Məlumat

NaCl su məhlulunda DNT lifləri üzərində duzun çökməsini gözləyərdimmi?

NaCl su məhlulunda DNT lifləri üzərində duzun çökməsini gözləyərdimmi?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bu yaxınlarda biokimya dərsimdə bir sınaq keçirdim, burada distillə edilmiş suya, izotonik duzlu suya və 2.5M NaCl -ə DNT əlavə etməli olduq. Mən həlledicidən asılı olaraq müxtəlif fiziki aspektləri müşahidə etdim, lakin onları necə təsnif edəcəyimi bilmirəm. Gördüyüm budur:

  • Distillə edilmiş: lifli çöküntü, buludlu maye
  • İzotonik: Düzünü desəm, burada bir dəyişiklik hiss etmədinizmi? Bəlkə də kifayət qədər sərt görünmürdüm
  • 2.5M: dib çöküntü və liflər

Mən bilirəm ki, DNT qütbdür, buna görə həlledicinin polaritesi artdıqca həllolma qabiliyyəti də artmalıdır. Ancaq xatırladığım üçün 2.5M duzlu suda və distillə edilmiş suda gördüklərim çox da fərqlənmədi. Bununla belə, həmişə qeyri-dəqiq müşahidələrə səbəb olan bəzi eksperimental səhvlərə yol verə biləcəyim ehtimalı var.

Beləliklə, kimsə bu həlledicilərin hər birində DNT -nin həll olunmasını (sadəcə həll olunan/həll olunmayan) təyin etməyimə kömək edə bilərmi və ya oxuya biləcəyim bir kağıza istinad edə bilərmi? Əvvəlcədən təşəkkürlər!


Hüceyrədən DNT-nin çıxarılması prosesi biotexnologiyada bir çox laboratoriya prosedurları üçün ilk addımdır. Alim, DNT -nin parçalanmaması üçün DNT -ni hüceyrənin lazımsız maddələrindən kifayət qədər yumşaq bir şəkildə ayıra bilməlidir.

Aşağıdakı prosedurdakı bəzi addımların səbəbini anlamaq həm maraqlı, həm də vacibdir. Soğandan istifadə olunur, çünki tərkibində az nişasta var və bu, DNT-nin aydın şəkildə görünməsinə imkan verir. Duz, DNT -nin mənfi fosfat uclarını qoruyur, bu da uclarının yaxınlaşmasına imkan verir ki, DNT soyuq bir spirt həllindən çökə bilsin. Yuyucu maddə, hüceyrə lipidlərini və zülallarını həll edərək hüceyrə membranını bir -birinə bağlayan bağları pozaraq hüceyrə membranının parçalanmasına səbəb olur. Yuyucu maddə daha sonra bu lipidlər və zülallarla komplekslər əmələ gətirir və bu da məhlulun çöküntüsünə səbəb olur.


Xromatoqrafiya

Sütun xromatoqrafiyası zülalların təmizlənməsinin ən geniş yayılmış üsullarından biridir. Bu saytdakı bir çox texnika kimi, bir elm qədər bir sənət növüdür. Proteinlər xüsusiyyətlərinə görə çox fərqlidir və fərqli sütun xromatoqrafiyası bu fərqlərdən istifadə etməyə imkan verir. Bu üsulların əksəriyyəti zülalların denaturasiyasını tələb etmir.

Ümumiyyətlə, bir zülal, müəyyən bir xüsusiyyətə (ölçüsü, yükü və ya tərkibi kimi) əsaslanaraq zülalların keçməsini yavaşlatmaq üçün nəzərdə tutulmuş bir sütundan keçir.

Zülalın təmizlənməsi üçün üç əsas addım var:

1. Tutmaq. Zülalınızı konsentrat bir forma almalısınız. Məsələn, bir E. coli hüceyrəsində sintez etdiyiniz bir zülalı təcrid etməyə çalışırsınızsa, 1: 1.000.000 nisbətində zülal -zibil nisbətinə baxa bilərsiniz. Tutmanın təmizlənməsi üçün yüksək tutumlu üsula ehtiyacınız var ki, bu da sürətlidir. Tez bir üsula ehtiyacınız var, çünki xam məhlulunuz çox güman ki, proteazları da ehtiva edir və bunlar zülalınızı tez çeynəyə bilər.

2. Orta. Aralıq təmizləmə həm sürət, həm də yaxşı həll tələb edir.

3. Cilalama. Təmizlənmənin son mərhələsi üçün həm yaxşı qətnamə, həm də sürətə malik bir sistemə ehtiyacınız var. Bu mərhələdə tutum adətən əhəmiyyətsizdir.

Daha çox yayılmış sütunlardan bəziləri bunlardır:

IEX: İon mübadiləsi xromatoqrafiyası. Tutmaq, aralıq və cilalamaq üçün yaxşıdır.

HIC: Hidrofobik qarşılıqlı əlaqə sütunu. Aralıq təmizləmə üçün yaxşıdır.

AC: Yaxınlıq xromatoqrafiyası. Tutmaq və ara təmizləmək üçün yaxşıdır.

GF: Gel filtrasiyası (ölçü istisna olmaqla) xromatoqrafiyası. Yaxşı cilalama addımı.

Bu tip sütunlara daha ətraflı baxaq.

İon mübadiləsi xromatoqrafiyası

İon mübadiləsi xromatoqrafiyası təcrid etməyə çalışdığınız zülalın yükünə əsaslanır. Zülalınız yüksək pozitiv yükə malikdirsə, onu mənfi yüklü bir sütundan keçirmək istəyəcəksiniz. Sütundakı mənfi yük müsbət yüklü zülalı bağlayacaq və digər zülallar sütundan keçəcəkdir. Daha sonra müsbət yüklü zülalınızı mənfi yüklü sütundan çıxarmaq üçün "tuzlama" adlı prosedurdan istifadə edirsiniz. Bunu edən sütun kation mübadiləsi sütunu adlanır və tez-tez sulfonlaşdırılmış qalıqlardan istifadə edir. Eyni şəkildə, mənfi yüklənmiş bir proteini müsbət yüklü bir sütuna bağlaya bilərsiniz. Bunu edən sütun anion mübadiləsi sütunu adlanır və çox vaxt dördüncü ammonium qalıqlarından istifadə edir.

Tuzlama zülalınızı sütundan çıxaracaq və ya süzəcək. Bu texnikada yüksək duz konsentrasiyası olan bir həll istifadə olunur. Duz məhlulu sütuna bağlanmada zülalla rəqabət aparacaq. Başqa sözlə, sütun, yüklənmiş zülaldan daha çox duz yükü üçün daha yüksək bir cazibəyə malikdir və bunun əvəzinə duzların bağlanması lehinə zülalı sərbəst buraxacaq. Zəif ion qarşılıqlı təsirləri olan zülallar daha aşağı bir duzda çıxacaq, buna görə də tez -tez bir duz qradiyenti ilə elüt etmək istəyəcəksiniz. Fərqli zülallar fərqli duz konsentrasiyalarında elut edir, buna görə də zülalınızın xüsusiyyətlərini yaxşı bildiyinizə əmin olmaq istərdiniz.

PH -dakı dəyişikliklərin zülal yüklərini dəyişdirdiyini də unutmayın. Zülalınızın izoelektrik nöqtəsini bildiyinizə əmin olun (izoelektrik nöqtə bir zülal yükünün sıfır olduğu pH -dır) və sisteminizin pH -nın buna uyğun olaraq tənzimləndiyinə və tamponlandığından əmin olun.

Bir ion mübadiləsi sütununun istifadəsinin əsas addımları bunlardır:

1. Sütunu hazırlayın. Tələb olunan pH-a bərabər olduğundan əmin olmaq üçün buferinizi sütunun üzərinə tökün.

2. Protein həllini yükləyin. Məhluldakı bəzi zülallar bağlanmır və bu yükləmə fazasında süzülür.

3. Tuzlayın. Bağlı zülalları çıxarmaq üçün duz konsentrasiyasını artırın. Fərqli ion qüvvələri olan zülalları tədricən elut etmək üçün bir duz gradientindən istifadə etmək yaxşıdır. Sonda bütün zülalların sütundan çıxdığından əmin olmaq üçün çox yüksək bir duz konsentrasiyası (2-3M) olan sistemi vurun.

4. Duzları çıxarın. Protein məhlulundan duzları çıxarmaq üçün dializdən istifadə edin.

Temperaturun sütun kimyasına böyük təsiri yoxdur. Bununla belə, zülallar daha sabit soyuq olduğundan soyuq işləmək daha yaxşıdır.

Hidrofobik qarşılıqlı xromatoqrafiya

İon mübadiləsi xromatoqrafiyası, onları təcrid etmək üçün zülal yüklərinə güvənirsə, hidrofob qarşılıqlı təsir kromatoqrafiyası bəzi zülalların hidrofob xüsusiyyətlərindən istifadə edir. Zülaldakı hidrofobik qruplar sütundakı hidrofob qruplara bağlanır. Zülal nə qədər hidrofob olsa, sütuna o qədər güclü bağlanar.

Zülalları yüksək miqdarda ammonium sulfat olduqda yükləyin (yox ammonium başınasulfat). Ammonium sulfat xaotropik bir maddədir. Suda xaosu (entropiyanı) artırır və bununla da hidrofobik qarşılıqlı təsirləri artırır (su nə qədər nizamsız olarsa, hidrofobik qarşılıqlı təsirlər də bir o qədər güclü olar). Ammonium sulfat zülalları da stabilləşdirir. Beləliklə, HIC sütununun istifadəsi nəticəsində zülalınızın ən sabit formada olmasını gözləyə bilərsiniz.

Hidrofob sütun bir fenil agaroz matrisi ilə doludur. Yüksək duz konsentrasiyası olduqda, bu matrisdəki fenil qrupları zülalların hidrofobik hissələrini bağlayır. Duz konsentrasiyasını azaltmaqla və ya həlledicilər əlavə etməklə müxtəlif sütuna bağlı zülalların elüsyonunu idarə edə bilərsiniz.

Affinity xromatoqrafiyası.

Affinity xromatoqrafiyası, bir zülalın bir sütuna bağlanması üçün bioloji funksiyalarına əsaslanır. Ən çox yayılmış növ bir ligand, xüsusi kiçik bir biomolekulu əhatə edir. Bu kiçik molekul immobilizasiya edilir və selüloz və ya poliakrilamid kimi bir sütun matrisinə yapışdırılır. Hədəf zülalınız daha sonra sütundan keçir və ona ligand tərəfindən bağlanır, digər zülallar isə ayrılır. Hədəf zülalınızın təmizlənməsi ümumiyyətlə sərbəst ligand konsentrasiyası yüksək olan sütundan keçməklə aparılır. Bu, çox səmərəli təmizləmə üsuludur, çünki o, fermentin substrata yaxınlığı kimi hədəf zülalınızın bioloji spesifikliyinə əsaslanır.

Gel filtrasiyası (ölçü istisna olmaqla) xromatoqrafiya d

Gel filtrasiyası və ya ölçü istisnası, xromatoqrafiya zülalları ölçülərinə görə ayırır. Sütun incə məsaməli muncuqların matrisi ilə doludur.

Bir ələk kimi işləyir, əksinə. Muncuqların içərisində çox kiçik deşiklər var. Zülal məhlulu sütuna töküldükcə kiçik molekullar muncuqlardakı məsamələrə daxil olur. Daha böyük molekullar deşiklərdən xaric edilir və muncuqlar arasında sürətlə keçir.

Bu daha böyük molekullar əvvəlcə süzülür. Kiçik molekullar, boncukdan boncuka qədər uzanan məsamələrin labirintində dəfələrlə ilişib qaldıqları üçün daha uzun bir səyahət yolu var. Bu kiçik molekulların sütundan keçmələri daha uzun çəkir və son olaraq ayrılır.


Fon

Silisium əsaslı bərk faza sütunlarından DNT ekstraksiya dəstləri tez-tez həm protein denaturant, həm də NA adsorbsiyasını təşviq edən kofaktor kimi xidmət edən xaotropik tampondan istifadə edir. Xaotrop, sulu bir mühitdə hidrogen bağlanmasını pozan və su molekullarını pozan bir iondur [14]. Bu ionlar zülalların həll olunma qabiliyyətini artırmaq qabiliyyətinə görə Hofmeister seriyasında sıralanır. Beləliklə, həm hidratasiya qarşılıqlı təsirləri, həm də spesifik ion effektləri Hofmeister seriyasının sırasını diktə etməkdə əsas rol oynayır [15,16]. Sadə elektrolit məhlullarında, yükə nəzarət edərkən, bu nizam müəyyən bir ionda yükün lokalizasiyası ilə özünü göstərir [17]. Xaotropik ionlar, qonşu hidrogen bağını pozan və birbaşa suda daha yüksək protein həllinə səbəb olan artan yük delokalizasiyasını nümayiş etdirir. Nəticədə, sudakı xaotropik ionlar, adətən baza cütləşməsinin pozulması nəticəsində artan NA denaturasiyası ilə əlaqələndirilir [18]. DNT ilə əvvəlki iş göstərmişdir ki, silisium hissəciklərinin xaotrop məhlula əlavə edilməsi hissəcik səthində pH-dan asılı olan DNT adsorbsiyasına səbəb olacaqdır [19].

DNT-silika-xaotrop adsorbsiyasının pH-dan asılılığı silisium və DNT-nin səth yükündən irəli gəlir [20]. Sütun istehsal üsulundan asılı olaraq, silika səthində pH 1.5-3.6 ətrafında bir izoelektrik nöqtəsi olan tək silanolların və/və ya geminal silanolların qarışığı ola bilər [21]. Araşdırmalar iki təsirli turşu dağılmasının sabitlərini (pKasilika silanollarının pH 4.5 və 8.5 [22,23]. Fizioloji pH 7.0-7.4 olan bioloji nümunələrdən NA çıxarılması kontekstində, məruz qalan silisium səthlərin böyük əksəriyyəti nəzəri olaraq mənfi yüklərlə örtülməlidir. Üstəlik, DNT-nin pH 5-ə yaxın bir izoelektrik nöqtəsi olduğu üçün, fizioloji pH-da da mənfi olaraq yüklənir. Bu səbəbdən, yalnız elektrostatik arqumentlərdən istifadə edərək NA hasilatı sütunlarında görünən silika -DNT yaxınlığını izah etmək çox çətindir [15,16,24]. Mikrofluidik tibbi diaqnostika tədqiqatları baxımından mürəkkəb heterojen bioloji nümunələrdən NA hasilatı məhsuldarlığını tam optimallaşdırmaq üçün pH funksiyası kimi DNT, silisium və xaotrop molekullar arasında qarşılıqlı əlaqəni kəmiyyətcə qiymətləndirərək fundamental səth kimyasını başa düşməyə çalışmaq lazımdır [17].

Əvvəlki iş DNT-nin 1 μg/mL-dən çox konsentrasiyalarda DNT-silika-xaotrop qarşılıqlı təsirlərini tədqiq etmişdir [19,25,26]. Bu təcrübələrdə, yüksək girişli DNT konsentrasiyaları tez -tez silika səthini doyurdu [19,26]. Beləliklə, bu nəticələrdən silisium səthini doyurmayan ümumi klinik nümunələr üçün NA ekstraksiya protokollarına ekstrapolyasiya etmək çox çətindir: məsələn, sidik, plazma və onurğa beyni mayesinin DNT konsentrasiyası 40-200 ng/ml, 17 ng olur. /ml və müvafiq olaraq 3 ng/ml DNT [13,27,28]. Beləliklə, məhlulda olan DNT məhdudlaşdırıcı reagent olduqda, DNT-silika-xaotrop qarşılıqlı təsirini başa düşmək vacibdir. Kiçik məsamələri olan miniatürləşdirilmiş silisium sütunlarının istifadəsi seyreltilmiş NA nümunələri üçün daha səmərəli adsorbsiya və elüsyona səbəb ola bilsə də, bu sütunlar zülallar, lipidlər və karbohidratlar kimi digər biomolekullar tərəfindən tıxanmağa və ya səthi passivləşdirməyə həssas ola bilər [12,29].

Burada, biz pH funksiyası kimi klinik cəhətdən müvafiq DNT konsentrasiyalarında DNT-silika-xaotrop qarşılıqlı təsirlərini xarakterizə etməyi hədəfləyirik. 3, 5.2 və 8 pH dəyərləri pK əsasında seçilmişdira silisium səthi qruplarının dəyərləri, DNT-nin depurinasiyası (pH 2-dən aşağı) və silisiumun əriməsi (pH 8-dən yuxarı) [30]. Silika səthindən DNT adsorbsiyası və elüsyonu, NA -ları insan nümunələrindən təcrid edən ticarət dəstlərində və inteqrasiya olunmuş POC diaqnostik cihazlarında çox istifadə olunanları təqlid edən şərtlərdə ölçülmüşdür [31-33]. Bununla birlikdə, tarazlığın əldə olunduğundan əmin olmaq üçün DNT və silika hissəciklərini əksər test protokollarının tələb etdiyi müddətdən xeyli uzun müddət inkubasiya etdik. Araşdırmamızın əhatə dairəsini daha da cəmləşdirmək üçün yalnız bioloji analizlər üçün hazırlanan ticari silika hissəciklərini və A-faj DNT-ni giriş NA hesab etdik. Nəhayət, guanidinium üçün istifadə olunan xaotropları məhdudlaşdırdıq (CH6N.3 və ya Gu) və tiosiyanat (SCN) ionları, adətən kommersiya NA ekstraksiya dəstlərində istifadə olunur [4,34].


NaCl/pH -nın Pulse Qığılcım Deşarjının İstehsal etdiyi Kolloid Nanogolda Etkisi

Bu tezisdə koloidal qızılı sintez etmək üçün nəbzli qığılcım axıdılması (PSD) istifadə edən yaşıl bir üsul öyrənilmişdir. PSD, deionlaşdırılmış suda (DIW) və/və ya etanolda (EtOH) qızıl nanohissəcikləri (AuNPs) sintez etmək üçün qığılcım axıdılmasından istifadə edir. Qızıl nanohissəcikləri bir çox sahələrdə, xüsusən də insan orqanizmi üçün geniş tətbiq olunsa da, istifadə zamanı NaCl və pH dəyərinin təsirini dəf etməlidir, buna görə də bu tədqiqat insan bədənini simulyasiya etmək üçün onun sabitliyini öyrənmək üçün PSD-AuNP-lərə NaCl əlavə edir. Bundan əlavə, AuNP-lər üçün ən yaxşı qoruyucu təyin etmək və bioloji cəhətdən uyğun potensialı yaxşılaşdırmaq üçün müxtəlif qoruyucu maddələr əlavə olunur. Bu tədqiqatın nəticələrinə əsasən, uzun zəncirli polimer Karboksimetilselülozun (CMC) və ya Polivinil pirolidonun (PVP-k30) əlavə edilməsi nanoqoldun NaCl-də və ya fərqli pH dəyərində yığılmasının və çökməsinin qarşısını ala bilər və nanoqold dispersiyasının xüsusiyyətlərini saxlaya bilər. hissəciklər arasında itələyici qüvvə. Bu araşdırmanın nəticələri nanogoldun biyomedikal elmdə tətbiqinə istinad ola bilər.

1. Giriş

Pulse qığılcımı boşalması (PSD) metodu işlənib hazırlanmış və AuNPs məhlulunu [1-5] hazırlamaq üçün istifadə edilmişdir ki, bu da deionlaşdırılmış su və ya etanola batırılmış iki qızıl elektroddan [6-8] nəbz cərəyanının keçməsini nəzərdə tutur. AuNP-lərin istehsalının bir çox üsullarına qızıl hissəciklərinin dayandırılmasını yaxşılaşdırmaq üçün səthi aktiv maddələrin tətbiqi daxildir. Bununla belə, heç bir səthi aktiv maddələr və ya stabilizatorlar olmadan deionlaşdırılmış suda və ya etanolda impuls qığılcım atılması (PSD) üsulu ilə hazırlanmış qızıl nanohissəciklər sabit kolloid kimi xarakterizə olunur və uzun müddət şüşə qabda otaq temperaturunda görünən çökmə olmadan saxlanıla bilər ( görünən çöküntü yoxdur). DIW_nanogold insan orqanizmi üçün təhlükəsizdir, məsələn, hədəf terapiya və dərman daşıyıcıları bu tədqiqatda NaCl və pH testi daxilində kolloid qızılın [9-13] sınaqları və nəticələrini simulyasiya edəcək.

Qızıl nanohissəcikləri insan orqanizmində geniş tətbiq edilir, lakin NaCl və pH dəyərinin təsirlərini aradan qaldırmağı tələb edir. Qızıl sayı [14] 1 sm 3 10% NaCl əlavə edilmiş 10 sm 3 qızıl məhlulunun yığılmasının qarşısını almaq üçün tələb olunan polimerin miqdarı (mq) kimi müəyyən edilir. Bu tədqiqat həmçinin potensial kolloid qızıl stabilizatorlarının qızıl sayını müəyyən etmək üçün effektiv qızıl sayı metodunu təklif edir (burada aparılan təcrübədə Zsiqmondinin [15] metodunun daha səmərəli variantı aparılır). Əlavə edilən səthi aktiv maddənin miqdarını dəyişdirmək əvəzinə, artan miqdarda NaCl, 0.1 mq stabilizatoru olan kolloid qızıl məhluluna əlavə olunur və bununla da davamlı titrasiyalar simulyasiya olunur. Ayrıca, AuNP -lərin fototermal təsiri xərçəng müalicəsi olaraq da istifadə edilə bilər [16]. Üstün bioloji piezoelektrik biosensorları, biyouyumluluq, elektrik keçiriciliyi və nanoqold hissəciklərin yüksək səth sahəsi vasitəsilə istehsal etmək olar [17]. Nanohissəciklərin xüsusiyyətləri metallara tətbiq olunaraq katalitiklərin faydalı reaksiyasını verə bilər [18]. Bu tədqiqat, bioloji cəhətdən uyğun potensialın yaxşılaşdırılması üçün müxtəlif bioloji cəhətdən uyğun qoruyucu vasitələr altında DIW_nanogoldun qızıl nanohissəciklərinə təsirini müzakirə etmək üçün NaCl -də insan orqanizmini və ya normal duzlu suyu simulyasiya edir. Digər üsullarla hazırlanmış qızıl nanohissəciklərinin (DIW_nanogold, chem._nanogold və etanol nanoqold) pH dəyərinin dayandırılmasına təsiri və dəyişmələri, həmçinin absorbsiya və dalğa uzunluğu dəyişiklikləri müqayisə edilir.

2. Eksperimental Quraşdırma

Bu iş, inkişaf etmiş PSD sistemini bir hazırlıq üsulu olaraq istifadə edir, üst və alt elektrodlar olaraq nanometal materiala çevriləcək bir çubuq materialı (Au) istifadə etməkdir, bu səbəbdən iki elektrod arasında birbaşa təmas yoxdur, buna görə heç bir fiziki İkisi arasında çıxarılan qüvvə ancaq elektrik enerjisi istifadə edilərək istilik enerjisinə çevrilərək, bir növ isti ərimə üsulu ilə elektrodun sürətlə əriməsi yaradılır. Palata əsas emal mərkəzidir. Yaxşı izolyasiya qabiliyyətinə malik olan deiyonlaşdırılmış su və ya etanol dielektrik maye kimi istifadə olunur. Yaranan nanohissəciklərin bərabər yayılmasına və birbaşa dielektrik maye içərisində saxlanılmasına səbəb olmaq üçün üst və alt elektrodlar dielektrik mayenin içinə batırılır.

2.1. NaCl Testinə hazırlıq

Cədvəl 1 -də göstərilən on dörd agent qızıl koloidal süspansiyonu saxlamaq qabiliyyətləri üçün sınaqdan keçirildi. NaCl simulyasiyası ilə insan bədənindəki mayelərdəki nisbətlərə bənzər nisbətlərdə (0,9%) və ya normal duzlu suda NaCl nisbəti ilə koloidal qızıl yüksək konsentrasiyalı NaCl məhlulu ilə qarışdırılır və nəticədə

AuNP-lərin səth elektrik potensialına hücum edən ionlar. Zeta potensialının itirilməsi ilə nanohissəciklər qarşılıqlı itələmə və aqlomeratını itirirlər. Zeta potensialının məhv olmasının qarşısını almaq üçün, qızıl koloidin ionla zəngin bir məhlulda yaşaya bilməsi üçün adekvat qoruyucu maddənin istifadəsi tələb olunur. Bu tədqiqat, PSDAuNPs-DIW aglomeratına müxtəlif qoruyucu vasitələrin (dərman tətbiqlərində istifadə üçün biocompatible olmalıdır) təsirlərini təhlil etdi və agent PSD-AuNPsDIW üçün qoruyucu vasitə kimi istifadə edilə bilər.

Əvvəlcə Au (0) nömrəli 15 konteynerin hər birinə 30 ppm kolloid qızıl məhlulundan 10 ml qoyulur.

Au (14) sonra, S (1) etiketli 0.1% (w/v) konsentrasiyası üçün 10 mL 14 D stabilizatorun 10 mq yerləşdirilməsi ilə ikinci bir dəst hazırlanır.

S(14). Sonra S (1) hər birindən 0,1 ml alınır.

Au (14) belədir ki, 0,1 mq agent var. Nəzarət həlli olan Au (0) a heç bir agent əlavə edilmir. 1 q susuz duzun 10 mL su ilə qarışığı 0,1 mL (hər dəyirmi) həcmində titrləmə üçün istifadə olunur və hər titrləmədən sonra rəng dəyişikliyi qeyd olunur. Hər turda 0,1 ml 10% NaCl həllini əlavə edin. Onuncu turdan sonra, NaCl (1/11) nisbəti, insan bədənindəki mayelərdə (0,9%) orta hesabla görülən miqdardır, buna görə də təcrübə o nöqtədə dayandırıla bilər. Davamlı titrləmə, rəng dəyişikliyi səviyyəsi ilə hansı stabilizatorun ən təsirli olduğunu göstərəcək. Şəkil 1-də (a) Zsiqmondinin metodunun və (b) Zsigmondy metodunun daha səmərəli versiyasının hərəkət sxemi təqdim olunur.

2.2. pH Testinin hazırlanması

Etanol nanogold, etanol nanogold (etanol (1/2) + DIW (1/2)), DIW_nanogold və chem._ nanogold üçün nümunə qrupu olaraq hər növ 10 ml -lik altı şüşə istifadə olunur. Hər bir nümunə qrupu turşu testləri üçün HCl və əsas testləri üçün NaOH əlavə edir, sonra pH-nın dəyişməsi, nümunə qrupunun vizual müşahidəsi, rəng dəyişiklikləri və aqlomerat müşahidə edilir. Müxtəlif qızıl nanohissəciklərinin süspansiyonu ilə pH arasındakı əlaqələri daha yaxşı başa düşmək üçün UV-Vis analizi, yığılmamış nümunələr üçün aparılır və absorbansa və dalğa ağacına pH təsirləri təhlil edilir. Şəkil 2 DIW_nanogold, chem._nanogold və etanol nanoqold üçün pH effekti analizinin axın cədvəlini təqdim edir.

3. Nəticələr və müzakirə

3.1. NaCl Testinin Nəticələri və Müzakirəsi

Cədvəl 2, hər bir səthi aktiv maddənin böyük bir rəng dəyişikliyi müşahidə edilməzdən əvvəl lazım olan turların sayını göstərir. Bir dəfə müşahidə edildikdə, artıq NaCl turu əlavə edilməmişdir.

İstinad 0 -dır: stabilizator koloidal qızılla qarışdırıldıqdan sonra rəng dəyişikliyi müşahidə olunarsa, lakin hər hansı bir NaCl əlavə edilməzdən əvvəl 0 tur qeyd olunur. Heykəllər aşağıdakı kimi təhlil edilir: (1) Duz məhlulu əlavə edildikdən dərhal sonra rəngini dəyişən nanoqold hissəcikləri: Au (6) və Au (10). (2) Toplanmış, çökmüş və ya ağa çevrilmiş nanoqold hissəcikləri: Au (2) və Au (11). (3) Mavi-bənövşəyi rəngə çevrilən nanogold hissəcikləri: Au (1), Au (3), Au (4), Au (5), Au (8), Au (9), Au (13) və Au (14) ). (4) Aqlomerasiya etməyən nanoqızıl hissəcikləri: Au(7) və Au(12).

Buna görə də CMC və PVP-k30 həllərinin kolloid nanogoldda yığılmaya qarşı ən yaxşı qorunma təmin etdiyi müəyyən edilmişdir. Bunlardan insan bədəninə heç bir zərər vermədiyi və hətta qida hissəcikləri süspansiyonunu qorumaq üçün bəzi qida maddələrində istifadə edildiyi üçün CMC daha təhlükəsiz seçimdir.

3.2. PH Testinin Nəticələri və Müzakirəsi

Şəkil 3(a), 3(b) və 3(c)-də göstərildiyi kimi HCl və NaOH şəraitində Chem._nanoqold, absorbsiya və dalğa uzunluğunun pH ilə əlaqəsi. Şəkillər 4 (a), 4 (b) və 4 (c) -də göstərildiyi kimi, HCl və NaOH şəraitində AuNPs-DIW, absorbans və dalğa uzunluğunun pH ilə əlaqəsi. HCl və NaOH vəziyyətində etanol nanoqold, 5(a), 5(b) və 5(c)-də göstərildiyi kimi absorbsiya və dalğa uzunluğunun pH ilə əlaqəsi. Cədvəl 3, fərqli nanogoldda absorbans və dalğa uzunluğunun sapmasını göstərir.


DNT Ekstraksiyasının Əsasları

Yəqin ki, genetik kod və ya həyat planı haqqında eşitmisiniz, bu terminlər DNT -yə aiddir. Heyvanlar, bitkilər və bakteriyalar da daxil olmaqla bütün canlıların hüceyrələrində DNT var. DNT, bir nukleotid zəncirindən ibarət çox uzun bir molekuldur və bu nukleotidlərin sırası, orqanizmləri öz növlərinin digərlərinə bənzər, lakin fərd olaraq fərqli edir. Genlər bu uzun DNT molekulundakı hissələrdir.

DNT -ni öyrənmək üçün əvvəlcə onu hüceyrədən çıxarmalısınız. İnsan və bitki hüceyrələri kimi ökaryotik hüceyrələrdə DNT, nüvə adlanan bir orqanoiddə xromosomlar şəklində təşkil edilir. Bakterial hüceyrələrin nüvəsi yoxdur. Onların DNT-si sitoplazmada olan halqalarda və ya dairəvi plazmidlərdə təşkil edilmişdir. DNT çıxarma prosesi DNT -ni hüceyrədən azad edir və sonra hüceyrə mayesindən və zülallardan ayırır, beləliklə təmiz DNT ilə qalacaqsınız.

DNT çıxarmanın üç əsas mərhələsi 1) lizis, 2) çökmə və 3) təmizlənmədən ibarətdir.

Addım 1: Lizis
Bu addımda hüceyrə və nüvə içərisindəki DNT -ni sərbəst buraxmaq üçün açılır və bunun iki yolu var. Birincisi, mexaniki pozğunluq hüceyrələri açır. Bu, toxuma homojenizatoru (kiçik bir qarışdırıcı kimi), havan və havan ilə və ya toxumanı kiçik parçalara kəsməklə edilə bilər. Bitki hüceyrələrindən istifadə edərkən mexaniki pozulma xüsusilə vacibdir, çünki onlar sərt hüceyrə divarına malikdirlər. İkincisi, lizis DNT -ni azad etmək və hüceyrə zülallarını həll etmək üçün Proteinase K kimi yuyucu vasitələrdən və fermentlərdən istifadə edir.

Addım 2: Yağış
Lizis mərhələsini tamamladığınızda, DNT nüvədən azad edildi, lakin indi püresi hüceyrə hissələri ilə qarışdırılır. Yağış DNT-ni bu hüceyrə zibilindən ayırır. Birincisi, Na+ ionları (natrium) DNT molekullarında olan mənfi yükləri neytrallaşdırır, bu da onları daha sabit və suda daha az həll edir. Daha sonra spirt (etanol və ya izopropanol kimi) əlavə edilir və DNT-nin spirtdə həll olunmadığı üçün sulu məhluldan çökməsinə səbəb olur.

Addım 3: Təmizləmə
İndi DNT sulu fazadan ayrıldığından, qalan istənməyən materialı və hüceyrə zibilini çıxarmaq üçün onu spirtlə yaxalamaq olar. Bu nöqtədə təmizlənmiş DNT, asan işlənməsi və saxlanması üçün ümumiyyətlə suda yenidən həll olunur.

Məqsədli Alyaska Dərəcəsi Səviyyə Gözləmələri
[9] SC1.1 Şagird bütün orqanizmlərin DNT-dən ibarət xromosomlara malik olduğunu və DNT-nin müəyyən etdiyi xromosomları qəbul etməklə, genetika, irsiyyət, təbii seçim prosesi və bioloji təkamül daxil olmaqla, zamanla həyat formalarında dəyişiklikləri elmin necə izah etdiyini başa düşdüyünü nümayiş etdirir. xüsusiyyətlər.


DNT və ribozimlərin katalitik fəaliyyətinə həlledici təsir göstərir

Üzvi həlledicilərin istifadəsi hidrofobik substratların həllolma qabiliyyətini artırmaqla DNT-zimlərin və ribozimlərin funksiyasını genişləndirə bilər. Katalitik DNT və RNT-nin in vitro seçilməsi zamanı və Diels-Alder reaksiyalarında (Seelig və Jäschke 1999 Chandra və Silverman 2008) və aldolda nisbətən az miqdarda kosolventlər (məsələn, 10 vol%-dən az olan DMSO) istifadə edilmişdir. reaksiyalar (Fusz et al. 2005) bu molekullar tərəfindən kataliz edilir. Herbisidlərin (alaklor və atrazin) iştirakı ilə DNT aptazimləri tərəfindən kataliz edilən RNA bağlama reaksiyası, 10  % metanol, etanol, DMSO, aseton və ya DMF əlavə edildikdə daha sürətli və daha yüksək məhsuldarlıqla davam edir. Birgə həlledicilər məhsulun sərbəst buraxılmasını asanlaşdıra, müəyyən strukturları sabitləşdirə, qeyri-aktiv konformasiyaların əmələ gəlməsinin qarşısını ala və/yaxud DNT və substratlar arasında əlaqəni yaxşılaşdıra bilər (Behera et al. 2013). DNT-zimlərin və ribozimlərin katalitik cəhətdən aktiv strukturları əsas cütləşmiş ikincili strukturlarla müqayisədə zəif qarşılıqlı təsirlərlə saxlanıldığından, RNT qarşılıqlı təsirini əhəmiyyətli dərəcədə pozan həlledici şərtlər istifadə üçün uyğun deyil.

RNT-nin sahəyə xas fosfodiester bağının parçalanmasını kataliz edən təbii ribozimlərin strukturlarının formalaşması su sərbəst buraxılması və metal ionlarının bağlanması ilə müşayiət olunur (Rangan və Woodson 2003 Bevilacqua və digərləri. 2004 Doudna və Lorsch 2005 Lilley 2005 Toor və digərləri 2008). Osmotik təzyiqin qurğuşundan asılı olan ribozim və saç sancağı riboziminin katalitik fəaliyyətinə təsirləri bildirilmişdir. Qurğuşundan asılı ribozim, qurğuşun adlanır, qısa bir kök halqa quruluşundan ibarətdir (Şəkil   5a) və Pb 2+ iştirakı ilə RNT parçalayır. Bu ribozim əvvəlcə təsadüfi ardıcıllıq kitabxanalarından (Pan və Uhlenbeck 1992) in vitro seçim yolu ilə yaradılmışdır və eyni ardıcıllıq motifləri maya fenilalaninə xas tRNA-da və insan mRNA-larında (Barciszewska et al. 2005) rast gəlinir. Aşağı molekulyar çəkili PEG (2.5 𠄷.5  vol%) əlavə edilməsi, 25  mM Pb 2+ varlığında 11-mer qurğuşun katalitik aktivliyini təxminən 2 dəfə artırır (Giel-Pietraszuk və Barciszewski 2012). Bu təkmilləşdirmə, kataliz zamanı suyun sərbəst buraxılmasını asanlaşdıran su aktivliyinin azalması ilə əlaqələndirilir. Hairpin ribozymes, tütün ringpot virusu kimi bitki viruslarının peyk RNT -də tapılır (Buzayan et al. 1986 Hampel and Tritz 1989). Bu ribozimlər bir substrat bağlayan domen döngəsindən və bir katalitik döngə domenindən (Şəkil   5a) ibarətdir və iki valent metal ionlarının iştirakı ilə RNT parçalayır. Aşağı molekulyar ağırlıqlı PEG-in miqdarı 10%-ə qədər artdıqca, 85-mer saç sancağı riboziminin 1'mM'Mg 2+ varlığında parçalanma sürəti bir neçə dəfə PEG artır, ehtimal ki, üçüncü qatlanmanı asanlaşdırır. su molekullarının sərbəst buraxılması ilə müşayiət olunur, halbuki bu sistemdə dielektrik sabit təsirinə dair heç bir dəlil yoxdur (Herve et al. 2006).

a Mətndə təsvir edilən ribozim quruluşları və parçalanma yerləri (qırmızı oxlar). b Çəkic başı riboziminin parçalanma sürəti sabitinin kosolventlər olmadıqda asılılığa nisbətən NaCl konsentrasiyasından asılılığının qrafikləri (S k c /S k w) dielektrik sabitinə qarşı (ε r və ya ε r 𢄡 ) 10 və ya 20 wt% cosolvents miqdarında qarışıq məhlullar (Nakano et al. 2014b). Əyri uyğunluqlar Şəkil   4f -də göstərilən hesablamaya əsasən çəkilir. c Su məhlulunda və aşağı dielektrik sabiti olan qarışıq məhlulda ribozimlərin katalitik aktiv formasının əmələ gəlməsi üçün reaksiya dövrü

Çəkic başlı ribozimlər bitki viruslarının RNT peyklərində və insanların genomları da daxil olmaqla tapılır (Bourdeau et al. 1999 Martick et al. 2008 de la Pena və Garcia-Robles 2010 Hammann et al. 2012). Bu ribozimlər üç gövdədən ibarətdir (Şəkil   5a) və ikivalentli metal ionlarının iştirakı ilə RNT-ni parçalayır (Forster və Symons 1987 Uhlenbeck 1987 Haseloff and Gerlach 1988 Martick and Scott et al. 2006e). Asetonitril, metanol, DMF, DMSO, etilen glikol və qliserol kimi kosmolventlər, 17 merli bir substratın molekullararası parçalanmasının dərəcəsi və 38 mer ribozim tərəfindən 10  mM  Mg 2+ içərisində minimal təsir göstərir. 60  vol%-dən yüksək konsentrasiyalarda bu kosolventlər parçalanma reaksiyasını tamamilə maneə törədir (Feig et al. 1998 Mikulecky və Feig 2002). Bənzər bir ribozim motifini (15-mer substratın 43-mer ribozim tərəfindən molekullararası parçalanması) istifadə edən bir araşdırma, etilen glikol törəmələrinin, kiçik birincili spirtlərin və aprotik birləşmələrin 20  wt% həllinin RNT parçalanma sürətini bir neçə dəfə artırdığını göstərdi. 10'mM'Mg 2+ və aşağı Mg 2+ konsentrasiyalarında 10 dəfədən çox olduqda (Nakano et al. 2009, 2015a). Araşdırmada istifadə olunan ribozimlərin üçüncül quruluşu çox sabit olmadığından, Mg 2+ bağlanmasının effektivliyi katalitik aktiv quruluşun və parçalanma sürətinin formalaşması üçün əhəmiyyətlidir. MgCl2 Qarışıq məhlullarda Mg 2+-nın bağlanmasının spesifik qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə həyata keçirildiyi sürətli kataliz üçün tələb olunan konsentrasiya dəyişdirilir. MgCl konsentrasiyası2 məhlulların dielektrik davamlılığı azaldıqca zəruri azalır, məsələn, konsentrasiya 20% 1,2-dimetoksietanda 10 dəfədən çox azalır (ε r =�) kosolventlərin olmaması ilə müqayisədə (Nakano et al. 2015a).

Hammerhead ribozim tərəfindən kataliz edilən reaksiyada, konsentrasiyalar kifayət qədər yüksək olarsa, iki valentli metal ionları monovalent kationlarla əvəz edilə bilər (Murray və digərləri, 1998). Na + və heç bir divalent kationun iştirakı ilə kataliz, katalitik aktiv formaya qatlanmağa kömək edən diffuzion kationlarla yüksək kooperativ və qeyri -spesifik zəif qarşılıqlı təsirlər vasitəsi ilə həyata keçirilir. Parçalanma sürəti sabitinin NaCl konsentrasiyasından asılılığı k (S k = ∂ln k/∂ln [NaCl], xətti asılılıqda) kosolventlərin iştirakı ilə dəyişdirilir (Nakano və s. 2014b). Asılılıq məhlulun dielektrik davamlılığı ilə azalır (Şəkil 5b) və çəkisi 20% 1,2-dimetoksietanda təxminən 40% daha az Na + tələb olunur.ε r  = �), kosolventlərin olmaması ilə müqayisədə. Substratın parçalanma sürətinin əmələ gələn katalitik aktiv quruluşun miqdarı ilə müəyyən edildiyini nəzərə alsaq, aktiv quruluşun meydana gəlməsi ilə Na + bağlanma dərəcəsi (∆Ψilə mütənasibdir S k) aşağı dielektrik davamlı məhlullarda azalır (S k c /S k w  <𠂑 və buna görə də ∆Ψ c /∆Ψ w   < 𠂑). Beləliklə, Şəkil 5c-dəki reaksiya dövründən istifadə edərək təhlil daha az qatılaşdırılmış qeyri-aktiv formalara daha çox Na + bağlanmasını təklif edir (∆Ψ əgər) than to the catalytic active form (∆Ψ af), analogous to the case of a duplex formation. About a 40 % decrease in Na + binding in the medium with ε r of about 60 is greater than the decreases observed for duplex formation (60� %) given in Fig.  3 , possibly because of greater Na + -induced collapse upon formation of the active structure of the ribozyme than occurs during duplex formation.

Water-soluble organic polymers are used as macromolecular crowding agents to mimic the crowded environment in cells (Minton 1998). Addition of high-molecular-weight PEG or dextran in the amount of 5� wt% enhances the RNA cleavage activity of group I ribozyme (195-mer RNA), human delta virus (HDV)-like ribozyme (76-mer RNA), and hairpin ribozyme (intermolecular cleavage of a 48-mer substrate by a 35-mer ribozyme) by several fold in a low concentration of Mg 2+ , around 1 mM (Kilburn et al. 2010 Strulson et al. 2013 Desai et al. 2014 Paudel and Rueda 2014). The rate enhancements result from increased compactness of the RNA structures through the excluded volume effect of the polymer additives. In the case of a hammerhead ribozyme motif (43-mer ribozyme and 15-mer substrate), the addition of high-molecular-weight PEG increases the cleavage rate at unsaturated concentrations but not at saturated concentrations of Mg 2+ (Nakano et al. 2009). This study showed that the Mg 2+ concentration required for fast catalysis is decreased in the presence of PEG with an average molecular weight of 8000, as is also the case for smaller cosolvents (Nakano et al. 2015a). Because polymer crowding substantially modifies the water activity and the dielectric constant (Nakano et al. 2004, 2012a), the effects of polymer additives may, at least partly, arise from changes in these solvent properties. Consistent with this possibility, values of ∆Ψ for the hybridization of 15, 25, 33, and 35 base pairs of DNA decrease linearly with the concentration of PEG with an average molecular weight of 3000 (0� wt%) (Markarian and Schlenoff 2010). It has also been reported that PEG with an average molecular weight of 8000 at 20 wt% shortens the length of a single-stranded oligonucleotide but not the length of a duplex (Nakano et al. 2008). In addition, the magnitude of the effect of polymer additives is sensitive to the ionic strength because the cation concentration affects the size of unfolded RNAs (Denesyuk and Thirumalai 2013). These results indicate that polymer solutions have effects on cation binding to nucleic acids in addition to their excluded volume effect.


Minipreps of DNA from Chlamydomonas Cultures

Try Scott Newman’s method, described in Genetics 126:875. I’ve found it quick & reliable. No problems with polysaccharides that I know of.

Here is Scott Newman’s protocol, as currently followed in the Boynton-Gillham laboratory. Cells can be grown as patches on agar plates, or as 1 ml aliquots of cells in multiwell plates.

  • Scrape cells off plate into 1.5 ml Eppendorf tube that contains 0.5 ml TEN buffer.
  • Resuspend vigorously by vortexing, spin for 10 sec. and aspirate off supernatant.
  • Resuspend cells in 150 ul H2O on ice and add 300 ul of SDS-EB buffer, vortex to mix.
  • Extract once with 350 ul phenol/CIA(1:1) for few min by vortexing, separate phases by centrifugation for 5 min., transfer aq. phase to a new tube.
  • Extract once with 300 ul CIA (24:1), transfer aq. to a new tube.
  • Add 2 volumes abs. ethanol, incubate on ice for 30 min., centrifuge for 10 min., wash pellet once with 200 ul 70% ethanol.
  • Dry pellet and resuspend in ca. 40 ul H2O. For Southern analysis use about 1-3 ul.

TEN = 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl.

SDS-EB = 2% SDS, 400 mM NaCl, 40 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0.

From Mark Buchheim, University of Tulsa
[email protected]

The following is a general mini-prep protocol we have been using to extract both RNA and DNA from green micro-algae (including lots of Chlamys). If you are not interested in the RNA, you may want to opt for a protocol that eliminates the RNA with RNAase.

  • 1. Harvest cells by centrifugation in sterile centrifuge tubes
  • 2. Wash cells in 50mM Tris HCl (pH 9.0). Discard wash.
  • 3. Resuspend and break material in 500 ul lysing buffer (Su and Gibor, 1988, Anal. Biochem. 174:650-657) with ultrasonic probe (10-20 pulses). Check cell breakage by microscopy
  • 4. Add 50 ul Guanidine HCl (8 M) to broken cell extract (precipitates polysaccharide and SDS). Vigorously mix for 1 minute
  • 5. Add equal volume (550 ul) of 49:1 in fume hood
    • mix for 2 minutes
    • spin (at max.) for 2 minutes
    • mix for 2 minutes
    • spin (at max.) for 2 minutes
    • mix for 2 minutes
    • spin (at max.) for 2 minutes
    • 21d. Add 2 volumes (800 ul) ethanol to DNA
    • 22d. Freeze for at least 2 hours or overnight
    • 23d. Pellet DNA by centrifugation (10-20 min, max speed)
    • 24d. Discard supernatant
    • 25d. Dry pellet in DNA SpeedVac caps open
    • 26d. Resuspend pellet in 200 ul water (ART tips)
    • 27d. Sample ready for UV spectrophotometry
    • 28d. Add 2 volumes (ca. 400 ul) ethanol to remaining nucleic acid preps
    • 29d. Freeze for at least 2 hours or overnight
    • 30d. Pellet nucleic acid by centrifugation
    • 31d. Discard supernatant
    • 32d. Dry pellet in DNA SpeedVac caps open
    • 33d. Resuspend nucleic to standard volume (1 ug/ul) in water (ART tips)

    From Tony Palombella, University of Colorado
    [email protected]

    Here’s a protocol I came up with a year or so ago to quickly make up enough genomic DNA for PCR reactions. since then, the Chlamy Newsletter has published a similar miniprep protocol.

    • 1) Resuspend one to several loopfuls of Chlamydomonas in 100 ml of lysis buffer (10mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA, 3% SDS) in a microfuge tube, or pellet 1ml of liquid culture 30″ in a microfuge. Remove the supernatant by aspiration and resuspend the pellet in 100 ml lysis buffer.
    • 2) Incubate 15′ at room temperature, mixing occasionally.
    • 3) Add 500 ml TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) in order to help separate phases in subsequent extractions. Add 1/10 volume 3M NaOAc, pH 5.2.
    • 4) Phenol extract once. Chloroform extract twice.
    • 5) Add 1.1 volumes isopropanol. Pellet 15′ in microfuge. Wash with 70% ethanol and air dry. Resuspend in 50 ml TE. A typical yield is 1 – 2 ug of genomic DNA. I use about 5 ul in a PCR reaction.

    More recently, I’ve tried other methods, including:

    • 1) Resuspend a couple of healthy loopfuls of cells in SDS extraction buffer (from Weeks et al. Anal. Biochem. 152:376- 3851986): 2% SDS, 400mM Nacl, 40mM EDTA, 100mM Tris-HCl, pH 8.0. Mix thoroughly, but try not to introduce too many bubbles. The volume used depends on the amount of cells used. Incubate 15′ @ RT or 65 C (depending on how clumpy the cells are).
    • 2) Phenol extract. If the aqueous phase is cloudy, add a couple hundred microliters of water to the tube and spin again.
      Chloroform extract.
    • 3) There’s enough salt in the aqueous phase to isopropanol precipitate directly.

    I get more than a few micrograms of digestable DNA from this protocol, but I haven’t tried it in a PCR reaction.

    I’ve only had problems with polysaccharides when doing CsCl preps. Even then, when I’ve had starch in my preps, a quick spin in a microfuge gets it out of the way after the prep is resuspended.

    From Gernot Gloeckner, University of Freiburg
    [email protected]

    Take 2 ml of a very dense grown culture and spin it down in 2 ml Eppendorff tubes at 3000 rpm.

    Resuspend the pellet in 500 ul of CTAB-Buffer.

      • 2% (w/v) CTAB
        • 100 mM Tris-HCl, pH 8
          • 1,4 M NaCl
            • 20 mM EDTA (pH 8)
            • 2 % (v/v) beta-Mercaptoethanol

            Incubate the solution at 65 degree C for 1 h.

            Extract with 500 ul of Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1).

            Take the upper phase and pellet it with 0.7 volumes of isopropanol for 15 min at 4 degree C. Spin down at 12000 rpm for 20 min.Wash the pellet

            From Terri Dunahay, National Renewable Energy Lab

            In response to the request for a miniprep protocol for Chlamy DNA, I have some preliminary information that might help. There was a paper published in Biotechniques recently (Goodwin and Lee, 1993, 15:438-444) “Microwave Miniprep of Total Genomic DNA from Fungi, Plants, Protists, and Animals for PCR”.

            A temporary technician in our lab tried this for DNA isolation from a green alga Monoraphidium. This is a very tough, tiny alga from which it is very difficult to isolate unsheared, clean DNA. In a preliminary experiment using the microwave technique, she was able to isolate about a microgram of digestable DNA from 40 ml of a medium density culture. Unfortunately, she left the lab and we haven’t had a chance to pursue this further, but it looked promising. Granted, its not as “mini” a prep as the one devised by Scott Newman, but it may be more useful for cells that are more difficult to lyse than Chlamy.

            PREPARATION OF DNA USING XANTINE

            For transformant analysis and prep of DNA from wt cells

            1. Centrifuge 5-15 ml of cells for 5 minutes at maximum speed using table-top at 3000 rpm. Use polypropylene 15 ml conical tubes.

            2. Remove medium very well. Cells can be frozen at -70 C at this stage.

            3. Add 2 ml of Xantine buffer and vortex the tube to resuspend cell pellet.

            4. Place the tube in a 65 C water bath and incubate for 40 minutes.

            5. Centrifuge for 5 minutes as in #1. Collect supernatant to fresh 5 ml polypropylene conical tube. Discard pellet.

            6. Add 5 ml of 95% ethanol (2.5 volume ). Yaxşı qarışdır. At this point tubes can be stored in -70 C freezer.

            7. Centrifuge 5 min. at 3000 RPM to collect DNA. Discard ethanol. Centrifuge the tubes for 1 minute and remove remaining ethanol with capillary tip. Remove all alcohol.

            8. Resuspend pellet in 300 ul of TE buffer (or water). Transfer the DNA solution to microfuge 1.5 ml tube.

            9. Add 150 ul of 7.5 M ammonium acetate. Mix well by inverting several times.

            10. Add 1000 ul of 95% ethanol and mix well.

            11. Centrifuge for 10 minutes in microcentrifuge. Discard supernatant.

            12. Wash pellet twice with 700 ul of cold 70% ethanol. Centrifuge for 30 sec after last ethanol wash to collect remaining ethanol from the centrifuge tube wall. Remove ethanol with capillary tip.

            13. Resuspend pellet in 300 ul of TE buffer. Add 10 ul of DNase free RNase A and 1 ul of RNase T1. Mix well and incubate for 30 minutes at 37 C.

            14. Add 150 ul of 7.5 M ammonium acetate. Note: Ammonium acetate must be fresh, i.e., not stored more than 1-2 weeks. Mix well by inverting 3-4 times.

            15. Add 1000 ul of 95% ethanol. Mix well by inverting 4-5 times.

            16. Centrifuge for 10 minutes at room temperature. Discard supernatant.

            17. Wash pellet 2 times with 700 ul cold 70% ethanol. Remove last drop of ethanol as described above after last wash.

            18. Resuspend pellet in 20-50 ul of sterilized water. Store in -20C. Concentration of DNA is 2-5 ug/ul. Note: You should expect 750 g DNA from 10 ml of cells. Note: Scale up DNA preparation by using multiple tubes not a larger volumes.

            Potassium ethyl xanthogenate (from Fluka cat # 60040) Synonym: Carbonodithioic, o-ethyl ester. MW 160.3

            RECIPE FOR XANTINE BUFFER:

            Ingredient, Amount/100 ml, Concentration

              • Potassium ethyl xanthogenete, 200.0 mg, 12.5mM
                • 1 M Tris-HCl pH 7.5, 10 ml, 100 mM
                  • 0.5 M EDTA pH 8.0, 2.0 ml, 10 mM
                    • NaCl, 4.09 g, 700mM
                    • Water to 100 ml

                    Adapted and modified from: Methods in Molecular and Cellular Biology 1992, 315-22.


                    NƏTİCƏLƏR

                    Use of the TRIzol supplemented with sarkosyl followed by removal of DNA with the TURBO DNA-pulsuz kit (Option 1) is an efficient and effective means of extracting RNA from a diverse array of plants, especially those that are woody, aromatic, or aquatic. With the addition of the traditional CTAB method prior to the TRIzol (Option 2), even the most stubborn taxa were mostly successful and gave consistent RNA quality measures. Option 3, which has been used successfully in many laboratories (including our own, e.g., Buggs et al., 2009 Johnson et al., 2012 ) for RNA isolation, is not the most efficient or robust method for obtaining high-quantity and -quality RNA in transcriptomics across the Embryophyta. Despite the success of the protocols described here, our methods were not successful for some plants that contain high amounts of mucilage, such as Opuntia sp.


                    NƏTİCƏLƏR

                    We have proposed a simple and universal model for the dependence of oligocation ligand concentration needed to induce DNA condensation (EC50) on the DNA (CP) and monovalent salt (Cduz) concentrations. The DNA condensation is well described for a range of conditions, by a model combining the established and uniform salt dependence of the oligocation–DNA dissociation constant with the necessity to neutralize about 90% of the DNA charge. These two assumptions, together with the approximation that the fraction of DNA charge neutralized by bound counterions is dominated by oligocations (N.critN.crit L ), leads to Equation (3). The virtue of this phenomenological relation is that it relates the DNA condensation behavior to its dependence on the experimental conditions in a very clear and simple way. Equation (3) connects two well-studied phenomena of DNA polyelectrolyte solution behavior, namely DNA oligocation-induced condensation and the salt-dependent DNA oligocation binding in a novel way. The appearance of one salt dependent and one salt-independent regime in this condensation follows naturally within this model. This model gives a qualitatively correct prediction of the salt and DNA concentration dependent ε-oligolysine induced DNA condensation. For the simple cations Spd 3+ , Spm 4+ and CoHex 3+ , the description is good in the high salt regime as well as in the low salt regime at higher DNA concentrations (PA data), while the prediction fails in the low-salt and low-DNA concentration limit. To our knowledge, this is the first study reporting a direct and simple connection between oligocation binding to DNA (Kd value) and DNA condensation.

                    Implications to in vivo şərtlər

                    The dynamic units of the histone–DNA interaction in chromatin are the histone tails with net positive charge from +8 to +14 and average charge density of one lysine or arginine per every three amino acids ( 70). The ε-oligolysines studied in this work can be considered as a simplified model of the histone tails with respect to positive charge and charge density. To a certain extent, the ε-oligolysines with high positive charge, Z = +31 (εK31) and Z = +20 (εRK110, εYRK10, εLYRK10) may serve as a simplified model for the nonspecific interaction between DNA and basic proteins of similar net positive charge (e.g. histones).

                    The concentration of the DNA in the cell nucleus is very high ( 71, 72). Recent fluorescent measurements give average concentration of 116 µM of nucleosomes (CP = 46.4 mM) with the highest concentration 260 µM of nucleosomes in heterochromatin (CP = 104 mM) ( 73). Extrapolating the EZ50 qarşı Cduz dependencies to such high DNA concentrations ( Figure 7), it is clear that under physiological concentration of salt (K + in the range 50–300 mM), condensation of DNA should always proceed in the salt-independent regime for all natural oligocations (histones, protamines, basic domains of the nuclear proteins, polyamines, etc.). At physiological concentration of salt, the critical degree of DNA neutralization needed to induce DNA condensation would be somewhat lower, in the range N.neut = 0.5 – 0.7, than the higher values N.neut = 0.7 – 0.95 observed at low salt concentration (CKCl = 10–20 mM). In addition, other factors such as the presence of Mg 2+ , polyamines as well as the crowded environment of the cell cytoplasm, would facilitate DNA condensation. Therefore, it is reasonable to suggest that the conditions of DNA in the nucleus are very close to the borderline separating the extended and collapsed DNA phases. Since DNA in the nucleus is in the salt-independent regime of condensation, the principal factor regulating DNA condensation should be any addition/removal of cationic (or any other) components facilitating the DNA collapse. As a result, there exist powerful ‘brakes’ for overproduction of the basic components (polyamines, protamines, histones), such that any excess of these components would result in DNA condensation blocking access to DNA for the transcription/replication machinery. On the other hand, insufficient amount of DNA condensing agents will lead to DNA expansion that might be damaging and harmful in the crowded space of the cell nucleus ( 74). The tight stoichiometry between DNA and the histones has recently been illustrated by the in vivo observation of strong correlation between the amount of the core histones, linker histones and nucleosome repeat length in the chromatin ( 75, 76).

                    Counter-intuitively, the presence of a certain excess of DNA-condensing agents in chromatin may also facilitate access to DNA of the proteins responsible for replication and transcription. From the ITC observation that DNA condensation proceeds with higher affinity than the preceding non-specific (charge neutralizing) interaction, it follows than when the amount of condensing agent exceeds the critical value, the onset of DNA condensation triggers a redistribution of the ligand between the two phases of DNA. Thus, in the region of coexistence between the condensed and extended DNA states, the soluble phase of DNA is depleted of cationic ligands. The remaining uncondensed DNA binds daha az ligand than under the conditions before the onset of condensation. For the cell nucleus it means that increase in cationic components may lead to DNA condensation (formation of heterochromatin). This will be accompanied by a depletion of oligocations for the rest of chromatin, thus making the euchromatin more open and accessible for transcription. Such an unexpected consequence of excessive concentration of the condensing agents in the chromatin might explain the observation of higher concentration of the polyamines in the eukaryotic cells with high metabolic activity (e.g. in cancer cells) ( 77).

                    Our study demonstrates that the electrostatic mechanism is a universal one and salt-dependence of binding constant (and free energy) of ligand–DNA interaction is expected to be similar for the ligand–DNA interaction in solution and in condensed state. The apparent independence of EC50 on salt concentration simply indicates that the DNA condensation is in salt-independent regime and that dissociation constant of ligand–DNA complex is very low so that KdCP in Equation (3). The net positive charge of the histone octamer forming the basic unit of eukaryotic chromatin, the nucleosome core particle, is about +147 ( 70). Therefore, from the salt dependence of oligocation–DNA-binding constant one can predict that the total electrostatic binding energy of the histone octamer to the nucleosomal DNA (the sum of binging energies of the all basic domains in the octamer) must be significant: ΔGbağlamaq el = RTlnKd = RT[lnKd(1M) + ZblnCduz] ≈ − 150Kcal/mol [assuming Z = +147, Cduz = 0.15M, b = 0.9 and lnKd(1M) ≈ 0]. This estimation demonstrates that the NCP and chromatin in general is an extremely stable polycation–polyanion complex, which challenges the view of a marginal stability of chromatin ( 78). This evaluation for the electrostatic free energy of chromatin formation is a rather low estimate. Some additional favorable contributions to this term might originate from the non-stoichiometric charge ratio between DNA and the histones ( 70, 79, 80). Notably, favorable electrostatic free energy greatly exceeds the unfavorable contributions to the formation of the NCP [mostly due to energy cost of the DNA bending ( 81, 82)] that was confirmed by early experimental observation ( 83) and by theoretical analysis based on the counterion condensation model ( 84). More detailed presentation of the arguments in support of a high stability of chromatin originating from nonspecific histone–DNA interaction as well as the consequence of the high stability of chromatin for its statics and dynamics and for the conditions for the protein machines operating on the chromatin template, is discussed in our earlier work ( 70, 80, 85).