Məlumat

İnkişaf zamanı müəyyən neyron zülallarının ümumi fosforlaşması niyə azalır?

İnkişaf zamanı müəyyən neyron zülallarının ümumi fosforlaşması niyə azalır?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Nörotransmitterin sərbəst buraxılmasında iştirak edən bir protein olan RIM1a'nın təsirlərinə baxırıq. Siçovulların inkişafı ilə onun ümumi fosforlaşmasının niyə azaldığına dair hər hansı bir fikir varmı?

Çox sağ olun

Şəkil; https://i.gyazo.com/16170fd79bd1f96517e028dfa2e70fbf.png">http://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(03)00727-X.pdf


İşdə kömək edə biləcək bir neçə Vikipediya məqaləsi:

Kritik dövr - Kritik dövr: sinir sistemindəki müəyyən plastiklik növlərinin yalnız müəyyən "kritik" zamanlarda meydana gəldiyi fikri.

Uzunmüddətli potensiya - LTP, əlaqələndirdiyiniz məqalədə çox danışdı: bu sinaptik əlaqələri gücləndirmək üçün bir mexanizmdir.

Sinaptik budama - # sinapslar/sinapsların gücü yeniyetməlikdən yetkinliyə qədər azalmağa meyllidir

Əlaqələndirdiyiniz kağız LTP-də fosforlanmış RIM1a-nın rolu haqqında çox danışır. Bu protein haqqında daha konkret bir şey bilmədən və əlaqələndirdiyiniz kağıza bir baxışdan, RIM1a'nın LTP -nin artması dövründə, xüsusən inkişafın əvvəlində fosforlandığından və heyvanların yaşı və beyinlərinin sinaptik budamaya girməsindən şübhələnərdim. mərhələdə, LTP ümumilikdə aşağı tənzimlənir və mexanizmlərdən biri də fosforlaşdırılmış RIM1a olmaması ola bilər.


Niyə bəzi neyron zülallarının ümumi fosforlaşması inkişaf əsnasında azalır? - Biologiya

Rett sindromu (RTT) kimi autizm spektri pozğunluqlarının təcrübəyə bağlı sinaps olgunlaşmasının qüsurlarından qaynaqlandığı hipotez edilmişdir. RTT, nöronal aktivləşməyə cavab olaraq S421 -də fosforlaşan bir nüvə proteini olan MECP2 -dəki mutasiyalardan qaynaqlanır. Burada göstəririk ki, MeCP2 S421 fosforiliyinin in vivo pozulması sinaps inkişafında və davranışında qüsurlara səbəb olur, beyin inkişafında və RTT-də MeCP2-nin fəaliyyətə bağlı tənzimlənməsini nəzərdə tutur. Biz S421 fosforilasiyasının MeCP2 funksiyasını tənzimləmə mexanizmini araşdırdıq və xromatin immunopresipitasiya ardıcıllığı ilə göstərdik ki, bu modifikasiya genomla bağlı MeCP2-də baş verir. MeCP2 S421-in fosforiləşməsi xüsusi genlərin ifadəsini tənzimləmir, əksinə MeCP2, fosforlaşması sinir sisteminin inkişafı zamanı kromatinin nöronal fəaliyyətə genom boyu reaksiyasını asanlaşdıra bilən histon kimi bir faktor kimi fəaliyyət göstərir. RTT-nin qismən bu təcrübədən asılı olan xromatinin yenidən qurulmasının itirilməsi ilə nəticələndiyini təklif edirik.

Vurğulanan məqamlar

► Fəaliyyətdən asılı MeCP2 fosfo-S421 in vivo itkisi sinaptik inkişafı dəyişdirir ► MeCP2 S421A döyən siçanlar yeniliyə anormal davranış reaksiyaları göstərir ► MeCP2-nin neyron genomu ilə bağlanması stimullaşdırma ilə aşkar edilərək dəyişdirilmir ► Fəaliyyətdən asılı pS421 MeCP2-nin baş verdiyini göstərir qlobal funksiyaya malikdir


Mücərrəd

Klassik və ümumi lipid modifikasiyası olan protein palmitoilasiyası neyron zülal alverinin və funksiyasının müxtəlif aspektlərini tənzimləyir. Palmitolyasiyanın geri dönən təbiəti hüceyrədaxili bölmələr arasında protein daşınması üçün potensial ümumi mexanizm təmin edir. Son zamanlarda böyük bir DHHC (Asp-His-His-Cys) zülal ailəsi olan palmitoiling fermentlərinin kəşfi və yeni proteomik və görüntüləmə metodlarının inkişafı palmitoilasiya analizini sürətləndirdi. Ayrı -ayrı DHHC fermentlərinin qütbləşdirilmiş neyronlarda substratların ixtisaslaşdırılmış bölmələrini yaratması və saxlaması aydınlaşır. Burada, dinamik zülal palmitoyiliyinin tənzimləyici mexanizmlərini və neyronal inkişaf və sinaptik plastiklik də daxil olmaqla, patofizyologiyanın müxtəlif aspektlərində protein palmitoyiliyinin ortaya çıxan rollarını müzakirə edirik.


Nəticələr

Bbs zülallarının itirilməsi əsas neyron dendritik morfologiyasına təsir göstərir

Neyronal dendritlərin əmələ gəlməsi üçün birincil kirpiklərə ehtiyac olduğunu nəzərə alaraq [21], siliyer Bbs zülallarının itirilməsinin əsas neyronların dendritik morfologiyasına təsirini araşdırdıq. Bbs siçan modelləri. Golgi-Cox emprenye üsulu ilə frontal korteksin dentrit girus (DG), bazolateral amigdala (BLA) və V qat piramidal neyronlarının dendritik uzunluğunu, onurğa sayını və onurğa sıxlığını ölçdük. P42 köhnə DG qranul hüceyrələrində ümumi onurğa sıxlığının 55% azaldığını aşkar etdik. Bbs4 −/− siçanlar (Şəkil 1A və 1B və S1 Video). V təbəqə neyronlarının bazal və apikal dendritlərində (daha sonra bazal və apikal bel sıxlığı olaraq adlandırılır) ümumi onurğa sıxlığı müvafiq olaraq 55% və 54% (Şəkil 1A və 1E) və BLA -nın ümumi bazal və apikal bel sıxlığı azalmışdır. neyronlar sırasıyla 23% və 22% azaldı (Şəkil 1A və 1J). Sholl analizi, ən distal budaq və 300 mikronluq dairə istisna olmaqla, DG-də bütün budaqların onurğa sıxlığında və 30 mikron aralığında əhəmiyyətli bir azalma olduğunu ortaya qoydu. Bbs4 −/− siçanlar (Şəkil 1C və 1D). Oxşar Sholl analizi nəticələri, hər bir filial üçün və 30 mikron aralığında dendritik bel sıxlığının təsirləndiyi Layer V neyronlarının apikal və bazal dendritlərində tapıldı (Şəkil 1F-1I). Apikal və bazal BLA dendritləri Bbs4 −/− siçanlar onurğa kiçilməsində yalnız bir neçə budaq və konsentrik dairələri təsir edən qeyri -bərabər nümunələr ortaya qoydu (Şəkil 1K -1N). DG, Layer V və BLA neyronlarında bir sıra dendritik kəsişmələr nəzarət siçanları ilə müqayisədə təsirlənməmişdir (S1A-S1E Şəkil ). Ümumi dendritik uzunluq DG neyronlarında 48% və V qat korteks neyronlarının bazal dendritlərində 25% azalmışdır. Bbs4 −/− siçan. V təbəqənin korteks neyronlarının apikal dendritlərinin uzunluğunun dəyişməsi Bbs4 −/− siçanlar statistik olaraq əhəmiyyətli deyildi. BLA apikal və bazal dendritlər, müvafiq olaraq, 14% və 19% uzunluğunda statistik olaraq əhəmiyyətli bir azalma göstərdi (S1F -S1J Şəkil). Ümumiyyətlə, bu məlumatlar dendritik morfologiyada əhəmiyyətli sapmalar göstərir Bbs siçan modeli.

(A) P42-nin Golgi-emprenye edilmiş DG, BLA və Layer V piramidal nöronlarının nümayəndə şəkilləri Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ siçanlar (100x miqyaslı bar, 5 μm). (B-D) DG neyronlarının onurğa sıxlığı. (B) Ümumi onurğa sıxlığı. (C) Şöbə sifarişinə görə onurğa sıxlığı. (D) 30 mikron intervalında onurğa sıxlığı. (E-I) V qat piramidal neyronların onurğa sıxlığı. (E) Onurğanın ümumi sıxlığı. (F) Budaq sırasına görə apikal dendritlərdə onurğanın sıxlığı. (G) Budaq sırasına görə bazal dendritlərdə onurğanın sıxlığı. (H) 30 mikron aralığında apikal dendritlərdə onurğa sıxlığı. (I) 30 mikron aralığında bazal dendritlərdə onurğa sıxlığı. (J-N) BLA-nın ümumi onurğa sıxlığı. (J) Onurğanın ümumi sıxlığı. (K) Budaq sırasına görə apikal dendritlərdə onurğa sıxlığı. (l) Budaq sırasına görə bazal dendritlərdə onurğa sıxlığı. (M) 30 mikron aralığında apikal dendritlərdə onurğa sıxlığı. (N) 30 μm intervalda bazal dendritlərdə onurğanın sıxlığı (N.siçan/WT = 5 N.siçanlar/KO = 7, N.hüceyrələr/WT = 25, N.hüceyrələr /KO = 35, ortalama ± SD, ***P & lt 0.001 **P < 0,01 *P & lt 0.05). Tək yönlü ANOVA, B, E, J istisna olmaqla, Tukey post hoc testi, eşlənməmişdir t testdən istifadə edilmişdir. Əsas məlumatlar S1 Data -da mövcuddur. Bbs4, Bardet-Biedl sindromu 4 BLA, bazolateral amigdala DG, dentat girus KO, nokaut ns, əhəmiyyətli WT deyil, vəhşi tip.

Dendritik arxitekturanın nə vaxt olduğunu müəyyən etmək Bbs4 −/− DG neyronları dəyişməyə başlayır, biz E19.5 və P21-də filial sırasına və 30 μm intervala görə dendritik uzunluq və onurğa sıxlığını təhlil etdik. P21-in nəticələri P42-də əldə edilənlərə bənzəyirdi: biz dendritik uzunluqda və onurğa sıxlığında əhəmiyyətli bir azalma müşahidə etdik və bir sıra dendritik kəsişmələrdə əhəmiyyətli dəyişikliklər görmədik (S2A-S2F Şəkil ). Əksinə, E19.5 -də dendritik filopodiyanın sıxlığı (inkişaf edən neyronlar üzərində dendritik çıxıntılar) Bbs4 −/− DG neyronları təsirlənməyib. Bununla birlikdə, dendritik uzunluq E19.5 -də əhəmiyyətli dərəcədə azaldı (S2A və S2G -S2K Şəkil). Birlikdə götürülən Bbs4 −/− fare modeli P21 (38%) və P42 (55%)-də dendritik onurğa sıxlığında mütərəqqi azalma göstərir, lakin gec embrion mərhələlərində deyil (S2L Şəkil ).

Bənzər dendritik anomaliyaların digərlərində aşkarlanıb araşdırılmaması üçün Bbs modelləri ilə biz P21-in DG dendrit morfologiyasını təhlil etdik Bbs5Bbs1 M390R modelləri. Xüsusilə, Bbs5 zülalının itirilməsi, vurulmuş siçanların dişli qranul hüceyrələrində DG dendritik uzunluğunun (34%) və ümumi bel sıxlığının (32%) əhəmiyyətli dərəcədə azalmasına səbəb olmuşdur (S3A -S3C Şəkil). Sholl analizi, onurğa sütununun anormal sıxlığını da ortaya çıxardı Bbs5 -/-sıçanlar, ikinci-beşinci budaq sırasından və müvafiq olaraq 60 μm-dən 150 μm aralığına qədər əhəmiyyətli bir azalma ilə (S3D-S3F Şəkil). Maraqlıdır ki, Bbs1 M390R/M390R ümumi onurğa sıxlığında yalnız 10% azalma göstərən DG neyronlarının spinogenezində ardıcıl, lakin marjinal anormalliklərlə əlaqələndirildi. Bununla birlikdə, dendritik uzunluq təsirlənməmişdir (S3A və S3G -S3K Şəkil). Bu tapıntı bizim klinik müşahidələrimizlə üst-üstə düşür BBS1 M390R xəstələrdə ən yumşaq koqnitiv fenotip var.

Xüsusi alt növlərin DG neyronlarında çox təmsil olunduğunu müəyyən etmək Bbs4 −/− siçanlar, ölçüsünə və formasına görə onurğaları təhlil etdik (S4A Şəkil) [22]. "Dallanmış" onurğalar istisna olmaqla, bütün onurğa alt növlərində ümumi onurğa sayının azaldığını müşahidə etdik. Ancaq dendritik uzunluğu azaldıqda Bbs4 −/− Neyronlar nəzərə alındı, yalnız "nazik" tikanların sıxlığının əhəmiyyətli dərəcədə azaldığını gördük (22%) (S4B -S4E Şəkil).

Kontekstual və işarələnmiş qorxu yaddaşı azaldı, lakin narahatlığa bənzər davranışda heç bir pozulma yoxdur Bbs4 −/− siçan

Hipokampus, amigdala və prefrontal korteks öyrənmə, yaddaş və sosial qarşılıqlı əlaqədə iştirak edən strukturlardır. DG, BLA və prefrontal korteks neyronlarının dendritik onurğalarının itməsinin davranış dəyişiklikləri ilə əlaqəli olub olmadığını araşdırmaq. Bbs4 −/− siçanlar üçün bir sıra davranış testləri həyata keçirdik. Bbs siçanların görmə pozğunluğu və piylənmə də daxil olmaqla bir sıra qüsurları inkişaf etdirdiyi bilinir [23]. Bu qarışıq faktorların təsirini minimuma endirmək üçün testləri daha gənc siçanlarda (8 həftə) həyata keçirdik. Ədəbiyyatın əksəriyyətinə və öz qiymətləndirmələrimizə görə, retinal degenerativ dəyişikliklər Bbs4 model 7-8 həftədə inkişaf etməyə başlayır, bu da görmə qüsurunu testdəki fərqləri nəzərə almır. Eynilə, piylənmə nəticələrimizi qarışdırmamalıdır, çünki bu yaşda çəki fərqi yoxdur Bbs4 −/−Bbs4 +/+ siçan. Qorxu yaddaşını qiymətləndirmək üçün kontekstual və qorxulu qorxu kondisioner testləri həyata keçirdik. 1-ci gündə kondisioner sessiyasında, kontekstli qorxu eksperimentinin yeni mühitində əsas aktivliyi qiymətləndirmək üçün şərti stimul (ton) və şərtsiz stimul (ayaq şoku) təqdim etmədən ilk 150 saniyə ərzində donma davranışı və qət edilən məsafə istifadə edilmişdir. Bbs4 itkisi, dondurma faizinə və ya gediş məsafəsinə təsir göstərməmişdir Bbs4 −/− kişi və dişi siçanlar. Lakin, 1-ci gündə qoşalaşmış ton-ayaq şoku stimulunun tətbiqindən sonra, post hoc təhlili donma faizində əhəmiyyətli bir azalma və 2-ci gündə səyahət edilən məsafənin artdığını ortaya qoydu. Bbs4 −/− dişi siçanlar qadın nəzarət siçanları ilə müqayisədə. Donma faizi və qət edilən məsafənin artması erkək siçanlarda statistik əhəmiyyət kəsb etməmişdir (Şəkil 2A, 2B və 2D).

(A) Kontekstual və cued qorxu kondisioner testinin sxematik təqdimatı. Birinci gündə siçanlar qorxu kondisioner kamerasına 616,6 saniyə yerləşdirildi. 150 saniyədən sonra 5 saniyəlik bir ton çalınır, ardınca 0,5 saniyəlik 0,5 mA şok gəlir. Ton və şok 150 saniyəlik fasilələrlə daha iki dəfə təkrarlanır. 2 -ci gündə siçanlar ton və şok olmadan 300 saniyə ərzində eyni kameraya yerləşdirildi. 4 saatdan sonra (Gün 2) siçanlar dəyişdirilmiş kontekstə yerləşdirilir və 180 saniyə buraxılır. 180 saniyədə 60 saniyəlik fasilələrlə iki dəfə təkrarlanan 5 saniyəlik bir ton çalınır. Kondisioner sınağının ilk 150 saniyəsi kontekst məlumatları üçün baza kimi istifadə edilmişdir. Dəyişdirilmiş kontekstdə ilk 180 saniyə işarə məlumatları üçün əsas xətt kimi istifadə edilmişdir. (B) Kontekstual yaddaş testində donma (%). (C) İstiqamət yaddaş testində donma (%). (D) Kondisioner testində, kontekst testində və cued testində gedilən məsafə (sm) (qadınlar: N.WT = 11, N.KO = 11 kişi: N.WT = 13, N.KO = 12 orta ± SD, ***P < 0,001 **P & lt 0.01 *P & lt 0.05). Tək yönlü ANOVA, Tukey post hoc testi. # Dondurulma müddətinin və getdiyi məsafənin əhəmiyyətli dərəcədə azaldığı qeyd edildi Bbs4 −/− siçanlar cütləşməmiş, iki quyruqlu t test (P & lt 0.05) istifadə edilmişdir. Əsas məlumatlar S3 Data -da mövcuddur. Bbs4, Bardet-Biedl sindromu 4 KO, nokaut WT, vəhşi tip.

Tonun təqdim edilməsindən əvvəl 2 -ci Gündə dəyişdirilmiş kontekst, işarə məlumatları üçün əsas xətt kimi istifadə edilmişdir. Məlumatlar, dəyişən kontekstin başlanğıc fəaliyyətində donma faizində əhəmiyyətli bir dəyişiklik olmadığını ortaya qoydu (Şəkil 2C və 2D). Tonla kondisioner seansı zamanı (2-ci gün, 180-360 saniyə) donma faizi əhəmiyyətli dərəcədə azaldı və qət edilən məsafə artdı. Bbs4 −/− erkək, lakin dişi siçanlarda yoxdur (Şəkil 2C və 2D). Bu nəticələr toplusu göstərir ki, Bbs4 zülalının itirilməsi cinsdən asılı olaraq kontekstual və qorxulu qorxu yaddaşına təsir edir.

Miniatür həyəcanlandırıcı postsinaptik cərəyanların amplitudası artır Bbs4 −/− DG neyronları

Dendritik onurğaların morfologiyası olduqca dinamikdir və onların əmələ gəlməsi və saxlanılması sinaptik funksiyadan və neyron aktivliyindən asılıdır [24]. Bir Bbs modelində sinaptik və sinir funksiyasını qiymətləndirmək üçün 3-4 həftəlik hipokampal qranul hüceyrələrinin daxili və sinaptik xüsusiyyətlərini ölçdük. Bbs4 −/−Bbs4 +/+ kəskin hipokampal dilimlərdə olan siçanlar. -Nin özünəməxsus xüsusiyyətlərini tapdıq Bbs4 −/− Neyronlar yaşa uyğun gələn nəzarətçilərlə müqayisədə təsirlənməmişdir (Şəkil 3A-3C). Bu iki qrupdakı qranul hüceyrələrinin sinaptik xüsusiyyətlərini qiymətləndirmək üçün miniatür həyəcanlandırıcı postsinaptik cərəyanları (mEPSCs) ölçdük. Xüsusilə, mEPSC -lərin tezliyi iki qrup arasında fərqlənməsə də, mEPSC amplitüdləri daha böyük idi. Bbs4 −/− neyronlar (Şəkil 3D -3F). Bu məlumatlar, neyronal aktivliyin azalmasının onurğa sıxlığının aşağı düşməsi ehtimalını azaldır. Əksinə, mEPSC amplitüdlərində müşahidə olunan artım, onurğa itkisinə cavab olaraq presinaptik və/və ya postsinaptik sahələrdə kompensasiya mexanizmlərinin aktivləşməsini göstərir.

(A) Hippokampal qranul hüceyrələrindən cari sıxac qeydləri zamanı cari enjeksiyonlara cavab olaraq atəş nümunələrinin müqayisəsi. (B) Pasif membranın xassələrini ümumiləşdirən bar qrafikləri. Arasında ciddi fərqlər aşkar edilməmişdir Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ siçanlar giriş müqavimətində (solda), membran vaxtı sabitində (ortada) və istirahət membran potensialında (sağda). (C) Atəş tezliyi cari enjeksiyon amplitüdlərinə qarşı tərtib edilmişdir. arasında əhəmiyyətli fərqlər aşkar edilməmişdir Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ siçanlar. (D) mEPSC'ler hipokampal qranul hüceyrələrindən qeydə alınmışdır Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ siçanlar (N. = 6). (E) arasında mEPSC amplitüdlərini müqayisə edən məcmu ehtimal sahəsi Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ siçanlar. qranul hüceyrələrində mEPSC amplitüdləri Bbs4 -/ - siçanlar əhəmiyyətli dərəcədə böyükdür (N. = 6, P & lt 0.05, Kolmogorov-Smirnov testi). (F) MEPSC-lərin hadisələrarası intervallarını (IEI) müqayisə edən məcmu ehtimal planı Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ siçanlar (N. = 6 P = 0.27, Kolmogorov-Smirnov testi). Əsas məlumatlar S3 Data -da mövcuddur. Bbs4, Bardet-Biedl sindromu 4 IEI, hadisələrarası interval KS, Kolmogorov-Smirnov mEPSC, miniatür eksitator postsinaptik cərəyan.

IGF-1R aşağı axını siqnalizasiyası nizamsızdır Bbs4 −/− sinaptosomlar

IGF, RET, TrkB, PDGF və EphB daxil olmaqla bir sıra tirozin kinaz reseptorlarının (RTK) dendritik böyüməni gücləndirdiyi və dendritik tikanların formalaşmasını və saxlanmasını təşviq etdiyi məlumdur [7,25]. Sinaptozomal fraksiyalarda RTK siqnalını qiymətləndirmək Bbs4 −/−Bbs4 +/+ siçanlar, bir Phospho-RTK Array istifadə edərək RTK-ların fosforlaşma səviyyəsini ölçdük. Dendritik onurğa itkisinin P1 və P21 arasında baş verdiyini və potensial kompensasiya mexanizmləri baş verməzdən əvvəl ilkin siqnal dəyişikliklərini tutmaq üçün P7 siçanlarının sinaptosomal fraksiyalarından istifadə etdik. Sinaptozomal fraksiyalar Bbs4 −/−Bbs4 +/+ siçanlar immobilizə edilmiş RTK anticisimlərini ehtiva edən membranla inkubasiya edilib, ardınca pan anti-fosfo-tirozin antikoru ilə RTK fosforilasiyası aşkar edilib. Maraqlıdır ki, insulin və IGF1 reseptorları da daxil olmaqla bir sıra RTK -ların fosforilləşmə səviyyələri dəyişdirilmişdir (Şəkil 4A və S5 Şəkil). MSS-də nöroplastisiteye dərin təsir göstərdiyi bilindiyi üçün IGF-1R/insulin reseptoru (İR) siqnalizasiyasına diqqət yetirdik [7-9]. Aşağı çəkilən təcrübələr təsdiq etdi ki, P7 ilə zənginləşdirilmiş sinaptozomal fraksiyada IGF-IR/InsulinR fosforlaşması azalmışdır. Bbs4 −/− siçanlar (Şəkil 4B). Bundan əlavə, kanonik IGF siqnalının aşağı axını olan Aktın fosforilləşmə səviyyələri əhəmiyyətli dərəcədə azaldı (Şəkil 4B). Sonra, IR və IGF-1R ilə fosforiləşmiş bir adapter zülalı olan P53 (IRS p58) insulin reseptor substratının fosforlaşma səviyyəsini sınadıq [26]. Maraqlıdır ki, əvvəllər IRS p58 zülalının glutamaterjik sinapsların PSD -də yüksək dərəcədə zənginləşdirildiyi göstərilmiş və bu zülalın neyronlarda rolunu vurğulamışdır [27]. IRS p58 -in fosforiləşməsinin P7 -nin sinaptozomal fraksiyalarında əhəmiyyətli dərəcədə azaldığını gördük Bbs4 −/− siçanlar (Şəkil 4B). Bundan əlavə, IGF-1R və ​​IRS p58-in fəaliyyəti Rho ailəsi GTPazaları ilə qarşılıqlı əlaqədən asılı olduğundan [28, 29], Rac1 və RhoA GTPazalarının fəaliyyətini araşdırdıq. P7 -nin zənginləşdirilmiş sinaptozomal hissəsində RhoA aktivliyinin artdığını və eyni zamanda Rac1 aktivliyinin azaldığını müşahidə etdik. Bbs4 −/− siçanlar (Şəkil 4C və 4D). Sonra Bbs −/− siçanlarında IGF-1 siqnalının tənzimlənməsinin N-metil-D-aspartat (NMDA) və Alfa-Amino-3-Hidroksi-5-Metil-4-İzoksazol Propion turşusu (AMPA) səviyyələrinə təsir edib-etmədiyini qiymətləndirdik. ) ümumi və sinaptosomal fraksiyaların reseptorları Bbs4 −/− və Bbs4 +/+ qərb ləkəsi ilə siçanlar. P7 -nin sinaptozomal hissəsində NMDA və AMPA reseptorlarının səviyyəsində əhəmiyyətli bir artım müşahidə etdik. Bbs4 −/− siçanlar, ümumi beyin hissəsində reseptorların səviyyəsində heç bir dəyişiklik aşkar edilməmişdir (Şəkil 4E). Bu məlumatlar mEPSC amplitüdlərinin artması ilə bağlı əvvəlki tapıntılarımıza uyğundur Bbs4 −/− neyronlar (Şəkil 3E), onurğa itkisinə cavab olaraq kompensasiya mexanizmini təklif edir.

(A) Fosfo-RTK dizisi, insulin və IGF1 reseptorlarının fosforlaşmasında əhəmiyyətli bir azalma olduğunu ortaya qoyur. Bbs4 −/− (N. = 2, ortalama ± SD). (B) Aşağı çəkmə təhlili aşağı axın siqnalını IGF-1R göstərir. Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ zənginləşdirilmiş sinaptosomal fraksiyalar gecə ərzində siçan anti-fosfotirozin antikoru ilə inkubasiya edildi, ardınca 2 saat ərzində Dynabeads M-280 ilə inkubasiya edildi. Boncuklardan çıxarılan zülalların immunoblotting təhlili anti-IGFR/InsR, anti-Akt və anti-IRS p58 antikorlarından istifadə edilərək həyata keçirildi. Giriş: IGFR/InsR, Akt və IRS p58-in ümumi səviyyəsini göstərən anti-fosfotirozin antikoru ilə inkubasiyadan əvvəl ümumi beyin zülal fraksiyası. Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ siçanlar. (C, D) RhoA və Rac1 G-LISA Aktivləşdirmə Testləri. Aktivləşdirilmiş RhoA (c) və Rac1 (d) səviyyələri ümumi beyin ekstraktlarında və zənginləşdirilmiş sinaptosomal fraksiyada ölçüldü. Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ siçanlar (N. = 3, ortalama ± SD ayrılmadı t test). (E) NMDA və AMPA reseptorlarının ümumi beyin ekstraktı və zənginləşdirilmiş sinaptozomal hissəsinin Western blot analizinin nümayəndəsi. Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ siçanlar. (F) Sinaptosomal fraksiyalarda LC3-II və p62 autofagiya markerlərinin qərb ləkələri Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ siçanlar P1, P7, P14 və P21 (N. = 3, ortalama ± SD). LC3-I, LC3-ün sitozolik formasıdır. LC3-II autofagosomal membranlara daxil olan LC3-fosfatidiletanolamin konjugatıdır (LC3-II). LC3-II və p62 səviyyələri Image J proqramından istifadə edərək western blot zolaqlarının intensivliyini ölçməklə ölçüldü (N. = 3, ortalama ± SD, ayrılmamışdır t test). Təmizlik genləri (aktin, GAPDH və s.) Bbs4 -/ - siçanlar (dərc olunmamış müşahidələrimiz). (G) Bütün beyin homogenatlarında oksidləşdirici fosforiləşmə (OXPHOS) kompleks fəaliyyətlərinin ölçülməsi Bbs4 -/ - və Bbs4 +/+ siçanlar. Vahidlər: mU: U CS xam məlumatları sintazı sitratlaşdırmaq üçün normallaşdırılmışdır N. = 4, ortalama ± SD ns, əhəmiyyətli ayrılmamışdır t sınaq Əsas məlumatlar S2 Datasında mövcuddur. AMPAR, alfa-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazol propionik turşu reseptoru NMDAR, N-metil-D-aspartat reseptoru Bbs4, Bardet-Biedl sindromu 4 CI, mitokondri kompleksi I CII, mitokondriya kompleksi II CIII, mitokondriya kompleksi III CS, sitrat sintaz, GAPDH, Gliseraldehid 3-fosfat dehidrogenaz GluR, glutamat reseptoru IGF-1R, insulinə bənzər böyümə faktoru resR reseptor LC3, mikrotübüllə əlaqəli protein 1A/1B-yüngül zəncir 3 LC3-I, otofagosomal membranlara yığılmış LC3 LC3-II, LC3-fosfatidiletanolamin konjugatının sitozolik forması OXPHOS, oksidləşdirici fosforiləşmə RTK, tirozin kinazazid reseptor SCC, (= kompleks II + III birləşdirilmiş) WB, western blot.

Dendritik onurğa budamasının mümkün mexanizmlərindən biri, makroautofagiyadır [18], bu proses IGF-1R siqnalları və kiçik GTPazalar tərəfindən sıx şəkildə tənzimlənir. Otofagiyanın orqanizmimizdə nizamsız olub olmadığını yoxlamaq üçün Bbs modeldə, LC3-II və p62 autofagiya markerlərinin səviyyəsini təhlil etdik, zənginləşdirilmiş sinaptozomal fraksiyalarda Bbs4 −/−Bbs4 +/+ siçanların beyinləri doğuşdan sonrakı müxtəlif mərhələlərdə. P1 və P7-də LC3-II səviyyəsində əhəmiyyətli bir artım müşahidə etdik Bbs4 −/− siçanlar (Şəkil 4F). P62 səviyyəsinin otofagiya ilə tərs korrelyasiya olması ilə bağlı geniş şəkildə tanınan anlayışı nəzərə alsaq, təcrübəmizdə P1 sinaptosomlarında p62-də artım gözlənilməz idi. Bununla birlikdə, p62 üçün çoxfunksiyalı bir rol səbəbiylə yüksək otofajik axın zamanı p62 səviyyələrinin tənzimlənə biləcəyi ilə əlaqədardır [30]. Mitokondriyal disfunksiyanı və oksidləşdirici stresi otofagik induksiya tetikleyicileri olaraq istisna etmək üçün [31], ümumi beyin homogenatlarında tənəffüs zənciri komplekslərinin I, II, III, IV və süksinat: sitokrom c oksidoreduktaza (SCC kompleksi II və III birləşmə) fəaliyyətini qiymətləndirdik. P7 Bbs4 −/−Bbs4 +/+ siçan. Oksidləşdirici fosforlaşma (OXPHOS) kompleks fəaliyyətləri müəyyən edilmiş və nəticələr sitrat sintazasının (CS) aktivliyinə normallaşdırılmışdır. OXPHOS-un fəaliyyətləri arasında əhəmiyyətli fərqlər tapmadıq Bbs4 −/−Bbs4 +/+ siçanlar (Şəkil 4G), beləliklə, BBS-də otofagiyanın səbəbi kimi mitoxondrial disfunksiyanı istisna edir. Birlikdə, tapıntılarımız göstərir ki, IGF-1 anormallığı, dendritik onurğa morfologiyasını və plastisiyasını idarə etdiyi bilinən müxtəlif hüceyrə yollarının nizamsızlaşmasına səbəb ola bilər.

BBS zülallarının sinaptik lokalizasiyası

Bbs zülallarının birincil siliya tənzimlənməsindəki rolu, son zamanlarda Bbs zülallarının mikrotubulyar stabilizasiya, aktinin yenidən qurulması, transkripsiya tənzimlənməsi və endosomal alverdə iştirak etdiyini göstərən tədqiqatlarla genişləndirilmişdir [16,17,32]. Bbs funksiyalarının bu geniş spektrini və Bbs -in rolunu izah edən hazırkı nəticələrimizi nəzərə alaraq, məsələn, dendritik onurğa sıxlığının azalması, anaptik sinaptik IGF reseptor siqnalları və dəyişmiş nörotransmitter reseptor səviyyələri (NMDA və AMPA) zülallar neyronların sinapslarında mühüm rol oynaya bilər. Siçovul qabığının, dorsal striatumun və DG-nin sinaptosomal [33,34] və xam sinaptosomal fraksiyalarının [35] əvvəlki kütləvi spektrometrik analizlərinin yenidən qiymətləndirilməsi Bbs1, Bbs2, Bbs4, Bbs5, Bbs7 və Bbs10 zülallarının mövcudluğunu aşkar etdi. (S1 Cədvəl).

BBS zülallarının sinaptik lokalizasiyasını biokimyəvi cəhətdən ətraflı öyrənmək üçün biz əvvəllər təsvir edilmiş metoddan istifadə edərək, yetkin siçovulların hippokampından sinaptosomal preparatların sitozolik, yuyucu vasitədə həll olunan sinaptosomal (DSS pre-sinaps zənginləşdirilmiş) və PSD fraksiyalarını zənginləşdirdik (S6 Şəkil) [36]. Etiketsiz MS1 intensivliyinə əsaslanan LC-MS kəmiyyəti PSD fraksiyasında Bbs1, Bbs2, Bbs5 və Bbs9 zülallarının yüksək bolluğunu aşkar etdi, halbuki Bbs7 əsasən sitozolik fraksiyada mövcud idi (Şəkil 5A və 5B). PSD fraksiyalarında Bbs4 zülalının aşağı səviyyəsi də birmənalı olaraq təsbit edildi (Şəkil 5A və 5B). Bbs4 və Bbs5 lokalizasiyasının immunofloresans analizi, siçanla ayrılmış hipokampal neyronların bütün dendritik ağacı boyunca Bbs punctae varlığını təsdiqlədi (Şəkil 5C və S7A -S7C Şəkil). Kollektiv olaraq, bu məlumatlar neyron proseslərdə və PSD-lərdə Bbs zülallarının mövcudluğunu açıq şəkildə göstərir.

(A) nano-LC-MS/MS analizindən istifadə edərək biokimyəvi fraksiyalarda BBS zülallarının proteomik profili. Bbs zülallarının və sinaptik markerlərin zülal səviyyələri, siçovul hipokampisinin aşağıdakı biokimyəvi fraksiyalarından etiketsiz LC-MS analizləri ilə təxmin edildi: sitosolik, yuyucuda həll olunan sinaptozomal preparat (DSS, sinaps öncəsi zənginləşdirilmiş) və postsinaptik sıxlıq hazırlığı (PSD) . Presinaptik (VGLU1, SYP) və postsinaptik (NMDAR1, PSD95) protein markerlərinin protein səviyyələri, sırasıyla DSS və PSD preparatlarında zənginləşdirilmişdir. (B) İstilik xəritəsində göstərilən protein bolluqları, bütün nümunələrin ortalamasına qədər ölçülən ümumi MS1 peptid intensivliyindən əldə edilir. Presinaptik (VGLU1, SYP) və postsinaptik (NMDAR1, PSD95) protein markerlərinin protein səviyyələri, sırasıyla DSS və PSD preparatlarında zənginləşdirilmişdir. (C) Bbs zülallarının immunolabelinqinin nümayəndəsi təsviri. Aşağı sıxlıqda becərilmiş siçan hipokampal neyronları, 6 gün in vitro (DIV6) sonra Bbs4 və Bbs5 antikorları (qırmızı), phalloidin (yaşıl) və beta-III tubulin (yaşıl) ilə immunobeled edildi. Ölçü çubuğu, 20 μm (üst panel) və 5 μm (alt panellər). Əsas məlumatlar S4 Data-da mövcuddur. BBS, Bardet-Biedl sindromu DIV6, altı gün in vitro hipokampal mədəniyyət DSS, deterjanda həll olunan sinaptozom LC-MS/MS, maye xromatoqrafiya- tandem kütlə spektrometriyası MS, kütlə spektrometriyası NMDAR1, N-metil-D-aspartat reseptoru 1 PSD, postsinaptik sıxlıq SYP, sinaptofizin TUBB3, TIBB3 geni VGLU1 ilə kodlanmış β-tubulin III, vezikulyar glutamat daşıyıcısı 1.


NƏTİCƏLƏR

Sf9 hüceyrələrində tau zülalının yaratdığı proseslərin formalaşması müxtəlif fosforlaşma yerləri tərəfindən gücləndirilir və ya bastırılır

Bu işdə məqsədimiz hüceyrə polaritesinin qurulmasında tau fosforilasiyasının rolunu araşdırmaq üçün bakulovirus ilə transfeksiya edilmiş Sf9 hüceyrə sistemindən istifadə etmək idi. Tau, aksonların böyüməsini dəstəkləməkdə və onları sabitləşdirməkdə iştirak edən neyron MAP-dır (Drubin və Kirschner, 1986 Lee və s., 1988 Barlow və s., 1994 Esmaeli-Azad və s., 1994). Tau nöronal olmayan hüceyrələrə, məsələn, COS hüceyrələrinə (Kanai) köçürüldükdə hüceyrə prosesləri də əmələ gəlir.və s., 1989) və ya Sf9 həşərat hüceyrələri (Baas və s., 1991, 1994 Knops və s., 1991). Baculovirus transfeksiya sisteminin səmərəliliyi onu hüceyrə reaksiyalarını öyrənmək üçün cəlbedici bir model edir. Bu sistemin MAP -ları və onların variantlarını öyrənmək üçün istifadəsi yaxşı qurulmuşdur (nəzərdən keçirmək üçün bax: Kosik və McConlogue, 1994). Bununla belə, bu tədqiqatları fosforlaşma sahəsinə genişləndirmək üçün əvvəlcə Sf9 hüceyrələrində transfeksiyadan sonra tau fosforlaşdırmağa qadir olan endogen kinazaların olduğunu müəyyən etməli olduq.

Mikrotubullara yaxınlıq və mikrotubulları nüvələşdirmək və ya sabitləşdirmək, onların dinamik qeyri-sabitliyini dəyişdirmək və ya mikroborucuq birləşməsini stimullaşdırmaq qabiliyyəti kimi bir neçə meyardan istifadə edərək, in vitroda geniş şəkildə xarakterizə edilən bir neçə tau konstruksiyasını seçdik (Butner və Kirschner, 1991 Gustke və s., 1994 Panda və s., 1995 Trinczek və s., 1995 Goode və s., 1997). Tau bir çox fosforiləşmə sahəsinə malikdir və müxtəlif kinazlar tərəfindən fosforlaşdırıla bilər, lakin xüsusilə maraqlı olan iki sinif fosforiləşmə yeri var. Bir sinif bir neçə proline yönümlü kinazaların hədəfi olan SP və TP motivlərindən ibarətdir. Bu növ fosforiləşmə inkişaf yolu ilə tənzimlənir, yəni fetal toxumada gücləndirilir (Bramblett və s., 1993) və Alzheimer xəstəliyinin patoloji şəraitində önəmlidir (baxış üçün Johnson və Jenkins, 1996 Mandelkow və Mandelkow, 1998). Buna görə də bəzi SP və ya TP saytlarının AP -yə mutasiya edildiyi və artıq fosforlaşdırıla bilmədiyi konstruksiyalar hazırladıq. Ən kiçik (fetal) insan tau izoformu, tau23/AP quruluşunda AP -yə çevrilmiş 14 belə saytdan ibarətdir (Şəkil 1A). Bu SP və TP motivlərindən bəziləri rahat şəkildə izlənilə bilər, çünki onları fosforlaşmadan asılı şəkildə tanıyan bir sıra mAb var (bu antikorların bir neçəsi əvvəlcə Alzheimer tau-ya qarşı yaradılıb, məsələn, AT-8 [Mercken). və s., 1992] və PHF-1 [Greenberg və s., 1992 nəzərdən keçirmək üçün, bax Friedhoff və Mandelkow, 1999]). Fosforiləşmə saytlarının başqa bir sinfi, təkrarlanan sahədəki KXGS motivlərindən ibarətdir (X = I və ya C). Bunlardan birincisinin fosforlaşması (Ser262 -də) taunun mikrotübüllərə bağlanmasına açıq təsir göstərir (Biernat və s., 1993) və Alzheimer tauda (Morishima-Kawashima) yüksəkdir.və s., 1995 Seubert və s., 1995). KXGS motivləri mikrotübül yaxınlığını tənzimləyən kinaz MARK və PKA (Drewes) hədəfləridir. və s., 1995, 1997 Zheng-Fischhöfer və s., 1998). Buna görə də tau23 -ün 1 -ci hissəsindəki KXGS motivinin KXGA (KXGA/R1 quruluşu), 1 və 4 -cü təkrarlarda (KXGA/R1/4) və ya hər üç təkrarda R1, R3 və R4 -ə çevrildiyi konstruksiyalar hazırladıq. , of tau23 (KXGA/R1/3/4 Şəkil 1A, təkrarların nomenklaturasının və ardıcıllıq nömrələnməsinin ən uzun izoformdan, tau40 -dan alındığını qeyd edir).

Şəkil 1. Tau izoformlarının və ya konstruksiyalarının və antikor epitoplarının diaqramları. (A) Konstruksiyalar: 1) insan mərkəzi sinir sistemində tau'nun ən böyük izoformu olan htau40, C-terminal yarısında dörd ədəd 31 qalıq təkrar (nömrəli qutular) və N-terminalın yaxınlığında iki əlavə (411 qalıq) ehtiva edir. Təkrarların yan tərəfində yerləşən bölgələr P1-P2 və R' (yumrulmuş) ilə etiketlənir. 2) htau23, alternativ birləşmə nəticəsində yaranan altı izoformdan ən kiçiyi (352 qalıq). N-terminal əlavə və ikinci təkrar yoxdur. 3) KXGA/R1 qurun, burada birinci təkrarın KXGS motivində Ser262 Ala ilə əvəz olunur. S262A və S356A). 5) KXGA/R1/3/4 qurun, burada 1, 3 və 4 təkrarların KXGS motivlərindəki serinlər Ala (S262A, S324A və S356A) ilə əvəz olunur. 6) Bütün SP və TP motivlərinin AP ilə əvəz olunduğu tau23/AP qurun. Construct tau23/AP/R1/4 oxşardır, lakin əlavə olaraq Ser262 və Ser356 Ala-ya dəyişdirilir 7) Construct K19 yalnız təkrarları təmsil edir. (B) Antikor epitopları. Fosforilləşmədən asılı olan anticisimlərin əksəriyyəti təkrarlardan əvvəl və ya sonra yan domenlərdə SP və TP motivləri ilə reaksiya verir.

Hüceyrələr tau ifadə edən bakulovirusla yoluxmuş və mikroskop altında bir təbəqədə müşahidə edilmişdir. Hüceyrə gövdələrinin diametri ~16-22 μm olan yuvarlaq formaya malikdir (müvafiq həcmdə hemositometrdə müəyyən edilir, ~2-4 pl), bu, bütün ömrü boyu təxminən sabit qalır. Proseslər >30 saat inkubasiya müddətindən sonra görünməyə başlayır. Tipik olaraq, hər hüceyrədə vahid diametrli (1-2 μm) və uzunluğu 100 μm -ə qədər olan tək bir proses var (Şəkil 2). Proseslərin tezliyi tau protein konsentrasiyasının artmasına paralel olaraq zamanla xətti olaraq artır (Şəkil 3A). Bununla belə, prosesin induksiyasının səmərəliliyi əhəmiyyətli dərəcədə dəyişir. Tau23 halı standart proses formalaşması kimi xidmət edir ~34 saatda başlayır və 1,4%/saat sürətlə artır və 75 saatdan sonra ~60% səviyyəsinə çatır. SP və TP motivlərinin fosforlaşdırıla bilməyəcəyi tau23/AP quruluşu ilə səmərəlilik daha yüksəkdir (t0 = 32 saat yamac, 1,9%/saat son səviyyə, ~80%. Əksinə, tau23 təkrarlanan iki və ya üç KXGS motivi, KXGA/R1/4 və ya KXGA/R1/3/4 -də olduğu kimi fosforlaşdırıla bilmədikdə, səmərəlilik kəskin aşağı düşür (gec başlanğıc, t0 = 38 saat və beş qat daha yavaş artım, 0.3%/saat). Bu fərqli davranışlar, bütün hallarda oxşar səviyyələrə çatan protein ifadəsi ilə əlaqəli deyil (∼45 μg/10 6 hüceyrə Cədvəl1). Beləliklə, fərqlər köçürülmüş zülalların təbiətinə bağlıdır.

Şəkil 2. Müxtəlif tau konstruksiyaları ilə köçürülmüş Sf9 hüceyrələrinin immunofloresans. Hüceyrələr htau23 (A), KXGA/R1 (B) və ya KXGA/R1/3/4 (C) ilə köçürüldü və DM1A (tubulin üçün, solda) və K9JA (tau üçün, sağda) antikorları ilə yoluxduqdan 60 saat sonra immunostain edildi. . Htau23 (A) ilə transfeksiya Ser262-nin Ala (B) ilə mutasiyaya uğradığı zaman bir çox proseslərə gətirib çıxarır, hələ də tau23-ə bənzər proseslər tapılır, lakin hər üç KXGS motivi KXGA (C) ilə dəyişdirildikdə, proseslərin formalaşması demək olar ki, tamamilə maneə törədilir. . Diqqət yetirin ki, tau ləkələnməsi halında hüceyrə cisimləri daha zəif ləkələnmiş prosesləri görüntüyə çox məruz qalır. Çubuq, 50 μm.

Şəkil 3. Prosesin formalaşması zamanı. (A) Bir qatlı kulturadan kəmiyyət təyini. Proseslər infeksiyadan ~30-40 saat sonra görünməyə başlayır, onların tezliyi bundan sonra xətti olaraq yüksəlir. Tau23 (dolu dairələr) üçün ekstrapolyasiya olunmuş başlanğıc t -dir0 = 34 h proses daşıyan hüceyrələrin artımı 1,4% hüceyrə/saat təşkil edir. Tau23/AP (açıq kvadratlar) qurmaq daha səmərəli proseslər daha erkən görünür və daha sürətli artır (t)0 = 32 saat yamac, 1,9%/saat), SP və TP sahələrinin fosforlaşmadığı zaman proseslərin əmələ gəlməsinin gücləndiyini göstərir. KXGA/R1/3/4 (doldurulmuş üçbucaqlar) qurmaq daha az səmərəlidir (t0 = 38 saat yamac, 0,3%/saat), KXGS motivlərinin fosforlaşmasının prosesin formalaşmasını artırdığını göstərir. KXGA/R1 konstruksiyası tau23-ə bənzəyir, KXGA/R1/4 (açıq dairələr) isə KXGA/R1/3/4-ə oxşar davranır və bu, hüceyrələrin reaksiyasını dəyişdirmək üçün iki və ya daha çox KXGS motivinin əməkdaşlıq etməli olduğunu göstərir. Eynilə, prosesin formalaşması da konstruksiya tau23/AP/R1/4 (almazlar) ilə inhibə edilir ki, bu da fosforlaşmanın dominant təsirinin cinah bölgələrində deyil, təkrarlarda olduğunu göstərir. (B) Süspansiyon mədəniyyətindən prosesin formalaşmasının kəmiyyətlənməsi. Bu, sabit prosesləri olan hüceyrələri həddindən artıq vurğulayır, çünki labil olanlar kəsici qüvvələr tərəfindən daha asan itirilir. Beləliklə, proseslər daha azdır, lakin keyfiyyət baxımından tendensiyalar A ilə eynidır, yəni tau23/AP qurmaq ən səmərəlidir, halbuki KXGA/R1/3/4 demək olar ki, heç bir prosesə səbəb olmur. Tau23 və tau23/AP arasındakı dörd qat fərqə diqqət yetirin ki, bu da proseslərin daha böyük sabitliyini göstərir, çünki SP və TP motivləri fosforlaşdırıla bilməz. Çubuqlar, standart sapmalar.

Cədvəl 1. Sf9 hüceyrələrində Tau zülalının konsentrasiyası infeksiyadan sonra vaxtdan asılı olaraq

Nəzərə alın ki, konsentrasiyalar bütün konstruksiyalar üçün müqayisə oluna bilər ki, hüceyrə genişlənmələrindəki fərqlər konsentrasiyadan çox mutasiyalarla hesablanır.

Yuxarıda təsvir olunan proseslərin güclü şəkildə yatırılması əvvəlcə üç KXGS motivinin eyni anda KXGA -ya mutasiya edildiyi zaman müşahidə edildi. Çünki tək bir sahə (ilk təkrarda Ser262) taunun mikrotubullara (Biernat) yaxınlığına üstünlük təşkil edirdi. və s., 1993), burada istifadə olunan analizlərdə də bunun olub olmadığını soruşduq. Ancaq tapırıq ki, Ala262 -yə (KXGA/R1 quruluşu) olan tək sahə mutasiyasının heç bir təsiri yoxdur, halbuki 1 və 4 -cü təkrardakı iki belə mutasiya (Ala262 və Ala356, KXGA/R1/4 qurmaq) mutasiyalarla eyni inhibitor təsir göstərir. hər üç motivdə (Ala262, Ala324 və Ala356, KXGA/R1/3/4 Şəkil 3A qurun). 1 və 4 təkrarlanan KXGA mutasiyalarının prosesin formalaşmasına tam inhibitor təsiri üçün zəruri və kifayət olduğu qənaətinə gəlirik. Bu yerlər MARK kinazının (Ser262 və Ser356 Drewes) ən güclü fosforlaşma yerləri ilə üst-üstə düşür. və s., 1995) PKA tərəfindən də fosforlaşa bilər və Sf9 hüceyrələrində meydana çıxa bilər (bax Şəkil 6, A və D).

SP və ya TP yerlərindəki mutasiyalar KXGA mutantlarına əks təsir göstərdiyindən, qarışdıqda bu mutasiyalardan hansının üstünlük təşkil etdiyini də soruşduq. Bir mutantda, bütün SP və ya TP saytları AP -yə, üstəgəl KXGA saytları 1 və 4 -də təkrarlanır (tau23/AP/R1/4 qurun). Prosesin formalaşması KXGA/R1/4 konstruksiyasında olduğu kimi güclü şəkildə yatırıldı (Şəkil 3A). Bu, təkrarlanan KXGA mutasiyalarının yan bölgələrdəki AP mutasiyalarına üstünlük verdiyini göstərir.

Hüceyrə prosesləri süspansiyonlardan təyin edildikdə, tau konstruksiyaları arasındakı fərqlər daha aydın görünməsi istisna olmaqla, keyfiyyətcə oxşar bir şəkil əldə edilir (Şəkil 3B). Məsələn, infeksiyadan 70 saat sonra tau23 ilə köçürülən hüceyrələrin ∼3% -i prosesləri inkişaf etdirir. Mutant tau23/AP olan hüceyrələr üçün tezlik beş qat daha yüksəkdir (∼15%), mutant KXGA/R1/3/4 olan hüceyrələrdə isə demək olar ki, yoxdur. Süspansiyondakı proseslər, onları pozmağa meylli olan kəsmə qüvvələrinə məruz qaldığından, bu məlumatlar prosesləri daha səmərəli (erkən başlanğıc və sürətli artım baxımından) yaradan quruluşların da mexaniki olaraq daha sabit hala gətirdiyini iddia edir.

Sf9 Hüceyrələrində tau-nun fosforlaşması

Prosesin formalaşmasına tau fosforilasiyası təsir etdiyi şərhi, Sf9 hüceyrələrinin endogen kinazları tərəfindən hansı saytların həqiqətən hədəf alındığından asılıdır. Bu məsələ bir neçə üsulla müəyyən edildi: gel dəyişməsi, antikor reaksiyaları və fosfopeptid analizi (Şəkil 4-6). Təxminən bir araşdırma, fosforlaşma sahəsindən asılı olaraq ≥5 kDa artımına çata bilən SDS gelindəki tau yuxarıya doğru sürüşməsindən əldə edilə bilər (Biernat və s., 1993).Bu dəyişiklik həm də Alzheimer tau üçün xarakterikdir (A68 proteini, Lee və s., 1991). Şəkil 4, transfeksiya edilmiş Sf9 hüceyrələrindən tau-nun da aydın sürüşmə (bir neçə zolaq üzərində paylanmış) nümayiş etdirdiyini göstərir ki, bu da taunun Sf9 hüceyrələrində endogen kinazlar tərəfindən fosforilləşdiyini göstərir. Dəyişmə, "təkrarlanan" mutantlar KXGA/R1 və KXGA/R1/3/4 ilə vəhşi tipli tau23 ilə görünür, ancaq "yan" mutant tau23/AP ilə deyil (homojen bir band olaraq işləyən, əsasən fosforlanmamış, bakteriya ilə ifadə olunan tau). Bu, SP və TP sahələrinin əsasən növbədə iştirak etdiyinə dair əvvəlki müşahidələrimizi təsdiqləyir və Sf9 hüceyrələrində endogen, prolinə yönəlmiş kinazların aktiv olduğunu göstərir.

Şəkil 4. Sf9 hüceyrələrində transfeksiya edilmiş tau və tau konstruksiyalarının fosforilasiyası. (A) 10% SDS-SƏHİFƏ. Tau zülalı və ya mutantlar (tau23, KXGA/R1, KXGA/R1/3/4 və tau23/AP), uyğun tau konstruksiyaları ilə transfekte edilmiş və bərabər həcmdə nümunə tamponunda hazırlanan bərabər miqdarda Sf9 hüceyrələrindən təcrid olunmuşdur. Müxtəlif məhsul vaxtlarını təmsil edən bərabər həcmdə protein məhlulu SDS gelinə yükləndi (10%). Yüklənmiş zülalların miqdarı təxminən 0,4 μg (48 h), 2,5 μg (66 h) və 3 μg (73,5 h) -ə bərabərdir. Çoxlu və güclü yerdəyişmiş zolaqlardan göründüyü kimi, tau23 heterojen bir şəkildə yüksək fosforlaşdırılır. Eyni şey KXGA/R1 və KXGA/R1/3/4 konstruksiyalarına da aiddir (onlarda KXGS motivlərində yalnız bir və ya üç fosforlaşma sahəsi yoxdur, lakin bütün SP və ya TP sahələrini saxlayır). Bunun əksinə olaraq, tau23/AP quruluşu çox az fosforlaşma göstərir və heç bir dəyişiklik göstərmir, çünki əksər fosforiləşmə yerləri yoxdur (KXGS saytlarının Drewesin dəyişməsinə səbəb olmadığını unutmayın. və s., 1995). Nəticə olaraq, güclü sürüşmə yerləri S409 və S416 (PKA və ya CaMKII hədəfləri) də Sf9 hüceyrələrində fosforlaşmır. (B) Eyni nümunələr fosforilasyondan asılı olmayaraq reaksiya verən və tau zülalının ümumi miqdarını əks etdirən 5E2 antikoru ilə immunoblotlandı. Lane M, marker zülallar.

Diaqnostik vasitələr kimi istifadə edilə bilən tau əleyhinə bir sıra fosforiləşməyə həssas antikorlar mövcuddur (Şəkil 1B). İstinad olaraq, transfeksiya edilmiş Sf9 hüceyrələrinin hüceyrə ekstraktları fosforlaşmadan müstəqil antikor 5E2 (Kosik) ilə immunoblotasiya edilmişdir. və s.Tau ümumi miqdarını göstərən 1988). Western blotlarda göründüyü kimi (Şəkil 5), Tau-1, Sf9 hüceyrələrində ifadə olunan bütün tau23 törəmələrini zəif tanıyır və bu, kiçik bir hissənin qalıq 200 ətrafında fosforlaşmadığını göstərir. Tamamlayıcı antikor AT-8, htau23, KXGA/ tərəfindən güclü bir siqnal ortaya qoyur. R1 və KXGA/R1/3/4. Bu təkrar mutantlar, Thr181, Thr231, Ser235, Ser396 və Ser404-də fosforiliyanı göstərən prolinə yönəlmiş fosforiləşməyə həssas olan digər antikorlar (AT-270, AT-180, SMI-34 və PHF-1) tərəfindən də açıq şəkildə tanınır (Şəkil 1B). Xüsusilə maraqlı bir nümunə, Alzheimer tau (Matsuo) üçün unikal olan AT-100 antikorudur. və s., 1994). Epitop əvvəlcə Thr212-nin GSK-3, sonra isə Ser214-ün PKA tərəfindən ardıcıl fosforlaşması ilə əmələ gəlir və polianionlar (Zheng-Fischhöfer) tərəfindən induksiya edilən PHF-yə bənzər konformasiya tələb edir. və s., 1998). Bu epitop köçürülmüş Sf9 hüceyrələrində tau üzərində mövcuddur (Şəkil 5). Eynilə, Ser262/Ser356, antikor 12E8 ilə reaksiyadan göründüyü kimi aydın şəkildə fosforlanır. AT-100 və 12E8 epitoplarında fosforiləşmə fosfatazlara xüsusilə həssasdır, çünki hazırlığın ilkin mərhələlərində sürətlə yox olur.

Şəkil 5. Bakulovirusla ifadə olunan tau və tau konstruksiyalarının fosforlaşma yerləri. Sf9 hüceyrə lizatları (infeksiyadan 72 saat sonra) ləkələnmiş və müxtəlif fosforilasyondan asılı və asılı mAbs ilə inkübe edilmişdir. Tau konstruksiyaları soldan sağa: 1) tau23/AP, 2) KXGA/R1, 3) htau23, 4) KXGA/R1/3/4, 5) transfeksiya edilməmiş Sf9 hüceyrə ekstraktı (tau olmadan nəzarət), 6) Vəhşi tipli baculovirus (tau olmadan nəzarət) ilə köçürülmüş Sf9 hüceyrələri, 7) htau23 ifadəsindəE. coli (fosforlaşdırılmamış nəzarət) və 8) htau23 ilə ifadə edilir E. coli və beyin ekstraktı kinaz aktivliyi ilə fosforlanmışdır (əsasən SP və TP sahələrini təsir edir və güclü bir induksiya yaradır Mr bax Biernatvə s., 1993). Antikorlar, yuxarıdan aşağıya: 5E2 (pan-tau antikoru) tərkibində tau olan bütün preparatları tanıyır. Tau-1, Sf9 hüceyrələrində ifadə olunan tau konstruksiyaları ilə yalnız mülayim bir reaksiya göstərir, çünki qalıq 200-ün yaxınlığındakı tək bir P bağlanması bağlamanı azaltmaq üçün kifayətdir, lakin fosforlanmamış tau ilə ifadə olunan güclü bir reaksiya var. E. colivə ya tau23/AP. ATI-8-dən SMI-34-ə qədər olan antikorlar fərqli fosforlu SP və TP motivlərinə xasdır və buna görə də tau23/AP mutantı və ya E. coli- ifadə edilmiş htau23. Antikor 12E8, təkrarlarda yalnız Ser262 və/və ya Ser356 olan konstruksiyaları tanıyır. AT-100, Thr212 və Ser214-də fosforlanmış tau tanıyır, bu reaksiya Alzheimer tau üçün yüksək dərəcədə spesifikdir, lakin hər iki sahənin fosforlana bilən olması şərtilə (məsələn, tau23/AP mutantında deyil) Sf9 hüceyrələrində də baş verir.

Taunun Metabolik Etiketlənməsi və Fosfopeptidlərin Analizi

Anticisimlər tərəfindən fosforlaşma sahələrinin aşkarlanması iki çatışmazlıqdan əziyyət çəkir: 1) antikorların olmadığı yerlər ola bilər və 2) antikorların rənglənməsi fosforlaşmanın dərəcəsinin etibarlı göstəricisi deyil (çünki antikor yaxınlıqları dəyişkəndir və tez-tez məlum deyil). Htau23 və onun törəmələrinin fosforlaşma yerlərinin daha da xarakterizə edilməsi üçün [32 P] ortofosfor turşusundan istifadə edərək Sf9 hüceyrələrinin metabolik etiketlənməsini həyata keçirdik. Etiketlənmiş tau proteini təcrid edildi, tripsinlə sindirildi və sonra 2D peptid analizi üçün işləndi (Boyle və s., 1991). Peptidləri müəyyən etmək üçün tau ifadə edilir Escherichia coli in vitro müxtəlif kinazlardan istifadə edərək radioaktiv şəkildə fosforilləşdi və tripsinlə həzm olundu və peptidlər HPLC ilə təmizləndi və matris yardımlı lazer desorbsiya və ionlaşma, fosfopeptidlərin ardıcıllığı və fosfopeptid xəritələşdirilməsi ilə müəyyən edildi (ətraflı məlumat üçün, seeDrewes). və s., 1995 İllenberger və s., 1998Zheng-Fischhöfer və s., 1998). Şəkil 6A, Sf9 hüceyrələrində fosforilləşmiş tau23 ilə tapılan fosfopeptid xəritəsini göstərir, burada əsas ləkələr fosforlaşma yerləri ilə müəyyən edilir (identifikasiya haqqında ətraflı məlumat üçün Illenberger-ə baxın. və s., 1998). Mutantlar ilə aparılan təcrübələr bizə fosforlaşma sahələrini 2D xəritədən müvafiq ləkələri çıxarmaqla müəyyən etməyə imkan verdi (Şəkil 6, B və C). Ləkələrin əksəriyyəti ümumi radioaktivliyin ∼80% -ni ehtiva edən SP və ya TP saytlarını təmsil edir. Bu ləkələr S214, S262, S320, S356 və iki naməlum ləkənin olduğu yalnız qeyri-SP və ya TP sahələrinin qaldığı tau23/AP mutantında yox olur (Şəkil 6B). Tau23 fosforlaşma yerlərinin paylanması və intensivliyinin neyronal hüceyrələr də daxil olmaqla, interfaza zamanı digər mədəni hüceyrələrə bənzəməsi diqqət çəkicidir (Illenberger)və s., 1998). Bu, kinaz və fosfataz balansının bu hüceyrələrdə oxşar olduğunu göstərir və baculovirusla köçürülmüş Sf9 hüceyrələrinin model sistem olaraq istifadə edilməsi üçün əlavə bir əsas verir.

Şəkil 6. Sf9 hüceyrələrində ifadə edilən və endogen kinazlarla fosforlanmış tau konstruksiyalarının iki ölçülü fosfopeptid xəritələri. (A) htau23 (daha böyük böyütmə) (B) htau23/AP (C) KXGA/R1/3/4 (D) PKA (E) tau23 və K19 fosforilləşdirilmiş PKA qarışığı ilə fosforilləşdirilmiş K19 qurur. A -da ləkələrin əksəriyyəti 14 SP və TP motivlərindən birini və ya daha çoxunu ehtiva edən fosfopeptidlər tərəfindən əmələ gəlir. Təkrarlanan dörd fosforiləşmə yeri vurgulanır və vurğulanır (S262, S324 və S356, üstəgəl S320 ilə üç KXGS motivi). B -də bütün SP və ya TP motivləri AP -ə çevrilir ki, qalan əsas fosforlaşma yerləri Ser214 və təkrardakılar, üstəgəl bəzi naməlum ləkələr olsun. C -də, təkrardakı KXGS motivləri KXGA olaraq dəyişdirilir və buna görə də S214 və S320 -ni müşahidə edən fosforlanmış SP və SP motivlərindən başqa xəritədə yoxdur. D -də təkrarlanan K19 konstruksiyası yalnız S262, S324, S356 və S320 saytlarını göstərən PKA ilə fosforlandı. Bu nümunə saytları müəyyən etmək üçün E-də tau23 ilə birlikdə işlədilib. Fosfopeptidlərin təhlili haqqında ətraflı məlumat üçün Illenberger-ə baxın və s. (1998).

Şəkil 6C mutant KXGA/R/1/3/4 üçün fosfopeptid xəritəsini göstərir, burada S262, S324 və S356 üç saytı Ala ilə əvəz olunub və buna görə də artıq xəritədə görünmür (bu ləkələr ilə müqayisədə adətən zəifdir). SP və TP saytları və yalnız daha uzun müddətdə görünür, bax. Şəkil 6A). Sf9 hüceyrələrində metabolik olaraq etiketlənmiş tau23-dən olan fosfopeptidləri MARK və ya PKA ilə in vitro fosforlanmış K19 konstruksiyasından (yalnız üç təkrar) fosfopeptidlərlə qarışdırmaqla təkrarlardakı yerlərdə fosforlaşmanı təsdiqlədik ki, bu da fosforu təmsil edən təkrar ləkələrin üst-üstə düşməsi ilə nəticələndi. saytlar (S262, S324 və S356 plus S320 Şəkil 6, D və E).


Alzheimer xəstəliyi və digər tauopatiyalarda Tau fosforlaşması

𠇊myloid kaskad hipotezi ”, AD tipik histologiyası olan bir ailədə bir amiloid prekursor zülal (APP) mutasiyası bildirildikdən sonra hazırlanmışdır və APP parçalanma məhsulu olan beta amiloid (A β) yığılmasının biokimyəvi AD xəstələrinin histoloji və kliniki dəyişiklikləri özünü göstərir (Hardy və Higgins, 1992). Daha sonra, A β oliqomerlərinin, ehtimal ki, tau fosforilləşmə yolu ilə AD -də neyrotoksisitəni tetiklemesi təklif edilmişdir. Glikogen sintaz kinaz-3 β (GSK-3 β) aktivləşdirilməsi, P301L siçanlarda tau fosforiliyinə A 𻉂 oliqomer tərəfindən törədilən təsirlərin vasitəçisi olaraq təklif edilmişdir (Selenica və digərləri, 2013).

Tau sitotoksisitesi və aqreqasiyasında fosforlaşmanın rolu

Tau, ən uzun izoformunda, 35 treonin, 45 serin və 5 tirozin qalığı ehtiva edir ki, bu da tau zülalının təxminən 20% -nin fosforlaşma potensialına malikdir. Erkən tədqiqatlar, taunun daha çox fosforlanmamış vəziyyətdə mikrotübüllərin (MT) yığılmasını təşviq etməkdə daha təsirli olduğunu ortaya qoydu (Lindwall və Cole, 1984). Bir neçə il sonra, tau, AD beynində tapılmış neyrofibrilyar dolaşıqları (NFT) meydana gətirən və bu strukturlarda anormal şəkildə fosforlaşan cütləşmiş sarmal filamentləri (PHF) meydana gətirdiyini nümayiş etdirdi (Grundke-Iqbal və digərləri, 1986 Goedert et. başqaları, 1988 Kosik və başqaları, 1988 Wischik və başqaları, 1988). Əlavə təhlillər PHF-tau-nun AD-də patoloji proseslərə töhfə verdiyi güman edilən patoloji yerlərdə fosforilləşdiyini ortaya qoydu. İnsan AD toxumalarında gücləndirilmiş immunoreaktivlik fosforilasyona bağlı AT8 antikorları (pS199/pS202/pT205 epitopu), PHF-1 (pS396/pS404 epitopu) və pS262 (Gu et al., 2013a Mondragon-Rodriguez et al., 2014). Taunun hiperfosforilasiyasının tau aqreqasiyası və sitotoksikliyində iştirak etdiyi göstərilmişdir (Cədvəl 2) (Kosik və Shimura, 2005 Noble et al., 2013).

Cədvəl 2. Tau fosforlaşma yerləri və təsirləri.

AD xəstələrində anormal yüksək hüceyrədaxili səviyyələr tez-tez müşahidə olunur və tau birləşməsi, PHF meydana gəlməsi və neyron itkisi ilə birbaşa əlaqəli ola bilər (Gomez-Isla və digərləri, 1997). Fərz edilirdi ki, tau-nun hiperfosforilasiyası NFT patologiyasından əvvəl baş verir və daha vacibi, tau-nun fibrillərə inteqrasiyası üçün əsas hadisədir (Bancher et al., 1991). Gümüş ləkə üsulu ilə AD ilə əlaqəli nörofibrilyar patologiyanın mərhələləşməsi AT8 epitopunda hiperfosforilləşmiş tau üçün immunostain istifadə edərək yenidən nəzərdən keçirildi (Braak və digərləri, 2006). Bir neçə tədqiqat, tau hiperfosforiliyasiyasının, nöronal sitopatologiyanın irəliləməsi və AD -də daha yüksək səviyyəli tau növlərinin əmələ gəlməsi ilə əlaqəli olub olmadığı sualını cavablandırdı. Beyin toxuması NFT öncəsi, nöron içi NFT və ekstra nöronal NFT olaraq təsnif edildi və fosforilasyona bağlı tau antikorlarının ən görkəmli boyanması ilə əlaqədar araşdırıldı. Pretangle, qeyri-fibrilyar tau ilə əlaqəli olan epitoplara pS199, pS202, pT231, pS262, pT153 və S409 daxildir. İntranöronal fibrillar strukturları pS46, pT175/pT181, pT231, pS262/pS356 (12E8 epitop), pS396, pS422 və pS214 tanıyan antikorlar ilə boyanmışdır. Hüceyrədənkənar filamentli tau ilə əlaqəli epitoplara AT8, AT100 (pT212/pS214) və PHF-1 (Morishima-Kawashima et al., 1995b Kimura et al., 1996 Augustinack et al., 2002) daxildir. Xüsusilə, xəstəliyin irəliləməsi ilə tau patoloji çox yerli epitoplarda (AT8, AT100, AT180, PHF-1, 12E8) fosforlanır. Tau daxilolmaları MSA (Giasson və digərləri, 2003b), ailəvi və sporadik PD (Ishizawa və digərləri, 2003 Rajput və digərləri, 2006) və Daun sindromu (Flament və digərləri, 1990) kimi digər neyrodegenerativ pozğunluqlarda müşahidə edilmişdir. Mondragon-Rodriguez et al., 2014). Yüngül koqnitiv pozğunluğu olan və sonradan AD inkişaf etdirən xəstələrin serebrospinal mayesində (CSF) yüksək AT180 (pT231/pS235)-fosforilləşdirilmiş tau səviyyələri aşkar edilmişdir (Arai və digərləri, 2000a).

Taunun hiperfosforiliyasını və tauopatiyaların əsas aspektləri kimi NFT -lərin meydana gəlməsini təkrarlamaq üçün bir neçə heyvan modeli yaradılmışdır (Ribeiro və digərləri, 2013). Bəzi tədqiqatlar göstərir ki, transgenik siçanlarda insan mutant taunun həddindən artıq ifadəsi taunun fosforlaşmasının artmasına və tau daxilolmalarının, aqreqatların və fibrillərin əmələ gəlməsinə səbəb olmuşdur. Taunun fosforiləşməsi xəstəliklə əlaqəli tanınmış S202, T205, S212, S216, T231, S262, S356, S422, AT100 epitoplarında aşkar edilmişdir (Kohler və digərləri, 2013 Nilsen və digərləri, 2013 Sahara və digərləri, 2013) ). Eyni şəkildə, siçanlarda LRRK2 və ya p25/Siklindən asılı kinaz-5 (Cdk5) həddindən artıq ifadəsi tau-nun hiperfosforilasiyası, tau-nun NFT-yə bənzər strukturlara yığılması və neyron ölümü ilə nəticələndi (Cruz və digərləri, 2003 Noble və digərləri, 2003 Bailey) və başqaları, 2013). Digər modellər, APP və presenilin 1 (Oddo və digərləri, 2003 Grueninger və s., 2010) kimi digər xəstəliklərlə əlaqəli zülalların birgə ifadəsindən istifadə etdi və ya A β fibrilləri (Gotz et. al., 2001).

AD-də hal-hazırda mövcud olan bütün heyvan modelləri, patogen mutant tau formalarının həddindən artıq ifadəsinə əsaslanır. Buna görə də, bu modellərin nə tau, nə də APP -də mutasiyalar olmadığı AD hallarını nə qədər yaxşı əks etdirməsi mübahisəlidir. Bununla belə, ya 3 təkrar, ya da 4 təkrar insan WT tau-nun həddindən artıq ifadəsinə əsaslanan tauopatiyanın ilk modelləri tau hiperfosforilasiyasını təqdim etdi, lakin heç bir NFT meydana gəlmədi. Tau-P301L ifadəsi, tez-tez digər xəstəliklərlə əlaqəli zülallarla birlikdə, AD-nin tau hiperfosforlaşması, toplanması və filament əmələ gəlməsi, eləcə də neyron ölümü kimi əsas aspektlərini təkrarlamaq üçün ən çox istifadə edilən və ən uğurlu yanaşmadır. Bu modellərdə tau hiperfosforiliyinin nəyə səbəb olduğu aydın deyil. In vitro tədqiqatlar spesifik patogen mutasiyaların tau fosforilasiyasına təsirini deşifrə etməyə kömək edə bilər, lakin mövcud məlumatlar ardıcıl deyil. Tanınmış FTDP-17 ilə əlaqəli missense tau mutasiyaları R406W, V337M, G272V və P301L, WT tau proteini ilə müqayisədə tau siçovul beyin kinazaları tərəfindən fosforlaşma üçün daha əlverişli substrat halına gətirir (Alonso Adel et al., 2004). ). Başqa bir araşdırmada, eyni mutasiyaların müəyyən yerlərdə fosforiliyanı təşviq etdiyi və ya inhibe etdiyi göstərilmişdir (Han və digərləri, 2009). In vitro rekombinant GSK-3b ilə fosforiləşmə, ehtimal ki, uzunmüddətli uyğunlaşma dəyişiklikləri nəticəsində R406W mutasiyasının azalmış fosforlaşmasını həyata keçirdi. Əksinə, P301L və V337M mutasiyalarının heç bir təsiri olmamışdır (Connell və digərləri, 2001). Oxşar nəticələr hüceyrə mədəniyyətində də əldə edilmişdir (Dayanandan et al., 1999). Bunun əksinə olaraq, hüceyrə kulturası modellərindən və insan beyin toxumasından istifadə edən bir neçə araşdırma göstərir ki, R406W mutasiyası yalnız qonşu PHF1 epitopunda deyil, bir neçə mövqedə tau fosforiliyasını azaldır (Miyasaka və digərləri, 2001 Deture et al., 2002 Tackenberg və Brandt) , 2009 Gauthier-Kemper et al., 2011). Bununla birlikdə, hüceyrə kontekstindən asılı olaraq, R406W -nin fosforiliyanı artırdığı və V337M kimi digər mutasiyaların müəyyən yerlərdə tau fosforiliyasını azaltdığı da göstərildi (Deture et al., 2002 Krishnamurthy və Johnson, 2004). Fosforlaşma vəziyyətindəki dəyişikliklər aşağıda müzakirə edildiyi kimi taunun struktur xüsusiyyətlərinə, funksiyasına və patologiyasına böyük təsir göstərə bilər.

In vitro məlumatlar müəyyən epitoplarda tau-nun fosforilləşməsinin yerli struktur xüsusiyyətlərinə və ya taunun qlobal uyğunlaşmasına birbaşa təsir etdiyini göstərir ki, bu da öz növbəsində onun PHF-lərə yığılmasına təsir göstərə bilər. AT8, AT100, AT180, PHF-1 və S305 daxil olmaqla, tau fibrilizasiyası üçün vacib olduğu bilinən PHF6-heksapeptid motivinin yuxarı axınında müxtəlif yerlərin tau birləşmə meyli və filament formalaşması üçün vacib olduğu təklif edilmişdir (Sun və Gamblin, 2009 Bibow et al., 2011 Inoue et al., 2012). Bəzi tədqiqatlar, AT8, PHF-1 və AT100 epitoplarında fosforiləşmədən asılı olaraq tau büzməli konformasiyasının sıxılmasının daha sıx və ya gevşek olacağını irəli sürdü (Jeganathan və digərləri, 2008 Bibow və digərləri, 2011). Eyni şəkildə, təkrar bölgə daxilində fosforiləşmə, xüsusən də KXGS motivlərində, taunun MT bağlayıcı xüsusiyyətlərini dəyişdirən spesifik konformativ dəyişikliklərə səbəb oldu (Fischer və digərləri, 2009). Digər hallarda, struktur dəyişiklikləri qlobal konformasiyaya təsir etmədən fosforlaşma sahələrinin yaxınlığında lokallaşdırılmışdır (Schwalbe et al., 2013).

Sahədə intensiv tədqiqatlara baxmayaraq, tau aqreqatlarının əmələ gəlməsinə fosforlaşmanın töhfəsi hələ də mübahisəlidir (Cədvəl 2). Son nəticələr in vitro rekombinant, fosforlaşdırılmamış tau, AD-dən alınan PHF-lərə bənzər fibril meydana gəlməsinə səbəb olduğunu göstərən təcrübələr, fibrillyasiya prosesi üçün tau fosforilasyonunun zəruriliyini şübhə altına aldı (Morozova və digərləri, 2013). Bundan əlavə, AD vəziyyətlərinin toxumasında dəyişdirilmiş onurğa morfologiyası və onurğa itkisi fosforlanmış tau miqdarından çox dolaşıqların tərkibinə aid edilmişdir (Merino-Serrais və digərləri, 2013). PS19 siçanlarını (tauP301S mutasiyası) istifadə edən bir işdə, sintetik tau fibrilləri tau hiperfosforiliyasız olduqda NFT patologiyasına səbəb olmuşdur (Iba və digərləri, 2013). “pro-” və ” və 𠇊nti-” məcmu mutasiyalarının tətbiqi, tau hexapeptid motivlərinin lokal və#x003B2 vərəqli bir quruluş meydana gətirmək və sonradan PHF meydana gəlməsinə səbəb olmaq üçün bir nüvə rolunu oynaya biləcəyini ortaya qoydu (Von) Bergen et al., 2000 Eckermann et al., 2007). Tau mRNA -nın sabitləşməsi ilə artan tau səviyyələri, tau fosforiliyasından asılı olmayan tau patologiyasına kömək edə bilər (Qian və digərləri, 2013).

Taunun digər PTM -ləri fosforlaşmasına mane ola bilər və bununla da zülalın quruluşuna, funksiyasına və tənzimlənməsinə təsir göstərə bilər, lakin məlumatlar tutarlı deyil. KXGS motivlərinin AD olan xəstələrdə hipoasetilləşmiş və hiperfosforilləşdiyi aşkar edilmişdir. in vitro taunun asetilasyonunun fosforlaşmasını maneə törətdiyini və tau birləşməsini maneə törətdiyini göstərən məlumatlar (Irwin və digərləri, 2013 Cook və digərləri, 2014).Bunun əksinə olaraq, K280-də tau asetilasyonu, tau transgenik siçanların tau aqreqatlarında AT8 epitopunda fosforilləşmə ilə əlaqəli idi və AD və ya digər tauopatiyalı xəstələrin ölümündən sonra toxumalarında aşkar edildi (Min və digərləri, 2010 Cohen et al., 2011 Irwin və digərləri, 2012). Taunun özünün asetiltransferaza aktivliyinə malik olduğunu və özünü asetilasiyanı katalizasiya edə biləcəyinə dair son sübutlar verilmişdir (Cohen və digərləri, 2013). In vitro, S400-də O-bağlı β-N-asetilqlükozaminilasiya (O-GlcNAcylation) S396-da tau fosforilasiyası ilə tərs korrelyasiya edildi (Smet-Nocca et al., 2011). Bununla birlikdə, tau transgenik siçanların bir O-GlcNAcase inhibitoru ilə müalicəsi tau O-GlcNAcylation'ı artırdı, tau aqreqatlarının meydana gəlməsini maneə törətdi və tau fosforlaşmasına təsir etmədən neyrodejenerasiyanı yavaşlatdı (Yuzwa et al., 2012 Graham et al., 2013).

Bir neçə qalıqda taunun fosforlaşması hüceyrə toksisitesinə vasitəçilik edir (Cədvəl 2). Bir çox məlumatlar tau fosforiliyinin yaxşı balanslaşdırılması lazım olduğunu göstərir. Belə bir fərziyyə irəli sürülmüşdü ki, tau-nun MT-dən ayrılması MT sabitliyinin pozulmasına və sitozolda həddindən artıq bağlanmamış hiperfosforilləşdirilmiş tau miqdarına səbəb olur və bununla da zəhərli insultlara səbəb olur. In vitro təcrübələr S262, T231 və S214-də tau-nun fosforilləşməsinin tau-nun MT-lərdən tam ayrılması üçün zəruri olduğunu sübut etdi (Illenberger et al., 1998 Sengupta et al., 1998). Ardıcıl olaraq, S262 və T231 -də fosforlaşmanın artması, hüceyrə və heyvan modellərində MT qeyri -sabitliyi və sitotoksisiteylə nəticələndi (Steinhilb et al., 2007 Qureshi et al., 2013). Üstəlik, təkrarlanan domenlərin KXGS motivlərində tau fosforiləşdirən mikrotubulaya yaxınlığı tənzimləyən kinazların (MARKs) həddindən artıq ifadə edilməsi və aktivləşdirilməsi ilə patoloji proseslər xilas edildi (Mandelkow və digərləri, 2004 Thies və Mandelkow, 2007). Patoloji yerlərdə tau-nun aberrant fosforilasiyası tau-MT bağlanmasının dəyişməsi ilə nəticələnə bilər və bununla da MT şəbəkələrinin təşkilinə və dinamikasına təsir göstərə bilər. Bu da öz növbəsində aksoplazmik axını və düzgün neyron funksiyasını poza bilər və nəticədə hüceyrə ölümünə səbəb ola bilər. KXGS motivləri daxilində fosforlaşma, xüsusilə S262 və GSK-3β-də, müvafiq olaraq, fosforlaşma yerləri və tau kinazlar arasında əsas rol oynayır.

Mitokondrial disfunksiya və oksidləşdirici stress həm neyrodegenerasiyada hüceyrə ölümü ilə sıx bağlıdır. Siçanlarda süperoksid dismutaz 2 çatışmazlığı və APP-ni ifadə edən mitokondriyal oksidləşdirici stress S396-da amiloid yükünü və taunun hiperfosforiliyasını ağırlaşdırdı. Antioksidantların yüksək dozaları ilə müalicə tau hiperfosforilasiyası və nevropatologiyanın qarşısını alır (Melov et al., 2007). Mutant tau, APP və presenilin 1 ifadə edən üçlü AD siçanları dolaşıqlıqlar və A β lövhələrini inkişaf etdirdi və mitokondriyanın məhv olmasında A β və taunun sinerjik təsirlərini göstərən bir neçə mitokondriyal zülalın tənzimlənməsini nümayiş etdirdi (Rhein və digərləri, 2009).

Şübhəsiz ki, tau hiperfosforilasiyası AD və digər tauopatiyalarda vacib bir hadisədir və tau aqreqatlarının və NFT-lərin görünüşünə paraleldir, lakin böyük səylərə baxmayaraq, nəticədə toksikliyə və neyrodejenerasiyaya səbəb olan əsas mexanizmlər çətin olaraq qalır (Papanikolopoulou et al. , 2011). Son illərdə, hüceyrədaxili aqreqatlarda taunun ayrılmasının, hüceyrənin artıq miqdarda zülaldan qaçma yolu olduğu hipotezi irəli sürüldü. Bunun əvəzinə, tau oligomerləri hüceyrəyə zərər verən və nəticədə hüceyrə ölümünə səbəb olan zəhərli növlər hesab olunurdu (Sahara və Avila, 2014).

Fosforlanmış (AT8, PHF-1, S422) tau oligomerlərinin yığılması, UPS disfunksiyası ilə müşayiət olunan insan AD sinapslarında aşkar edilmişdir (Henkins və digərləri, 2012 Tai və digərləri, 2012). İnsan AD beyin nümunələrində tau oliqomerə xas antikorun istifadəsi, tau oliqomerlərinin AD-nin erkən mərhələlərində, ya spesifik epitoplarda tau fosforilasiyasının təzahüründən əvvəl və ya sonra ortaya çıxdığını aşkar etdi (Lasagna-Reeves et al., 2012). Beləliklə, hiperfosforilləşmiş tau formalarının PHF strukturlarına yığılması, əhəmiyyətli hüceyrə zülallarını ayıraraq neyrotoksik ola bilər, eyni zamanda zəhərli oligomerik tau yığılmasının qarşısını alaraq neyroprotektiv ola bilər.

Tau fosforlaşmasının fizioloji və patoloji təsirləri

Normal fosforlaşma səviyyəsində, tau 2 𠄳 mol fosfat/mol protein ehtiva edir və həll olunan sitosolik zülaldır (Khatoon et al., 1992). Ümumilikdə 85 fosforlaşdırıla bilən qalıqdan təxminən 30 qalıq normal tau zülallarında fosforlanır (Morishima-Kawashima et al., 1995a Hanger et al., 2009a). Tau fosforiləşmə sahələrinin çoxu, prolinlə zəngin olan bölgədə, mikrotübül bağlayıcı təkrarları (MTBR) və ya MTBR-yanındakı sahələrdə qruplaşdırılmışdır.

Tau ifadəsi və fosforiləşmə inkişaf yolu ilə tənzimlənir. Tək bir tau izoformu fetal insan beynində ifadə edilir, altı isoform yetkin insan beynində ifadə edilir, fetal tau ən qısa yetkin tau izoformuna uyğundur. Embriogenez zamanı tau fosforlaşma dərəcəsi azalır (Mawal-Dewan və digərləri, 1994), bu da erkən inkişaf prosesində nöronal plastisiyanın artması ilə əlaqəli ola bilər (Brion və digərləri, 1993 Hanger və digərləri, 2009a). PHF-tau, normal yetkinlərə nisbətən 3 və#x020134 qat fosfat ehtiva edir (Khatoon et al., 1992 Iqbal et al., 2013). Yetişməmiş beyində, PHF-lərdə olduğu kimi, tau çox sayda saytda fosforlanır (Kenessey və Yen, 1993 Morishima-Kawashima və digərləri, 1995b). Ancaq yetkin beyində olduğu kimi, fetal tauda fosforlaşma yalnız qisməndir. PHF-lərdə tau-nun fosforilasiyası “hyperphosphorylation” kimi ifadə edilir, bu da fizioloji olanlardan başqa digər sahələrin fosforilləşdiyini nəzərə alır. Bu vəziyyətə həmçinin �normal” və ya “patoloji” fosforilasiya da deyilir.

MT dinamikası tau molekulları ilə MT izləri arasındakı balanslaşdırılmış nisbətdən asılıdır. Tau molekullarının həddindən artıq və ya zəif bağlanması, məsələn, tau fosforlaşma vəziyyətinin tənzimlənməsinin pozulması nəticəsində MT şəbəkələrinin sabitsizləşməsi və dağılması ilə nəticələnir. Bu, sitoskeletal arxitekturanın formalaşmasında və aksonal və orqanellə daşınması üçün yol kimi MT funksiyasına birbaşa təsir göstərir və “CTau-mikrotubul hipotezi”ndə (Alonso et al., 1994) bərpa olunur.

Erkən tədqiqatlar aydın şəkildə göstərdi ki, tau neyron polaritesinin və aksonal böyümənin qurulmasında mühüm rol oynayır (Caceres və Kosik, 1990). Neyritin uzanması və geri çəkilməsi MARK və GSK-3 və#x003B2 vasitəli tau fosforilləşmə ilə tənzimlənə bilər (Biernat və digərləri, 2002 Sayas və digərləri, 2002). MTBR daxilində tau fosforlaşmasının müvafiq neyrit artımı üçün zəruri olduğu güman edilirdi, halbuki yan domenlər daxilində SP və TP motivlərində fosforlaşma neyronların diferensiasiyasını gecikdirir (Biernat və Mandelkow, 1999). Tau, kinesin yükü, digər kinesin əsaslı yükləri sıxışdıraraq, aksonların inkişafı və sabitləşməsinin sitoskeletal elementlərin tarazlığından asılı olduğunu göstərir (Dubey et al., 2008).

Tau-nun həddindən artıq ifadəsi, fosforlaşmadan asılı şəkildə MT-dən asılı aksonal nəqli pozduğu bilinir (Sato-Harada et al., 1996). GSK-3 və#x003B2-nin konstitusiya cəhətdən aktiv ifadəsi daha da ağırlaşdı, halbuki GSK-3 β inhibisyonu veziküllərin birləşməsini və lokomotor disfunksiyanı xilas etdi. Drosophila model (Mudher et al., 2004 Cowan et al., 2010b). G18-də Fyn kinaz tərəfindən tau fosforiləşməsi, GSK-3 β siqnal kaskadının aktivləşməsinin qarşısını almaq və bununla da anterograd sürətli aksonal nəqliyyata tau və x00027-lərin inhibitor təsirini aradan qaldırmaq üçün təklif edilmişdir (Kanaan et al., 2012). Bu məlumatlar, GSK-3 β-nin patoloji həddindən artıq aktivləşməsinin tau hiperfosforlaşması yolu ilə aksonal nəqli maneə törətdiyini göstərir. Bunun əksinə olaraq, digər tədqiqatlar göstərdi ki, tau fosforilasiyasının GSK-3 β inhibitorları tərəfindən inhibə edilməsi mitoxondrial nəqliyyatın və hərəkətliliyin azalması və hüceyrələrdə mitoxondrial klasterləşmənin artması ilə əlaqələndirilir (Tatebayashi et al., 2004 Llorens-Martin et al., 2011). Tau, motorların, xüsusən də kinesinin, MT izlərinə bağlanma və ayrılma tezliklərinə təsir edərək hüceyrədaxili alveri idarə edə bilər (Trinczek və digərləri, 1999 Morfini və digərləri, 2007). Həddindən artıq taunun, MARK-ın vasitəçiliyi ilə tau fosforilləşməsi və taunun MT-lərdən ayrılması ilə taunun çıxarılması ilə geri çevrilən veziküllər və orqanellələr üçün nəqliyyat bloku rolunu oynadığı fərz edildi (Thies və Mandelkow, 2007). Bununla birlikdə, tau'nun MT-dən ayrılması aksonal nəqliyyat blokadasına və nörodejenerasyona da kömək edə bilər (Iijima-Ando və digərləri, 2012). Tau kinazları və fosfatazların qarşılıqlı təsiriylə taufun fosforlaşma və fosforiləşmə dövrləri, nevritin böyüməsi və aksonal nəql üçün dinamik bir MT şəbəkəsini qorumaq üçün tau funksiyasını tənzimləmək üçün ümumi bir mexanizm olaraq xidmət edə bilər (Fuster-Matanzo və digərləri, 2012 Mandelkow və Mandelkow, 2012). Maraqlıdır ki, həddindən artıq ifadə edilmiş tau-nun somatodendritik bölmədə düzgün paylanmaması, aksonlarda və dendritlərdə daha çox və sıx şəkildə yığılmış MT-lərin meydana gəlməsi ilə nəticələndi. AT8 epitopunun fosfomimik mutasiyaları MT -lər arasındakı boşluğun genişlənməsinə səbəb olmuş və bununla da aksonal nəqliyyat və mitokondrial hərəkət qüsurlarına kömək edə bilər (Thies və Mandelkow, 2007 Shahpasand və digərləri, 2012). Bundan əlavə, fosforlaşdırılmış tau, mikrotubulyar sitoskeletonun pozulmasına və aksonal nəqlin pozulmasına səbəb olan MT -lərdən uzaq olan nevritlərdə normal tau tuta bilər (Niewiadomska və digərləri, 2005 Cowan və digərləri, 2010a Iqbal və digərləri, 2013).

Hüceyrədənkənar Aβ, tau və NFT əmələ gəlməsinin hiperfosforilasiyasını gücləndirir, həmçinin N-metil-D-aspartat reseptorunun (NMDAR) funksiyasını modulyasiya etmək və eksitotoksisiteyi induksiya etmək təklif edilmişdir (Lauren et al., 2009). Bununla birlikdə, A β ilə qarşılıqlı əlaqədə olan molekulların çoxluğu arasında spesifik A β hədəfi və siqnalın hüceyrədaxili yayılması çətin olaraq qalır. Prion zülalı A β -nin bağlayıcı ortağı olaraq təklif edildi, lakin bu qarşılıqlı əlaqənin əhəmiyyəti haqqında hələ də mübahisə var (Balducci və digərləri, 2010 Kessels və digərləri, 2010 Chen və digərləri, 2013a). A β, Fyn-in aktivləşməsinə səbəb olur və bu da öz növbəsində post-sinapsda tau fosforilləşmə vəziyyətindən və tau lokalizasiyasından asılı olan NMDAR-ların alt birliyinin fosforlaşmasını artırır. İlkin artımdan sonra səthi NMDARların sayı azaldı, bu da dendritik onurğa itkisi və eksitotoksisitə səbəb oldu (Um et al., 2012). NMDAR ilə birlikdə bir kompleks meydana gətirən Fyn və tau'nun qarşılıqlı əlaqəsi sinaptik plastisiyanı modullaşdırır və AD -də glutamatın eksitoksisitesinə sinapsları həssaslaşdırır (Ittner və digərləri, 2010).

Taunun fosforlaşması da dəyişmiş dövriyyə və proteolizlə əlaqəli idi. Tau daxil edilmələrində ubiquitin immunoreaktivliyinin aşkarlanması, ubiquitin proteazom sisteminin (UPS) artıq tau proteolitik cəhətdən pozmaması kimi şərh edilmişdir (Bancher və digərləri, 1989). Proteasomal inhibisyon, xüsusilə hiperfosforilləşmiş tau növlərinin yığılması ilə nəticələndi (Shimura və digərləri, 2004) və nevritik nəqliyyatın pozulması (Agholme və digərləri, 2013). Neyronlarda otofaginin inhibisyonu, fosforlanmış tau növlərinin klirensindən həm otofajik, həm də proteazomal yolların məsul olduğunu göstərən yabanı tip tau üzərində fosfomimik taunun 3 qat yığılması ilə nəticələndi (Rodriguez-Martin və digərləri, 2013). AD kortekslərinin biokimyəvi və morfoloji təhlili aşkar etdi ki, tau, ubiquitinated substratların və proteazom komponentlərinin artması ilə əlaqəli olaraq, presinaptik və postsinaptik terminallarda hiperfosforilləşir və yanlış qatlanır (Tai və digərləri, 2012).

Tauopatiyalarda tau hiperfosforilasiyasının təsiri üçün bir çox başqa mexanizmlər təklif edilmişdir. Hüceyrə ölümü, yaşlı siçanlarda insan tau izoformlarını nokaut fonunda ifadə edən hüceyrə dövrü tənzimləyici zülalların ifadəsi ilə müşayiət olunurdu (Andorfer və digərləri, 2003). Hüceyrə dövrünə uyğun olmayan təkrar giriş AD-də rol oynayır və hüceyrə dövrü ilə əlaqəli kinazların aktivləşdirilməsi yolu ilə tau hiperfosforilasiyası ilə əlaqələndirilə bilər (Delobel və digərləri, 2002 Absalon və digərləri, 2013). Mitoxondrial parçalanma proteini Drp1 ilə anormal qarşılıqlı əlaqə mitoxondrial disfunksiya və neyron zədələnməsinə səbəb ola bilər (Manczak və Reddy, 2012). DNT zədələnməsi Chk1 və 2 nəzarət nöqtələrinin kinazlarının aktivləşməsi, AD ilə əlaqəli yerlərdə sonradan tau fosforlaşması və insan tau ifrazında tau ilə əlaqəli nörodejenerasiyanın artması ilə nəticələndi. Drosophila (Iijima-Ando et al., 2010). AD beyinlərinin immunohistokimyəvi analizi, tau-nun D421-də kəsildiyini və bu parçalanmanın Alz-50 antikoru tərəfindən aşkar edilən konformasiya dəyişikliklərindən sonra baş verdiyini, lakin E391-də parçalanmadan əvvəl olduğunu ortaya qoydu (Guillozet-Bongaarts et al., 2005). D421 və E391 kəsilmiş növlərin yığılması xəstəliyin erkən mərhələlərində baş verir və AD-nin irəliləməsi ilə əlaqələndirilir (Basurto-Islas və digərləri, 2008). Transgen siçanlarda taunun kəsilməsinin dolaşıqlaşmadan əvvəl patologiyaya səbəb olduğu göstərildi (McMillan et al., 2011). Hüceyrələrdə tau-nun bir neçə qalıqda hiperfosforilasiyası və kaspaza-3-ün imtiyazlı parçalanma yeri olan D421-də taunun parçalanması tau ifrazını gücləndirdi. Bu, beyində tau patologiyasının yayılması və CSF-də tau yığılması üçün potensial mexanizmlər kimi təklif edilmişdir (Plouffe et al., 2012).

Kinazlar Tau Fosforlaşmasında iştirak edir

Tau hiperfosforlaşma modelinə bənzər, tau kinaz aktivləşməsinin fərqli bir imzaya xas modeli haqqında fikir ortaya çıxdı (Duka və digərləri, 2013). Məsul kinazları və tau-nun müvafiq fosforlaşma yerlərini müəyyən etmək üçün bir neçə cəhd edildi (Cədvəl 2). Bununla birlikdə, kinazların çoxu bir neçə tau qalığını fosforilləşdirir və əksər tau fosforiləşmə yerləri birdən çox kinazın hədəfləridir (Şəkil 3). Əlavə olaraq, bir yerdə fosforlaşmanın başqa bir yerdə fosforlaşmasını asanlaşdırması və tau fosforiliyinin ümumi səviyyəsini tənzimləmək üçün geribildirim hadisələrinin olması, xüsusi bir fosforilasyon sahəsinin müəyyən bir disfunksiya funksiyasına təyin edilməsinə mane olur. tau (Bertrand et al., 2010 Kiris et al., 2011).

Şəkil 3. Fosforilləşə bilən tau-nun ən uzun izoformunda müxtəlif qalıqları təsvir edən sxematik təsvir. SP/TP motifləri (mavi ilə təmsil olunur), KXGS motivləri (sarı rənglə təmsil olunur) və digər yerlər (boz rənglə təmsil olunur) prolinə yönəldilmiş kinazlar (mavi rəngdə təmsil olunur) və prolin olmayan Ser/Thr kinazları (təmsil olunur) ilə fosforlaşdırıla bilər. yaşıl). Antikor epitopları AT8, AT100, AT180 və PHF-1 ikili və üçlü serin/treonin qalıqlarından ibarətdir (mötərizədə göstərilir). FTDP-17 ilə əlaqəli bəzi mutasiyalar qırmızı rəngdə göstərilmişdir. N1, N2 və R2 -nin alternativ birləşməsi tau -nun altı fərqli izoformunu yaradır. N1, N2, N-terminal əlavə 1 və 2 R1-R4, MT bağlama 1 𠄴 GSK-3 β, Glikogen sintaz kinaz 3 β Cdk5, Siklindən asılı kinaz 5 CK, kazein kinaz MARK, mikrotubul yaxınlığı tənzimləyir. kinaz LRRK2, lösinlə zəngin təkrar kinaz 2 DAPK, Ölümlə əlaqəli protein kinaz Dyrk1A, ikili spesifik protein kinaz.

20-dən çox serin/treonin kinaza da daxil olmaqla çoxsaylı kinazların tau fosforilləşdirdiyi göstərilmişdir. in vitro lakin AD ilə əlaqələri hələ də araşdırılır (Hanger et al., 2009b Cavallini et al., 2013).

Prolin yönümlü kinaz GSK-3β xüsusilə PHF və NFT-lərin əmələ gəlməsi ilə əlaqəli idi və AD patogenezində əsas vasitəçi kimi təklif edildi (Hooper et al., 2008 Terwel et al., 2008 Ma, 2014 Medina və Avila, 2014). GSK-3β PHF-1, AT8, AT180, AT100, S404 və S413 epitopları daxil olmaqla, SP/TP sahələrində tau hədəfləyir (Pei və digərləri, 1999 Medina və Avila, 2014). GSK-3 β səviyyələrindəki dəyişikliklər bir neçə hüceyrə və heyvan modellərində tau fosforlaşmasındakı dəyişikliklərlə əlaqələndirilmişdir (Hernandez et al., 2013). Mitoxondrial toksinlər və ya neyrodejenerativ pozğunluqlardakı şərtləri təqlid etmək üçün oksidləşdirici stress kimi stress stimulları tau-nun GSK-3 β vasitəçiliyi ilə fosforilləşməsinin artması, hüceyrə metabolik fəaliyyətinin azalması və MT-nin destabilizasiyası ilə nəticələndi (Hongo et al., 2012 Selvatici et al., 20) . Digər tədqiqatlar GSK-3 β-ni tau fosforiləşdirici kinaz rolundan kənarda AD patogenezində görkəmli oyunçu kimi göstərir. Tau-P301Lx GSK-3 β siçanları, neyronların əksəriyyətində dolaşıqlığı olan, lakin tau hiperfosforiliyasız olduqda ağır ön beyin tauopatiyası inkişaf etdirmişlər (Muyllaert və digərləri, 2006). Bir Drosophila model, bir GSK-3 β homologunun və insan taunun birgə ifadəsi, GSK-3 β-nin tau fosforiliyasına görə pro-apoptotik bir protein olması səbəbindən toksisitenin artmasına səbəb olmuşdur (Jackson et al., 2002).

Serin/treonin kinaz Cdk5, nöronal inkişafda və köçdə, nevritin böyüməsində və sinaptik ötürülmədə mühüm rol oynayır və AD patogenezində rol oynayır (Cheung və Ip, 2012 Shukla və digərləri, 2012). AD-in bir neçə beyin bölgəsindəki Cdk5-in immunoreaktivliyi, əvvəlcədən dolaşma və erkən NFT mərhələləri ilə əlaqələndirilmiş və bir sıra neyronlarda AT8-pozitiv tau ilə kolokalizasiya olunmuşdur (Pei və digərləri, 1998 Augustinack və digərləri, 2002). Cdk5 aktivatorunun p35-in konstitutiv aktiv formaya p25-ə çevrilməsi ilə əlaqədar olaraq Cdk5 aktivliyinin AD-də nəzarət hallarından daha yüksək olduğu aşkar edilmişdir (Lee və digərləri, 1999 Patrick və digərləri, 1999 Shukla et al., 2012).

İnsan p25/Cdk5 həddindən artıq ifadə edən siçanlar inkişaf etmiş Cdk5 aktivliyini, taunun hiperfosforiliyasını və sitoskeletal disorganizasiyanı nümayiş etdirdi (Ahlijanian et al., 2000). Cdk5-in aktivləşməsi mutant taunun həddindən artıq ifadəsi ilə birlikdə tau hiperfosforilasiyası və dolaşıq meydana gəlməsi ilə əlaqələndirildi (Noble və digərləri, 2003). APPswe siçanları, p25 səviyyəsindəki artım səbəbiylə artan Cdk5 aktivliyi və AT8 və PHF-1 epitoplarında tau əhəmiyyətli fosforiliyasını, artan Cdk5 aktivliyi ilə tau hiperfosforiliyinə bağlayan AT8 və PHF-1 epitoplarında göstərdi (Otth və digərləri, 2002). Bundan əlavə, Cdk5-in GSK-3 və#x003B2 ilə əlaqəli olması təklif edildi. İnsan p25-ni ifadə edən siçanlar yüksək Aβ səviyyələri göstərdi, lakin fosfo-tau səviyyələrini azaldıb və GSK-3β aktivliyini azaldıb. Cdk5 inhibitorlarının tətbiqi A β istehsalını azaldıb, lakin taunun fosforiliyasını dəyişdirməmişdir ki, Cdk5 əsasən APP işlənməsini tənzimləyir, GSK-3 β isə tau fosforlaşmasında dominant rol oynayır (Wen və digərləri, 2008 Engmann və Giese, 2009 ). Cdk5 və mitogenlə aktivləşdirilmiş protein kinaz (MAPK) yolları arasındakı kəsişmə, nöronal apoptoz və sağ qalma siqnalı ilə əlaqəni göstərir (Sharma və digərləri, 2002 Zheng və digərləri, 2007). AD və digər nörodejenerativ xəstəliklərdə (Kim və Choi, 2010).AD gedişində, ERK və JNK bütün mərhələlərdə, p38 isə yüngül və ağır hallarda (Braak III -VI mərhələlər) aktivləşir (Pei və digərləri, 2001 Zhu və digərləri, 2001). p38 və JNK immunoreaktivliyi, fosforlanmış PHF-tau əleyhinə qaldırılmış antikorlar tərəfindən tanınan neyritik lövhələr, nöropil iplər və NFT-lər olan neyronlarla əlaqəli idi (Hensley və digərləri, 1999 Atzori və digərləri, 2001).

MARK1-4 kinazları neyron polaritesinin qurulmasında və neyrit artımının tənzimlənməsində iştirak edən qeyri-prolin yönümlü kinazlardır (Biernat et al., 2002 Matenia və Mandelkow, 2009 Reiner və Sapir, 2014). MARK -lar, fosforilləşmə yolu ilə tau -nun MT -lərə yaxınlığını tənzimləmək qabiliyyətinə görə adlandırılmışdır (Drewes et al., 1997). Əhəmiyyətli olaraq, MARKs, KXGS motivləri içərisində, xüsusən də S262 -də, fosforilasyonun AD dövründə erkən aşkar edildiyi üçün fosforilat edir. MARK2 və MARK4 ifadəsi, həmçinin bu kinazların tau ilə qarşılıqlı təsirləri, AD beyinlərində əhəmiyyətli dərəcədə inkişaf etmiş, xəstəliyin Braak mərhələləri ilə əlaqələndirilmiş və NFT -lərlə əlaqələndirilmişdi (Chin et al., 2000 Gu et al., 2013a).

Transgenik olaraq Drosophila, həddindən artıq ifadəsi Drosophila homolog Par-1 fosforilasyonun artması və insan taunun toksikliyinin artması ilə əlaqələndirildi. Par-1 funksiyasının itirilməsi və Par-1 istiqamətləndirilmiş fosforlaşma yerlərində (S262, S356) tau mutasiyası tau-induksiya etdiyi toksiklikdən xilas edilmişdir. Maraqlıdır ki, tau-nun Par-1 fosforilasiyası GSK-3β və Cdk5 vasitəsilə aşağı axın fosforilasiyası və xəstəliklə əlaqəli fosforlaşma epitoplarının yaranması üçün ilkin şərt idi (Nishimura et al., 2004). MARK2 aktivləşdirilməsi, somatodendritik bölmədə həddindən artıq ifraz və taunun düzgün paylanmaması nəticəsində yaranan sinaptik çürümədən xilas oldu (Mandelkow və digərləri, 2004 Thies və Mandelkow, 2007). Bununla birlikdə, MARK4 -ün həddindən artıq ifadəsi tau hiperfosforlaşması və onurğaların itməsi ilə nəticələndi ki, bu da A β müalicəsindən sonra özünü göstərdi. Buna görə də, MARKlar onurğa morfologiyasında və sinaptik ötürülmədə tənzimləyici funksiyalara malik ola bilər, eyni zamanda sinapslar və dendritik onurğalar üzərində A β ilə əlaqəli toksiklikdə kritik vasitəçi rolunu oynaya bilər (Zempel və digərləri, 2010 Hayashi və digərləri, 2011 Yu et al. , 2012). Bundan əlavə, tau-nun MARK tərəfindən fosforlaşması, tau-nun PHF-lərə yığılmasını maneə törətməsi təklif edildi (Schneider və s., 1999), hiperfosforilləşmiş, MT ilə bağlanmamış tau hovuzunun PHF-lərə yığılması fərziyyəsinə ziddir. SP/TP sahələrində tau-nun fosforilasiyası tau-MT bağlanmasına az təsir göstərir və AD-də müşahidə olunur, tau-nun MT-dən ayrılmasını PHF-lərə toplaşmaq qabiliyyətindən ayırır. GSK-3 β, iki fərqli saytda, aktivləşdirici T208 və inhibitor S212-də, MARK2-ni fosforilləşdirərək, xüsusən S262-də taunun fosforiliyasını modullaşdırdığını göstərdi (Kosuga və digərləri, 2005 Timm və digərləri, 2008). MARK1/2 aktivliyi də DAPK -nın ölüm sahəsi ilə tənzimlənirdi. DAPK MARK-ı aktivləşdirdi və tau-nun fosforlaşmasını təşviq etdi, eyni zamanda tau-nun T231, S262 və S396-da MARK-dan asılı olmayan yollarla hərəkət etdiyi görünür (Wang et al., 2010 Duan et al., 2013). Üstəlik, DAPK kobud göz və fotoreseptor neyronlarının itkisinə səbəb oldu Drosophila model, qismən aktivləşdirmə yolu ilə Drosophila ortholog Par-1 (Wu et al., 2011b). PKC, sinir polaritesinde əhəmiyyətli bir rol oynayan MARK2'nin mənfi tənzimləyicisi olaraq təsvir edilmişdir (Chen et al., 2006).

CK1 və CK2 serin/treonin-selektiv protein kinazlardır. NFT-lər anti-CK2 antikorları ilə çox güclü boyansa da, ümumi CK2 immunoreaktivliyi AD hallarının beynində azalır (Iimoto et al., 1990). CK-1 δ, AD beyinində tənzimlənir və regional patoloji dərəcəsi ilə əlaqədardır. CK-1 δ, NFT'ler, nöropil iplər və distrofik nevritlərlə birlikdə kolokalizasiya olunur (Yasojima və digərləri, 2000). Hüceyrələrdə CK1 δ inhibisyonu, S396/S404 səviyyəsindəki tau fosforilasyonunu 70%-dən çox azaldır. CK1δ-ün ekzogen ifadəsi S202/T205 və S396/S404-də tau fosforlaşmasını artırdı və tau-MT bağlanmasını azaltdı (Lee və Leugers, 2012).

PHF-tau'daki bir neçə sayt, GSK-3 β və protein kinaz A (PKA) kimi digər kinazlarla birlikdə CK1 tərəfindən hədəf alınır. Üstəlik, S113, S238 və S433 olan üç sahə, bu kinazın tau patologiyasında müvafiq rolunu düşündürən CK1 δ hərəkəti ilə fosforiləşmişdir (Hanger et al., 2007). Sintetik Aβ-nin CK1 və CK2-nin fəaliyyətini stimullaşdırdığı və substrat kazeinin fosforlaşmasına vasitəçilik etdiyi bildirildi. in vitro (Chauhan və başqaları, 1993). Konstruktiv olaraq aktiv CK1-in ekzogen ifadəsi olan hüceyrələrdə Aβ istehsalı artdı və CK1 spesifik inhibisyonu ilə azaldı (Flajolet et al., 2007).

Dyrk1A AD, Down sindromu və Pick xəstəliyində yuxarı tənzimlənir. Dyrk1A immunoreaktivliyi səpələnmiş neyronların sitoplazmasında və nüvəsində müşahidə edilmiş və sarkosildə həll olunmayan PHF fraksiyalarında aşkar edilmişdir. Transgenik siçanlarda Dyrk1A -nın həddindən artıq ifadəsi beyində tau səviyyəsinin artmasına və NFT -lərdə yığılmasına gətirib çıxardı (Wegiel et al., 2008). Dyrk1A tərəfindən T212-də tau-nun birbaşa fosforilasiyası hələ də sübuta malik deyil in vivo.

LRRK2, ehtimal olunan bir kinaz, həm irsi, həm də sporadik PD ilə genetik əlaqəsi və AD ilə mümkün üst-üstə düşməsi səbəbindən son illərdə maraq qazandı (Zhao et al., 2011 Ujiie et al., 2012). LRRK2-nin tau patologiyasında iştirakı ilə bağlı ilk göstərişlər mutant LRRK2 ifadə edən transgen siçanlarda verilmişdir. Bu heyvanlar T149, T153 və AT8, CP13, 12E8 və PHF-1 epitoplarında tau fosforlaşmasının artdığını, hüceyrə cisimlərində və nöropildə tau mislokalizasiyasını və tau birləşməsini göstərdi (Li və digərləri, 2009, 2010 Melrose və digərləri, 2010 Bailey və digərləri, 2013). Müvafiq olaraq, AT8 epitopunda tau fosforilasiyası LRRK2 nokautlu siçanlarda azalmışdır (Gillardon, 2009). Bir neçə tədqiqat, LRRK2 -nin digər kinazları və siqnal ötürmə yollarını fosforiləşdirdiyini və aktivləşdirdiyini, bununla da tau fosforiliyasına, mislokalizasiyasına və dendritik dejenerasyona töhfə verdiyini göstərir (Gloeckner və digərləri, 2009 Lin və digərləri, 2010 Chen və digərləri, 2012).

İnsan beynindəki anormal fəaliyyətlərindən gözlənilən bir neçə digər kinaz AD patologiyasına səbəb ola bilər (Martin və digərləri, 2013). Ümumiyyətlə, kinazların nizamsızlaşmasının, tau, anormal tau-MT bağlanması, tau mislokalizasiyası və PHF-lərə tau yığılmasının hiperfosforiliyindən məsul olduğu ehtimal olunur. Bununla birlikdə, taunun hansı fosforlaşma yerlərinin ən kritik olduğu, hansı kinazların əsas oyunçular olduğu və bu proseslərin AD və digər nörodejenerativ xəstəliklərdə toksikliklə mexaniki olaraq necə əlaqəli olduğu hələ də bilinmir.


Məzmun

Elm adamları qəhvəyi yağ toxumasında termojenik aktivliyi müşahidə etdilər və nəticədə əvvəlcə "Açılmayan Protein" kimi tanınan UCP1 -in kəşfinə səbəb oldu. [3] Qəhvəyi toxuma, yüksək termojenik aktivliyi simvolizə edən mitokondriyal tənəffüsün yüksək səviyyələrini və ATP sintezi ilə birləşməyən başqa bir tənəffüsünü ortaya qoydu. [3] UCP1, ADP fosforiləşməsi ilə əlaqəli olmayan bir proton yolunun aktivləşdirilməsindən məsul kəşf edilmiş zülal idi (adətən ATP Sintaz vasitəsilə aparılır). [3]

Məməlilərdə tanınan beş UCP homologu var. Bunların hər biri özünəməxsus funksiyaları yerinə yetirsə də, müəyyən funksiyaları bir neçə homoloq yerinə yetirir. Homoloqlar aşağıdakılardır:

  • UCP1, termogenin və ya SLC25A7 olaraq da bilinir, SLC25A8 olaraq da bilinir, SLC25A9 olaraq da bilinir
  • UCP4, SLC25A27 olaraq da bilinir
  • UCP5, həmçinin SLC25A14 kimi tanınır

Bədən istiliyinin saxlanması Redaktə edin

Kəşf edilən ilk ayrılan protein UCP1, qışqıran və kiçik gəmiricilərin qəhvəyi yağ toxumalarında kəşf edildi və bu heyvanlara titrəməyən istilik verir. [3] Bu qəhvəyi yağ toxumaları kiçik gəmiricilərin bədən istiliyinin qorunması üçün çox vacibdir və (UCP1) sökülmüş siçanlar üzərində aparılan tədqiqatlar göstərir ki, bu toxumalar ayrılmayan zülallar işləmədən düzgün işləmir. [3] Əslində, bu tədqiqatlar aşkar etdi ki, bu nokaut siçanlar üçün soyuq uyğunlaşma mümkün deyil, bu da UCP1-in bu qəhvəyi yağ toxumalarında istilik istehsalının vacib bir sürücüsü olduğunu göstərir. [7] [8]

Bədənin başqa yerlərində, zülal aktivliklərinin mikro mühitlərdə istiliyə təsir etdiyi bilinir. [9] [10] Bunun, bu bölgələrdəki digər zülalların fəaliyyətinə təsir göstərəcəyinə inanılır, baxmayaraq ki, hüceyrələrdəki temperatur gradyanlarının ayrılmasının əsl nəticələrini müəyyən etmək üçün hələ də iş görmək lazımdır. [9]

ATP konsentrasiyalarında rolu Düzəliş edin

UCP2 və UCP3-ün ATP konsentrasiyasına təsiri hüceyrə tipindən asılı olaraq dəyişir. [9] Məsələn, pankreas beta hüceyrələri UCP2 aktivliyinin artması ilə ATP konsentrasiyasında azalma yaşayır. [9] Bu, hüceyrə degenerasiyası, insulin ifrazının azalması və II tip diabetlə əlaqədardır. [9] [11] Əksinə, hipokampus hüceyrələrində UCP2 və əzələ hüceyrələrində UCP3 mitoxondrilərin istehsalını stimullaşdırır. [9] [12] Daha çox mitokondriya, ADP və ATP -nin birləşdirilmiş konsentrasiyasını artırır və bu birləşməyən zülallar birləşdikdə ATP konsentrasiyasında xalis bir artımla nəticələnir (yəni protonun sızmasına imkan verən mexanizm inhibə edilir). [9] [12]

Reaktiv oksigen növlərinin konsentrasiyasının saxlanılması Edit

UCP2 və UCP3 funksiyalarının bütün siyahısı məlum deyil. [13] Bununla belə, tədqiqatlar göstərir ki, bu zülallar reaktiv oksigen növlərinin (ROS) konsentrasiyasını məhdudlaşdıran mənfi əks əlaqə dövrəsində iştirak edir. [14] Hazırkı elmi konsensus bildirir ki, UCP2 və UCP3 proton nəqlini yalnız aktivləşdirmə növləri mövcud olduqda həyata keçirir. [15] Bu aktivatorlar arasında yağ turşuları, ROS və bəzi ROS yan məhsulları da var ki, onlar da reaktivdir. [14] [15] Buna görə də yüksək ROS səviyyələri birbaşa və dolayısı ilə UCP2 və UCP3-ün aktivliyinin artmasına səbəb olur. [14] Bu, öz növbəsində, mitoxondriyadan proton sızmasını artırır, mitoxondrial membranlar boyunca proton-hərəkətedici qüvvəni azaldır, elektron daşıma zəncirini aktivləşdirir. [13] [14] [15] Bu proses vasitəsilə protonun hərəkətverici qüvvəsinin məhdudlaşdırılması, ROS istehsalını məhdudlaşdıran mənfi geribildirim döngəsi ilə nəticələnir. [14] Xüsusilə, UCP2 mitokondriyanın transmembran potensialını azaldır və bununla da ROS istehsalını azaldır. Beləliklə, xərçəng hüceyrələri mitoxondriyada UCP2 istehsalını artıra bilər. [16] Bu nəzəriyyə həm UCP2, həm də UCP3 nokaut siçanlarında ROS istehsalının artdığını göstərən müstəqil araşdırmalarla dəstəklənir. [15]

Bu proses insan sağlamlığı üçün vacibdir, çünki ROS-un yüksək konsentrasiyası degenerativ xəstəliklərin inkişafında iştirak etdiyinə inanılır. [15]

Neyronlardakı funksiyalar Edit

Əlaqədar mRNT aşkar edilərək, UCP2, UCP4 və UCP5 insan mərkəzi sinir sisteminin bütün neyronlarında yerləşdiyi göstərildi. [17] Bu zülallar neyron funksiyasında əsas rol oynayır. [9] Bir çox tədqiqat nəticələri mübahisəli olaraq qalsa da, bir neçə tapıntı geniş şəkildə qəbul edilir. [9]

Məsələn, UCP -lər neyrondakı sərbəst kalsium konsentrasiyalarını dəyişir. [9] Mitoxondriya neyronlarda kalsiumun saxlanmasının əsas yeridir və saxlama qabiliyyəti mitoxondrial membranlardakı potensialla artır. [9] [18] Buna görə də, ayrılan zülallar bu membranlardakı potensialı azaltdıqda, kalsium ionları neyronda ətraf mühitə buraxılır. [9] Akson terminalları yaxınlığında mitokondriyanın yüksək konsentrasiyası səbəbindən bu, UCP -lərin bu bölgədəki kalsium konsentrasiyalarının tənzimlənməsində rol oynadığını göstərir. [9] Kalsium ionlarının nörotransmisyonda böyük rol oynadığını nəzərə alaraq, elm adamları bu UCP -lərin nörotransmisyona birbaşa təsir etdiyini proqnozlaşdırırlar. [9]

Yuxarıda müzakirə edildiyi kimi, hipokampusdakı neyronlar bu ayrılan zülalların mövcudluğunda ATP konsentrasiyasının artmasına səbəb olur. [9] [12] Bu, alimləri UCP-lərin sinaptik plastisiyanı və ötürülməsini yaxşılaşdırdığı fərziyyəsinə gətirib çıxarır. [9]


NƏTİCƏLƏR

N2a Hüceyrələrində Neurit artımı Tau'nun Təkrar Sahəsində KXGS Motiflərində Fosforlaşma tələb edir

Araşdırmalarımızın bir məqsədi tau zülalının, fosforiliyinin və protein kinazlarının nevritlərin işlənməsindəki rolunu müəyyən etmək idi. Buna nail olmaq üçün həm hüceyrə bioloji, həm də biyokimyəvi müşahidələrə imkan verən eksperimental sistem lazımdır. Biz siçan neyroblastoma hüceyrə xətti N2a üzərində cəmləşdik, çünki serumdan məhrum edildikdən sonra retinoik turşu ilə asanlıqla neyritəbənzər hüceyrə prosesləri yaratmaq üçün differensasiya oluna bilər (Şəkil 2). Neyron hüceyrələrinin diferensiallaşması endogen tau tələb edir (Drubin və Kirschner 1986 Caceres və Kosik, 1990 Esmaeli-Azad və s., 1994) N2a hüceyrələrində tau yalnız aşağı konsentrasiyalarda, immunofluoressensiya ilə aşkar edilə biləndən aşağıdır. Biz insan fetal tau izoformu htau23-ü (352 qalıq) keçici olaraq vəhşi tipli N2a hüceyrələrinə köçürdük ki, bu da onları diferensiallaşma stimulundan sonra uzun neyritlər inkişaf etdirməyə vadar edir. Şəkil 2a misalında transfeksiya edilmiş hüceyrələrin ~60%-də hüceyrənin bədəninin diametrindən iki dəfə artıq proseslər var. Nəzarət olaraq, ekzogen htau23 ifadə etməyən hüceyrələr arasında yalnız 20% -i uzadılmış proseslər inkişaf etdirir (Şəkil 2, a, b və f).

Şəkil 2. N2a hüceyrələri tərəfindən neyritin böyüməsi və tau fosforlaşmasından asılılıq. N2a hüceyrələri zərdabın çıxarılması və retinoik turşusu ilə fərqləndirildi və sonra tau və ya tau mutantları ilə keçici olaraq transfeksiya edildi və iki hüceyrə bədən diametrindən (>40 mkm) daha uzun uzanmış neyritlərin inkişafı üçün xal verildi. (a və c) Tau boyanması (antikor K9JA). (b və d) Tubulin boyanması (DM1A). (a və b) Htau23 (50% effektivlik) ilə keçici olaraq köçürülən hüceyrələr. Ekzogen tau ifadə etməyən hüceyrələr arasında yalnız 20% genişlənmiş neyritlər inkişaf etdirir (nəzarət Şəkil 2e). Bunun əksinə olaraq, ekzogen htau23 ifadə edən hüceyrələr arasında uzadılmış nevritləri olan fraksiya 60% -ə yüksəlir (Şəkil 2, a və b, oxlar və f). (c və d) Htau23-ün KXGA mutantı ilə transfeksiya edilmiş hüceyrələr: Ekzogen tau mutantını ifadə edən hüceyrələr arasında (2, c və d-də oxlarla vurğulanan üç hüceyrə) yalnız bir neçə hüceyrədə iki hüceyrə bədən diametrindən daha uzun neyritlər inkişaf edir (digər transfeksiya edilməmiş hüceyrələri müqayisə edin). d). Bu, KXGS motiflerindeki fosforlaşmanın nevritin böyüməsi üçün əhəmiyyətli olduğunu göstərir. (e) Fərqləndirilmiş nəzarət N2a hüceyrələri (tau ilə transfeksiya yoxdur). (f) Müxtəlif tau konstruksiyaları ilə neyrit əmələ gəlməsinin histoqramı: Nəzarət hüceyrələrinin yalnız 20%-i genişlənmiş neyritləri göstərir, lakin htau23 ilə transfeksiya olunmuş hüceyrələrin 60%-i. Htau23 KXGA mutantı ilə köçürülən hüceyrələr nəzarətlə müqayisə olunur (20%, MARK2 ilə fosforlaşma mümkün deyil). AP mutantı ilə köçürülən hüceyrələr htau23 (60%, prolinə yönəldilmiş kinazlar tərəfindən fosforlaşma yoxdur) ilə transfeksiyaya bənzəyir. Məlumatlar göstərir ki, htau23 və AP mutantı ilə transfeksiya neyritin böyüməsini təşviq etməkdə eyni dərəcədə effektivdir, KXGA mutantı ilə transfeksiya isə heç bir təsir göstərmir. Səhv çubuqlarında SE göstərilir.

Tau, bir neçə kinaz tərəfindən fosforlaşdırıla bilən bir çox Ser və ya Thr qalıqları ehtiva edir. Neyritlərin böyüməsinin taunun fosforlaşmasından asılı olub-olmadığını araşdırmaq üçün müəyyən Ser və ya Thr qalıqlarının Ala-ya çevrildiyi bir neçə tau konstruksiyaları yaratdıq və beləliklə, onları fosforlaşma üçün əlçatmaz etdi. Fosforiləşmə sahələri arasında fərqli sinifləri ayırd etmək olar: 1) S-P və ya T-P motivləri (14, isoform htau23-də, əsasən Şəkil 1-in təkrarlanmasını əhatə edən sahələrdə) GSK-3β və cdk5 kimi prolinə yönəldilmiş kinazlarla fosforlaşdırıla bilər. Neyrodejenerasiyada rol oynadıqları düşünülür (Imahori və Uchida, 1997 Mandelkow və Mandelkow, 1998), Alzheimer tau üçün xarakterik olan bir neçə antikorun (məsələn, AT-8, AT-100, AT-180 və PHF) epitoplarını təhrik edirlər. -1), lakin tau-mikrotubul qarşılıqlı təsirinə yalnız təvazökar təsir göstərir (Biernat və s., 1993). 2) KXGS motivləri (təkrar üçün bir, htau23-də üç, htau40-da dörd Şəkil 1) ilk növbədə MARK (və daha az səmərəli PKA Biernat) prolin yönümlü olmayan kinazaların hədəfləridir. və s., 1993 Drewes və s., 1997), mikrotübüllərdən tau ayırmaqda (xüsusilə ilk təkrarda Ser262) aydın təsir göstərir və onları in vitro və in vivo dinamik hala gətirir (Ebneth və s., 1999). Buna görə də biz htau23-ün dəyişdirilmiş konstruksiyalarını yaratdıq, birində bütün 14 S-P və ya T-P motivləri A-P (AP-tau) şəklində mutasiya edilmiş, digəri isə KXGA (fosforlana bilməyən KXGA-tau) mutasiya edilmiş KXGS motivləri ilə (Şəkil 1). AP-tau N2a hüceyrələrinə köçürüldükdə, təsir yabanı tipli tau təsirinə bənzəyirdi, yəni köçürülmüş hüceyrələrin təxminən yarısı genişlənmiş prosesləri nümayiş etdirərək güclü bir nevrit induksiyasına bənzəyirdi (Şəkil 2f). Prolin yönümlü kinazlar hüceyrələrdə aktiv olduğundan (aşağıya bax), bu nəticə o deməkdir ki, SP və ya TP motivlərində fosforlaşma neyritin böyüməsi üçün daha az əhəmiyyət kəsb edir.

Bunun əksinə olaraq, KXGA-tau ilə eksperimentin təkrarlanması zamanı diferensiasiya stimulundan sonra genişlənmiş neyritlərin böyüməsi demək olar ki, ləğv edildi. Nəzarət olaraq, təsir tau mutantını əslində ifadə edən hüceyrələrlə məhdudlaşdı (Şəkil 2c, oxlu hüceyrələr), digərləri fərqləndikdən sonra normal proseslər əldə edir (Şəkil 2d, oxsuz hüceyrələr). Beləliklə, təkrarlanan KXGA mutasiyaları taunun nevritləri induksiya etmə qabiliyyətini əslində ləğv edir (Şəkil 2f). Qeyd edirik ki, KXGA mutantı, KXGS motivlərində tau fosforiləşmiş taudan fərqli olaraq, yabanı tip fosforlanmamış tau kimi mikrotübülləri bağlamaq və polimerləşdirmək qabiliyyətinə malikdir (Biernat və s., 1993 nəşr olunmamış məlumatlarımız). Bu nəticələr, N2a hüceyrələrinin KXGS motivlərini fosforiləşdirən aktiv kinaz (lar) ehtiva etdiyini və bu motiflərdəki fosforiliyin nevritin böyüməsi üçün vacib olduğunu göstərir.

Neurit artımı MARK2-nin Fəaliyyəti ilə Təşviq Edilir

Taunun KXGS motivlərinin nevritin böyüməsi üçün əhəmiyyətli olduğunu nəzərə alaraq, növbəti sual məsul kinaz (lar) ı müəyyən etmək idi. Daha əvvəl göstərdik ki, tau və əlaqəli MAP -lərdə KXGS motivlərini fosforlaşdıran kinaz MARK (Drewes)və s., 1995 İllenberger və s., 1996). Buna görə də, MARK-ın N2a hüceyrələrində neyritin böyüməsinə və tau fosforlaşmasına necə təsir etdiyini soruşaraq kinazanın identifikasiyasına yaxınlaşdıq. Təəccüblüdür ki, MARK2-nin N2a hüceyrələrinə keçici transfeksiyası, transfeksiya dərəcəsi aşağı (1-2%) olmasına baxmayaraq, əlavə stimullar olmadan (məsələn, zərdabın çıxarılması və retinoik turşusu Şəkil 3a, b və e) fərqləndirməyə səbəb oldu. Bunun əksinə olaraq, MARK2-nin dominant mənfi mutantını ifadə edən N2a hüceyrələrinin əksəriyyəti (Şəkil 3, c, d və e) diferensiasiya stimulundan sonra belə genişlənmiş neyritlər əmələ gətirə bilmədi. Daha əvvəl göstərildiyi kimi (Drewes və s., 1997), bu mutant in vitro və hüceyrələrdə tənzimləyici dövrədə fosforilə bilən qalıqları alaninlərlə (T208A və S212A) əvəz etməklə qeyri-aktiv hala gətirildi. Vəhşi tipli N2a hüceyrələri yalnız aşağı səviyyədə 24 ng/10 7 hüceyrə səviyyəsində endogen tau ehtiva edir (Ackmann tərəfindən hazırlanmış fermentlə əlaqəli immunosorbent analizindən istifadə etməklə) və s., 2000).Buna görə də tau-nun fosforlaşma vəziyyətini biokimyəvi cəhətdən təhlil etmək üçün MSS-də ən böyük tau izoformu olan htau40-ı stabil şəkildə ifadə edən N2a hüceyrələrini ~40 qat daha yüksək səviyyədə (~1 μg/107 hüceyrə) yaratdıq. Bu hüceyrələr dnMARK2 ilə müvəqqəti olaraq köçürüldü. MARK2-nin qeyri-aktiv mutantını ifadə edən hüceyrələr neyritlər əmələ gətirə bilmədi (Şəkil 4, a-d, oxlar), halbuki dnMARK2-ni ifadə etməyən hüceyrələr fərqlənə bildi (Şəkil 4, a-d, ulduzlar). Bu, MARK2 və ya yaxından əlaqəli bir izoformun nevritin böyüməsi və taudakı KXGS motivlərinin fosforlaşması üçün əhəmiyyətli ola biləcəyini iddia edir. MARK2-nin tau fosforilləşmə yolu ilə işlədiyini yoxlamaq üçün, N2a hüceyrələri GFP-MARK2 və KGXA-htau23 ilə kotransfekte edildi (Şəkil 4, e-h). Hüceyrələrin tau mutantının KXGA mutantını və ya həm MARK2, həm də KXGA mutantını ifadə etdiyi hallarda genişlənmiş neyritlərin əmələ gəlməsi kəskin şəkildə azalır. Başqa sözlə, tau'nun nevrit təşviq edən təsirləri ya KXGS hədəf motivini tau üzərində dəyişdirməklə (KXGA-tau Şəkillər 2c və 4, e-g), ya da kinaz MARK2 inaktivləşdirməklə aradan qaldırıla bilər (Şəkil 3, c-e ).

Şəkil 3. N2a hüceyrələrinin MARK2 ilə transfeksiyası nevrit əmələ gəlməsini təşviq edir və dominant mənfi MARK2 onu maneə törədir. N2a hüceyrələri müvəqqəti olaraq MARK2 (a və b) və ya MARK2 (c və d) dominant mənfi mutantı ilə transfekte edildi. (a və c) MARK2 üçün boyanma (antikor 12CA5). (b və d) Tubulin üçün boyanma (antikor DM1A). (a və b) Yalnız aşağı səviyyəli endogen tau olan hüceyrələr fərqlənmədən əvvəl zərdabda heç bir nevrit göstərməsə də (b, ulduz işarələrində yuvarlaqlaşdırılmış hüceyrələrə baxın) və prosesləri inkişaf etdirmək üçün fərqlənmə şərtləri (serum çəkilməsi, retinoik turşu və s.) , MARK2 ilə transfeksiya bu maneəni aşır və MARK2 transfeksiya edilmiş hüceyrələrin 60%-nə hətta serum çəkilməməsi və retinoik turşusu olmadan neyritləri fərqləndirməyə və genişləndirməyə imkan verir (a və b-də mərkəzdəki hüceyrəyə, ox və histoqram e bax). (c və d) N2a hüceyrələri dnMARK2 ilə transfeksiya edildikdə, dnMARK2 ifadə edən hüceyrələrin yalnız kiçik bir hissəsi (6%) diferensiallaşmadan sonra genişlənmiş neyritlər əmələ gətirir (Şəkil 3e).

Şəkil 4. Aktiv olmayan MARK2 (dnMARK2) və ya fosforlaşdırıla bilməyən Tau (KXGA) tərəfindən nevrit artımının inhibe edilməsi. Htau40 ilə sabit şəkildə transfekte edilmiş N2a hüceyrələri serumun çıxarılması və retinoik turşu ilə fərqləndirilə bilər (b və c, ulduzlara baxın). Bununla birlikdə, dnMARK2 nevrit meydana gəlməsini maneə törədir (a, oxlara baxın). (d) dnMARK2 -nin nevritləri basdırdığını göstərən histogram (köçürülmüş hüceyrələrin təxminən 90% -i nevrit inkişaf etdirə bilmir). (a -c) N2a/htau40 hüceyrələrində dominant mənfi mutantın (dnMARK2) ifadəsi. (a) dnMARK2 (antikor 12CA5) üçün boyanma. (b) Tau üçün rəngləmə (K9JA). (c) tubulin üçün boyanma (DM1A). (e-g) N2a hüceyrələri GFP-MARK2 və KXGA/htau23 ilə müvəqqəti olaraq kotransfeksiya edilir və sonra fərqlənir. İkiqat köçürülmüş hüceyrələrdə (oxlar) heç bir nevrit yoxdur, köçürülməmiş hüceyrədə isə uzadılmış nevritlər vardır. (h) Transfeksiyadan sonra genişlənmiş nevritlərlə N2a fraksiyasını göstərən histogram: nəzarət N2a hüceyrələri, htau23, MARK2, htau23-KXGA mutantı ilə köçürülmüş hüceyrələr, htau23-KXGA və MARK2 ilə ikiqat transfeksiya. Məlumat göstərir ki, htau23 və MARK2 nevritin böyüməsini təşviq edir, htau23-KXGA bu aktivasiyanı ləğv edir və hətta MARK2, KXGS motivlərində taunun fosforlaşması səbəbindən KXGA-tau mutantının nevrit əmələ gəlməsinə mane olan təsirini xilas edə bilmir. bloklanır.

MARK2-nin canlı hüceyrələrdə tau KXGS motivlərini həqiqətən fosforiləşdirdiyini göstərmək üçün GFP-MARK2-ni (və ya dominant mənfi mutantını) tau ilə sabit şəkildə transfuziya edilmiş N2a hüceyrələrinə köçürdük. Fərqlənmiş hüceyrələr GFP flüoresansı (MARK2 Şəkil 5a-nı göstərir), aktiv MARK2-yə qarşı p-MARK antikoru ilə immunofluoressensiya (Şəkil 5b) və tauda (antikor 12E8 Seubert) fosfo-KXGS motivləri ilə təhlil edilmişdir. və s., 1995 Şəkil5c). Üç nümunə oxşar idi, bu, aktiv MARK2-nin hüceyrə boyu tau ilə eyni bölmələrdə lokalizasiyasını və buna görə də onu fosforlaşdıra biləcəyini göstərirdi. Bunun əksinə olaraq, dnMARK2 ilə transfeksiya heç bir fərq göstərmədi, aktiv MARK2 üçün boyanma və fosfo-KXGS tau (bizim nəşr olunmamış məlumatlarımız). Bu tapıntıları təsdiqləmək üçün zülallar N2a hüceyrələrindən təcrid edildi və fosforiləşmə yerləri Western blotlarda məlum olan fosfoya həssas antikorlar tərəfindən təyin edildi (Şəkil 5, d və e). Pan-tau antikoru K9JA, fosforilişdən asılı olmayaraq tau algılar və protein konsentrasiyası üçün standart olaraq xidmət edir. 12E8 antikoru 1 və 4-cü tau-təkrarlarda (S262 və S356 ehtiva edir) fosforlanmış KXGS motivlərini aşkar edir. MARK2 köçürüldükdə (Şəkil 5d, zolaq 2), lakin transfeksiyasız və ya dnMARK2 ilə transfeksiyadan sonra zəif olduqda onun siqnalı artır (Şəkil 5d, Zolaqlar 1 və 3). 1-ci zolağındakı zəif reaksiya, ehtimal ki, endogen MARK izoformalarının qalıq fəaliyyətini əks etdirir. Nəzarət olaraq MARK2 ifadəsi (aktiv və ya qeyri-aktiv) HA-teqinə qarşı antikor tərəfindən aşkar edilir (Şəkil 5, d və e). Nəhayət, MARK2-nin aktivləşmə vəziyyəti, dovşan poliklonal peptid antikoru p-MARK (SA6941) tərəfindən MARK2-nin fosforlaşdırılmış aktivləşdirici döngəsinin bir peptidinə qarşı (fosforlanmış T208 və S212 ilə) göstərilir. Bu antikor yaxınlıq baxımından təmizlənmiş və ətraflı xarakterizə edilmişdir Şəkil 5g göstərir ki, rekombinant MARK2 beyin ekstraktında (Drewes) kinaz aktivliyi ilə 10 dəfə fosforlaşdırıla və aktivləşdirilə bilər.və s., 1997). MARK-ın bu fosforiləşməsi SDS gelinin dəyişməsinə və p-MARK antikoru ilə reaksiyaya səbəb olur (Şəkil 5f). P-MARK antikoru, aktiv MARK2 ilə hüceyrələrin köçürülməsindən sonra ləkədə aydın bir siqnal göstərir, ancaq MARK2 transfeksiyası olmayan və ya dnMARK2 ilə zəif bir siqnal göstərir (Şəkil 5d, şeritler 1-3). Məlumatlar iddia edir ki, neyritlərin işlənməsi MARK2-nin tau üzərindəki KXGS motivlərini fosforlaşdıraraq əldə edilir. Təcrübə təkrar edildikdə təsir daha aydın şəkildə nümayiş etdirilə bilər, lakin məhsul yığımından əvvəl hüceyrələr fosfataz inhibitoru okadaik turşusu (0,2 μM, 30 dəqiqə) ilə inkubasiya edilir. Bu vəziyyətdə, 12E8 antikorunun (p-Tau-ya qarşı) ləkələrdə gördüyü KXGS motivlərindəki fosforiləşmə xüsusilə MARK2 (Şəkil 5e, şerit 2) ilə transfeksiyadan sonra aydın olur, lakin dnMARK2 ilə deyil (Şəkil 5e, zolaq 3). digər kinazlar okadaik turşusunun iştirakı ilə KXGS motivlərini fosforlamır.

Şəkil 5. MARK2 tərəfindən induksiya edilən tau fosforlaşması. (a-c) N2a/htau40 hüceyrələri GFP-MARK2 ilə müvəqqəti olaraq transfekte edilir, fərqlənir, 24 saat sonra sabitlənir və floresan mikroskopiya ilə analiz edilir. (a) GFP-MARK2-nin paylanması. (b) aktiv MARK2-yə qarşı p-MARK antikorunun immunofluoresansı (fosforilləşdirilmiş T-döşəməsi). (c) tau fosfo-KXGS motivlərinə qarşı 12E8 antikoru. KXGS sahələrində aktiv MARK2 və fosforlanmış tau colokalize olduğunu unutmayın (aşağıya baxın). (d və e) N2a/htau40 hüceyrələri müvəqqəti olaraq MARK2 və ya dominant bir mənfi mutant (dnMARK2) ilə transfekte edildi, 6 saat fərqləndi və bir hüceyrə lizatı hazırlayaraq və fosforlanmış MARK2 və tau əleyhinə bir antikor paneli ilə Qərb ləkəsi ilə araşdıraraq analiz edildi. . Məlumatlar göstərir ki, MARK2, tau və dnMARK2 -nin KXGS motivlərinin fosforlaşmasına səbəb olur. (d) Zolaq 1, nəzarət N2a/htau40 hüceyrə ekstraktı. Zolaq 2, MARK2 ilə köçürmə. Zolaq 3, dominant mənfi MARK2 ilə transfeksiya (T208A və S212A). Antikor K9JA ("Tau") fosforlaşmadan asılı olaraq tau boyayır. Üç nümunədə eyni miqdarda tau var. Tau təkrar 1 və 4-də (fosfo-S262 və -S356, “p-Tau”) fosforlanmış KXGS motivlərinə qarşı 12E8 antikoru MARK2 transfeksiyası (zolaq 2) zamanı daha güclü boyanma göstərir, lakin MARK2 transfeksiyası (zolaq) olmadan yalnız zəif boyanma göstərir. 1) və dnMARK2 (zolaq 3) ilə boyanma yoxdur. Hemagglutinin-tag ("MARK") əleyhinə antikor, ekzogen MARK2 və ya dnMARK2 (2 və 3-cü zolaqlar) ifadəsini ortaya qoyur, lakin zədələnməmiş hüceyrələrdə yoxdur (şerit 1). SA6941 antikoru, MARK2-də (aktivləşdirilmiş MARK2-ə uyğun olaraq, fosforilləşdirilmiş T-loop peptidinə qarşı) pT208, pS212, aktiv MARK2-yə (şerit 2) köçürüldükdən sonra açıq bir boyanma olduğunu göstərir, ancaq endogenlərin aktivliyinə uyğun olan idarəetmələrdə (1-ci zolaqda) zəif boyanma göstərir. İşarəyə bənzər kinazlar və dnMARK varlığında boyanma yoxdur. (e) N2a/htau40 hüceyrələri keçici olaraq MARK2 və ya dominant mənfi mutant dnMARK2 ilə 6 saat fərqləndi və məhsul yığılmadan əvvəl 0.2 mkM okadaik turşusu ilə 30 dəqiqə müalicə edildi. Qeyd edək ki, yalnız dnMARK2 deyil, köçürülmüş wt MARK2-ni ifadə edən nümunə, antikor 12E8 ("p-Tau", zolaq 2) ilə reaksiya ilə göstərilən KXGS motivlərində fosforiliyanı açıq şəkildə artırmışdır. Bu o deməkdir ki, MARK2, lakin PKA kimi digər endogen kinazlar deyil, bu şərtlərdə KXGS motivlərində tau fosforlaşmasına cavabdehdir. (f və g) p-MARK antikorunun (poliklonal antikor SA6941) kinaz MARK2-nin aktivləşdirici döngəsindəki T208 və S212 posforilasyon sahələrinə qarşı spesifikliyini nümayiş etdirən Western blot analizi. Beyin ekstraktı kinaz aktivliyi ilə fosforilləşmədən əvvəl (şerit 1) və sonra (şerit 2) MARK2 zülalı (bax: MALZEMƏ VƏ METODLAR). Aşağıda, p-MARK (SA6941) antikoru yalnız fosforlanmış MARK2-ni (zolaq 2) tanıyır, onun aktivliyi histoqramda (g) nümayiş etdirilir. (h – j) N2a/htau40 hüceyrələri keçidlə HA etiketli MARK2 ilə transfekte edilir, fərqlənmədən 24 saat sonra sabitlənir və konfokal floresans mikroskopiyası ilə analiz edilir. (h) Floresan HA antikoru istifadə edərək MARK2 -nin yayılması. (i) Falloidin etiketli aktinin floresanlığı. (j) h və i-nin birləşməsi. Diqqət yetirin ki, MARK2 və aktin əsasən kokalizasiya olunur.

Şəkil 5, a-c-də göründüyü kimi, fərqlənmiş N2a hüceyrələri, aktiv MARK2 və fosfo-taunun aktin şəbəkəsi ilə kolokalizasiya oluna biləcəyini düşündürərək, hüceyrə bədənindən və nevritlərdən çıxan çoxsaylı filopodiya və mikrospike göstərdi. Buna görə də MARK2-ni N2a-htau40 hüceyrələrinə keçidlə köçürdük və immunofloresans ilə MARK2 və aktinin paylanmasını yoxladıq. Şəkil 5, h – j, konfokal mikroskopla MARK2 modelinin əsasən aktin nümunəsi ilə üst -üstə düşdüyünü göstərir. KXGS motivlərində tau fosforilləşmiş mikrotübüllərdən ayrıldığını və KXGS motivlərində fosforiləşmiş MAP2 ilə son müşahidələrə uyğun olaraq, nevrit çıxışı zamanı aktin şəbəkəsinə qismən köçdüyünü fərz edirik (Ozer və Halpain, 2000).

MARK Hymenialdisine tərəfindən güclü şəkildə inhibə edilir

Tau, funksiyasını müxtəlif yollarla təsir edə biləcək çoxlu fosforiləşmə yerləri ehtiva edir. Hüceyrələrdə tau-nun endogen fosforlaşmasının əksəriyyəti (95%) təkrarların yan tərəfində yerləşən bölgələrdə SP və ya TP motivlərində baş verir (İllenberger). və s., 1998 Biernat və Mandelkow, 1999). Bu sahələr, neyronların fərqlənməsində rol oynadığı bilinən cdk5 və GSK-3β kimi prolinə yönəldilmiş kinazlar tərəfindən fosforlanır. Bu kinazların proses artımındakı rolunu təhlil etmək üçün həm cdk5, həm də GSK-3β, FL və HD (Meijer) iki yeni güclü inhibitorundan istifadə etdik. və s., 2000 Leclerc və s., 2001) və onları htau40 ilə stabil olaraq transfekte edilmiş N2a hüceyrələrinə tətbiq etdi. Şəkil 6a göstərir ki, nəzarət hüceyrələri diferensiasiya mühitində uzadılmış nevritlər (∼25%) inkişaf etdirir. Hüceyrələr 50 μM FL-ə məruz qaldıqda, neyritin böyüməsi oxşar və ya bir qədər gücləndirilmişdir (Şəkil 6, b və d), SP və ya TP motivlərində tau fosforlaşmasının neytral və ya bir qədər inhibə etdiyinə dair əvvəlki müşahidəmizə uyğundur (Biernat və Mandelkow, 1999). Bunun əksinə olaraq, N2a/htau40 hüceyrələri kinaz inhibitoru HD (50 μM) ilə müalicə edildikdə, nevritin böyüməsi güclü şəkildə inhibe edildi (∼3% Şəkil6, c və d). İki kinaz inhibitoru arasındakı bu uyğunsuzluğu necə izah etmək olar? Bu suala cavab vermək üçün tau üzərindəki təsirlənmiş fosforilləşmə yerləri daha ətraflı müəyyən edilməli idi. Buna N2a və ya N2a/htau40 hüceyrələri ilə nail olmaq mümkün deyil, çünki onların tau səviyyəsi biokimyəvi analiz üçün çox aşağıdır. Bu səbəbdən köçürülmüş taunun biokimyəvi analizi üçün kifayət qədər miqdarda protein yaradan Sf9 hüceyrə sisteminə müraciət etdik. Əsaslandırma, prosesin əmələ gəlməsi zamanı tau və tau kinazların qarşılıqlı təsirinin neyron və neyron olmayan hüceyrələr arasında keyfiyyətcə oxşar olduğunu müşahidə etməkdir (Biernat və Mandelkow, 1999).

Şəkil 6. Htau40 ilə stabil şəkildə transfeksiya olunmuş N2a hüceyrələrində tau-induksiya olunmuş neyrit artımına kinaz inhibitorları FL və HD-nin təsiri. (a) Nəzarət N2a/htau40 hüceyrələri differensiallaşdırıldı və immunofluoressensiya üçün tau antikor K9JA ilə rəngləndi Hüceyrələrin ~25%-i genişlənmiş hüceyrə proseslərini inkişaf etdirir. (b) N2a/htau40 hüceyrələri cdk5 və GSK-3β (Leclerc) güclü bir inhibitoru olan 50 μM FL ilə fərqlənir və müalicə olunur. və s., 2001). Nevritin artımı bir qədər artır (∼35%). (c) N2a/htau40 hüceyrələri 50 μM HD ilə fərqlənir və müalicə olunur, eyni zamanda cdk5 və GSK-3β (Meijer) güclü bir inhibitorudur.və s., 2000). Nevritin böyüməsi güclü şəkildə inhibe edilir (∼3%). (d) HD və FL kinaz inhibitorları ilə diferensiasiya və müalicədən sonra uzadılmış neyritləri daşıyan N2a/htau40 hüceyrələrinin fraksiyasını göstərən histoqram. HD nevrit əmələgəlmə dərəcəsini güclü şəkildə azaldır və FL bir qədər artmağa səbəb olur.

Şəkil 7, təmizlənməmiş Sf9 hüceyrələrini (diametri 20 μm ətrafında, heç bir hüceyrə prosesi yoxdur Şəkil 7a) və htau23 ilə köçürülmüş hüceyrələri (Şəkil 7b) göstərir. 30 saat transfeksiyadan sonra, bu hüceyrələrin ∼25% -i genişlənmiş və vahid diametrli tək hüceyrəli bir proses inkişaf etmişdir. Sonra hüceyrələri FL (50 μM) dərmanına məruz qoyduq. Bu, cdk5 və GSK-3β ilə tau-nun prolin yönümlü fosforilasiyasının hüceyrə prosesləri üçün inhibitor olduğunu iddia edərək, prosesləri olan hüceyrələrdə üçqat artımla nəticələndi (~75% Şəkil 7, c və e). Bununla belə, hüceyrələr HD-yə məruz qaldıqda, prosesin formalaşması güclü şəkildə azaldı (~10% Şəkil 7, d və e). Nəticələr göstərdi ki, həm N2a hüceyrələri, həm də tau-transfekte edilmiş Sf9 hüceyrələri kinaz inhibitorları FL və HD-yə oxşar bir reaksiya verdilər.

Şəkil 7. Kinaz inhibitorları FL və HD-nin Sf9 hüceyrələrində tau-induksiya edilmiş prosesin böyüməsinə təsiri. (a) Təmizlənməmiş Sf9 hüceyrələri (nəzarət), yuvarlaq formaları göstərən) və hüceyrə prosesləri yoxdur. (b) htau23 ilə bakulovirus vektoru ilə transfeksiya edilmiş Sf9 hüceyrələri ~30% 100 μm-ə qədər uzanan hüceyrə proseslərini böyüdür. Onlar həmçinin daha böyük hüceyrə bədənlərinə malikdirlər (2-3 qat). (c) htau23 ilə transfekte edilmiş və kinaz inhibitoru FL (50 μM) ilə müalicə olunan Sf9 hüceyrələri. Prosesləri olan hüceyrələrin sayı kəskin şəkildə artır (~3 dəfə). (d) htau23 ilə transfekte edilmiş və kinaz inhibitoru HD (50 μM) ilə müalicə olunan Sf9 hüceyrələri. Prosesləri olan hüceyrələrin sayı ~10%-ə qədər azalır. (e) kinaz inhibitorlarının iştirakı ilə Sf9 hüceyrələri tərəfindən prosesin əmələ gəlməsinin səmərəliliyini göstərən histoqram. HD onları güclü şəkildə maneə törədir, LiCl və H89 təvazökar şəkildə, FL isə güclü şəkildə təşviq edir.

Tau üzərindəki fosforlaşma yerləri Western blotlarda sahəyə məxsus antikorlardan istifadə edilməklə və 2D fosfopeptid xəritələşdirilməsi ilə müəyyən edilmişdir (Şəkil 8). Daha əvvəl göstərildiyi kimi (Illenbergervə s., 1998 Godemann və s., 1999), tau üzərindəki GSK-3β-nın əsas hədəfləri S404, ardınca S396 (birlikdə PHF-1 epitopunu təşkil edir) və daha az dərəcədə S202 və T205 (AT-8 antikoru). CDk5-in əsas hədəfləri S235, ardınca T231 (AT-180 antikorunun epitopu), S202/T205 (AT-8 epitopu), halbuki PHF-1 ilə reaksiya çox zəifdir, çünki S404 əsas yerdir, lakin S396 deyil. Sf9 hüceyrələri çox aktiv kinazlar ehtiva edir, belə ki köçürülmüş tau üzərində bütün fosforilasyona bağlı antikor reaksiyaları müşahidə olunur (Biernat və Mandelkow, 1999). Şəkil 8a (lent 1) bunu 12E8 (pS262 və pS356), AT-100 (pT212 və pS214), AT-180 (pT231 və pS235), AT-8 (pS202 və pT205) və PHF-1 ( pS396 və pS404). Hüceyrələrə FL inhibitoru əlavə edildikdə (Şəkil 8a, zolaq 3) AT-100, AT-180, AT-8 və PHF-1 antikorları ilə Western blotlarda tau reaksiyaları güclü şəkildə bastırılır. Eyni şey HD inhibitoru üçün də keçərlidir (Şəkil 8a, zolaq 2). Bununla belə, tərkibində fosfo-S262/S356 olan KXGS motivləri üçün diaqnostik olan 12E8 antikoru ilə bağlı gözlənilməz fərq var idi. FL bu yerlərdə fosforlaşmaya imkan verir, HD isə Qərb ləkəsində göründüyü kimi (Şəkil 8a, zolaqlar 2 və 3) onu maneə törədir. Çünki nə GSK-3β, nə də cdk5 fosforilat S262 və ya S356 (Godemann) və s., 1999), nəticə göstərir ki, HD eyni zamanda bu sahələri ən səmərəli şəkildə fosforlaşdıran kinaz olan MARK2 inhibitorudur. Bu birbaşa rekombinant MARK2 və GSK-3β in vitro ilə edilən kinaz aktivliyi analizləri ilə yoxlandı (Şəkil 9). GSK-3β vəziyyətində, HD (IC50 = 0,13 μM) və FL (IC50 = 0,55 μM Şəkil 9). MARK2 vəziyyətində yalnız HD güclü inhibitordur (IC50 = 0.67 μM).

Şəkil 8. Sf9 hüceyrələrində kinaz inhibitorlarının htau23 fosforlaşmasına təsiri. (a və b) Antikor ləkələri. (c və f) 2D fosfopeptid xəritələri. (a) Zolaq 1, inhibitor yoxdur (nəzarət). Zolaq 2, 50 μM HD. Zolaq 3, 50 μM FL. Yuxarıdan aşağıya: təxminən bərabər miqdarda tau Western blotu göstərən Coomassie boyalı gel (nəzarət), fosforiləşdirmə antikoru 12E8-dən asılı olmayaraq tau tanıyan K9JA antikoru (fosforlanmış KXGS motivlərinə qarşı). HD inhibitoru, GSK-3β-nın inhibə edilməsinə görə deyil, MARK və əlaqədar kinazları inhibə etdiyi üçün fosforiliyanı (şerit 2) maneə törədir (aşağıya baxın). LiCl və PKA inhibitorlarının heç bir açıq təsiri yoxdur (Şəkil 8b, zolaq 1 və 2). AT-100 antikoru (fosfo-T212 və S214 əleyhinə). Bu epitop GSK-3β (T212-ni fosforilləşdirmək üçün) və PKA (S214 Zheng-Fischhofer-i fosforilləşdirmək üçün) aktivliyini tələb edir. və s., 1998). Buna görə də, epitop həm HD, həm də FL (2 və 3-cü zolaqlar) tərəfindən bloklanır. AT-180 antikoru (fosfo-T231 və S235 əleyhinə). Bu, cdk5 və GSK-3β tərəfindən törədilən epitopdur və beləliklə, siqnal həm HD, həm də FL (2 və 3-cü zolaqlar) tərəfindən bloklanır. Antikor AT-8 (fosfo-S202 və T205-ə qarşı). Bu, əsasən cdk5 tərəfindən törədilən bir epitopdur və buna görə də siqnal həm HD, həm də FL (2 və 3 -cü zolaqlar) tərəfindən bloklanır. Antikor PHF-1 (fosfo-S396 və S404-ə qarşı). Bu epitop əsasən GSK-3β tərəfindən fforiləşdirilir və buna görə də siqnal HD tərəfindən, lakin daha az FL tərəfindən inhibə edilir. (b) Zolaq 1, 50 mM LiCl. Zolaq 2, 50 μM H89, PKA inhibitoru. (c – f) Sf9 hüceyrələrində ifadə olunan və (c) olmadan və ya kinaz inhibitorlarının (d-f) iştirakı ilə endogen kinazlarla fosforlaşan htau23 zülalının iki ölçülü fosfopeptid xəritələri. (c) Nəzarət, tau Sf9 hüceyrələrində ifadə olunur. (d) cdk5, GSK-3β və MARK-ı maneə törətmək üçün 50 μM HD ilə inhibe. (e) GSK-3β-nı inhibə etmək üçün 50 mM LiCl ilə inhibə. (f) cdk5 və GSK3β-ni inhibə etmək üçün 50 μM FL inhibəsi qeyd edin ki, c, e və f fosforlanmış S262 üçün ləkələri göstərir (dairə, həmçinin daha yüksək məruz qalmada e-dəki əlavəyə baxın), d bunu etmir, çünki HD MARK fəaliyyətini maneə törədir.

Şəkil 9. HD və FL inhibitorları ilə tau kinazalarının in vitro inhibe analizi. (a) MARK2. (b) GSK3β. Qeyd edək ki, GSK-3β HD (IC50 = 0.13 μM) və FL (IC50 = 0,55 μM), lakin MARK2 əsasən HD (IC50 = 0.67 μM), halbuki FL yalnız zəif bir inhibitordur (IC50 = 38 μM).

Sf9 hüceyrələrində əlavə nəzarət təcrübələri GSK-3β (Stambolic) spesifik bir inhibitoru olan LiCl ilə aparılmışdır. və s., 1996) və H89, PKA inhibitoru (Chijiwa və s., 1990). Bu təcrübələr, PKA -nın aşağı səmərəliliyinə baxmayaraq, in vitroda KXGS motivlərini fosforiləşdirə biləcəyi ilə bağlı əvvəlki müşahidələrimizdən irəli gəlir (Schneider və s., 1999) və GSK-3β-nın KXGS motivlərini də fosforiləşdirə biləcəyi ilə bağlı ziddiyyətli məlumatlara əsasən (Moreno)və s., 1995 Godemann və s., 1999). Bu iki kinazı inhibitorları ilə sınadıq (GSK-3β üçün LiCl, PKA üçün H89) və pSer262 əleyhinə 12E8 antikoru ilə reaksiyanın təsirlənmədiyini gördük (Şəkil 8b, şerit 1 və 2, Şəkil 8a'dakı nəzarətlə müqayisə 1) əksinə, 50 μM HD 12E8 antikoru ilə reaksiyanı basdırdı (Şəkil 8a, zolaq 2). Bu, GSK-3β inhibe etmək üçün 50 mM LiCl ilə müalicədən sonra Sf9 hüceyrələrində tau fosfopeptid xəritələməsi ilə təsdiqləndi (aşağıya baxın, Şəkil 8e, dairəvi nöqtə). Bundan əlavə, LiCl və ya H89 inhibitorları ilə müalicə edildikdən sonra Sf9 hüceyrələrinin tau ilə əlaqəli hüceyrə proseslərinin miqdarı, MARK inhibitoru HD ilə müşahidə edilən kəskin azalma deyil, bir qədər artım göstərdi (Şəkil 7e). Bu, GSK-3β və PKA-nın hüceyrə prosesinin formalaşması zamanı taudakı KXGS motivlərinin fosforlaşmasına cavabdeh olmadığını göstərir.

Nəhayət, Sf9 hüceyrələrinin 32 P ilə metabolik etiketlənməsini həyata keçirdik və fosfopeptid xəritələməsi ilə taunun fosforlaşma vəziyyətini təhlil etdik (Şəkil 8, c – f). Sf9 hüceyrələrində ifadə olunan tau-nun triptik fosfopeptidlərinin istinad xəritəsi Şəkil 8c-də göstərilmişdir, ləkələrin identifikasiyası başqa yerdə ətraflı təsvir edilmişdir (İllenberqer və s., 1998 Biernat və Mandelkow, 1999). pS262 və pS356 ləkələri SP və ya TP motivləri ilə müqayisədə kifayət qədər zəifdir. Buna baxmayaraq, pS262 nöqtəsi LiCl və ya FL ilə əldə edilmiş xəritələrdə aydın görünür (Şəkil 8, e və f, dairələr, daxilə baxın), HD ilə deyil (Şəkil 8d, dairə). Bu, HD-nin də MARK2-nin inhibitoru olduğunu və GSK-3β və ya cdk5-in Sf9 hüceyrələrində S262-də tau-nun fosforlaşmasına cavabdeh olmadığını təsdiqləyir.

Kinaz inhibitorları ilə əldə edilən nəticələr antikor reaksiyalarını (HDE inhibitorunun iştirakı ilə 12E8 boyanmasının yox olması) izah edir, lakin daha əhəmiyyətlisi hüceyrələrin inhibitor müalicəsinə reaksiyasını izah edir. Yuxarıda qeyd edildiyi kimi, prosesin əmələ gəlməsi üçün KXGS motivlərində fosforlaşma vacibdir. Buna MARK2 tərəfindən nail olunduğundan, HD inhibitoru (lakin FL deyil) hüceyrə proseslərini (Şəkil 7, d və e) boğur, çünki həm də GSK-3β və cdk5 inhibitoru olduğu üçün deyil, həm də MARK2 inhibitorudur.


Mücərrəd

Gübrələmə mayot həbsini azad edir və yumurtanı sonrakı inkişaf proqramı üçün hazırlayan hadisələri başlatır. Protein parçalanması və fosforiləşmənin bu prosesdə zülal aktivliyini tənzimlədiyi bilinir. Bununla belə, zülal itkisi və fosfor tənzimlənməsinin tam həcmi hələ də məlum deyil. Elektroaktivləşdirilmiş yumurtalarda kütlə spektrometriyasına əsaslanan proteomika ilə gübrələmə reaksiyasının mütləq protein və fosfozit dinamikasını araşdırdıq. Bunun üçün biz dinamik, stabil və multisite fosforlaşmaya uyğun olan multipleksləşdirilmiş proteomikalardan fosfositlərin stoxiometriyasını hesablamaq üçün bir yanaşma hazırladıq. Ümumiyyətlə, məlumatlar tənəzzülün az miqdarda bol proteinlə məhdudlaşdığını göstərir. Bununla birlikdə, bu deqradasiya meyoz çıxışı zamanı çoxlu bolluqda baş verən geniş defosforlaşmanı təşviq edir. Biz həmçinin göstəririk ki, yumurtalar mayalanmadan dərhal sonra mühitə çox miqdarda protein buraxır, çox güman ki, polispermiya blokları ilə bağlıdır. Eyni zamanda, kalsiumla aktivləşdirilmiş kinazlarla əlaqəli fosforlaşmada əhəmiyyətli bir artım var. Ehtimal olunan tənəzzül hədəflərini və yavaş blokun komponentlərini polispermiyə təyin edirik. Burada nümayiş etdirilən analitik yanaşmalar dinamik bioloji sistemlərin tədqiqatlarında geniş tətbiq olunur.

Onilliklər ərzində çox yüksək sinxron gübrələmə hadisələri hüceyrə tənzimlənməsinin bir çox aspektlərini, xüsusən də zülalların parçalanmasını və fosforiləşməsini öyrənmək üçün faydalı bir sistem təmin etmişdir. Cyclin-B və digər zülalların məhv edilməsi M-faza çıxışını təşviq edən anafaza təşviq edən kompleks (APC/C) tərəfindən katalizlənir (1). APC/C -nin iki aktivatoru Cdc20 və Cdh1 -dir. Yumurtada hüceyrə dövrü adətən yalnız Cdc20 (2) ehtiva edir. Məlum Cdh1 substratlarının siyahısı artmağa davam edərkən (3), Cdc20 hədəf siyahısı kiçik olaraq qalır (4 ⇓ –6). Erkən hüceyrə dövrünü gücləndirən minimum Cdc20 substratlarını xarakterizə etmək böyük maraq doğurur. Kinaz aktivliyi bu tənzimləmə üçün eyni dərəcədə vacibdir. Siklin-B deqradasiyası siklin-asılı kinaz 1 (Cdk1) fəaliyyətini inhibə edərək mitotik çıxışı təşviq edir. Yumurtanın aktivləşməsindən sonra çoxlu fosforlaşma itkisi var (7). Bu fosfoproteinlərin böyük əksəriyyətinin şəxsiyyətləri hələ də kəşf edilməmişdir. Bununla birlikdə, bu tənzimləmənin Cdk1 fosforilləşməsinin əksini əks etdirəcəyi güclü bir gözləntidir. Gübrələmə, digər hüceyrə dövrləri üçün ümumi olmayan əlavə tənzimləmə tətbiq edir. Fosforlaşmanın dalğaları var ki, bu da mayalanmadan dərhal sonra polippermiyə gedən yavaş blokun bir hissəsi olaraq kortikal qranulların sərbəst buraxılmasına uyğundur. Bu buraxılış kalsiuma həssasdır və protein kinaz C (PKC) (8, 9) və CaMKII (10) aktivliyindəki artımları əks etdirə bilər. İfraz olunan zülalların, onların funksiyalarının və yuxarı siqnal komponentlərinin hesabları məhduddur. Gübrələmə zamanı zülalların parçalanmasının, salınmasının və modifikasiyasının bu naməlum aspektlərini araşdırmaq üçün kütləvi spektrometriyadan (MS) istifadə etdik. Xenopus laevis yumurta. Multiplexed proteomicsdəki son inkişaflar, tandem kütləvi etiketləri (TMTs) istifadə edərək bir çox şərtlərin kəmiyyət müqayisəsinə imkan verir (11-13). Son işimiz proteomikanın gücünü nümayiş etdirir Xenopus erkən inkişafın tədqiqatları üçün (14 ⇓ –16). Gübrələmə əvvəllər MS ilə (17 ⇓ ⇓ –20) tədqiq edilsə də, tədqiqatlar ya keyfiyyətcə olub, ya da fosforlaşmanı ölçməyib. Zənginləşdirmə mərhələsi (21 ⇓ –23) ilə çoxlu fosfoproteidlərdə nisbi dəyişiklikləri ölçmək mümkündür. Bununla belə, bu cür tədqiqatlar sahə stoxiometriyasını ölçmədən məhdud faydalıdır. Fosforlaşma tədqiqatları üçün yalnız qat dəyişikliyinə güvənmək, 10% nisbi dəyişiklikləri 1% -dən 10% -ə qarşı 10 ilə 100% arasında fərqləndirməyəcəkdir. Bir neçə yanaşma mövcuddur (24-26), lakin bunların heç biri çoxsaylı MS ilə ölçülmüş və ya çoxlu fosforlanmış qalıqları olan peptidlərin tutulmasını təyin edə bilmir. Bu məqalə, gübrələmə və hüceyrə dövrünün inkişafı ilə bağlı bioloji tapıntıları, habelə MS protein modifikasiyası tədqiqatlarında geniş tətbiq olunan fosfozitlərin mütləq stokiyometriyasını ölçmə üsullarını təqdim edir.


MÜZAKİRƏ

Bu işdə, aksonal böyüməni başlatdığı bilinən bir protein olan tau'nun funksiyasının fosforilləşmə ilə necə tənzimləndiyini və bunun üçün hansı kinazların məsul olduğunu soruşduq. Biz iddia edirik ki, tau-nun KXGS motivlərində kinaz MARK tərəfindən fosforlaşması neyronlarda və neyron olmayan hüceyrə modellərində (N2a və Sf9 hüceyrələri) kritikdir. Bu hüceyrə tiplərində endogen tau az və ya heç olmadığı üçün hüceyrə prosesləri ekzogen tau ilə transfeksiya yolu ilə güclü şəkildə gücləndirilə bilər. MARK -ın əhəmiyyətinin sübutu, ya kinaz MAZ tənzimləyicisinin aktivliyini, ya da efuor protein tau sahələrini dəyişdirdiyimiz təcrübələrə əsaslanır. Tau funksiyası, MARK -ın hədəf yerlərindəki nöqtə mutasiyaları ilə KXGS motivlərini fosforlaşdırılmayan KXGA motivləri ilə əvəz etməklə dəyişdirildi. KXGA-tau, N2a hüceyrələrində nevrit artımını stimullaşdıra bilmədi. MARK -ın aktivliyi üç şəkildə dəyişdirildi: 1) aktivləşdirici döngədə fosforlaşma ilə aktivləşdirilə bilən MARK izoformlarından biri olan MARK2 ilə hüceyrələrin müvəqqəti köçürülməsi (Drewes) və s.2) tənzimləyici fosforlaşma yerləri olmayan (T208A və S212A) dominant mənfi MARK ilə transfeksiya və 3) yeni kinaz inhibitoru (Meijer) olan hymenialdisine ilə MARK inaktivasiyası. və s., 2000). MARK inaktiv edildikdə, nevritin böyüməsinin stimullaşdırılması baş vermədi.

Tau çoxlu fosforlaşma sahələrini ehtiva etdiyi üçün açıq bir məsələ onların tau funksiyalarına təsirini ayırd etməkdir. Bu sahədə tez -tez rast gəlinən bir problemdir, çünki hüceyrələrdə tau fosforlaşması yaxınlıq və spesifikliyə görə dəyişə bilən antikorlar tərəfindən aşkarlanır. "Alzheimer diaqnostikası" antikorlarının çoxu, prolinlə əlaqəli kinazların (məsələn, MAP kinaz, GSK-3β və ya cdk5) fəaliyyətini göstərən fosfo-SP və ya -TP motivlərinə qarşı yönəldilmişdir. Bizim vəziyyətimizdə, bu kinazların tau səbəbli nevrit çıxışı üçün böyük rolunu istisna edə bilərik, çünki AP-tau mutantı (bütün SP və ya TP motivlərinin AP-ə çevrildiyi yer) normal tau ilə müqayisədə nevritlərin oxşar və ya daha çox stimullaşdırılmasını göstərir. taunun KXGA-mutantının əksinə. Bu, Sf9 hüceyrələri ilə bağlı əvvəlki müşahidələrlə razılaşır (Biernat və Mandelkow, 1999). Digər, KXGS olmayan və ya SP/TP olmayan fosforilləşmə sahələri də kiçik əhəmiyyət kəsb edir, çünki hüceyrə fosforlaşma yerlərinin kiçik bir hissəsini təmsil edir (Watanabe və s., 1993, Illenbergervə s., 1998) və MARK tərəfindən fosforlaşdırılmamışdır ki, MARK inhibisyonunun təsirini izah edə bilməsinlər (Drewes)və s., 1995). Xüsusi bir məsələ, KXGS motivlərinin digər iki kinaz, GSK-3β və ya PKA ilə mümkün fosforlaşmasıdır. Bir araşdırmada GKS-3β-nın S262 (Morenovə s., 1995), lakin sonrakı təhlillərimiz bunun kinaz hazırlıqdakı digər fəaliyyətlərə bağlı olduğunu göstərdi (Godemannvə s., 1999). Bu, KXGS sahələrinə təsir etmədən (Şəkil 8b, zolaq 1, 12E8 ilə boyanma və Şəkil 8e) tau (SP və ya TP motivləri Şəkil 8b, zolaq 1, PHF1 boyanması) üzərində GKS-3β hədəflərini inhibə edən LiCl təcrübəsi ilə təsdiqlənir. , daxildə fosfo-S262 ləkəsi). PKA, KXGS motivləri də daxil olmaqla bir neçə yerdə tau fosforlaşdıran başqa bir ehtimal olaraq qalır (MARK Drewes -dən daha az səmərəli olsa da) və s., 1995 Schneider və s., 1999). Bununla birlikdə, H89 tərəfindən PKA -nın inhibisyonu, prosesin meydana gəlməsini maneə törətməmişdir (Şəkil 7e), MARK -ın HD tərəfindən inhibe edilməsinin əksinə olaraq və KXGS motivlərinin fosforiliyasını maneə törətməmişdir (Şəkil 8b, zolaq 2, 12E8 ilə boyanma). Biz də in vitro aktivlik analizində (Şəkil 9) göstərdik ki, hymenialdisine MARK -ı inhibə edə bilir, ancaq PKA -nı yox. Bundan əlavə, N2a/htau40 hüceyrələrinin okadaik turşusu ilə müalicəsi, hüceyrələri yalnız MARK2 (lakin dnMARK2 ilə deyil) və ya köçürülməmiş MARK2 olmayan hüceyrələrdə (Şəkil 5e, zolaqlar 1-3) transfeksiya edildikdən sonra KXGS motivlərində fosforiliyin artmasına səbəb olmuşdur. . Bu, başqa heç bir kinazın, oxadaik turşusu şəraitində belə, məsul kinaz olaraq MARK2-yə işarə edən N2a hüceyrələrini fərqləndirən tau KXGS motiflərini fosforiləşdirmədiyini göstərir. Nəhayət, canlı hüceyrələrdə GFP-MARK2 (lakin dnMARK2 deyil) MARK2 aktivliyi (p-MARK antikoru ilə göstərildiyi kimi) və fosfo-KXGS tau (Şəkil 5, a-c) ilə kolokallaşır. Kollektiv olaraq, biokimyəvi və immunofluoressensiya sübutları göstərir ki, MARK2 və ya MARK ailəsinin bir kinazı N2a hüceyrələrinin diferensiallaşdırılmasında KXGS motivlərində fosforlaşdıran kinazdır.

Mikrotübül sabitliyi nevritlər üçün zəruri hesab olunur, çünki hüceyrədaxili nəql üçün mexaniki güc və izlər təmin edir. Neyritlərin böyüməsi zamanı taunun KXGS motivlərinin fosforlaşması tau mikrotubullardan ayırmağa meyllidir və beləliklə, mikrotubulları daha az stabil edir. Bu, intuitiv olaraq gözlənilən şeyin əksidir və buna görə də sual yaranır ki, bu, neyritin böyüməsi üçün niyə vacib olmalıdır. Cavab mikrotübüllərin daha incə bir rolunda ola bilər: Böyümə konisi irəlilədikcə aktin filamentləri zəmini keçici lamellipodiya və filopodiya şəklində hazırlayır. Bu zəmin aktin şəbəkəsinə müvəqqəti ekskursiya edən və yenidən geri çəkilən qabaqcıl mikrotubullar tərəfindən yoxlanılır, nəhayət, onları sabitləşdirmək, bağlamalar yaratmaq və böyümə konusunun irəliləməsinə imkan verən qərar qəbul edilənə qədər (Borisy və Svitkina, 2000-da nəzərdən keçirilmiş Bradke və Dotti, 2000 Yaxşı və s., 2000). Beləliklə, neyritlər uzanmazdan əvvəl mikrotubullar dinamik olaraq qeyri-sabit olmalıdır. Bu, polimer kütləsi dəyişməsə belə, dinamik qeyri-sabitliyin yatırılmasının neyritlərin böyüməsini əngəlləmək üçün nə üçün kifayət etdiyini izah edir (Baas və Əhməd, 1993 Liao). və s., 1995 Tanaka və s., 1995 Rochlin və s., 1996 Kaverina və s., 1998). Hüceyrə bu tənzimləmə üçün tau və ya əlaqəli MAPlardan istifadə edir (Drubin və Kirschner, 1986 Panda və s., 1999). Tau böyümə konusundadır, lakin əsasən mikrotübüllərdən ayrılır (Qara və s., 1996). Nə üçün bu tau hovuzu mikrotubulları sabitləşdirməməlidir ki, onlar neyritin şaftından irəliləsinlər? Biz təklif edirik ki, tau KXGS motivlərində yerli olaraq fosforlaşdırılır, buna görə də mikrotubullara bağlana bilmir (beləliklə, onları qeyri-sabit edir) və aktin şəbəkəsinə köçür (Şəkil 5c Ozer və Halpain, 2000, MAP2-nin analoji halı üçün). Mikrotübüllərin yalnız kiçik bir hissəsi yüksək dinamikliyə malikdir (Waterman-Storer and Salmon, 1997 Kabir və s., 2001) bu, KXGS-fosforiləşmənin ümumi dərəcəsinin, həlledici roluna baxmayaraq, normal hüceyrələrdə niyə aşağı olduğunu izah edir (Biernat və Mandelkow, 1999).

Nəticələrimizi neyronlarda taunun fosforlaşması ilə bağlı iki başqa araşdırma ilə müqayisə etmək maraqlıdır. Mandell və Banker (1996), mikrotübüllərin ən dinamik olduğu neyritin distal ucunda tau fosforlaşmasının ən aşağı olduğunu müdafiə etdi. Bu qəribə göründü, çünki fosforlaşdırılmamış tau tez -tez sabit mikrotübüllərə bərabər gəlir. Tapıntı müəlliflərin təkrar domendən (S202 və T205) kənarda iki fosforlanmış SP və TP motivlərini hiss edən, lakin KXGS motivlərində fosforlaşmanı tanımayan AT-8 antikorundan istifadə etdiklərini qeyd etməklə izah edilə bilər. Biz başqa yerdə göstərmişik ki, SP və ya TP motivlərinin yerlərində fosforlaşma tau-mikrotubula bağlanmasına (Biernat) yalnız təvazökar təsir göstərir. və s., 1993) və həqiqətən birləşdirilmiş bütün prolinə yönəldilmiş saytların KXGS motivlərindən fərqli olaraq nevritin böyüməsinə böyük təsiri yoxdur (Şəkil 2f). Ümumiyyətlə, tau-nun prolin yönümlü fosforlaşmasının rolu zəif başa düşülür və digər kontekstlərdə, məsələn, deqradasiyadan qorunma (Litersky və Johnson, 1995), hüceyrə bölünməsi (Ookata) kimi vacib ola bilər. və s., 1997 İllenberger və s., 1998) və neyronlarda bölünmə (Binder və s., 1985 Hirokawa və s., 1996).

Müvafiq bir araşdırmada Ozer və Halpain (2000) HeLa hüceyrələrində MAP2-nin fosforlaşmasını araşdırdılar. Bu Xəritə, KXGS motivləri də daxil olmaqla homolog təkrarlara malik olmaqla tau və endogen HeLa MAP4 -ə bənzəyir və neyronların somatodendritik bölməsinə (aksonal taudan fərqli olaraq) bölünür. Müəlliflər, MAP2 -nin KXGS motivlərinin PKA tərəfindən fosforiləşə biləcəyini, nəticədə MAP2 -nin mikrotübüllərdən ayrılması və aktin şəbəkəsinə köçürülməsi ilə nəticələnə biləcəyini tapdılar. Bu, PKA -nın tənzimləyici RII alt vahidi vasitəsi ilə MAP2 -yə bağlanması ilə uyğun olardı (Obar və s., 1989), bu tau üçün belə deyil. Onların və bizim nəticələrimizin ortaq məxrəci, hüceyrənin KXGS motivlərində yerli olaraq mövcud olan MAP -ları fosforlaşdıraraq mikrotübüllərin dinamikasını idarə etməsi lazımdır. Bu, aksonlarda tau, dendritlərdə MAP2 və ehtimal ki, digər hüceyrə növlərində MAP4 ola bilər. Fosforlaşma müxtəlif kinazlar (məsələn, MARK və ya PKA) ilə əldə edilə bilər, eyni nəticə ilə MAP-ları mikrotubullardan ayırmaq olar. Alternativ olaraq, kinazları və/və ya fosfatazları aktivləşdirən daha mürəkkəb mexanizmin olması mümkündür. Təcrübə sistemimizdə, hüceyrə polaritesinin qurulmasında MARK/PAR-1 ailəsinin kinazlarının rolu ilə uyğun gələn, nevrit inkişafının başlanmasında PKA-nın böyük rolunun olduğuna dair heç bir dəlil tapmadıq (Drewes və s., 1998 Kemphues, 2000, Shulman və s., 2000Tomancak və s., 2000).

Neyronlar fərqli paylanmalara və qismən üst -üstə düşən funksiyalara malik bir neçə MAP -dan ibarətdir. Məsələn, tau və MAP1b fərqli hüceyrədaxili mühitlərdə aksonal böyümə zamanı bir -birini əvəz edə bilər (DiTella və s., 1996). Yalnız tau olmayan transgen siçan canlıdır, lakin həm tau, həm də MAP1b olmayan siçan modeli aksonogenezdə ciddi qüsurlar göstərir (Harada). və s., 1994 Takei və s., 2000). Komplementarlıq hətta molekulyar xassələrə də şamil edilir: müəyyən yerlərdə tau-nun fosforilasiyası tau mikrotubullardan ayırır və onları daha dinamik edir, halbuki MAP1b-nin müəyyən fosforilasiyası mikrotubullara bağlanmağa kömək edir və hər iki halda da aksonlar boyunca aşağı yaxınlıq ilə qradiyent olur. böyümə konisinin yaxınlığındakı növlər (Ulloa və s., 1994). GSK-3β-nın WNT siqnal yolu ilə aşağı tənzimlənməsi və ya lityum tərəfindən inhibe edilməsi, MAP1b-nin defosforlaşmasına, mikrotubulalardan ayrılmasına və dolayısı ilə böyümə konisinin ölçüsü və dallanması kimi aksonal yenidən qurulmaya səbəb olur (Lucas və s., 1998). Çünki hymenialdisine təkcə MARK deyil, həm də GSK-3β (Meijer) inhibitorudur. və s., 2000), onun neyrit artımına təsirinin GSK-3β və bəlkə də MAP1b tərəfindən vasitəçi ola biləcəyini iddia etmək olar. Bununla belə, bunu istisna etmək olar, çünki GSK-3β-nin digər iki inhibitoru, litium və flavopiridol HD-nin təsirini təkrar etmir. Bundan əlavə, tau vasitəçiliyi ilə MARK inhibisyonunun təsirləri (yəni, neyritin böyüməsinin inhibəsi) MAP1b (böyümə konusunun yenidən qurulması) vasitəçiliyi ilə GSK-3β inhibisyonunun təsirlərinin əksinədir. Başqa sözlə, MARK-ın inhibisyonu mikrotübül dinamikasını azaldır, GSK-3β-nın inhibə edilməsi isə dinamikanı gücləndirir.

Nəhayət, qeyd edirik ki, neyritin böyüməsi zamanı köməkçi komponentlərin fosforlaşması ilə vasitəçilik edilən mikrotubul və aktin dinamikası arasında qarşılıqlı əlaqə üçün artan sübutlar var. Bu lif sistemlərindən birinə və ya hər ikisinə yerləşdirilmiş və onların təşkilini təşviq edən bir neçə kinaz təsvir edilmişdir, məsələn, c-Abl, PAK5 və ya protein kinaz C (Kabir) və s., 2001 Dan və s., 2002 Vudrinqvə s., 2002) və MARK başqa bir nümunə olardı. Adətən, bu, rho ailəsinin kiçik G zülalları ilə sıx əlaqələndirmə halında baş verir (Daub və s., 2001 Palazzo və s., 2001). MAP-ların fosforlaşması böyümə konusunda mikrotubul davranışının müxtəlif subaspektlərini tənzimləyə bilər, məsələn, mildə mikrotubul birləşmələri, pioner mikrotubulların dinamik qeyri-sabitliyi, statmin kimi tubulin təmizləyicilərinin aktivləşdirilməsi və fokus kontaktlarında lövbərləmə. Bundan əlavə, MAP -lar aktin sitoskelet kimi mikrotübüllərdən başqa komponentlərlə qarşılıqlı əlaqə qura bilər (Griffith and Pollard, 1982 DiTella və s., 1994 Kanninqem və s., 1997 Özer və Halpain, 2000). Bu, müxtəlif kinazların, ehtimal ki, təbiəti hələ açıqlanmayan müxtəlif xarici siqnallara cavab olaraq, böyümə konusunun davranışına üst-üstə düşən təsirlərini izah edə bilər.


Videoya baxın: What Happens If You Dont Eat For 5 Days? (Dekabr 2022).