayışları aşkar etməyə başladı. Bu icmalda daşıyıcıların oliqomerləşməsinin rolları haqqında cari anlayışın qısa icmalı təmin etmək üçün çox yaxşı öyrənilmiş daşıyıcılardan və daşıyıcı ailələrdən istifadə olunur. Əlavə nümunələr var ki, yüksək ayırdetmə strukturları oliqomerik quruluşda daşıyıcı protomerlər arasındakı interfeysin substratı bağlayan yer və translokasiya kanalını təşkil etdiyini ortaya qoydu. Nümunələrə kiçik çoxlu dərman daşıyıcısı, EmrE [6] və ABC daşıyıcıları [7,8] daxildir. Bu hallarda, oliqomerləşmə həm substratın bağlanması, həm də daşınması üçün düzgün arxitekturanın yaradılmasından məsuldur. Bu daşıyıcılar bu icmalda əhatə olunmur. Bundan əlavə, oliqomerləşmənin yeganə məqsədinin sabitlik olduğu görünən daşıyıcıları daxil etməmişik.


Nəticələr və Müzakirə

Dimerizasiya avtogen dövrədə uzunmüddətli səs-küy korrelyasiyasını pozur

Müsbət avtotənzimləmə gen sxemlərində zülal-zülal bağlanmasının dinamik təsirlərini qiymətləndirmək üçün müsbət autogen sxemlərin bir neçə alternativ modelini qururuq. Hər bir model mümkün əks əlaqə mexanizmlərinin fərqli birləşməsini vurğulayır və nəzərdən keçirilən şəbəkə topologiyaları protein-dimer vəziyyətinin mövcudluğuna uyğun olaraq yalnız monomer (MO) və dimer icazəli (DA) sxemlərinin iki sinfinə qruplaşdırıla bilər ( Şəkil 1-də rəng kodlaması). Zülalın hansı formasının funksional transkripsiya faktoru (TF) olmasından və dimerləşmənin harada baş verdiyindən asılı olaraq, DA dövrələrini DA1-dən DA3-ə qədər üç variasiyaya qruplaşdırırıq. DA1 üçün biz yalnız dimerin DNT-operator ardıcıllığı (dimerik transkripsiya faktoru, DTF) ilə bağlanmasına icazə veririk, DA2 üçün isə dimerləşmə DNT-də monomerlərin ardıcıl bağlanması ilə baş verir. DA3-də zülal-DNT bağlama kinetikası MO dövrəsindəki kimidir, buna görə də sitozolik zülal dimer dövlətinin əlavə edilməsi ilə monomerik transkripsiya faktoru (MTF). Bu yazıda yalnız DA1 üçün nəticələri təqdim etsək də, DA2 və DA3 üçün əhəmiyyətli fərq yoxdur [Əlavə fayl 1].

Model avtotənzimləmə gen dövrəsinin sxemi. DNT bağlama statusu Dxy ilə göstərilir, burada x operator bölgəsinə (boş = 0, monomer = 1, dimer = 2) və y promotor bölgəsinə (boş = 0, RNT polimeraza bağlı = 1) uyğun gəlir. C, RNT-dən yenicə təmizlənmiş promotor ardıcıllığı ilə DNT-RNAp holoenziminin açıq kompleksini təmsil edir və transkripsiya uzanmasına məruz qalır. Nəhayət, M, P1 və P2 müvafiq olaraq mRNT, protein monomer və dimerə uyğundur. Şəbəkə topologiyaları iki sinfə qruplaşdırıla bilər, yalnız monomer (MO) və ya dimerlə icazə verilən (DA) sxemlər. Biz yalnız dimerin DNT-operator ardıcıllığı ilə bağlanmasına imkan verən DA1 (qırmızı xətlər), DNT-də monomerlərin ardıcıl bağlanması ilə DA2 (yaşıl) və zülal-DNT bağlama kinetikasını paylaşan DA3 (mavi) tədqiq etdik. MO, sitozolda dimerləşməyə imkan verir. Qeyd edək ki, DA2 topologiyası üçün biz seçmişik K31 = K30 (ətraflı məlumat üçün mətnə ​​baxın) Hüceyrələrin eksponensial böyümə mərhələsində olduğunu və RNAp (R) sayının sabit olduğunu fərz etdik.

Qeyd edək ki, əks əlaqə dövrəsi Şəkil 1-də açıq deyil, lakin RNAp-promotorun bağlanma tarazlığının TF-operator cütünün bağlanma statusundan asılılığı vasitəsilə dolayı daxil edilir. Əks əlaqə nəzarətinin işarəsi (müsbət və ya mənfi) və gücü sərbəst və ya TF-ə bağlı olan RNAp və DNT arasındakı dissosiasiya sabitlərinin nisbi böyüklüyü ilə müəyyən edilir. Məsələn, DA1 topologiyası əgər müsbət rəyə nəzarət edir K30 = k30/q30 & gt K32 = k32/q32, və K30 konstitutiv transkripsiyanın səviyyəsinə uyğun gəlir (bağlanmış transkripsiya amili olmadıqda transkripsiyanın başlaması). Hər bir topologiya üçün dimerin ömrünü, bağlanma yaxınlığını və fərdi assosiasiya/dissosiasiya dərəcələrini dəyişdirərək səs-küy xüsusiyyətlərinin kinetik dərəcələrdən asılılığını öyrənirik (Cədvəl və Şəkil 1-ə baxın). Biz bu yazıda yalnız avtogen dövrənin müsbət rəy nəzarətini müzakirə etsək də, mənfi rəyə nəzarət üçün müvafiq nəticələr əldə etdik [Əlavə fayl 1].

Şəkil 2 zülal bolluğu üçün on təmsilçi vaxt kursunun nümunəsini göstərir. Stokastik dalğalanmaların təsiri MO sxemində qeyd olunur. Bununla belə, zülalın sitozolik dimer meydana gətirə biləcəyi bütün DA dövrələrində monomer bolluğunda səs-küy səviyyəsinin əhəmiyyətli dərəcədə azaldığını müşahidə edirik. Dəyişmələrin yatırılması (indiyə qədər) fizioloji cəhətdən uyğun olduğu məlum olan kinetik parametrlər diapazonunda davam edir (Cədvəl 1-ə baxın).

(müsbət) avtotənzimləmə dövrəsində protein monomerlərinin bolluğunun on müstəqil vaxt kursu. Sitozolik dimer dövlətinin mövcudluğu (qırmızı, dövrə topologiyası DA1 istifadə edərək) monomerin nüsxə sayının dəyişməsini yalnız monomer (MO) dövrə (mavi) ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə azaldır. Bütün uyğun MO və DA1 parametrləri eyni dəyərlərə malikdir. Sonrakı simulyasiyalarda ilkin şərtlər müvafiq deterministik dərəcə tənliyinin sabit vəziyyət həlli olaraq seçilir ki, keçici davranış minimuma endirilməlidir.

Monomer və dimer bolluğu üçün sabit vəziyyət paylanmasını hesablayarkən (şək. 3) biz monomer Fano faktorunun (variasiya-orta nisbəti) bağlanma tarazlığının dimerə doğru sürüşməsi ilə azaldığı aydın tendensiyasını müşahidə edirik. Bu tendensiya bütün tədqiq edilmiş DA topologiyaları üçün qorunur (bax Əlavə məlumat). Sitozolda dimerləşməyə icazə verildiyi müddətcə, sürətli bağlanan tarazlıq monomerin partlayış sintezi və ya çürüməsi nəticəsində yaranan uzunmüddətli dalğalanmaları udur. Təsadüfi dalğalanma monomer nüsxə sayında qəfil dəyişikliyə səbəb olduqda, dimerləşmə qəfil dəyişikliyi udan tamponlama hovuzunu təmin edir. Əks təqdirdə, monomer bolluğundakı təsadüfi partlayışlar promotorun transkripsiya aktivliyinə yayılacaq və zülal ifadəsinin qeyri-sabit idarə olunmasına səbəb olacaqdır. Vurğulamaq lazımdır ki, bunun tənzimləmə işarəsi ilə heç bir əlaqəsi yoxdur və Ref. [21] mənfi avtotənzimləmə üçün. Təəccüblüdür ki, müsbət avtotənzimləmə dövrəsində səs-küyün azaldılması miqyası adətən yüksək sabit konstruksiya hesab edilən mənfi avtotənzimləmə ilə təxminən eynidir [Əlavə fayl 1].

Müsbət avtogen dövrələrdə monomer (qara) və dimer (narıncı) zülal bolluğunun stasionar vəziyyətdə paylanması. Sol (sağ) sütun dimer və monomerin parçalanma sürətlərinin nisbətinə uyğundur ..2/..1 = 1/10 (..2/..1 = 1/2). Molekulyar nüsxə nömrələri sabit vəziyyətə çatdıqdan sonra müəyyən vaxt intervalında (5·10 3 saniyə) toplanır. Burada K1q1/k1 zülal dimerinin dissosiasiya sabitidir. Bağlayıcı tarazlıq dimer vəziyyətinə doğru sürüşdükcə (azalır K1), səs-küy səviyyəsi monoton şəkildə azalır (Cədvəl 2-ə baxın). Nəzərə alın ki, kompleks formalaşma (sol sütun) səbəbiylə uzun zülal ömrü səs-küy səviyyəsinə təsir göstərir.

Evristik izahat sabit vəziyyət ətrafında kiçik təhriklər üçün əsaslandırılan deterministik dinamik sistemin Yakobi təhlilindən tapıla bilər. Təsadüfi dalğalanma monomer nüsxə nömrəsini sabit vəziyyət dəyərindən uzaqlaşdırdıqda, sabit vəziyyətə doğru çürümə Jacobian sistemi ilə təsvir edilə bilər. MO və DA dövrələri üçün Yakobi matrisinin (mənfi) öz dəyərlərinin böyüklüyündə uyğunsuzluq, pozulmuş vəziyyətin monomer-dimer tarazlığının sürətli həlli ilə tamponlandığını göstərir. Bu tamponlama, DA sxemlərindən fərqli olaraq, MO modelində müşahidə olunan kobud uzunmüddətli nümunələri izah edərək, ola bilsin, fəlakətli fizioloji təsirlərlə təsadüfi dalğalanmalar yığılmadan əvvəl baş verir (Şəkil 2).

Brown səs-küyünün tezliyi-selektiv ağardılması

Dimerləşmə prosesinin özü qısa zaman miqyasında stoxastik dalğalanmalar yaradır. Bununla belə, bu zaman miqyası mahiyyət etibarı ilə monomer sintezi və tənəzzüldən (daha sürətli böyüklük sıraları) ayrıldığından, dimerləşmə monomer səviyyəsindəki dalğalanmaları effektiv şəkildə azaldır. Dəyişmələrin tezlik məzmunu ən yaxşı şəkildə siqnalın işlənməsi üçün təqdim edilmiş avtokorrelyasiya funksiyasının Furye transformasiyası kimi təyin olunan güc spektral sıxlığının (PSD) təhlili ilə daha yaxşı öyrənilir. Şəkil 4 DA1-in səs-küy gücü spektrlərini göstərir və MO dövrəsi ilə DA topologiyası arasındakı fərq dərhal aydın olur. Xüsusilə aşağıdakı iki xüsusiyyəti qeyd edirik. (i) Artan tezliklə güc qanununun pozulması və (ii) DA dövrələri üçün üfüqi yayla. Güc qanunu xüsusiyyəti zülal sintezi və çürüməsinin "təsadüfi gəzinti" təbiəti ilə izah olunur: Güc qanunu göstəricisi təxminən 2-dir və bu, böyük molekulyar surətlərin sayı həddində Brown hərəkətini (Winer prosesi) xatırladır. Ağ (əlaqəsiz) səs-küy və ya 1/f səs-küy, zülal sintezi/çürüməsi daha uzun korrelyasiya müddətinə malikdir. Zaman kursunun avtokorrelyasiya funksiyası, Brown səs-küyü üçün olduğu kimi, tək eksponensial tənəzzüllə xarakterizə olunursa, PSD Lorentsian profili ilə verilir və beləliklə, aşağı tezlikli rejimdə tərs kvadrat qanunu ilə yaxşı yaxınlaşır. . Biz MO dövrəsi üçün doyma dəyərini müşahidə etmirik və o, çox güman ki, fizioloji maraq doğuran tezlik pəncərəsində deyil. Bu, xüsusilə korrelyasiya müddətlərinin uzun olduğu dövrələrə aid ola bilər.

Zülal bolluğundakı dalğalanmaların güc spektral sıxlığı (PSD).. MO dövrəsinin PSD-si güc qanunu davranışını açıq şəkildə göstərir. Mövcud sitozolik zülal dimer vəziyyətinə (DA1 burada göstərilmişdir) malik olan bütün digər model sistemləri, model detallarından asılı olmayaraq, orta tezlikli bölgədə yayla inkişaf etdirir (bax. Əlavə məlumat). Dimerin bağlanma yaxınlığı artdıqca, səs-küy səviyyəsi daha da azalır. MO nəticəsini istinad üçün dimer panelinə (sağda) daxil etdik. Möhkəm (boş) simvolları olan verilənlər dəstləri uyğun gəlir ..2/..1 = 1/10 (..2/..1 = 1/2).

Səs-küyün azaldılması fizioloji cəhətdən müvafiq aşağı tezlikli rejimdədir və Şəkil 4-də biz hüceyrə dövrü və mRNT ömrü üçün tipik dəyərləri göstərmişik. Stokastik tərəddüdlər mobil məlumatların işlənməsi üçün əsas məhdudiyyət qoysa da, çoxsaylı səs-küy mənbələri hüceyrə fiziologiyasına əlavə olmayan təsir göstərə bilər. Canlı hüceyrə üçün dalğalanmalar, onların korrelyasiya müddəti hüceyrə dövrü ilə müqayisə edilə bilən və ya ondan daha uzun olduqda xüsusilə aktualdır. Eyni zamanda, qısamüddətli miqyaslı dalğalanmalar (hüceyrə dövrünə nisbətən) daha asan zəiflədilir və ya yayılmır [28]. Əlavə olaraq, DA dövrələrinin PSD-də müşahidə olunan düz bölgə orta diapazonlu tezlik dalğalanmalarına gəldikdə, onları ağ səs-küy kimi etibarlı şəkildə təxmin edə biləcəyimizi nəzərdə tutur. Bu fikir yalnız zülallı modellərdə effektiv stoxastik dinamika üçün yaxınlaşma sxemlərinin etibarlılığına işıq sala bilər.

Dimerin ömrünün artması mühüm rol oynayır

Sitozolik dimer vəziyyətinin fəziləti də kompleksdə olan zülalların ömrünün uzadılması ilə birbaşa bağlıdır. Aktiv proteoliz üçün deqradasiya etiketlənməsi istisna olmaqla, protein oliqomerlərinin daha yavaş dövriyyəsi normadır. Bu, qismən monomerlərin proteoliz hədəfi olmağa meylli olan əsasən açılmış strukturlara malik olması ilə bağlı ümumi müşahidə ilə izah olunur [29]. Həmçinin qeyd edilmişdir ki, oliqomerik formanın uzun ömür müddəti gen dövrələrinin mümkün parametr diapazonlarını artırmaq üçün kritik amildir [30]. Şəkil 3-dən göründüyü kimi (həmçinin Cədvəl 2), səs-küyün azaldılmasının qat dəyişməsi hələ də əhəmiyyətli olsa da, dimerin ömrünün monomerlə eyni olması (hipotetik) halında o qədər də güclü deyil...2/..1 = 1/2). Bununla belə, aşağı tezlikli güc spektrləri hələ də eyni sürət parametrləri ilə MO dövrəsinə nisbətən demək olar ki, daha kiçik bir səs-küy gücü nümayiş etdirir (Şəkil 4). Beləliklə, dimerin ömrü monomer-dimer keçidi ilə müqayisədə kifayət qədər uzun müddət saxlanıldığı müddətcə səs-küyün azaldılması qabiliyyəti yaxşı qalır.

Genetik keçid keçidində homo-dimerləşmənin təsiri

Fajın müstəsna sabit lizogeni .., bunun üçün kortəbii itki nisbəti hər nəsildə hüceyrə başına ≲ 10 -7 [31, 32], genetik keçid keçidinin sintezinə təkan verdi [15]. Keçid açarı gen kimi qeyd edəcəyimiz bir cüt gendən qurulub AB, transkripsiya olaraq bir-birinin ifadəsini sıxışdırır. Bu qarşılıqlı mənfi tənzimləmə effektiv müsbət rəy döngəsi hesab edilə bilər və çoxsaylı sabit vəziyyətlər üçün əsas verir. Çoxsabitliyin mövcudluğu, öz növbəsində, epigenetik yaddaş və ya qərar qəbul etmək üçün bir cihaz kimi istifadə edilə bilər [33].

Kooperativlik ilə müsbət rəyin ümumi atributlarından göründüyü kimi, genetik keçid açarı xarici siqnallara ultrahəssas şəkildə cavab verir: Siqnalın gücü eşik dəyərə yaxınlaşdıqda, gen ifadə vəziyyəti siqnalda kiçik bir dəyişikliklə dəyişdirilə bilər. Məsələn, protein konsentrasiyası A (B) sürətlə yüksəkdən aşağıya və əksinə keçə bilər. Bununla belə, sintetik keçid keçidinin əvvəlki tədqiqatları göstərdi ki, səs-küydən qaynaqlanan vəziyyətə keçid nadir hadisədir [15, 34, 35]. Sonrakı təhlildə biz bu müstəsna sabitliyin mənşəyini müəyyənləşdirmək məqsədi daşıyırıq.

Sadə bir modeldə, yalnız monomer (MO) keçidi, tənzimləyici zülallar yalnız monomer formada mövcuddur.Xarici siqnal açıq şəkildə daxil edilməsə də, dövrənin molekulyar komponentlərinin bolluğundakı təsadüfi dalğalanmalar iki zülal növü üçün keçid vəziyyətini bəzən dəyişdirəcəkdir. Müsbət avtotənzimləyici gen sxemlərinin təhlilinin nəticələrinə əsaslanaraq, keçid keçidinin tənzimləyici zülallarında dimerləşmənin səs-küyə qarşı fəaliyyətini sabitləşdirməyə xidmət edəcəyini fərz edirik. Biz hər genin zülal məhsullarının bir homodimer meydana gətirməsinə icazə veririk AA və ya BB, bu faqdakı cI-cro sisteminə bənzəyir .. [36]. Dimerlər üçün dissosiasiya sabiti kimi müəyyən edilir K1 = q1/k1, harada k1 kompleksi əmələ gətirən iki monomerin sürətidir və q1 kompleksin iki tərkib hissəsinə parçalanma sürəti.

Sürətli zülal bağlama-açma dinamikasının keçid keçid performansına təsirini ya (i) monomerlərdən və ya (ii) repressorun funksional forması kimi homodimerlərdən istifadə etməklə qiymətləndiririk. Şəkil 5 dissosiasiya sabitinin seçilmiş qiymətlərini göstərir K1, müvafiq olaraq (a) monomerik və ya (b) dimerik transkripsiya faktorları üçün zülal monomerinin (solda) və dimerin (sağda) bolluğunun təmsilçi zaman sıraları. Seçdiyimiz parametrlər dəsti üçün faza sahəsinin (səs-küy olduqda) diqqətlə təhlili tədqiq olunan keçid sistemlərinin bistabil bölgədə olduğunu təsdiqləyir [37].

Genetik keçid keçidində monomer və dimer nüsxə nömrələrinin nümunə vaxt seriyası. (a) MTF sxemi, burada monomer repressorun funksional formasıdır. (b) DTF sxemi, burada dimer repressorun funksional formasıdır. Sol (sağ) sütun iki monomer molekulunun sayını göstərir AB (dimerlər AABB) və ilkin vəziyyət həmişə növlərlədir A (qırmızı) yüksək bolluqda. Qeyd edək ki, keçid tezliyi protein dimerinin bağlanma yaxınlığından asılıdır.

Monomer repressor molekulunun funksional forması olduqda (Şəkil 5(a)) və K1 böyükdür (aşağı dimer yaxınlığının həddi), zülal populyasiyalarında monomerlər üstünlük təşkil edir. Beləliklə, dövrə effektiv şəkildə MO keçidi kimi davranır. kimi K1 azalır, təsadüfi keçid səviyyəsinin sıxışdırıldığını görürük: Avtogen dövrəyə analoji olaraq, dimer hovuzu protein monomer populyasiyasını sabitləşdirir. Bununla belə, səs-küyün yatırılması artan dimer bağlanma yaxınlığı ilə monoton deyil. Həqiqətən, çox böyük bağlama yaxınlıqları üçün (kiçik K1), təsadüfi keçid hadisələrinin sayı artır, çünki monomer yalnız aşağı nüsxə ədədlərində mövcuddur. Nəticə etibarilə, bu hədddə monomer bolluğunda kiçik bir dalğalanmanın ümumi gen ifadə profilində dramatik dəyişikliyə səbəb ola biləcəyi ehtimalı artır. Dimerləşmənin səs-küy sabitləşdirici təsiri müvafiq PSD-lərdə də əks olunur [Əlavə fayl 1]. Məsələn, monomer bolluğunda aşağı tezlikli dalğalanmaların nəzərəçarpacaq dərəcədə sıxışdırılmasını müşahidə edirik. K1.

Şəkil 5(b)-də biz dimerik repressorun işi üçün müvafiq nümunə vaxt seriyasını göstəririk, bütün digər xassələri (a) ilə eynidir. Ümumi tendensiyalar oxşar olsa da, biz aşağıdakı fərqi qeyd edirik. Monomer repressor vəziyyətindən fərqli olaraq, güclü bağlanma həddində keçid hadisələri çox azdır: Dominant genin ("on"-gen) siqnal molekulları (dimerləri) çox sayda nüsxədə mövcud olmağa meylli olduğundan, əhəmiyyətli dalğalanma olur. keçid açarının vəziyyətini çevirmək lazımdır. Monomer repressiya vəziyyətində siqnal molekulu bu hədddə az miqdarda mövcuddur. Beləliklə, dimerik-repressor sistemindəki dominant protein növləri keçid açarının vəziyyətinə daha yaxşı nəzarət edə bilir.

Şəkil 6-da paylanmanı göstəririk (N. A- N. B), monomerik (solda) və dimerik (sağda) transkripsiya faktoru vəziyyətində iki protein növü üçün molekul bolluğundakı fərq. Sıfır oxu ilə bağlı asimmetriya ilkin şərtləri (zülal növləri) seçdiyimizdən qaynaqlanır A yüksək konsentrasiyada və növlərdə B aşağı konsentrasiyada), həmçinin zaman seriyasının sonlu uzunluğu. Monomer transkripsiya üçün orta dərəcədə bağlanma yaxınlığı olan dimerlərin olması monomer bolluğunun paylanmasını kəskinləşdirir, eyni zamanda onun bimodal xarakterini vurğulayır. Bu, keçid sabitliyinə dair Şəkil 5-dəki keyfiyyət müşahidəsi ilə uyğun gəlir. Dimerik transkripsiya üçün, sistemin simmetriyasının kiçik dəyərlər üçün pozulduğunu aydın şəkildə müşahidə edirik. K1, keçid açarının vəziyyətinin son dərəcə sabit olduğunu və buna görə də, ehtimal ki, ilkin şərtlərin seçimi ilə müəyyən edildiyini göstərir.

Zülal növləri arasında monomer bolluğu fərqlərinin paylanması A B. Sıfır oxuna görə asimmetriya ilkin vəziyyətin (növlərin) seçilməsi ilə əlaqədardır A yüksək) və simulyasiyaların sonlu zaman intervalı.

Dimer-bağlayıcı yaxınlıq və keçid keçidinin funksional sabitliyi arasındakı qarşılıqlı əlaqəyə dair müşahidələrimizi sistematik şəkildə qiymətləndirmək üçün orta kortəbii keçid sürətini ölçmək üçün uzun zaman seriyaları (≈3 · 10 7 san) yaratdıq. Şəkil 7-də, bağlama yaxınlıqları üçün MO keçidinə nisbətən orta keçid tezliyini göstəririk. K1/nM = <2, 20, 100, 1000> və orta MO keçid sürəti 7,5 × 10 -6 /saatdır. Gözlənildiyi kimi, aralıq dəyərləri tapırıq K1 keçid açarını sabitləşdirə bilirlər. Şəkil 7, həmçinin dimer və monomerik transkripsiya faktoru üçün keçid keçidinin artan sabitliyini vurğulayır, dimer keçid dərəcələri həmişə aşağı olur və güclü dimer bağlanması üçün sıfıra yaxınlaşır.

Genetik keçidlərin təsadüfi keçid dərəcələri. Ordinat müxtəlif keçid açarlarının təsadüfi keçid sürətlərinin yalnız monomer (MO) dövrəsinə nisbətidir, 7,5 × 10 -6 /saat. MTF, monomerik transkripsiya faktoru DTF, dimer transkripsiya faktoru Het-MTF, deaktivləşdirilmiş heterodimer vəziyyəti ilə monomerik transkripsiya faktoru.

Genetik keçid keçidində heterodimerləşmə

Keçid açarında heterodimerləşməni də nəzərdən keçirdik, çünki açarın səs-küy və funksional sabitləşməsi dimerlərin tərkibi və mənbəyindən birbaşa təsirlənə bilər. Qeyd edək ki, gen tənzimləmə fəaliyyəti iki monomer zülalı tərəfindən verilir AB və heterodimer deyil AB. Bununla belə, biz tapırıq ki, (qeyri-aktiv) heterodimerlərin olması homodimerlərə bənzər səs-küy sabitləşdirici təsirlərə səbəb olur (Şəkil 7). Əslində, heterodimer vəziyyətinin mövcudluğu dominant zülal növlərinə azlıq növlərinin (aktiv) monomerlərini effektiv şəkildə boğmağa imkan verir. Beləliklə, heterodimer sxemi, MO dövrəsinin daxili səs-küyə qarşı müzakirə olunan zəifliyini bölüşməyən, homodimerik repressorlarla müqayisədə kəskin şəkildə inkişaf etmiş funksional sabitlik göstərir. Bildiyimizə görə, bu, sırf hipotetik keçid dizaynı olsa da, o, sintetik gen sxemlərində səs-küyün idarə edilməsi üçün ümumi strategiyanı və yuxarı axın tənzimləmə sahələrinin üst-üstə düşməsi üçün əvvəllər təklif edilmiş yanaşmanı təmin edir [38].


FL_RAGE-in oliqomerləşmə halları

SEC-MALS

Məhlulda FL_RAGE-ni saxlamaq üçün biz TM bölgəsinin normal olaraq yerləşdiyi yerli lipid mühitini təqlid edə bilən yuyucu mühit tətbiq etdik. Buna görə də, FL_RAGE təmizlənmiş və qeyri-ion yuyucu n-Dodecyl β-D-maltosidin (DDM) iştirakı ilə xarakterizə edilmişdir. DDM varlığında FL_RAGE-nin SEC-MALS təhlili yaxşı müəyyən edilmiş pik aşkar etdi (Şəkil 3a). Zülal-yuyucu kompleksi vəziyyətində isə müvafiq kütlələrin təfsiri sadə deyil. Zülala bağlanan yuyucu vasitənin miqdarı həm zülal strukturundan, həm də yuyucu vasitənin təbiətindən asılı olaraq fərqli ola bilər. Buna görə də, miseldəki zülal və yuyucu vasitə arasındakı kütlə nisbəti kəskin şəkildə dəyişə bilər. Yuyucu vasitənin mövcudluğunu nəzərə alan məlumatların təhlili mərhələsində xüsusi yanaşma tələb olunur 25 . ASTRA proqramının (Wyatt Technologies) “protein konjugatı” modulu bütün kompleksin molekulyar çəkisini, həmçinin onun zülal komponentini və zülalla əlaqəli yuyucu mitsel kütləsini hesablamağa imkan verir.

Tam uzunluqlu RAGE-nin SEC-MALS və AUC təhlili. (a) FL_RAGE üzrə SEC-MALS. Xromatoqramlar LS və UV detektorlarının detektor oxunuşlarını müvafiq olaraq qırmızı və qara rəngdə göstərir. LS və UV detektorları üçün tərəzilər sol oxun şkalasında sağ oxda molekulyar kütləni təmsil edir. Zirvələr boyunca yaşıl, mavi və mavi xətlər zülal/deterjan kompleksinin (yaşıl), zülalın (mavi) və əlavə edilmiş yuyucu mitselinin (siyan) hesablanmış molekulyar kütlələrini göstərir. (b) DDM-də həll olunan FL_RAGE-nin çökmə sürəti təcrübəsi (qırmızı rəngdə 280 nm-də udma və yaşıl rəngdə müdaxilə). Qara iz DDM miselləri də daxil olmaqla buferin müdaxilə məlumatlarını təmsil edir. (c) f/fo tipli GUSSI membran zülalının hesablanması modulundan istifadə edərək FL_RAGE (panel b) verilənlər toplusunun təhlili nümunəsi. Qırmızı, yaşıl və mavi xətlər müvafiq olaraq zülal/misel fraksiyası üçün f/fo-nun yüksək, optimal və aşağı hədlərini təmsil edir (mətnə ​​bax). Şəkillər 5.8S zirvəsinin təhlilini göstərir və dimerin varlığını göstərir. 4.4S və 7.4S zirvələri müvafiq olaraq monomerləri və trimerləri təmsil edir (Əlavə məlumatda Şəkil S5-ə baxın).

FL_RAGE-nin SEC-MALS xromatoqramı (Şəkil 3a) əsas zülal pikini göstərdi.

13 ml. ASTRA tərəfindən təxmin edilən kompleksin molyar kütləsi zirvə boyu heterojen idi və protein-yuyucu misel kompleksinin kütlələrinin diapazonunu əhatə edirdi (

120–140 kDa). Zülalın hesablanmış molyar kütləsi də heterojen idi (

47–75 kDa), FL_RAGE nümunələrində əhəmiyyətli qeyri-monomer fraksiyanı göstərir (FL_RAGE-nin gözlənilən molekulyar kütləsi 41,8 kDa-dır).

FL_RAGE-nin çökmə sürəti (Şəkil 3b) absorbans və müdaxilə məlumatlarının monitorinqi ilə tədqiq edilmişdir. 280 nm-də absorbans 3.5S və 8.0S arasında geniş bir siqnal göstərdi, maksimum təxminən 4.4S və daha yüksək molekulyar çəki növlərinin iz miqdarı. Eyni zamanda, udma ilə müqayisədə daha yaxşı məkan həlli ilə xarakterizə olunan müdaxilə eyni 3.5-8.0S diapazonunda yerləşən üç yaxşı müəyyən edilmiş zirvə (4.4S, 5.8S və 7.4S) göstərdi. 3.2S-də əlavə pik tampon üçün müşahidə edilən müdaxilə sərhədinə aydın şəkildə uyğun gəlirdi. Sərbəst DDM-nin mövcudluğunu göstərən udma qabiliyyəti (məlumatlar göstərilmir) ilə tək tamponun tədqiqi zamanı bu pik aşkarlanmadı. Oxşar siqnal digər müəlliflər tərəfindən də müşahidə edilmişdir 26 . Bu tapıntıları FL_RAGE-nin oliqomerləşmə statusu baxımından şərh etmək daha ətraflı təhlil tələb edirdi. Bu məqsədlə f/f-dən istifadə etdiko Brautigam 27 tərəfindən GUSSI Membrane Protein Module paketində təsvir edilən analiz proseduru. Bundan sonra nəticələr göstərdi ki, 4.4S, 5.8S və 7.4S pikləri müvafiq olaraq monomer, dimer və trimerə uyğundur, yalnız bu halda f/fo dəyərlər icazə verilən 1,2-1,7 aralığında idi. Başqa dərəcədə oliqomerləşmənin fərziyyəsi f/f-ə səbəb olduo qiymətlər icazə verilən diapazondan kənara çıxdı: daha yüksək dərəcəli və daha kiçik oliqomerlər üçün müvafiq olaraq >1.9 və <1, bu mümkün deyil. Şəkil 2c pik sayı 2 (5.8S) əsasında bu tip analizi göstərir. AUC təcrübəsinin bu nəticələri monomerlərin, dimerlərin, trimerlərin və hətta SEC-MALS nəticəsi ilə yaxşı uyğun gələn yüksək dərəcəli oliqomerlərin kiçik bir hissəsinin qarışığının mövcudluğunu aşkar etdi. Aydındır ki, monomerik və dimerik növlər arasında sürətli mübadilə 280 nm-də geniş bir zirvə ilə nəticələndi.

Doğma MS

Doğma MS analizi üçün FL_RAGE DDM və ya Triton X-100-də kritik misel konsentrasiyasının (CMC) iki qatı konsentrasiyada həll edilmişdir. Zülalın təmizlənməsi zamanı DDM-in mövcudluğunda FL_RAGE-nin sabitliyinə baxmayaraq, buferin MS dostu ammonium asetat (AmAc) məhlulu ilə mübadiləsi, həmçinin 2x CMC DDM ehtiva edən AmAc-ın kifayət qədər yüksək konsentrasiyasında belə zülalın çökməsinə səbəb oldu. (1M). DDM əvəzinə Triton X-100 (2x CMC) istifadə edildikdə FL_RAGE yağıntısı müşahidə edilmədi. Bunun ardınca 600 mM AmAc-da əldə edilən yerli MS spektri monomerik, dimerik, trimerik və hətta tetramerik siqnalları aşkar etdi (Şəkil 4a). Həm monomerik, həm də dimerik növlər tarazlığa yaxındır və siqnalın böyük əksəriyyətini təşkil edir. Maraqlıdır ki, FL_RAGE-nin ion mübadiləsi xromatoqrafiyası əvəzinə SEC-dən istifadə etməklə təmizlənməsi daha yüksək dərəcəli oliqomerlərin daha yaxşı saxlanmasına imkan verdi, məs. trimerlər və tetramerlər (Şəkil S3), lakin bəzi çirkləri (müəyyən edilməmiş çirkləndiricilər) və qaz fazasında daha çətin membran zülalının sərbəst buraxılması (zəif həll). FL_RAGE-ə 0,1% qarışqa turşusu və 50% asetonitril əlavə edilməsi oliqomerik növlərdən qaynaqlanan siqnalların yox olmasına gətirib çıxardı (Şəkil 4b), oliqomerləşmənin qeyri-kovalent xarakterini göstərir. Membran zülallarının yerli MS-si zülalın yuyucu vasitənin misel klasterindən toqquşma ilə aktivləşdirilmiş azad edilməsindən asılı olduğundan, (monomerik) müşahidə etmək üçün nümunə konusunda 200V aktivasiya ilə yanaşı minimum (15V) 30V toqquşma enerjisi tələb olunurdu. spektrdə FL-RAGE-nin oliqomer növləri.

Doğma altında FL_RAGE kütlə spektrləri (a) və (b) denaturasiya şərtləri. Zirvələr rəngli nöqtələr və müvafiq olaraq FL_RAGE monomerləri və multimerləri üçün müvafiq yük vəziyyəti ilə qeyd olunur.


Müzakirə

GPCR oliqomerləşməsi indi əhəmiyyətli funksional və tənzimləyici təsir potensialına malik olmaqla yaxşı tanınır (Cvejic və Devi 1997 Pascal və Milligan 2005 Rocheville et al. 2000a). GPCR oliqomerizasiyasının ən geniş təhlili Ailə A reseptorlarında aparılmışdır və bu reseptor alt ailəsi də struktur baxımından ən yaxşı xarakterizə olunur (Milligan 2007). Ailə B GPCR-ləri də homo-oliqomerik (Harikumar və digərləri. 2006b Lisenbee və Miller 2006 Seck et al. 2003) və hetero-oliqomerik komplekslər (Harikumar et al. 2006b) əmələ gətirir. Bu ailədəki reseptorların strukturunun A ailəsindəkilərdən fərqli olacağı proqnozlaşdırılır (Dong et al. 2007 Salom et al. 2006), müxtəlif imza ardıcıllığı və hətta spiral paketdə proqnozlaşdırılan fərqlər.

Ailə B GPCR-ləri üç qorunmuş disulfid bağında iştirak edən altı qorunmuş sistein qalıqlarını ehtiva edən uzun amin-terminal hüceyrədənkənar quyruq bölgəsinə malikdir (Lisenbee et al. 2005). Bu bölgə təbii peptid liqand bağlanması üçün vacibdir (Dong və Miller 2002). Bununla belə, bu bölgə sekretin reseptorlarının oliqomerləşməsi üçün vacib deyildir (Lisenbee və Miller 2006). Sekretin reseptorunun hüceyrədaxili karboksil-terminal quyruğu da onun oliqomerləşməsinə təsir etmədən kəsilə bilər (Lisenbee və Miller 2006). Bu yaxınlarda aparılan bir araşdırmada sekretin reseptorunun homo-oliqomerləşməsinin əsas determinantı dördüncü transmembran seqmentinin lipidlərə məruz qalmış üzü idi (Harikumar et al. 2007).

Cari işdə biz geniş çeşiddə Ailə B GPCR-lərinin sekretin reseptoru ilə hetero-oliqomerik komplekslər yaratmaq qabiliyyətini sistematik şəkildə araşdırdıq. Seçilmiş A Ailəsi GPCR-lərinin belə komplekslər yaratmadığını artıq bilirdik (Harikumar et al. 2006a) və ən yaxından əlaqəli Ailə B GPCR-lərinin, VPAC1 və VPAC2 reseptorlarının oliqomerlər meydana gətirə bildiyini (Harikumar et al. 2006b). Bu tədqiqatlarda biz bu sorğunu geniş çeşiddə Ailə B peptid hormonu reseptorları arasında genişləndirdik. Qeyd edək ki, kalsitonin reseptoru istisna olmaqla, bu reseptorların hər biri sekretin reseptoru ilə hetero-oliqomerlər meydana gətirə bilmişdir ki, bu da hetero-oliqomerləşmə potensialının B Ailəsi reseptorları arasında geniş ola biləcəyini göstərir. Bu reseptorların dördüncü transmembran seqmentini qiymətləndirərkən maraqlıdır ki, insan kalsitonin reseptoru bu seqmentdə bu seriyanın heç bir digər reseptorunda olmayan iki qalıq ehtiva edir. Bunlar sekretin reseptorunun Tyr 233-ə ekvivalent mövqedə olan Arg və sekretin reseptorunun Ala 250-yə ekvivalent mövqedə olan Thr-dir, bu qalıqların lipid iki qatına baxan transmembran seqmentinin hər iki ucunda olacağı proqnozlaşdırılır. Bu qalıqlardan biri (və ya hər ikisi) hazırkı təcrübələr seriyasında kalsitonin reseptorunun nümayiş etdirdiyi fərqli hetero-oligomerizasiya davranışına kömək edə bilər. Bununla belə, homo-oligomerizasiyadan məsul olan eyni ardıcıllığın determinantının da hetero-oliqomerləşmədə iştirak edən əsas ardıcıllıq olub-olmadığı aydın deyil. Gələcək iş B Ailəsi reseptorları arasında heteroloji qarşılıqlı əlaqənin fizioloji əhəmiyyətini nəzərdən keçirəcəkdir.


Giriş seçimləri

1 il ərzində tam jurnal girişi əldə edin

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.
ƏDV sonradan hesaba əlavə olunacaq.
Vergi hesablanması yoxlama zamanı yekunlaşacaq.

ReadCube -də vaxt məhdud və ya tam məqalə əldə edin.

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.


Nəticələr

Təmizlənmiş monomerin sayt üçün xüsusi etiketlənməsi 𻈪R və lipid veziküllərinə yenidən qurulur

Tədqiqatlarımızın məqsədi β-nin öz-özünə birləşməsini izləmək idi2Lipid veziküllərində yenidən qurulduqdan sonra AR və oliqomerlərdə protomerlərin nisbi oriyentasiyası haqqında məlumat əldə etmək. Kiçik molekulyar çəkili flüoresan zondlardan istifadə edən FRET bu tədqiqatlar üçün ideal vasitədir, çünki o, nisbi məsafə haqqında məlumat verir, lakin nisbətən az miqdarda protein tələb edir (Mansoor və b, 2006). Saytın xüsusi etiketlənməsinə nail olmaq üçün β2AR, biz kimyəvi cəhətdən sulfidril-reaktiv flüoroforlarla dəyişdirilə bilən tək reaktiv sisteinlərə malik olan dəyişdirilmiş reseptorlar yaratdıq. Mutantlar minimal sistein fonunda hazırlanmışdır, burada 13 kimyəvi reaktiv sisteindən beşi mutasiyaya uğramışdır (bax: Materiallar və üsullar bölməsi). Bu mutasiyaların liqand bağlanmasına və ya G protein birləşməsinə heç bir təsiri yoxdur. Palmitollaşdırılmayan və ya disulfid bağlarının bir hissəsi olan qalan üç sistein hidrofobik nüvədə yerləşdiyinə görə reaktiv deyildir (Şəkil 1A). Biz əvvəlcə reseptorun sitoplazmik domenlərində 18 tək sisteinli mutant yaratdıq. Üçü funksional xassələri, kimyəvi reaktivliyi və paylanması əsasında seçilmişdir (Şəkil 1B): 㥅-T66C (hüceyrədaxili dövrə-1, ICL1), 㥅-A265C (transmembran domen-6, TM6) və 㥅 -R333C (sarmal-8, H8) (Çerezov və b, 2007 Rasmussen və b, 2007 Rosenbaum və b, 2007).Etiketləmə saytlarının bu məkan paylanması protomerlərin bir-birinə nisbətən oriyentasiyası haqqında məlumat vermək üçün nəzərdə tutulmuşdur.

β2AR tək sistein konstruksiyaları və FRET donor qəbuledici cütü. (A) Minimal sistein fonunda üç tək reaktiv sistein konstruksiyaları yaradıldı (㥅-β2AR). Etiketləmə saytları ilk ICL-də yerləşdirildi, 㥅-β2AR-T66C, altıncı transmembran seqmentinin sitoplazmik ucunda, 㥅-β2AR-A265C və spiral səkkiz, 㥅-β2AR-R333C. (B) Tək sisteinli mutantlar, α-karbonlar üçün seçilmiş bölgələrin paylanmasının hüceyrədaxili 3D görünüşü təsvir edilmişdir. (C) FRET donoru (λməs=549 nm λem=570 nm) və qəbuledici cütü (λməs=650 nm λem=670 nm).

Modifikasiya edilmiş reseptorlar rekombinant bakulovirusdan istifadə edərək Sf9 hüceyrələrində ifadə edildi və ardıcıl antikor və alprenolol yaxınlıq xromatoqrafiyasından istifadə edərək təmizləndi. Biz əvvəllər göstərmişdik ki, bu təmizləmə protokolu monomerik, yuyucu vasitədə həll olunan β2AR (Worton və b, 2007). Təmizlənmiş, yuyucu vasitə ilə həll olunan β2AR Cy3 və ya Cy5 maleimid ilə etiketlənmişdir. Bu flüoroforlar FRET tədqiqatları üçün seçilmişdir, çünki onlar R0 eksperimental sistemdən (Mansur) asılı olaraq 37 ilə 56 arasında dəyişən dəyər (50 enerji ötürülməsinin baş verdiyi Förster kritik məsafə) və b, 2006 Massey və b, 2006). Bu, reseptor reseptorlarının qarşılıqlı təsirini öyrənmək üçün idealdır, çünki monomerin təqribi ölçüləri 30 ℃ ≥ 40 ≥ ≥ 70 ≥ olur. β2AR-lər ya Cy3, ya da Cy5-in stoxiometrik miqdarları ilə etiketlənmişdir və etiketləmənin effektivliyi udma spektroskopiyası ilə müəyyən edilmişdir (Əlavə Cədvəl I). Etiketli β2AR 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) və xolesterin hemisüksinat (CHS) lipidlərinin qarışığına çevrildi. Hər təcrübə üçün üç nümunə yaradıldı: (1) yenidən qurulmuş Cy3 etiketli β2AR (2) bərpa edilmiş Cy5 etiketli β2AR və (3) Cy3 etiketli β2Cy5 etiketli β ilə qarışdırılmış AR2AR və sonra yenidən qurulur. Əgər başqa cür göstərilməyibsə, son lipid-reseptor molar nisbəti (mol-to-mol) 1000:1 təşkil etmişdir. Eyni nümunələr nəzarət üçün hazırlanmışdır, lakin 0,1 DM-də saxlanılmış və veziküllərə çevrilməmişdir.

Orientation of 㬢Lipid veziküllərində AR

β-nin oriyentasiyasını bilmək2Lipid veziküllərimizdəki AR FRET ölçmələrini şərh etmək üçün vacibdir. Təsadüfi oriyentasiya potensial qeyri-fizioloji (antiparalel) oliqomerlər yarada bilər. Təsadüfi oriyentasiya gözlənilə bilsə də, əvvəlki tədqiqatlar göstərmişdir ki, rhodopsin yenidən qurulduqdan sonra əsasən bir istiqamətə yönəlir (Niu və b, 2002). β-nin oriyentasiyasını müəyyən etmək üçün bir neçə tamamlayıcı strategiyadan istifadə etdik2Fosfolipid veziküllərində AR (Şəkil 2A). Xa faktoru seçici olaraq β-ni parçalayan proteazdır2Üçüncü ICL (ICL3) daxilində AR. Daxildən xaricə yönəlmiş reseptorlar (lipid vezikülündən kənarda olan ICL3) Xa Faktoruna həssas olacaq, xaricə yönəlmiş reseptorlar isə deyil (Şəkil 2A). Təxminən 90% sulandırılmış β2AR faktor Xa-ya davamlı idi, halbuki reseptorun hamısı vezikülləri keçirən yuyucu vasitənin konsentrasiyası olan 0,1 DM (Şəkil 2B) varlığında parçalandı. Bu nəticələr əsasən xaricə yönəlmiş istiqamətə uyğundur. PNGase F, hüceyrədənkənar N-terminusda asparaginlə əlaqəli oliqosakaridləri parçalayan bir fermentdir (Şəkil 2A). Yenidən qurulmuş reseptorun PNGase F ilə müalicəsi, əsasən xaricə yönəlmiş oriyentasiyaya uyğun olaraq, 0,1 DM varlığında müşahidə ediləndən fərqlənməyən hərəkətliliyin dəyişməsinə səbəb oldu (Şəkil 2C). Orientasiya NHS-PEO istifadə edərək daha da təsdiqləndi4N-terminusun kimyəvi modifikasiyası üçün biotin (Şəkil 2A). Bu qütb birləşməsinin lipid ikiqatını keçməsi gözlənilməzdi. N-terminal FLAG epitopunun kimyəvi modifikasiyası sulandırıldıqdan sonra veziküllərin M1 antikor müalicəsi üçün reaktivliyin itirilməsi ilə nəticələnir və M1 reaktivliyinin 90%-dən çox bərpası üçün itirilməsi ilə nəticələnir.2AR (Şəkil 2D və E). Nəhayət, β-nin sitoplazmik tərəfində A265C-ni etiketlədik.2monobromobimane (mBBr) ilə AR və bimane flüoresansını söndürmək üçün məhluldakı triptofanın qabiliyyətini araşdırdı. Biz yenidən qurulmuş, bimane etiketli β sönmədiyini müşahidə etmədik.21 mM triptofan ilə AR. Bununla belə, 0,2 DM-dən istifadə edərək veziküllərin həll edilməsi əhəmiyyətli dərəcədə söndürmə ilə nəticələndi (Əlavə Şəkil 1). Birlikdə götürdükdə bu tədqiqatlar göstərir ki, β2AR əsasən vezikülün xaricindəki hüceyrədənkənar domenlərə yönəldilmişdir.

β2AR-lər əsasən lipid ikiqatlarında xaricə yönəldilmişdir. (A) oriyentasiyanın müəyyən edilməsi üçün strategiyalar β2Lipid ikiqatlarında AR. (B) Təmizlənmiş reseptorlar Materiallar və üsullar altında təsvir olunduğu kimi yenidən quruldu və sonra Xa Faktoru ilə müalicəyə məruz qaldı və 10 SDS–PAGE ilə həll edildi və nitroselülozaya köçürüldü. β-nin olması2AR Alexa-680 ilə konyuqasiya edilmiş M1 antikoru ilə zondla müəyyən edilmişdir. (C) PNGase F-ə məruz qalan nümunələr A panelində olduğu kimi hazırlanmış və təsvir edilmişdir.D, E.) Hazırlanmış nümunələr hidrofilik, amin-reaktiv, alkilləşdirici reagent NHS-PEO ilə emal edilmişdir.4- M1 monoklonal antikorunun FLAG epitopuna bağlanmasını pozan biotin. Nümunələr M1 antikoruna (D) və C-terminal altı histidin etiketini (E) tanıyan bir antikora qarşı reaktivlik üçün qiymətləndirilmişdir. Bütün məlumatlar üç müstəqil eksperimentin nümayəndəsidir.

Paylanması 㬢Lipid veziküllərində AR

Oliqomerləşməni öyrənərkən, qeyri-homogen rekonstisiya yolu ilə zülalları bir araya gətirməkdən, yəni reseptor molekullarının əksəriyyətini lipid veziküllərinin kiçik bir populyasiyasında tutmaqdan qaçınmaq vacibdir. Məsələn, əvvəllər 90 rodopsin molekulunun yalnız 10 vəzikülə daxil olduğu göstərilmişdir (Mansur və b, 2006). β paylanmasını qiymətləndirmək üçün izopiknik sıxlıq sentrifuqasından istifadə etdik.2Əvvəllər rodopsin (Mansoor və b, 2006). Cy5 etiketli β2AR-lər NBDfosfokolini olan lipidlərdə 1000:1 lipid-reseptor nisbətində (ümumi lipid tərkibinin 0,4 º finalında) yenidən quruldu. Bu, bizə Cy5 flüoresansına əməl etməklə fasiləsiz saxaroza sıxlığı qradiyentinə məruz qalmış nümunələri təhlil etməyə imkan verdi (mövcudluğu üçün2AR) və NBD floresansı (lipid veziküllərinin olması üçün). Nəticələrimiz təhlil edilən hər bir fraksiyada Cy5 flüoresansı ilə NBD flüoresansı arasında demək olar ki, mükəmməl korrelyasiya göstərir ki, β2AR molekulları bu veziküllərdə bərabər paylanmışdır (Şəkil 3A). Oxşar nəticələr β ilə əldə edilmişdir2AR 10 000:1 lipid-reseptor nisbətində yenidən quruldu (Əlavə Şəkil 2).

β2AR-lər lipid veziküllərində homogen şəkildə paylanır. (A) β-nin paylanmasını təyin etmək2Lipid veziküllərindəki AR-lar, tərkibində 0,4 NBD 'fosfokolin və Cy5' olan nümunələrin saxaroza sıxlığı qradiyenti.21000:1 lipid-reseptor nisbətində yenidən qurulmuş AR-lar Əlavə məlumatda təsvir olunduğu kimi yerinə yetirilmişdir. Lipid fraksiyalarının aşkarlanması NBD floresansına (λ) əməl etməklə həyata keçirilmişdir.məs=460 nm) və reseptor fraksiyaları Cy5 flüoresansına (λ) əməl etməkləməs=649 nm). (B) Yenidən qurulmuş β2AR-lər veziküllərin ölçüsünü və hər bir veziküldə reseptorların sayını təyin etmək üçün Əlavə məlumatda təsvir olunduğu kimi mənfi rəngləmə protokolundan istifadə edərək təsvir edilmişdir. Ölçək çubuğunun uzunluğu 200 nm-dir. Məlumatlar üç müstəqil eksperimentin nümayəndəsidir.

β-nin sıxlığını qiymətləndirmək üçün2Lipid veziküllərindəki AR-lar, bizim β orta diametrini təyin etmək üçün elektron mikroskopiyadan istifadə etdik.2AR tərkibli lipid vezikül preparatları. Mənfi bir boyama protokolundan istifadə edərək, lipid-reseptor nisbətində 1000:1 olan vezikül preparatlarımızın orta diametrinin 83 nm 넒 nm olduğunu təyin etdik (Şəkil 3B). Əlavə materiallar və metodlar bölməsində təfərrüatlı hesablamalardan istifadə edərək belə nəticəyə gəldik ki, 50 � β2Əksəriyyəti xaricə yönəlmiş lipid vezikül başına AR.

Funksional xarakteristikası 㬢Lipid veziküllərində AR

Antaqonist [3H]-dihidroalprenolol (DHA) üçün hər üç tək sistein mutantının yaxınlığını müəyyən etmək üçün təmizlənmiş, yenidən qurulmuş reseptorda doyma bağlanmasını həyata keçirdik. Üç dəyişdirilmiş β arasında heç bir əhəmiyyətli fərq müşahidə etmədik2AR və vəhşi tip β2AR-lar (Cədvəl I və Əlavə Şəkil 3). Müəyyən etmək üçün [3 H]-DHA ilə rəqabət bağlayıcı tədqiqatlar istifadə edilmişdir Ki agonist izoproterenol (Iso) və tərs agonist ICI 118,551 (ICI) üçün dəyərlər. Cədvəl I və Şəkil 4-də göstərildiyi kimi, tək sisteinli mutantlar üçün qiymətlər vəhşi tip β üçün alınan qiymətlərlə müqayisə edilə bilər.2AR, tək reaktiv sisteinlərin tətbiqini və təmizlənmiş β2Lipid veziküllərə AR reseptorun farmakologiyasını dəyişdirmir.

Tək reaktiv sistein mutantları tam funksionaldır. Aqonist izoproterenolun yaxınlığı (A) və tərs agonist ICI 118,551 (B) hər üç tək sisteinli mutant (㥅-T66C, 㥅-A265C və 㥅-R333C) və vəhşi tipli reseptor üçün [3H]-DHA-nın rəqabətli bağlanması ilə ölçüldü. Nəticələr rəqib olmadıqda bağlı radio-ligandın faizi kimi ifadə edilir. (C) Etiketsiz və ya Cy5 ilə etiketlənmiş üç tək sisteinli mutantın və vəhşi tipli reseptorun funksionallığı Əlavə məlumatda təsvir olunduğu kimi GTP'nin bağlanması ilə müəyyən edilmişdir. 10 M izoproterenol (aqonist cavab) və ya 10 M ICI 118,551 (tərs agonist reaksiya) ilə induksiya edilən [35 S]-GTP's-x003b3S-ə spesifik bağlanma bazal üzərində qat olaraq göstərilir. Bütün funksional məlumatlar orta göstəricini təmsil edir. üç nüsxədə həyata keçirilən üç müstəqil təcrübədən.

Cədvəl 1

Tək reaktiv sistein reseptorları üçün agonist, antaqonist və tərs agonist bağlama xüsusiyyətləri

β2ARKi [s.e. interval] (n M )Kd±s.e.m.
mutant(−)-İzoproterenolICI 118,551[3 H-DHA]
Vəhşi tip355 [203�]1,17 [0,77𠄱,77]1.3ଐ.16
㥅-T66C388 [319�]2,09 [1,86𠄲,35]1.8ଐ.21
㥅-A265C298 [255�]1,84 [1,45𠄲,33]2.5ଐ.23
㥅-R333C214 [168�]1,90 [1,59𠄲,27]2.4ଐ.24
a Doyma və rəqabət bağlaması Materiallar və üsullar altında təsvir edildiyi kimi yerinə yetirildi. Məlumatlar orta göstəricini təmsil edir. ən azı üç müstəqil təcrübə.

Üç tək-sistein mutantının G zülalının birləşməsi üçün funksionallıq [35 S]-GTPγS bağlanması ilə həll edilmişdir. Bu analiz təmizlənmiş β-nin yenidən qurulmasını əhatə edir2Təmizlənmiş Tet-G ilə ARαs daha əvvəl təsvir edildiyi kimi (Swaminath və b, 2005 Granier və b, 2007). Hər üçünə agonist bağlanması β2AR tək-sistein mutantları vəhşi tipli reseptorlara oxşar olan G protein birləşməsinin əhəmiyyətli stimullaşdırılmasına səbəb oldu (Şəkil 4C). Nümunələrin tərs agonist ICI ilə müalicəsi vəhşi tipli reseptor üçün müşahidə edilənə bənzər bazal aktivliyin azalmasına səbəb oldu (Şəkil 4C). Tək sisteinlərin Cy5 maleimid fluorofor ilə modifikasiyası G zülalının birləşməsinə əhəmiyyətli təsir göstərməmişdir (Şəkil 4C PϠ.05).

Flüorofor etiketli FRET analizi 㬢Lipid ikiqatlarında AR

Əvvəlcə eyni mövqedə etiketlənmiş reseptorlar arasında FRET təyin etdik. Cy3 ilə etiketlənmiş 㥅-A265C, TM6/TM6 qarşılıqlı təsirlərini izləmək üçün Cy5 ilə etiketlənmiş 㥅-A265C ekvivalent miqdarı ilə yenidən quruldu. Bu, 㥅-T66C və 㥅-R333C üçün, müvafiq olaraq, ICL1/ICL1 və H8/H8 qarşılıqlı təsirləri üçün müxbirlər kimi təkrarlandı. Şəkil 5A 㥅-T66C-də həyata keçirilən tipik bir təcrübə nümunəsini göstərir. Cy3- və Cy5 ilə işarələnmiş reseptorlar (30.3଑.2%) arasında FRET yalnız reseptorların ikiqat lipid qatına çevrilməsindən sonra müşahidə olunur, lakin reseptorlar yuyucu vasitədə həll olunanda deyil (Şəkil 5A və Cədvəl II). Oxşar müşahidələr Cy3- və Cy5 etiketli 㥅-A265C (16.7଑.3%) və Cy3- və Cy5-etiketli 㥅-R333C (26.9.05b) üçün də aparılmışdır. ).

Cy3- və Cy5 etiketli β arasında molekullararası FRET2AR digər hüceyrə zülallarından müstəqildir və spesifikdir. (A) Təmizlənmiş, yuyucu vasitə ilə həll olunan reseptor zülalı Cy3 və ya Cy5 maleimid ilə etiketləndi və reaksiyaya girməmiş flüorofor sisteinlə söndürüldü və Materiallar və üsullar bölməsində təsvir olunduğu kimi gel filtrasiyası ilə zülaldan ayrıldı. Cy3 və Cy5 etiketli zülal nümunələri 1:1 molar nisbətdə qarışdırıldı və ikiqat fosfolipidlər şəklində yenidən quruldu və ya yuyucu vasitədə saxlanıldı. Düzgün nəzarətlərin çıxarılması və xam izlərin normallaşdırılması Əlavə məlumatda təsvir edilmişdir. Etiketli β2AR-lər 10 qat daha yüksək lipid-reseptor nisbətində (10 000:1) yenidən quruldu və FRET effektivliyi ICL1/ICL1 üçün ölçüldü (B), TM6/TM6 (C) və H8/H8 (D) qarşılıqlı təsirlər. Məlumatlar ən azı üç müstəqil eksperimenti təmsil edir (A) və ya orta göstəricidir. ən azı üç müstəqil təcrübədən (B𠄽).

Cədvəl 2

Liqand olmadıqda və agonist, neytral antaqonist və ya tərs agonist bağlandıqda FRET effektivliyi

β2AR bölgəsiLiqand yoxdur±s.e.m.+İzoproterenol±s.e.m.P-dəyərʺlprenolol±s.e.m.P-dəyər+ICI 118,551±s.e.m.P-dəyər
ICL-1/ICL-130.26଑.231.43ଐ.40.4529.72ଔ.10.8634,86଑,40,043 *
TM-6/TM-616.73଑.317.71଒.10.6421.48ଐ.80.2327,67଒,00,005 **
H-8/H-826,85ଐ,829.56଑.10.0631.40ଓ.50.0728.33଑.80.418
ICL-1/TM-624.58଒.322.26ଐ.40.5627.82ଖ.10.5430.00ଔ.60.269
ICL-1/H-824.08଑.623.71ଐ.70.9126,87ଔ,80.4935.33଒.40,006 **
TM-6/H-830,98ଐ,735,27଑,50,01 * 33.63ଐ.20,05 * 25.33଒.00,005 **
a FRET səmərəliliyi Materiallar və üsullar altında təsvir olunduğu kimi hesablanmışdır. Məlumatlar orta göstəricini təmsil edir. ən azı üç müstəqil təcrübə. P-dəyərləri heç bir liqand və üç fərqli liqand arasında statistik müqayisələrə istinad edir: izoproterenol, alprenolol və ICI 118,551.
* Pπ.05 ** Pπ.005.

β-nin nisbi oriyentasiyası haqqında əlavə məlumat vermək2AR protomerləri, fərqli etiketləmə saytları arasında FRET-i araşdırdıq. Məsələn, Cy3 ilə etiketlənmiş 㥅-T66C, ICL1/TM6 qarşılıqlı təsirlərini araşdırmaq üçün Cy5 ilə etiketlənmiş 㥅-A265C ekvivalenti ilə yenidən quruldu. Eyni yanaşma digər mümkün birləşmələr, ICL1/H8 və TM6/H8 üçün də tətbiq edilmişdir (Cədvəl II). Fərqli etiketləmə cütləri üçün fərqli FRET effektivliyinin müşahidəsi qeyri-spesifik birləşmədən daha çox lipid billayerlərində reseptorların xüsusi yerləşməsini təklif edir. Bu tədqiqatlarda müşahidə edilən FRET-in sadəcə olaraq lipid iki qatında etiketlənmiş reseptorların sıxlaşması, lipidlərin 10 qat daha yüksək molar konsentrasiyası (son lipid-reseptor nisbəti 10 000:1) ilə əlaqədar olması ehtimalını istisna etmək üçün. lipid ikiqatının vahid sahəsinə düşən reseptorların sayını azaltmaq üçün istifadə edilmişdir. 10 000:1 lipid-reseptor nisbətində müşahidə olunan FRET effektivliyi 1000:1 nisbətində əldə edilənlərdən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmirdi (Şəkil 5B𠄽 PϠ.05).

Flüorofor etiketli FRET doyması 𻈪R oliqomerləri

Müşahidə olunan oliqomerləşmənin spesifikliyini, eləcə də oliqomerlərin stoxiometriyasını daha da araşdırmaq üçün biz FRET doyma təcrübələrini həyata keçirdik, burada qəbuledici floroforun nisbəti (Cy5 etiketli β)2AR) donor florofora (Cy3 etiketli β2Ümumi reseptor konsentrasiyası və lipid-reseptor nisbəti sabit saxlanılmaqla AR) artır. Enerji ötürülməsi xüsusi reseptor reseptorlarının qarşılıqlı təsirindən qaynaqlanırsa, Cy5/Cy3 nisbəti artdıqca FRET səmərəliliyi doyacaq. Bunun əksinə olaraq, təsadüfi toqquşmalar kvazi xətti əlaqə yaratmalıdır (Mercier və b, 2002 Ceyms və b, 2006 Harikumar və b, 2008). Biz hər üçü üçün FRET doymasını müşahidə edirik β2Qarşılıqlı əlaqələrin spesifik xarakterini nümayiş etdirən AR etiketləmə saytları (Şəkil 6A𠄼).

β-nin spesifikliyi2FRET saturasiyası ilə qiymətləndirilən AR oliqomerizasiyası. FRET doyma Cy5- və Cy3 etiketli β nisbətinin dəyişdirilməsini əhatə edir.21:1 ilə 10:1 (Cy5:Cy3) diapazonunda AR-lar, ümumi β2AR konsentrasiyası sabit saxlanıldı. ICL1/ICL1 üçün doymuş FRET müşahidə olunur (A), TM6/TM6 (B) və H8/H8 (C). FRET ölçmələri Əlavə məlumatda təsvir olunduğu kimi aparıldı və hesablandı. Məlumatlar orta göstəricini təmsil edir. ən azı üç müstəqil təcrübə. (D) Hər üç konstruksiyadan (yuxarıda A𠄼) FRET doyma məlumatları maksimum FRET səmərəliliyinə normallaşdırıldı və sonra ortalandı və tənlikdən istifadə edərək yaradılan dimer, trimer, tetramer və daha yüksək səviyyəli oliqomer üçün nəzəri əyrilərlə (kesikli xətlər) birlikdə qrafiki tərtib edildi. 1) Əlavə məlumatda.

Bundan əlavə, FRET doyma oliqomer başına protomerlərin sayı haqqında fikir verə bilər. FRET doyma nəticələrimiz yaxşı təsvir edilmiş riyazi modellə müqayisə edilmişdir (Veatç və Stryer, 1977 Mercier və b, 2002 Ceyms və b, 2006 Harikumar və b, 2008 Harding və b, 2009) dimerlər, trimerlər, tetramerlər və s. üçün enerji ötürmə doyma təcrübələrində (FRET və ya BRET) gözlənilən maksimum enerji ötürülməsini proqnozlaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir.Bundan belə nəticə çıxır ki, doyma sadə dimerlərə nisbətən daha yüksək dərəcəli oliqomerlər üçün daha aşağı qəbuledici/donor nisbətində baş verəcəkdir. Biz hər üç konstruksiya üçün FRET doyma məlumatlarımızı normallaşdırdıq və onları dimerlər, trimerlər, tetramerlər və daha yüksək dərəcəli oliqomerlər (səkkiz protomer) üçün modellərlə müqayisə etdik və məlumatlarımızın tetramerlər üçün nəzəri əyri üzərində üst-üstə düşdüyünü tapdıq (Şəkil 6D).

Liqanda effektivliyinin təsiri 𻈪R oliqomerləşməsi

Üç sinif GPCR dərmanının təsirini araşdırdıq: tam agonist (izoproterenol), neytral antaqonist (alprenolol) və tərs agonist (ICI) fərqli etiketləmə saytları arasında FRET effektivliyinə. Tam agonist izoproterenolun doymuş miqdarları (10 º03bcM) ilə müalicə edildikdə, TM6 və H8 arasında FRET-də kiçik, lakin əhəmiyyətli artım müşahidə edildi (Şəkil 7A və Cədvəl II Pπ.05). Doymuş konsentrasiyalarda (500 nM) alprenolol TM6 və H8 arasında oxşar nəticə verdi (Şəkil 7A və Cədvəl II Pπ.05). Bu kiçik dəyişikliklərin protomerlərin nisbi düzülüşündəki incə dəyişikliklərdən, yoxsa reseptordakı kiçik konformasiya dəyişikliklərindənmi olduğunu söyləmək mümkün deyil.

β2AR oliqomerləri tərs agonistlər tərəfindən tənzimlənir. (A) FRET nümunələrinin doymuş miqdarda tərs agonist ICI 118,551, agonist izoproterenol və neytral antaqonist alprenolol ilə müalicəsi. (B) Liqandların iştirakı ilə FRET saturasiyası. İzoproterenol və alprenolol, bağlanmamış FRET doyma əyrisindən heç bir müşahidə edilə bilən fərqə səbəb olmadı, ICI 118,551 isə daha yüksək dərəcəli oliqomerlərə daha uyğun olan əyriyə gətirib çıxardı. (C) Təmizlənmiş Cy5 etiketli β-nin çarpaz bağlanması2İzoproterenolun və ya ICI 118,551-in mövcudluğu və ya olmaması halında AR nümunələri Əlavə məlumatda təsvir olunduğu kimi aparılmışdır. (D) Karvedilol (qırmızı) və karazolol (yaşıl) tərs agonistlərinin iştirakı ilə FRET saturasiyası. Bütün məlumatlar orta hesabla bildirilir. (A, B, D) və ya ən azı üç müstəqil eksperimentin nümayəndəsidir (C). * (Pπ.05) və ** (Pπ.005).

Aqonist və neytral antaqonist ilə müşahidə edilən kiçik dəyişikliklərdən fərqli olaraq, tərs agonist ICI-yə məruz qaldıqdan sonra daha böyük dəyişikliklər müşahidə edildi (Şəkil 7A və Cədvəl II). Tərs agonistlərə əvvəlcə antaqonistlər kimi təsnif edilən bir çox birləşmələr, ortosterik bağlanma yerini tutan, lakin reseptor funksiyasını dəyişdirməyən ligandlar daxildir. Bunun əvəzinə, tərs agonistlər bir çox GPCR-lər tərəfindən nümayiş etdirilən bazal agonistdən asılı olmayan fəaliyyəti inhibə edir, o cümlədən β2AR (Galandrin və Bouvier, 2006). Maraqlıdır ki, ICI-nin doymuş konsentrasiyasında (500 nM) altı etiketləmə cütündən dördü üçün FRET səmərəliliyində əhəmiyyətli dəyişikliklər müşahidə edilmişdir (Şəkil 7A və Cədvəl II). FRET-də ICI-in səbəb olduğu dəyişikliklər maksimuma 10 dəqiqəyə çatır (Əlavə Şəkil 4).

ICI ilə müşahidə edilən FRET-dəki dəyişikliklər protomerlərin oriyentasiyasında və ya oliqomerik kompleksdə protomerlərin sayında dəyişiklikləri əks etdirə bilər. Bununla belə, bu dəyişikliklər həm də flüoroforun hərəkətliliyinə və ya ətraf mühitin qütblüyünə təsir edən reseptorların konformasiyasında liqandla bağlı dəyişikliklərlə bağlı ola bilər. Buna görə də, izoproterenol və ICI-nin flüoresansın intensivliyinə və etiketlənmiş reseptorlarda flüoroforların anizotropiyasına təsirini araşdırdıq. Həm Cy3, həm də Cy5 etiketli β üçün2Ayrı-ayrılıqda bərpa edilən AR, ya izoproterenol, ya da ICI ilə müalicə flüoresansın intensivliyində (məlumatlar göstərilmir) və ya flüoroforların anizotropiyasında əhəmiyyətli dəyişikliklərə səbəb olmadı, bu, ICI ilə müalicə zamanı müşahidə edilən FRET effektivliyindəki dəyişikliyin konformasiya dəyişikliklərinin nəticəsi olmadığını göstərir. protomerlərdə (Əlavə Şəkil 5).

FRET-in effektivliyində ICI-induksiya etdiyi dəyişikliklər bir neçə əlavə faktorla əlaqələndirilə bilər: oliqomerlərdə protomerlərin oriyentasiyası, protomerlərin daha sıx bir şəkildə yığılması, oliqomerlərin müvəqqəti dayanıqlığının artması (monomerlər və oliqomerlər arasında tarazlığın olduğunu nəzərə alaraq) , və oliqomerik dövlətin stoxiometriyasında artım (məsələn, dimerlərdən və ya tetramerlərdən daha yüksək dərəcəli oliqomerlərə keçmək). Bu imkanları ayırd etmək üçün biz ICI, alprenolol və ya izoproterenolun mövcudluğu və yoxluğunda FRET saturasiyasını həyata keçirdik. Nümunələr otaq temperaturunda 30 dəqiqə ərzində ligandlarla inkubasiya edilmiş və ölçmələr aparılmışdır. Nəticələr göstərir ki, ICI varlığında doyma əyrisi daha yüksək dərəcəli oliqomerlər üçün modelə daha çox bənzəyir, alprenolol və izoproterenol isə reseptorun görünən oliqomer vəziyyətinə heç bir təsir göstərmir (Şəkil 7B). Tərs aqonistlər karazolol və karvedilol üçün də daha yüksək dərəcəli oliqomerləşmə müşahidə edilmişdir (Şəkil 7D).

Çarpaz birləşmə β-nin multimerik montaj vəziyyətini daha da həll etmək üçün istifadə edilmişdir.2AR. istifadə etdik Bis(NHS) PEO5, N-terminalında lizin qalıqlarının 'aminlərini və 'amin qruplarını kovalent olaraq dəyişdirən, qarşılıqlı məsafələrə daxil olan reseptorları təsirli şəkildə tutan, 21,7 º5 aralıq uzunluğu olan homobifunksional çarpaz bağlayıcı. Çapraz bağlayıcıların müvəqqəti qarşılıqlı zülalları tutma potensialı ilə bağlı narahatlıqlar qaldırılsa da (Brett və Findlay, 1979 Downer, 1985 Medina) və b, 2004), aydındır ki, nümunələrin ICI ilə əvvəlcədən inkubasiyası yenidən qurulmuş β daha yüksək dərəcəli oliqomerlərin daha geniş çapraz bağlanmasına və tutulmasına gətirib çıxarır.2AR, bağlanmamış, agonist və antaqonist ilə müalicə olunan nümunələrlə müqayisə edildikdə (Şəkil 7C və Əlavə Şəkil 6). Birlikdə götürdükdə bu nəticələr göstərir ki, β2AR tərs aqonistlər ICI, karazolol və karvedilolun iştirakı ilə yüksək dərəcəli oliqomerlər əmələ gətirir.

ICI-nin protomerlər arasında qarşılıqlı təsirlərin sabitliyinə təsirini araşdırmaq üçün vezikülləri həll edən yuyucu vasitənin konsentrasiyası olan 0,2 % DDM əlavə edildikdən sonra FRET-ə nəzarət etdik. Yuyucu vasitənin əlavə edilməsindən sonra FRET-in azalmasının, bağlanmamış nümunələrlə müqayisədə ICI ilə əvvəlcədən inkubasiya edilmiş nümunələrdə daha yavaş və daha az tamamlandığını gördük (Əlavə Şəkil 7, Pπ.05), ICI-nin də protomerlər arasında qarşılıqlı əlaqəni sabitləşdirdiyini sübut edir.

G-lərin təsiri 𻈪R oliqomerləşməsi

G zülal birləşməsinin oliqomerləşməyə təsirini araşdırmaq üçün biz β-ni yenidən təşkil etməklə FRET doyma təcrübələrini həyata keçirdik.2Təmizlənmiş Gs heterotrimerinin üç qat molar artıqlığı ilə AR (Şəkil 8). G zülalının bu konsentrasiyası rekonstitusiyaya minimal təsir göstərməklə kifayət qədər G zülalının veziküllərə daxil olmasını təmin etmək üçün seçilmişdir. G-lərin daxil edilməsi β-nin oriyentasiyasını dəyişmədi2PNGase F-ə həssaslıqla müəyyən edilən AR (Şəkil 8A). Biz statistik cəhətdən əhəmiyyətli (Pπ,008) Cy5/Cy3 üçün 0,25, 0,5 və 1 üçün Gs olmayan rekonstitusiyalarla müqayisədə G-lərin iştirakı ilə FRET saturasiyasının azalması (Şəkil 8B). Başqa bir membranla əlaqəli zülal ilə yenidən qurulmasının qeyri-spesifik təsirlərinə görə biz β-nin FRET doymasını həyata keçirdik.2Gs və GTPγS varlığında AR, β-ni ayırır2AR və Gs. Şəkil 8C-də göstərildiyi kimi, GTPγS-in mövcudluğu statistik əhəmiyyətli şəkildə artır (Pπ.04), β üçün müşahidə edilən dəyərlərə FRET doyma2AR tək. β-nin hissəsini təxmin etmək2Bu sulandırma şərtləri altında G-lərlə birləşən AR, biz TM6-nın sitoplazmik ucunda C265-i ətraf mühitə həssas flüoresan zond olan mBBr ilə etiketlədik. Biz əvvəl G-lərin β-yə maksimal birləşməsini göstərmişdik2HDL hissəciklərində yenidən qurulan AR flüoresans intensivliyinin azalmasına və maksimal emissiya dalğa uzunluğunda 18 nm sürüşməsinə səbəb olur (λMAX) mBBr–β2AR (mBBr–β2AR Yao və b, 2009). Şəkil 8D-də göstərildiyi kimi, FRET doyma təcrübələri üçün istifadə edilən sulandırma şəraitində, Gs intensivliyin azalmasına və λ-də 4 nm sürüşməsinə səbəb oldu.MAX mBBr–β2GTPγS varlığında eyni rekonstitusiyaya nisbətən AR. λ-nin yerdəyişməsinə əsaslanırMAX biz təxmin edirik ki, yenidən qurulanların təxminən 20 % β2AR Gs ilə birləşdirilir.

G proteininin G-nin Cy5 və Cy3 etiketli β-nin FRET doymasına təsiri2AR. FRET saturasiyası Cy5-dən Cy3-lə işarələnmiş β nisbətinin dəyişdirilməsi ilə həyata keçirilmişdir.2AR-R333C 1:4 ilə 4:1 (Cy5:Cy3) diapazonunda, ümumi β2AR konsentrasiyası sabit saxlanıldı. Təmizlənmiş Gs heterotrimeri 3 Gs:1 β molar nisbətində əlavə edildi.2Yenidən qurulmadan əvvəl AR. (A) G-lərin sulandırmaya daxil edilməsi β-nin oriyentasiyasını dəyişmədi.2Sulandırılmış β-nin həssaslığı ilə müəyyən edilən veziküllərdə AR2AR-dan PNGase F-ə (bax Şəkil 3C). FRET saturasiyası G-lərin mövcudluğunda β ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə aşağı idi2tək AR (B) və ya β210 μ M GTPγS ilə AR və Gs (C). (D) β2AR TM6-nın sitoplazmik ucunda mBBr–β ilə C265-də etiketlənmişdir.2AR və FRET doyma təcrübələri üçün istifadə edilən eyni şərtlər altında Gs ilə yenidən quruldu. Gs intensivliyin azalmasına və λ-də 4 nm sürüşməsinə səbəb oldu.MAX mBBr–β2GTPγS varlığında eyni rekonstitusiyaya nisbətən AR. β üçün FRET dəyərlərini müqayisə etmək üçün ikitərəfli ANOVA-dan istifadə edilmişdir2AR, β2AR+Gs və β2Müxtəlif Cy5:Cy3 nisbətlərində AR+Gs+GTPγS. Bir posteriori statistik təhlil β arasında FRET-də əhəmiyyətli azalma göstərdi2AR və β2AR+Gs (Pπ.008) və β arasında FRET-də əhəmiyyətli artım2AR+Gs və β2AR+Gs+GTPγS (Pπ.04) 2 və 4 istisna olmaqla, bütün Cy5:Cy3 əmsalları üçün. β arasında statistik fərq aşkar edilməyib2AR və β2AR+Gs+GTPγS.


Müzakirə

PI3K-Akt hüceyrələrin sağ qalmasına vasitəçilik edən əsas tənzimləyicidir (Franke və b, 2003). İndi biz E2F1 və Miz1 fəaliyyətlərinə nəzarət etmək üçün PI3K-Akt-ı BRCT domen proteini TopBP1 ilə birləşdirən yeni yolu müəyyən etdik. Akt-TopBP1 yolu vasitəsilə həm E2F1-induksiya etdiyi apoptoz, həm də Miz1-induksiya etdiyi hüceyrə dövrünün dayanması normal proliferasiyanın irəliləməsini təmin etmək üçün idarə oluna bilər. Üstəlik, Akt-dan asılı oliqomerləşmə yolu ilə TopBP1 funksiyasının tənzimlənməsinin yeni mexanizmi də aydınlaşdırılmışdır.

E2F1 vasitəçiliyi ilə apoptozun idarə edilməsində Akt-TopBP1 yolu

Akt-ın bir Ser 1159 qalığında TopBP1-i fosforilləşdirdiyinə inandırıcı sübut təqdim edirik. Bu fosforlaşma hadisəsi TopBP1 üçün fizioloji şəraitdə E2F1-in transkripsiya və proapoptotik fəaliyyətini basdırmaq üçün lazımdır. Biz həmçinin nümayiş etdiririk ki, E2F1-in TopBP1 tərəfindən tənzimlənməsi bütün cib zülallarından müstəqildir. Birlikdə götürdükdə, biz indi E2F1-dən asılı apoptoza nəzarət etmək üçün klassik Cdk-Rb yoluna (Şəkil 7F) paralel olaraq Akt-TopBP1-ni əhatə edən bir yol təklif edirik. Böyümə faktorunun stimullaşdırılmasına cavab olaraq, Cdk-nin aktivləşdirilməsi pRb fosforlaşmasına və S-fazasına daxil olmaq üçün sərbəst E2F-nin sərbəst buraxılmasına səbəb olur. PI3K-Akt-ın aktivləşdirilməsi, G1/S keçidi zamanı TopBP1-in tənzimlənməsi yolu ilə E2F1-in proapoptotik fəaliyyətini yoxlamaq üçün vacibdir. Apoptozun düzgün idarə edilməsini təmin etmək üçün bir neçə geribildirim döngəsi mövcuddur. TopBP1 əslində E2F hədəfidir və onun səviyyəsi G1/S və S fazalarında zirvələrə çatır (Liu və b, 2004 Yoshida və Inoue, 2004). E2F həmçinin Gab2-ni aktivləşdirir və Akt fəaliyyətini tənzimləyir (Chaussepied və Ginsberg, 2004). S fazasında E2F1 aktivliyi siklin A/Cdk2 (Krek və b, 1994 Xu və b, 1994). Birlikdə, bu mexanizmlər hüceyrə proliferasiyası zamanı E2F1 vasitəçiliyi ilə apoptozu idarə etmək üçün çox qatlı tənzimləmə təmin edir.

Akt-TopBP1 yolu DNT zədəsi zamanı E2F1-i də idarə edə bilər. TopBP1 və E2F1 arasındakı qarşılıqlı əlaqə ATM ( Liu və b, 2003). TopBP1 ATM ( Yamane və b, 2002) və TopBP1 zülalının səviyyəsi radiomimetic agent neocarzinosttain (NCS) (Liu) tərəfindən induksiya olunur. və b, 2003). İonlaşdırıcı şüalanma Akt-ı aktivləşdirir ( Contessa və b, 2002 Viniegra və b, 2005), NCS müalicəsi ilə əlimizdə təsdiqlənmişdir (məlumatlar göstərilmir). ATM Ser 473-də Akt-ın fosforlaşmasına vasitəçilik edir və ionlaşdırıcı şüalanmaya cavab olaraq Akt-ın aktivləşməsinə kömək edir (Viniegra) və b, 2005). Adriamisin müalicəsi zamanı Akt-ın aktivləşdirilməsi TopBP1 hərəkəti vasitəsilə E2F1 hədəf genlərinin ifadəsini maneə törədir (Şəkil 3B). Beləliklə, ionlaşdırıcı şüalanmaya cavab olaraq, ATM kinaz E2F1 vasitəçiliyi ilə apoptozu idarə etmək və DNT təmirini tamamlamaq üçün Akt-TopBP1 yolunu hədəfləyə bilər.

HPV 16 E2 və Miz1 nəzarətində Akt-TopBP1 yolu

TopBP1 və HPV16 E2 və ya Miz1 arasındakı qarşılıqlı əlaqə Akt fosforlaşma sahəsini də tələb edir. Bu nəticələr Akt-TopBP1-in digər bioloji prosesləri də tənzimlədiyini göstərir. HPV16 E2 HPV-lərin həyat dövrü üçün vacibdir. Viral genomun transkripsiyasını tənzimləyir. O, həmçinin viral replikasiya faktoru E1 ilə qarşılıqlı əlaqədə olur və virus replikasiyası üçün replikasiya mənşəli E1-i işə götürür. TopBP1 HPV16 E2 ilə qarşılıqlı əlaqədə olur və onun transkripsiya və replikasiyanı aktivləşdirmək qabiliyyətini artırır (Boner və b, 2002). HPV infeksiyası zamanı HPV E7, E2F-ləri buraxmaq üçün pRb kimi cib protein ailəsinin üzvlərini hədəf alır. O, həmçinin PP2A ilə qarşılıqlı təsir yolu ilə Akt-ı aktivləşdirir, aktivləşdirilmiş Akt-ın (Pim) fosforsuzlaşmasının qarşısını alır. və b, 2005). Beləliklə, Akt-ın E7 tərəfindən aktivləşdirilməsi TopBP1-i tənzimləyə və virus transkripsiyası və replikasiyasının E2 vasitəçiliyi ilə aktivləşdirilməsini gücləndirə bilər.

Miz1 Myc ilə əlaqəli sink-barmaq transkripsiya faktorudur. Miz1, p15 INK4b və p21 Cip1-i (Wanzel) aktivləşdirmək üçün fəaliyyəti ilə hüceyrə dövrünün həbsində iştirak edir. və b, 2003). Myc Miz1 ilə qarşılıqlı əlaqə qurur və Miz1 ilə transkripsiya aktivləşdirməsini ən azı qismən Miz1-ə bağlanmaq üçün p300 ilə rəqabət vasitəsilə sıxışdırır ( Staller və b, 2001). Miz1 ilə qarşılıqlı əlaqə Myc tərəfindən transkripsiya repressiyasına vasitəçilik etməkdə mühüm rol oynayır. TopBP1, BRCT7 və BRCT8 domenləri vasitəsilə Miz1 ilə qarşılıqlı əlaqə qurur və Miz1 transkripsiya fəaliyyətini sıxışdırır (Herold və b, 2002). Məlumatlarımız daha sonra onu göstərir ki, TopBP1 üçün Miz1-i bağlamaq və basdırmaq üçün Akt tərəfindən fosforlaşma tələb olunur. Miz1-in Akt-TopBP1 tərəfindən idarə edilməsinə əlavə olaraq, Akt Miz1-i birbaşa fosforlaşdırır, bu fosforlaşma 14-3-3η-nin Miz1 DNT-nin bağlanma sahəsinə bağlanmasına gətirib çıxarır və Miz1 funksiyasını inhibə edir (Wanzel və b, 2005). Buna görə də, Akt Miz1-ni birbaşa olaraq Miz1-in fosforilasiyası və dolayısı ilə TopBP1-in fosforilasiyası vasitəsilə hüceyrə dövrünün dayanmasına nəzarət etmək üçün tənzimləyir (Şəkil 7F). Miz1-in 14-3-3η-vasitəçiliyi və TopBP1-vasitəçiliyi ilə maneə törədilməsi ehtimal ki, iki alternativ prosesdir, çünki TopBP1 və 14-3-3 arasında trimerik Miz1/TopBP1/14-3-3 kompleks formalaşmasını təklif etmək üçün aşkar edilə bilən qarşılıqlı əlaqə yoxdur. (Əlavə Şəkil 6). Ca-Akt ilə adriamisinin müalicəsi zamanı p21 ifadəsinin inhibəsi TopBP1 siRNA tərəfindən ləğv edilir (Şəkil 3B), Miz1-in Akt tərəfindən tənzimlənməsinin, ən azı DNT zədəsi zamanı p21-in idarə edilməsində əsasən TopBP1 tərəfindən vasitəçilik edildiyini göstərir. G1-in həbsi üçün Miz1-in rolu DNT zədələnməsi kontekstində nümayiş etdirildi (Seoane və b, 2002 Wanzel və b, 2005) və TGFβ siqnalizasiya (Seoane və b, 2001). Miz1 fəaliyyətinin Akt-TopBP1 tərəfindən tənzimlənməsi, Miz1-in E2F1 vasitəçiliyi ilə əlaqəli apoptoza nəzarətə bənzər normal yayılma zamanı Akt-TopBP1 tərəfindən daimi repressiya altında ola biləcəyini göstərir. Hipoteza Akt-TopBP1-in normal böyümə zamanı Miz1 hədəf genlərindən biri olan p21-in ifadəsini idarə etmək üçün tələb olunması ilə dəstəklənir (Şəkil 3A və 7E). Bu, Miz1-in tükənməsi ilə stresssiz hüceyrələrdə gen ifadəsinə ölçülə bilən təsirin olmamasını izah edə bilər ( Wanzel və b, 2005 ).

Akt fosforilasiyası TopBP1 zülalının oliqomerləşməsini tənzimləyir

Akt ümumiyyətlə öz substratlarını fermentativ fəaliyyətini dəyişdirərək və ya substratların 14-3-3 zülallara yaxınlığını artırmaqla tənzimləyir və bununla da sitozolda fosforlanmış substratları saxlayır. TopBP1-in nüvə lokalizasiyası Akt tərəfindən tənzimlənmir və böyüyən HEK293 hüceyrələrində 14-3-3 və TopBP1 arasındakı qarşılıqlı əlaqəni aşkar edə bilmirik (Əlavə Şəkil 6). TopBP1-in Akt tərəfindən fosforlaşmasının TopBP1 BRCT domenlərinin birbaşa öz-özünə birləşməsinə səbəb olduğuna dair sübut təqdim edirik. Bildiyimizə görə, bu, Akt tərəfindən fosforlaşmanın tənzimləyici mexanizm olaraq zülal oliqomerizasiyasına səbəb olduğuna dair ilk nümunədir. Nəzərə alsaq ki, BACH1 fosfopeptid iki BRCT təkrarının qovşağında səth yarığı ilə spesifik qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə BRCA1-in BRCT təkrarlarına bağlanır (Şiozaki). və b, 2004), TopBP1 BRCT6 domeni tək TopBP1 və E2F1 arasında sabit qarşılıqlı əlaqəni inkişaf etdirmək üçün kifayət olmaya bilər. TopBP1-in oliqomerləşməsi E2F1 ilə qarşılıqlı əlaqəni sabitləşdirmək üçün iki BRCT6-nı yaxınlaşdıra bilər. TopBP1-in hüceyrələrdə dimerlər, trimerlər, tetramerlər və ya daha yüksək səviyyəli multimerlər kimi əmələ gəlib-gəlmədiyi bu anda aydın deyil. TopBP1 kompleksinin multimerik strukturunu təhlil etmək çox informativ olardı. TopBP1 öz-özünə birləşməsində fosforlanmış Ser 1159-un rolunun struktur əsası da çox maraqlı sualdır. BRCT78-in pSer 1159-peptidinə qarşı fosfopeptid bağlayan fəaliyyəti Ser 1159-un fosforilləşməsinin digər TopBP1 molekullarının BRCT78-i üçün bağlanma yeri yaratdığı və oliqomerləşməyə səbəb olduğu modeli təklif edir.

TopBP1 DNT mübadiləsinin bir neçə aspektində iştirak etsə də, zülal oliqomerizasiyası onun transkripsiya faktorları ilə qarşılıqlı əlaqəsi üçün xüsusi olaraq tələb olunur. Ser 1159-un və onun ətrafdakı ardıcıllığın TopBP1 metazoasında qorunmasını nəzərə alaraq, Akt-dan asılı oliqomerləşmə də çox güman ki, qorunub saxlanılır. TopBP1-in karboksil oliqomerləşmə sahəsi maya homoloqlarında tapılmır. Beləliklə, təkamül zamanı metazoan TopBP1-də həm oliqomerləşmə, həm də transkripsiya tənzimləmə funksiyası əldə edildiyi görünür. Akt-ın TopBP1-in transkripsiya funksiyasını seçici şəkildə tənzimləyə biləcəyini düşünmək cazibədardır.Rad9 və ya topoizomeraz IIβ ilə bağlanması üçün Akt fosforlaşma sahəsi tələb olunmasa da, TopBP1-in oliqomerləşməsinin nəzarət nöqtəsinin aktivləşdirilməsində və ya DNT replikasiyasında iştirak edib-etmədiyini yoxlamaq çox maraqlı olardı. Qeyd etmək lazımdır ki, TopBP1 və Rad9 arasındakı qarşılıqlı əlaqə dördüncü və beşinci BRCT motivlərindən asılıdır və karboksil oliqomerizasiya sahəsini tələb etmir. TopBP1-in ATR aktivatoru olduğu da sübut edilmişdir (Kumagai və b, 2006). Baxmayaraq ki, ATR-aktivləşdirici domen (insan TopBP1 qalıqları 978-1286) Ser 1159 qalığını ehtiva edir, o, yalnız yeddinci BRCT motivinin bir hissəsini ehtiva edir. Beləliklə, oliqomerləşmənin bu prosesdə iştirak etməsi ehtimalı azdır. Akt fosforilasiyasının ATR aktivləşdirilməsində iştirak edib-etməməsi əlavə araşdırma tələb edir. Akt fosforlaşmasının və TopBP1 oliqomerləşməsinin müəyyən edilməsi TopBP1 funksiyalarında gələcək tədqiqatları xeyli asanlaşdıracaq.

E2F1 nəzarətində TopBP1 özünü assosiasiyasının rolu terapevtik təsir göstərə bilər. Əksər xərçəng hüceyrələri Rb yolunun tənzimlənməsinin pozulması səbəbindən həddindən artıq E2F1 fəaliyyətini saxlayır. TopBP1-in aşağı tənzimlənməsi E2F1-dən asılı apoptoza səbəb olur (Liu və b, 2004) buna görə də daha yüksək E2F1 səviyyələrini ehtiva edən hüceyrələr TopBP1 inhibitorlarına daha həssas olardı. TopBP1-in oliqomerizasiya sahəsi, kemoterapi zamanı E2F1 aktivliyini azaltmaq və E2F1 vasitəçiliyi ilə apoptozu gücləndirmək üçün terapevtik hədəf kimi qəbul edilə bilər.


İstinadlar

Terrillon S və Bouvier M (2004) G-protein ilə əlaqəli reseptorların dimerizasiyasının rolları. EMBO Rep 5: 30–34

Milligan G (2004) G protein ilə əlaqəli reseptorların dimerizasiyası: funksiya və liqand farmakologiyası. Mol Pharmacol 66: 1–7

Park PS və b. (2004) G proteini ilə əlaqəli reseptorların oliqomerizasiyası: keçmiş, indiki və gələcək. Biokimya 43: 15643–15656

Roşvil M və b. (2000) Somatostatin reseptorunun alt növləri funksional homo- və heterodimerlər kimi yığılır. J Biol Chem 275: 7862–7869

Pfeiffer M və b. (2001) Somatostatin reseptor alt tiplərinin homo- və heterodimerizasiyası. SST(2A) ilə heterodimerizasiya yolu ilə SST(3) reseptor funksiyasının inaktivasiyası. J Biol Chem 276: 14027–14036

Qrant M və b. (2004) İnsan somatostatin reseptoru 2 dimerlərinin agonistdən asılı dissosiasiyası: reseptor alverində rol. J Biol Chem 279: 36179–36183

Monnot C və b. (1996) Tip 1 angiotenzin II reseptorunun transmembran domenlərindəki qütb qalıqları bağlanma və birləşmə üçün tələb olunur. J Biol Chem 271: 1507–1513

Abdalla S və b. (2004) XIIIA faktoru transqlutaminaz aterosklerozun başlanğıcında monositlərin AT(1) reseptor dimerlərini çarpaz bağlayır. Hüceyrə 119: 343–354

Miura S və b. (2005) Konstruktiv olaraq aktiv homo-oligomerik angiotenzin II tip 2 reseptoru reseptorların konformasiyası və liqand stimullaşdırılmasından asılı olmayaraq hüceyrə siqnalını induksiya edir. J Biol Chem 280: 18237–18244

Terrillon S və b. (2003) Oksitosin və vazopressin V1a və V2 reseptorları biosintez zamanı konstitutiv homo- və heterodimerlər əmələ gətirir. Mol endokrinol 17: 677–691

Zhu X və Wess J (1998) Vəhşi tipli V2 reseptor funksiyasının mənfi tənzimləyiciləri kimi kəsilmiş V2 vazopressin reseptorları. Biokimya 37: 15773–15784

Kroeger KM və b. (2001) Tirotropin azad edən hormon reseptorunun konstitutiv və agonistdən asılı homo-oligomerizasiyası. Bioluminescence rezonans enerji transferindən istifadə edərək canlı hüceyrələrdə aşkarlanması. J Biol Chem 276: 12736–12743

Mahnı gj və b. (2005) Tirotropin azad edən hormon reseptorunun tənzimlənən dimerizasiyası reseptor ticarətinə təsir edir, lakin siqnal vermir. Mol endokrinol 19: 2859–2870

Lətif R və b. (2001) İnsan tirotropin reseptorunun oliqomerizasiyası: flüoresan zülal etiketli hTSHR post-translational kompleksləri ortaya qoyur. J Biol Chem 276: 45217–45224

Lətif R və b. (2002) İnsan tirotropin reseptorunda oliqomerləşmənin liganddan asılı inhibisyonu. J Biol Chem 277: 45059–45067

Urizar E və b. (2005) Glikoprotein hormon reseptorları: reseptor homodimerizasiyası və mənfi əməkdaşlıq arasında əlaqə. EMBO J 24: 1954–1964

Kalebero D və b. (2005) Dominant TSH müqaviməti ilə əlaqəli mutantlarla oliqomerləşmə yolu ilə vəhşi tipli TSH reseptorunun hüceyrədaxili tutulması. Hum Mol Genet 14: 2991–3002

Roess DA və b. (2000) Lüteinizləşdirici hormon reseptorları plazma membranında öz-özünə əlaqələndirilir. Endokrinologiya 141: 4518–4523

Horvat RD və b. (2001) Luteinizing hormon reseptorları reseptorların desensitizasiyası zamanı yavaş-yavaş yayılan komplekslərdə öz-özünə əlaqələndirilir. Mol endokrinol 15: 534–542

Osuga Y və b. (1997) Qüsurlu luteinləşdirici hormon reseptor fraqmentlərinin birgə ifadəsi liqandla induksiya olunan siqnal nəsilini qismən bərpa edir. J Biol Chem 272: 25006–25012

Ji I və b. (2002) Hormon reseptorlarının sis- və trans-aktivləşdirilməsi: LH reseptoru. Mol endokrinol 16: 1299–1308

Tao YX və b. (2004) Hüceyrə səthinin insan lutropin reseptorunun konstitutiv və agonistdən asılı öz-özünə birləşməsi. J Biol Chem 279: 5904–5914

Ji I və b. (2004) Mutant follikul stimullaşdırıcı hormon reseptorlarının transaktivləşməsi seçici olaraq iki hormon siqnalından yalnız birini yaradır. Mol endokrinol 18: 968–978

Fan QR və b. (2005) İnsan follikulunu stimullaşdıran hormonun reseptoru ilə kompleksdə quruluşu. Təbiət 433: 269–277

Kornea A və b. (2001) Gonadotropin azad edən hormon reseptorlarının mikroaqreqasiyası. Flüoresan rezonans enerji ötürülməsi ilə izlənilən dərəcə. J Biol Chem 276: 2153–2158

Horvat RD və b. (2001) Antaqonist olmayan, lakin agonistin bağlanması, flüoresan gonadotropin-relizinq hormon reseptorları arasında flüoresan rezonans enerjisinin ötürülməsinə gətirib çıxarır. Mol endokrinol 15: 695–703

Qardaşlar SP və b. (2004) İnsan "funksiyasını itirən" GnRH reseptor mutantları endoplazmatik retikulumda vəhşi tipli reseptorları saxlayır: dominant-mənfi təsirin molekulyar əsası. Mol endokrinol 18: 1787–1797

Berqlund MM və b. (2003) Neyropeptid Y Y4 reseptor homodimerləri agonist stimullaşdırılması ilə dissosiasiya olunur. J Pharmacol Exp Ther 307: 1120–1126

Dinger MC və b. (2003) Canlı hüceyrələrdə flüoresan rezonans enerjisinin ötürülməsi ilə tədqiq edilən neyropeptid Y reseptorlarının homodimerizasiyası. J Biol Chem 278: 10562–10571

Mandrika I və b. (2005) Melanokortin reseptorları konstitutiv homo- və heterodimerlər əmələ gətirir. Biochem Biophys Res Commun 326: 349–354

Biebermann H və b. (2003) Şiddətli erkən başlanğıc piylənmə olan bir xəstədə melanokortin-4 reseptor mutasiyasının autosomal-dominant irsiyyət rejimi reseptorların dimerizasiyasının səbəb olduğu dominant-mənfi təsirə bağlıdır. Diabet 52: 2984–2988

Bai M və b. (1998) CaR ilə transfeksiya edilmiş HEK293 hüceyrələrinin hüceyrə səthində hüceyrədənkənar kalsium qəbul edən reseptorun (CaR) dimerizasiyası. J Biol Chem 273: 23605–23610

Bai M və b. (1999) Dimerik kalsium həssas reseptor monomerləri arasında molekullararası qarşılıqlı əlaqə onun normal fəaliyyəti üçün vacibdir. Proc Natl Acad Sci ABŞ 96: 2834–2839

Jensen AA və b. (2002) Bioluminescence rezonans enerji ötürülməsi (BRET) istifadə edərək kalsium həssas reseptor homodimerində molekullararası zülal-zülal qarşılıqlı təsirinin araşdırılması. Eur J Biochem 269: 5076–5087

Pin JP və b. (2005) Dimerik sinif C G-zülal ilə əlaqəli reseptorların allosterik işləməsi. FEBS J 272: 2947–2955

Patel RC və b. (2002) Photobleaching flüoresan rezonans enerji ötürülməsi insan somatostatin reseptor alt tiplərinin ligand-induksiya edilmiş oliqomer əmələ gəlməsini aşkar edir. Metodlar 27: 340–348

Rocheville M və b. (2000) Dopamin və somatostatin üçün reseptorlar: inkişaf etmiş funksional aktivliyə malik hetero-oliqomerlərin formalaşması. Elm 288: 154–157

Terrillon S və b. (2004) V1a və V2 vazopressin reseptorlarının heterodimerizasiyası β-həbs ilə qarşılıqlı əlaqəni və onların ticarət nümunələrini müəyyən edir. Proc Natl Acad Sci ABŞ 101: 1548–1553

Hanyaloğlu AC və b. (2002) Tirotropin azad edən hormon (TRH) reseptor alt tiplərinin homo- və hetero-oligomerizasiyası. 1 və 2-ci beta-həbslərin diferensial tənzimlənməsi. J Biol Chem 277: 50422–50430

Saveanu A və b. (2002) İnsan hipofiz somatotrof adenoma hüceyrələrindən böyümə hormonu və prolaktin ifrazını boğmaqda kimerik somatostatin-dopamin molekulunun, BIM-23A387-nin gücləndirilmiş potensialının nümayişi. J Clin Endocrinol Metab 87: 5545–5552

Milligan G və Bouvier M (2005) G zülalı ilə əlaqəli reseptorların dördüncü quruluşunu izləmək üçün üsullar. FEBS J 272: 2914–2925

Eidne KA və b. (2002) Canlı hüceyrələrdə dinamik hormon reseptorlarının qarşılıqlı təsirini öyrənmək üçün yeni rezonans enerji ötürmə üsullarının tətbiqi. Trendlər Endokrinol Metab 13: 415–421

Förster T (1948) Molekullararası enerji miqrasiyası və flüoresan. Ann Phys (Leyptsiq) 2: 55–75

Suhling K və b. (2005) Zamanla həll olunan flüoresan mikroskopiya. Photochem Photobiol Sci 4: 13–22

Maurel D və b. (2004) Hüceyrə səthi membran zülalının qarşılıqlı təsirinin homojen zamanla həll olunan flüoresan rezonans enerji ötürülməsi texnologiyası ilə aşkarlanması. Anal Biokimya 329: 253–262

Xu Y və b. (1999) Bioluminescence rezonans enerji transferi (BRET) sistemi: qarşılıqlı sirkadiyalı saat zülallarına tətbiq. Proc Natl Acad Sci ABŞ 96: 151–156

Ban T və b. (1992) Tirotropin reseptoruna spesifik antikor vəhşi tipli reseptor tamamlayıcı dezoksiribonuklein turşusu ilə transfeksiya edilmiş hüceyrələrin membranlarında çoxlu reseptor formalarını müəyyən edir: onların reseptor sintezi, işlənməsi, strukturu və funksiyası ilə əlaqəsinin xarakteristikası. Endokrinologiya 131: 815–829

Qrossman RF və b. (1995) İmmunoprecipitation insan tiroid toxumasından çoxlu TSH reseptor formalarını təcrid edir. Tiroid 5: 101–105

Graves PN və b. (1996) Solübilizasiya olunmuş tiroid membranlarında tireotropin reseptoru tərəfindən multimerik kompleks formalaşması. Endokrinologiya 137: 3915–3920

Alberti L və b. (2002) TSH reseptor geninin germline mutasiyaları qeyri-autoimmun subklinik hipotiroidizmin səbəbi kimi. J Clin Endocrinol Metab 87: 2549–2555

Refetoff S (2003) Tirotropinə qarşı müqavimət. J Endocrinol Invest 26: 770–779

Persani L və b. (2004) Tirotropin (TSH) fəaliyyətinə qarşı müqavimətin müxtəlif formaları. Daxilində Hipotalamus-Hipofiz-Tiroid Oxunda Hormon Müqavimət Sindromları, 177–192 (Red. Beck-Peccoz P) Norwell, MA: Kluwer Academic