Məlumat

Endogen retrovirus ilə irsiyyət necə işləyir?

Endogen retrovirus ilə irsiyyət necə işləyir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

S1: Bir növdən biri endogen retrovirusa yoluxarsa, bu, tamamilə bütün uşaqlarının bu endogen retrovirusa sahib olacağı anlamına gəlirmi? Yoxsa təsadüfə əsaslanır?

2-ci sual: Virusun orada olması və olmaması üçün allel deyə bir şey varmı? Bu necə işləyir?

3-cü sual: Endogen retrovirus bir növdən necə yox ola bilər? Və nə vaxt yox ola bilməz?


Bir provirusun irsi olması üçün infeksiya cücərmə xəttində baş verməlidir. İlkin inteqrasiya genomun bir yerində baş verərdi və buna görə də lokus hemizigot kimi təsvir edilə bilər. Bir nəslin provirus ehtiva edən xromosomu və ya onun yoluxmamış homologunu miras alacağından asılı olaraq irsiyyət ehtimal olunan olardı.

Sonda, endogen retrovirus (ERV) genetik sürüşmə və təbii seçmə nəticəsində bir populyasiyada sabitləşə və ya itə bilər. Bundan əlavə, retrotranspozisiya və daha da əhəmiyyətlisi reinfeksiya nüsxə sayını əhəmiyyətli dərəcədə artıra və xüsusi lokuslarda fiksasiya olmamasına baxmayaraq ERV-nin davamlılığına imkan verə bilər. Onu da qeyd etmək lazımdır ki, insanlarda fiksasiyaya çatmamış daha yaxınlarda əldə edilmiş ERV-lər mövcuddur.


İstinadlar və Əlavə Oxu:

Boeke JD, Stoye JP. Retrotranspozonlar, Endogen Retroviruslar və Retroelementlərin Təkamülü. In: Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE, redaktorlar. Retroviruslar. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1997.

Belshaw R, Pereira V, Katzourakis A, Talbot G, Pačes J, Burt A, Tristem M. 2004. İnsan genomunun endogen retroviruslar tərəfindən uzunmüddətli yenidən infeksiyası. Proc Nat Acad Sci 101 (14): 4894-4899.


Tədqiqatçılar, qoyunların çoxalmaq üçün retroviruslara ehtiyacı olduğunu kəşf edirlər

Texas A & ampM Universiteti və Şotlandiyanın Qlazqo Universiteti Baytarlıq Məktəbindən bir qrup alim qoyunlarda hamiləlik üçün təbii olaraq meydana gələn endogen retrovirusların lazım olduğunu kəşf etdi.

Xüsusilə, Jaagsiekte qoyun retrovirusu və ya enJSRV ilə əlaqəli endogen retroviruslar olaraq bilinən bir endogen retroviruslar, hamiləliyin erkən mərhələsində plasentanın inkişaf etməyə başladığı zaman çox vacibdir.

İnsan immunçatışmazlığı virusu və ya HİV kimi retroviruslar virusların bir sinfidir. Texas Kənd Təsərrüfatı Təcrübə Stansiyası və Texas A&M Universitetinin reproduktiv bioloqu Dr. Tomas Spenser dedi ki, onlar xəstəliklərə səbəb olmaq qabiliyyəti ilə məşhurdurlar.

Sentyabrın 11-də Milli Elmlər Akademiyasının materiallarında dərc edilən tapıntılar qoyunlarda plasentanın inkişafı üçün enJSRV-lərin vacib olduğunu nümayiş etdirir.

Onun sözlərinə görə, retroviruslar öz genetik materiallarını daimi olaraq ev sahibi hüceyrələrin DNT-sinə daxil etmək qabiliyyətinə görə unikaldır. Məməlilərin təkamülü zamanı bəzi retroviruslar daha sonra uşaqlarına miras qalmış ev sahibinin cücərmə xəttini (genetik materialı olan yumurtalıq və testis hüceyrələrini) yoluxdurdu. Endogen retroviruslar olaraq bilinən bu retroviruslar, insanlar da daxil olmaqla, bütün məməlilərin genomunda mövcuddur. Spencer demişdir ki, endogen retroviruslar qədim retroviral infeksiyaların qalıqları hesab edilə bilər.

Bir çox elm adamı bu endogen retrovirusların lazımsız DNT olduğuna inanırdı.

"Həqiqətən də, bu endogen retroviruslar adətən zərərsizdir və ümumiyyətlə, onların yoluxucu retrovirusların əmələ gəlməsinə mane olan mutasiyalar ehtiva edir" dedi.

Bununla belə, bir neçə endogen retrovirus infeksiyadan qorunma təmin edir və çoxalmada iştirak edir. Məsələn, ekzogen Jaagsiekte Sheep Retrovirusu və ya JSRV qoyunlarda ağciyər şişlərinə səbəb olur və böyüklər hüceyrəsindən klonlanmış dünyanın ilk məməlisi Dollinin ölümünə səbəb olur.

Spencer, endogen retrovirusların məməlilərdə çoxalma üçün əhəmiyyətli olduğu fikrinin təxminən 30 ildir mövcud olduğunu söylədi. Kultura hüceyrələrində aparılan tədqiqatlar göstərdi ki, insan endogen retrovirusunun zülalının insan plasentasının inkişafında rolu ola bilər.

Komanda, xüsusi mesajçı RNT -nin tərcüməsini maneə törədən morfolino antisens oligonükleotidlərdən istifadə edərək enJSRV -lərin zərfinin ifadəsini blokladı. Erkən plasentada zərf zülalının istehsalı bloklandıqda, plasentanın böyüməsi azaldı və nəhəng binukleat hüceyrələr adlanan müəyyən bir hüceyrə növü inkişaf etmədi.

Nəticə embrionların implantasiya oluna bilmədiyi və qoyunların aşağı düşməsi oldu, Spenser dedi.

Doğuş bütün məməlilər, o cümlədən insanlar üçün ciddi tibbi problemdir.

"Araşdırmamız, endogen retrovirusların məməlilərdə plasentanın təkamülünü formalaşdırdığı və daha sonra hamiləlik üçün vazgeçilməz olduğu fikrini dəstəkləyir və bu səbəbdən bir çox məməlilərin plasentasında ifadə oluna bilər" dedi.

Bundan əlavə, Palmarini, "enJSRV -lər, təkamül zamanı kiçik ruminantların qədim infeksiyalarından yarandı" dedi, Glasgow Universiteti Baytarlıq Məktəbinin bir virusoloqu Dr. Massimo Palmarini. "Bu infeksiya ev sahibi üçün faydalı idi və daha sonra təkamül zamanı müsbət olaraq seçildi. Başqa sözlə, enJSRV-ləri olan heyvanlar olmayanlardan daha yaxşı təchiz olunmuşdu. Buna görə də, enJSRV-lər qoyun genomunun daimi hissəsinə çevrildi və bu günlərdə qoyunlar onlarsız etmə. "

Tədqiqat qrupu enJSRV-lərin qoyun plasentasının inkişafında necə işlədiyini dəqiq müəyyən etməyə çalışır. Onların nəticələri həm insan sağlamlığına, həm də heyvan istehsalına təsir göstərməlidir.

Komandaya Spencer və Palmarini rəhbərlik edirdi. Komanda üzvləri Texas A&M-də Kathrin Dunlap, Robert Burghardt, Kanako Hayashi və Jennifer Farmer və Qlazqo Universitetinin Baytarlıq Məktəbində Mariana Vareladır.


Mənşəyi Olmadan Giriş Virologiyası

Dərslik tərifi

Müasir dərsliklər virusları məcburi hüceyrədaxili parazitlər kimi təyin edir - onların hüceyrənin içində olmaq və daha çox virus yaratmaq və hüceyrəni öldürmək üçün normal hüceyrə funksiyalarını oğurlamaq öhdəliyi (yəni, ehtiyac) var.3 Virusun etdiklərinin dəqiq təfərrüatları azaldılması mümkün olmayan dərəcədə mürəkkəbdir. 4 Azaldılmaz mürəkkəblik bütövün bir hissəsi çıxarıldıqda effektiv fəaliyyətini dayandıran bir şeydir. Viruslar hər hissəyə ehtiyac duyduqları üçün, azaldılmayacaq dərəcədə kompleks olma tərifinə uyğundur. Azaldılmayan mürəkkəblikləri nəticəsində, virusların ev sahibi hüceyrənin təmin etdiyi əlavə baqaj olmadan yalnız ehtiyac duyduqlarını daşıdıqları üçün işıq yayıldığı deyilir. Bütün viruslar genetik materialdan (DNT və ya RNT) və zülal örtüyündən ibarətdir. Onların ölçüsü də xüsusilə aktualdır, çünki onlar əvvəlcə tütün bitkilərində xəstəliyə səbəb ola bilən yoluxucu filtrat kimi müəyyən edilmişdir. Virusların ölçüləri bir neçə nanometrdən (nm) bir neçə mikrometrə qədər dəyişir. Virusun nə qədər kiçik olduğu barədə sizə daha yaxşı fikir vermək üçün qırmızı qan hüceyrələrimiz 10.000 nm enindədir və buna bənzər sadə bir bakteriya var. E. coli 1000 nm-ə 3000 nm ölçüsündədir. Nəticədə, virusları ənənəvi mikroskopdan istifadə etməklə görmək olmur və mürəkkəb elektron mikroskoplar tələb olunur.

Ev Sahibliyi və Genetik Makiyaj

Virusların müxtəlifliyi heyrətləndiricidir. Viruslar insanlar, böcəklər, bitkilər və hətta bakteriyalar da daxil olmaqla bütün həyat formalarına yoluxur. Əvvəllər qeyd olunan virusun genetik məlumatı onun host(lar)ını hədəf alır və müasir təsnifat sxemi kimi istifadə olunur. Soyuq yaralara səbəb olan viruslara DNT virusları deyilir. Qrip bir RNT virusudur. Hətta hüceyrə daxilində RNT daşıyan və RNT -ni DNT -yə çevirən viruslar da var. HİV, RNT -ni DNT -yə necə çevirdiyinə görə retrovirus adlanan xüsusi bir virus ailəsinə aiddir.

Retroviruslar (məsələn, HİV) tez -tez ev sahibi arasında hərəkət etmək üçün hüceyrələrin xaricində mövcuddur. Digər retroviruslar, ev sahibinin DNT -sinə yerləşdirilmiş ev sahibləri arasında hərəkət edir. Bu retroviruslar ev sahibi genomu vasitəsilə ötürülür və buna görə də endogen retroviruslar (ERV) adlanır. ERV'ler, bütün məməlilər genomlarının (insanlar da daxil olmaqla) təxminən 5-10% -ni təşkil edir

Filogenetik həyat ağacı. Şəkil Maulucioni tərəfindən, Wikimedia Commons vasitəsilə.

Virusların mənşəyi

Virusların müxtəlifliyini nəzərə alaraq, onların mənşəyini izah etmək üçün təkamülçülərə ciddi şəkildə meydan oxunur. Ənənəvi həyat ağacı indi üç sahəni göstərir: eubacteria, archaea və eukarya. Dərsliklərdəki tipik təkamül ağacları həyatın üç sahəsini göstərir, lakin çox vaxt viruslara göz yumur. Viruslar tez -tez göz ardı edilir, çünki dünyəvi elm adamları virusların tərifinə görə canlı olub -olmadığını müzakirə edirlər.6 Gəlin virusları tipik təkamül ağaclarından kənarlaşdıraq. Viruslar haqqında standart mikrobiologiya dərsliyi fəsillərində bir əlavə ilə həyatın üç sahəsinin daha sadə təsvirləri var: virus adlanan üç alandan uzanan bir xətt. Dərsliklər bu təkamül ağaclarını hazırlayarkən virusun mənşəyinə dair heç bir izahat olmadığını bildirir. Virusun əsas tərifi Catch-22-dir: viruslar hüceyrələrə ehtiyac duyur, lakin viruslar hüceyrələri öldürür. Magistratura səviyyəsində molekulyar virusologiyanı oxuyanda professorumdan virusun mənşəyi haqqında soruşdum və o, “biz bilmirik” dedi.

Arshan Nasir və Gustavo Caetano-Anolles. "Virusların mənşəyi və təkamülünün filogenomik məlumatlara əsaslanan tədqiqi" Elm Tərəqqi 1, yox. 8 (Sentyabr 2015): 1–24, http://advances.sciencemag.org/content/1/8/e1500527.full.

Bu şəkildə, virusları təmsil etmək üçün bu sxemlərdə yerləşən çəhrayı sahələrə diqqət yetirin. Təkamül baxımından standart bir həyat ağacı üçün bütün canlıların tək bir nöqtə ilə işarələnmiş ortaq bir əcdadı paylaşması ehtimal edilir. Alt paneldəki (B) tək nöqtənin bir ucunda bütün çəhrayı rənglərə sahib olduğuna diqqət yetirin ki, bu da virusların ortaq atalar baxımından bütün canlılardan tamamilə ayrı olduğunu göstərir.

Bu yaxınlarda çıxan bir məqalə jurnalda bu təkamül sirrini həll etməyə çalışdı Elm.7 Bu müəlliflər müxtəlif DNT ardıcıllığını empirik olaraq təhlil etdilər (yəni, sınaqdan keçirilə bilən və təkrarlana bilən), lakin faktiki olaraq tarix elmini bildirdilər (yəni, cari sürətlərin və proseslərin keçmişə ekstrapolyasiyası).8 Heç bir faktiki təcrübə milyonlarla il davam etmədi. mənşəyimizlə bağlı onların müddəalarına uyğundur.


Nəticələr

K222 proviruslarının kəşfi

Bu araşdırmada biz bir neçə insan xromosomunda olan perisentromerik endogen retrovirusların yeni nəslinin kəşfini bildiririk. Bu yeni perisentromerik ardıcıllıqlar ilk olaraq bir xəstədən və bir B hüceyrəli lenfoma xəttindən alınan üç dəri T hüceyrəli lenfoma (CTCL) hüceyrə xəttinin öyrənilməsi yolu ilə müəyyən edilmişdir. Daha sonra sağlam insanların genomunda olduqları təsdiqləndi. Bu hüceyrə xətlərində əvvəlcə məlum sentromerik endogen retrovirus K111 yox idi, bu təəccüblü idi, çünki sentromerik K111 provirusları laboratoriyamızda sınaqdan keçirilmiş demək olar ki, bütün insan subyektlərinin DNT -də PCR ilə aşkar edilir [10]. K111 proviruslarının CER: D22Z3 elementində 5 'yanal ardıcıllığını bağlayan primerlərdən istifadə edərək 19 insan hüceyrə xəttinin DNT -yə inteqrasiyasını araşdırdıqda. gag K111-in proviral ardıcıllığını (10 Şəkil 1A primerləri P1 və P4), biz bütün hüceyrə xəttlərində K111 aşkar etdik, lakin bir B-hüceyrə xəttində (IRA) və ya üç CTCL hüceyrə xəttində (HUT78, H9 və H9/HTLVIII Şəkil 1B) heç biri ). K111 aşkarlamasının olmamasının DNT-nin pisləşməsi ilə bağlı olması ehtimalını nəzərdən keçirdik və buna görə də başqa bir geni, GAPDH-ni gücləndirərək genom bütövlüyünü yoxladıq. GAPDH aşkarlanması, bütün hüceyrə xətlərinin DNT -də görüldü ki, bu da bəzi hüceyrə xətlərində K111 -in və ya ən azı K111 -in 5 ′ ucunun əslində olmadığını göstərir (Şəkil 1B). Sonra, K111-i xüsusi olaraq hədəf alan xüsusi bir zond və bir sıra primerlərdən istifadə edərək real vaxt PCR ilə K111-i araşdırdıq. env gen, lakin o zaman məlum olan başqa heç bir HERV-K (HML-2) provirusu yoxdur (Şəkil 1A 10). (Daha sonra bu zondun K222 provirusu aşkar etdiyini gördük və aşağıya baxın). K111 env sınaqdan keçirilmiş bütün hüceyrə xətlərinin DNT -də amplifikasiya siqnalı aşkar edildi (məlumatlar göstərilməyib). Birlikdə götürsək, bu nəticələr göstərir ki, bəzi insan hüceyrə xətlərinin genomunda K111 5 ′ ucunu aşkar edə bilməsək də, yenə də K111 aşkar edirik. env. K111 -in 5 ′ ucunun aşkar edilməməsi, bəzi hüceyrə xəttlərində K111 genomunun 5 ′ hissəsinin silinməsi və/və ya P1 və/və ya P4 hədəfini təşkil edən ardıcıllığın silinməsi/mutasiyası ilə izah edilə bilər. K111-in davamlı aşkarlanması env siqnal, əks halda bu primer/zond kombinasiyası ilə aşkar edilə bilən K111 ilə yaxından əlaqəli naməlum HERV-K (HML-2) ardıcıllığının mövcudluğu ilə izah edilə bilər.

Bəzi hüceyrə xətlərinin genomunda K111 5′ sonunun olmaması. (A) K111 provirusunun genomik quruluşu. Oxlar, K111 -in 5 ′ inteqrasiyasını gücləndirən P1 və P4 primerlərinin və K111 və K222 -ni xüsusi olaraq fərqləndirən K111F, K111R və ​​K111P astar/prob kombinasiyasının mövqeyini göstərir. env digər HERV-K genindən (HML-2) env 6 bp mutasiyasına görə ardıcıllıqlar [10]. (B) İnsan hüceyrə xətlərində K111 5 ′ uclu əlavələrin aşkarlanması. H9, HUT78, H9/HTLVIII və IRA B-hüceyrələrinin DNT-si istisna olmaqla, P1 və P4 [10] primerlərindən istifadə edərək bu tədqiqatda PCR ilə sınaqdan keçirilmiş bütün insan hüceyrə xətlərində 5′ yan K111 daxiletmələri aşkar edilmişdir. xətt. Oklar fərdi K111 daxiletmə polimorfizmlərini göstərir. DNT -nin bütövlüyü GAPDH -nin amplifikasiyası ilə qiymətləndirilmişdir (aşağı gel bax). DNT nərdivanının molekulyar ölçüsü gelin solunda göstərilir. Hər bir zolağın üstündə tədqiq edilməli olan hər bir hüceyrə xəttinin adı göstərilir. H9 və H9/HTLVIII-də müşahidə olunan zəif bantlar, qeyri-spesifik PCR amplifikasiyasının nəticəsi olaraq ardıcıllıqla göstərilmişdir.

Yuxarıdakı imkanları yoxlamaq üçün genomda 5′ ucunda kəsilmiş natamam K111 və ya K111 ilə yaxından əlaqəli yeni bir provirusun olub-olmadığını yoxlamaq üçün PCR strategiyası hazırladıq. Başlanğıcda, K111 -in yanındakı 5 'ardıcıllığını bağlayan dörd irəli astar hazırladıq. Bu astarlar, K111 -ə bağlanan tərs astarla (P4) birləşir gag, eyni fərddən alınan iki CTCL hüceyrə xəttinin DNT-sində K111 5′ ucunu aşkar etmədi bütün bu primerlər normal insan DNT-sinin əksəriyyətində K111 5′ ucunu aşkarladı (məlumatlar göstərilmir). Bu nəticə yenə də bəzi insan hüceyrə xətlərində K111 və ya ən azı 5 ′ ucunun silinməsini təklif edir.

Daha sonra K111 5 ′ ucu olmayan hüceyrələrin DNT -də mövcud ola biləcək sentromerik provirusu gücləndirmək üçün bir PCR strategiyası hazırladıq. HERV-K (HML-2) genomunu əhatə edən bir neçə yeri sentromerik bölgələri bağlayan primerlərlə (P1 və P2) birləşdirən primerlərdən (irəli və tərs) istifadə etdik (Şəkil 2) [10]. K111-in 5′ ucu olmayan hüceyrələrdə bu primerlər dəstləri K222 adlandırdığımız yeni provirusun genomunu gücləndirə bildi. Normal insan DNT -sində bu primerlər K111 -i gücləndirir (Şəkil 2). K222 gücləndirmə məhsulları yalnız tamamlayıcı primerlər HERV-K (HMl-2) üzərində oturduqda görüldü. pro, pol, və env amma deyil gag gen (Şəkil 2). Tam uzunluqlu K222-nin klonlanması və ardıcıllığı K222-ni K111-dən fərqli edən iki fərqli xüsusiyyət aşkar etdi. Birincisi, K111 -dən fərqli olaraq, K222 -də 5′LTR və gag gen. İkincisi, K222 5 'cinah ardıcıllığı, CER: D22Z3 [10] olaraq bilinən K111 5' yanalma ardıcıllığına yalnız 78% bənzəyir. K222 5′ cinah bölgəsindəki ardıcıl fərqlər və K222-nin perisentromer domenində ehtimal olunan yerləşməsi (aşağıya bax) bizi bu təkrarlanan bölgələri pCER:D22Z8 təyin etməyə vadar etdi. K222 -nin 3 ′ sonunda, CER: D22Z3 elementi ilə əhatə olunmuş K111 (GAATTC) saytının hədəf sayını təkrarladıq.

İnsan genomunda K222 proviruslarının xəritələndirilməsi. (A) K222 -ni PCR ilə təcrid etmək üçün istifadə olunan astar dəstlərinin sxematik təsviri. Bir sentromerik provirus K111 -in genomik quruluşu viral genləri göstərir gag, pro, pol, env, və np9, LTR -lərlə əhatə olunmuş, sentromerik təkrarlara inteqrasiya olunmuşdur (CER: D22Z3). K111 GAATTC-nin hədəf sayt təkrarlanması göstərilir. P1 və P2 astarları CER: D22Z3 -ə bağlanır. Bu primerlər, provirus genomunu əhatə edən primerlərlə birlikdə istifadə edilmişdir. Oklar, astarların mövqeyini və istiqamətini göstərir, yuxarıdakı rəqəm K111 -ə istinad edərək bağladıqları nukleotid mövqeyini göstərir. Provirusun 5′ ucunun xəritələşdirilməsi P1 primerindən və bir sıra HERV-K (HML-2) əks primerlərdən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. Provirusun 3 ′ ucuna xəritələşdirmə tərs P2 və HERV-K (HML-2) irəli astar dəsti ilə həyata keçirildi. (B, C) K222 provirusunun təcrid edilməsi. K222 ardıcıllığı, K111 5 ′ ucu olmayan H9 və HUT78 hüceyrə xətlərinin DNT -dən PCR ilə aşkar edildi. Tərkibində K111 olan normal insan DNT-si PCR reaksiyası üçün nəzarət kimi istifadə edilmişdir. Hər zolaq üçün göstərilən nömrə astarları təmsil edir. Jeller 5 'Xəritəçəkmənin gücləndirmə məhsullarını göstərir (B) və ya 3 'Xəritəçəkmə (C) H9, HUT78 və normal insan DNT -də fərqli primer birləşmələri istifadə edən sentromerik proviruslar. Solda molekulyar ölçülü nərdivan göstərilir. P1-982R, P1-2499R astar dəstlərini istifadə edərkən normal insan DNT-dən fərqli olaraq H9 və HUT78 hüceyrə xətlərində heç bir gücləndirici məhsul aşkar edilməmişdir. (B)və ya astar dəstləri P2-1965F və P2-2641F (C). Ulduz işarəsi, qeyri-spesifik amplifikasiyanın nəticəsi olaraq ardıcıllıqla göstərilmiş bir zolağı göstərir. H9 və HUT78 hüceyrələrinin DNT-sindən əldə edilən xəritələşdirmə məhsullarının ardıcıllığı K222 ardıcıllığını ortaya qoyur.

K222 -nin ehtimal olunan tam genomunu təyin etdikdən sonra insan genomu məlumat bazalarında oxşar ardıcıllıqlar axtardıq. Ən son insan genomu toplusu GRCh38/hg38 -də və ya İnsan Arxivi Arxiv kitabxanalarında K222 -yə bənzər ardıcıllıqlara rast gəlmədik. Bununla birlikdə, Whole-Genome Shotgun (WGS) Contigs kitabxanasında (Acc. No. AADC01167561.1) bir K222 provirusu tapdıq. Bu ardıcıllıq, ehtimal ki, sağlam bir insanın genomik DNT-sindəndir və bu, K222-nin yalnız bəzi hüceyrə xətlərinin DNT-sində deyil, həm də müasir sağlam insanların genomik DNT-sində olduğunu göstərir. Bu K222 ardıcıllığı həm də 5′LTR və gag gen, silinmə, PCR və ardıcıllıq araşdırmalarımızın ortaya qoyduğu eyni mövqedə baş verər. Maraqlıdır ki, bu K222 ardıcıllığı hər iki tərəfdən pCER: D22Z8 elementləri ilə əhatə olunmuşdur və insan hüceyrə xəttindən K222 -nin 3 ′ inteqrasiya yerində müəyyən etdiyimiz K111 hədəf saytının təkrarlanması GAATTC yoxdur. Bu, insan hüceyrə xəttindən gücləndirdiyimiz tam K222 ardıcıllığının rekombinant K222/K111 ardıcıllığı olduğunu göstərə bilər. Gücləndirdiyimiz rekombinant K222/K111 ardıcıllığı NCBI verilənlər bazasında saxlanılır (Acc. No. KF651980).

K222-nin 5′ və 3′ inteqrasiya sahələrində onu K111-dən fərqli edən fərqli xüsusiyyətlər tapdığımız üçün biz WGS kitabxanalarında digər mümkün K222 ardıcıllıqlarını axtardıq. Daha beş K222 ardıcıllığı (Acc. Nos. ABSL01025452.1, ABBA01170497.1, AADB02159125.1, ABSL01190241.1 və ABBA01169090) tapdıq. LTR -də silinmələri var və gag gen və buna görə də bir pCER göstərin: D22Z8-pro qovşağı. Biz, həmçinin, 3′ LTR inteqrasiya yerində K111 olmayan, lakin K222-yə oxşar ardıcıllığa malik olan daha üç K222 ardıcıllığını (Acc. No. AADB02144450.1.1, ABSL01242357.1 və ABBS01119704.1) müəyyən etdik. Bu ardıcıllıqlar, ehtimal ki, sağlam fərdlərin DNT nümunələrində aşkar edildi və bu, yenidən K222-nin insan populyasiyasında baş verdiyini göstərir.

K111 -in 5 ′ sonu silinməsini və PCR tərəfindən müşahidə edilən K222 -nin mövcudluğunu təsdiq etmək üçün, PCR tərəfindən K222 ehtiva edən K111 provirusu olmayan bir hüceyrə xəttinin DNT nümunələrində yuva və cənub ləkəsi apardıq və başqa bir hüceyrə xətti hər iki provirus olmalıdır. Biz Materiallar və metodlarda təsvir olunduğu kimi K111 və K222 aşkarlanması üçün xüsusi biotinləşdirilmiş zondlar yaratdıq. K111-ə xas zond, K111 provirusunun 5′ yan ardıcıllığını və 5′ LTR-nin dərhal 116 bp-ni əhatə edən 422 bp məhsuldur. K222 spesifik zondu, K222 provirusunun 5 'yandan uzanan ardıcıllığını və onun dərhal 396-nı əhatə edən 464 at gücündə bir məhsuldur. pro gen (Şəkil 3A). Yuva nöqtəsində, K111 zondunun IRA hüceyrələrindən, siçan DNT -dən və ya K222 ardıcıllığını ehtiva edən bir plazmiddən DNT -ni tanımadığını müşahidə etdik (Şəkil 3B). Bununla belə, K111 zondu BJAB hüceyrələrindən DNT-ni tanıdı. Bu müşahidələr PCR ilə əvvəlki nəticələrimizi təsdiqləyir (Şəkil 1A). K222 zondu, həm insan B hüceyrə xəttlərindən, həm də tam K222 ardıcıllığı olan bir plazmiddən DNT tanıdı, lakin K111 və ya siçan DNT ilə plazmid deyil. Bu müşahidələr K222 zondunun spesifikliyini nümayiş etdirir və insan DNT-sində K222-nin mövcudluğunu təsdiqləyir. Southern blot analizlərindən istifadə edərək, K111 5′ ucu olan və ya olmayan insan B-hüceyrə xətlərinin DNT-sində K222-nin aşkarlanmasını daha da yoxladıq (məlumatlar göstərilmir). K222 zondu, K222 ehtiva edən, lakin K111 olmayan bir plazmiddən DNT -ni tanıdı və müşahidələrimizi daha da təsdiqlədi. Bu nəticələr K222-nin həqiqətən K111-dən fərqli olduğunu və insan əhalisinin çoxunda mövcud ola biləcəyini göstərir.

Slot blot analizi ilə insan hüceyrə xətlərinin genomunda K222 provirusunun aşkarlanması. PCR ilə K111 -in 5 ′ ucuna sahib olduğu və ya olmaması və ehtimal ki, kəsilmiş K222 provirusu ehtiva edən insan hüceyrə xətlərinin DNT -si, yuva ləkəsi analizləri ilə K111 və K222 üçün tarandı. (A) K111 və K222 spesifik biotinlənmiş probların istehsalı. Zondlar biotin etiketli dCTP-nin PCR daxil edilməsi ilə yaradılmışdır. K111 probu 422 bp uzunluğundadır və CER: D22Z3 yanal ardıcıllığını və K111 LTR -nin başlanğıcını əhatə edir. K222 probu 464 bp uzunluğundadır və pCER: D22Z8 yanal ardıcıllığını və pro K222 geni. (B) PCR tərəfindən müşahidə edildiyi kimi BJAB (K111-in 5 ′ ucu var) və IRA (5 ′ ucu yoxdur) B-hüceyrə xətlərindən alınan DNT, yuva ləkələnməsi ilə K111 və K222 virusu üçün tarandı. DNT, PVDF membranları ilə çarpaz əlaqələndirilmiş və biotinlənmiş problar istifadə edərək K111 və K222 üçün taranmışdır. Zondlar HRP-konjuge streptavidin ilə kimyiluminesans üsulu ilə aşkar edilmişdir. Genomik K111 -in 5 ′ ucunu hədəf alan K111 zondu, IRA hüceyrələrində virus genomunun 5 ′ ucunun olmadığını təsdiqləyərək, IRA hüceyrələri deyil, BJAB hüceyrələrinin DNT ilə reaksiya verdi. K222 zondu, həm BJAB, həm də IRA hüceyrələrinin DNT -si ilə reaksiya verərək, hər iki hüceyrə xəttinin 5 ′ ucunda kəsilmiş K222 virusuna sahib olduğunu təsdiqlədi. Siçan DNT-si mənfi nəzarət kimi xidmət etdi və K111 və ya K222 genomlarını ehtiva edən plazmidlər müsbət nəzarət kimi istifadə edildi. K111 zondu K222 plazmidinə reaksiya vermədi və əksinə.

Tam uzunluqlu K111 və K222 və insan hüceyrə xəttində aşkarlanan rekombinant K222/K111-in hizalanmasını yaratdıq. K111 və K222 arasındakı nukleotid fərqləri Vurgulayıcı sahələri istifadə etməklə görülə bilər (Şəkil 4A). Diqqətə çatdırılır ki, 5′ LTR-nin silinməsindən başqa və gag K222 genində, CER: D22Z3 və pCER: D22Z8 ilə əhatə olunmuş K222 ilə əhatə olunan K111 proviruslarının hər iki ucunu əhatə edən nukleotid sıralarında fərqlər var. Şəkildə aydın görünmür ki, K111-in 5′ və 3′ ucunda tapılan hədəf saytın təkrarlanması GAATTC, həmçinin 3′LTR (ACCCTTCA) son 9 bp-i K222-də mövcud deyil. K222 -də cinah ardıcıllığı və vaxtından əvvəl silinmə fərqi hər iki provirusun iki müstəqil infeksiyadan qaynaqlandığını göstərir. Daha əvvəl qeyd etdiyimiz kimi, H9 hüceyrə xəttinin genomunda olan K222 ardıcıllığı onun K222/K111 rekombinant ardıcıllığı olduğunu göstərən xüsusiyyətlərə malikdir. Bu K222/K111 ardıcıllığı 5 ′ LTR və gag gen K222 -yə bənzəyir və 5 'ucunda pCER: D22Z8 təkrarlanması ilə əhatə olunur. Bununla birlikdə, 3 'ucunda bu ardıcıllıq K111 hədəf saytının təkrarlanması GAATTC -yə malikdir və K111 provirusuna bənzər bir CER: D22Z3 təkrarlanması ilə əhatə olunmuşdur (Şəkil 4A). Bu K222/K111 ardıcıllığının rekombinasiya nəticəsində yaranıb -yaranmadığını həll etmək üçün bir rekombinasiya testi (RIP 3.0) etdik. Rekombinasiya təhlili göstərir ki, bu ardıcıllıq əksər hallarda K222 valideyn provirusundan qaynaqlanır. 3 'LTR və inteqrasiya saytının yanındakı yanal ardıcıllıq K111 provirusuna bənzəyir, bu da bu ardıcıllığın rekombinant K222/K111 provirus olduğunu göstərir (Şəkil 4B). Bu rekombinasiya analizinə əlavə olaraq, insan məlumat bazalarında və laboratoriyamızda tapılan K111, K222 və rekombinant K222/K111 proviruslarının bir neçə 3'LTRs və yanal ardıcıllığının filogenetik analizini apardıq [10]. Filogenetik ağac, K111 və K222 ardıcıllığı arasındakı orta nöqtədə CTCL hüceyrə xətləri H9 və HUT78 klasterində tapılan K222 LTR və 5 'yandan uzanan ardıcıllığı göstərir və bu ardıcıllığın rekombinant olduğunu göstərir (Şəkil 4C).

Tam uzunluqlu K111, K222 və K222/K111 rekombinant proviruslarının genomik quruluşu və nukleotid fərqləri. (A) Bir WGS verilənlər bazasında (Acc. No. AADC01167561.1) və K222/K111 rekombinant provirus ilə işarələnmiş H9 hüceyrə xəttinin genomundan təcrid olunmuş K222 provirusu ilə birlikdə K111 arasındakı nukleotid fərqlərini göstərən işıqlandırıcı süjet (yaşıl gənələr: A qırmızı gənələr: T portağal gənələri: G açıq mavi gənələr: C). Boz qutular K222 -də silinmiş sahələri bildirir. (B) K222/K111 provirusunun rekombinasiya planı. K222/K111 rekombinant ardıcıllığı ilə hər bir valideyn K222 və K111 provirusu arasındakı oxşarlıq təxminən 10 Kb bp sürüşmə pəncərəsinin hər mövqeyi üçün tərtib edilmişdir. Y oxu, hər bir valideyn ardıcıllığına (qırmızı və mavi xətlər) sorğu sırasının uyğunluq hissəsini təmsil edir. 1 uyğunluq hissəsi 100% eynilik deməkdir. Rekombinant sorğu ardıcıllığı X oxunda (yuxarıdakı yuxarı qırmızı/mavi xətt) göstərilmişdir. Oklar rekombinasiya nöqtələrini göstərir. (C) Filogenetik dendroqramda əvvəllər bildirilmiş 3′ LTR K111 (bəzən K105 adlanır) ardıcıllığı (10 qara), insan məlumat bazalarında tapılan 3′ LTR K222 ardıcıllığı (mavi) və H9 və K222 ardıcıllığının 3′ LTR üç əsas təbəqəsi göstərilir. HUT78 hüceyrə xətləri (sarı). Bizim tərəfimizdən K105J və K105K olaraq təyin edilmiş əvvəlki ardıcıllıqlar həqiqətən K222 ardıcıllığı idi və pCER:D22Z8 təkrarı ilə əhatə olunmuşdu. (D) K222 və K111 provirusları müstəqil infeksiyalar nəticəsində yaranıb. Bayesian bir nəticə ağacı, müxtəlif HERV-K (HML-2) proviruslarından 5 ′ və 3 ′ LTR-lərin qruplaşmasını göstərir. K111 5 ′ LTR (qırmızı) və 3 ′ LTR K111 (mavi) və K222 (boz) provirusları ortaq bir əcdadı olan üç müstəqil qrupa yığılır. Arxa ehtimal dəyərləri & gt 70 göstərilir.

K111s (bəzən K105 adlanır) və K222s də daxil olmaqla bir neçə HERV-K (HML-2) LTR-nin filogenetik rekonstruksiyası, K222 3 'LTR-lərinin ata-baba K111 LTR örtüyündə toplandığını göstərdi (Şəkil 4D). Provirus inteqrasiyası zamanı həm 5′, həm də 3′ LTR ardıcıllığı oxşardır, lakin zaman keçdikcə mutasiyalar toplanır. Fərdi HERV-K (HML-2) proviruslarının LTR-ləri buna görə də müəyyən bir qrupa yığılır (məsələn, K101, K102 və sair provirusların LTR-ləri birlikdə). Eyni şəkildə, 5 'və 3' LTR tam uzunluqlu provirusların yenidən birləşməsi nəticəsində yaranan Solo LTR-lər, daxili genləri silməklə yanaşı, orijinal 5 'və 3' LTR-lərə də yığılır (məsələn, K109 və K111 Solo LTR-lər) ). Bu ağacda (Şəkil 4D), müstəqil infeksiyaları göstərən bir neçə fərqli HERV-K (HML-2) proviral LTR ilə təmsil olunan (qara rəngdə göstərilmiş) bir təbəqəni müşahidə edirik. Digər tərəfdən, K111 LTR və K222 LTR -lərin ortaq bir ata ardıcıllığına sahib olduğunu müşahidə edirik. Daha sonra müşahidə edirik ki, bu təkamül xətti üç yaxşı işarələnmiş təbəqəyə bölünür: K111 5′ LTR (qırmızı), K111 3′ LTR (mavi) ilə uyğun gələn təbəqə və K222 3′ LTR-dən əldə edilən digəri ( Boz). Qeyd edək ki, əvvəlki nəşrimizdə [10] gücləndirdiyimiz və K105K və K105J 3′ LTR ilə etiketlədiyimiz bəzi ardıcıllıqlar əslində K222 ardıcıllıqları idi və 3′ LTR-in son 9 bp-si, K111-in GAATTC hədəf saytının təkrarlanması yoxdur. və ya yan CER: D22Z3 elementi. Bunun əvəzinə pCER: D22Z8 elementi ilə əhatə olunur. Bütün bu K222 3 'LTR sekansları, K111 3' LTR sekanslarından müstəqil bir dalda bir araya gələrək yenidən iki müstəqil infeksiyaya işarə edir. H9 və HUT78 xətlərindən gücləndirilmiş K222 3′ LTR ardıcıllıqları, eləcə də K111 solo LTR ardıcıllıqları da K222 3′ LTR ardıcıllıqlarına yaxın, lakin müstəqil təbəqələrdə çoxluq təşkil edir (Şəkil 4D). Bu sübutlar göstərir ki, K111 və K222 cücərmə xəttində iki fərqli inteqrasiyanı təmsil etsə də, insan təkamülü zamanı bir anda K111 ilə K222 arasında filogenetik ağacda ortaq bir ata -baba ardıcıllığı meydana gətirəcək rekombinasiya/gen çevrilmə hadisələri meydana gəlmişdir.

İnteqrasiya ardıcıllığının təhlili, K111 və K222 -nin iki fərqli sentromerik təkrar daxil edildiyini kəşf etməyimizə səbəb oldu. Həm K111 cinah ardıcıllığı, CER: D22Z3, həm də pCER: D22Z8 adlandırdığımız K222 yanalma ardıcıllığı, hər ikisi də 384 bp -dən ibarət CER təkrarlarının növüdür. Bu təkrarların təşkili səkkiz dəfə təkrarlanan 48 bp seqmentindən ibarətdir. CER: D22Z3 və pCER: D22Z8 -in nukleotid oxşarlığı təxminən 71,8% -dir (Şəkil 5). Beləliklə, bu ardıcıllıqlar arasındakı oxşarlıq K111 inteqrasiyasını gücləndirmək üçün adətən istifadə etdiyimiz P1 və P2 bir sıra primerlərdən istifadə edərək K222 inteqrasiyasını gücləndirməyə imkan verə bilərdi.

CER:D22Z3 və pCER:D22Z8-in ardıcıl düzülüşü təkrarlanır. K222-ni əhatə edən ardıcıllıqlar təhlil edilmişdir. PCER: D22Z8 adlandırdığımız yeni ardıcıllıq, CER: D22Z3 ilə 71.8% oxşarlıq göstərir. PCER -in təkrarlanması: D22Z8, perisentromerdəki ehtimal olunan mövqeyinə görə pCER adlandırdığımız centromeric təkrar (CER) -dir (mətnə ​​baxın). PCER: D22Z8, hər biri 48 bp olan səkkiz təkrardan ibarətdir. K222 -nin xromosom mövqeyinə görə, pCER: D22Z8 22 -ci xromosomda və səkkiz əlavə xromosomda yerləşir.

K112 5 ′ inteqrasiyası olmayan insan hüceyrə xətlərinin DNT -sini istifadə edərək K222 -nin meydana gəldiyinə dair sübutlar tapdıq və insan WGS ardıcıllığı məlumat bazalarında və cənub ləkələnməsi ilə K222 -nin varlığını təsdiq etdik. Bəzi insan hüceyrə xətlərində K111 5 ′ ucunun olmamasının sağlam insan populyasiyasında da görüləcəyini müəyyən etmək üçün P1 və P4 primerlərindən istifadə edərək K111 aşkar etməyə çalışdıq (Şəkil 6A). Biz 96 insan fərdinin DNT-sini PCR ilə sınaqdan keçirdik və K111 5′ inteqrasiyasının 96 fərddən 11-də aşkar edilmədiyini aşkar etdik (Şəkil 6B). Bu, K111 5′ saytının silinməsinin insanlarda 11,4% tezliyində aşkar edildiyini göstərir (ən azı Birləşmiş Krallıqda tədqiq edilmiş əhali arasında) və yalnız hüceyrə xəttlərində tapılan bir genotip deyil. K111 5 ′ ucu olmayan bəzi şəxslərdə, bəzən doğru ölçüdə zəif bir amplifikasiya məhsulu müşahidə edirik. Bu fərdlərin genomunda K111 5 ′ ucunun bir neçə nüsxəsi olması ehtimalı mövcuddur, lakin bu məhsulun konsentrasiyası klonlaşdırma və/və ya ardıcıllığın təsdiqlənməsi üçün çox aşağı idi. Biz daha sonra K111 5′ silmə genotipini boyunca bağlanan primerlərlə təhlil etdik gag K101 genomuna istinadən 982, 1968 və 2499 mövqelərindəki gen (Hesab No. AF164609.1) və 3460 mövqeyinə bağlanan bir astar pro həm K111, həm də K222 -də olan gen (Şəkil 6A). Müsbət test edən beş şəxsin və K111 5′ sonu üçün mənfi test edən daha beş şəxsin DNT-də K111 5′ inteqrasiyasının xəritəsini çəkdik. Bu K111 5 ′ xəritəsində, K111 5 ′ ucu üçün pozitiv test edən beş xəstədə K111 5 ′ ucu olduğunu təsdiqləyərək K111 amplifikasiya məhsullarını aşkar edə bildik (Şəkil 6C). Bunun əksinə olaraq, insan əhalisinin bu hissəsində K111 5 ′ saytının olmadığını təsdiq edən mənfi K111 5 ′ uclu (Şəkil 6C) olan beş fərddə K111 gücləndirə bilmədik. Astar P1 və astar 3460R ilə bağlanır pro gen, K111 5 ′ inteqrasiyası üçün müsbət olan insanlarda K111 və K222 təsbit etdik. Bu primer dəsti ilə, K111 -in 5 ′ inteqrasiyası üçün mənfi olan şəxslərin DNT -də K222 aşkar etdik. Ardıcıllıq təhlili, K111 -dən fərqli olaraq, gücləndirilmiş K222 ardıcıllığının 5 ′ LTR və gag gen.

İnsan əhalisində K111 və K222 -nin aşkarlanması. (A) K111 və K222 viruslarının genomik təşkili. K111 və K222 xəritələrində astarların yeri göstərilir. (B) İnsan populyasiyasında K111 5 ′ sonunun aşkarlanması. K111-in 5′ ucu P1 və P4 primerlərindən istifadə etməklə aşkar edilmişdir. Qara ox A K111 5′ ucunu göstərir. Boz ox qeyri-spesifik PCR məhsullarını göstərir. Hər bir zolağın üstündə tədqiq olunan hər bir fərdi ifadə edən bir nömrə var. (C, D) K111-in xəritələşdirilməsi (C) və K222 (D) K111 5′ sonu üçün müvafiq olaraq müsbət və ya mənfi olan beş fərddə. K111 xəritəsi (C) primer P1 və K111 provirusunun 982, 2499 və 3460 bp mövqelərində bağlanan tərs astarlarla aparılmışdır. Qara oxlar xüsusi K111 daxiletmələrini A (məhsul P1-982R), C (məhsul P1-2499R) və D (məhsul P1-3460R) göstərir. Boz ox qeyri-spesifik PCR gücləndirmələrini göstərir. 5 ′ K111 ucu üçün müsbət olan 1, 2, 3, 5 və 6 rəqəmləri ilə etiketlənmiş şəxslərdə K111 aşkarlanması müşahidə edildi. B-də göstərildiyi kimi 5 'K111 ucu üçün mənfi olan 4, 68, 86, 90 və 95 rəqəmləri ilə etiketlənmiş şəxslərdə qeyri-spesifik PCR məhsulu aşkar edilmişdir. və ya 5 ′ K111 inteqrasiyası üçün müsbətdir (ulduzlara baxın). K222 Xəritəçəkmə K222F astar və K111 -ə istinadla 982, 1968, 2499 və 3460 bp mövqelərində bağlanan tərs astarlarla həyata keçirildi. K111 müsbət şəxslərin DNT-sində görülən A, B və C (qara oxlar) PCR məhsullarının K111-in gücləndirilməsi olduğu göstərildi. K111-in 5′ ucu olmayan şəxslərdə gücləndirmə məhsulları görülmədi. D K222-nin gücləndirmə məhsulunu təmsil edir.

Nəhayət, K222-nin olması üçün K111-in 5′ inteqrasiyasına malik və ya olmayan şəxslərin DNT-sini qiymətləndirdik. Biz K222-ni pCER:D22Z8 elementinə bağlayan K222F primerindən və ya hədəfi hədəfləyən tərs primerlərdən istifadə edərək xəritələşdirdik. gag gen (K222 -də yoxdur) və ya pro gen (K222 -də mövcuddur). 5′ K111 ucu olan fərdlər dəstində bu primerlər dəstləri K111-i gücləndirdi (Şəkil 6D). K222F primeri, ehtimal ki, K111-in gücləndirilməsini yaradan pCER:D22Z8-ə 71,8% oxşar olan K111 yan CER:D22Z3 elementində oturur. Lakin bu primerlər dəstləri mənfi K111 genotipi olan şəxslərin DNT-sində provirusu gücləndirməmişdir. K222F astarları ilə bağlayan tərs astar birləşməsi pro gen (3460R) həm K111 olanlarda, həm də olmayanlarda K222 -ni gücləndirdi. K222F astarı K111 -in CER: D22Z3 yanal ardıcıllığına bağlana bilsə də, K111 5 ′ ucu üçün müsbət olan şəxslər qrupunda bu primerlər K221 -in deyil, K111 -in gücləndirilməsinə üstünlük verir, çünki K222 -nin hədəflənməsi ən kiçik amplifikasiyanı istehsal edəcək. məhsul (Şəkil 6D). Beləliklə, bu məlumatlar K222-nin indiyə qədər yoxlanılan bütün insanlarda mövcud olduğunu göstərir.

K111 5 ′ inteqrasiyası olmayan şəxslərdə həm K222, həm də rekombinant K222/K111 aşkarlanması

İndiyə qədər əldə edilən dəlillər K222 ardıcıllığının bütün insanlarda olduğunu göstərirdi. Bəzi insan hüceyrə xəttlərində aşkar etdiyimiz K222 ardıcıllığı K222 və K111 rekombinasiya xüsusiyyətlərinə malikdir. HUT78 hüceyrə xəttində və sağlam insanlardan alınan DNT nümunələrində tam bir K222 ardıcıllığının (rekombinant olmayan) aşkarlanmasının və K222/K111 rekombinant ardıcıllığının yalnız hüceyrə xətlərində deyil, insan populyasiyasında aşkarlanıb-aşkarlanmadığını qiymətləndirdik. . Bunu həyata keçirmək üçün əvvəlcə K111 5 ′ ucu olan və ya itmiş DNT nümunələrində K111 -in 3 ′ inteqrasiya sahəsinə bağlanan primerlərdən istifadə edərək mümkün K222/K111 rekombinant ardıcıllığını qiymətləndirdik. Bu test üçün primerlər hədəfə alındı env gen (7972F) və CER: 3 'saytının (P2) yanındakı D22Z3 (Şəkil 2A). K111 5 ′ ucu olmayan nümunələrdə bu primerlərlə K222/K111 rekombinant ardıcıllığını aşkar edə bildik (Şəkil 7A). Əvvəlki tapıntıları təsdiqləyərək, HUT78 hüceyrə xəttində bir K222/K111 rekombinant məhsulu da aşkar edildi. Bu məhsulların təhlili göstərir ki, bu K222/K111 rekombinant ardıcıllığı K111 3 ′ LTR, K111 hədəf saytının təkrarlanması GAATTC və CER: D22Z3 yanalma ardıcıllığına malikdir. Daha sonra biz K222 3′LTR-pCER:D22Z8 qovşağına (K111 vəziyyətində 3′ LTR ucu ACCCCTTCA və K111 hədəfi tərəfindən pozulacaq sahə) xüsusi olaraq bağlanan primer dizayn edərək K222 3′ ucunu aşkarlamağa cəhd etdik. saytın təkrarlanması GAATTC). K111 5 ′ inteqrasiyası üçün müsbət və ya mənfi olan şəxslərdə, həmçinin HUT78 hüceyrə xəttinin DNT -də K222 ardıcıllığını aşkar edə bildik (Şəkil 7B).

K111 5′ ucu olmayan şəxslərdə K222 və rekombinant K222/K111 ardıcıllığının aşkarlanması. (A) K222/K111 rekombinant ardıcıllığının gücləndirilməsi. K222/K111 sekansları, K111 5′ ucu (68, 90 və 95) olmayan şəxslərdən DNT-də K111 3′ yan ardıcıllığına (Şəkil 2-ə bax) bağlanan primer 7972F və primer P2 ilə gücləndirilmişdir. HUT78 hüceyrə xətti, bu da K111 inteqrasiyasından məhrumdur. Müsbət nəzarət kimi biz K111 5′ sonu üçün müsbət olan 96-cı fərdin DNT-sindən istifadə etdik. (B) K222 3 ′ inteqrasiyasının gücləndirilməsi. K222, 7972F və K222LTR-pCER: D22Z8R, K222-də mövcud olan LTR-pCER: D22Z8 birləşmə ardıcıllığına bağlanan sonuncu primer ilə gücləndirilmişdir, lakin K111-də yoxdur.K111 3 ′ inteqrasiyası bunun əvəzinə LTR -dən 5 bp ardıcıllığa malikdir və K222 -də olmayan hədəf saytın təkrarlanması GAATTC -yə malikdir. K222 3′ inteqrasiyasının gücləndirilməsi K111 5′ ucu olan (96) və ya olmayan (68, 90 və HUT78) şəxslərdə görüldü. (C) İnsanlarda K222 və K222/K111 rekombinant sekanslarının təkamülü. K111 5′ ucu olmayan şəxslərdə PCR ilə əldə edilən K222 və K222/K111 LTR ardıcıllıqlarının Bayesian nəticə ağacı. Gücləndirilmiş K222 ardıcıllığı K222 etiketi ilə göstərilmişdir. Ağac, K222 provirusuna (mavi) bənzər iki fərqli K222 LTR təbəqəli K222 ardıcıllığını və K111 provirusuna (qırmızı) klaster olan ardıcıllığı göstərir. K111 -in K111 5 ′ ucu qruplaşması olmayan fərdlərdə K222 ardıcıllığı, bu fərdlərin ata -baba nəslində K111 -in ehtimal olunan mövcudluğunu göstərir. K222/K111 rekombinant təbəqəsi (qırmızı) həmçinin K222 və K111-in K111-in nəsildən itirilməsindən əvvəl insan təkamülü zamanı rekombinasiya/gen çevrilməsi ilə rekombinasiya olunduğunu göstərir. Ən yaxşı ağac üçün posterior ehtimal dəyərləri >85 göstərilir.

Bəzi insanlarda K111 -in 5 ′ ucunu aşkar etməsək də, bu fərdlərin rekombinant K222/K111 ardıcıllığı varsa, K111 -in silinməzdən əvvəl atalar genomunda olub -olmadığını soruşduq. Bu problemi həll etmək üçün K222 və rekombinant K222/K111 ardıcıllığının iki fərqli təbəqəyə bölünüb-parçalanmadığını müəyyən etmək üçün Bayes filogenetik ağacı yaratdıq. K111 5′ ucu üçün mənfi genotipi olan şəxslərdə gücləndirilmiş K222 ardıcıllığı (bu ardıcıllıqlar K222 ilə etiketlənir) K222 ardıcıllığı ilə təmsil olunan təbəqədə toplanmışdır (Şəkil 7C-də mavi rənglə göstərilmişdir). Belə şəxslərdə rekombinant K222/K111 LTR ardıcıllığı ya K111 örtüyünə (qırmızı) və ya K222 örtüyünə (mavi) yığılır (Şəkil 7C). Bu, K111 ardıcıllığının K111 5 ′ ucunu itirmiş fərdlərin genomunda mövcud olduğunu göstərir. K111 və K222 təbəqələrinin ayrılması K222-nin inteqrasiyasını və K222 və K111-in rekombinasiyası insanların təkamülü üzərində iki ayrı hadisədə baş verdiyini göstərir. Çox güman ki, K222 -nin 5 ′ ucunda silinməsi K111 -in bu sahəsini silmək üçün şablon rolunu oynadı və K111 5 ′ uç silinməsinə səbəb oldu. K111-in bir çox nüsxəsi müasir insanların əksəriyyətində mövcud olduğundan, rekombinasiya ilə vasitəçilik edilən bu silinmə hadisəsi, ehtimal ki, K111-in genişlənməsindən əvvəl insan təkamülünün əvvəlində baş vermişdi.

Primatların təkamülündə K222-nin inteqrasiya vaxtı

K111 və K222 arasındakı ardıcıl oxşarlıqlara baxmayaraq, proviral inteqrasiya ardıcıllığındakı fərqlər, K222 genomunda vaxtından əvvəl silinmələr və filogenetik analiz (yuxarıya bax) onların fərqli proviruslar olduğunu göstərir. Bu virusların müstəqil infeksiyalardan və ya ortaq bir ata infeksiyasından qaynaqlandığını aydınlaşdırmaq üçün K222 -nin cücərmə xəttinə inteqrasiya müddətini hesablamağa və bunu K111 -in inteqrasiya vaxtı ilə müqayisə etməyə çalışdıq. 5′ və 3′ LTR-ləri fərqləndirən mutasiyalar arasında müqayisə provirusun inteqrasiya vaxtını hesablamaq üçün istifadə edilmişdir. 5 'və 3' LTR -lərin ardıcıllığı inteqrasiya zamanı eyni sayılır, lakin zamanla mutasiyalar yığır. Beləliklə, 5 ′ və 3 ′ LTR -lərin ardıcıllıq fərqlərini müqayisə edərək virus inteqrasiyasının yaşını təxmin edə bilərik [11]. K111 -in LTR -lərini müqayisə edərək K111 -in cücərmə xəttinə 2.6 ilə 6.3 milyon il əvvəl daxil olduğunu hesabladıq [10]. Bununla birlikdə, K222 -nin 5 ′ LTR -si yoxdur və buna görə də K222 LTR -lər üçün molekulyar saat analizi etibarsızdır. Buna görə də, K222 üçün spesifik primerlər (K222F və K222bR primerləri Şəkil 8A) istifadə edərək həm Yeni, həm də Köhnə Dünya meymunlarının və primatlarının DNT -də K222 inteqrasiyasını axtardıq və K222 -nin primat təkamül xəttində inteqrasiya müddətini təxmin etdik. Babun (Köhnə Dünya meymunu), orangutan, qorilla, şimpanze və insan genomunda K222 aşkar etdik (Şəkil 8B). Qeyd edək ki, K222 bütün 112 insan DNT nümunəsinin genomunda aşkar edilmişdir (məlumatlar göstərilmir). Bu primer dəsti makakalarda və Afrika yaşıl meymunlarında (Köhnə Dünya meymunları), Yeni Dünya meymunlarında və ya primat olmayan növlərdə K222 aşkar etməmişdir (Şəkil 8B). Mövcud olduğu halda K222-ni gücləndirə bilən və yenə də makakalarda, Afrika yaşıl meymunlarında və Yeni Dünya meymunlarında K222-ni aşkar edə bilməyən digər primerlər dəstləri hazırladıq və yuxarıda təsvir edilən əvvəlki təcrübəni təsdiqlədik. Bu məlumatlar ümumiyyətlə K222-nin Yeni və Köhnə Dünya meymunlarının ayrılmasından sonra birləşdiyini göstərirdi, bu hadisənin təxminən 25 milyon il əvvəl baş verdiyi hesablanır (Şəkil 8B [29]). K222 makakalarda və Afrika yaşıl meymunlarında, həm də Köhnə Dünya meymunlarında aşkar edilməsə də, təxminən 6-10 milyon il əvvəl makakalardan və Afrika yaşıl meymunlarından ayrılan başqa bir Köhnə Dünya meymunu olan babunda tapıldı (Şəkil 8B [30]) . Bu məlumatlar K222 -nin bəzi Köhnə Dünya meymunlarının genomunda silindiyini və ya mutasiya edildiyini göstərir. Əlbəttə ki, K222 -nin ortaq ata -baba olan Köhnə Dünya meymun populyasiyasında sabitləşmədiyini və sonra yalnız babunlara yerləşdirildiyini, lakin makakanın və Afrika yaşıl meymun nəslinin deyil [31] olduğunu da irəli sürə bilərik. Bunun əksinə olaraq, K111 yalnız şimpanze və insan DNT-sində aşkar edilir [10], bu, K111-in yalnız insanlar və şimpanzelərin ayrılmasından əvvəl cücərmə xəttinə daxil olduğunu göstərir, təxminən 6 milyon il əvvəl baş verdiyi hesablanmış bir hadisə, K111-in molekulyar saat analizini təsdiqləyir. LTR [10]. Buna görə də, bu nəticələr K222-nin primat xəttinə təxminən 25 milyon il əvvəl və K111-in təxminən 6 milyon il əvvəl daxil olduğunu göstərir ki, bu provirusların müstəqil infeksiyalardan yarandığını göstərir.

K222, Yeni və Köhnə Dünya meymunlarının ayrılmasından sonra primat cücərmə xəttinə inteqrasiya etdi və insanların təkamülü zamanı nüsxə sayını artırdı. (A) Centromeric K111 və K222 viruslarının genomik təşkili. K222 -ni PCR və qPCR ilə gücləndirmək üçün istifadə olunan astarların mövqeləri oxlarla göstərilir. (B) Yeni və Köhnə Dünya primatlarının DNT-sindən K222-nin aşkarlanması. K222, babun, orangutan, qorilla, şimpanze və insanlarda K222F və K222bR primerləri olan PCR ilə aşkar edildi, lakin makakalarda, Afrika yaşıl meymunlarında və Yeni Dünya meymunlarında yox idi. Digər bantlar (məsələn, siçan, hamster və rhesus makakada aşkarlanan PCR məhsulları) qeyri-spesifik PCR amplifikasiyasının nəticəsi olaraq sıralanaraq göstərilmişdir. Yeni Dünya meymunlarının, Köhnə Dünya meymunlarının və hominoidlərin (insanlar və meymunlar) filogeniyası göstərilir. Ayrılığın təxmini vaxtları göstərilir. MYA: milyon il əvvəl. (C) Köhnə Dünya meymunlarının, insanların və bir sıra digər primatların genomlarında qPCR tərəfindən K222 nüsxəsinin miqdarı. K222, ehtimal ki, babun, orangutan, qorilla və şempanze genomlarında tək bir nüsxə olaraq, insan genomunda isə birdən çox nüsxədə mövcuddur. İçərisində hər növün etiketi (B) barlara uyğun gəlir.

K222 inteqrasiyasını gücləndirərkən üç əlavə tapıntı müşahidə edildi. Birincisi, oranqutanda K222 amplifikasiyası babun, qorilla, şimpanze və insan DNT-sinə nisbətən daha yüksək molekulyar çəkiyə malik PCR məhsulu istehsal etdi. İkincisi, K222 gücləndirmə məhsullarının sıralanması və filogenetik təhlili göstərdi ki, qorilla və orangutandakı K222, babun, şimpanze və insan əmiuşağından ayrılır (Şəkil 9A). Orangutanda, K222 37 bp nukleotid əlavələrini birləşdirdi ki, bu da müşahidə etdiyimiz daha uzun PCR məhsulunu izah etdi. K222 ardıcıllığı qorillada 11 nukleotid əvəzlənməsini topladı (Şəkil 9B). Beləliklə, K222 müasir oranqutanların və qorillaların təkamülü zamanı müasir şimpanzelərin və insanların təkamülü ilə müqayisədə daha çox mutasiya əldə edib. Üçüncü tapıntı, insanlarda K222 bantlarının daha güclü intensivliyi, insanlarda K222 genişlənməsini göstərə bilər. K222 nüsxələrinin təxmini sayını təxmin etmək üçün K222 daxil edilməsi üçün spesifik primerlər/zondlarla hər bir növün DNT-nin bərabər konsentrasiyalarından istifadə edərək real vaxt rejimində PCR həyata keçirdik (Şəkil 9A). Real-vaxt PCR kəmiyyəti K222-nin babun, oranqutan, qorilla və şimpanzenin genomlarında tək nüsxə kimi mövcud olduğunu təxmin etdi, lakin insan genomunda bir çox nüsxə tapıldı (Şəkil 9C). Bu məlumatlar göstərir ki, K222, insanların təkamülü əsnasında, bəzən rekombinasiya ilə nüsxə sayında genişlənmişdir.

Köhnə Dünya meymunlarının, primatlarının və insanların genomlarında K222 provirusu. (A) Babun, oranqutan, qorilla, şimpanze və insanın DNT-sindən gücləndirilmiş K222 inteqrasiya ardıcıllığının filogenetik qonşu-birləşən ağacı. Ağac köksüzdür, balanslaşdırılmış bir forma üçün taksilər düzülmüşdür. Ağac Kimura 2-parametrli modeldən istifadə edilməklə tikilib. Filialların dayanıqlığı, 10.000 replikasiya ilə bootstrap testləri ilə qiymətləndirildi. Ölçək çubuqları hər bir ardıcıllıqdakı nukleotid əvəzlərini təmsil edir. (B) Köhnə Dünya meymunlarının, primatlarının və insanların genomlarından gücləndirilmiş K222 daxiletmə ardıcıllığının nukleotid ardıcıllığı. Ardıcıllıqlar, ən qədim cücərmə xətti olan zeytun babun ardıcıllığı ilə müqayisə olunur. Nöqtələr əsas ardıcıllıqla nukleotid oxşarlıqlarını göstərir. Nukleotidlərin dəyişdirilməsi hərflərlə göstərilir. Orangutanda K222 ardıcıllığında bir neçə nukleotid əlavəsi görülə bilər, lakin digər primatlar və ya insanlarda deyil. (B), filogenetik ağacda K222 oranqutanının ayrılmasına səbəb olur (A), bu əlavələrin yalnız müasir oranqutanların təkamülü zamanı yarandığını irəli sürdü.

İnsanlarda K222 nüsxə nömrəsinin təyini

K222-ni primatların və insanların DNT-də saydıqda, K222-nin çox nüsxəli provirus kimi mövcud olduğunu müşahidə etdik. Sonra insanlarda K111 və K222-nin təxmini surətinin nə olduğunu soruşduq. K111-i [10] aşkar etmək üçün həyata keçirdiyimiz kəmiyyət analizinin K222-ni də aşkar etdiyini gördük. Bu, ardıcıllığın oxşarlığı ilə izah edilə bilər env K111 və K222 bölgələrini bu test üçün hədəfləyirik (Şəkil 1A). K222 -ni ölçmək üçün hazırlanan analiz, K222 üçün başqa bir xüsusiyyətdir və K111 -i aşkar etmir (Şəkil 8A). Buna görə bərabər miqdarda DNT istifadə edərək 16 fərddə K111 + K222 nüsxə sayını və K222 nüsxə sayını ölçdük. Biz nəzarət kimi eyni miqdarda DNT-də tək nüsxə geni Top3A (topoizomeraz III A) kəmiyyətini təyin etmək üçün qPCR analizini daha da inkişaf etdirdik. Daha sonra K111 və K222 nüsxələrinin sayını bir nüsxəli gen olan TOP3A üçün aşkar edilən nüsxələrin sayına normallaşdırdıq. K111-in nüsxələrinin sayı hər iki provirusu aşkar edən analizlə aşkar edilmiş nüsxələrdən K222 üçün aşkar edilmiş nüsxələrin sayını çıxmaqla təxmin edilmişdir. Nəticələrimiz göstərir ki, K111 insan diploid genomlarında təxminən 207 ilə 968 nüsxə arasında, K222 isə insan genomunda səkkizdən 61 nüsxəyə qədər mövcuddur (Şəkil 10).

Müasir insanlarda K111 və K222-nin təxmini nüsxə sayı. K111 və K222 nüsxə nömrələri qPCR ilə hesablanmışdır. K111 plus K222 nüsxələri K111F və K111R primerlərindən və həm K111, həm də K222-ni aşkar edən K111P zondundan istifadə etməklə hesablanmışdır. K222 nüsxə sayı, K222F və K222R primerləri və K222 ilə xüsusi olaraq bağlanan prob K222P ilə hesablanmışdır. K111 nüsxələri K111 + K222 nüsxələrindən K222 nüsxələri çıxılmaqla hesablanmışdır. K111 və K222 nüsxələri TOP3A tək nüsxəli gen səviyyəsinə qədər normallaşdırıldı. Süjet 16 sağlam fərddə K111 və K222 genomuna düşən nisbi surət sayını göstərir.

K222 -nin insan xromosomlarına inteqrasiyası

K222, insan genomunda K111 [10] kimi çoxsaylı nüsxələrdə mövcuddur. Bu işıqda, hər birində bir insan xromosomu olan insan/gəmirici hüceyrə hibridlərindən (Şəkil 11A) DNT istifadə edərək insan xromosomlarında K222 varlığını araşdırdıq. K222 inteqrasiyası 1, 7, 12, 13, 14, 15, 18, 21 və 22 insan xromosomlarında PCR ilə aşkar edilmişdir, lakin başqa heç bir insan xromosomunda yox. Maraqlıdır ki, K222 limanında tapılan bütün sentromerlərdə K111 də var. Bu DNT xarici bir laboratoriyada hazırlandı və xromosoma xas genlərin aşkarlanması ilə DNT ilə yoluxma ehtimalı istisna edildi [10]. Ardından, K222-nin hər bir insan xromosomunda bir və ya birdən çox nüsxədə olub olmadığını real vaxtda PCR kəmiyyətcə araşdırdıq. Kəmiyyət təhlili, doqquz insan xromosomunda K222 aşkarlanmasını təsdiqlədi (yuxarıya bax). Kəmiyyət təhlili, K222 -nin 1, 18, 21, 22 və bəlkə də 11 -ci xromosomda təxminən bir nüsxədə olduğunu ehtimal etdi, lakin K222 7, 12, 13, 14 və 15 xromosomlarında bir neçə nüsxə olaraq mövcuddur. (Şəkil 11B). Filogenetik analiz üç ayrı qrupda toplanmış K222 ardıcıllığını göstərir: 13-cü xromosomda yerləşən K222, 12, 14 və 22-ci xromosomlarda yerləşən başqa bir K222 qrupu və 1, 7, 18, 15-ci xromosomlarda olan K222 və (Şəkil) . K222 inteqrasiyasının ardıcıllığı (K222F və K222bR primerləri ilə) spesifik insan xromosomlarında olan K222 proviral ardıcıllıqları arasında nukleotid fərqlərini göstərir (Şəkil 12B).

İnsan xromosomlarında K222 aşkarlanması. (A) K222 yalnız bir spesifik insan xromosomunu daşıyan insan/gəmirici hibrid hüceyrə xətlərindən DNT-də K222F və K222bR primerlər dəstindən istifadə etməklə PCR ilə aşkar edilmişdir. K222 1, 7, 12, 13, 14, 15, 18, 21 və 22 xromosomlarında tapıldı. Digər bantlar (məsələn, 17, 19, 20, X və Y xromosomlarında aşkar edilən PCR məhsulları) ardıcıllıqla göstərildi qeyri-spesifik PCR gücləndirilməsinin nəticəsi olmalıdır. (B) İnsan xromosomlarında qPCR ilə K222 nüsxələrinin miqdarının təyini. K222 nüsxələrinin sayı insan/gəmirici hüceyrə xətlərindən alınan 250 ng DNT -dən hesablanmışdır. İnsan hüceyrələrinin 8 ilə 61 arasında K222 nüsxəsi olduğunu düşünsək, K222 -nin təxminən bir nüsxəsinin 1, 18, 21, 22 xromosomlarda və bəlkə də 12 -ci xromosomda birdən çox olduğunu təxmin edə bilərik. 7, 13, 14 və 15-ci xromosomlarda mövcuddur.

İnsan xromosomlarında K222 -nin təkamülü. (A) İnsan/gəmirici hüceyrə hibridlərində yetişdirilən tək insan xromosomlarından gücləndirilmiş K222 inteqrasiya ardıcıllığının filogenetik qonşu birləşmə ağacı. Ağac Şəkil 9-dakı ağacla eyni şəkildə qurulmuşdur. (B) Tək insan xromosomlarından gücləndirilmiş K222 daxiletmə ardıcıllığının nukleotid ardıcıllığı. Ardıcıllıqlar H9 hüceyrə xəttinin genomundan gücləndirilmiş K222 daxiletmə ardıcıllığı ilə müqayisə edilir. Nöqtələr H9 ardıcıllığı ilə nukleotid oxşarlıqlarını göstərir. Nukleotidlərin yerdəyişməsi və daxil edilməsi hərflərlə göstərilmişdir.

Daha sonra PCR ilə aşkar edilən K222 ardıcıllığının başqa bir metodologiya ilə aşkar edilə biləcəyini araşdırdıq: dərin sıralama və insan DNT nümunələrinin bioinformatik təhlili. Böyük B hüceyrəli lenfoma olan bir xəstənin dalaq fibroblastlarından və bitişik bədxassəli lenfositlərdən hazırlanan HERV-K (HML-2) ilə zənginləşdirilmiş DNT kitabxanalarında K222 üçün araşdırma apardıq [10]. Biz K222 5′ inteqrasiyası ilə ardıcıl oxşarlıqları axtardıq: bu, ən azı 20 bp 5′ cinah ardıcıllığı pCER: D22Z8, ACATATACCCAGT birləşmə ardıcıllığı və bitişik K222 provirusunun 20 bp olması kimi müəyyən edilir. Doqquz insan xromosomunda gücləndirilmiş bütün K222 daxiletmə ardıcıllığını araşdırdıq. Bu müstəqil yanaşmadan istifadə edərək, bu insan DNT kitabxanalarında yüzlərlə eyni K222 inteqrasiyasını aşkar etdik (məlumatlar göstərilmir), insanlarda çoxsaylı K222-nin mövcudluğunu təsdiqləyir. PCR istifadə edərək yuxarıda edilən müşahidələri təsdiqləyən üç fərqli filogenetik K222 qrupuna bölünmüş K222 ardıcıllığı ilə eyni oxunuşlar aşkar etdik. İnsan DNT-nin dərin ardıcıllıqla araşdırılması nəticəsində yaranan ardıcıllıqla oxunan arxiv (SRA) kitabxanalarının xam məlumatlarını tarayarkən bir neçə K222 daxiletmə ardıcıllığını daha aşkar etdik. Daha əvvəl qeyd etdiyimiz kimi, WGS kitabxanalarında K222 ilə əlaqəli bir neçə inteqrasiya da aşkar etdik.

K222-nin xromosomda yeri

Daha sonra, K222 -nin sentromeranın nüvəsində və ya kənarında olub -olmamasını kromatin immunopresipitasiya (ChIP) tədqiqatlarından istifadə edərək araşdırdıq. Histon 3 variantlı centromere protein A (CENPA) [32] və centromere protein B (CENPB) [33], sentromer nüvəsinə xas olan bağlayıcı zülallardır, histon translasyon sonrası dəyişiklik işarəsi H3K9Me3, perisentromerik sahənin əlamətidir [34] ]. Xüsusi antikorlardan istifadə edərək HeLa hüceyrələrindən xromatin ekstraktlarında CENPA, CENPB və H3K9Me3 işarəsini immunopresipit etdik və bu sentromer işarələri ilə əlaqəli K222 inteqrasiyası qPCR ilə kəmiyyətləndirildi. K222-nin CENPA və CENPB immunopresipitasiya olunmuş fraksiyalarında zənginləşdirilməsini tapmadıq (Şəkil 13A), sentromerik DNT üçün müsbət nəzarətin zənginləşdirilməsi, 21-ci xromosomun 11-mer alfoid təkrarlanması (alfoid Chr.21), əvvəllər bildirildiyi kimi tapıldı. [10,35] Şəkil 13B). Gözlənildiyi kimi, CENPA və CENPB -yə xas antikorlar 1 -ci xromosomun q qolunda olan 5S ribozomal DNT genini (mənfi nəzarət olaraq istifadə olunur) zənginləşdirməmişdir (Şəkil 13C). Perisentromerik bölgələrdə [34] bol miqdarda rast gəlinən H3K9Me3 histon markasının immunopresipitasiyası K222 (təxminən 50 qat dəyişiklik) və endogen alfoid Chr.21 təkrarını (təxminən 650 dəfə dəyişmə) təmin etdi, lakin 5S ribozomal DNT -ni əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirməmişdir (Şəkil 12A -dan C -ə). Bu nəticələr, K222 ardıcıllığının sentromerik nüvədə deyil, sentromerin perisentromerik sahələrində yerləşdiyini güclü şəkildə göstərir. K222 -nin genomun digər sahələrində mövcud olduğunu istisna edə bilməsək də, K222 -nin ən böyük əksəriyyətinin perisentromerdə olduğu görünür.

ChIP təhlili göstərir ki, K222 provirusları perisentromerik bölgələrdə olur. K222 DNT-nin kəmiyyət PCR, 21-ci xromosomun sentromerik 11-mer alfoid təkrarı (alphoidChr.21) DNT və CENPA, CENPB, H3K9Me3 və ya nəzarət IgG-yə antikorlar tərəfindən immunopresipitasiya edilən 5S ribosomal DNT. (A) Nəzarət IgG fraksiya ilə müqayisədə, K222, H3K9Me3 fraksiyasında 50 qat zənginləşdirilmişdir, lakin sentromerik CENPA və CENPB protein fraksiyalarında deyil. (B) Müsbət nəzarət, alfoid Chr.21, CENPA və CENPB fraksiyalarının hər birində təxminən 8 qat, H3K9Me3 fraksiyasında isə təxminən 650 dəfə zənginləşdirilmişdir. (C) 1 -ci xromosomun q qolunda 5S ribozomal DNT olan mənfi nəzarət, CENPA, CENPB və ya H3K9Me3 antikorları ilə əhəmiyyətli zənginləşmə göstərmir. Qrafiklər üç müstəqil təcrübədən IgG-çökülmüş fraksiyaları idarə etmək üçün normallaşdırılmış nisbi zənginləşdirməni göstərir. Ulduzlar statistik əhəmiyyətini göstərir: *** = P <0.001, ** = P <0.01, * = P <0.05, n.s = əhəmiyyətli deyil.


Mikrob Hüceyrələrində ERV və İmplantasiya Embrionlarında

Bir çox epigenetik yenidən proqramlaşdırma dalğası ilə xarakterizə olunan məməlilərin implantasiya əvvəli embrion və mikrob hüceyrələrinin inkişafının müəyyən mərhələləri, endogen retroviral aktivliyin nəzarətində unikal bir problem yaradır. İlkin mikrob hüceyrələrində (PGC) və mayalanmış oositlərdə baş verən iki epigenetik yenidən proqramlaşdırma dalğası zamanı əhəmiyyətli miqdarda DNT demetilasiyası baş verir.Bu mərhələlərdə qlobal DNT metilasyonunun araşdırılması, insanlara və siçanlara implantasiya əvvəli embrionların səviyyəsinin növlərə görə 1-2 hüceyrəli mərhələdən başlayaraq, blastosist mərhələsinə qədər və ya ondan dərhal sonra azaldığını göstərdi (Kobayashi et al. ., 2012 Guo et al., 2014 Lee et al., 2014 Okae et al., 2014 Wang L. et al., 2014). DNT metilasiyası ERV-lər də daxil olmaqla bir çox köçürülə bilən elementlərin repressiyasından böyük ölçüdə cavabdeh olduğundan (Walsh et al., 1998), ERV-lərin fəaliyyəti və qlobal hipometilasiyanın bu dövrlərində ERV aktivləşdirilməsini repressiya edən alternativ mexanizmlər son dövrlərdə bir sıra tədqiqatların diqqət mərkəzində olmuşdur. araşdırmalar.

Bəzi ERV ailələrinin heyvanlarda genomik inteqrasiyaların sayında əhəmiyyətli dərəcədə genişləndiyini nəzərə alsaq (Tristem, 2000 Bénit et al., 2001), mikrob hüceyrəsi daxilində qlobal yenidən proqramlaşdırma dalğaları zamanı ERV-lərin geniş şəkildə yenidən aktivləşməsi ehtimal edilmişdir. -implantasiya inkişafı bu genişlənmədən böyük ölçüdə məsuldur. Digər tərəfdən, eyni zamanda məlumdur ki, epigenetik yenidən proqramlaşdırma zamanı genomik stabilliyi qorumaq və mikrob hüceyrələrinin normal inkişafı, döllənmə və embrion inkişafı üçün lazım olan yüksək xoreoqrafik molekulyar prosesləri qorumaq üçün əlavə ERV repressiv mexanizmlərin mövcud olması lazımdır. Bu fikirlər bir-birini istisna etmir, çünki həm reaktivasiyanı (Fuchs et al., 2013 Wang J. et al., 2014 Grow et al., 2015) həm də alternativ repressiyanı (Thomas and Schneider, 2011 Manghera and Douville, 2011) dəstəkləyən əsaslı sübutlar var. 2013 Leung və digərləri, 2014 Liu və başqaları, 2014 Schlesinger və Goff, 2015 Wolf və digərləri, 2015 Thompson et al., 2016) germ hüceyrələrinin inkişafı və embriogenez zamanı genom daxilində ERV-lərin çoxlu sayda və müxtəlifliyində.

Genom daxilində ERV inaktivasiyasına vasitəçilik edən mükəmməl mexanizmlərin mövcudluğuna baxmayaraq, bəzi ERV-lərin hələ də aktiv olduğuna və gametogenez və preimplantasiya inkişafı zamanı mühüm rol oynadığına dair geniş sübutlar mövcuddur. ERV proviral transkripsiyasının və protein ifadəsinin tənzimlənməsi erkən insan embrionlarında və embrion kök hüceyrələrində (hESC) yaxşı sənədləşdirilmişdir. Məsələn, ERV-H ailənin yüksək ifadəsi həm n ïve kimi və həm də astarlanmış hESC alt populyasiyalarında müşahidə edilmişdir (Wang J. et al., 2014 Theunissen və digərləri, 2016 Əlavə Cədvəl 1). ERV-K (HML-2) ailəsindən əlavə transkriptlər də hESCs daxilində yüksək səviyyədə müşahidə olunur və fərqləndikdən sonra sürətlə azalır (Fuchs et al., 2013). ERV-K-nın ifadəsi embrion genomunun aktivləşdirilməsi (EGA) ilə eyni vaxtda 8 hüceyrəli mərhələdə başlayır və blastosist mərhələsinə qədər implantasiyadan əvvəlki inkişaf boyu davam edir. Bu müddət ərzində aktiv şəkildə transkripsiya edilmiş ERV-K lokuslarının əksəriyyəti insan və şimpanze ilə məhdudlaşan və OCT4 bağlama motivini ehtiva edən LTR-nin xüsusi alt sinfi olan LTR5HS ilə əlaqələndirilir. LTR5HS alt sinfi, ERV-K ifadəsini sinerjik olaraq asanlaşdıran transkripsiya aktivləşdirilməsi üçün həm hipometiliyanı, həm də OCT4 bağlamasını tələb edir (Grow et al., 2015 Əlavə Cədvəl 1). Bu ERV-lərin hESCs və implantasiya əvvəli embrionlardakı yüksək aktivliyinə və bu müddət ərzində digər hüceyrə faktorları ilə bilinən qarşılıqlı əlaqələrinə əsaslanaraq, bu ERV-lərin pluripotent spesifik halların müəyyən edilməsi və saxlanılması üçün vacib rollara funksional olaraq daxil edildiyi düşünülür. .

Proviral DNT üçün tənzimləyici bölgələr olaraq LTR -lərin rolu, ev sahibi genomlar tərəfindən istifadə edilə bilən və ya daxil edilə bilən əlavə bir funksiyanı təmsil edir. Xüsusilə, LTR-lərin, embrion inkişafı və pluripotensiyanın qorunması zamanı vacib olan yaxınlıqdakı genlərin təbliğatçıları və ya gücləndiriciləri olaraq birlikdə seçildiyi bilinir (Friedli və Trono, 2015). İnsan embrion toxumalarındakı bütün transkriptlərin təxminən 33% -i təkrarlanan elementlərlə əlaqədardır ki, bu da viral təbliğatçılar üçün embrion hüceyrə spesifikliyinin açıq bir nümunəsini göstərir (Fort və digərləri, 2014). Siçan 2 hüceyrəli embrionların totipotent blastomerlərində aşkar edilən bir çox transkript EGA-da LTR-lərdən başlayır və bu təkrarlanan ardıcıllığın məməlilərdə hüceyrə taleyinin tənzimlənməsinə kömək edə biləcəyini göstərir (MacFarlan et al., 2012). Bəzi LTR -lərin tənzimləyici fəaliyyətinin, təkcə embrion hüceyrələrdə deyil, gametogenez zamanı germ hüceyrələrində də əhəmiyyətli funksiyaları təmin etdiyi göstərilmişdir. Məsələn, p53 ailənin üzvü olan və insan kişi cücərtisində genetik sədaqətin qorunması üçün vacib olan transkripsiyaya malik germline xas xüsusi transaktivləşdirici p63 (GTAp63), ERV9 LTR-in transkripsiya nəzarəti altındadır (Ling və digərləri, 2002 Beyer et al. ., 2011 Liu və Eiden, 2011 Əlavə Cədvəl 1). Transkripsiya ilə aktiv olan GTAp63, sağlam testisdə DNT zədələnməsi ilə çoxalmağı basdırır və apoptozu induksiya edir və insan testis xərçənglərində tez -tez itirilir. Bir histon deasetilaz (HDAC) inhibitoru ilə müalicə edildikdə, xərçəng hüceyrələrində GTAp63 ekspresiya səviyyəsinin bərpası müşahidə edildi, bu da histon asetilasiya işarələrini aktivləşdirməklə ERV9-vasitəçiliyi ilə GTAp63 ifadəsinin mümkün epigenetik nəzarətini göstərir. Beləliklə, ERV9 tənzimləyici bölgələrinin kişi cücərmə xəttinin sabitliyinin saxlanmasına töhfə vermək qabiliyyəti, ERV-lərin insan sahiblərində mühüm bir funksiyaya xidmət etmək üçün necə təkamül etdiyini göstərən başqa bir nümunədir (Liu və Eiden, 2011).


Retrovirus reseptorlarının qarşılıqlı əlaqəsi və girişi

Lorraine M. Albritton, Retrovirus-Hüceyrə Qarşılaşmalarında, 2018

Betaretrovirus İnfeksiyasında Zərərli Protein -Sürücü Neoplaziya

Yumurtalı betaretroviruslar, JSRV və ENTV, sırasıyla, ağciyər adenokarsinomunun (York və s., 1992 Palmarini və digərləri, 1999 DeMartini və s., 2001) və enzootik burun adenokarsinomunun (Walsh və digərləri, 2013) törədiciləridir. . Bu neoplaziyalar Env səbəb olduğu hüceyrə çevrilməsi nəticəsində yaranır (Allen et al., 2002 Chow et al., 2003 Hull and Fan, 2006 Dirks et al., 2002 Alberti et al., 2002). Transformasiya prosesi JSRV üçün daha yaxşı başa düşülür. JSRV və ENTV üçün ortaq reseptor olan HyaL2 ilə Env qarşılıqlı təsirləri bu neoplaziyada heç bir açıq rola malik deyildir (Chow et al., 2003). Əvəzində o, TM-nin və xüsusilə onun sitoplazmatik quyruğunun reseptor olmayan hüceyrə zülalları ilə qarşılıqlı təsirindən yaranır.

Maya iki hibrid sistemindən istifadə edilən tədqiqatlar JSRV Env ilə koimmunoprecipitasiya edən iki hüceyrə zülalını müəyyən etdi. Ras ailəsinin siqnalında transkripsiyanı bastıran hüceyrəli RalA-bağlayıcı protein-1 (RALBP1), Env-in CT sahəsini yem olaraq və insan HeLa hüceyrə kitabxanasını yırtıcı olaraq təyin etdi (Monot və digərləri, 2015). Müstəqil olaraq hüceyrəvi Kruppel ailəsinin sink barmaq proteini 111 (Zfp111) tam uzunluqda Env-ni yem kimi və siçan qaraciyərinin cDNA-larını yırtıcı kimi istifadə edərək ekranda müəyyən edildi (Hsu et al., 2015). RALBP1 ifadəsi JSRV-induksiya etdiyi ağciyər şişi hüceyrələrində repressiya edilir, lakin transformasiya edilməmiş MDCK hüceyrələrində RALBP1 ER-də və plazma membranında Env ilə colocalized və RALBP1-Env komplekslərində koimmunoprecipitasiya olunur (Monot və digərləri, 2015). Bunun əksinə olaraq, Zfp11 -ə bağlanan Env glikozilləşdirilməmiş və nüvədə lokallaşdırılmış komplekslər (Monot və digərləri, 2015). Mümkündür ki, hər iki qarşılıqlı əlaqə yoluxmuş ağciyər hüceyrələrində baş versin və Enf mRNA-larının bir hissəsini normal membran marşrutundan yayındıra bilən Enf sintezinin əvvəlində Zfp111-glikosilasyon-mənfi Env komplekslərinin meydana gəlməsinə imkan yaradan RALBP1 ifadəsinin azalması ilə transformasiyada əməkdaşlıq edə bilər. ER-də tam sitoplazmik tərcüməyə tərcümə.


Materiallar və metodlar

Cas9-GFP siçan NPC mədəniyyətlərinin nəsli

Heyvanlarla əlaqəli bütün prosedurlar Lund Universitetinin laboratoriya heyvanlarından istifadə komitəsi tərəfindən təsdiq edilmiş və ona uyğun olaraq aparılmışdır.

Ön beyin, homozigot Cas9-GFP sıçanlarını yetişdirməklə əldə edilən embrionlardan 13.5-ci günündə parçalanmışdır (Platt və b, 2014). Doku mexanik olaraq ayrıldı və jelatinlə örtülmüş qablarda örtüldü və bir qatlı mədəniyyət kimi saxlanıldı (Conti və b, 2005) N2 hormon qarışığı, EGF (20 ng/ml Gibco), bFGF (20 ng/ml Gibco), 2 nM l -glutamin və 100 µg/ml Pen/Strep ilə tamamlanmış NSA mühitində (Euromed, Euroclone). Hüceyrələr daha sonra Accutase (Gibco) istifadə edərək hər 2-3 gündə 1: 3-1: 6 keçdi.

Hədəfləmə Trim28 in vitro

Bələdçilər crispr.mit.edu saytında hazırlanmış və Əlavədə verilmişdir. Lentiviruslar Zuffereyə görə istehsal edilmişdir və b, (1997) və titrlər 10 9 TU/ml idi ki, bu da qRT-PCR-dən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir. Cas9 siçan NPC-ləri MOI 40-da ötürüldü və FACS-dən (FACSAria, BD Biosciences) 10 gün əvvəl genişlənməsinə icazə verildi. Hüceyrələr propidium iyodid (BD Bioscience) və süzülmüş (70 µm süzgəclər, BD Bioscience) ilə əsas mədəniyyət mühitində (böyümə faktorları istisna olmaqla) ayrıldı və yenidən dayandırıldı. RFP hüceyrələri FACS 4°C-də təcrid olundu (yenidən analiz > 99% təmizlik göstərdi) və 400°C-də qranullandı. g 5 dəqiqə quru buz üzərində dondurulur və RNA/DNT təcrid olunana qədər -80 ° C -də saxlanılır. Bütün qruplar bioloji üçlüklərdə yerinə yetirildi.

Hədəfləndirmə Trim28 in vivo yetkinlərin beynində CRISPR/Cas9 istifadə

Heyvanlarla əlaqəli bütün prosedurlar Lund Universitetinin laboratoriya heyvanlarından istifadə komitəsi tərəfindən təsdiq edilmiş və ona uyğun olaraq aparılmışdır.

AAV5 vektorlarının istehsalı başqa yerdə ətraflı təsvir edilmişdir (Ulusoy və b, 2009) və titrlər 10 13 TU/ml qaydasında idi ki, bu da ITR-ə doğru TaqMan primerlərindən istifadə edərək qRT-PCR ilə müəyyən edildi. Enjeksiyondan əvvəl, vektorlar PBS-də seyreltildi, bələdçi RNT-ləri ehtiva edən vektorlar, hər biri 10% -ə qədər seyreltilmiş 3, 4 və 13-cü bələdçilərin birgə enjeksiyonu istisna olmaqla, 30% -ə qədər seyreltildi. Rosa26 Cas9 döyülən siçanlar, 1 μl virus məhlulunun (0,1 µl / 15 s) intra-striatal inyeksiyadan əvvəl (bregmadan koordinatlar: AP + 0,9 mm, ML + 1,8 mm, DV -2,7 mm) izofluran ilə anesteziya edilmişdir. Geri axının qarşısını almaq üçün iynə enjeksiyondan 2 dəqiqə sonra əlavə saxlanılır. Heyvanlar 2 aydan sonra qurban edildi və ya IHC, ya da nüvələrin təcrid edilməsi (aşağıdakı təfərrüatlara baxın) və sonra DNT və ya RNT seq ilə təhlil edildi.

Hədəfləndirmə Trim28 in vivo sinir inkişafı zamanı

Kişi Emx1-Cre (+/-) Kəsmə 28-flox (+/−) gtRosa (+/−) yetişdirilmişdir Düzəldin 28-flox (+/+) dişi olan (Emx1-Cre +/− Düzəldin 28-flox +/−) və ya hər ikisi (Emx1-Cre +/− Kəsmə 28-flox +/+) Kəsmə 28 allellər kəsilmiş, nəzarət və istifadə edilmişdir Düzəldin 28-sırasıyla KO. IHC üçün istifadə olunan heyvanlar, Cre'nin ifadə edildiyi hüceyrələri görselleştirmek üçün gtRosa üçün əlavə olaraq heterozigot idi. Heyvanlar əvvəlki protokollara görə quyruq biopsiyalarından genotip edilmişdir (Cammas və b, 2000) və ya IHC, ya da RNT ardıcıllığı üçün 3 aylıq yaşda qurban verildi.

İmmunohistokimya

Siçanlara ölümcül bir fenobarbiturat dozası verildi və transkardiyal olaraq 4% paraformaldehid (PFA, Sigma) ilə töküldü, beyinlər 2 saat ərzində sabitləndi və 25% saxaroza ilə fosfat tamponlu duzlu suya (PBS) köçürüldü. Beyinlər mikrotomda (30 µm) koronal hissələrə bölündü və KPBS-ə yerləşdirildi. IHC başqa bir yerdə ətraflı təsvir edildiyi kimi edildi (Sachdeva və b, 2010). Antikorlar: Trim28 (Millipore, MAB3662, 1:500), Trim28 (Abcam, ab10484, 1:1,000), NeuN (Sigma-Aldrich, MAB377, 1:1,000), IAP-Gag (Bryan Cullen-dən xoş bir hədiyyə və burada təsvir edilmişdir. (Dewannieux və b, 2004), 1:2,000), Iba1 (WAKO, no.019-19741, 1:1,000). Bütün bölmələr 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma-Aldrich, 1: 1,000) ilə boyanmışdır. Jackson Laboratories -dən ikincil antikorlar 1: 400 -də istifadə edildi.

Nüvələrin izolyasiyası

Heyvanlar servikal dislokasiya ilə qurban edildi və beyinləri tez bir zamanda çıxarıldı. İstədiyiniz bölgələr parçalandı və quru buz üzərində donduruldu və -80 ° C-də saxlanıldı. Nüvələrin izolyasiyası (Sodersten və b, 2018). Qısaca olaraq, toxuma buz kimi soyuq lizis tamponunda (0,32 M saxaroza, 5 mM CaCl) əridi və dissosiasiya edildi.2, 3 mM MgAc, 0.1 mM Na2EDTA, 10 mM Tris -HCl, pH 8.0, 1 mM DTT) 1 ml toxuma dozer (Wheaton) istifadə edərək. Homojenat, 30.000 × santrifüjdən əvvəl saxaroza yastığının (1.8 M saxaroza, 3 mM MgAc, 10 mM Tris -HCl, pH 8.0 və 1 mM DTT) üzərinə diqqətlə qatlanmışdır.g 2 saat və 15 dəqiqə. Peletlənmiş nüvələr 100 μl nüvə saxlama tamponunda (15% saxaroza, 10 mM Tris -HCl, pH 7.2, 70 mM KCl və 2 mM MgCl) 10 dəqiqə yumşaldılmışdır.2) 300 μl seyreltmə tamponunda (10 mM Tris -HCl, pH 7.2, 70 mM KCl və 2 mM MgCl) yenidən süspanse edilməmişdən əvvəl2) və hüceyrə süzgəcindən keçirin (70 μm). Hüceyrələr FACS (FACS Aria, BD Biosciences) vasitəsilə 4 C C -də aşağı axın sürəti ilə 100 μm nozzle istifadə edərək reanaliz edildi və gt 99% saflıq göstərdi). DNT və ya RNT ardıcıllığı üçün nəzərdə tutulmuş çeşidlənmiş nüvələr 1300 × ölçüdə peletlənmişdirg 15 dəqiqə və birdəfəlik dondurulmuş, tək nüvəli RNT-ardıcıllığı üçün nəzərdə tutulmuş nüvələr birbaşa 10 × Genomics Tək Hüceyrəli 3 ′ Çipə yüklənmişdir-bax Tək nüvəli ardıcıllıq.

CRISPR/Cas9 vasitəçiliyinin təhlili Kəsmə 28-indels

Hamısından ümumi genomik DNT çıxarıldı Düzəldin 28NexteraXT parçalanmasına məruz qalmadan əvvəl, DNeasy qan və toxuma dəsti (Qiagen) və fərqli hədəf ardıcıllığını əhatə edən 1.5 kb -lik bir parça istifadə edən KO və nəzarət qrupları PCR (hədəf və astar sıraları üçün sırasıyla Cədvəl EV3 və EV4 -ə baxın) ilə gücləndirildi. istehsalçı tövsiyələri. İndeksli etiketləmə kitabxanaları, CRISPR/Cas9 redaktə səmərəliliyini qiymətləndirmək üçün daxili TIGERq boru kəməri ilə 2 × 150 bp PE oxunması ilə ardıcıllıqla təhlil edildi.

RNT ardıcıllığı

Ümumi RNT, RNeasy Mini Kit (Qiagen) istifadə edərək donmuş hüceyrə/nüvə qranullarından və beyin toxumasından təcrid olunmuş və RNA-seq üçün istifadə edilmişdir (toxuma parçaları 2 dəqiqə 30 Hz müddətində toxuma parçalayıcıda işlədilmişdir). Kitabxanalar Illumina TruSeq Stranded mRNA kitabxana hazırlıq dəsti (poli-A seçimi) istifadə edərək yaradıldı və NextSeq500 (PE 2 × 150 bp) üzərində sıralandı.

Oxumalar STAR (2.6.0c) (Dobin və b, 2013), bələdçi kimi gencode siçan annotasiyasından GRCm38.p6 vM19 istifadə edərək. Oxumaların (Jin və b, 2015 ) TEtranskriptləri işə salmaq üçün.

Oxunma kəmiyyəti TEtranscripts 2.0.3 versiyası ilə gen annotasiyası üçün GRCm38.p6 vM19 genkod annotasiyasından, həmçinin TEtranscripts müəllifləri (Jin) tərəfindən təqdim edilmiş TE-lərin seçilmiş GTF faylından istifadə etməklə multimodda həyata keçirilib. və b, 2015). Bu fayl RepeatMasker -dən fərqlənir, çünki sadə təkrarları, rRNA -ları, scRNA -ları, snRNA -ları, srpRNA -ları və tRNA -ları istisna edir. Çıxış matrisi daha sonra DESeq2 (versiya 1.22.2) ilə diferensial ifadə analizini (DEA) yerinə yetirmək üçün TE alt ailələri və genlər arasında bölündü (Sevgi). və b, 2014) ziddiyyətli Kəsmə 28-Nəzarət nümunələrinə qarşı KO. DESeq2, nümunənin vəziyyəti və bir genin normallaşdırılmış dəyərlərindən istifadə edərək mənfi binomial paylanmanı qəbul edən ümumi xətti model yaradır. Nəticədə əmsallar Wald testindən istifadə edərək şərtlər arasında yoxlanılır. P dəyərlər daha sonra Benjamini və Hochberg korreksiyasından istifadə edərək düzəldilir. Paket üsulları haqqında daha çox məlumat üçün baxın (Sevgi və b, 2014 ).

TE alt ailələrinin olduğu təqdirdə əhəmiyyətli dərəcədə fərqli olduğunu bildiririk P düzəliş edilmiş dəyər 0,05 -dən aşağıdır və log2 qat dəyişikliyinin mütləq dəyəri 0,5 -dən yüksəkdir.

Şərt başına ifadə səviyyələrini göstərmək üçün fərqli bələdçilərdən nümunələr hədəf alır Düzəldin 28 birlikdə birləşdirildi və LacZ nəzarətlərinə qarşı sınaqdan keçirildi. Verilənlər, ardıcıllıq dərinliyindəki hər hansı bir fərqi nəzərə almaq üçün DESeq2 obyektindən sizeFactors ((Anders & Huber, 2010) -da təsvir edilən orta nisbət metodu) istifadə edərək normallaşdırılmışdır.

Diferensial şəkildə ifadə olunan elementləri müəyyən etmək və onların gen ifadəsinə təsirlərini öyrənmək üçün oxunuşlar STAR (2.6.0c) ilə unikal şəkildə xəritələnmişdir. Tam uzunluqda siçan ERV proqnozları RetroTector proqram təminatından (Sperber və b, 2007) və onların oxunan miqdarı xüsusiyyətCounts (Subread 1.6.3) (Liao və b, 2014). Diferensial ifadə təhlili (DEA) DESeq2 ilə edildi. GENCOD annotation GRCm38.p6 vM19 ilə 10, 20 və 50 kbp pəncərələri olan tənzimlənmiş elementlərin yuxarı və aşağı axını BEDtools kəsişməsi ilə edildi (Quinlan & Hall, 2010) müqayisə edilməyən elementlər üçün eyni kəsişmə edildi. yaxınlıqdakı genlərin nizamsızlaşması.

Bigwig faylları, deeptools-dan bamCoverage istifadə edərək RPKM tərəfindən normallaşdırıldı və USCS Genome Brauzerinə yükləndi (buraxılış GCF_000001635.25_GRCm38.p5 (2017-08-04)).

DESeq2 istifadə edərək diferensial gen ifadəsi təhlili aparıldı. Yuxarı və aşağı tənzimlənən genlər (P-adj < 0.05, log2FC > 0.5) veb-əsaslı PANTHER (Mi) alətindən istifadə edərək GO terminlərinin həddən artıq təmsil olunmasını yoxlamaq üçün istifadə edilmişdir. və b, 2019). 30407594 GO-Slim bioloji proses verilənlər bazasında Fisherin dəqiq testi ilə saxta kəşf dərəcələri ilə terminlərin həddən artıq təqdim olunmasını sınadıq. Əsas rəqəmlərdə göstərilən terminlər, sınaqdan keçirdiyimiz genlər qrupu arasında dörddən çox geni olan (yuxarı və ya aşağı tənzimlənmiş), mütləq log2 qat dəyişmə dəyəri 0,5 -dən yüksək və yalan kəşf dərəcəsi 0,05 -dən aşağı olanlardır.

Tək nüvəli RNT ardıcıllığı

Nüvələr korteksdən təcrid olunmuşdur Emx1-Cre (+/−)/Düzəldin 28-flox (+/−, +/+) heyvanlar (Ctl n = 2, KO n = 2) yuxarıda göstərildiyi kimi. Nümunə başına 8500 nüvə FACS vasitəsilə çeşidləndi və tək hüceyrə yaratmaq üçün istehsalçının Xrom Tək Hüceyrəli 3′ Kitabxanası (10× Genomics, PN-120233) protokoluna uyğun olaraq 10× Genomics Single Cell 3′ Chip və Reverse Transkripsiya Master Mixə yükləndi. emulsiyadakı hüceyrə gel muncuqları. cDNA amplifikasiyası 10 × Genomics təlimatlarına uyğun olaraq həyata keçirildi və hər bir nümunə üçün unikal nümunə indeksləri (SI) ilə ardıcıllıqla kitabxanalar yaradıldı. Nümunələr üçün kitabxanalar 150 dövrəli dəstdən istifadə edərək Novaseq-də multipleksləşdirilmiş və ardıcıllıqla tərtib edilmişdir.

Xam əsas zənglər, multiplexed və Illumina tərəfindən təmin edilən bcl2fastq proqramını istifadə edən cellranger mkfastq 1 istifadə edərək xüsusi fastq sənədlərinə çevrildi. İndeksdə 1 uyğunsuzluğa imkan verən bcl2fastq proqramı üçün defolt parametrdən istifadə edildi və oxumaların xam keyfiyyəti FastQC və multiQC alətləri ilə yoxlanıldı. Hər bir nümunə üçün fastq faylları cellranger count versiyası 3.0 boru kəmərindən istifadə etməklə müstəqil şəkildə işlənmişdir (defolt parametrlər). Bu boru kəməri cDNA oxunuşlarını transkriptoma (mm10) xəritələşdirmək üçün splice-dən xəbərdar olan STAR 5 proqramından istifadə edir. Nüvə nümunələrində pre-mRNA-nın daha yüksək bir hissəsini əldə etməsi gözlənildiyindən, hüceyrə nəzarətçisi təlimatları istifadə edərək əvvəlcədən mRNA istinadı yaradılmışdır.

Oxunanların ən azı 50% -i bir ekzonla kəsişərsə, ekzonik deyilsə, intronik, digər tərəfdən isə interon və intergenik ilə kəsişirsə, xəritələnmiş oxunuşlar ekzonik, intronik və intergenik olaraq xarakterizə olunurdu. Aşağıdakı analiz üçün, transkriptomla (və eyni iplə) bənzərsiz şəkildə eşlenen yalnız ekzonik oxunuşlar istifadə edilmişdir.

Aşağı keyfiyyətli hüceyrələr və genlər, hər bir hüceyrədə aşkar edilən ümumi gen sayının bir hissəsi (±3 nmads) əsasında süzülüb. Qalan 16.671 nüvədən 6.472 -si nəzarət nümunələrindən (Ctl), 7199 -u isə nokautdan (KO) gəldi.

Aşağı axın təhlili üçün nümunələr Seurat (versiya 3) R paketi (Dobin) istifadə edilərək birləşdirildi və b, 2013). Kümeler, 0.1 qətnamə istifadə edərək Seurat funksiyası FindClusters ilə təyin edildi və UMAP sahələri ilə görüntüləndi. Hüceyrə tipi annotasiyası, hər bir qrup üçün tanınan marker əsaslı ifadə və siçan beyni Atlas (Zeisel) ifadə profillərinin müqayisəsi istifadə edilərək həyata keçirildi. və b, 2018). Müqayisədə, atlasdakı bütün 256 hüceyrə növləri üçün marker genləri ilə birlikdə hüceyrələr arasında hər bir tənzimlənmiş gendən ibarət bir marker gen dəsti istifadə edilmişdir. 256 atlas hüceyrə növü, Taksonomiya dərəcəsi 4 -də (39 qrup) əsas qruplara qruplaşdırıldı və hər qrup üçün ortalama ifadə marker gen dəsti ilə hesablandı. Bunlar Spearman korrelyasiyasından istifadə edərək qruplarımızdakı orta ifadə ilə müqayisə edildi. Kümelenmelerin annotasiyasına əsaslanaraq, 0, 1, 2, 5 və 6, 7 qrupları, sırasıyla, həyəcan verici və inhibitor neyronlar olaraq birləşdirildi. Hər bir hüceyrə növü üçün nokaut və nəzarət nümunələri arasında diferensial ifadə Seurat FindMarkers funksiyasından (Wilcox testi, P düzəldilmiş & lt 0.01).

Transcosable elementlərin ifadəsi, SeCrats funksiyasından istifadə edərək, bütün qruplar üçün hüceyrə barkodlarının çıxarılması ilə təhlil edildi. Every.bam faylı daha sonra 10 × bamtofastq alətindən istifadə edərək yenidən qrupların fastq sənədlərinə çevrildi.

Nəticədə fastq faylları bələdçi kimi gencode siçan annotasiyasından GRCm38.p6 vM19 istifadə edərək STAR-da defolt parametrlərdən istifadə edilməklə xəritələnmişdir. Nəticə olan bam faylları, xüsusiyyət Counts (irəli strandness) ilə genlərə oxunma xəritələrinin kəmiyyətini müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir. Çıxış matrisi daha sonra TE sayını normallaşdırmaq üçün istifadə ediləcək DESeq2 ilə sizeFactors hesablamaq üçün istifadə edilmişdir.

Klaster fastq faylları, həmçinin TEtranscripts müəllifləri tərəfindən tövsiyə edildiyi kimi, 100 loci və 200 lövbərə imkan verən xəritələnmişdir. Oxunuş miqdarı daha sonra gen annotasiyası üçün GRCm38.p6 vM19 və TEtranskript müəllifləri tərəfindən verilən TE -lərin seçilmiş GTF faylı istifadə edərək, çox modlu (irəli zolaqlı) TEtranskriptlərlə həyata keçirildi. Ətraflı məlumat üçün RNA sıralama paraqrafına baxın.

Şəkil 5B-də təqdim olunan məlumatlar üçün qat dəyişdirmə zolağı qrafikləri nəzarət və nokaut nümunələrini müqayisə edərək hər bir hüceyrə tipli TE alt ailələrinin DESeq2 ilə yerinə yetirilən DEA-dan hazırlanmışdır, daha ətraflı məlumat üçün RNT ardıcıllığı paraqrafına baxın. Eyni rəqəmdəki ortalama sahələr, standart parametrlərin xəritələndirilməsi ilə genin ölçülməsi nəticəsində yaranan sizeFactors istifadə edərək normallaşdırıldı.

KƏSİN və ÇALIŞIN

CUT & RUN (Skene & Henikoff, 2017) uyğun olaraq yerinə yetirildi. Qısacası, 200.000 siçan NPC yuyuldu, keçirdi və H3K9me3 (1:50, ab8898, Abcam) antikoru ilə 4 ° C temperaturda bir gecədə inkubasiya edilmədən əvvəl ConA ilə örtülmüş maqnit boncuklarına (Bang Laboratories) yapışdırıldı. Hüceyrələr yuyuldu və pA-MNase füzyon proteini ilə inkubasiya edildi və CaCl əlavə edilərək həzm aktivləşdirildi.2 0 ° C -də. Həzm 30 dəqiqədən sonra dayandırıldı və DNT-nin çıxarılmasından əvvəl həll olunmayan nüvə xromatindən hədəf xromatin ayrıldı. Eksperimental müvəffəqiyyət kapilyar elektroforez (Agilent) və H3K9me3 üçün nukleozom merdivenlərinin olması ilə qiymətləndirildi, lakin IgG nəzarətləri üçün deyil.

Kitabxana hazırlığı Hyper hazırlıq dəsti (KAPA biosystems) istifadə edilərək NextSeq500 2 × 75 bp -də sıralanmışdır. Oxumaların mm10 -a uyğunlaşdırılması Bowtie2 2.3.4.2 (Langmead & Salzberg, 2012) ilə yerli hizalanma üçün standart parametrlərdən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. Multi-mapper oxunuşları SAMtools view 1.4 versiyası ilə süzülmüşdür və b, 2009 ).

Bölmədə təsvir olunan ERVK proqnozundan istifadə RNT ardıcıllığı, MMERVK10C -nin tam uzunluğunu əldə etdik. Mm10 RepeatMasker annotasiyasına (açıq-4.0.5 — Təkrar Kitabxana 20140131) əlavə edilmiş MMERVK10C-int, tam uzunluqlu ERVK proqnozunda 50% -dən çox üst-üstə düşdüyü zaman, bir ERVK tam uzunluqlu MMERVK10C hesab edilmişdir. Kəsişmə BEDtools ilə kəsişmə 2.26.0 (-f 0.5) ilə aparıldı (Quinlan & Hall, 2010). İstilik xəritələri və profil sahələri deepTools -un plotHeatmap (Ramirez və b, 2016) və maksimum ifadəsini istifadə edərək sıralanmışdır Düzəldin 28-KO nümunələri və ya bələdçi 3 üçün in vitroin vivo CRISPRs. Genom brauzeri üçün treklər deepTools'un bamCoverage (versiya 2.4.3) (Ramirez) istifadə edərək RPKM istifadə edərək normallaşdırıldı. və b, 2016 ).

Yetkin siçan korteksindən H3K9me3 ChIP-seq məlumatları (Jiang) əldə edildi. və b, 2017), yuxarıda təsvir edilən daxili Cut & Run nümunələri ilə eyni şəkildə xəritələndi və təhlil edildi.

QRT - PCR

Kortikal beyin parçaları, RNeasy Mini Kit (Qiagen) istifadə edərək RNA izolyasiyasından əvvəl bir toxuma parçalayıcıda (2 dəq, 30 Hz, 4 ° C) pozulmuşdur. cDNA, Maxima First Strand cDNA Sintez Kiti (Invitrogen) tərəfindən sintez edildi və LightCycler 480 (Roche) üzərində SYBR Green I master (Roche) ilə təhlil edildi. Məlumatlar təsərrüfat genlərinə normallaşdırılmış ΔΔCt metodu ilə təmsil olunur Gapdh və β-aktin. Astarlar EV4 Cədvəlində verilmişdir.

Qərb ləkəsi

Kortikal hissələrdən kəsilmiş Emx1-Cre (+/-) Düzəldin 28-flox (+/− və +/+) heyvanlar (Ctl n = 5, KO n = 5) tərkibində Proteaz inhibitor kokteyli (PIC, Complete, 1:25) olan RIPA buferinə (Sigma-Aldrich) qoyuldu və 2 dəqiqə, iki dəfə və sonra 50 Hz-də TissueLyser LT (Qiagen) istifadə edərək 4°C-də parçalandı. 10.000 × -də fırlanmadan əvvəl 30 dəqiqə buzda saxlanılırg 4°C-də 10 dəqiqə. Supernatantlar toplandı və yeni bir boruya köçürüldü və -20 ° C-də saxlanıldı. Hər bir nümunə 1:1 (10 μl + 10 μl) Laemmli tamponu (Bio-Rad) ilə qarışdırılmış və 4-12% SDS-PAGE gelinə yüklənməmişdən əvvəl 95°C-də 5 dəqiqə qaynadılmış və elektrotransferdən əvvəl 200 V-da işlədilmişdir. Transblot-Turbo Transfer sistemindən (Bio-Rad) istifadə edərək membrana. Membran daha sonra TBS-də 0,1% Tween20 (TBST) ilə 2 × 15 dəqiqə yuyulur, 5% yağsız quru süd ehtiva edən TBST-də 1 saat bloklanır və sonra TBST-də seyreltilmiş əsas antikorla 4 ° C-də inkübe edilir. 5% yağsız quru süd (dovşan anti-Trim28, Abcam ab10484, 1: 1.000 dovşan əleyhinə CD68, 1: 1.000, Abcam ab125212 dovşan əleyhinə IAP-Gag, 1: 10.000, Bryan Cullen tərəfindən verilən gözəl bir hədiyyə. (Dewannieux və b, 2004)). Membran 2 × 15 dəqiqə TBST-də yuyuldu və 5 saat yağsız quru süd ilə seyreltilmiş HRP-konjüge edilmiş dovşan əleyhinə antikor (Sigma-Aldrich, NA9043, 1: 2500) ilə 1 saat otaq temperaturunda inkübe edildi. Membran, Immobilon Western (Millipore) istifadə edərək kimyəvi parıltı ilə aşkar edildikdən və ChemiDoc MP sistemi (Bio-Rad) istifadə edərək aşkar edildikdən əvvəl, TBST-də yenidən 2 × 15 dəqiqə və TBS-də 1 × 15 dəqiqə yuyuldu. Membran 15 saniyə ərzində metanol ilə müalicə olunaraq 15 dəqiqə sonra TBST-də soyulmuş buferdə (100 mM 2-merkaptoetanol, 2% (w/v) SDS, 62.4 mM Tris-HCL, pH 6.8) 30 müddətində inkubasiya olunaraq soyulmuşdur. minimum 50 ° C. Membran 15 dəqiqə axan suda yuyulur, sonra TBST-də 3 × 15 dəq sonra 5% yağsız quru süd olan TBST-də 1 saat bloklanır. Daha sonra membran boyandı və yuxarıda təsvir edildiyi kimi β-aktin (siçan anti-β-aktin HRP, Sigma-Aldrich, A3854, 1:50,000) üçün vizuallaşdırıldı.

Morfoloji analiz

İba1+ hüceyrələrinin morfologiyası Emx1-Cre/Düzəldin 28-flox heyvanları (Ctl n = 3, KO n = 2) Cellomics Array Scan (Array Scan VTI, Thermo Fischer) istifadə edərək qərəzsiz, avtomatlaşdırılmış bir proses vasitəsilə 2D -də təhlil edildi. Skaner korteks (Ctl) boyunca çoxlu sayda fotoşəkil çəkdi (20× obyektivdən istifadə etməklə) n = 361, KO n = 215) və striatum (Ctl n = 104, KO n = 63) və “Neyron profilləşdirmə” proqramı hər bir hüceyrə üzrə prosesin uzunluğunu, proses sahəsini və filial nöqtələrini təhlil etməyə imkan verdi. Hər bir heyvandan 10 ədəd korteks fotoşəkili təsadüfi olaraq seçildi və İba1 + hüceyrələri əl ilə kor bir şəkildə sayıldı və mm2 başına Iba1 + hüceyrələri olaraq təqdim edildi.

Kod mövcudluğu

Boru kəməri, konfiqurasiya faylları və aşağı analizlər GitHub-dakı src qovluğunda mövcuddur (https://github.com/ra7555ga-s/trim28_Jonsson2020.git). Bütün aşağı axın təhlili və vizuallaşdırma R 3.5.1 -də aparılmışdır.

Məlumat əldə etmək üçün heç bir məhdudiyyət yoxdur. Bütün fayl adları Cədvəl EV5 -də təsvir edilmişdir və bu işdə təqdim olunan RNT və DNT sıralama məlumatları üçün giriş kodu GSE154196 -dır.


Neyrodegenerativ xəstəlikdə HERV zülalları

MS və ALS xəstələrinin eroziyaya uğramış beyinlərində viral zülalların aşkar edilməsi tədqiqatçıları HERV -lərin bu xəstəliklərdə rolunu araşdırmağa vadar etdi. Bu araşdırma getdikcə daha geniş yayılsa da, mexanizmlər hələ də aydın deyil və hipotetik olaraq qalır.

Çox skleroz

HERV-W zərf zülalı, mikroglia üzərindəki pullu reseptoru 4 bağlayır və hüceyrələri proinflamatuar sitokinlər ifraz etməyə təhrik edir. (1). Eyni zamanda, zülal da bu hüceyrələrin miyelin qalıqlarını təmizləməsini maneə törədir (2), MS-də zədələnmiş miyelin örtüklərinin bərpası üçün vacib bir mexanizmdir və normal olaraq zədələnmiş aksonların remiyelinləşdirilməsinə kömək edən oliqodendrosit prekursor hüceyrələrinin (OPC) yetkinləşməsinin qarşısını alır. (3). Birlikdə bu iki yol beyindəki lezyonların inkişafına kömək edən iltihablı bir mühit yaradır, eyni zamanda yerli hüceyrələrin zədələnmələri düzəltmə qabiliyyətini pozur. Tədqiqatçılar HERV-W istehsalının ilk növbədə nəyə səbəb olduğunu hələ kəşf etməyiblər.

Siçanlar üzərində aparılan təcrübələr, HERV-K kimi tanınan insan genomunda ən son inteqrasiya olunmuş HERV-in sinir sisteminin müəyyən bölgələrində aktivləşməsinin motor neyronun pozulmasına səbəb olduğunu göstərdi. Bu, ALS-də görülən nörodejenerasiyanı izah edə bilər, baxmayaraq ki, HERV-K-nin tam olaraq necə iştirak etdiyi hələ aydın deyil. Tədqiqatçılar HERV-K-nın zərf zülalının ribosomların istehsalına cavabdeh olan nüvələrdəki mexanizmlərin pozulmasına səbəb olduğunu və bu da öz növbəsində hüceyrə ölümü ilə nəticələndiyini düşünürlər. (1) .Bu prosesin ALS-də müşahidə olunan mütərəqqi pisləşməyə uyğun olaraq, virus zərfinin zülalının istehsalını stimullaşdıran amillər vasitəsilə, zülalın ifrazı vasitəsilə hüceyrədən hüceyrəyə yayıldığı düşünülür. (2), və ya ola bilsin ki, HERV-K-nın özünün yayılması ilə ola bilər, baxmayaraq ki, endogen virusun bu şəkildə davrana biləcəyinə dair heç bir sübut yoxdur.

Zərf zülalı HERV-lərin immunitet sistemi ilə qarışmasının yeganə yolu deyil. GeNeuro-dan maliyyə alan Feschotte izah edir ki, zülal olmadıqda belə, artıq HERV RNT və HERV-dən əldə edilən digər nuklein turşuları orqanizmin immun reaksiyasına səbəb ola bilər, sitoplazmik DNT-ni aşkar edən hüceyrə sensorlarına xəbərdarlıq edir. Və "bu sensorlar boğulanda otoimmün reaksiyalara səbəb olur" deyir. "Bu çox yaxşı xarakterizə olunur."

Cavabsız qalan əsas sual, bu xəstəlik proseslərinin niyə yalnız bəzi insanlarda meydana çıxmasıdır. HERV ardıcıllığının böyük əksəriyyəti hər kəsdə mövcuddur. Ancaq insanlar dəyişkən sayda xüsusi HERV parçaları daşıyırlar və bir neçə HERV parçası yalnız bəzi insan genomlarında olur-hər iki faktor da HERV-ə əsaslanan patologiyalara fərdi həssaslığa kömək edə bilər.

Bundan əlavə, Orhus Universitetində Kristensenin komandasının işi ev sahibinin fərdi genetik quruluşunun işə düşə biləcəyini göstərir. 2011-ci ildə, tədqiqatçılar, sağlam insanlarla müqayisədə MS xəstələrində X xromosomunda HERV-F qrupunun üzvü olan HERV-Fc1-in müəyyən bir lokusu ətrafında müəyyən tək nukleotid polimorfizmlərin üstünlük təşkil etdiyini nümayiş etdirdilər. 10 Və digər tədqiqatlar göstərir ki, ətraf mühit faktorları - məsələn, Epstein-Barr virusu, MS-də rol oynadığı düşünülən ümumi infeksiya - HERV-W ifadəsini aktivləşdirə bilər. Hammell və həmkarları, ALS xəstələrinin böyük əksəriyyətində toplandığı bilinən bir RNA və DNT bağlayan protein olan TDP-43 zülalının birləşməsinin endogen retrovirusun ifraz olunmasına səbəb olduğunu tapdılar. Drosophila. 11


Bəzi təəccüblü HERV bağlantıları

HERV -lərlə genetikanın və biokimyanın tam aydınlaşdırılmadığı müxtəlif idiopatik şərtlər arasındakı əlaqəni göstərən tədqiqat ədəbiyyatı da artmaqdadır. De Meirleir və həmkarları 13, miyalji ensefalomiyeliti (ME) diaqnozu qoyulmuş xəstələrdən alınan duodenal biyopsilərdə HERV zülallarına qarşı immunoreaktivliyin ilkin nəticələrini bildirdi. HERV ifadəsinin ME hallarında qeyd olunan iltihablı sitokinlərin ifadəsi ilə əlaqəsi ola biləcəyini və xroniki iltihabın görünüşü ilə əlaqəli ola biləcəyini düşündülər.

HERV-lər şizofreniya və bipolyar pozğunluq hallarında da iştirak etmişdir. Perron və həmkarları 14 təklif etdilər ki, xüsusi HERV &mdash HERV-W &mdash simptomların başlanğıcı ilə əlaqədar olaraq &ldquoətraf mühit, genetik və immunoloji amillər arasında&rdquo mühüm kəsişmə nöqtəsində ola bilər. Onlar təklif etdilər ki, HERV-W-nin spesifik infeksiyalar vasitəsilə aktivləşdirilməsi iltihab və immun aktivləşdirmə ilə bağlı təkrar təsir göstərə bilər.

Digər tədqiqatlar həmçinin diqqət əskikliyi-hiperaktivlik pozğunluğu 15 və autizm spektri pozğunluğu kimi şərtlərlə bağlı digər HERVs &mdash HERV-H &mdash həddindən artıq ifadə edildiyini bildirmişdir. 16 Baxmayaraq ki, yenə də HERV-lərin bu şərtlərlə və həqiqətən də, potensial olaraq mövcud olan hər hansı digər komorbid vəziyyətlərlə bağlı biliklərimizdə hələ də boşluqlar var, Şuvarikov və həmkarlarının 17 nəticələrini qeyd etmək maraqlıdır. HERVs, otistik davranışların və digər idrak və inkişaf xüsusiyyətlərinin ortaya çıxması ilə üst -üstə düşən bir genetik silinməyə vasitəçilik edir.


NƏTİCƏLƏR

Bu məqalə, ev sahibi qoruma, xərçəng və otoimmünizmə təsir göstərə biləcək kompleks bir mövzuya ümumi bir baxış təqdim etdi. Nəticədə, HERV -lərin dostu və ya düşmənidir? Bioloji üstünlük verməkdə HERV-lər (və tək LTR-lər) həqiqətən faydalı ola bilər. Onların immunoloji homeostazda və bəlkə də ekzogen retroviruslardan qorunmada rolu maraqlıdır. Alternativ olaraq, HERV daxiletmə mutasiyası, molekulyar mimika, superantigen motivləri və digər viruslarla rekombinasiya xəstəliyin inkişafı və patologiyası üçün cavabdeh ola bilər. Əlavə bir cəhət, ontogenez zamanı HERV peptidlərinin varlığının immun repertuarında bir çuxurla yekunlaşmasıdır. Nəticədə, HİV-CTL ardıcıllığına oxşar peptidlər müəyyən bir fərd üçün daha təhlükəli ola bilər.

Ev mesajları alın

İnsan endogen retrovirusları (HERVs) genomumuzun bir hissəsini təşkil edir və əvvəlki retrovirus infeksiyasının izlərini təmsil edir.

HERV-lər müasir ekzogen retroviruslarla oxşar genomik təşkilata (gag-pol-env) malikdirlər, lakin yoluxucu deyillər.

HERV-K super ailəsi ən aktiv HERV-lərdən birini təmsil edir və retroviral hissəciklər istehsal etmək qabiliyyətinə malikdir.

HERVs ev sahibi üçün faydalı ola bilər, həm də zərərli ola bilər və müəyyən otoimmün xəstəliklərə və xərçənglərə cəlb edilə bilər.

"Əlavə bir aspekt, ontogenez zamanı HERV peptidlərinin mövcudluğunun immun repertuarda bir boşluqla başa çatmasıdır"

Aydındır ki, HERV(lər) və otoimmün xəstəlik halları və bəzi xərçənglər arasında möhkəm əlaqəni müəyyən etmək üçün çoxmərkəzli tədqiqatlara ehtiyac var. Xüsusilə "gen çipi" texnologiyaları, şübhəsiz ki, HERV ifadəsini xəstəlik və patoloji irəliləyişlə əlaqələndirəcəkdir. Fərdi HERV-lərin transkripsiyası və ya HERV-lərin əlaqələndirilmiş ifadəsi, vacib olsa da, normal toxumalarda olan ifadə ilə balanslaşdırılmalıdır. Nəticə etibarilə, HERV/LTR polimorfizmləri, köməkçi viruslar (və ya digər tetikleyiciler) tərəfindən transaktivasiya və tam uzunluqlu və ya birləşdirilmiş transkriptlərin rolu ilə bağlı tədqiqatlar bu viruslar haqqında əlavə biliklər verə bilər. Bundan əlavə, xəstəliyin yerində retrovirus məhsulları müəyyən etmək üçün asanlıqla əldə edilə bilən antikor reagentləri (məsələn, monoklonal antikorlar, rekombinant faq antikorları) paneli tələb olunur. Şübhəsiz ki, HERV tədqiqat sahəsi sürətlənməyə davam edəcək ki, biz reneqat endogen retrovirusların nəticələrini və onların ksenotransplanasiyada ötürülməsini tam olaraq müəyyən edə bilək. 85, 86


Bu məqalənin əsasını təşkil edən məlumatlar NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) verilənlər bazasında mövcuddur. İstifadə olunan genomların qoşulma nömrələri, lokiretrovirusların konsensus ardıcıllığı və düzülmələr əlavə cədvəl S2, əlavə məlumat dəsti 1 və əlavə məlumat dəstləri 2-8, Əlavə materialda mövcuddur.

Bu iş, Çin Milli Təbiət Elmləri Vəqfi (31922001 və 31701091) və Jiangsu Ali Təhsil Təşkilatlarının Prioritet Akademik Proqram İnkişafı (PAPD) tərəfindən dəstəkləndi.


Videoya baxın: Retrovirus reverse transcripiton (Noyabr 2022).