Məlumat

6: Amino Asit Ayrılması, Peptid Bağları və Protein Sıralaması - Biologiya

6: Amino Asit Ayrılması, Peptid Bağları və Protein Sıralaması - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

6: Amin turşusunun ayrılması, peptid bağları və zülal sıralaması

Fəsil 4 Peptidlərin ayrılması və təmizlənməsi

Bu fəsil peptidlərin ayrılması və təmizlənməsinə yönəlmişdir. Bir zülalın ferment və ya kimyəvi üsullarla parçalanması, strukturlarının təyin edilməsi üçün bir -birindən ayrılmalı olan bir neçə və ya çoxlu peptid parçasının qarışığı ilə nəticələnir. Peptidlərin təmizlənməsi zülalın amin turşusu ardıcıllığının təyin edilməsində ən çox vaxt aparan mərhələdir, lakin indi tələb olunan vaxt əvvəlkindən xeyli azdır. Peptidlərin ayrılma üsulları aşağıdakı fiziki kimyəvi xüsusiyyətlərdən birinə və ya bir neçəsinə əsaslanır: molekulyar ölçü, yük, polarite, həll olma qabiliyyəti və spesifik kovalent və ya kovalent olmayan qarşılıqlı təsirlər. Bir peptidin yükü pH-ın dəyişməsi ilə dəyişdirilə bilər. Bu fəsildə müzakirə edilən amin turşusu qalıqlarının qeyri -adi paylanmasına malik olan kollagen kimi tipik kürəcik zülallar üçün ixtisaslaşdırılmış siniflər üçün uyğun üsullar müzakirə olunur. Peptidlərin inteqral membran zülallarından ayrılması ciddi problemlər yaradır, çünki belə peptidlərin peptid qarışıqlarının həlli üçün adi mühitlərdə birləşməsinə və ya həll olunmamasına böyük meyli var.


Mücərrəd

Yüksək hidrostatik təzyiq (HHP) və ultrafiltrasiya membranları olan elektrodializ (EDUF), müvafiq olaraq protein enzimatik hidrolizini və bioaktiv peptidlərin bərpasını yaxşılaşdırmaq üçün istifadə olunan iki səmərəli texnologiyadır, lakin heç vaxt birlikdə sınaqdan keçirilməmişdir. Beləliklə, bu tədqiqatda, fermentativ hidrolizdən əvvəl yağsız kətan toxumu zülal izolatında HHP-nin ilkin müalicəsi aparıldı və nəticədə peptidlər EDUF ilə ayrıldı. HHP-nin ilkin müalicəsi hissəcik ölçüsünə, zülal uyğunluğuna və hidroliz dərəcəsinə təsir etdi. EDUF ayrılmasından sonra, KCl fraksiyasında bərpa olunan peptid fraksiyaları (nəzarətin enzimatik hidrolizindən və təzyiqlə işlənmiş protein izolatı) argininlə zənginləşdirilmiş və özbaşına hipertansif siçovullarda sistolik qan təzyiqinin (SBP) azalması ilə əlaqələndirilmişdir. Əlavə olaraq, əvvəlcədən işlənmiş zülaldan əmələ gələn son EDUF hidrolizatı və yerli proteindən alınan ilkin EDUF hidrolizatı da aşağı SBP ilə əlaqələndirilmişdir. Bununla belə, yalnız yerli zülal hidrolizatından əldə edilən nəzarət KCl fraksiyasının diabet əleyhinə aktivliyi ilə əlaqələndirilmişdir.


3. Nəticələr və Perspektivlər

Arabidopsisdə IDA-HSL siqnal yolunun müxtəlif komponentlərinin identifikasiyası ilə başlayaraq, biz və başqaları indi çiçəkli bitkilərin bütün sıralarında bu genlərin ortoloqlarını müəyyən etdik və onların AZ-lərdə və ya çiçəklərdə, yarpaqlarda və meyvələrdə ifadə edilməsinə dair nümunələr təqdim etdik. peptid həm monokotlarda, həm də dikotlarda abses proseslərini induksiya edə bilər və bəzi hallarda Arabidopsisin tamamlanması ilə orqan və növlər arasında fərziyyə olunan qorunmuş funksiyanı təsdiq edir. ida mutant. Bununla belə, qorunan funksiyanın son sübutu hələ də yoxdur, peptid və ya reseptor genlərinin mutasiyası ilə absisiyanın tam çatışmazlığı indiyə qədər yalnız Arabidopsisdə göstərilmişdir.

Laboratoriyamız tədqiqat işlərinə başladı ida təxminən 20 il əvvəl fərqli absisiyası və#x02014 qeyri -kafi fenotipinə görə mutant. Bu illər ərzində texnoloji yeniliklər bitki elmləri də daxil olmaqla elmdə inqilab etdi, buna görə də hər hansı bir növün, hər bir fərdin və hətta hər hansı bir hüceyrənin genetik məlumatlarına daxil ola bilərik. Çiçəkli bitkilərin hər sırasından növlərin bütün genom ardıcıllığı təkamül nöqteyi-nəzərindən morfologiya, inkişaf və ətraf mühitə uyğunlaşmadakı variasiyanı öyrənməyə imkan verir.

Peptidlər həm inkişaf prosesləri, həm də müdafiə ilə bağlı hüceyrələrarası əlaqəni asanlaşdıran yeni hormonlar kimi kəşf edilmişdir (son araşdırmalara baxın [47,48,49,50]). IDA-HAE/HSL2 peptid-reseptor qarşılıqlı əlaqəsi, müştərək reseptorların identifikasiyası və MAP kinazları və KNOX transkripsiyası ilə aşağı axın siqnal yolunun komponentləri üçün genetik, biokimyəvi və struktur sübutları ilə tarixdə ən yaxşı işlənmiş peptid-liqand reseptor modulları arasındadır. faktiki hüceyrə ayrılma mərhələsində iştirak edən genlərin ifadəsini nəzarət edən [4,5,6,10,13,14,21,23,25,26,34,35]. Təkamül biologiyasında əsas suallardan biri, xüsusiyyətlərin təkamülünün əsasən zülallardakı mutasiyalardan və ya genlərin nə vaxt və harada ifadə olunmasının tənzimlənməsindən qaynaqlandığıdır. Orqan absisiyasının harada və nə vaxt baş verməsindən asılı olmayaraq, IDA-HSL ligand reseptor siqnal modulunda hüceyrə ayrılmasının molekulyar əsasının saxlanıldığı halda, absisasiya prosesləri ilə əlaqədar olaraq sonuncunun olduğunu düşünürük.

Çiçəklərin və meyvələrin vaxtında alınmaması səbəbindən fermerlər ciddi itkilərə məruz qalırlar və hər hektardan yüksək məhsuldarlıq ətraf mühit baxımından da müsbət qarşılanacaqdır. İstənilən genin məqsədyönlü mutagenezini vəd edən CRISP/Cas gen redaktə texnikasının durmadan artan sayda bitki növlərinə uyğunlaşması ilə biz ehtimal edirik ki, bizim fərziyyəmiz nəsillər tərəfindən yoxlanılacaq. BİA və ya HSL yaxın gələcəkdə müvafiq növlərdə mutantlar.


Bu məqalə 32 başqa nəşrə istinad edir.

Bu məqalə 44 nəşr tərəfindən istinad edilmişdir.

  1. Frensis Bertias, Metyu A. Baird, Aleksandr A. Şvartsburq. d/l Peptid Epimerlərinin Diferensial İon Hərəkətlilik Ayrılmaları. Analitik kimya 2021,93 (8), 4015-4022. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05023
  2. Pratima Pathak, Anastasiya Sarycheva, Matthew A. Baird, Alexandre A. Shvartsburg. İzonerlərin İon Mobility Spektrlərindəki 13C Yerdəyişmələri ilə Təsnifatı. Amerika Kütləvi Spektrometriya Cəmiyyətinin jurnalı 2021,32 (1), 340-345. https://doi.org/10.1021/jasms.0c00350
  3. K. H. Brian Lam, J. C. Yves Le Blanc, J. Larry Campbell. Diferensial Hərəkətlilik Spektroskopiyası, Kütləvi Spektrometriya və Hidrogen-Deyterium Mübadiləsindən istifadə edərək Siklosporinin İzomerlərinin, Konformerlərinin və Analoqlarının Ayrılması. Analitik kimya 2020,92 (16), 11053-11061. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c00191
  4. Pratima Pathak, Matthew A. Baird, Alexandre A. Shvartsburg. Daha Ağır Növlər üçün İon Mobility Spektrlərində Struktur Məlumatlı İzotopik Dəyişikliklər. Amerika Kütlə Spektrometriyası Cəmiyyətinin jurnalı 2020,31 (1) , 137-145. https://doi.org/10.1021/jasms.9b00018
  5. Aleksandr A. Şvartsburq, Rox Andjeyevski, Endryu Entvistl, Rocer Gils. Qaz Təzyiqini Dəyişdirməklə Dəyişdirilə bilən Dipol Alignmentli Makromolekulların İon Hərəkətlilik Spektrometriyası. Analitik kimya 2019,91 (13) , 8176-8183. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b00525
  6. Matthew A. Baird, Pavel V. Shliaha, Gordon A. Anderson, Eugene Moskovets, Victor Laiko, Alexander A. Makarov, Ole N. Jensen, Alexandre A. Shvartsburg. Tampon Qazı Məhdudiyyəti olmadan Yüksək Çözünürlüklü Diferensial İon Mobility Ayırmaları/Orbitrap Kütlə Spektrometriyası. Analitik kimya 2019,91 (10) , 6918-6925. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b01309
  7. Matthew A. Baird, Pratima Pathak, Alexandre A. Shvartsburg. Yüksək Sahə İon Mobility Spektrlərində Struktur Xüsusi İzotopik Dəyişmələrin Elementar Asılılığı. Analitik kimya 2019,91 (5) , 3687-3693. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b05801
  8. Pratima Pathak, Matthew A. Baird, Alexandre A. Shvartsburg. Yüksək sahəli ion hərəkətlilik spektrlərində çoxölçülü izotop sürüşmələri ilə izomerlərin identifikasiyası. Analitik kimya 2018,90 (15) , 9410-9417. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b02057
  9. Alyssa Garabedian, Matthew A. Baird, Jacob Porter, Kevin Jeanne Dit Fouque, Pavel V. Shliaha, Ole N. Jensen, Todd D. Williams, Francisco Fernandez-Lima və Alexandre A. Shvartsburg. Orta-aşağı proteoformaların xətti və diferensial ion hərəkətliliyinin ayrılması. Analitik kimya 2018,90 (4), 2918-2925. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b05224
  10. Alexandre A. Shvartsburg, Anisha Haris, Roch Andrzejewski, Andrew Entwistle, Roger Giles. Aşağı təzyiq rejimində diferensial ionların hərəkətliliyinin ayrılması. Analitik kimya 2018,90 (1) , 936-943. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b03925
  11. Brandon G. Santiago, Matthew T. Campbell, Gary L. Glish. Diferensial ionların hərəkətlilik spektrometriyası ilə ayrılması zamanı peptid ionlarının daxili enerjisinə təsir edən dəyişənlər. Amerika Kütləvi Spektrometriya Cəmiyyətinin jurnalı 2017,28 (10), 2160-2169. https://doi.org/10.1007/s13361-017-1726-8
  12. Matthew A. Baird, Alexandre A. Shvartsburg. Elektron köçürmə dissosiasiyasının ardınca yüksək rezolyusiyaya malik diferensial ionların hərəkətlilik ayırmaları vasitəsilə peptid qarışıqlarında post-tərcümə modifikasiyalarının lokallaşdırılması. Amerika Kütləvi Spektrometriya Cəmiyyətinin jurnalı 2016,27 (12) , 2064-2070. https://doi.org/10.1007/s13361-016-1498-6
  13. Zhidan Chen, Stephen L. Coy, Evan L. Pannkuk, Evagelia C. Laiakis, Adam B. Hall, Albert J. Fornace, Jr., Paul Vouros. İnsan və qeyri-insani primatlarda radiasiya biomarkerlərinin diferensial hərəkətlilik spektrometriyası-kütlə spektrometriyası ilə sürətli və yüksək məhsuldarlığın aşkarlanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi. Amerika Kütləvi Spektrometriya Cəmiyyətinin jurnalı 2016,27 (10), 1626-1636. https://doi.org/10.1007/s13361-016-1438-5
  14. Helen J. Cooper. Zülalların Analizində FAIMS Nə dərəcədə Faydalıdır ?. Amerika Kütlə Spektrometriyası Cəmiyyətinin jurnalı 2016,27 (4), 566-577. https://doi.org/10.1007/s13361-015-1326-4
  15. Hong Hee Lee, Areum Hong, Yunju Cho, Sunghwan Kim, Won Jong Kim, Hugh I. Kim. İyon Mobility Kütlə Spektrometriyası və Tandem Kütlə Spektrometriyasından istifadə edərək Xərçəng əleyhinə Dərman Paklitakselin və Onun Metabolitlərinin Struktur Xarakteristikası. Amerika Kütlə Spektrometriyası Cəmiyyətinin jurnalı 2016,27 (2), 329-338. https://doi.org/10.1007/s13361-015-1280-1
  16. Brandon G. Santiago, Rachel A. Harris, Samantha L. Isenberg, Mark E. Ridgeway, Alice L. Pilo, Desmond A. Kaplan, Gary L. Glish. Taşıyıcı Qaz Tərkibi və Kompensasiya Sahəsinin Bağlı Taramalarından istifadə edərək Təkmilləşdirilmiş Diferensial İon Mobility Ayırmaları. Amerika Kütlə Spektrometriyası Cəmiyyətinin jurnalı 2015,26 (10), 1746-1753. https://doi.org/10.1007/s13361-015-1208-9
  17. Joscelyn Sarsby , Rian L. Griffiths , Alan M. Race , Josephine Bunch , Elizabeth C. Randall , Andrew J. Creese və Helen J. Cooper . Maye Çıxarma Səthi Analizi Kütləvi Spektrometriya, Bioloji Substratlardan Alınmamış Zülalların Analizi üçün Sahə Asimmetrik Dalğa Formalı İon Mobility Spektrometriyası ilə birləşir. Analitik kimya 2015,87 (13) , 6794-6800. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5b01151
  18. Vladimir Kopysov, Alexander Makarov və Oleq V. Boyarkin. Molekulyar Kütlələr üçün Rənglər: Biomolekulların İdentifikasiyası üçün Spektroskopiya və Kütləvi Spektrometriyanın Füzyonu. Analitik kimya 2015,87 (9), 4607-4611. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5b00822
  19. Nikolas E. Manicke, Michael Belford. Yüksək Sahə Asimmetrik Dalğaformalı İon Hərəkətlilik Spektrometriyasına Birləşdirilmiş Elektrosprey İonizasiyası və Kağız Spreyindən istifadə edərək Opiat İzomerlərinin Ayrılması. Amerika Kütlə Spektrometriyası Cəmiyyətinin jurnalı 2015,26 (5), 701-705. https://doi.org/10.1007/s13361-015-1096-z
  20. David Auerbach, Julia Aspenleiter, Dietrich A. Volmer. Diferensial İon Hərəkətlilik Spektrometriyasında Qaz Fazalı İon/Neytral Qarşılıqlı Əlaqələrin Təsviri: Kalibrləmə Runlarından istifadə edərək CV Proqnozu. Amerika Kütlə Spektrometriyası Cəmiyyətinin jurnalı 2014,25 (9) , 1610-1621. https://doi.org/10.1007/s13361-014-0934-8
  21. Samantha L. Isenberg, Paul M. Armistead, Gary L. Glish. Diferensial İon Hərəkətlilik Spektrometriyası ilə Peptid Ayrılmalarının Optimallaşdırılması. Amerika Kütlə Spektrometriyası Cəmiyyətinin jurnalı 2014,25 (9) , 1592-1599. https://doi.org/10.1007/s13361-014-0941-9
  22. Chenxi Jia , Christopher B. Lietz , Qing Yu və Lingjun Li . İon Hərəkətlilik Spektrometriyası ilə D-Amin Turşusu Tərkibində Peptid Epimerlərinin Sahəyə Xüsusi Xarakteristikası. Analitik kimya 2014,86 (6), 2972-2981. https://doi.org/10.1021/ac4033824
  23. Andrew J. Creese, Jade Smart və Helen J. Cooper. Peptid ardıcıllığının variantlarının geniş miqyaslı təhlili: Yüksək sahəli asimmetrik dalğa formalı ion hərəkətlilik spektrometriyası üçün iş. Analitik kimya 2013,85 (10) , 4836-4843. https://doi.org/10.1021/ac400646m
  24. Yaoyang Zhang, Bryan R. Fonslow, Bing Shan, Moon-Chang Baek və John R. Yates, III. Ov tüfəngi/Aşağıdan yuxarıya Proteomika ilə Protein Təhlili. Kimyəvi rəylər 2013,113 (4), 2343-2394. https://doi.org/10.1021/cr3003533
  25. Andrew J. Creese, Neil J. Shimwell, Katherine P. B. Larkins, John K. Heath, Helen J. Cooper. Av tüfəngi Proteomikasında FAIMS və Güclü Katyon Mübadilə Xromatoqrafiyasının Bir -birini Tamamlaması Araşdırılması. Amerika Kütləvi Spektrometriya Cəmiyyətinin jurnalı 2013,24 (3) , 431-443. https://doi.org/10.1007/s13361-012-0544-2
  26. Alexandre A. Shvartsburg və Richard D. Smith. Zülalın Yüksək Rezolyusiyalı Diferensial İon Hərəkətlilik Spektrometriyası. Analitik kimya 2013,85 (1) , 10-13. https://doi.org/10.1021/ac3029129
  27. Alexandre A. Shvartsburg, Yupeng Zheng, Richard D. Smith və Neil L. Kelleher. "Orta-Aşağı" Aralığına Uzanan Variant Histon Kuyruklarının İon Mobility Ayırması. Analitik kimya 2012,84 (10) , 4271-4276. https://doi.org/10.1021/ac300612y
  28. Andrew J. Creese və Helen J. Cooper. Yüksək Sahə Asimmetrik Dalğaforma İon Hərəkətlilik Spektrometriyası ilə İzomerik Qlikopeptidlərin Ayrılması və İdentifikasiyası. Analitik kimya 2012,84 (5), 2597-2601. https://doi.org/10.1021/ac203321y
  29. Alexandre A. Shvartsburg və Richard D. Smith. Hidrogen istifadə edərək sürətləndirilmiş yüksək qətnaməli diferensial ion hərəkətliliyi. Analitik kimya 2011,83 (23), 9159-9166. https://doi.org/10.1021/ac202386w
  30. Yang Li, Dandan Jiang, Kun Zhao, Enyou Li, Yiping Liu, Chuang Chen, Weiguo Wang, Haiyang Li. Planar diferensial hərəkətlilik spektrometriyası ilə intraoperativ iz ekshalasiya olunan propofolun real vaxt rejimində davamlı ölçülməsi. Analitik üsullar 2021,13 (23) , 2624-2630. https://doi.org/10.1039/D1AY00179E
  31. Voislav Blagojeviç , Amanda De Filippis , Diethard K. Bohme . Diferensial Hərəkətlilik Spektrometriyası (DMS) ilə peptid analizində həssaslığın və seçiciliyin artırılması strategiyası kimi metilləşmə. Beynəlxalq Kütlə Spektrometriyası Jurnalı 2020,450 , 116310. https://doi.org/10.1016/j.ijms.2020.116310
  32. Gongyu Li, Daniel G. Delafield, Lingjun Li. Qabaqcıl ion hərəkətliliyi-kütlə spektrometriyasından istifadə edərək peptid izomerlərinin və onların reseptorlarının struktur aydınlaşdırılması. Analitik Kimyada TrAC Trendləri 2020,124 , 115546. https://doi.org/10.1016/j.trac.2019.05.048
  33. Oleq V. Boyarkin. Biomolekulların struktur identifikasiyası üçün soyuq ion spektroskopiyası. Fiziki Kimya üzrə Beynəlxalq Rəylər 2018,37 (3-4) , 559-606. https://doi.org/10.1080/0144235X.2018.1547453
  34. Xueyun Zheng, Liulin Deng, Erin S. Baker, Yehia M. Ibrahim, Vladislav A. Petyuk, Richard D. Smith. Amiloid β peptidlərdə d - və l - aspartik və izoaspartik turşuların ultra yüksək ayırdetməli ion hərəkətlilik spektrometriyası ilə fərqləndirilməsi. Kimyəvi Əlaqələr 2017,53 (56), 7913-7916. https://doi.org/10.1039/C7CC03321D
  35. Bradley B. Schneider , Erkinjon G. Nazarov , Frank Londry , Paul Vouros , Thomas R. Covey . Diferensial mobillik spektrometriyası/kütləvi spektrometriya tarixi, nəzəriyyəsi, dizaynın optimallaşdırılması, simulyasiyalar və tətbiqlər. Kütləvi Spektrometriya Baxışları 2016,35 (6) , 687-737. https://doi.org/10.1002/mas.21453
  36. Navin Chicooree, Richard D. Unwin, John R. Griffiths. Tərcümə sonrası dəyişikliklərin aşkarlanması və lokalizasiyasında məqsədli kütlə spektrometriyasına əsaslanan strategiyaların tətbiqi. Kütləvi Spektrometriya Baxışları 2015,34 (6) , 595-626. https://doi.org/10.1002/mas.21421
  37. Goran Mitulović. Proteomik Analiz üçün Yeni HPLC Texnikaları: Son İnkişaflara Qısa Baxış. Maye Kromatoqrafiya və əlaqəli texnologiyalar jurnalı 2015,38 (3), 390-403. https://doi.org/10.1080/10826076.2014.941266
  38. Julie A. Rey , Mark M. Kushnir , Richard A. Yost , Alan L. Rockwood , A. Wayne Meikle . Diferensial ion hərəkətlilik spektrometriyası ilə birlikdə LC-MS/MS ilə 5 endogen steroidin ölçülməsində performansın artırılması. Klinika Chimica Acta 2015,438 , 330-336. https://doi.org/10.1016/j.cca.2014.07.036
  39. Brandon G. Santiago, Rachel A. Harris, Samantha L. Isenberg, Gary L. Glish. Bağlı taramalardan istifadə edərək & gt7900 -ün səlahiyyətlərini həll etmək: həlletmə gücü diferensial ion hərəkətlilik spektrometriyasının ayrılma qabiliyyətini nə qədər yaxşı təsvir edir. Analitik 2015,140 (20), 6871-6878. https://doi.org/10.1039/C5AN00845J
  40. Nannan Pang, Cunyu Yan. Sahə mobilliyinin asılılığının öyrənilməsi və asidik fitohormonların diferensial hərəkətlilik spektrometriyası - kütlə spektrometriyası ilə birbaşa ayrılması. Beynəlxalq Kütləvi Spektrometriya Jurnalı 2014,362 , 48-55. https://doi.org/10.1016/j.ijms.2013.12.025
  41. Corina Flangea, Catalin Schiopu, Florina Capitan, Cristina Mosoarca, Marilena Manea, Eugen Sisu, Alina Zamfir. Tamamilə avtomatlaşdırılmış çip əsaslı nanoelektrik spreyi, yüksək ötürmə qabiliyyətli yuxarıdan-aşağıya proteomika üçün elektron köçürmə dissosiasiyası ilə birlikdə. Açıq Kimya 2013,11 (1) , 25-34. https://doi.org/10.2478/s11532-012-0130-2
  42. Maira Fasciotti, Gustavo B. Sanvido, Vanessa G. Santos, Priscila M. Lalli, Michael McCullagh, Gilberto F. de Sá, Romeu J. Daroda, Martin G. Peter, Marcos N. Eberlin. Drift qazı kimi CO 2 istifadə edərək dalğa ionlarının hərəkətliliyi kütlə spektrometriyası ilə izomer disakaridlərin ayrılması. Kütləvi Spektrometriya Jurnalı 2012,47 (12), 1643-1647. https://doi.org/10.1002/jms.3089
  43. Kristian E Swearingen, Robert L Moritz. Kütləvi spektrometriyaya əsaslanan proteomika üçün yüksək sahəli asimmetrik dalğa formalı ion hərəkətlilik spektrometriyası. Ekspert Proteomik Baxış 2012,9 (5) , 505-517. https://doi.org/10.1586/epr.12.50
  44. Caroline Evans , Josselin Noirel , Saw Yen Ow , Malinda Salim , Ana G. Pereira-Medrano , Narciso Couto , Jagroop Pandhal , Duncan Smith , Trong Khoa Pham , Ether Karunakaran , Xin Zou , Catherine A. Bigs , Phillips. iTRAQ-a baxış: biz indi harada dayanırıq?. Analitik və Bioanalitik Kimya 2012,404 (4), 1011-1027. https://doi.org/10.1007/s00216-012-5918-6

Kapilyar elektroforezlə β-saç sancağı ilə birləşmiş protein kinaz C substratının peptid fraqmentlərinin ayrılması

Yaxşı qatlanmış β-saç iynəsi peptidlərini özündə birləşdirən sintetik peptidlər, proteolitik parçalanmaya artan müqavimət sayəsində hüceyrə biologiyasının müxtəlif tətbiqlərində üstünlüklərə malikdir. Bu işdə bir protein kinaz C (PKC) substratına əridilmiş WKpG β-hairpin peptidi sintez edildi və bu peptid və onun proteolitik parçaları üçün kapilyar-elektroforetik ayrılma şərtləri inkişaf etdirildi. WKpG-PKC fraqmentləri hüceyrə lizatında deqradasiya fraqmentlərinin identifikasiyası üçün standartlar yaratmaq üçün tripsin və Pronase E ilə enzimatik müalicə ilə yaradılmışdır. 250 mM H sadə bufer sistemi3PO4, pH 1.5 WKpG-PKC-nin və onun fraqmentlərinin kapilyar elektroforezlə 16 dəqiqədən az müddətdə ayrılmasına imkan verdi. Ba/F3 hüceyrələrindən istehsal olunan bir hüceyrə lizatı istifadə edərək, β-hairpin-konjuge edilmiş substrat və onun PKCα-fosforlu məhsulu aşkar edilə bilər və bir hüceyrə lizatında istehsal olunan peptidaz tərəfindən yaradılan parçalardan ayrılır. Metod, peptid PKC fəaliyyətini təhlil etmək üçün müxbir kimi istifadə edildikdə, mürəkkəb bioloji sistemlərdə WKpG-PKC və onun fraqmentlərinin identifikasiyası və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün potensial tətbiqə malikdir.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Mücərrəd

Ticarət çöl noxudunun zülalla zənginləşdirilmiş unundan xam ekstraktların (C8 ekstraktlarının) xromatoqrafik fraksiyalanması (Pisum sativum L.) sisteinlə zəngin bitki peptidlərinin noxud albümini 1b (PA1b) ailəsi ilə əlaqəli peptid qarışıqları verdiyini burada göstərmişdir. Qarışıqlar əvvəlcə silisium gel ilə flaş xromatoqrafiya ilə əldə edilmişdir. Soyasaponinlərin və lizolesitinlərin elüsyonundan sonra iki flaş xromatoqrafik həlledici sistemin istifadəsi ilə əldə edilən son fraksiyalar, düyü buğdası ilə qidalanma əleyhinə bioanalizdə aktivlik nümayiş etdirdi.Sitophilus oryzae (L.)]. Bu qarışıqların kimyəvi xüsusiyyətləri nazik təbəqə xromatoqrafiyası, yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası (HPLC), IR, MS və amin turşusu analizləri ilə müqayisə edilmişdir. Orta kütlələri 3752, 3757 və 3805 Da olan C8 ekstraktlarının əsas peptidləri anyon mübadiləsi xromatoqrafiyası ilə təcrid olunmuşdur. 3752 kütləli peptidlə zənginləşdirilmiş nümunələr kation mübadiləsi xromatoqrafiyası ilə təcrid edilmişdir. Elektrosprey ionlaşma kütlə spektrometriyası ilə birlikdə reduksiya və alkilləşmə təcrübələri göstərdi ki, C8 ekstraktlarında təxminən 10 peptid var və PA1b kimi, hər bir peptid altı sistein qalığına (üç disulfid bağı) malikdir. 2-merkaptoetanol ilə disulfid bağının azaldılması antifidant aktivliyi məhv etdi. C8 ekstraktlarının yerli peptidlərinin qələvi pH -da işləyən XTerra HPLC sütunları ilə doqquz zirvədə həll edildiyi aşkar edildi. Bu sütunlar noxud peptidlərinin təcrid olunmuş fraksiyalarda paylanmasını, fotodiod massivi və elektrosprey aşkarlanması ilə qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir.

Açar sözlər: Pisum sativum noxud albüminləri PA1b bioinsektisidlər flash xromatoqrafiya ion mübadiləsi xromatoqrafiyası XTerra HPLC

Yazışmalar kimə ünvanlanmalıdır. Tel: 306-956-7651. Faks: 306-956-7247. E-poçt: [email qorunan]


PHYLIP paketinin UPGMA variantı altında Neighbor proqramı tərəfindən Cədvəl 1-in aşağı sol yarısında göstərilən məsafə matrislərindən hazırlanmış köklü ağac (Felsenstein, 1993). Dal uzunluqları ağacın altındakı zülal məsafələri ilə mütənasibdir. Ağacda, UPGMA analizi ilə eyni dallanma quruluşu istehsal edən qonşu birləşmə analizindən (Felsenstein, 1993) ayrı-ayrı dal uzunluqları da göstərilmişdir. Mya, milyon il əvvəl. Növlərin qısaltmaları Şəkil 5 -də istifadə olunanlara uyğundur.

Anelid hemoglobinin ayrı -ayrı zəncirlərini ayırmaq və təmizləmək üçün bir çox cəhdlər edildi: gel filtrasiyası (Shlom və Vinogradov, 1973 Suzuki və b., 1983b), DEAEion mübadiləsi sütun xromatoqrafiyası (Suzuki və b., 1983a), preparativ gel elektroforezi (Ochiai və Enoki, 1979), xromatofokuslama (Gotoh, 1982 Shishikura) və b., 1986), əks fazalı sütun xromatoqrafiyası (Fushitani və b., 1988 Suzuki və b., 1990a Ownby və b., 1993) və başqaları (Bonaventura və Bonaventura, 1981). Burada təsvir edilən ayırma metodumuz, əvvəllər ayrılmasında əldə edilənə bənzər bir səmərəliliyə malikdir Lumbricus Ownby tərəfindən hemoglobin və b. (1993) və Lamellibrachia Suzuki tərəfindən hemoglobin və b. (1990b), əks fazalı sütunlardan istifadə edən Synchropak RP-P C18 və Cosmosil 5C18-sırasıyla 300. Bununla belə, bir sıra üstünlüklər hələ də mövcuddur: Resurs RPC yüksək kimyəvi sabitliyə malik böyük miqdarda nümunə tutumuna malikdir, aşağı geri təzyiqlə yüksək axın sürətlərində ayırmada əla həll edir (qarşı axın sürətləri) və 1-12 arasında dəyişən pH-da işlədilə bilər. Bu tədqiqatda monomer alt bölmələri üçün 520 μg (20.8%) və 480 μg (19.2%) və Pontodrilus matsushimensis və Pheretima communissimanın trimer subunitləri üçün müvafiq olaraq 1.16 mq (46.4%) və 1.56 mq (62.4%) kimi böyük məbləğlər müəyyən edilmişdir. hər bütöv hemoglobin nümunəsindən 2,5 mq əldə edilmişdir.

Azaldılmış və azaldılmamış şəraitdə SDS-PAGE təhlillərinə əsasən, trimer alt bölməsinin hər hansı bir tərkib polipeptid zəncirindən daha yavaş miqrasiya edən Pontodrilus monomer alt bölməsi (Şəkil 2B, zolaq 5) unikal xüsusiyyət idi, çünki digər annelid hemoglobinlərin müvafiq alt bölmələri var idi. , ümumiyyətlə, trimer subunitinin üç zəncirindən daha sürətli köçdü (Vinogradov, 1985). Bundan əlavə, görünən molekulyar çəkisi Pontodrilus monomer alt vahidinin SDS-PAGE-də təxminən 18,400 Da olduğu təxmin edilmişdir. Lakin ardıcıllıqdan sonra monomer alt biriminin molekulyar kütləsinin 16,366 Da olduğu təyin edildi. Bu dəyər Megascolecidae (Suzuki, 1989 Shishikura, 1996), o cümlədən Pheretima communissima monomer zəncirləri haqqında bildirilənlərlə yaxşı uyğun gəlirdi. SDS-PAGE analizi ilə əldə edilən dəyər, buna görə də, anlaşılmazlıqdır və çox güman ki, molekulyar formada fərqlilik və SDS ilə işlənmiş aşkar xalis yüklə bağlıdır. Pontodrilus monomer alt vahidi. Şəkillər 1, 2 və 3, daha əvvəl Lumbricus terrestris hemoglobinde (Shishikura) göstərildiyi kimi, həm Pontodrilus matsushimensis, həm də Pheretima hilgendorfi hemoglobinde monomer globin alt birləşmələrinin heterojenliklərinin olduğunu göstərir. və b., 1987 Sahibkarlıq və b., 1993) kimi Rəngarəngdir hemoglobin (Suzuki və b., 1994). Bu təcrübədə hər iki hemoglobin monomerinin yalnız əsas fraksiyaları təmizləndi və ardıcıllıqla sıralandı.

Ardıcıl monomerlərin ən diqqət çəkən xüsusiyyətlərindən biri də odur Pontodrilus monomer globinin 2, 73 və 131 mövqelərində üç sistein qalığının olduğu göstərilmişdir. Annelidlərdə, A suşunun üzvünə aid olan globin zəncirləri, amino- və karboksil-terminilərdə yerləşən iki sistein qalığını ehtiva edən qorunmuş bir xüsusiyyətə malikdir. Hər iki növdəki iki sistein qalığı, annelid hemoqlobinlərin monomer alt hissələrinin məlum ardıcıllığında bildirildiyi kimi, bir disülfidlə əlaqəli zəncir təşkil edir. Bu səbəbdən, 73 -cü mövqedəki üçüncü sistein qalığı sərbəst ola bilər və Pontodrilus matsushimensis monomer globininin diqqətəlayiq xüsusiyyətidir. Bu, annelid hemoglobinlərin monomer subunitlərində üçüncü sistein qalığının mövcudluğunun ilk müşahidəsidir. Bu yaxınlarda Suzuki və b. (1990b) dərin dəniz boru qurdunun tərkib polipeptid zəncirində (AIII) üç sistein qalığının mövcudluğunu nümayiş etdirdi. Lamellibrachia (phylum Vestimentifera) hemoglobin. 74 -cü mövqedəki üçüncü sistein qalığının olduğunu göstərdilər Lamellibraxiya hemoglobin sulfid bağlama qabiliyyətinə cavabdehdir, çünki hemoglobin kifayət qədər sulfidləri daxili sulfid oksidləşdirən bakteriya simbionlarına daşımaq üçün yüksək molekulyar uyğunlaşma əldə etmiş ola bilər (Childress və b., 1987). Üçüncü sistein qalığının funksiyasını izah etmək üçün müzakirələrini birbaşa tənzimləmək çətindir Pontodrilus hemoglobin, çünki Pontodrilus matsushimensis yalnız heyvanların yaşadığı və qışda 50 sm yer altında keçirdikləri dəniz sahili mühitlərində olur (Dr. N. Takeuchi, şəxsi ünsiyyət). Hipoksik şəraitə uyğunlaşmaları ilə əlaqədar olaraq, onların adekvat 0-nı saxlamaq üçün xüsusi mexanizmlər hazırladıqlarını söyləmək olar.2 toxumaların təchizatı. Qlobin strukturları, xüsusən də geniş şoranlığa dözümlü su və ya dəniz oliqochetləri haqqında məlumatların olmamasına baxmayaraq, diqqətəlayiqdir ki, Pontodrilus Hemoqlobinin amin turşusu ardıcıllığında dərin dəniz borusu qurdu ilə müqayisədə fərqli oxşarlığı var. Lamellibrachia. Bu səbəbdən, üçüncü sistein qalıqlarının biokimyəvi mənalarını araşdırmaq maraqlı olardı Pontodrilus hemoglobinin molekulyar təkamülü üçün hemoglobin və onurğasız hemoglobinlərin fiziologiyası.

Əvvəlki əsərlər (Gotoh və b., 1987 Shishikura, 1996), hemoglobin molekullarında ortoloji bir əlaqəni paylaşan homolog subunitlərin, qurdların genetik əlaqəsini təhlil etmək üçün faydalı ipuçları olduğunu irəli sürdü. Cədvəl 1-də tam amin turşusu ardıcıllığı arasındakı faiz fərqləri və zülal məsafələri verilmişdir FeretimaPontodrilus məlum oligochaetes və polychaetes ardıcıllığı ilə müqayisədə. Üç növ arasında eyni ballar (81,6%-87,9%) Feretima çox yüksək dərəcədə oxşarlıq göstərdi və bir neçə növ qruplaşdıran Easton-un (1984) əvvəlki morfoloji tədqiqatı üçün sübut biokimyəvi dəstəyi təmin edə bilər. Feretima, o cümlədən yuxarıda üç növ Amynthas hilgendorfi növ-kompleksinə. Bu yaxınlarda Boore və Brown (1995) yer qurdlarının (Lumbricus terrestris-dən) tam mitoxondrial DNT-sini ardıcıllıqla tərtib etdilər. Həm də bu növlər arasında həm də anelidlər arasındakı genetik əlaqələri təhlil etmək üçün istifadə oluna biləcəyinə ümid edilir.

Cədvəl 1-in aşağı sol yarısında göstərilən məsafə matrislərinin UPGMA təhlili (Felsenstein, 1993) təkamül saatı fərziyyəsi ilə köklü bir ağac yaratdı (Şəkil 6). Eyni ağac topologiyası qonşu-birləşmə analizi ilə əldə edilmişdir (Felsenstein, 1993). Bu köklü ağac, annelidlərin ənənəvi filogeniyasına təsadüf edirdi. Bundan əlavə, anelid hemoglobinin monomer alt birimlərinin təkamül nisbətləri, Oligochaeta və Polychaeta arasındakı fərqin təxminən 450 milyon il əvvəl meydana gəldiyi fərz edilərək hesablanmışdır (Fushitani və b., 1988). Bu, 62.5 milyon il əvvəl Pheretima Communissima və Pheretima hilgendorfi, Pheretima sieboldi və digər iki növün təxmini ayrılıq vaxtını verdi. Feretima 83.3 milyon il əvvəl və bu Pontodrilus və üç növ Feretima 208.8 milyon il əvvəl. Çox yaxın növlər olsa da Feretima təhlil edildikdə, annelid hemoglobinin monomer alt hissələrindən alınan amin turşusu ardıcıllığı məlumatlarından istifadə edərək təkamül fərqlilik nümunələrinin öyrənilə biləcəyi aydın şəkildə göstərildi.


MÜZAKİRƏ

4.1. CaM Allostery -nin təyin edilməsi

Ca 2+ bağlanması zamanı CaM-in allosterik davranışına daxil olmaq üçün dörd EF əlini əhatə edən peptidlərin Ca 2+-dan asılı davranışının ümumi görünüşünü götürürük. Ca 2+ ilə qarşılıqlı əlaqədə olduqda, EF-4 ilk olaraq Ca 2+ qəbul edərək cavab verir, belə ki, triptik peptid 127-148 (Şəkil S4b) və kimotriptik peptid 125-138 üçün qorunmanın artması müşahidə olunur (Şəkil 4c). Qorunma daha sonra [Ca 2+]: [CaM] arasında azalır

1.5, 76-90 (Şəkil S3a) və 107-126 (Şəkil S3b) peptidləri ilə təmsil olunan iki çevik bağlayıcı daha çox məruz qaldıqda. Üstəlik, 38-74 bölgəsinin modifikasiyası [Ca 2+ ]:[CaM] qədər artmağa davam edir.

1.7 (Şəkil 5a), burada EF-4 Ca 2+ bağlamasını tamamlayır (Şəkil 4c və Şəkil S4b) və EF-3-də bağlama hələ də davam edir (Şəkil 4a və S4a). Əhəmiyyətli odur ki, 38-74, 76-90 və 107-126 peptidləri üçün qorunma itkisi EF-4 və EF-3-ün Ca 2+ ilə bağlanması zamanı baş verir. Peptid 38-74 EF-2-ni əhatə edir (Şəkil 1) və onun davranışı Ca ilə bağlandıqda CaM allosteriyasını ortaya qoyur. LITPOMS nəticələri, EF-3 və EF-4-də Ca 2+ bağlanmasının EF-2 (və zülalın digər hissələri) üçün uyğun bir dəyişikliyə səbəb olduğunu və onu sonrakı Ca 2+ bağlanması üçün hazırladığını göstərir.

Titrləmə [Ca 2+ ] qədər davam etdikcə:[CaM]

5.0, CaM-in əksəriyyəti LITPOMS tərəfindən 38-74, 76-90, 91-106, 107-126 və 127-148 peptidləri üçün tutulduğu kimi açılmışdır. Bu vaxt, EF-1 (triptik peptid 14-30 ilə örtülmüşdür) Ca 2+ bağlamağa başlayır (Şəkil 3a). Əyrilər həmçinin Ca 2+ ilə CaM bağlanmasında dörd EF əlinin kooperativ xarakterini ortaya qoyur. [Ca 2+]: [CaM] > 15 olduqda, sonrakı titrləmə mərhələlərində, bütün LITPOMS cavabları Ca 2+ ilə doyma olduğunu demək olar ki, sabit olur. LITPOMS cavablarını [Ca 2+] funksiyası olaraq izləmək, peptiddə və hətta amin turşu səviyyələrində (şəkil 5b-də M51) Ca 2+ bağlanma dinamikası haqqında bizə məlumat verir ki, bu da aşağı-orta qətnamə yanaşmaları ilə əldə edilə bilməz. (məsələn, proteolitik ayaq izi 40 və floresans 15).

4.2. Kalsiumun bağlanma əmrinin təyin edilməsi

Ca 2+-nın CaM ilə bağlanması qaydası ilə bağlı uzun müddətdir davam edən mübahisələr olmuşdur. Dörd EF-əli iki lobda mövcuddur, N-terminal lobda EF-1 və EF-2, C-terminal lobda EF-3 və EF-4. Erkən tirozin floresans və terbiyum luminescent tədqiqatları əvvəlcə N-terminal lobunda, sonra C-terminal lobunda bağlanma olduğunu irəli sürdü. 41 Daha sonra, xromofor şelatorlu bir bağlama təhlili, dörd bağlanma yaxınlığına N-terminal lobundan əvvəl C-terminal lobuna nisbətən altı qat daha yüksək kalsium yaxınlığı verir. 10 Sonradan, mutasion tədqiqatların və triptofan floresansının nəticələri bağlama əmrinin EF-3 > EF-4 > EF-1 və#x0003e EF-2 olaraq tənzimlənməsinə imkan verdi. 42 Eyni dörd yerlik mutantlardan istifadə edərək, izotermik titrləmə kalorimetriyası bağlanmanın əvvəlcə C-terminal lobunda baş verdiyini təsdiqlədi. 17 Bu günə qədər bu, qəbul edilmiş məcburi sifarişdir, baxmayaraq ki, digər mutasiyalar düzəlişlərə səbəb ola bilər. Aşağı rezolyusiyaya malik flüoresans, lakin bu nəticələrin etibarını məhdudlaşdırır. Ye et al. 18, bir iskele zülalına ayrı-ayrılıqda dörd kalsium döngəsi aşıladı və nəticədə dörd döngənin daxili bağlanma yaxınlığının EF-1 və#x0003e EF-3 və#x0003e EF-2 və#x0003e EF-4 olaraq sıralandığı qənaətinə gəldi. Bununla birlikdə, dörd EF-əli Ca 2+ bağlamasında tez-tez birlikdə işlədikləri üçün kalsium bağlama əmrlərini daxili bağlama yaxınlıqlarını müqayisə edərək təyin etmək risklidir. Beləliklə, kalsiumun bağlanma qaydası həll olunmamış qalır.

LITPOMS bu vacib suala cavab vermək üçün yeni bir yanaşma təklif edir. Ca 2+ binding increases protection (decreases reactivity) at a binding site owing to spatial hinderance. Thus, comparing the onset point of the LITPOMS decay as a function of [Ca 2+ ] affords the binding order. Although previously we suggested a binding order of EF-4 > EF-3 > EF-2 > EF-1 by ranking four tryptic peptides, 33 the order for EF-3 and EF-2 is competitive and thus ambiguous owing to entanglement of LITPOMS decay curves for regions 91-106 and 38-74. The entanglement is due to broad coverages of these peptides, where part of a region opens and part tightens. The order was eventually assigned by the early onset of EF-3.

Elevated spatial resolution for each EF-hand can give more accuracy. We chose peptides 125-138, 90-99 and 14-30 that cover primarily calcium loops of EF-4, EF-3 and EF-1, respectively (no peptides or resolved residues for calcium loop of EF-2 were captured). Fortunately, residue M51 is close to the calcium loop of EF-2 and exhibits binding-induced protection, and we chose it for comparison.

To illustrate better calcium binding orders for each EF-hand, plots of the decay region for four candidates were normalized to 1 and plotted together ( Figure 6 ). Clearly, the first binding occurs at EF-4 (peptide 125-138) whereas EF-1 binds last (peptide 14-30). Curves for EF-3 and EF-2 are now well separated at the early stage of the titration, clearly indicating that EF-3 binds prior to EF-2. With improvement of LITPOMS, the overall binding order can be confidently assigned as EF-4 > EF-3 > EF-2 > EF-1.

Normalized (to 1) peptide-level LITPOMS responses for selected peptides and residue showing increases in protection (decreases in modification) for peptides 125-138, peptide 90-99, residue M51 and peptide 14-30 representing EF hands 4 – 1 of CaM, respectively. The insert shows expanded decreases in modification for peptide 90-99, residue M51 and peptide 14-30. Data are averages of two independent runs, and error bars are standard deviations and are normalized accordingly. The relatively large standard deviations for EF-3 (90-99) are discussed in SI.

4.3. Measuring Site-specific Binding Affinity

In addition to assessing binding orders, another LITPOMS advance is the determination of site-specific binding affinities. This is particularly important for signaling proteins whose binding stoichiometry is usually greater than 1, and the affinities for different binding sites may differ significantly owing to allostery. 1 Current approaches are mainly based on optical methods, requiring specific fluorophores for signal enhancement but giving limited spatial resolution. 10 LITPOMS, however, delivers site-specific binding affinities with mid-to-high structural resolution. We previously communicated that affinities for EF-2 and 3 agree with literature values within a factor of 1.6, and EF-1 and 4 are within a factor of 20. 10, 33 Binding within each lobe (N-terminal lobe of EF-1 and EF-2, C-terminal lobe of EF-3 and EF-4) is positively cooperative, consistent with previous conclusions.

In this work, the binding affinities obtained from fitting the eight original tryptic peptides were adopted to reconstruct simulation curves for the newly obtained LITPOMS curves of chymotryptic peptides ( Figure 4a , ​ ,4c 4c and ​ and4d) 4d ) and residues ( Figures 2a – b , ​ ,3b 3b – d , ​ ,4b, 4b , ​ ,5b 5b – d , S4c𠄿). The current fitting algorithm cannot fit all available LITPOMS responses thus, the newly obtained LITPOMS responses were not part of the fitting. The reconstructed simulations for these newly obtained LITPOMS responses agree well with the data, indicating confidence in the binding affinities and the LITPOMS approach. It is possible that the values determined here are more accurate than those in the literature.

4.4. Dissecting the Composite Behavior

In general, spatial resolution can be elevated by tracking smaller peptides, obtainable by either a combination of multiple enzymes to cleave differently the protein or by fragmentation in MS 2 accompanied by improved LC separation.

Class IV tryptic peptides 38-74, 91-106 and 127-148 behave compositely because the peptides are long and represent regions undergoing multiple conformational changes (e.g., peptide 127-148 covers the calcium loop and F-helix of EF-4). These two structural motifs behave differently in the Ca 2+ titration, resulting in a composite curve. By digesting with a different protease, however, the two motifs can be cleaved into two peptides that cover each region and reveal single behavior.

Furthermore, given the irreversible labeling by FPOP, the resolution can be enhanced by tracking at the amino-acid residue level. 35� The response of peptide 38-74 can be dissected by three residue-level LITPOMS curves, each showing simpler behavior. Residue M51, however, is either involved with or near an allosteric site, as seen from its “up and down” modification behavior. The promise of increased spatial resolution motivates the development of new FPOP reagents that provide complementary labeling to OH radicals, 43� even of residues directly involved in binding.

4.5. Probing Local Conformational Changes in Calcium Loop

The elevated spatial resolution allows differentiating direct binding sites from those not directly involved in binding, even in a calcium loop. Residue Y138 sits in the calcium loop of EF-4. Binding of Ca 2+ tightens the loop by chelating with negatively charged residues and protecting them. Tyrosine, however, is not involved in Ca 2+ chelation and becomes less protected upon binding owing to a structural transition of the calcium loop whereby the SASA of the unbound at 23 Å 2 becomes 50 Å 2 in the bound form. Residue-level LITPOMS successfully captures these transitions, as demonstrated in Figure S4d.

4.6. Advancing LITPOMS over Other Approaches

Another hydroxyl radical-based protein footprinting approach utilizing synchrotron radiation was previously applied to a Ca 2+ binding protein. With an X-ray exposure time of 80 ms, Chance and coworkers followed structural transitions of gelsolin upon Ca 2+ titration and successfully identified a three-state activation process. 22� Moreover, three classes of residues/peptides were identified, which become more and less protected while titrating with Ca 2+ . Although conceptually similar, the synchrotron footprinting does not reveal composite behavior or the relative timing of change from one region to another. This may be because the timescale for footprinting by LITPOMS is shorter by two orders of magnitude.

Quantitative measurements of protein ligand interactions by HDX were pioneered in the SUPREX 21 and PLIMSTEX 19 methods, both of which were brought to regional-level spatial resolution by protease digestion. 46 HDX detects changes of SASA by probing the changes in hydrogen bonding. Protein conformational changes, however, do not necessarily associate with re-organization of its hydrogen bonding pattern. In an HDX study that compares Ca 2+ -free and Ca 2+ -bound CaM, kinetic curves successfully reveal the binding regions of Ca 2+ in CaM, whose deuterium uptake decreases upon Ca 2+ binding. HDX fails to probe regions that open-up, whose SASA increases upon Ca 2+ binding. 47 Ca 2+ -binding tightens the calcium loop in an EF-hand, which strengthens the hydrogen bonds in the backbone. Structural opening of E and F helices, however, is due to changes in their interhelical angles that is not easily captured by HDX. FPOP is more sensitive to subtle changes in the SASA of amino acid side chains, making it suitable to probe such structural transitions.

In addition to HDX and free radicals, slower reacting reagents such as GEE 24 and BHD 25 also shed light on this field. Negative-charged side chains of D and E in the calcium loop of EF-hands are the actual binding motifs that chelate with the positive-charged Ca 2+ . GEE 48 and BHD 25 footprinting of CaM reveal decreases in modification extents for D and E that located in the calcium loop upon Ca 2+ binding, but these changes have not yet been followed in a titration format and composite behavior not seen.

A binding site that has a fast off-rate can show noticeable convergence in footprinting if the labeling time is slow. The result is a reduction in the difference in labeling between bound and unbound states. Calcium off-rate constants for interacting with CaM range from 10 to 4000 s 𢄡 , 15, 49� making the off-rate timescale for Ca 2+ binding fast, in the range of 200 μs to 100 ms. For HDX, which labels the protein over exchange times of minutes to hours, problems in convergence occur. 19 Similar slow timescales apply to GEE labeling, where the reaction times for protein and reagent can be up to an hour. 24 Other spectroscopic methods such as fluorescence and circular dichroism, even though their detection timescales are often shorter than the ligand off-rates, cannot afford the detailed structural information afforded by LITPOMS. 10 LITPOMS, for the first time, combines high resolution with an ultra-short timescale for footprinting. The labeling time of hydroxyl radical-based FPOP is in the sub-millisecond range, which is comparable or even shorter than the calcium off-rates, 34� allowing structural details to be revealed at high spatial resolution without diminishing the footprint between bound and unbound states.


Mücərrəd

Many proteins and proteolytic peptides incorporate the same post-translational modification (PTM) at different sites, creating multiple localization variants with different functions or activities that may coexist in cells. Current analytical methods based on liquid chromatography (LC) followed by tandem mass spectrometry (MS/MS) are challenged by such isomers that often coelute in LC and/or produce nonunique fragment ions. The application of ion mobility spectrometry (IMS) was explored, but success has been limited by insufficient resolution. We show that high-resolution differential ion mobility spectrometry (FAIMS) employing helium-rich gases can readily separate phosphopeptides with variant modification sites. Use of He/N2 mixtures containing up to 74% He has allowed separating to >95% three monophosphorylated peptides of identical sequence. Similar separation was achieved at 50% He, using an elevated electric field. Bisphosphorylated isomers that differ in only one modification site were separated to the same extent. We anticipate FAIMS capabilities for such separations to extend to other PTMs.


Videoya baxın: Amino Asit Nedir? Ne işe Yarar? (Yanvar 2023).