Məlumat

Taxıl Alfa və Beta Amilazanın temperatur aralığı və reaksiya sürəti

Taxıl Alfa və Beta Amilazanın temperatur aralığı və reaksiya sürəti


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bu sual çörək istehsalında praktik bir tətbiqdən irəli gəlir. Həm alfa, həm də beta amilaza üçün optimal (ən yüksək reaksiya dərəcəsi) temperaturların hansı olduğu yaxşı bilinsə də, temperaturun funksiyası olaraq reaksiya sürəti ilə bağlı dəqiq məlumat tapa bilmirəm.

  1. Temperatur azaldıqda alfa və beta amilazanın aktivliyi necə dəyişir?
  2. Hansı temperaturda onların fəaliyyəti dayanır?

Taxıl Alpha və Beta Amylase temperatur diapazonu və reaksiya dərəcəsi - Biologiya

Alpha Amylase fermentləşdirilə bilən qatıq istehsalında pivə istehsalçıları üçün kritik əhəmiyyət kəsb edən əsas püresi fermentidir. Böyük bir qlükoza polimeri olan nişastanı daha kiçik hissələrə həzm edərək, beta amilaza ilə daha da həzm olunmasına səbəb olur. Bu iki amilaza birlikdə pivə istehsalında vacib olan şəkər spektrini əmələ gətirir. Alfa amilaza nişastanın alfa 1-4 bağlarını uclarında deyil, zəncir daxilindəki nöqtələrdə həzm edən endo fermentdir.

Pivə istehsalında alfa amilazanın istifadəsinə diqqət yetirmək üçün müvəffəqiyyətli bir püresi ehtiyaclarına, xüsusən son qoxuda lazım olan şəkər spektrinə baxmaq lazımdır. İdeal olaraq bunlar sadə fermentləşdirilə bilən şəkərlərin - qlükoza, maltoza və maltotriozun və təxminən 3:1 nisbətində daha böyük fermentləşdirilməmiş dekstrinlərin uyğun balansı olmalıdır. Demək olar ki, bütün şəkərlərin fermentləşdirildiyi şərabdan fərqli olaraq, pivə şirinliyi, bədəni və ağız hissini təmin etmək üçün qalıq şəkərlərə malik olması ilə fərqlənir. Dekstrinlər buna böyük töhfə verir və pivəyə onun xarakterinin əsas hissəsini verir. Dekstrinlərə baxın.

Nişasta molekulu, əslində, bir-birinə bağlı qlükoza molekulları qrupudur. Fermentlər bu əlaqələri pozur. Alfa amilaz, qlükoza molekulları arasındakı daxili bağları pozaraq nişastanın həzminə kömək edir. Nəticədə nişasta molekulunu açaraq onu bir sıra ara ölçülərə ayırır. Beta amilaz, bu ara molekulları daha çox maltoza-iki qlükoz biriminin şəkərinə-həzm edir, həm də qlükozanın özünə və üç qlükoza molekulu olan maltotrioza həzm edir. Bu həzm üçün əsas məhdudiyyət nişasta amilopektinin yan bağlarıdır, nə alfa, nə də beta amilaz tərəfindən həzm olunmur. Nişasta molekulunun bu yan bağları ehtiva edən hissələri əzmə nəticəsində əmələ gələn mühüm fermentləşdirilməmiş dekstrinlərin əsasını təşkil edir.

Püredə istifadə olunan alfa amilaza, maltlama zamanı tamamilə aleuron qatında istehsal edildiyi səməni gəlir. Aleuron qatına baxın. Arpa toxumunda onun səfərbərliyi endospermdə olan nişasta ehtiyatlarını həzm etmək və böyüyən toxumu qida ilə təmin etmək üçün induksiya edilir. Maltster bunu ferment səviyyəsinin maksimal olduğu və əzmə zamanı istifadəyə hazır olan quru taxılda saxlandığı nöqtədə dayandırır.

Alfa amilazın səviyyələri ümumiyyətlə solğun maltda yüksəkdir, lakin istilik parçalanması səbəbindən qovrulmuş maltda demək olar ki, sıfırdır. Səməni çeşidinə və səməni şəraitinə görə səviyyələr dəyişir. Aleurona nisbətdə daha az endosperm olan taxılların daha kiçik olması səbəbindən ümumiyyətlə altı sıra arpa iki sıralı arpadan daha yüksək səviyyəyə malikdir.

Alfa amilaza arpa ilə məhdudlaşmır, lakin bakteriyalardan insanlara qədər əksər orqanizmlərdə olur. Tüpürcək amilazası, ptyalin, məməlilərin ağzında nişastanın həzmini başlatan tanınmış amilazadır.

Fermentlər aktiv olduqları xüsusi temperatur və pH diapazonlarına malikdirlər - bu diapazon "optima" adlanır. Alfa amilaza beta amilazdan əhəmiyyətli dərəcədə fərqli temperatur və pH optimasına malikdir. Alfa amilaza üçün, temperatur kalsium ionları ilə sabitləşə biləcəyi üçün, optima beta amilaza üçün 60 ° C ilə 65 ° C arasında təxminən 70 ° C -də daha yüksəkdir. Alfa amilazanın pH optiması, beta amilaz üçün 5.1-5.3 ilə müqayisədə 5.3-5.7 -də daha yüksəkdir. Bu fərqlər, fərqli temperaturda aparılan pürelərdən fərqli qoxu şəkər profilləri ilə nəticələnə bilər və püresi şərtlərinə nəzarət etməklə pivə xarakterini dəyişən vasitələrdən biridir.

Ənənəvi pivə fabriklərində dəmləmək üçün lazım olan bütün fermentlər pivənin hazırlandığı təbii maddələr içərisindədir. Bununla birlikdə, ekzogen alfa amilaza ferment təminatçılarından təmizlənmiş formada mövcuddur və mənşəyinə görə fərqli xüsusiyyətlərə malik ola bilər. Bunlar "yüngül pivə" istehsalında geniş istifadə olunur. Yüngül pivəyə baxın. Pivə istehsalçıları üçün ən uyğun fərqlər istilik və pH dözümlülükləridir. İstiliyə davamlı alfa amilazlar səməni fermentlərini əlavə etmək və ya əlavə nişastanı həzm etmək üçün istifadə edilə bilər. İstiliyə həssas olduqları üçün pasterizasiya yolu ilə denaturasiya ediləcəklər. İstiliyə dözümlü alfa amilazlar, ləzzət verən aktiv şəkərlərə həzm üçün qalıq dekstrinlər mövcud olduqda, zaman keçdikcə daha şirin ola biləcək son pivəyə qədər sağ qalacaqlar.

Ticarət alfa amilazalar, saf olmayan və beta amilaz və proteaz ehtiva edən və ya bakterial və ya mantar böyüməsindən toksinlər ehtiva edən problemlərə də səbəb ola bilər. Bununla birlikdə, onların istifadəsi bir çox qida sənayesində artmaqdadır və xüsusilə yeni maddələr gələcək biralar üçün alınarsa, pivə istehsalında tətbiq olunmağa davam edəcəkdir.

Briggs, D.E., J.S. Hough, R. Stevens və T.W. Gənc. Dəmləmə və dəmləmə elmləri. New York: Springer, 1995.

Lewis, Michael J. və Tom W. Young. Dəmləmə. New York: Springer, 2002.


Taxıl Alpha və Beta Amylase temperatur diapazonu və reaksiya dərəcəsi - Biologiya

İki növ əlaqənin, alfa-1,4 və alfa-1,6-nın mövcudluğuna görə, nişasta molekulları üçün müxtəlif strukturlar mümkündür. Yalnız alfa-1,4 qlükozid bağları olan 500-2000 qlükoza alt birimindən ibarət budaqsız, tək zəncirli polimer adlanır. amiloza. Digər tərəfdən, alfa-1,6 qlükozid bağlarının olması dallı bir qlükoza polimeri ilə nəticələnir. amilopektin. Amilopektində dallanma dərəcəsi, dallanmamış seqmentlərdə iyirmi beş qlükoza vahidindən təxminən biridir. Heyvan hüceyrələrində qlükoza saxlama funksiyasını yerinə yetirən yaxından əlaqəli başqa bir birləşmə deyilir glikogen, 12 qlükoza vahidinə bir budaqlanan. Budaqlanma dərəcəsi və yan zəncirin uzunluğu mənbədən mənbəyə dəyişir, lakin ümumilikdə zəncirlər nə qədər çox budaqlanırsa, nişasta bir o qədər çox həll olur.

Nişasta ümumiyyətlə otaq temperaturunda suda həll olunmur. Bu səbəbdən təbiətdəki nişasta mikroskop altında görünə bilən kiçik qranullar şəklində hüceyrələrdə saxlanılır. Nişasta qranulları eyni molekul daxilində və digər qonşu molekullarla hidrogen bağlarının yaranması səbəbindən həm su, həm də hidrolitik fermentlərin nüfuz etməsinə kifayət qədər davamlıdır. Bununla birlikdə, hidrojenlər arası və daxili bağlar, süspansiyonun temperaturu yüksəldikcə zəifləyə bilər. Nişastanın sulu bir süspansiyonu qızdırıldıqda, hidrogen bağları zəifləyir, su əmilir və nişasta qranulları şişir. Bu proses adlanır jelatinləşmə çünki əmələ gələn məhlul jelatinli, yüksək viskoz tutarlılığa malikdir. Eyni proses uzun müddətdir ki, yemək hazırlanmasında suyu sıxlaşdırır.

Zəncirin sonundan etibarən hücum edilən bağın nisbi yerindən asılı olaraq, bu həzm prosesinin məhsulları dekstrin, maltotrioz, maltoz və qlükoza və s. daxili qlükozid bağlarının təsadüfi hidrolizi. Bir nişasta molekulunun ucundan üçüncü bağın parçalanması halında maltotrioz molekulu əmələ gəlir, əgər hücum nöqtəsi ikinci bağdırsa, bağlanan terminal terminaldırsa qlükoza molekulu əmələ gəlir. üzərində Təcrübə №3-dəki məşqlərdən göründüyü kimi, təsadüfi depolimerləşmənin ilkin mərhələsi iri zəncirlərin müxtəlif kiçik ölçülü seqmentlərə parçalanmasıdır. Böyük hissəciklərin parçalanması jelatinləşdirilmiş nişasta məhlulunun viskozitesini kəskin şəkildə azaldır və nəticədə proses mayeləşmə məhlulun incəlməsi səbəbindən. Depolimerləşmənin son mərhələləri əsasən mono-, di- və tri-saxaridlərin əmələ gəlməsidir. Bu proses adlanır saxarifikasiya, saxaridlərin əmələ gəlməsi ilə əlaqədardır.

İnsanlar da daxil olmaqla müxtəlif orqanizmlər nişastanı həzm edə bildiyindən, selülazdan fərqli olaraq alfa-amilaza təbiətdə geniş şəkildə sintez olunur. Məsələn, insan tüpürcəyi və mədəaltı vəzi sekresiyasında nişastanın həzmi üçün çoxlu miqdarda alfa-amilaza var. Alfa-amilazaların hücum etdiyi bağın spesifikliyi fermentlərin mənbələrindən asılıdır. Hal-hazırda, alfa-amilazların iki əsas sinfi kommersiya olaraq mikrob fermentasiyası yolu ilə istehsal olunur. Qlükoza polimer zəncirindəki hücum nöqtələrinə əsasən, mayeləşdirmə və saxarlaşma olmaqla iki kateqoriyaya bölünə bilər.

Bu təcrübədə istifadə ediləcək bakterial alfa-amilaza təsadüfi olaraq yalnız alfa-1,4 bağlarına hücum etdiyi üçün mayeləşdirici kateqoriyaya aiddir. Bu sinif fermentləri tərəfindən kataliz edilən hidroliz reaksiyası, adətən, məsələn, nişastanın toxuculuq sənayesində nişasta ölçülü parçalardan asanlıqla çıxarılmasına imkan verən qədər həll edilərək həyata keçirilir. Kağız sənayesi həmçinin kağız örtüyündə istifadə olunan nişastada mayeləşdirici amilazalardan istifadə edir, burada ən kiçik qlükoza alt bölmələrinə parçalanma əslində arzuolunmazdır. (Selüloz lifləri şəkərlə bağlaya bilməzsiniz!)

Digər tərəfdən, göbələk alfa-amilazası saxarifikasiya kateqoriyasına aiddir və düz seqmentin azalmayan terminallarından (yəni C4 ucundan) ikinci keçidə hücum edir və nəticədə bir anda iki qlükoz vahidinin parçalanması ilə nəticələnir. Əlbəttə ki, məhsul maltoza adlanan bir disaxariddir. Beləliklə, bağın qırılması mayeləşdirici fermentlərə nisbətən sacxarifikasiya edən fermentlərdə daha genişdir. Nişasta zəncirləri sözün həqiqi mənasında kiçik parçalara və parçalara kəsilir. Nəhayət, amilaz preparatının amiloqlükozidaza (həmçinin qlükoamilaz adlanır) komponenti reduksiya etməyən terminallardakı sonuncu bağa seçici olaraq hücum edir. Bu təcrübədə istifadə ediləcək növ, nisbi nisbətdə 1:20 nisbətində həm alfa-1,4, həm də alfa-1,6 qlükozid bağları üzərində hərəkət edə bilər və nəticədə sadə qlükoza vahidlərinin məhlula parçalanması ilə nəticələnə bilər. Nişastanı sadə şəkərə çevirmək üçün mantar amilaz və amiloqlukozidaz birlikdə istifadə edilə bilər. Bu növ ferment qarışığının praktik tətbiqlərinə qarğıdalı şərbətinin istehsalı və pivəbişirmə zamanı taxıl pürelərinin şəkərə çevrilməsi daxildir.

Beləliklə, fermentlərin hərəkətləri və kinetikləri müqayisə edilərkən fermentlərin mənbəyinin dəqiqləşdirilməsi vacibdir. Bu təcrübədə müxtəlif mənbələrdən dörd növ alfa-amilaz istifadə ediləcək: üçü mikrob mənşəli və biri insan mənşəli. Temperaturun, pH -nın, substrat konsentrasiyasının və inhibitor konsentrasiyasının amilaza katalizləşdirilmiş reaksiyaların kinetikasına təsiri öyrəniləcək. Nəhayət, mikrob mənbələrindən təcrid olunmuş amilaza preparatlarının hərəkəti insan tüpürcəyindən alınan hərəkətlə müqayisə olunacaq.


Taxıl Alfa və Beta Amilazanın temperatur aralığı və reaksiya sürəti - Biologiya

Y53 r < 7 s o > x > | 쇊 z >yz axın endobj 28 0 obj >axın h 1 6 = D` x# (v axın endobj 29 0 obj >axın h <[ eו u

^ P, $ X $ d * [email protected] SK CR+Jb iE endstream endobj 4 0 obj> endobj 5 0 obj> stream h ބ XɎ 6 W eQ < 8F 8 X Z > j! < B

= endstream endobj 6 0 obj >stream h 24V0P w (q .I,I L Avv n y%@ c 3 i `be + @U ' D 釤 V endstream endobj 7 0 obj> stream h 24Q0P04U0 T + - b B .vv endstream endobj 8 0 obj> stream

Acrobat Distiller 9.0.0 (Windows)

PScript5.dll Versiya 5.2.2 21-06-2011 Word-100477.doc 19636 uuid: 963eab22-c3d7-4f12-9635-c26e83cd2acc uuid: c88f56af-5b71-4b3f-ae2c-5eab3315bbfd endstj endobj 9 0 obj> h wS0 L) 62) I RY Zlg` h endstream endobj 10 0 obj> stream h L 0 m & KlS+" ] b D F > : rw ͦؽ X . , 9 vmPk L m 2 kMQwt R>%8 *e Ł = . ɿ ` sL ! C S B p> | xz ) S ) C ܑ n zb Јe]+ONn = endstream endobj 11 0 obj>/Filter/FlateDecode/ID [ ]/Məlumat 17 0 R/Uzunluq 69/Kök 19 0 R/Ölçü 18/Tip/XRef/W[1 2 1]>>axın h bb & e ۀ u H0 $ Ě j3 q A # `` L 1 endstream endobj startxref 116 %%EOF


Prinsip:

Enzim tərəfindən kataliz edilənlər də daxil olmaqla reaksiyaların sürəti Arrhenius tənliyi K = Ae- & DeltaEa/RT əsasında temperaturun artması ilə yüksəlir, burada K reaksiya üçün kinetik nisbət sabitidir, A da tezlik faktoru olaraq da bilinən Arrenius sabitidir. & DeltaG, entropik və entalpik faktorlardan asılı olan standart sərbəst aktivasiya enerjisidir (KJ), R universal qaz sabitidir və T mütləq temperaturdur. Sistemin istiliyinin artması sistemin kinetik enerjisinin artması ilə əlaqədardır. Molekullar toqquşduqda molekulların kinetik enerjisi molekulların kimyəvi potensial enerjisinə çevrilir. Beləliklə, sistemdəki molekulların daha çox K.E-si avtomatik olaraq yaranan kimyəvi potensial enerjini artırır. İstilik artdıqca, vahid vaxtda daha çox molekulun aktivasiya enerjisinə çatması mümkündür. Beləliklə, reaksiya sürəti arta bilər. Substratı məhsula çevirmək üçün fermentlər aktiv yerində substratla toqquşmalı və ona bağlanmalıdır. Bir sistemin temperaturunun artması, vahid zamanla fermentin və substratın toqquşma sayını artıracaq. Beləliklə, məhdudiyyətlər daxilində reaksiya sürəti artacaq.


Α-amilazanın quruluşu və xassələri

X-ray kristalloqrafiyası insan mədəaltı vəzi 21 və tüpürcək 17 və donuz mədəaltı vəzindən 22 α-amilaza fermentlərinin 3D strukturlarını əldə etmək üçün istifadə edilmişdir. Bu fermentlərin strukturları çox yaxından əlaqəlidir. Məməlilərin amilazaları üç struktur sahədən ibarətdir, bunlardan ən böyüyü (A sahəsi) iki aspartat və bir glutamat qalığını ehtiva edən aktiv aktiv sahə qalıqlarını ehtiva edir. A sahəsi də bağlı Cl - ionunu ehtiva edir. Amilazanın xloridlə aktivləşdirilməsi çoxdan məlumdur 23, 24. B sahəsi aktiv sahə bölgəsi ilə həmsərhəddir və ehtimal ki, aktiv sahənin bölgəsində zülal konformasiyasını qorumaqda əhəmiyyətli olan əlaqəli Ca 2+ ionu ehtiva edir. C ünvanında N.-molekulun terminal bölgəsinin katalitik mexanizmdə birbaşa rol oynaması ehtimalı azdır. A və B 21, 25 domenləri ilə daha az sıx bağlıdır.

Amilazalardakı katalitik hadisə, ikiqat yerdəyişmə mexanizminin nümunəsidir və aspartat və glutamat qalıqlarının karboksil qrupları turşu/əsas katalizatorları kimi və katalitik ardıcıllıqda kovalent bir ara maddənin əmələ gəlməsi üçün bir nukleofilik reaktiv kimi fəaliyyət göstərir. Cl-ionun aktivləşdirilməsi, 26-28 yükləmə rölesi sistemi vasitəsilə katalitik cəhətdən əhəmiyyətli bir karboksil qrupunun protonlanmasını asanlaşdırmaqla baş verə bilər.

α-Amilaz, əsas qısa zəncir məhsulları 1, 29 olaraq maltoz və maltotrioz ilə AM və AP-nin xətti hissələrinə çoxlu hücumlar edən bir endofermentdir. Yalnız kiçik miqdarda qlükoza 1, 30 istehsal olunur. Kinetik tədqiqatlar, donuz pankreas fermentinin aktiv sahəsinin beşə qədər qlükoza qalığını saxlaya biləcəyini irəli sürdü, yəni qlükoza qalıqlarının bağlana biləcəyi 5 alt sahə var. Birdən çox saytın mövcudluğu, rentgen kristalloqrafiyasından 3D strukturların istehsalı ilə təsdiqləndi, baxmayaraq ki, güclü karbohidrat inhibitoru akarboz ilə kompleksləşdirilmiş donuz pankreas amilazasının quruluşu haqqında bir hesabat altıncı sahənin 22 olduğunu sübut etdi. Hücuma həssas olan qlükozid bağı ondan ibarətdir ki, birləşdirici qalıqlar 3 və 4 (Şəkil 1) və aktiv sahənin katalitik əhəmiyyətli aspartat və qlutamat qalıqları həssas linkə hücum üçün uyğun şəkildə yerləşdirilir.

Α-amilazanın aktiv mərkəzində yerləşir. Bağın qırılması qalıqlar 3 və 4 arasında baş verir. Əsas aspartat və qlutamat qalıqlarının karboksil qrupları turşu-qələvi və nukleofil katalizator kimi fəaliyyət göstərir 22 .

Bağlayıcı sərbəst enerjini təyin etmək üçün malto-oligoskaridləri 31 substrat kimi istifadə edən kinetik tədqiqatlar (Δ)G) beş saytın hər biri ilə əlaqəlidir. ΔG dəyərlər daha mənfi olur (təqribən -5 ilə −16 kJ/mol arasında), yəni 1-5 alt sahələr 30-32 bir substratda qlükoza qalıqları ilə dolduqca bağlanma daha da güclənir. 3-cü sahənin bağlanma enerjisi +17,6 kJ/mol təşkil edir və bu əlverişsiz vəziyyət yəqin ki, bağlanma zamanı qlükan halqasının məcburi təhrifindən yaranır. Bağlanma enerjisi, lizozim 33 üzərindəki sahələr üçün müşahidə edilən enerjiyə bənzəyir. Yerli və hidrotermal işlənmiş nişasta üzərində amilazanın təsirini nəzərə alsaq, bütün alt hissələrin tutulması nəticəsində yaranan ümumi sərbəst enerjinin nəticəsidir (aşağıya baxın).


Geniş temperatur və pH stabilliyinə malik bir α-amilazanın identifikasiyası və funksional xarakteristikası Paenibacillus sp.

Amilazalar, qida, yuyucu və sellüloz sənayesində və fermentasiya proseslərində geniş tətbiq olunan əhəmiyyətli sənaye fermentləridir. Bu araşdırmada, genomik DNT kitabxanasından alfa-amilazanı kodlayan bir gen Paenibacillus sp. müəyyən edildi və xarakterizə edildi. Təyin olunmuş amilaza geni amy1 1980 bp-dən ibarət olduğu və digərindən α-amilaz genləri üçün paylaşılan ardıcıllıq kimliyi göstərildi Bacillus sp. Amy1 üçün çıxarılan amin turşusu ardıcıllığı digərləri ilə 80 % ardıcıllıq kimliyini göstərir Bacillus suşlar Rekombinant Amy1 -in heteroloji ifadəsi Escherichia coli BL21 (DE3) bu proteinin həll olunan formada bərpasını asanlaşdırdı. Fermentin kinetik məlumatları Amy1-ə sahib olduğunu ortaya qoydu K m 23,83 mq/ml və K pişik 48,74 dəq -1 və K pişik /K m 2 dəq −1 mq −1 mL −1 nişasta üçün. Bu zülalın fəaliyyətinin Mn 2+ ilə gücləndirildiyi aşkar edildi və bundan əlavə Amy1 geniş pH diapazonunda (4-10) və temperaturda (30-90 °C) aktiv qaldı. Amy1 -in geniş temperatur və pH şəraitində qida tullantıları üzərində hərəkət etmə qabiliyyəti, sadə şəkər istehsal etmək qabiliyyəti ilə yanaşı, qida sənayesində daha çox tətbiq üçün bir çox üstünlüklər göstərir.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Təşəkkürlər

Dr. Amy S.Y. -yə təşəkkür edirik. Lee (Kaliforniya Universiteti, Berkeley, ABŞ) bu əlyazmanın hazırlanması zamanı faydalı şərhlər üçün. Çin Elmlər Akademiyasının (Y42416101Q) və Çin Milli Təbiət Elmləri Fondunun (No. 31470181) Chaomin Sun üçün “100-İstedad Layihəsi” maliyyə dəstəyi üçün qəbul edilir. Dəniz bakteriyalarının suşu Vibrio alginolyticus 63, Çin Elmlər Akademiyası Okeanologiya İnstitutundan professor Dechao Zhang tərəfindən təmin edildi.


Tələb olunan reaktivlər və avadanlıqlar

Sodyum fosfat, bir əsaslı, Məhsul nömrəsi S0751

Natrium xlorid, Məhsul nömrəsi S9888

Kartofdan nişasta, Məhsul nömrəsi S2004

Natrium hidroksid, Məhsul nömrəsi S5881

Kalium natrium tartrat, tetrahidrat, Məhsul nömrəsi S2377

3,5-Dinitrosalicylic acid, Məhsul nömrəsi D0550

D‑(+)‑Maltoza, monohidrat, Məhsul nömrəsi M9171

Ehtiyat tədbirləri

Zəhmət olmasa təhlükələr və təhlükəsiz rəftar üsulları ilə bağlı məlumat üçün Təhlükəsizlik Məlumat Vərəqinə müraciət edin.


Amy1-in biokimyəvi və struktur xarakteristikası: bir Alfa-Amilaz Cryptococcus flavus İçində ifadə edildi Saccharomyces cerevisiae

Geni hüceyrədənkənar bir alfa-amilaza (Amy1) Cryptococcus flavus əvvəllər ifadə edildi Saccharomyces cerevisiae ion mübadiləsi və molekulyar istisna kromatoqrafiyası ilə homojenliyə (67 kDa) qədər təmizlənmişdir. ferment tərəfindən aktivləşdirildi

və Cu +2 və Hg +2 tərəfindən inhibe edilir. Vəhşi tip və rekombinant arasında əhəmiyyətli biokimyəvi və struktur uyğunsuzluqlar α-K -a görə amilazam dəyərlər, ferment spesifikliyi və ikincil quruluş məzmunu tapıldı. PH 7.0-da Uzaq UV CD spektrlərinin analizi, hər iki zülalın yüksək istilik dayanıqlığını və Amy1-in qatlama modelindəki fərqi yabanı tipli amilaza ilə müqayisədə ortaya çıxardı. C. flavusrekombinant zülalın enzimatik aktivliyinin azalmasında (10 qat) əks olunur. Fərqliliklərə baxmayaraq, Amy1 -in ən aşağı aktivliyindən fərqli olaraq həll olunan nişasta, amilopektin və amilaza qarşı ən yüksək aktivliyiw, bu zülalın qida sənayesindən bioyanacaq istehsalına qədər bir çox tətbiqi ilə böyük biotexnoloji əhəmiyyətə malik olduğuna işarə edir.

1. Giriş

Nişasta, buğda, düyü, manyok və kartof kimi bir çox iqtisadi əhəmiyyətli bitkilərin əsas saxlama məhsuludur [1]. Çox sayda mikroorqanizmlər nişastanı hidroliz etmək üçün hüceyrədənkənar və ya hüceyrədaxili fermentlərdən istifadə edir, beləliklə də onun enerji mənbəyi kimi istifadəsinə şərait yaradır. Nişastanı emal edən fermentlərin ən əhəmiyyətli qruplarından biri ilə təmsil olunur α-amilaza ailəsi və ya 13 qlikosil hidrolaza ailəsi [2, 3]. Amilazalar (EC 3.2.1.1, α-1,4-qlükan-qlükanohidrolaz) dekstrinlər və qlükoza kiçik polimerləri daxil olmaqla müxtəlif məhsullar verən nişasta polimerlərini hidroliz edən fermentlərdir. Bu fermentlər qida sənayesindən bioyanacaq istehsalına qədər bir çox tətbiqlərlə böyük biotexnoloji maraq doğurur. Hər bir fərqli tətbiq unikal xüsusiyyətlərə malik amilazaları tələb etdiyi üçün çox vaxt bu fermentlərin yeni mənbələri üçün biomüxtəliflikdə axtarış aparmaq lazımdır [4]. Kimi mayalardan təcrid olunmuş bir neçə amilaza Candida antarctica, Candida japoca [4], Lipomyces kononenkoae, Saccharomycopsis fibuligera, Schwanniomyces alluvius [5]Trichosporon pullulans,Filobasidium capsuligenum [6] təsvir edilmişdir. Bir-in xarakteristikasını daha əvvəl bildirmişdik α-amilaza (Amy1) basidiomycetous mayadan Cryptococcus flavus pH 5.5 -də yüksək stabillik və 50 ° C -də optimal temperatur kimi sənaye istifadəsi üçün əhəmiyyətli biokimyəvi xüsusiyyətlər nümayiş etdirdi [7]. Bunu kodlayan gen α-amilaza (AMY1) klonlandı və uğurla ifadə edildi Saccharomyces cerevisiae [8]. İstifadəsini qiymətləndirmək üçün S. cerevisiae Amy1-in heteroloji istehsalı üçün bir ev sahibi olaraq bu sistemdə istehsal olunan rekombinant fermentin təmizlənməsi və fermentativ xarakteristikası axtardıq.

2. Material və Metodlar

2.1. Ştammlar

S. cerevisiae CENPK2 (MATa/αura3-52/ura3-52 leu 2-3,112 trp1-289/trp1-289 his3-1/his3-1).

2.2. Enzim təmizlənməsi

Bir koloniya S. cerevisiae YEpAMY saxlayan CENPK2, SD mühitində (0,62% YNB, 2% qlükoza, urasil, triptofan və histidin) becərildi və 2 ml bu mədəniyyətdən eyni mühitdən 200 ml olan 1 L konik bir qaba köçürüldü. 60 saat (200 rpm) üçün 28°C. S. cerevisiae hüceyrələr sentrifuqasiya yolu ilə yığıldı (5000 q/10 dəq) və supernatant gecə ərzində suya qarşı dializ edildi və Q-Sepharose sürətli axın sütununa yükləndi (

sm) əvvəllər 50 mM natrium asetatda (pH 5.5) tarazlaşdırılmışdır. Sütun eyni tamponla yuyuldu və zülallar 0-0,5 M NaCl xətti gradienti ilə elüt edildi. 3 ml-lik dörd fraksiya toplandı və zülalların və amilaza aktivliyinin mövcudluğuna nəzarət edildi. Bu nümunələr toplandı, dializ edildi, liofilləşdirildi və 1 mL suda yenidən dayandırıldı və Sephacryl S-200 HR-ə yükləndi (

sm) əvvəllər tərkibində 0,1 M NaCl olan 50 mM natrium asetat ilə tarazlaşdırılmış sütun. Sütun eyni tamponla 12 ml · h -1 axın sürətində yuyulur. Amilaza aktivliyi olan fraksiyalar toplandı, suya qarşı dializ edildi, liyofilizə edildi və −20 ° C -də saxlanıldı. Xromatoqrafiya təcrübələrində, hər bir fraksiyanın protein tərkibi 280 nm -də udma qabiliyyətini ölçməklə mütəmadi olaraq izlənilirdi. Zülal konsentrasiyası standart olaraq serum albumin istifadə edərək ölçüldü [9].

2.3. Elektroforez və Zimoqramma Analizi

Protein bütövlüyü və molekulyar kütlənin hesablanması nümunələri 12% natrium dodesil sulfat-poliakrilimid gellərində işlətməklə həyata keçirilmişdir [10]. İstehsalçı [11] (1987) tərəfindən təsvir edildiyi kimi zülallar gümüşə boyanmışdır. Molekulyar kütlə markerləri (Fermentas Həyat Elmləri) aşağıdakı kimidir: β-qalaktosidaza (116 kDa), iribuynuzlu zərdab albumini (66,2 kDa), ovalbumin (45 kDa), laktat dehidrogenaz (35 kDa), REase Bsp98I (25 kDa), β-laktoglobulin (18.4 kDa) və lizozim (14.4 kDa) istehsalçı tərəfindən. Fəaliyyət jelləri (zymogram) nümunələri 12% nondenaturing PAGE -də işlədikdən sonra həyata keçirildi. Gellər distillə edilmiş su ilə yuyulur, 50 mM sodyum asetat (pH 5.5) ilə 60 dəqiqə inkubasiya edilir və sonra 0,5% nişasta (50 mM sodyum asetat tamponunda [pH 5.5] olan bir məhlulda 12 saat ərzində 4 ° C -də inkübe edilir. ). Jel daha sonra 37 ° C -də 2 saat inkübe edildi və yod məhlulu ilə boyandıqdan sonra (1 mM I) amilaza aktivliyi olan bantlar aşkar edildi.2 0.5 M KI).

2.4. Amilaz Testi

α-amilaza dekstrinizasiya edici aktivliyi 100 olan bir reaksiya sistemində analiz edildi μL 0,5% (ağırlıqda) həll olunan nişasta, 40 μL 0.5 M asetat tamponu (pH 5.5), ferment məhlulu (0-60 μL) və ümumi həcmi 200-ə qədər su μL. 60°C-də 10 dəqiqədən sonra reaksiya 200 ilə dayandırıldı μL 1.0 M sirkə turşusu. Sonra dekstrinləşdirici aktivliyi müəyyən etmək üçün yod reagenti əlavə edildi [12]. Saxarifikasiya fəaliyyəti, dinitrosalisilik turşusu (DNS) üsulu ilə nişastadan şəkərin azaldılması istehsalının ölçülməsi ilə təyin edilmişdir [13]. Dekstrinizasiya fəaliyyətinin bir vahidi, 0,1 mq nişasta/dəq hidrolizi üçün lazım olan ferment miqdarı olaraq təyin edilmişdir. Sakarlaşma fəaliyyətinin bir vahidi, 1 mq qlükoza ekvivalenti/dəq istehsal etmək üçün lazım olan ferment miqdarı olaraq təyin edilmişdir.

2.5. Fermentlərin xarakteristikası

Rekombinant amilazanın optimal pH-ı aşağıdakı tamponlardan (50 mM) istifadə etməklə reaksiya qarışıqlarının pH-nın dəyişdirilməsi ilə müəyyən edilmişdir: qlisin-HCl (pH 1,0-3,0), natrium asetat (pH 4,0-5,5), natrium fosfat (pH 6,0). -7,0) və Tris-HCl (pH 8,0-10) 60°C-də. PH sabitliyini müəyyən etmək üçün ferment müxtəlif tamponlarda 60 dəqiqə 60°C-də əvvəlcədən inkubasiya edilmişdir. Qalıq ferment aktivliyi 50 mM natrium asetat tamponunda (pH 5.5) yoxlanılıb. Fermentin optimal hesablanmış temperaturu 50 mM natrium asetatda (pH 5.5) müxtəlif temperaturlarda (30°C-dən 70°C-dək) ​​amilaza aktivliyinin ölçülməsi yolu ilə qiymətləndirilmişdir. Temperaturun ferment sabitliyinə təsiri 55 və 60°C-də 50 mM natrium asetatda (pH 5.5) 15, 30, 45 və 60 dəqiqəlik preinkubasiyadan sonra qalıq aktivliyin ölçülməsi ilə müəyyən edilmişdir. Metal ionlarının təsirini müəyyən etmək üçün analiz 4 mM yekun konsentrasiyada müxtəlif metal ionları ilə fermentin preinkubasiyasından sonra aparılmışdır. 10 mM CaCl təsiri2 və DTT (5-10 mM) də qiymətləndirilmişdir.

təmizlənmiş fermentin dəyərləri, fermenti 0-0.8 mq ilə inkübe etməklə müəyyən edilmişdir

60 ° C -də 50 mM sodyum asetat (pH 5.5) içərisində ml -1 həll olunan nişasta. Alınan məlumatlar xətti ən kiçik kvadratlar reqressiyasından istifadə edərək standart Lineweaver-Burk modelinə quraşdırılmışdır.

2.6. İncə Layer Xromatoqrafiya Analizi

Qısaca olaraq, təmizlənmiş amilaza 0,5% nişasta, glikogen, pullulan, amilaza və amilopektinlə 50 mM natrium asetatda (pH 5,5) 40°C-də inkubasiya edilmişdir. Alikotlar (10 μL) 6 və 12 saat inkubasiyadan sonra çıxarıldı. İlə xromatoqram hazırlanıb n-butanol/metanol/H2O (4 : 2 : 1). Şəkərlər nazik təbəqəli xromatoqrafiya ilə aşkar edilmişdir [14].

2.7. Dairəvi Dixroizm Spektroskopiyası

Dairəvi Dikroizm (CD) analizləri Peltier tipli temperatur kyuvetası ilə təchiz olunmuş Jasco J-815 spektropolarimetrindən (Jasco, Tokio, Yaponiya) istifadə edilməklə həyata keçirilmişdir. Uzaq UV spektrləri 0,1 sm uzunluğunda bir kvars küveti istifadə edərək qeyd edildi. Proteinlər (0.085 ilə 0.100 mq/ml) arasında 2 mM glisin pH 3.0 və 4.0, 2 mM sodyum asetat pH 5.5, 2 mM Tris-HCl pH 7.0 və 8.0-da analiz edilmişdir. CD məlumatlarını qənaətbəxş bir CD siqnalını təmin etmək və yüksək siqnal-səs-küy nisbətinin qarşısını almaq üçün 260–200 nm dalğa uzunluğu aralığında istifadə etdik. Ardıcıl dörd ölçmə toplandı və tamponun əsas qatqısı üçün ortalama spektrlər düzəldildi. Temperaturun 25-dən 95°C-ə yüksəldilməsi ilə termal denatürasiya analizləri aparılmışdır. Müşahidə olunan elliptikliklər molar elliptikliyə çevrildi ([θ]) 115 Da qalıq başına molekulyar kütlə əsasında. Zülal quruluşu və istilik açılma əyriləri [[θ] 222 və ya 206 nm-də.

İkinci dərəcəli strukturun temperaturdan asılılığı CDNN dekonvolution proqramından (Versiya 2.1, Bioinformatik.biochemtech.uni-halle.de/cdnn) istifadə edərək Uzaq-UV CD əyrilərinin tənzimləmələrindən təxmin edilmişdir [15].

3. Nəticələr və müzakirə

3.1. Amy təmizlənməsi 1

Amy1 süpernatantından təmizləndi S. cerevisiae iki mərhələli xromatoqrafik prosedurda mədəniyyətlər. Həm Q-Sepharose, həm də Sephacryl-S200HR xromatoqrafiyasının elüsyon profilləri amilaza aktivliyi ilə bir pik göstərdi (məlumatlar göstərilmir). Bu fraksiya toplanmış, dializ edilmiş və liyofilizasiya yolu ilə konsentrasiya edilmişdir. Məhsuldarlığı ilə spesifik aktivlik 3.79 qat artaraq ferment homojenliyə qədər təmizləndi

Üstünlüklə müqayisədə 10,3% (Cədvəl 1). Rekombinant fermentlə müqayisədə vəhşi tip Amy1-dən təmizləndi C. flavus mədəniyyətlər yalnız bir təmizləmə mərhələsində [7]. Təmizlənmiş rekombinant amilazanın SDS-PAGE analizi, uyğun bir zülal zolağı göstərdi

67 kDa (Şəkil 1(a)) göstərdi αzymogram analizlərindən sonra amilaza aktivliyi (Şəkil 1 (b)). Amilaza istehsal edən mayalar və filamentli göbələklər arasında α- amilazlardan Kriptokok sp S-2 [16], Aspergillus fumigatus [17], Lipomyces starkeyi [18], və Lipomyces kononenkoae [19] Amy1 -in istehsal etdiyi oxşar molekulyar kütlələri göstərdi S. cerevisiae.


(a)
(b)
(a)
(b) (a) 12% SDS-PAGE M üzərində təmizlənmiş rekombinant Amy1 təhlili, standart marker zülalları zolağı 1, zolaq 2, Q-Sepharose sütun zolağı 3-də ion mübadiləsindən sonra protein profili, Sephacryl S-200HR sütununda gel filtrasiyasından sonra təmizlənmiş rekombinant amilaz . (b) Denatüre olmayan PAGE-də amilaz aktivliyinin aşkarlanması.
3.2. Fermentlərin xarakteristikası

Rekombinant ferment üçün optimal pH pH 5.5 olaraq təyin edilmişdir (Şəkil 2 (a)). Amy1 təmizlənmiş fermenti 1 saat ərzində müvafiq tamponlarda əvvəlcədən inkubasiya etməklə pH sabitliyi üçün sınaqdan keçirilmişdir. Məlumatlar Amy1 -in geniş pH aralığına tolerant olduğunu göstərir (Şəkil 2 (b)). Bu nəticə tapılana bənzəyirdi α-müxtəlif maya suşlarından olan amilazalar [20, 21]. Maya üçün optimal pH α-amilaza aktivliyi adətən 4.0 və 6.0 [5, 7, 16, 21] diapazonunda olur.


(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d) PH (a-b) və temperaturun (c-d) Amy1 aktivliyinə və stabilliyinə təsiri. PH optimallığı və pH stabilliyi, reaksiya qarışıqlarının pH -nın dəyişməsi və fermentin müxtəlif tamponlarda 60 dəqiqə 55 ° C (kvadrat) və 60 ° C (dairə) daxilində əvvəlcədən inkubasiya edilməsi yolu ilə müəyyən edilmişdir. Fərqli temperaturda amilaza aktivliyi ölçülüb və temperaturun ferment stabilliyinə təsiri 50, 50 nM natrium asetat (pH 5.5) içərisində 15, 30, 45 və 60 dəqiqəlik əvvəlcədən inkubasiyadan sonra qalıq aktivliyin ölçülməsi ilə müəyyən edilmişdir. 55 və 60 ° C.

30 ilə 70 ° C arasındakı temperaturun funksiyası olaraq ölçülən amilaza aktivliyi, aktivliyin 60 ° C -də ən yüksək olduğunu göstərir (Şəkil 2 (c)). Bu optimal temperatur ilə uyğundur α-dan amilazalar Kriptokok sp S-2 1 mM CaCl ilə işlənir2 [16] və Aureobasidium pullulans N13d [20]. Termostabillik sənaye tətbiqi üçün vacib və faydalı meyar hesab olunur α-mikroorqanizmlərdən amilaza. Şəkil 2(d)-də göstərildiyi kimi, qalıq amilaza aktivliyi 1 saat inkubasiyadan sonra 55°C-də praktiki olaraq sabitdir. Ancaq 60 ° C -də qalıq aktivliyin 50% -i itirildi. Iefuji və başqaları. [16] C-terminal xam nişasta bağlama motivlərinin mövcud olduğunu təklif etdi Kriptokok sp S-2 amilaza (AMY-CS2) bu amilazanın təqdim etdiyi termostabilliyə aid ola bilər. Amy1, AMY-CS2 ilə [8] 97% ardıcıllıq kimliyinə malik olduğundan, eyni izahatın Amy1-ə də aid olması mümkündür.

Cədvəl 2-də təqdim olunan nəticələr göstərir ki, nisbi aktivlik 70%-dən yüksək olduğundan rekombinant Amy1 sınaqdan keçirilmiş 4 mM ionların əksəriyyətindən (Mg 2+, Mn 2+ və Ca 2+) zəif təsirlənir. Bundan əlavə, 10 mM CaCl iştirakı ilə də aşkar edilmişdir2, Amy1 hələ də bu fəaliyyətin Ca +2 -dən təsirlənmədiyini göstərən orijinal fəaliyyətini (məlumatlar göstərilməmişdir) qoruyub saxlamışdır. Oxşar davranış vəhşi tip Amy1 üçün tapıldı. Bununla birlikdə Takeuchi və digərləri. [22] qeyd etdi ki, Pichia burtoniiα-amilaza Ca +2 (135%) tərəfindən aktivləşdirilmişdir. Bu müəlliflər, fermentin kalsium ionları ilə aktivləşdirilməsinin, ehtimal ki, fermentin fəaliyyətini itirdiyi zaman, təmizləmə proseduru zamanı baş verdiyini irəli sürmüşlər. The Bacillus halodurans 38C-21 α-amilazanın da Ca 2+ varlığında aktivliyi artmışdır [23]. NH varlığı4 + ionları rekombinant Amy1 üzərində ən görkəmli aktivləşdirici təsirə malik idi (111%). Bununla birlikdə, Zn 2+, Cu 2+ və Hg 2+ amilaza aktivliyinin inhibitorları kimi çıxış edir, Cu +2 və Hg 2+ tam inhibe göstərir (Cədvəl 2). Hg 2+ tərəfindən inhibe edilməsi, amin turşusu qalıqlarının indol qrupunun ferment funksiyasındakı əhəmiyyətini göstərə bilər [4, 24]. Vəhşi tipli amilaz Hg 2+, Ag+, Cu 2+ və Mg 2+ [16] tərəfindən inhibə edilir. L. kononenkoae CBS 5608 Ag + və Cu 2+ tərəfindən inhibə edilir [21]. Maraqlıdır ki, mayadan olan amilaza Aureobasidium pululanlar N13d təmizlənmiş fermentə aktivləşdirici təsir göstərən Cu 2+ tərəfindən inhibə olunmur [20]. DTT tez -tez molekullararası və molekullararası disülfid bağlarını azaltmaq və qarşısını almaq üçün istifadə olunur. DTT (4-25 mm) istifadə edildikdə fermentin fəaliyyəti praktiki olaraq sabit idi (məlumatlar göstərilməyib). Bu nəticə ilə müşahidə ediləndən fərqli idi Thermotoga maritima MSB8 amilaza ilə ifadə edilir E. coli DDT varlığında 5 ilə 10 mM arasında artan aktivlik göstərdi [25].

Wanderley və başqaları. [7] yabanı tip Amy1 üçün 0,056 mq ml-1 olduğunu bildirdi ki, bu, substrat kimi həll olunan nişasta ilə Michaelis-Menten tipli kinetika göstərən rekombinant amilaza (0,37 mq mL -1) üçün müşahidə ediləndən xeyli kiçikdir. Rekombinant fermentin əmələ gəlməsi digər maya amilazalarına bənzəyir Schwanniomyces alluvius [5] və Termomonospora curvata [26].

Rekombinant Amy1-in spesifikliyini müəyyən etmək üçün ferment nişasta, amilopektin, amiloza, glikogen və pullulan ilə inkubasiya edilmişdir. Bu substratlar tərkibində müxtəlif qlükoza polimerlərindən ibarətdir α-1,4 əlaqə və ya qarışığı α-1,4- və α-1,6-qlükozid əlaqələri. Amy1 həll olunan nişasta (100%) amilopektin (97.9%), amilozaya (50.6%) qarşı ən yüksək aktivlik göstərdi, lakin pullulan üzərində heç bir aktivlik müşahidə olunmadı. This result is similar to that observed for the Bacillus subtilis truncated α-amylase produced in E. coli [27], but different from that observed for wild-type Amy1 which showed the highest activity towards starch (100%), glycogen (18.9%), amylopectin (16.7%), and amylose (7.1%). The recombinant enzyme displayed typical α-amylase properties based on the evidence that oligosaccharides from several sizes were the main products from the digestion of glycogen, amylose, amylopectin, and starch (Figure 3).


Thin-layer chromatogram of products released from starch after treatment with recombinant Amy1. The standards used were glucose (G1), maltose (G2), maltotriose (G3), and maltotetraose (G4). Lane 1, control (starch without enzyme) lane 2, pullulan lane 3, glycogen lane 4, amylose lane 5, amylopectin, and lane 6, soluble starch.
3.3. Conformational Stability of Amy

Structural characterization of recombinant (Amy1) and wild-type (Amyw) amylase from C. flavus was carried out by circular dichroism spectroscopy for comparison. Far-UV CD spectra of Amy1 and Amy1w at pH 7.0 and 25°C are quite different showing typical features of beta/unordered and beta/α-helix secondary structure pattern, respectively (Figure 4(a)). While the 222 nm dichroic band is predominantly associated with α-helical structure, the dichroic band at 198 and 206 nm may arise from changes in other secondary structure elements in the protein, as unordered or beta structure. The secondary structure content of both proteins slightly differs on helical (Amy1, 5.7% and Amy1w, 9.5%) and antiparallel β-sheet (Amy1, 42.1% and Amy1w, 32.4%) and is similar for other secondary structures.


(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d) Far-UV circular dichroism analyses. Residual molar ellipticity [θ] was measured from 200 to 260 nm at 25°C or temperature arising from 25 to 95°C. (a) The distinct spectra of wild-type (Amy1w) and recombinant (Amy1) amylase are shown, indicating that they had different amount of secondary structure (see Section 3). (b) Effect of temperature on secondary structure of Amy1. Changes in molar ellipticity at 222 and 200 nm are shown as a function of temperature. (c) Effect of pH on secondary structure of Amy1. Note the slight differences of CD spectra at pH 7.0, 3.0, and 5.5 and similarity of CD spectra at pH 4.0 and 8.0. (d) Effect of temperature on secondary structure of Amy1w. Changes in molar ellipticity at 222 and 206 nm are shown as a function of temperature.

Thermal stability of the proteins at pH 7.0 was assessed upon raising the temperature from 20 to 95°C (Figures 4(b) and 4(d)). The thermal denaturation curves analyzed from Far-UV CD measurements at 206 and 222 nm at pH 7.0 strongly indicated the Amy1w and Amy1 as thermally stable proteins since no pattern of protein denaturation could be verified (data not shown). Indeed, although the CD spectra of the Amy1w in this condition show a gradual increase (downward) of the dichroic bands at 206 nm and slight at 222 nm (Figure 4(d)), no secondary structure changes were detected suggesting only conformational changes of protein or secondary structure rearrangement as a function of temperature. In contrast, CD spectra of the Amy1 show a gradual increase and decrease of the dichroic bands at 222 and 200 nm, respectively, suggesting the alteration of helical and β-sheet structures content (Figure 4(b)). A slight increase was observed in terms of α-helix (from 5.7% to 6.8%) and decrease of β-sheet (from 42.1% to 38.8%) when raising the temperature from 25 to 95°C. Altogether, these results revealed the high thermal stability of both proteins and the difference in folding pattern of Amy1 compared with wild-type amylase from C. flavus reflecting in decrease (10-fold) of enzymatic activity ( values) of recombinant protein using a soluble starch as substrate, as discussed above.

Besides significant distinction in pH region where the maximum enzymatic activity of Amy1 occurred (Figure 2(a)), the protein achieved similar secondary structure content (helical 5.7%–6.5% and β-vərəq

42%) in a broad range of pH (pH 3.0, 5.5, and 7.0), as indicated by the CD spectra (Figure 4(c)) and CDNN estimative. At pH 8.0 as well as pH 4.0, it was verified the mainly increase in the CD signal at 200 nm (Figure 4(c)), compatible with minor β-sheet structures content (

37%) compared with pH 3.0, 5.5, and 7.0 (

42%). Noteworthy, although no secondary structure changes have been observed, analogous or different conformation of Amy1 side chains could occur as a function of those pHs, as judged by the relative activity of the enzyme in these condition (Figures 2(a) and 2(b)). In these cases, some important structural changes related with side chains ionization of aspartate, glutamate, and histidine residues at pH 4.0 and 5.5 could occur and are fundamental to enzyme activity.

In this work we have observed some significant biochemical and slight structural discrepancies between wild-type and recombinant Amy1 especially with respect to values, enzyme specificity, and helical and β-sheet structure content. These could be explained by small folding alterations in the structure of recombinant amylase during its expression. Different patterns of protein glycosylation between C. flavusS. cerevisiae could also account for these differences. In fact, three putative N.-glycosylation sites have been identified in Amy1 [8]. Work is under way to assess the role of glycosylation on the activity of Amy1. Because recombinant Amy1 showed considerable thermostability, its use in biotechnological processes should be considered.

4. Nəticə

In conclusion, the enzymatic and structural features of Amy1, the highest activity towards soluble starch, amylopectin, and amylase, in contrast with the lowest activity of Amy1w, points out this protein as being of paramount biotechnological importance with many applications ranging from food industry to the production of biofuels.

Acronyms

SD:Synthetic dextrose minimal media
YNB:Yeast nitrogen base
REase:Ribonuclease
PAGE:Polyacrilymide gel electrophoresis
DTT:Dithiothreitol
CDNN:Neural network circular dichroism.

Təşəkkürlər

This work was supported by a biotechnology research grant to C. J. Ulhoa and F. A. G. Torres (CNPq, FINEP, and FUNAPE/UFG). A. S. Galdino was supported by CAPES/Brazil.

İstinadlar

  1. M. J. E. C. Van Der Maarel, B. Van Der Veen, J. C. M. Uitdehaag, H. Leemhuis, and L. Dijkhuizen, “Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family,” Biotexnologiya jurnalı, cild 94, yox. 2, pp. 137–155, 2002. View at: Publisher Site | Google Alimi
  2. B. Henrissat, “A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities,” Biokimyəvi jurnal, cild 280, yox. 2, pp. 309–316, 1991. View at: Google Scholar
  3. B. Henrissat and A. Bairoch, “Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,” Biokimyəvi jurnal, cild 316, no. 2, pp. 695–696, 1996. View at: Google Scholar
  4. R. Gupta, P. Gigras, H. Mohapatra, V. K. Goswami, and B. Chauhan, “Microbial α-amylases: a biotechnological perspective,” Proses Biokimyası, cild 38, yox. 11, pp. 1599–1616, 2003. View at: Publisher Site | Google Alimi
  5. J. J. Wilson and W. M. Ingledew, “Isolation and characterization of Schwanniomyces alluvius amylolytic enzymes,” Tətbiqi və Ətraf Mühitin Mikrobiologiyası, cild 44, yox. 2, pp. 301–307, 1982. View at: Google Scholar
  6. R. De Mot and H. Verachtert, “Secretion of α-amylase and multiple forms of glucoamylase by the yeast Trichosporon pullulans,” Canadian Journal of Microbiology, cild 32, yox. 1, pp. 47–51, 1986. View at: Google Scholar
  7. K. J. Wanderley, F. A. G. Torres, L. M. P. Moraes, and C. J. Ulhoa, “Biochemical characterization of α-amylase from the yeast Cryptococcus flavus,” FEMS Mikrobiologiya Məktubları, cild 231, no. 2, pp. 165–169, 2004. View at: Publisher Site | Google Alimi
  8. A. S. Galdino, C. J. Ulhoa, L. M. P. Moraes, M. V. Prates, C. Bloch, and F. A. G. Torres, “Cloning, molecular characterization and heterologous expression of AMY1, an α-amylase gene from Cryptococcus flavus,” FEMS Mikrobiologiya Məktubları, cild 280, yox. 2, pp. 189–194, 2008. View at: Publisher Site | Google Alimi
  9. M. M. Bradford, "Zülal boyası bağlama prinsipindən istifadə edərək mikrogram miqdarda protein miqdarının sürətli və həssas bir üsulu" Analitik biokimya, cild 72, yox. 1-2, s. 248–254, 1976. Bax: Google Scholar
  10. U. K. Laemmli, “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4,” Təbiət, cild 227, yox. 5259, pp. 680–685, 1970. View at: Publisher Site | Google Alimi
  11. H. Blum, H. Bier, and H. Gross, “Improved silver staining of plants proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels,” Elektroforez, cild 8, pp. 93–99, 1987. View at: Google Scholar
  12. H. Fuwa, “A new method for microdetermination of amylase activity by the use of amylose as the substrate,” Journal of Biochemistry, cild 41, yox. 5, pp. 583–603, 1954. View at: Google Scholar
  13. G. L. Miller, “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar,” Analytical Chemistry, cild 31, yox. 3, pp. 426–428, 1959. View at: Google Scholar
  14. M. Lato, B. Brunelli, G. Ciuffini, and T. Mezzetti, “Thin-layer chromatography of carbohydrates on silica gel impregnated with sodium acetate, monosodium phosphate and disodium phosphate,” Journal of Chromatography A, cild 39, pp. 407–417, 1969. View at: Google Scholar
  15. G. Bohm, R. Muhr, and R. Jaenicke, “Quantitative analysis of protein far UV circular dichroism spectra by neural networks,” Protein Engineering, cild 5, yox. 3, pp. 191–195, 1992. View at: Google Scholar
  16. H. Iefuji, M. Chino, M. Kato, and Y. Iimura, “Raw-starch-digesting and thermostable α-amylase from the yeast Kriptokok sp. S-2: purification, characterization, cloning and sequencing,” Biokimyəvi jurnal, cild 318, yox. 3, pp. 989–996, 1996. View at: Google Scholar
  17. C. E. Goto, E. P. Barbosa, L. C. L. Kistner, F. G. Moreira, V. Lenartovicz, and R. M. Peralta, “Production of amylase by Aspergillus fumigatus utilizing α-methyl-D-glycoside, a synthetic analogue of maltose, as substrate,” FEMS Mikrobiologiya Məktubları, cild 167, no. 2, pp. 139–143, 1998. View at: Publisher Site | Google Alimi
  18. H. K. Kang, J. H. Lee, D. Kim et al., “Cloning and expression of Lipomyces starkeyiα-amylase in Escherichia coli and determination of some of its properties,” FEMS Mikrobiologiya Məktubları, cild 233, no. 1, pp. 53–64, 2004. View at: Publisher Site | Google Alimi
  19. A. J. C. Steyn, J. Marmur, and I. S. Pretorius, “Cloning, mapping and characterization of a genomic copy of the Lipomyces kononenkoaeα-amylase-encoding gene (LKA1),” Yeast, cild 12, yox. 10, pp. 925–937, 1996. View at: Publisher Site | Google Alimi
  20. H. Li, Z. Chi, X. Wang, X. Duan, L. Ma, and L. Gao, “Purification and characterization of extracellular amylase from the marine yeast Aureobasidium pullulans N13d and its raw potato starch digestion,” Enzyme and Microbial Technology, cild 40, yox. 5, pp. 1006–1012, 2007. View at: Publisher Site | Google Alimi
  21. J. A. Prieto, B. R. Bort, J. Martínez, F. Randez-Gil, C. Buesa, and P. Sanz, “Purification and characterization of a new alpha-amylase of intermediate thermal stability from the yeast Lipomyces kononenkoae,” Biokimya və Hüceyrə Biologiyası, cild 73, yox. 1-2, pp. 41–49, 1995. View at: Google Scholar
  22. A. Takeuchi, A. Shimizu-Ibuka, Y. Nishiyama et al., “Purification and characterization of an α-amylase of Pichia burtonii isolated from the traditional starter "murcha" in Nepal,” Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, cild 70, yox. 12, pp. 3019–3024, 2006. View at: Publisher Site | Google Alimi
  23. S. Murakami, H. Nishimoto, Y. Toyama et al., “Purification and characterization of two alkaline, thermotolerant α-amylases from Bacillus halodurans 38C-2-1 and expression of the cloned gene in Escherichia coli,” Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, cild 71, yox. 10, pp. 2393–2401, 2007. View at: Publisher Site | Google Alimi
  24. F. Moranelli, M. Yaguchi, G. B. Calleja, and A. Nasim, “Purification and characterization of the extracellular alpha-amylase activity of the yeast Schwanniomyces alluvius,” Biokimya və Hüceyrə Biologiyası, cild 65, yox. 10, pp. 899–908, 1987. View at: Google Scholar
  25. M. Ballschmiter, O. Fütterer, and W. Liebl, “Identification and characterization of a novel intracellular alkaline α-amylase from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima MSB8,” Tətbiqi və Ətraf Mühitin Mikrobiologiyası, cild 72, yox. 3, pp. 2206–2211, 2006. View at: Publisher Site | Google Alimi
  26. J. L. Glymph and F. J. Stutzenberger, “Production, purification, and characterization of α-amylase from Thermomonospora curvata,” Tətbiqi və Ətraf Mühitin Mikrobiologiyası, cild 34, yox. 4, pp. 391–397, 1977. View at: Google Scholar
  27. J. L. Marco, L. A. Bataus, F. F. Valencia, C. J. Ulhoa, S. Astolfi-Filho, and C. R. Felix, “Purification and characterization of a truncated Bacillus subtilisα-amylase produced by Escherichia coli,” Applied Microbiology and Biotechnology, cild 44, yox. 6, pp. 746–752, 1996. View at: Publisher Site | Google Alimi

Müəllif hüququ

Copyright © 2011 Alexsandro Sobreira Galdino et al. Bu, Creative Commons Attribution License əsasında paylanmış açıq giriş məqaləsidir və orijinal əsərə lazımi sitat gətirmək şərti ilə istənilən mühitdə məhdudiyyətsiz istifadəyə, paylanmaya və təkrar istehsala icazə verir.


Videoya baxın: Kimyevi reaksiya tenliklerinin emsallasdirilmasi (Dekabr 2022).