Məlumat

Real vaxt üçün standart əyri

Real vaxt üçün standart əyri


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Qat dəyişikliyini yoxlamaq üçün bəzi yeni astarlar üçün standart bir əyri yerinə yetirərkən, standart əyrini yerinə yetirmək lazımdırmı? Demək istəyirəm ki, təcrübəniz eyni ekotip fonunda bir neçə genotipə sahib olduğu təqdirdə, müxbir nəzarəti və müalicəsi ilə, bütün bu ssenarilər üçün standart əyriləri icra etməliyəmmi, daha doğrusu, təsadüfi müalicə olunan genotip deyim, baxın R = 0.99 və ya daha yüksək olduğunu və səmərəliliyinin 2 olduğunu? Materialı israf etməmək üçündür.


Effektivliyi müəyyən etmək üçün hər bir astar cütü üçün standart əyrini bir dəfə edin. İstənilən şablon ilə istənilən sayda təkrarlama üçün səmərəlilik dəyərlərindən istifadə edə bilərsiniz.

Düşünürəm ki, əvvəlki yazınızda bu mövzunu bir qədər müzakirə etdik.


Şablonun real vaxt tərs transkriptaz-polimeraz zəncirvari reaksiyası ilə RNT virusunun mütləq kəmiyyətlənməsi üçün standart bir əyri yaratmağa təsiri.

Real vaxt rejimində əks transkriptaza-PCR (RT-PCR) ilə RNT virusunun mütləq kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün lazım olan standart əyrilərin yaradılmasına müxtəlif şablonların təsiri qiymətləndirilmişdir. Tədqiqat üçün bir RNT virusu nümunəsi olaraq yabanı və mədəni somonun əsas viral patogenlərindən olan yoluxucu pankreas nekroz virusundan (IPNV) istifadə etdik. IPNV proteaz genini təmsil edən dörd fərqli şablondan ibarət bir seyreltmə seriyası (göy qurşağı alabalığında IPNV yükünü ölçmək üçün standart əyrilər istehsal etmək üçün şablon olaraq 100 baza və 500 baza malik iki in vitro transkripsiyalı RNA, bir plazmid DNT və bir DNT oligo) istifadə edilmişdir. . PCR -də istifadə olunan şablonun xarakterindən asılı olmayaraq, yamac, uyğunluğun yaxşılığı (r (2)) və PCR -nin səmərəliliyi (e) statistik olaraq bərabər idi. Faktorial ANOVA istifadə edərək, təcrübəli şəkildə sınaqdan keçirilmiş göy qurşağı alabalığında IPNV-nin mütləq miqdarı üçün dörd fərqli standart əyrilərdən istifadə edərək IPNV nüsxə sayında əhəmiyyətli bir fərq müşahidə edilməmişdir. Bununla belə, IPNV transkript bolluğu hər reaksiya üçün 100 nüsxədən az olduqda və şablon ölçüsü amplikon ölçüsündən böyük olduqda gücləndirmə daha dəyişkən idi. Məlumat göstərir ki, standart əyri yaratmaq üçün istifadə olunan şablonun ölçüsü amplikonun ölçüsünə çox bənzəməlidir. Sintetik DNT oliqo şablonu bu məqsəd üçün optimal olardı, çünki o, sifarişlə hazırlana bilər və onun sintezi üçün yalnız ardıcıllıq məlumatı tələb olunur. Bununla belə, əgər standart əyri hər reaksiya üçün 100 nüsxədən çox şablon surəti ilə yaradılarsa, şablonun təbiəti standart əyriyə heç bir təsir göstərmir və buna görə də, daha ucuz şablon digərindən daha çox üstünlük təşkil edəcək. bahalı variantlar.


Nisbi real vaxt PCR məlumat emalı üçün standart əyri əsaslı bir üsul

Fon: Hal-hazırda real vaxtda PCR gen ifadəsini ölçmək üçün ən dəqiq üsuldur. Metod böyük miqdarda xam rəqəmsal məlumat yaradır və emal son nəticələrə əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərə bilər. Məlumatların emalı ya standart əyrilərə, ya da PCR səmərəliliyinin qiymətləndirilməsinə əsaslanır. Hal -hazırda nisbi PCR -də PCR səmərəliliyi yanaşmasına üstünlük verilir, halbuki standart əyri tez -tez mütləq PCR üçün istifadə olunur. Bununla belə, nisbi PCR üçün standart əyrilərdən istifadə etmək üçün heç bir maneə yoxdur. Bu məqalə, standart əyri metodunun tətbiqini təmin edir və nisbi real vaxt PCR -də üstünlüklərini və məhdudiyyətlərini müzakirə edir.

Nəticələr: Nisbi real vaxt PCR -də məlumatların işlənməsi üçün bir prosedur hazırladıq. Prosedura tamamilə PCR səmərəliliyinin qiymətləndirilməsinin qarşısını alır, operatorun iştirakını minimuma endirir və analizdaxili variasiyanın statistik qiymətləndirilməsini təmin edir. Prosedura aşağıdakı addımlar daxildir. (I) Səs hamarlaşdırma, bazal çıxma və amplituda normallaşdırma yolu ilə çiy floresans oxunuşlarından süzülür. (II) Optimal hədd standart əyrinin reqressiya parametrlərindən avtomatik seçilir. (III) Keçid nöqtələri (CP), eşik xəttinin səs -küy süzgəcindən sonra əldə edilən floresans sahələrini keçdiyi nöqtələrin koordinatlarından birbaşa əldə edilir. (IV) Vasitələr və onların fərqləri PCR replikalarında CP-lər üçün hesablanır. (V) Yekun nəticələr CP -lərin vasitələrindən əldə edilir. CP-lərin fərqləri səhvlərin yayılması qanunu ilə nəticələrə görə izlənilir. Bu məlumatların işlənməsinin ətraflı təsviri və təhlili verilir. Parametrik statistik metodların istifadəsi və amplitudun normallaşdırılması ilə bağlı məhdudiyyətlər xüsusi olaraq təhlil edilir və adi laboratoriya təcrübəsinə uyğun gəlir. Çoxsaylı istinad genlərindən əldə edilən məlumatların toplanması üçün fərqli variantlar müzakirə olunur.

Nəticə: PCR məlumatlarının emalı üçün standart əyri əsaslı prosedur tərtib edilmiş və təsdiq edilmişdir. Standart əyri dizaynının nisbi real vaxtlı PCR-də PCR səmərəliliyinə əsaslanan hesablamalara etibarlı və sadə bir alternativ olaraq qaldığını göstərir.


Normal paylanmanın 9 real həyat nümunəsi

Normal paylama əhali arasında faktorların paylanmasının başa düşülməsində geniş istifadə olunur. Normal paylanma bir çox təbiət hadisələrini çox yaxşı təxmin etdiyi üçün, bir çox ehtimal problemləri üçün istinad standartına çevrilmişdir.

Normal/Gauss Dağılımı, iki əsas termini əhatə edən zəng formalı bir qrafikdir- orta və standart sapma. Əksər dəyərlərin ortalamada toplandığı, qalanlarının simmetrik olaraq hər hansı bir həddinə doğru büküldüyü bir məlumat dəstinin simmetrik bir tənzimləməsidir. Çoxsaylı genetik və ətraf mühit faktorları xüsusiyyətə təsir göstərir.

Mərkəzi Limit Teoremi

Normal paylama, müxtəlif müstəqil amillərin müəyyən bir xüsusiyyətə təsir etdiyini bildirən mərkəzi limit nəzəriyyəsinə uyğundur. Bütün bu müstəqil amillər bir fenomenə töhfə verdikdə, onların normallaşdırılmış cəmi Gauss bölgüsü ilə nəticələnir.

Normal əyri

Paylanmanın orta dəyəri qrafikin mərkəzinin yerini müəyyənləşdirir, standart kənarlaşma isə qrafikin hündürlüyü və enini təyin edir və normal əyri altındakı ümumi sahə 1-ə bərabərdir.

Normal Dağıtımın gündəlik həyat nümunələrini anlayaq.

1. Hündürlük

Əhalinin boyu normal paylanmanın nümunəsidir. Müəyyən bir populyasiyadakı insanların çoxu orta boylu insanlardır. Orta boylu insanlardan daha uzun və qısaboylu insanların sayı demək olar ki, bərabərdir və çox az sayda insan ya həddindən artıq boylu, ya da son dərəcə qısadır. Ancaq boy tək bir xüsusiyyət deyil, bir neçə genetik və ekoloji faktor boya təsir edir. Buna görə də normal paylanmaya əməl edir.

2. Zar atmaq

Zarların ədalətli yuvarlanması da normal paylanmanın yaxşı bir nümunəsidir. Bir təcrübədə, bir zarın 100 dəfə yuvarlandığı zaman 𔃱 ’ almaq şansının 15-18% olduğu və zarı 1000 dəfə yuvarlasaq 𔃱 ’ almaq şansının olduğu, yenə eyni, orta hesabla 16.7% (1/6). Eyni anda iki zar yuvarlasaq, 36 mümkün birləşmə var. 𔃱’” yuvarlanma ehtimalı (altı mümkün kombinasiya ilə) yenidən orta hesabla 16,7%-ə yaxındır, yəni (6/36). Normal paylama qrafiki daha çox zar sayının daha ətraflı izahı olacaq.

3. Sikkə atmaq

Sikkə çevirmək mübahisələrin həlli üçün ən qədim üsullardan biridir. Hamımız bir matçdan və ya oyundan əvvəl bir sikkə çevirdik. Bir sikkəni çevirməkdə ədalətlilik, hər iki nəticə ilə bərabər şansa sahib olmasıdır. Baş almaq şansı 1/2, quyruqlar üçün də eynidir. Hər ikisini əlavə etdikdə birinə bərabər olur. Sikkələri bir neçə dəfə atsaq, baş və quyruq əldə etmə ehtimalının cəmi həmişə 1 qalacaq.

4. IQ

Artan rəqabət ssenarisində, əksər valideynlər, eləcə də uşaqlar, Ağıllı Kot səviyyəsini təhlil etmək istəyirlər. Bəli, müəyyən bir əhalinin IQ, normal bir paylanma əyrisidir, burada əhalinin əksəriyyətinin IQ normal diapazonda, qalan əhalinin IQ isə sapma aralığında yerləşir.

5. Texniki Birja

Bir çoxumuz birjada səhmlərin qiymətinin qalxması və düşməsi haqqında eşitmişik.

Valideynlərimiz və ya xəbərlərin düşməsi və səhmlərin qiymətində yürüyüş. Forex məzənnələrinin, qiymət indekslərinin və səhm qiymətlərinin qaytarılmasının qeyd dəyərlərindəki bu dəyişikliklər tez-tez zəng şəklində bir əyri meydana gətirir. Səhm gəlirləri üçün standart sapma çox vaxt dəyişkənlik adlanır. Əgər gəlirlər normal şəkildə paylanırsa, gəlirlərin 99 faizindən çoxunun orta dəyərin kənara çıxması daxilində olacağı gözlənilir. Zəng formalı normal paylamanın bu cür xüsusiyyətləri analitiklərə və investorlara səhmlərin gözlənilən gəliri və riski haqqında statistik nəticələr çıxarmağa imkan verir.

6. İqtisadiyyatda gəlir bölgüsü

Bir ölkənin gəliri davamlı siyasət və hökumətin əlindədir. Gəlirləri varlılar və kasıblar arasında necə bölüşdürmələri onlardan asılıdır. Hamımız yaxşı bilirik ki, orta təbəqə əhalisi varlı və kasıb əhalidən bir qədər çoxdur. Beləliklə, orta təbəqə əhalisinin əmək haqqı normal paylanma əyrisində ortalamanı təşkil edir.

7. Ayaqqabı Ölçüsü

Zoluşkanın şahzadənin evində qoyub getdiyi şüşə başmaq başqa qadının ayağına taxsaydı, nə baş verərdi, heç düşünmüsünüzmü? O, başqa qadınla evlənəcəkdi. Hamımızın rastlaşdığımız əyləncəli fərziyyələrdən biri idi. ABŞ-da toplanmış məlumatlara görə, qadın ayaqqabılarının ölçülərinə görə satışları normal olaraq paylanır, çünki əksər qadınların fiziki makiyajı demək olar ki, eynidir.

8. Doğum Çəki

Yenidoğanın normal doğum çəkisi 2,5 ilə 3,5 kq arasında dəyişir. Yenidoğulmuşların əksəriyyətinin çəkisi normaldır, yenidoğulmuşların isə yalnız bir neçə faizinin çəkisi normadan yüksək və ya aşağıdır. Beləliklə, doğum çəkisi də normal paylanma əyrisini izləyir.

9. Tələbə ’s Orta Hesabatı

İndiki vaxtda məktəblər öz çıxışlarını sosial mediada və televiziyada reklam edirlər. Onlar məktəblərinin orta nəticəsini təqdim edir və valideynləri övladını həmin məktəbə yazdırmağa cəlb edirlər. Məktəb rəhbərliyi bütün tələbələrin orta akademik performansını tapır və əksər hallarda normal paylanma əyrisini izləyir. Orta intellektli tələbələrin sayı digər tələbələrin əksəriyyətindən çoxdur.


Standart Curve Protocol ilə SYBR Green qPCR

Bu protokol, StepOnePlus Maşın istifadə təcrübələrinə əsaslanır və istifadəçilərə mənalı qPCR nəticələri yaratmağa kömək etmək üçündür.

Prosedur

Addım 1: RNT təmizlənməsi

Növlərə və nümunə növünə (məməlilərin hüceyrələri/toxuma/qan, maya, bitki) asılı olaraq satışda olan uyğun dəsti istifadə edin. RNT ilə çirklənmədən son dərəcə ehtiyatlı olaraq protokolu diqqətlə izləyin. Çılpaq əllərlə heç bir şeyə toxunmayın, əlcəkləri tez-tez dəyişdirin, tezgahı və avadanlıqları satılan RNAse təmizləyici sprey ilə təmizləyin (məsələn, RNAse Away #038184, MBP). Bütün plastik aşınmalar (pipet ucları, 1.5 ml polipropilen borular və s.) "RNAse-Free" alınmalıdır. İstifadədən əvvəl plastik boruları avtoklavlamayın. Başlamazdan əvvəl yaxşı bir RNTaz-sız suyun olması ümumiyyətlə yaxşı bir fikirdir.

Addım 2: Təmizlənmiş RNT-nin kəmiyyət və keyfiyyətini qiymətləndirin

Yuxarıdakı dəstlərdən birini istifadə edərək RNA təmizlənməsinin son addımından sonra, keyfiyyət testi üçün kiçik bir hissə (5-10ul) RNT götürün. Bu hissəni yeni bir RNAse pulsuz boruya köçürün və nümunənin qalan hissəsini -80C -də saxlayın. Bir nanodrop maşın və ya ekvivalenti ilə təmizlənmiş RNT konsentrasiyasını (ng/ul) təyin edin. Maşını RNA təmizləmə prosedurunun son mərhələsində RNT-ni elut etmək üçün istifadə etdiyiniz eyni məhlulla (ümumiyyətlə RNTsiz su) boşaltmalı olacaqsınız. Ümumiyyətlə, sizi əsasən nanodrop maşınının konsentrasiyası maraqlandıracaq, lakin bəzi digər dəyərlər sizə faydalı ola biləcək zülal və ya həlledicilərlə çirklənmə haqqında bəzi məlumatlar verə bilər. Məsələn, ən az 2.0 olan 260nm-to 280nm nisbətində zülal və həlledicilərdən nisbətən azad olduğu düşünülür. Eynilə, 260nm-230nm nisbəti ümumiyyətlə 2.0 ilə 2.2 arasındadır və daha aşağı dəyərlər karbohidratların və ya həlledicilərin mövcudluğunu göstərə bilər.

Keyfiyyətin yoxlanılması üçün siz ya RNT geli işlədə, ya da deqradasiyanın (və ya RNTaz ilə çirklənməsinin) olub olmadığını müəyyən etmək üçün 28S və 18S RNT arasındakı nisbəti kəmiyyətcə hesablamaq üçün Agilent Bioanalizator və ya ekvivalent maşından istifadə edə bilərsiniz.

Şəkil əldə etmə proqramınız bant intensivliyinin hesablanmasına imkan verməsə belə, ImageJ proqramından istifadə edərək olduqca yaxşı 28S: 18S dəyərlər yarada bilərsiniz. Bunu etmək üçün ImageJ ilə şəkil faylınızı açın, boş/qara bir sahəyə düzbucaqlı bir qutu çəkin və Analiz et-Ölçün. Bu, 28S və 18S dəyərlərindən çıxardacağınız əsas dəyərdir. Sonra qutunu 28S diapazonuna sürükləyin, Analyze-Measure düyməsini basın və sonra 18S diapazonu üçün təkrarlayın (Şəkil 2).

Nisbi 28S və 18S miqdarlarını və tənəzzülünü göstərən bir histogram yaratmaq üçün ImageJ Analiz-Plot Profil funksiyasından da istifadə edə bilərsiniz (Şəkil 3).

Agilent Bioanalyzer istifadə edirsinizsə, siz həm 28S:18S nisbətinə, həm də onların RNT Bütövlük Nömrəsinə (RIN) etibar edəcəksiniz. Bu sənəddə hər iki tədbiri təsvir edirlər:

Agilent Bioanalyzer, RNT -nin keyfiyyətini qiymətləndirmək üçün mikro axıcı bir yanaşma tətbiq edir, lakin bu prinsip yuxarıda təsvir edilənə bənzəyir. Şəkil 4 bəzi nümunə nəticələrini göstərir.

Bir çox tətbiq üçün yalnız 28S: 18S & gt1.5 və RIN & gt8.0 ilə RNA istifadə etmək daha yaxşıdır.

Addım 3: Birinci Strand Sintezi (cDNA istehsalı)

-80C -də saxladığınız RNT -dən başlayaraq (Adım 2), seçdiyiniz cDNA sintez dəstindəki protokolu izləyin. Bu dəstlər ümumiyyətlə 1ng -dən 5ug -a qədər RNT tələb edir. Addım 2 -də əldə etdiyiniz nanodrop konsentrasiyalarına müraciət edin və bütün nümunələriniz üçün bərabər miqdarda RNT -də Birinci Strand Sintezi aparın. Həcmləri RNTsiz su ilə bərabərləşdirməlisiniz.

Seçdiyiniz dəstlə əlaqəli protokolu tamamladıqdan sonra cDNA-nı kommersiya dəsti ilə təmizləmək tövsiyə olunur (məs. Qiagenin Qiaquick PCR təmizləməsi və ya MACHEREY-NAGEL-in NucleoSpin Gel və PCR Təmizləməsi) qalıq oliqomerləri və tərs transkriptazı çıxarmaq üçün. CDNA nümunələrinizi RNTsiz suda ən az 1: 5 nisbətində seyreltin, hər birindən kiçik bir hissə (10ul -20ul) alın və qalan cDNA nümunələrini ehtiyacınız olana qədər -20C və ya -80C -də saxlayın.

Addım 4: qPCR Primerləriniz sınaqdan keçirilir

İstər kommersiya məqsədli astar alsanız, istərsə də protokolumuzdan istifadə edərək öz qPCR Astarlarınızı hazırlayın, nümunələri, SYBR Green Master Mix və qPCR maşınınızı istifadə edərək, bir tək təkmilləşdirdiyinizə əmin olmaq üçün primerləri sınamaq vacibdir. amplikon və onun ölçməyə çalışdığınız mRNT üçün uyğun ardıcıllıq olduğunu.

*Həmişə qPCR master qarışığının istifadə edəcəyiniz qPCR maşını ilə uyğun olduğunu təsdiq edin

qPCR primerlərinin ilkin sınağı üçün qPCR lövhəsinin hazırlanması proseduru

1) Yuxarıdakı 3-cü Addımın sonunda götürdüyünüz 10-20ul kiçik alikotlardan başlayaraq, bu qPCR Primer testi məqsədi üçün bütün cDNA nümunələrinizin vahid hovuzunu yaradın. Bu hovuzdan Ct dəyərlərinizin ölçülə bilən diapazonda olduğunu görmək üçün bir seyreltmə seriyası hazırlayın (1: 5). Aşağıdakı konsentrasiyalara sahib olmaq kifayətdir:

2) Primer cütü (İrəli və Geri) ehtiyat məhlulu 10uM konsentrasiyada olmalıdır.

3) SYBR Green Master Mix (2X) və astarların (0.4uM) əsas qarışığını hazırlayın.

4) QPCR boşqabının hər quyusuna qısaca qarışdırın və 10ul pipetka ilə çəkin. Baloncukların qarşısını almaq üçün, qarışığı toplamadan əvvəl pipetteman pistonunu çıxartma mövqeyinə itələyin. Pipet ucunda artıq 10ul -dan çox olacaq, ancaq birbaşa quyunun dibinə atılarkən ilk müqavimət nöqtəsində dayansanız 10ul (və baloncuklar yoxdur) çıxaracaq. İstifadə edəcəyiniz bütün quyulara 10ul əlavə edin.

5) Hər bir quyu üçün ayrıca bir pipet ucu istifadə edin və 10ul nümunəni (su ilə düzgün şəkildə seyreltilmiş) birbaşa SYBR Green Master Mix tərkibli astarlara əlavə edin. Pipet edərək bir və ya iki dəfə qarışdırın. Bu addım üçün pipettemanın çıxarma funksiyasından istifadə etməyin. Həmişə mənfi nəzarət (master qarışığı, astarlar və su) işlədin ki, astar dimerlərinin varlığını, ərimə temperaturunu və s.

6) Plitəni möhürləyin qPCR optik möhürləri və qPCR maşınınızda qPCR-ni işə salın. Maşınınızın proqramı sizi seçim etməyə məcbur edirsə, SYBR Green reagentlərindən istifadə etdiyinizi (Taqman deyil), uzun protokolu (Fast protokolu deyil) istədiyinizi, delta-delta Ct metodundan istifadə etdiyinizi və ərimə əyrisinin təyinini daxil etmək istədiyiniz. Bir referans geni və bir nümunə seçmək məcburiyyətindəsinizsə, qPCR primerlərinizi sınadığınız üçün hər hansı birini seçin.

QPCR Run -dan sonra nəticələri qiymətləndirmək üçün proqramdan istifadə edin, ancaq boşqabı 4C -də saxlayın 5 -ci addım üçün.

Ərinmə əyriləri (test spesifikliyi)

QPCR maşınının proqram təminatından istifadə edərək, sınaqdan keçirilmiş hər bir astar cütü üçün ərimə əyrilərinə baxın, vahid bir temperatur zirvəsi olub olmadığını yoxlayın. Şəkil 5 yaxşı və pis ərimə əyrilərinin bəzi nümunələrini göstərir.

Gücləndirmə sahələri (xətti aralığın tapılması)

Sonra, qPCR maşınının proqram təminatından istifadə edərək, mənfi nəzarət ilə birlikdə yuxarıda hazırlanmış 1:1, 1:5, 1:25, 1:125 qatılmalarının hər biri üçün gücləndirmə əyrilərinə baxın. Ct-də hər 1 vahid dəyişikliyi başlanğıc materialda 2 qat fərqi əks etdirməlidir, buna görə də daha çox seyreltilmiş nümunələrlə daha yüksək Ct dəyərlərinə doğru bir dəyişikliyi görməlisiniz. Burada baxmaq lazım olan şey əyrinin formasıdır. Həddindən artıq konsentrasiya olunmuş nümunələrdə S-şəkilli gücləndirmə əyrisi ola bilər, çox seyreltilmiş nümunələrdə isə heç əyrilik olmaya və ya çox yüksək Ct dəyərlərinə malik ola bilər (Şəkil 6).

Bu analizin nəticələrinə əsaslanaraq, C-ni görmək üçün bu primer cütü istifadə etməzdən əvvəl cDNA-nızı hansı dərəcədə (1: 1, 1: 5, 1:25 və ya 1: 125) seyreltməli olduğunuzu biləcəksiniz. 7 -ci addımı yerinə yetirərkən əyri formalı.

Addım 5: Məhsulun Sanger Sıralaması və Standart Eğrinin Yaradılması

İndi 4C -də saxladığınız tamamlanmış/möhürlənmiş qPCR lövhəsindən başlayaraq DNT -ni ticari olaraq satılan bir dəstlə təmizləyin (məs. Qiagen Qiaquick PCR təmizləmə və ya MACHEREY-NAGEL NucleoSpin Gel və PCR Təmizləmə). Bir nanodrop maşın və ya ekvivalenti ilə təmizlənmiş DNT -nin konsentrasiyasını (ng/ul) təyin edin. DNT təmizləmə prosedurunun son mərhələsində DNT-ni təmizləmək üçün istifadə etdiyiniz eyni məhlulla (ümumiyyətlə DNTazsız su) maşını boşaltmalı olacaqsınız.Standart əyrinizi yaradarkən istifadə etdiyiniz PCR məhsulunun əsl bolluğunu (ng) bilmək üçün çox əhəmiyyətli olacaq bu konsentrasiyanı qeyd edin. Təmizlənmiş PCR məhsulunun kiçik bir hissəsini və ya irəli və ya tərs astarını nümunə və astar konsentrasiyası ilə bağlı göstərişlərini diqqətlə yerinə yetirərək Sanger sekanslaşdırmasını həyata keçirən bir şirkətə göndərin. Xərclər ümumiyyətlə 5 EUR / ardıcıldır. Sizə göndərdikləri zaman nəticələr gücləndirilmiş məhsulun həqiqətən maraq doğuran gen olduğunu təsdiqləyir. Siz həmçinin proqnozlaşdırılan molekulyar çəkidə tək bir zolaq olduğuna əmin olmaq üçün EtBr ilə boyanmış agaroz DNT gelində təmizlənmiş məhsula baxa bilərsiniz, lakin ardıcıllıq ümumiyyətlə kifayətdir.

Standart əyri yaratmaq üçün ardıcıllaşdırılmış PCR məhsulunu 1:100-dən yuxarı 1X TE buferində, pH 7,5 olan 10 ug/ml Kəsilmiş Somon Sperma DNT ilə seyreltin. Məsələn, təmizlənmiş PCR məhsulunun 10ulunu 990ul tamponuna əlavə edin. Sonra standartları hazırlamaq üçün eyni tamponda 1:10 seyreltmə seriyası həyata keçirin: 1:10 3, 1:10 4, 1:10 5, 1:10 6 və 1:10 7. Hər standartdan ən az 500ul etmək və gələcəkdə istifadə etmək üçün -20C və ya -80C -də saxlamaq məsləhətdir.

*Qeyd: Bu gücləndirilmiş PCR məhsulları ilə işləyərkən çox güman ki, pipetmanınızı çirkləndirəcəksiniz. Filtr ipuçlarından istifadə edin və bu addım üçün qonşunuzdan pipetman götürməyi düşünün.

Addım 6: qPCR-nin effektivliyinin qiymətləndirilməsi

Standart əyrisinizi yaratdığınıza görə, qPCR maşınınızdan istifadə edərək bu nümunələri sınaya bilərsiniz. Adım 4 -də olduğu kimi eyni proseduru istifadə edərək standartlarınızda qPCR edin, hər biri üç dəfə. Maşınınız 5-ci addımda nanodrop nəticələrinə əsasən bilməli olduğunuz hər bir standartın həqiqi kəmiyyətlərini (ng) daxil etməyə imkan verə bilər.

Yaxşı standart əyri Şəkil 7-də göstərilmişdir.

Standartlarınızı qiymətləndirərkən (1:10 3, 1:10 4, 1:10 5, 1:10 6 və 1:10 7), bəzilərinin çox incə olduqları üçün digərləri ilə uyğun olmadığını görə bilərsiniz. və ya çox konsentrasiyalı. Bunları analizdən silə bilərsiniz, analiziniz üçün ən yaxşı 3 və ya 4 standartı tapın. Ümumiyyətlə, standartlar Şəkil 6-da təsvir olunan S şəkilli əyri fenomenindən əziyyət çəkmir və xətti bir sıra hətta 10 ətrafında Ct dəyərlərinə qədər uzana bilər (Şəkil 7). Bu kənarları atdıqdan sonra standart əyriniz hələ də qəbul edilə bilməz bir R 2 dəyərinə sahibdirsə, çox güman ki, növbəti seyreltməyə keçməzdən əvvəl hər bir seyreltməni yaxşı qarışdırmaq üçün daha çox qayğı göstərərək standart əyrini yenidən düzəltməlisiniz. 100% -dən çox olan bir məhsuldarlıq daha əhəmiyyətli problemlərə işarə edə bilər və yeni bir astar cütü hazırlamağınızı tələb edə bilər.

Addım 7: Nümunələrinizdə qPCR yerinə yetirmək

Addım 3 -ün sonundan bəri dondurulmuş saxladığınız cDNA nümunələrində qPCR aparmağa hazırsınız.

Nümunələrinizdə qPCR üçün qPCR boşqabının hazırlanması qaydası

1) Yuxarıdakı 3-cü addımın sonunda dondurduğunuz 1:5 nisbətində seyreltilmiş cDNA-dan başlayaraq, 4-cü addımda əldə etdiyiniz nəticələrə uyğun olaraq bütün nümunələri müvafiq şəkildə (1:1, 1:5, 1:25 və ya 1:125) seyreltin. Qalan cDNA-nızın hamısını bu seyreltmə üçün əvvəlcədən sulandıra bilərsiniz, lakin bəzi primer cütlərinin digərlərindən əhəmiyyətli dərəcədə fərqli gücləndirmə əyriləri verəcəyini bilməlisiniz. Çox zəngin bir transkriptlə işləyirsinizsə (məsələn GAPDH), məsələn, cDNA-nı çox sulandıra bilərsiniz ki, daha az bol olan transkriptləri aşkar edə bilməyəcəksiniz.

2) Primer cütü (İrəli və Geri) ehtiyat məhlulu 10uM konsentrasiyada olmalıdır.

3) SYBR Green Master Mix (2X) və astarların (0.4uM) əsas qarışığını hazırlayın.

4) QPCR boşqabının hər quyusuna qısaca qarışdırın və 10ul pipetka ilə çəkin. Baloncukların qarşısını almaq üçün, qarışığı toplamadan əvvəl pipetteman pistonunu çıxartma mövqeyinə itələyin. Pipet ucunda artıq 10ul -dan çox olacaq, ancaq birbaşa quyunun dibinə atılarkən ilk müqavimət nöqtəsində dayansanız 10ul (və baloncuklar yoxdur) çıxaracaq. İstifadə edəcəyiniz bütün quyulara 10ul əlavə edin.

5) Hər bir quyu üçün ayrıca bir pipet ucu istifadə edin və 10ul nümunəni (su ilə düzgün şəkildə seyreltilmiş) birbaşa SYBR Green Master Mix tərkibli astarlara əlavə edin. Pipet edərək bir və ya iki dəfə qarışdırın. Bu addım üçün pipettemanın çıxarma funksiyasından istifadə etməyin. Nümunələr ən azı üç nüsxədə təhlil edilməlidir. Həmişə mənfi nəzarət (master qarışığı, astarlar və su) işlədin ki, astar dimerlərinin varlığını, ərimə temperaturunu və s. Eyni lövhədə standart əyrinizi iki və ya üç nüsxədə yükləyin.

6) Plitəni möhürləyin qPCR optik möhürləri və qPCR maşınınızda qPCR-ni işə salın. Maşınınızın proqramı sizi seçim etməyə məcbur edirsə, SYBR Green reaktivlərindən istifadə etdiyinizi (Taqman deyil), uzun protokolu (Fast protokolu deyil) istədiyinizi, standart əyrilik metodundan istifadə etdiyinizi və ərimə əyrisinin təyinini daxil etmək istəyirəm.

QPCR maşını daha sonra mənalı kəmiyyət PCR nəticələri verəcək və hər bir nümunədə transkriptinizin əsl miqdarını (ng) sizə xəbər verəcəkdir. Testin ardıcıllığından, spesifikliyindən və xəttiliyindən əmin olacaqsınız.

Qanuni qeydlər:

StepOnePlus Applied Biosystems şirkətinin qeydə alınmış ticarət nişanıdır. NanoDrop, şirkətinin qeydiyyatdan keçmiş ticarət nişanıdır NanoDrop Technologies, Inc. TaqMan Roche Molecular Systems, Inc-in ticarət nişanıdır. RNase AWAY Molecular Bio-Products, Inc şirkətinin qeydə alınmış ticarət nişanıdır. Qiaquick QIAGEN Qrupunun qeydə alınmış ticarət nişanıdır. NucleoSpin & reg MACHEREY-NAGEL-in qeydə alınmış ticarət nişanıdır. SYBR Molecular Probes, Inc şirkətinin qeydə alınmış ticarət nişanıdır. Digər tərəflərin ticarət nişanları onların müvafiq sahiblərinin mülkiyyətidir və belə davranılmalıdır.

Bu protokolu bəyəndinizmi? Həyat Elmləri Şəbəkəsinə üzv olun.
Artıq Life Science Network, LinkedIn və ya Google hesabınız varsa:


CFX Maestro Proqram Xüsusiyyətləri

Bio-Rad-ın real vaxt rejimində PCR aşkarlama sistemlərinin hamısına güclü, istifadəsi asan CFX Maestro Proqramı daxildir. Dörd sistem üçün bir proqramla, hər hansı bir alətdən faylları asanlıqla aça və oxuya, digər tədqiqatçılarla əməkdaşlıq edə və yeni proqramdan istifadə etməyi öyrənmədən başqa bir sistemə keçə bilərsiniz.

Digər real vaxt PCR proqramları kimi, CFX Maestro proqramı da kəmiyyət, ərimə əyrisi, gen ifadəsi, allel ayrı-seçkiliyi və son nöqtə analizləri daxil olmaqla bir neçə analiz modulu təklif edir. CFX Maestro proqramında gen ifadəsi təcrübəsini necə təhlil etmək nümunəsi aşağıda göstərilmişdir.

Plitəni düzəldin &mdash naməlumun mövqeyini, şablon nəzarəti (NTC) və boşqabda standart əyri nümunələri göstərir (Şəkil 1). Bu, qaçışdan əvvəl, qaçış zamanı və ya sonra edilə bilər.

Şəkil 1. Plaka Redaktoru pəncərəsində boşqab qurulması.

Məlumatları təhlil edin & mdash bir məlumat faylı, gen ifadəsi modulu ilə işlədikdən sonra avtomatik olaraq yaradılır. Fərdi Məlumat Görünüşü nişanı ilə gücləndirmə qrafiki, standart əyri, gen ifadə diaqramı, boşqab düzümü və ya ərimə zirvəsi kimi altıya qədər müxtəlif diaqram və ya cədvələ asanlıqla baxın (Şəkil 2). Standart əyrinin səmərəliliyini və R 2-ni yoxlayın. Səmərəlilik 90&ndash110%, R 2 isə >0,990 olmalıdır. Bu dəyərlər diapazonda deyilsə, sınağınızın problemlərini həll etməlisiniz.

Şəkil 2. Xüsusi Məlumat Görünüşü pəncərəsi.

Nəticələri nəşr üçün ixrac edin &mdash Pəncərədə sağ klikləyərək Şəkli Saxla (Şəkil 3) və ya Excelə İxrac et (Şəkil 4) seçimi ilə istənilən diaqram və ya cədvəli sürətlə ixrac edin. Qbase+ proqramına sürətli idxal üçün hesabatlar və ya real vaxt PCR məlumat işarələmə dili (RDML) faylları da yarada bilərsiniz.

Şəkil 3. Məlumat təhlili pəncərəsində Şəkli Kimi Saxla seçin.

Şəkil 4. Məlumatların təhlili pəncərəsində Export to Excel seçin.


Cy0 - Yeni qPCR kəmiyyət metodu

Fon: Real zamanlı PCR son zamanlarda mütləq və nisbi nuklein turşusu kəmiyyətinin ölçülməsi üçün seçim üsulu halına gəldi. Real zamanlı PCR-də qızıl standart kəmiyyət ölçmə metodu müqayisə edilən nümunələrin oxşar PCR səmərəliliyinə malik olduğunu güman edir. Bununla belə, bioloji nümunələrdə mövcud olan bir çox amillər PCR kinetik, çaşdırıcı kəmiyyət analizinə təsir göstərir. Bu işdə, kənar nümunələri aşkar etmək üçün SOD adlı yeni bir strategiya təklif edirik.
Nəticələr: Richards funksiyası gücləndirmə əyrilərini parametrləşdirmək üçün flüoresan oxunuşlara quraşdırılmışdır. Hesablanmış gücləndirmə parametrləri (yayla, yamac və əyilmə nöqtəsinin y-koordinatı) və giriş DNT jurnalı arasında əhəmiyyətli korrelyasiya yox idi, bu yanaşmanın hər gücləndirmə əyrisi üçün "barmaq izi" əldə etmək üçün istifadə oluna biləcəyini nümayiş etdirir. Həddindən artıq göstəriciləri müəyyən etmək üçün hər bir naməlum nümunənin hesablanmış parametrləri standart nümunələrin parametrləri ilə müqayisə edilmişdir. Tannik turşusu, IgG və ya quercitin kimi bioloji inhibitorların mövcudluğuna görə başlanğıc DNT molekullarının əhəmiyyətli dərəcədə aşağı qiymətləndirilməsi aşkar edildikdə, SOD bu gücləndirmə profillərini səmərəli şəkildə kənar göstəricilər kimi qeyd etdi. SOD sonradan PCR səmərəliliyinin qiymətləndirilməsinə əsaslanan mövcud yanaşma olan KOD ilə müqayisə edildi. Əldə edilən məlumatlar SOD -un KOD -dan daha həssas olduğunu, SOD və KOD -un eyni dərəcədə spesifik olduğunu göstərdi.

Nəticə: Nəticələrimiz göstərdi ki, ilk dəfə, bu kənar aşkarlama, PCR səmərəliliyi əvəzinə gücləndirmə formasına əsaslana bilər. SOD real vaxtda PCR analizində təkmilləşməni təmsil edir, çünki o, məlumatların müxtəlifliyini azaldır və bununla da kəmiyyətin etibarlılığını artırır.

-->

Salam, siz 102954 qonaq, təşəkkürlər.

Dan bizi ziyarət edir.

Son klik.

Son bir neçə ildə real vaxt rejimində kəmiyyət polimeraza zəncirvari reaksiyası (real vaxtda PCR) sürətinə, dəqiqliyinə və həssaslığına görə gen ifadəsinin mütləq və ya nisbi ölçülməsi üçün seçim üsuluna çevrilmişdir[1-3].
Bundan əlavə, çox sayda xərçəng növünün insan genomu, mRNA və miRNA ifadəsinin profillənməsi, xəstəliklə əlaqəli polimorfizmin identifikasiyası və insan patogenləri üçün genomik ardıcıllıq məlumatlarının genişlənməsindəki son irəliləyişlər molekulyar diaqnostikada nəzərəçarpacaq dərəcədə artıma səbəb olmuşdur [4-6 ].
Real vaxtda PCR-də qızıl standart kəmiyyət metodu (Ct metodu) müqayisə edilən nümunələrin oxşar PCR effektivliyinə malik olduğunu güman edir. Bununla birlikdə, real vaxtda PCR ilə ölçmə, nümunələr arasındakı PCR səmərəliliyindəki kiçik fərqlərə çox həssasdır. Həqiqətən də, PCR effektivliyində 5%-lik kiçik fərq 25 eksponensial gücləndirmə dövründən sonra DNT-nin miqdarında üç qat fərqlə nəticələnəcək. Nümunələrdə mövcud olan bir çox amillər, eləcə də birgə çıxarılan çirkləndiricilər PCR-ni maneə törədə bilər, şablon gücləndirilməsi və təhlilini qarışdıra bilər [7-10]. Bu, bioloji nümunələrlə işləyərkən əsas problemdir. Şiddətli inhibə yalan-mənfi nəticələrə gətirib çıxaracaq, cüzi və ya orta dərəcədə inhibə təsirə məruz qalmış nümunənin DNT konsentrasiyasının düzgün qiymətləndirilməməsi ilə nəticələnə bilər [11]. Bundan əlavə, gücləndirmə səmərəliliyi qeyri-optimal analiz dizaynı, ferment qeyri-sabitliyi və ya inhibitorların mövcudluğundan asılı olaraq dəyişə bilər [12]. Şablon DNT-nin kəmiyyətini müəyyən etmək üçün müxtəlif üsulların işlənib hazırlanmasına baxmayaraq [11, 13-17], çox az bir şey maraq hədəfi ilə birlikdə gücləndirilmiş daxili müsbət nəzarət əlavə edilmədən şablonun kəmiyyət və keyfiyyətinin eyni vaxtda qiymətləndirilməsinə imkan verir. Beləliklə, Bar və əməkdaşları qeyri-optimal analiz şərtlərinin erkən aşkarlanması üçün gücləndirmə səmərəliliyinin hesablanmasına əsaslanan bir üsul (KOD adlanır) təklif etdilər [18, 19]. Bu yanaşma son dərəcə sadə və təsirli olsa da, elmi ictimaiyyət tərəfindən tam olaraq qəbul edilməmiş bir metodun olmadığı bir PCR gücləndirmə səmərəliliyinin hesablanmasına əsaslanır. Çox sayda tədqiqat, PCR -in mahiyyət etibarilə eksponensial olduğunu nəzərə alaraq gücləndirmə səmərəliliyini hesablamağa çalışdı. Log-xəttilik regionu fərziyyəsinə əsasən, həmin pəncərədə xətti reqressiyanın mailliyindən sabit gücləndirmə səmərəliliyi hesablanır [20, 23]. Alternativ bir yanaşma, PCR traektoriyasının sigmoid funksiyası ilə effektiv şəkildə modelləşdirilə biləcəyinə dair müşahidəyə əsaslanır [14, 24] ki, xətti olmayan reqressiya uyğunluğu [15, 25, 26] istifadə edərək PCR səmərəliliyinin qiymətləndirilməsinə imkan verir. Son zamanlarda "səmərəliliyin xətti reqressiyası" adlanan sadələşdirilmiş bir yanaşma, amplifikasiya profilinin mərkəzi bölgəsindəki floresans oxunuşlarına xətti reqressiya təhlili tətbiq etməklə amplifikasiya səmərəliliyini qiymətləndirməyə imkan verdi [27]. Xüsusilə, PCR səmərəliliyinin qiymətləndirilməsinin qəbul edilən yanaşmaya görə çox fərqli olduğu sübut edilmişdir [28].
Çox yaxınlarda Tichopad et al. [29] bu prosedurda kəmiyyət PCR üçün yeni bir keyfiyyət yoxlama testi təqdim etdi, birinci törəmə maksimumu və ikinci törəmə maksimumu, PCR traektoriyasında bir lojistik uyğunluq istifadə edərək təxmin edildi. Bu yanaşma onlara iki parametrdən istifadə edərək əyrinin birinci yarısını izləməyə imkan verdi. Tədqiqatımız, standart nümunələrə bənzər bir amplifikasiya kinetiği olmayan nümunələri aşkar etmək üçün gücləndirmə səmərəliliyinin qiymətləndirilməsinə əsaslanmayan bir keyfiyyət test vasitəsi hazırlamağı hədəfləyir. Bu işdə, böyük bir nümunə dəstindən PCR gücləndirmə profillərini parametrləşdirmək üçün Richards tənliyinin qeyri-xətti uyğunluğundan istifadə edilmişdir. Təxmini parametrlərin dəyişkənliyinin sonrakı hesablanması və Mahalanobis məsafəsinə əsaslanan bir statistik tədbirin hazırlanması SOD metodunu inkişaf etdirməyə imkan verdi (Shape əsaslı kinetik Oistifadəçi Dtərbiyə). İnhibe edilmiş gücləndiricilərin SOD analizi və bu metodun KOD ilə müqayisəsi ətraflı araşdırılmışdır.

Kəmiyyət Real-time PCR

DNT standartı əlavə olaraq mitoxondrial genin NADH dehidrogenaz 1 (MT-ND1) 104 bp fraqmentini ehtiva edən pGEM-T (Promega) plazmidindən ibarət idi. Bu DNA fraqmenti ND1/ND2 astar cütü (irəli ND1: 5'-ACGCCATAAACTCTTCACCAAAG- 3 'və tərs ND2: 5'-TAGTAGAAGAGCGATGGTGAGAGCTA- 3') tərəfindən istehsal edilmişdir. Bu plazmid istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq Plasmid Midi Kit (Qiagen) istifadə edərək təmizlənmişdir. Standart plazmidin son konsentrasiyası üç replika A ortalaması ilə spektofotometrik olaraq qiymətləndirildi260 absorbans təyini.
Real vaxtda PCR gücləndirilməsi istifadə edildi LightCycler ® 480 SYBR Green I Master (Roche) istehsalçının göstərişlərinə əsasən, 500 nM astarlı və 20 µl son reaksiya həcmində dəyişkən miqdarda DNT standartı ilə. Termosikl a LightCycler və#174 480 (Roche) 95ºC-də 10 dəqiqəlik inkubasiya ilə başladıldı, ardınca 40 dövr (5 saniyə üçün 95º176C, 5 saniyə üçün 60ºC, 20 saniyə üçün 72º176C) hər dövrün sonunda bir flüoresan göstərici götürüldü .
Hər bir reaksiya birləşməsi, yəni başlanğıc DNT və amplifikasiya qarışığı faizi üç dəfə aparılır və dörd ayrı gücləndirmə işində təkrarlanır. Bütün qaçışlar, amplifikasiyanın spesifikliyini və primer dimerlərin olmamasını təsdiqləmək üçün ərimə əyrisi təhlili ilə tamamlandı. Ct (uyğun nöqtə metodu) və Cp (ikinci törəmə üsul) qiymətləri ilə müəyyən edilmişdir LightCycler ® 480 proqram versiyası 1.2 və arxa plan çıxarıldıqdan sonra analiz üçün MS Excel məlumat vərəqinə (Microsoft) ixrac olunur (Əlavə fayl 1 olaraq mövcuddur). üçün Ct (uyğun nöqtə metodu) qiymətləndirməsi bütün qaçışlar üçün əl ilə 0,4-ə təyin edilmiş flüoresan həddi istifadə edilmişdir.

PCR səmərəliliyinin qiymətləndirilməsi

Ham PCR məlumatları gücləndirmə səmərəliliyini hesablamaq üçün istifadə edilmişdir. Hər bir fərdi nümunə üçün PCR səmərəliliyi xətti pəncərədəki reqressiya xəttinin yamacından əldə edilmişdir [20]. Başlanğıc düzəliş və xətti eyniləşdirmə pəncərəsi LinRegPCR -in son buraxılışından istifadə edilərək həyata keçirilmişdir [23]. PCR səmərəliliyi dörd nümunə dəstindən qiymətləndirildi: standart amplifikasiya əyriləri, tannik turşusu oxunuşlarının standart amplifikasiya əyriləri, IgG oxunuşlarının standart amplifikasiya əyriləri və quercitin oxunuşlarının standart amplifikasiya əyriləri. Bütün orta məlumat dəstlərindən hesablanmış xəttilik pəncərəsi kəmiyyət təhlili üçün seçilmiş 0,4 flüoresan həddini əhatə etmişdir.

KOD -un riyazi modeli

Effektivliyə əsaslanan KOD-un riyazi modeli Bar və digərləri tərəfindən təklif edilmişdir. [18]. Qısacası, bu nümunənin PCR səmərəliliyini müqayisə edərək edildi (xeff) standart əyri nümunələrinin səmərəliliyi ilə. Test nümunəsi, əgər |z| & gt 1.96 ilə > - mu_>> < sigma _ < vurğu> > > , harada & mikroeff səmərəlilik deməkdir və σeff standart əyri nümunələrinin səmərəliliyinin standart sapmasıdır. Alternativ olaraq nəzərə alınmalıdır ki, statistik < left ( frac ight )^2 > is distributed as a c ² with one degree of freedom if c ² > 3.84, we can reject the null hypothesis at a = 0.05. c IE7 Mozilla c ²Chrome c -->

SOD -un riyazi modeli

Formaya əsaslanan kinetik kənar fərqləndirmə (SOD) gücləndirmə əyrilərinin formalarına əsaslanır. Flüoresan xammal məlumatlarını uyğunlaşdırmaq üçün logistik böyümə əyrisinin uzantısı olan 5 parametrli Richards funksiyasının qeyri-xətti reqressiya uyğunluğundan istifadə edilmişdir [11, 25]:

Bərabərlik 1
harada x dövr nömrəsidir, Fx dövrədə reaksiya verən floresansdır x, Fmaksimum maksimum reaksiya floresansdır, Fb fon reaksiyası flüoresandır və b, cd təxmin edilən əmsalları təmsil edir. 5 parametrli Richards funksiyaları üçün qeyri-xətti reqressiyalar yerinə yetirildi və parametrlərdən istifadə edərək parametrlərin ölçülməmiş ən kiçik kvadratlarının təxminləri təyin edildi. Levenberq-Marquardt üsul
İstifadə olunan forma parametrləri amplifikasiya əyrisinin plato dəyəri idi (Fmaksimum), əyilmə nöqtəsində tangens düz xəttin yamacı (m) və əyilmə nöqtəsinin y koordinatı (Yf) (Əlavə fayl 2).
Qıvrım nöqtəsinin y koordinatı (Yf) aşağıdakı kimi hesablanmışdır:
eq. 2
və teğet düz xətt yamacı (m) kimi qiymətləndirildi:
eq. 3
Normal paylanması Fmaksimum, Yfm standart nümunələrdən alınan parametrlər vasitəsilə yoxlanılır Kolmoqorov-Smirnov normallıq üçün test bu parametrlər və giriş DNT konsentrasiyaları arasında korrelyasiya əhəmiyyəti kimi ifadə edilir Qeyd (DNT) ilə sınaqdan keçirilmişdir t aşağıdakı kimi test edin:
eq. 4
harada r Pirson əmsalı və n nümunə ölçüsü (n = 72). Qəbul edilmiş istinad dəstinin çox dəyişkən normallığı Rencher AC [30] (Əlavə fayl 3) üzrə qiymətləndirilmişdir. Bundan əlavə, asimmetriya (Asim) gücləndirmə əyriləri aşağıdakı kimi qiymətləndirildi:
eq. 5
əvəz edir YfFmaksimum, Eq. 5 aşağıdakı kimi sadələşdirilə bilər:
Bərabərlik 6
Bu tənliyə uyğun olaraq, d = 1 və ya olduqda, əyri simmetrikdir (yəni Asym = 0) 2*Yf = Fmaks. Əksinə, d & gt 1 olduğunda 2*Yf & lt Fmax (əyri asimmetrikdir), buna görə də Asym & gt 0 olur.

Üç fərqli forma parametrini qiymətləndirmək üçün bir üsul hazırladıqdan sonra (Fmaksimum, yfm), növbəti addım gözlənilən dəyərlərdən kənara çıxan test nümunələrini müəyyən etmək üçün bir meyar təyin etmək idi. Bu, hər bir eksperimental gücləndirmə üçün hesablana bilən nümunə vektorundan istifadə etməklə edildi y çoxdəyişənli normal paylanmaya aiddir, orta vektor və Σ uyğun dispersiya-kovarians matrisi, (y - Σ)' Σ -1 (y - Σ) dəyəri (Mahalanobis məsafəsi) 3 dərəcə sərbəstliklə asimptotik c ² paylanmasına malikdir. Mahalanobis məsafəsi dəyişənlər arasındakı korrelyasiyaya əsaslanır, bunun vasitəsilə müxtəlif nümunələri müəyyən etmək və təhlil etmək olar. Naməlum çoxdəyişənli nümunə dəstinin məlum olana oxşarlığını təyin etmək üçün faydalı bir üsuldur. Məlumat toplusunun korrelyasiyasını nəzərə alır və ölçmə miqyasından asılı deyil. Standart əyri nümunələrinin forma parametrlərindən orta vektor və dispersiya-kovarians matrisi hesablanmışdır. Sonra c ² & gt 7.81 olarsa, sıfır hipotezi rədd edə bilərik (a = 0,05 ilə) və amplifikasiya əyrisinin formasının hər üç parametri nəzərə alaraq standart əyri nümunələrinin şəklindən fərqli olduğunu təyin edə bilərik [30]. Bütün işlənmələr və qrafiklər Excel (Microsoft), Statistica 6.0 (Statsoft) və Sosial Elmlər üçün Statistik Paket (SPSS 13.0) proqramlarından istifadə etməklə əldə edilmişdir.

Standart əyri SOD təhlili

SOD modeli etibarlı bir kəmiyyət əldə etmək üçün naməlum nümunələrin amplifikasiya əyrilərinin standart əyrilərdən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənməməsi ehtimalına əsaslanır. Amplifikasiya kinetikinin amplifikasiya əyrisinin şəkli ilə izlənilə biləcəyi fikrini təqdim etdik. Amplifikasiya əyrilərinin forması, floresans oxunuşlarında Richards funksiyasının qeyri -xətti reqressiya quruluşundan istifadə edərək parametrləşdirilmişdir [11].
Bu riyazi prosedur, Richards tənliyinə xas olan beş parametr əldə etməyə imkan verdi. Bu dəyərlər sonradan əyilmə nöqtəsindəki teğetin yamacını hesablamaq üçün istifadə edilmişdir (m), əyilmə nöqtəsinin y koordinatı (yf) və maksimum floresans dəyəri (Fmaksimum) bir oxu. Nəhayət, bu üç parametr bizə hər gücləndirmə əyrisi üçün "barmaq izi" yaratmağa imkan verdi.
Bu fərziyyəyə əsaslanaraq parametrlər m, yfFmaksimum standart əyri yaratmaq üçün istifadə edilən gücləndirmələr bir-birindən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənməməli və giriş DNT ilə əlaqələndirilməməlidir. Bu fərziyyəni yoxlamaq üçün geniş bir daxil olan DNT üzərində standart bir əyri meydana gəldi (3.14x10 7 -3.14x10 2 Şəkil 1 Əlavə fayllar 1).
Cədvəl 1, 72, ortalama, SD və Kolmogorov-Smirnov testini göstərir. Bu nəticələr bunu nümayiş etdirdi m, yfFmaksimum fərqli bir dispersiya göstərsələr də normal olaraq paylanırdılar. Sonradan arasında əlaqə m, yfFmaksimum və başlanğıc DNT şablonunun jurnalı tədqiq edilmişdir. Şəkil 2-də göstərildiyi kimi, giriş DNT-nin Qeydiyyatı ilə bu parametrlər arasında əhəmiyyətli korrelyasiya yox idi (Fmaksimum: R 2 = 0.017 səh = 0.28 yf : R 2 = 0.033 səh = 0.12 m: R 2 = 0.030 səh = 0,14). Əslində təyin əmsalları (R 2) 3,3%-dən az olan parametr dəyişkənliklərinin yalnız çox aşağı bir hissəsini ölçdü.
Gücləndirmə profilini obyektiv olaraq müəyyən etmək üçün Log dəyişənini təqdim etdik (N.ob/Nexp), Ct metodundan istifadə edərək kəmiyyət qiymətləndirməsindəki səhvləri qiymətləndirir. Bu dəyişən Ct metodundan istifadə edərək hesablanmış molekullar (Müşahidə olunan Molekulların Sayı Qeydiyyatı, LogNob kimi istinad edilir) və daxil olan DNT molekulları (Gözlənilən Molekulların Qeydiyyatı, əslində LogNexp kimi istinad edilir. LogNexp = Log(N.ob/Nexp)). Günlük nisbəti (N.ob/Nexp) homosedastiklik fərziyyəsini təmin edən normal paylanma göstərdi (Əlavə fayl 4). Log dəyişənləri üçün 95% etibarlılıq aralığını (CI) təyin etmək mümkündür.N.ob/Nexp). Bu qalıqlar başlanğıc DNT şablonundan asılı olmayaraq, orta sıfıra bərabər və standart sapma sabiti (σ = 0,041) ilə normal paylanma göstərdi. Verilənlər bazamızda, standart əyri qurmaq üçün istifadə olunan 72 qaçışdan 6 -sı Log nisbətini göstərdi (N.ob/Nexp) CI-dən (Əlavə fayl 5). Daha sonra hər bir gücləndirmə əyrisi üçün PCR səmərəliliyi (Eff) də təxmin edildi (Cədvəl 1). ).
KOD və SOD tərəfindən kənar nümunələrin nə qədər yaxşı təsbit edilə biləcəyini müəyyən etmək üçün bu statistik təhlilləri, xüsusən standart əyrinin qaçışlarına tətbiq etdik, KOD -un 3.84 c ² eşik dəyərinin üzərində 2 qaçış, SOD -da 3 qaçış aşkarladığını gördük. CI-dən (Əlavə fayl 5). 95% CI-nin tərifi və özünəməxsus xüsusiyyətlərindən ötəri yəqin ki, bu pozuntular yanlış pozitivlərdir.

Cədvəl 1: Bir Nümunə Kolmoqorov-Smirnov Kalibrləmə əyrisinin testi.

Aşağıdakı parametrlərin vasitələri (standart sapma) və Kolmogorov-Smirnov (K-S) test dəyəri (ehtimal): LineReg səmərəliliyi (Eff), əyilmə nöqtəsinin ordinat dəyəri (yf), əyilmə nöqtəsindəki teğet düz xəttin yamacı (m) və yayla dəyəri (Fmaksimum).

Real vaxt gücləndirilməsinə inhibitor təsiri

Tannik turşusu oksidləşərək kovalent bağlanan quinonlar əmələ gətirir Taq Fəaliyyətini maneə törədən DNT polimeraz [31].
Tannik turşularının artan konsentrasiyalarının (0-0,1 mq/ml) mövcudluğunda 3,5 x 10 4 DNT molekulundan real vaxtda gücləndirmə qrafikləri əldə edilmişdir. Bütün kəmiyyət dəyərləri istifadə edərək əldə edilmişdir Ct üsul Alınan gücləndirmə əyriləri və müvafiq kəmiyyət göstəriciləri inhibənin real vaxt analizinə təsirini nümayiş etdirir (Şəkil 3A və 3B). Tanin turşusu konsentrasiyası artdıqca Ct dəyərlər getdikcə artdı və başlanğıc molekullarının qiymətləndirilməməsinə səbəb oldu. Bu kəmiyyət qiymətləndirmə xətası Log (N.ob/Nexp) müvafiq CI -dən çıxdı (Şəkil 3B). Bastırılmış gücləndirmə LinRegPCR prosedurundan istifadə edərək səmərəliliyin hesablanması ilə nümayiş olundu (Əlavə fayl 5). Müşahidə olunan səhvlər yaylanın, xətti faza uzunluğunun və inhibe edilmiş əyrilərin yamacının tədricən azalmasının nəticəsi idi. Ct dəyərlər (şək. 3A) [19, 32].

SOD və KOD analizləri, səhv kəmiyyət göstəricilərinə səbəb ola biləcək inhibitorların mövcudluğuna görə anormal PCR kinetikasına malik nümunələri müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir. Fmaksimum, myf artan tanin turşusu, IgG və ya quercitin konsentrasiyalarının iştirakı ilə əldə edilən hər bir amplifikasiya əyrisindən hesablanan dəyərlər, müəyyən edilmiş 2 c və#178 qaçışını təxmin etmək üçün istifadə edilmişdir.SOD dəyər. Beləliklə, əgər c ²SOD bir amplifikasiya əyrisindən alınan dəyər, eşik dəyər 7.81 -dən yüksək idi, kəmiyyət müəyyən bir kənar olaraq təyin edildi. PCR səmərəliliyi də təxmin edildi və c ²KOD eyni amplifikasiyalarla təyin olunan dəyərlər. C ² ilə kantifikasiya əyriləriKOD 3.84-dən yuxarı qiymətlər rədd edildi.
Bu səbəbdən, SOD və KOD performansları Gündəlikdə (N.ob/Nexp) nisbəti 95% CI daxilində deyil.
Artan tanin turşusu konsentrasiyalarının varlığında SOD və KOD analizləri ilə əldə edilən nəticələr Şəkil 6A və 6B -də göstərilmişdir. 0,1 - 0,0125 mq/mL arasında dəyişən tannik turşusu konsentrasiyaları əlavə edildikdə, əldə edilən bütün əyrilərdə əhəmiyyətli kəmiyyət səhvləri var idi (Şəkil 6A və 6B tam simvolları Log() nisbətini göstərən nümunələri göstərir.N.ob/Nexp) 95% CI aşağı həddindən aşağı).

Cədvəl 2: KOD və SOD analizinin həssaslığı və spesifikliyi.

Çox maraqlanan bir mövzu, real vaxt PCR analizində anormal amplifikasiya profillərinin aşkarlanması üçün əlsiz vasitələrin hazırlanmasıdır. Real vaxtda PCR sürətlə nuklein turşusunun miqdarının təyin edilməsində ən çox istifadə edilən texnikaya çevrildi. Real vaxtda PCR analizi molekulyar biologiyanın bir çox sahələrində böyük diqqət qazansa da, hələ də əhəmiyyətli texniki problemlər onu narahat edir [34]. Buna görə də, hazırkı tədqiqat PCR səmərəliliyinin qiymətləndirilməsinə deyil, gücləndirmə profilinin formasına əsaslanan yeni kənar aşkarlama yanaşmasının tədqiqinə yönəlmişdir.
PCR-nin gücləndirici təbiəti onu müqayisə edilən nümunələrin effektivliyindəki kiçik fərqlərə qarşı həssas edir [20]. Əslində, real vaxt PCR analizində mövcud "qızıl standart", eşik dövrü metodu (adlanır Ct metod), müqayisə edilən nümunələr arasında oxşar PCR səmərəliliyini tələb edir.
Bununla belə, PCR effektivliyindəki fərqlilik müxtəlif başlanğıc material mənbələrindən, məsələn, müxtəlif növ toxumalardan qaynaqlanır [9]. Bu cür fərqlər inhibitorlar olduqda da tapıla bilər Taq DNA polimerazı cDNA nümunələrində [35] və ya aşağı keyfiyyətli SYBR yaşıl və/və ya dNTP -lərin mövcudluğunda mövcuddur [36, 37]. Bundan əlavə, PCR inhibisyonunun tezliyi [38] və hətta replikatlar arasında müxtəlif inhibitor təsirlər [39] hər bir nümunə üçün kinetik keyfiyyətin qiymətləndirilməsi ehtiyacını vurğulayır. Beləliklə, Bar et al. [18] fərqli effektivliyə malik nümunələri aşkar etmək üçün KOD adlı statistik metod təklif etdi.
KOD, etibarlı bir kəmiyyət əldə etmək üçün PCR işlərinin bir -birindən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənməyən səmərəliliyi göstərməli olduğu əsas fərziyyəsinə əsaslanaraq kənara çıxanlar axtarır. Bu şərt, hər oxunan floresansın log çevrilməsindən sonra xətti pəncərədə hesablanan düz xətti reqressiyanın yamaclarını müqayisə edərək yoxlanılır. Başqa sözlə, xam məlumatlara qayıtsaq, xətti pəncərədəki eksponensial əyrilərin profili müqayisə olunan qaçışlar arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənməməlidir. SOD metodunun inkişafında biz bu konsepsiyanı bütün əyriyə qədər genişləndirdik və təhlilə daxil olan bütün qaçışlar müqayisə edilə bilən gücləndirmə profillərini göstərməlidir.
The Ct metod ardıcıl seyreltilmiş hədəfin təhlilinə əsaslanır. Bu yanaşmanın bir nümunəsi Şəkil 1 -də verilmişdir. Əldə edilən gücləndirmə profillərinin diqqətlə araşdırılması SOD metodunun əsas prinsipini göstərir: bütün amplifikasiya əyriləri formaya bənzəyir və yalnız profil mövqeyi hədəf miqdarı ilə əlaqədardır. Ən çox konsentrasiya edilmiş nümunələrə uyğun gələn ilk gücləndirmə profilləri solda, seyreltmə əmsalı artan nümunələr isə müntəzəm olaraq sağa doğru sürüşür. Bu müşahidə bizi istisna meyarının səmərəliliyə deyil, forma fərqinə əsaslana biləcəyi qənaətinə gətirdi. Bu, bu müəlliflərin amplifikasiya əyrisini səmərəliliyin funksiyası olaraq təsvir etdikləri Rutledge və Stewart [40] əsərləri ilə uzlaşır. Beləliklə, əgər səmərəlilik əyrinin formasını müəyyən edirsə, gücləndirmə profilinin formasına nəzarət etməklə gücləndirmənin effektivliyinə dair məlumat əldə etmək olar.
Birincisi, istifadə edərək hər gücləndirmə əyrisi üçün "barmaq izi" m, yfFmaksimum Richards tənliyinin xam məlumatlara uyğunlaşdırılması nəticəsində əldə edilmişdir. Sonradan bu parametrlər hesablamaq üçün varyans-kovarians matrisini əldə etmək üçün istifadə edilmişdir Mahalanobis məsafəsi [30].
Bu statistik ölçü dəyişənlər arasında korrelyasiyaya əsaslanır, bunun vasitəsilə müxtəlif nümunələri müəyyən etmək və təhlil etmək olar. Xüsusilə, SOD təhlili, Mahalanobis məsafəsindən istifadə edərək naməlum nümunənin standart dəstə bənzərliyini təyin etdi. Bu yanaşma çox faydalı idi, çünki o, bizə təkcə tək parametrlərin fərqini deyil (m, yfFmaksimum), həm də aralarındakı qarşılıqlı ko-variasiyaların miqdarını ölçmək m, yfFmaksimum.
Fmaksimum SOD-un işlənib hazırlanmasında nəzərə alınmışdır, çünki bu parametr uğurlu gücləndirmə nümayiş etdirir və adətən, suboptimal gücləndirmə şəraitində oxunuşlar xarakterik göstəricilərə çatmır. Fmaksimum dəyərlər [9]. Məlumat bazamızı araşdırarkən qeyd olundu ki, Fmaksimum yüksək varyans göstərdi, beləliklə c ² -ə bir qədər təsir edirSOD tək, amma Fmaksimum varyans-kovarians matrisinə əhəmiyyətli təsir göstərmişdir. Parametr m əyilmənin əyilmə nöqtəsindəki yamacını təsvir edir [11]. Modelimizdə dəyəri nə qədər yüksəkdir m, amplifikasiya dərəcəsi nə qədər yüksəkdir. Bununla birlikdə, bu qiymətləndirici, cari və əvvəlki məhsul miqdarı arasındakı nisbət olaraq başa düşülən gücləndirmə səmərəliliyini birbaşa göstərmir [38].
Nəhayət, gücləndirici profillərin asimmetriyası arasındakı əlaqə ilə izlənildi Fmaksimumyf. Mütləq simmetrik PCR əyrilərinin nadir hallarda baş verdiyi nümayiş etdirilmişdir ki, bu da beş parametrli uyğunluğun tətbiqini əsaslandırır [25]. Bundan əlavə, əvvəlki işimizdə [11], amplifikasiya reaksiyasının suboptimal səmərəliliyin mövcudluğunda simmetrik bir sigmoid əyrisindən asimmetrik bir sigmasiyaya (Richards tənliyi ilə yaxşı təsvir edilmiş) keçə biləcəyi göstərilmişdir. Əslində, lojistik modelin uyğunluğunun yaxşılığı tədricən azaldı, PCR əyrisi amplifikasiya formasının dəyişdiyini irəli sürdü [32].
arasında korrelyasiya təhlili m, yfFmaksimum standart əyri və giriş DNT -dən əldə edilən bu forma parametrlərinin konsentrasiyadan asılı olduğunu göstərdi. Bu, bizim eksperimental fərziyyəmizi dəstəkləyir ki, standart əyrinin bütün gücləndirmə əyriləri formaca oxşardır və yalnız profil mövqeyi hədəf kəmiyyəti müəyyən edir. PCR inhibisyonu halında, tannik turşusu və IgG konsentrasiyalarının artmasının azalmasına səbəb olduğu aşkar edilmişdir. Fmaksimumm daha yüksək inhibitor konsentrasiyası ilə asimmetriya artarkən (asimmetriya artdıqda, yf uyğun olandan daha çox azalır Fmaksimum Şəkil 3 və 4). Tannik turşusunun inhibə edilməsi sadəcə floresan söndürmə səbəbindən ola bilər, çünki bizdə dramatik bir azalma tapdıq. Fmaksimum və sürüşmə əyrisi yamacının azalması. Bununla belə, biz həmçinin fluoressensiya asimmetriyasının artdığını göstərərək tannik turşusunun gücləndirici kinetik təhrif yaratdığını nümayiş etdirdik. PCR gücləndiricilərinə quercitin əlavə edilməsi çox maraqlı məlumatlar verdi. Əslində azaldığını gördük Fmaksimumm yüksək inhibitor konsentrasiyası olduqda dəyərlər, lakin bu flavonid əyrilərin asimmetrik dəyişikliyinə səbəb olmadı (Şəkil 5D). Məlumatlar aydın şəkildə nümayiş etdirir ki, SOD metodu müxtəlif inhibə modellərindən yaranan qeyri-optimal PCR kinetikasını müəyyən edə bilir. Bundan əlavə, quercitin iştirakı ilə əldə edilən nəticələr çoxvariantlı yanaşmanın istifadəsinin vacibliyini vurğulayır.
SOD -u KOD performansı ilə müqayisə edərkən SOD -un bütün sınaqdan keçirilmiş parametrlərdə KOD -dan daha həssas olduğu aşkarlandı. SOD və KOD IgG və quercitin varlığında eyni dərəcədə spesifik idi, halbuki SOD tannik turşusunun iştirakı ilə KOD-dan daha spesifik idi.
Əlavə olaraq, SOD metodu, KOD SOD-un tamamilə əlsiz olması ilə müqayisədə bir sıra üstünlüklər təqdim edir. Həqiqətən də, istifadəçinin KOD metodunda olduğu kimi bir analiz pəncərəsi təyin etməsi lazım deyil və daha da əhəmiyyətlisi, SOD onun təyin edilməsi ilə əlaqədar bütün problemlərin qarşısını almaq üçün sabit bir səmərəlilik dəyərinə güvənmir [28, 40, 41]. Daha əvvəl bildirildiyi kimi, dəyişən PCR səmərəliliyinin təyin edilməsi, səhv və yayılmış kəmiyyətlərə kömək edən fərqli nəticələrə səbəb ola bilər [19].
Bundan əlavə, analizdə qərəzdən məsul ola biləcək floresans məlumatlarının log-çevrilməsinin qarşısı alınır.
SOD metodu Sybr Green kimyası üçün işlənib hazırlanmışdır və bu prosedurun TaqMan kimi digər kimyalara tətbiqi geniş şəkildə qiymətləndirilməlidir.
Çox yaxınlarda Tichopad et al. [29] Malahanobis statistikasına əsaslanan yeni KOD proseduru təklif etdi [30]. Bu işdə birinci törəmə maksimumu və ikinci törəmə maksimumu PCR traektoriyasının mərkəzi hissəsindəki bir lojistik qurğu istifadə edərək təxmin edildi. Bu iki parametrdən istifadə edərək, müəlliflər əyrinin yalnız ilk yarısını izləməyi təklif etdilər. Əksinə, SOD metodu Richards tənliyindən istifadə edərək bütün PCR traektoriyasını təsvir etmək imkanına əsaslanır. SOD, real vaxt PCR oxunuşlarına Richards tənliyinin tətbiqinin davamını və uzantısını təmsil edir [11]. Düşünürük ki, SOD metodu Tichopad və digərləri tərəfindən təsvir edilən bu yaxınlarda işlənib hazırlanmış metodda rast gəlinməyən orijinal anlayışları təqdim edir. [29]. SOD parametrlərin birləşməsi vasitəsilə bütün PCR trayektoriyasının formasını təsvir etmək imkanından istifadə edir. m, yfFmaksimum Tichopad et al metodu isə. [29] traektoriyanın iki əsas nöqtəsinə diqqət yetirir: birinci və ikinci törəmənin maksimumu.
Bundan əlavə, SOD metodunda biz tamamilə fərqli bir metrik yanaşmadan istifadə etdik. Oxşar tapşırıqlar üçün (dəstək vektor maşınları, K-vasitəsilə klaster) başqa çoxdəyişənli üsullar mövcud olsa da, biz Mahalanobis məsafəsinin asimptotik paylanmasından istifadə etdik, çünki bu, birdəyişənli normal paylanmaya əsaslanan KOD metodunun məntiqi uzantısıdır.

nümayiş etdirdik, ilk dəfə, amplifikasiya profilinin formalı dəyişikliyinin standart profillərin forması ilə müqayisəsi, sapma nümunələrini istisna etmək üçün istifadə edilə bilər. Ct təhlil. Bu, nəticələrin yayılmasının qarşısını almağa imkan verir və buna görə də kəmiyyət analizi potensialını artırır.
Beləliklə, SOD-u hər hansı bir molekulyar diaqnostika sahəsindəki tətbiqlərlə real vaxtda PCR analizində əldən-ələ keyfiyyətə nəzarət üsulu olaraq təklif edirik.

Əlavə fayl 1 -
Tanen turşusu, IgG və quercitin: floresans məlumatları və standart nümunə gücləndiricilərinin (standart əyri) və amplifikasiyaların uyğun işlənməsi. Əlavə fayl 2 -
Qıvrım nöqtəsinin y dəyəri üçün analitik həllər (Yfvə) teğet düz xəttin yamacı (m) əyilmə nöqtəsini keçmək.
  • A) Kvadrat məsafələrin populyasiya ətrafında xi-kvadrat paylanması orta vektor (D2 = y - Σ)'Σ -1 (y - Σ)) 3 sərbəstlik dərəcəsi ilə.
  • B) Bütün cüt dəyişənlərin səpələnmə sahələri Fmaksimum, Yfm.
Əlavə fayl 2 -
tannik turşusu, IgG və quercitin: amplifikasiyalar (standart əyri) və varlığında əldə edilən gücləndirmələr.

Ct: eşik dövrü IgG: immunoglobulin G SOD: forma əsaslı kinetik kənar hədlərin aşkarlanması KOD: kinetik kənar təsbit Asim: Asimmetriya.

MG və DS, işin dizaynını həyata keçirdi, məlumatların analizində iştirak etdi, SOD metodunu inkişaf etdirdi və əlyazmanın layihəsini hazırladı. MBLR məlumatların toplanması və təhlilində iştirak etdi və əlyazmanı tənqidi şəkildə yenidən nəzərdən keçirdi. PT real vaxtda PCR aparıb. DM məlumatların toplanmasında iştirak etdi. VS tədqiqatın dizaynında iştirak etdi və əlyazmanı tənqidi şəkildə yenidən nəzərdən keçirdi. Bütün müəlliflər son əlyazmanı oxudular və təsdiq etdilər.

1 Dipartimento DiSUAN, Sezione di Biomatematica, Universit degli Studi di Urbino "Carlo Bo", Campus Scientifico Sogesta Localit Crocicchia - 61029 Urbino, İtaliya və 2 Dipartimento di Scienze Biomolecolari, Sezione di Biomolecolari, Rivitilla Univers, Sezione de la Universitas Urbino "Carlo Bo", Via I Maggetti, 26/2 - 61029 Urbino, İtaliya.

Bu məqaləni aşağıdakı kimi alın: Sisti və başqaları., Real vaxtda PCR-də forma əsaslı kinetik kənar göstəricilərin aşkarlanması BMC Bioinformatika 2010, 11:186

1. Gingeras TR, Higuchi R, Kricka LJ, Lo YM, Wittwer CT: Əlli illik molekulyar (DNT/RNT) diaqnostika.

Təbiət protokolları 2006 , 1(3):1559-1582. PubMed Abstract | Nəşriyyatçı Tam Mətn BioMed

Bio Texnikaları 2008 , 44(5):619-626. BioMed

Gunson RN, Bennett S, Maclean A, Carman WF: Rutin diaqnostika xidmətini sadələşdirmək üçün multipleks real vaxt PCR-dən istifadə.

J Clin Virol 2008 , 43(4):372-375.

Watzinger F, Ebner K, Lion T: Virus infeksiyalarının real vaxtda PCR ilə aşkarlanması və izlənməsi.

Təbabətin molekulyar aspektləri 2006 , 27(2-3):254-298. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətn | BioMed

Kaltenboeck B, Wang C: Real vaxtda PCR-də irəliləyişlər: klinik laborator diaqnostikaya tətbiq.

Klinik kimyada irəliləyişlər 2005 , 40:219-259. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətn | BioMed

Akane A, Matsubara K, Nakamura H, Takahashi S, Kimura K: Polimeraz zəncirvari reaksiya (PCR) amplifikasiyasının əsas inhibitoru olan qan ləkələrindən deoksiribonuklein turşusu (DNT) ilə kopurifikasiya edilmiş heme birləşməsinin müəyyən edilməsi.

Məhkəmə Elmləri Jurnalı 1994 , 39(2):362-372. PubMed Abstract | BioMed

Wilson IG: Nuklein turşusunun gücləndirilməsinin qarşısını almaq və asanlaşdırmaq.

Tətbiqi və ətraf mühit mikrobiologiyası 1997 , 63(10):3741-3751. PubMed Abstract | PubMed Mərkəzi Tam Mətn | BioMed

Tichopad A, Didier A, Pfaffl MW: Dokuya xas olan çirkləndiricilər səbəbindən real vaxt rejimində RT-PCR kəmiyyətinin qarşısını almaq.

Mol Hüceyrə Zondları 2004 , 18(1):45-50. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətn | BioMed

Rossen L, Norskov P, Holmstrom K, Rasmussen OF: Qida nümunələri, mikrob diaqnostik analizləri və DNT-ekstraksiya həlləri komponentləri ilə PCR-nin inhibe edilməsi.

Qida Mikrobiologiyası Beynəlxalq jurnalı 1992 , 17(1):37-45. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətni | BioMed

Guescini M, Sisti D, Rocchi MB, Stocchi L, Stocchi V: Yüngül gücləndirmə inhibəsi səbəbindən əhəmiyyətli kəmiyyət qeyri-dəqiqliyini aradan qaldırmaq üçün yeni real vaxt PCR üsulu.

Kainz P: PCR yaylası mərhələsi - məhdudiyyətlərinin anlaşılmasına doğru.

Biochimica və biophysica acta 2000 , 1494(1-2):23-27. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətni | BioMed

Livak KJ, Schmittgen TD: Real vaxt kəmiyyət PCR və 2 (-Delta Delta C (T)) Metodundan istifadə edərək nisbi gen ifadəsi məlumatlarının təhlili.

Metodlar (San Diego, Kaliforniya) 2001 , 25(4):402-408. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətni | BioMed

Liu W, Müqəddəs DA: Real vaxt PCR kinetikası üçün kəmiyyət metodunun təsdiqlənməsi.

Biochem Biophys Res Commun 2002 , 294(2):347-353. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətn | BioMed

Rutledge RG: Sigmoidal əyri uyğunluq, avtomatlaşdırılmış yüksək məhsuldarlıq tətbiqlərinin inkişafı perspektivi ilə kəmiyyət real vaxtda PCR-ni yenidən təyin edir.

Pfaffl MW: Həqiqi zamanlı RT-PCR-də nisbi miqdar üçün yeni bir riyazi model.

Goll R, Olsen T, Cui G, Florholmen J: Zond əsaslı real vaxt PCR-də qeyri-xətti reqressiya ilə mütləq kəmiyyətin qiymətləndirilməsi.

Bar T, Stahlberg A, Muszta A, Kubista M: Kinetik Outlier Detection (KOD) real vaxt PCR-də.

Kontanis EJ, Reed FA: PCR inhibitorlarını aşkar etmək üçün real vaxtda PCR gücləndirmə səmərəliliyinin qiymətləndirilməsi.

Ədliyyə elmləri jurnalı 2006 , 51(4):795-804. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətni | BioMed

Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF: Kəmiyyət real vaxt polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) məlumatlarının fərziyyəsiz təhlili.

Neurosci Lett 2003 , 339(1):62-66. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətni | BioMed

Wilhelm J, Pingoud A, Hahn M: Real vaxt polimeraz zəncirvari reaksiya ilə nuklein turşusu nüsxə ədədlərinin avtomatik kəmiyyətlənməsi üçün alqoritmin təsdiqlənməsi.

Anal Biokimya 2003 , 317(2):218-225. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətn | BioMed

Wilhelm J, Pingoud A, Hahn M: SoFAR: real vaxt PCR məlumatlarının tam avtomatik qiymətləndirilməsi üçün proqram.

Bio Texnikalar 2003 , 34(2):324-332. BioMed

Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, Karlen Y, Bakker O, Hoff MJ, Moorman AF: Gücləndirmə səmərəliliyi: kəmiyyət PCR məlumatlarının təhlilində əsas və qərəzli əlaqələr.

Liu W, Saint DA: Polimeraz zəncirvari reaksiya kinetikasının simulyasiyasına əsaslanan real vaxt tərs transkripsiya polimeraz zəncirvari reaksiya analizinin yeni kəmiyyət metodu.

Anal Biokimya 2002 , 302(1):52-59. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətni | BioMed

Spiess AN, Feig C, Ritz C: Asimmetriya üçün bir parametr təqdim etməklə real vaxt rejimində PCR məlumatlarının yüksək dəqiqlikli sigmoidal uyğunlaşdırılması.

Qiu H, Durand K, Rabinovitch-Chable H, Rigaud M, Gazaille V, Clavere P, Sturtz FG: HIF-1alpha və XRCC4 gen ifadəsi, sigmoidal əyri uyğunlaşdırma metodundan istifadə edərək real vaxt RT-PCR ilə insan nümunələrində ölçülür.

Bio Texnikaları 2007 , 42(3):355-362. BioMed

Rutledge RG, Stewart D: Polimeraz zəncirvari reaksiya üçün kinetik əsaslı sigmoidal model və yüksək tutumlu mütləq kəmiyyət real zamanlı PCR-ə tətbiqi.

Cikos S, Bukovska A, Koppel J: MRNA nisbi kəmiyyət: real vaxt PCR məlumat analizi üçün istifadə olunan metodların müqayisəsi.

Tichopad A, Bar T, Pecen L, Kitchen RR, Kubista M, Pfaffl MW: Gücləndirmə uyğunluğu testinə əsaslanan kəmiyyət PCR üçün keyfiyyətə nəzarət.

Rencher AC: Çox dəyişkənli analiz metodları. 2 -ci nəşr. Wiley, ABŞ -da 2002 -ci ildə çap edilmişdir.

Young CC, Burghoff RL, Keim LG, Minak-Bernero V, Lute JR, Hinton SM: Polivinilpirolidon-Aqaroza Gel Elektroforez Torpaqlardan Polimeraza Zəncir Reaksiyasının Gücləndirilə bilən DNT-nin Təmizlənməsi.

Tətbiqi və ətraf mühit mikrobiologiyası 1993 , 59(6):1972-1974. PubMed Abstract | PubMed Mərkəzi Tam Mətn | BioMed

Tichopad A, Polster J, Pecen L, Pfaffl MW: Thermus aquaticus polymerase və Moloney murine lösemi virusunun tərs transkriptazasının çay polifenolları (+)-kateşin və (-)-epigallocatechin-3-gallat tərəfindən inhibe edilməsi modeli.

J Etnofarmakol 2005 , 99(2):221-227. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətn | BioMed

Nolan T, Hands RE, Ogunkolade W, Bustin SA: SPUD: nuklein turşusu preparatlarında inhibitorların aşkarlanması üçün kəmiyyət PCR analizi.

Anal Biokimya 2006 , 351(2):308-310. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətn | BioMed

Murphy J, Bustin SA: Klinik diaqnostikada real vaxt tərs transkripsiya PCR-nin etibarlılığı: qızıl standart yoxsa standart olmayan?

Ekspertlərin molekulyar diaqnostika 2009 , 9(2):187-197. PubMed Abstract | Nəşriyyat Tam Mətni | BioMed

Chandler DP, Wagnon CA, Bolton H Jr: Şablonun aşağı konsentrasiyalarında PCR-in əks transkriptaza (RT) inhibisyonu və onun kəmiyyət RT-PZR üçün təsiri.

Tətbiqi və ətraf mühit mikrobiologiyası 1998 , 64(2):669-677. PubMed Abstract | PubMed Mərkəzi Tam Mətn | BioMed

Kubista M, Stahlberg A, Bar T: İşıqlandırma zondu əsaslı real vaxt Q-PCR.

Daxilində Genomika və Proteomika Texnologiyaları SPIE materialları Redaktə edən: TW Raghavachari R. 2001, 53-58. BioMed

Karsai A, Muller S, Platz S, Hauser MT: Evdə hazırlanan SYBR yaşıl I reaksiya qarışığının, gen ifadəsinin real vaxtda PCR kəmiyyətlənməsi üçün qiymətləndirilməsi.

Bio Texnikalar 2002 , 32(4):790-792. BioMed

Tichopad A, Dzidic A, Pfaffl MW: Primerlə əlaqəli gücləndirmə səmərəliliyini artırmaqla kəmiyyət real vaxt rejimində RT-PCR təkrar istehsalını yaxşılaşdırmaq.

Biotexnologiya məktubları 2002 , 24:2053-2056. Nəşriyyat Tam Mətn | BioMed

Rosenstraus M, Wang Z, Chang SY, DeBonville D, Spadoro JP: Rutin diaqnostik PCR üçün daxili nəzarət: dizayn, xüsusiyyətlər və klinik performansa təsiri.

Klinik mikrobiologiya jurnalı 1998 , 36(1):191-197. PubMed Abstract | PubMed Central Tam Mətn | BioMed

Rutledge RG, Stewart D: Amplifikasiya səmərəliliyini təyin etmək üçün istifadə olunan metodların tənqidi qiymətləndirilməsi real zamanlı PCR-nin eksponent xarakterini təkzib edir.

Skern R, Frost P, Nilsen F: Kəmiyyət PCR ilə nisbi transkript kəmiyyəti: təxminən doğru və ya dəqiq səhv?


Nəticələr

AccuCal istifadə edərək kəmiyyət

Ənənəvi PCR ölçmə metodlarının [8] uzun müddətdir davam edən problemlərini həll etmək üçün metodoloji həll hər qPCR işinə asanlıqla inteqrasiya etməli, dəqiq nəticələr verməli və ideal olaraq universal olaraq tətbiq olunmalıdır.

Metod interkalasiya edən boyalarla istifadə üçün ikiqat zəncirli DNT kalibratoru olan AccuCal-D və ya zond əsaslı qPCR analizləri üçün tək zəncirli, flüoresan etiketli kalibrator olan AccuCal-P-ə əsaslanır. İlkin optimallaşdırma tələb olunur, lakin bundan sonra AccuCal metodu üç sadə addımı əhatə edir (Şəkil 1a və Metodlarda ətraflı). RealCount ™ proqramı hesablama addımlarını avtomatlaşdırmaq üçün hazırlanmışdır.

AccuCal kalibratorundan istifadə edərək PCR gücləndirilmiş nuklein turşusunun kəmiyyətinin müəyyən edilməsi. a Hər bir PCR -də nuklein turşusunun miqdarını ölçmək üçün AccuCal istifadə etməklə əlaqəli iş axını, b AccuCal kalibratoru seyreltildi ki, Sso Fast EvaGreen Supermix -də 0, 40, 60, 80, 120, 140 və 200 ng bir PCR plitəsinin müvafiq quyularına əlavə edildi və 40 amplifikasiya dövrünə məruz qaldı. c Hər bir AccuCal kalibratorunun flüoresan intensivliyi (ortalama 0 ng AccuCal floresansının çıxılmasından sonra) məbləğə (pmols) və kalibrləmə əyrisi yaratmaq üçün quraşdırılmış xətti bir reqressiya xəttinə qarşı tərtib edilmişdir. d 4,5 × 10 6 – 4,5 × 10 1 nüsxə/PCR arasında dəyişən lambda DNT-nin on qat qatılmaları AccuCal kalibratorları ilə eyni lövhədə Sso Fast EvaGreen Supermix-də dörd dəfə gücləndirilmişdir. e Hər bir gücləndirmə reaksiyasının hesablanmış səmərəliliyi və hər bir gücləndirmə reaksiyası üçün qalxma nöqtəsi (Cq) və ikinci törəmə maksimumları arasındakı dövr nömrələri ilə yanaşı, hər bir PZR-də DNT-nin orta başlanğıc miqdarının kəmiyyətini müəyyən etmək üçün kalibrləmə əyrisindən istifadə edilmişdir. Ortanın standart xətası da təqdim olunur. f Nəzəri və müəyyən edilmiş nüsxə sayı/PZR, üstəgəl SEM, bir-birinə qarşı qurulmuş və iki dəyər arasında uyğunluğu nümayiş etdirmək üçün reqressiya xətti çəkilmişdir.

İstifadə ediləcək AccuCal-D diapazonunu müəyyən etmək üçün ilkin optimallaşdırma DNT gücləndirmələri ilə eyni reaksiya şəraitində aparılmışdır. Göstərilən nümunədə 0-140 ng diapazonu optimal idi, çünki bu, gücləndirmə əyrilərinin eksponensial hissəsini əhatə edirdi, burada gücləndirilmiş hədəfin miqdarı giriş məbləği ilə düz mütənasibdir [9, 10] və xətti bir dəyər verdi. 0.9987 olan R 2 dəyəri olan kalibrləmə əyrisi (Şəkil 1b, c və Əlavə fayl 1). Bütün sonrakı PCR-lərin reaksiya şərtləri sabit qaldıqda, bu təyinetmə yalnız bir dəfə həyata keçirilməlidir.

AccuCal-D-nin kəmiyyətcə dəqiqliyini göstərmək üçün, AccuCal-D ilə yanaşı, dörd dəfə, 4.5 × 10 6-4.5 × 10 1 nüsxədən lambda DNT-dən 92 bplik amplikonun bilinən miqdarlarının on qatlı seyreltmələrini gücləndirdik. əvvəlcədən müəyyən edilmiş məbləğlər və kalibrləmə əyrisinin qrafiki (Şəkil 1b-d). Hər amplifikasiya reaksiyasının səmərəliliyi daha sonra məlum alqoritmlərdən istifadə edərək RealCount tərəfindən təyin edilmişdir [10]. Nəhayət, səmərəlilik dəyərləri və kalibrləmə əyrisindən istifadə edərək, DNT -nin orta miqdarı və ortalamanın standart xətası, RealCount istifadə edərək hər bir amplifikasiya əyrisinin eksponensial mərhələsindəki bütün dövrlər üçün hesablandı (Şəkil 1e). Müəyyən edilmiş dəyərlər və PCR-ə səpilən nəzəri miqdar arasındakı bir reqressiya təhlili, AccuCal-D metodunun faydalılığını və real vaxt qPCR-in mütləq kəmiyyətcə dəqiqliyini göstərən 0.9977 (Şəkil 1f) bir R 2 verdi.

AccuCal-D, floresans yaratmaq üçün interkalasiya edən bir boyaya güvənir, ancaq boya: AccuCal-D floresans nisbəti bilinmir. Bu əlaqəni başa düşmək üçün AccuCal, AccuCal-P-nin proba əsaslanan bir versiyasını hazırladıq. Bir sıra lambda DNT konsentrasiyalarından 92 bp amplikon gücləndirilmiş və ya FAM etiketli bir hidroliz probu və ya EvaGreen intercalating boyası ilə aşkar edilmişdir. Həm AccuCal-D, həm də FAM etiketli AccuCal-P PCR lövhəsinə daxil edildi və hər iki marker tərəfindən aşkarlanan lambda DNT-ni ölçmək üçün müstəqil olaraq istifadə edildi. Hər iki PCR gücləndirmə dəsti üçün AccuCal-D və ya AccuCal-P istifadə olunan kəmiyyət, hər bir seyreltmə üçün, nəzəriyyəli nüsxə sayı müəyyən edilmiş nüsxə sayına (yamaclar = 0.9601, 0.9653) nisbətlə tərtib edildikdə, yamaclar arasında əhəmiyyətli fərqlər olmadan fərqlənməyən nəticələr verdi. , 0,9623 və 0,9701, hər bir Şəkil 2a və Əlavə fayl 1 üçün R 2 = 1). AccuCal-P və hidroliz probu, DNT molekulu başına bir FAM hissəsi ilə etiketlənmişdir və bu qPCR şərtlərində EvaGreen boyası ilə eyni DNT molekulu başına eyni floresanlığı bildirir.

Həm AccuCal-D, həm də AccuCal-P istifadə edərək kəmiyyətin təyini. a 4,5 × 10 5 ilə 4,5 × 10 1 arasında dəyişən lambda DNT-nin məlum miqdarının beş, on qat qatılmaları dörd dəfə iki dəfə gücləndirilmiş və ya EvaGreen, Sso Fast mastermiksində interkalasiya boyası və ya FAM etiketli istifadə edərək aşkar edilmişdir. hədəf amplikona xas olan hidroliz probu. Hər iki halda, AccuCal-D və AccuCal-P kalibratorları eyni lövhəyə daxil edilib və hər bir PCR-də daxil olan DNT-nin başlanğıc miqdarını müstəqil şəkildə ölçmək üçün istifadə edilib. EvaGreen boyası (EG) və ya hidroliz probu (P) istifadə edərək AccuCal-D və ya AccuCal-P tərəfindən təyin olunan hesablanmış məbləğlə müqayisədə nəzəri məbləğ tərtib edildi və hər birinin xətti reqressiyası sağdakı qrafikdə göstərildi. . b Dörd nüsxədə məlum miqdarda lambda DNT-nin beş, on qat qatılmaları 501 bp amplikon vermək üçün primerlərdən istifadə edərək Sso Fast mastermiksində gücləndirildi. AccuCal-D və AccuCal-P kalibratorları eyni lövhəyə daxil edilib və hər bir PCR-də lambda DNT-nin başlanğıc miqdarını müstəqil olaraq ölçmək üçün istifadə edilib. 501 bp amplikon üçün AccuCal-D və ya AccuCal-P tərəfindən təyin olunan hesablanmış məbləğlə müqayisədə nəzəri məbləğ tərtib edildi və hər birinin xətti reqressiyası sağdakı qrafikdə göstərildi. c Məlum miqdarda lambda DNT-nin beş, on qat qatılmaları (Eko-da 3 yüz qat qatılma) 2-10 PCR əməliyyatı üzərində göstərilən müxtəlif qPCR platformalarında müxtəlif mastermikslərdə (Usullara baxın) gücləndirildi. Bütün platformalarda AccuCal-D tərəfindən təyin olunan orta hesablanmış məbləğlə müqayisədə nəzəri məbləğ tərtib edildi və xətti reqress sağdakı qrafikdə göstərildi. Hər bir halda hesablanmış nüsxələrin/PCR və SEM -in orta sayı göstərilir

AccuCal-D kəmiyyətinin istifadə oluna biləcəyi amplikon ölçülərinin aralığını müəyyən etmək üçün 501 bp-lik lambda amplikonlarını da gücləndirdik. 92 bp ilə 501 bp arasında olan amplikonlar adətən qPCR ilə gücləndirilən amplikon ölçülərinin spektrini əhatə edir. Yenə də AccuCal-P və FAM etiketli şablona xas hidroliz zondu AccuCal-D və interkalasiya boyası üçün müqayisəedici kimi istifadə edilmişdir. Nəticələr göstərir ki, kəmiyyət göstəricisi AccuCal-D və ya AccuCal-P ilə hesablansa da, hər iki amplikon ölçüsü üçün oxşardır, heç bir yamac 1-dən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmir (Şəkil 2b). Bu onu göstərir ki, boya və zond flüoresansı bu amplikon ölçüləri diapazonunda sabit qalır və buna görə də AccuCal bu diapazonda istənilən amplikonun kəmiyyətini müəyyən etmək üçün etibarlı şəkildə istifadə edilə bilər.

Bir sıra real vaxt rejimində qPCR platformalarında müxtəlif boya əsaslı mastermikslərdə AccuCal-D performansını qiymətləndirmək üçün səkkiz müstəqil tədqiqat qrupu AccuCal-D və lambda gücləndirilməsi üçün reagentlər (92 bp amplikon) ilə təmin edilmişdir. Hər bir laboratoriya, bu laboratoriyalar üçün xarakterik olan bir sıra şərtlərdə GOI -lərini və məlum olan lambda miqdarını artırdı. Nəticələr göstərir ki, AccuCal-D bu müxtəlif və müstəqil testlərdə məlum olan lambda DNT konsentrasiyalarının dəqiq, mütləq miqdarını təmin edir (Şəkil 2c). Bütün platformalarda kollektiv olaraq müqayisə edildikdə, müəyyən edilmiş ortalamanın miqdarı hər bir PCR -dəki nəzəri nüsxə sayı ilə mükəmməl şəkildə əlaqələndirilir (Şəkil 2c, yamac = 1).

GOI(lər) ilə eyni şərtlər altında hər bir qPCR işə inteqrasiya olunduqda, AccuCal boya və ya zond əsaslı analizlərdə bir sıra daxilolma məbləğləri və amplikon ölçüləri üzərində möhkəm mütləq kəmiyyətləşdirməni təmin edir.

AccuCal nisbi kəmiyyət təhlilinə inam təmin edir

Nisbi kəmiyyət ΔΔCq [11] və Pfaffl [12] analizləri ənənəvi olaraq PCR kəmiyyətinin müəyyən edilməsində ən sadə və ən çox istifadə edilən üsul olmuşdur. AccuCal mütləq kəmiyyət təmin etsə də, nisbətən tətbiq oluna bilər.

AccuCal-D ΔΔCq və Pfaffl analizləri ilə müqayisə etmək üçün CD40 və Interleukin 7 reseptor alfa zənciri (IL7R) variantlarının səviyyələrini qiymətləndirdik. İnsan periferik qanının tək nüvəli hüceyrələrinin (PBMC) aktivləşməsi çoxlu skleroza meylini əks etdirən bu genlərin birləşmə variantlarının repertuarını ortaya qoyur [13, 14]. səviyyələrini ölçmək üçün təcrübələr apardıq CD40IL7R müxtəlif miqdarda forbol miristat asetat (PMA) və ionomisin (PMA/I) ilə 24 saat aktivləşdirmədən sonra qPCR vasitəsilə insan PBMC-lərində. QPCR-nin mütləq miqdarı AccuCal-D və RealCount istifadə edərək həyata keçirilmişdir (Şəkil 3a və Əlavə fayl 1). Nisbi kəmiyyət, PMA/ionomisin yoxluğuna nisbətən mütləq AccuCal-D dəyərlərini ifadə etməklə və ya gliseraldehid 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) bir istinad geni və bir nəzarət olaraq stimullaşdırılmamış hüceyrələr (Şəkil 3b). Pfaffl təhlili üçün RealCount tərəfindən hesablanan səmərəlilikdən istifadə edilmişdir.

Kəmiyyət CD40, IL7RGAPDH 0-1x PMA/ionomisin ilə stimullaşdırılan PBMC-lərdə. a Mütləq miqdar CD40, IL7RGAPDH qPCR-dən sonra AccuCal-D kalibratorlarından istifadə edərək RealCount proqramı tərəfindən 0, 0.25x, 0.5x və 1x PMA/ionomisin (20 ng ml -1 PMA, 500 ng ml -1 ionomisin PMA/I) ilə stimullaşdırılmış PBMC-lərdə. b Nisbi ifadə səviyyələri CD40IL7R 0, 0,25x, 0,5x və 1x PMA/ionomisin (20 ng ml -1 PMA, 500 ng ml -1 ionomisin) ilə stimullaşdırılan PBMC-lərdə. Çirklənmiş çubuqlar ΔΔCq istifadə edərək təyin olunan nisbi ifadə səviyyələridir GAPDH istinad nümunəsi olaraq və nəzarət nümunəsi olaraq PMA/ionomisin olmadığı üçün, bərk çubuqlar, PFaffl analizi ilə təyin olunan nisbi ifadə səviyyələridir, istinad geni olaraq GAPDH istifadə olunur, nəzarət kimi stimullaşdırılmamış hüceyrələr və RealCount proqramı tərəfindən hesablanan fərdi səmərəlilik dəyərləri və damalı çubuqlar kəmiyyətlənir RealCount proqramı tərəfindən AccuCal-D eyni PCR işinə daxil edildikdən sonra və PMA/ionomisin nəzarətinin olmaması ilə əlaqədar ifadə edilir. c 0 ilə stimullaşdırılmış PBMC -lərin eyni populyasiyasında CD40 və IL7R nisbi ölçüsünü göstərən axın sitometriyasından təmsilçi örtüşmə qrafikləriqırmızı), 0,25x (mavi), 0,5x (yaşıl) və 1x PMA/ionomisin (20 ng ml -1 PMA, 500 ng ml -1 ionomisin narıncı) kimi (a). **** səh Müvafiq PMA/ionomisin nəzarətinə nisbətən 0.0001, n = 4

Həm mütləq, həm də nisbi analizlər ifadəsini göstərdi IL7R stimullaşdırılmış hüceyrələrdə 3-10 qat aşağı idi (səh Bütün üsullarla ≤ 0.0001) stimullaşdırılmamış hüceyrələrlə müqayisədə, CD40 böyük əhəmiyyət kəsb etmirdi. Bu təcrübədə ΔΔCq və Pfaffl analizlərindən əldə edilən qPCR məlumatlarının təfsiri AccuCal-D tərəfindən təmin edilənlə eyni idi (Şəkil 3b). ΔΔCq və Pfaffl analizləri üçün fərziyyə səviyyəsidir GAPDH istinad geni müalicələr arasında sabit qalır. Əhəmiyyətli olan AccuCal-D istifadə edərək mütləq kəmiyyət ölçüsü bunun həqiqətən də belə olduğunu göstərdi (Şəkil 3a). qPCR analizlərinin nəticələri CD40 ifadəsinin səviyyəsində heç bir fərq və ifadədə 3-5,5 dəfə azalma göstərən axın sitometriyası ilə dəstəkləndi. IL7R müalicə olunmamış hüceyrələrlə müqayisədə müalicə qrupunda (Şəkil 3c).

Vacib odur ki, AccuCal-D və RealCount analizi bütün genlərin, o cümlədən istinad geninin müalicələr/qruplar arasında ifadə səviyyələri (Şəkil 3a) və ΔΔCq və Pfaffl istifadə edilməklə mövcud olmayan hər bir gücləndirmə reaksiyası üçün fərdi effektivliklərlə bağlı məlumatları təmin edir. təhlil edir.

AccuCal ənənəvi kəmiyyət analizlərini əvəz edir

Prostat epiteli spesifik fosfataz və tensin homolog nokautu (pePTENKO) prostat patologiyasını [15] induksiya edir və immunohistokimya (Şəkil 4a və Əlavə fayl 1) və ya Western blot (şəkil 4b) ilə təyin olunan siçanlarda prostata xas androgen reseptor (AR) ifadəsini dəyişdirir. ). Qərb təhlili göstərdi ki, β-aktin (ACTB) zülalının səviyyələri sabitdir və nisbi protein ifadə səviyyələrini müəyyən etmək üçün istifadə olunur. AR zülalının tərkibi əhəmiyyətli dərəcədə böyük idi (səh = 0,008) vəhşi tiplə müqayisədə pePTENKO siçanlarından prostat toxumasında (WT Şəkil 4b).

Androgen reseptorunun zülal və mRNT səviyyələrinin miqdarının təyini (AR, Ar) siçanın ön prostatında. a WT və pePTENKO siçanlarının prostat vəzində AR protein ifadəsini (qəhvəyi boyanma) və diferensial patologiyanı göstərən nümayəndə immunohistokimyası. b WT -nin ön prostatında AR zülalının Western blot ilə ölçülməsi (n = 2) və pePTENKO (n = 4) nisbi protein səviyyələrini təyin etmək üçün yükləmə nəzarəti olaraq β-aktin (ACTB) istifadə edən siçanlar. c Nisbi kəmiyyət Ar istifadə edərək ΔΔCq və Pfaffl analizləri Actb istinad gen kimi və WT nəzarət kimi. d qPCR ArAktb WT-də (mavi əyrilər, n = 7 dublikat) və pePTENKO (qırmızı döngələr, n = 5 dublikat) siçan. e Tərkibində olan plazmidlərin ardıcıl seyreltilməsinin nəzəri və müəyyən edilmiş kəmiyyətinin müqayisəsi Ar və ya Actb ənənəvi standart əyrilərlə amplikonlar (mavi brilyant və xətt) və ya AccuCal və RealCount istifadə (qırmızı meydanlar və xətt). f Mütləq mRNA nüsxə sayı kəmiyyətinin ArActb WT-nin ön prostatında istinad geni (n = 7) və pePTENKO (n = 5) AccuCal kalibratorları və RealCount proqram təminatı (AC) və ya standart əyriləri (Std) ilə RT-qPCR tərəfindən müəyyən edilən siçanlar. g Hər iki WT üçün AccuCal və RealCount istifadə edərək bir sıra istinad genlərinin mütləq kəmiyyəti (n = 7) və pePTENKO (n = 5) siçanlar. h Üçün nisbi kəmiyyət metodologiyalarının müqayisəsi Ar. UsedCq və Pfaffl analizlərindən istifadə olunur Aktb və ya Hmbs istinad geni və nəzarət olaraq WT, AccuCal (AC) və standart əyri (Std) mütləq dəyərlər nəzarət olaraq WT ilə nisbi şəkildə ifadə edildi. Bütün qrafiki məlumatlar ortalama ± SEM olaraq göstərilir. **** p <0,0001, ** səh = 0.001–0.01, * səh = 0.01-0.05 müstəqil iki nümunə ilə t- WT siçanları ilə müqayisədə pePTENKO siçanlarında androgen reseptoru və ya β-aktin mRNA və ya zülal ifadəsi arasında və ya ΔΔCq və Pfaffl ilə müqayisədə nisbi ifadə üsulları arasında test Aktb istinad gen kimi

Bu kompleks analizlərin qPCR istifadə edərək mRNA analizi ilə əvəz oluna biləcəyini təyin etmək üçün PCR gücləndirdik ArAktb WT və pePTENKO siçanlarından alınan prostat RNT -dən. İlkin olaraq, nisbi kəmiyyət ənənəvi ΔΔCq və Pfaffl analizləri ilə aparıldı. Aktb istinad gen kimi və WT nəzarət kimi. Aktb zülal qruplar arasında sabit şəkildə ifadə olunduğu üçün seçildi (Şəkil 4b). ΔΔCq və Pfaffl analizləri əhəmiyyətli bir dəyişiklik olmadığını göstərdi Ar WT ilə müqayisədə pePTENKO siçanlarında ifadə səviyyələri (müvafiq olaraq 1.250 və 1.286 dəfə artım, Şəkil 4c). Məlumdur ki, zülal və mRNT səviyyələri mütləq korrelyasiya etmir [16, 17], bu nəticəni izah edə bilər. Alternativ olaraq nisbi qPCR analizi səhv ola bilər. Tədqiqat amplifikasiya sahələrinin daha böyük ifadəsini təklif etdi Ar, eləcə də Aktb, pePTENKO siçanlarının prostatında (Şəkil 4d).

Bu problemi həll etmək üçün səviyyələri müəyyən etmək üçün AccuCal-D və ya standart əyrilər vasitəsilə mütləq kəmiyyətdən istifadə etdik. ArAktb pePTENKO və WT siçanlarında. Nəticələr, hər bir genin ifadə səviyyələrinin hər iki üsulla oxşar mütləq kəmiyyətlərə malik olduğunu göstərdi (Şəkil 4e) və pePTENKO siçanlarından prostatlarda həm standart əyri, həm də AccuCal-D üçün WT siçanlarından xeyli yüksək idi.Ar, səh & lt 0.0001 və səh < 0,0001 Aktb, səh = 0.0049 və səh = 0.0043, müvafiq olaraq Şəkil 4f). Nisbi şəkildə ifadə edildikdə, Ar pePTENKO siçanlarında ifadə standart əyri kəmiyyətcə WT siçanlarından 3.806 qat, AccuCal-D kəmiyyətlənməsi ilə 3.697 qat daha yüksək idi. Bunların hər ikisi istifadə edilən ΔΔCq və Pfaffl analizlərindən əhəmiyyətli dərəcədə fərqli idi Aktb istinad gen kimi (səh < 0.0001 Şək. 4h), lakin Western blot nəticələrinə uyğun idi. Bu misalda ΔΔCq və Pfaffl analizləri dəqiq deyildi, çünki istifadə olunan istinad geni fenotiplər arasında GOI ilə oxşar şəkildə dəyişmişdir (Şəkil 4f).

Bundan əlavə, biz AccuCal-D ilə normallaşdırma üçün istifadə ediləcək bir sıra digər mümkün istinad genlərini kəmiyyətləşdirdik. Ribozomal zülal L19 ifadəsi arasında əhəmiyyətli bir fərq yox idi.Rpl19) və hidroksimetilbilan sintaza (Hmbs) WT və pePTENKO arasında, lakin qalan istinad genlərinin hamısı WT siçanlarına nisbətən pePTENKO siçanlarının prostat vəzlərində əhəmiyyətli dərəcədə daha çox ifadə edildi, bəzi təcrübələrdə uyğun bir istinad geninin tapılmasının çətinliyini vurğuladı (Şəkil 4g). Daha sonra ən az dəyişən istinad genindən istifadə edərək ΔΔCq və Pfaffl analizlərini təkrarladıq, Hmbs, və nəticələr (müvafiq olaraq 4,294 və 3,603 dəfə artım) AccuCal-D və ya standart əyri kəmiyyətləşdirmə ilə əldə edilənlərə çox oxşar idi və istifadə edilən ΔΔCq və Pfaffl analizlərindən əhəmiyyətli dərəcədə fərqli idi. Actb istinad geni olaraq (səh < 0,0001 hər iki halda Şək. 4h).

Təsvir edilən nümunədə AccuCal-D, tapılması çətin olan istinad genlərindən asılı olmayan alternativ bir kəmiyyət ölçmə metodu təqdim etdi (Şəkil 4h). Mühüm olaraq, standart əyri ilə mütləq kəmiyyətin AccuCal-D analizinə mükəmməl uyğun gəldiyini də göstərdik (Şəkil 4e, f). Bu göstərdi ki, AR-nin protein və gen ifadə səviyyələriAr qPCR tərəfindən sadiq bir müxbir təhlili olaraq mRNA analizinin istifadəsinə icazə verən əlaqəli. Qeyd edək ki, AccuCal bu məlumatı standart əyri metodundan daha sadə şəkildə təqdim etdi və eyni vaxtda araşdırılan bütün genlərin kəmiyyətini müəyyən etmək üçün tək kalibrləmə əyrisi istifadə edilə bilər.


Prizma 3 -- Standart əyridən istifadə edərək "Naməlum" konsentrasiyaların hesablanması

Standart əyri, ölçülmüş bir miqdarı (məsələn, radioaktivlik, floresans və ya optik sıxlıq) maraqlandıran maddənin konsentrasiyası ilə əlaqəli bir qrafikdir. Siz "naməlum" nümunələrdə tapmağı gözlədiyiniz konsentrasiyalar diapazonunu əhatə etmək üçün seçilmiş miqdarda maddəni ehtiva edən "məlum" nümunələri hazırlayır və təhlil edirsiniz. Daha sonra, test edilmiş miqdar (Y eksenində) və konsentrasiyaya (X oxunda) qrafiki çəkərək standart əyrini çəkirsiniz. Belə bir əyri, maddənin & quot bilinməyən & quot; nümunələrində konsentrasiyasını təyin etmək üçün istifadə edilə bilər. Prizma bu prosesi avtomatlaşdırır.

Prizma qeyri-xətti reqressiya (əyri uyğunluğu), xətti reqressiya və ya kub spline (və ya AŞAĞI) əyrisindən istifadə edərək standart əyrilərə uyğunlaşa bilər. Standart əyridən istifadə edərək "naməlum" konsentrasiyalarını tapmaq üçün bu addımları yerinə yetirin:

İçində Prizma xoş gəldiniz dialoq qutusunu seçin Yeni bir layihə yaradınMüstəqil işləyin. X sütunu kimi formatlamağı seçin Nömrələri və məlumatlarınızdakı təkrarların sayı üçün Y sütununu formatlaşdırmaq üçün. Bizim nümunəmiz üçün seçin Tək dəyərlər sütunu.

Standart əyri üçün məlumatları daxil edin. Aşağıda göstərilən nümunəmizdə "məlum" nümunələr üçün konsentrasiyaları X sütununa, 1-5-ci sətirlərə və müvafiq analiz nəticələrini Y sütununa daxil etdik. Prism sizin daxil etmədiyiniz arxada sıfırları göstərərsə narahat olmayın - biz bunu sonra dəyişəcəyik. 6 -cı sıradan başlayaraq standart əyri dəyərlərin altında, müvafiq sütunları boş buraxaraq & quot; naməlum & quot nümunələri üçün analiz nəticələrini Y sütununa daxil edin. Daha sonra, Prizma standart əyriyə uyğun olacaq və sonra bu əyrini istifadə edərək bilinməyən maddə konsentrasiyalarını bildirəcək.

üzərinə klikləyin Təhlil edin düymə. seçin Daxili analiz. Etibarən Döngələr və reqressiya kateqoriya, seçin Xətti reqressiya nümunə məlumatlarımızı istifadə edirsinizsə (və ya əyri olduğuna şübhə etdiyiniz məlumatları təhlil edirsinizsə, seçin Qeyri -xətti reqressiya [əyri uyğunluq]). Qeyri -xətti məlumatlarla necə davam edəcəyinizə dair bir nümunə üçün RIA və ya ELISA Məlumatlarının Təhlili nümunəsinə baxın.

Parametrlər: Xətti reqressiya informasiya qutusunda etiketli qutuyu yoxlayın Y -dən Standart Curve Xçünki naməlum konsentrasiyalarımızın təmin edilməsini istəyirik. İçində Çıxış seçimlər kateqoriyasını seçin Avtomatik Prizmanın reqressiya xəttinin haradan başlayacağını və bitəcəyini təyin etmək üçün seçimlər. Əhəmiyyətli rəqəmlərin sayını 3-ə təyin edin.

Tıkladığınız zaman tamam Xətti reqressiya parametrləri informasiya qutusundan çıxmaq üçün Prizma uyğunluğu yerinə yetirir və nəticələr vərəqi yaradır.

Prizma nəticələri baxış adlanan səhifələrdə göstərir. Varsayılan görünüş, ən yaxşı uyğunluq əyrisi üçün təyin olunan parametrləri göstərir.

Alətlər panelinin üçüncü cərgəsində "View" etiketli açılan qutunu tapın (ekranın ən yuxarısındakı "View" menyusu deyil). Seçin İnterpolyasiya edilmiş X dəyərləri (ilk Prism buraxılışlarında bu "Y-dən Standart əyri X" idi).

Prizma, məlumat vərəqinizdəki hər bir eşlenməmiş Y dəyəri üçün müvafiq X dəyərini bildirir.

Qrafikinizə Bilinməyənlər əlavə edin

Prizma və#39 -un avtomatik qrafiki, məlumat vərəqindəki məlumatları və əyrini ehtiva edir. Qrafikə "unknowns" əlavə etmək üçün:

-Ə keçin Qrafiklər layihənizin bölməsi.

üzərinə klikləyin Dəyişdirin düyməsini basın və sonra seçin Qrafik üzrə məlumatlar.

Dialoq qutusu qrafikdə göstərilən bütün məlumatları və nəticələr cədvəllərini göstərir. üzərinə klikləyin Əlavə et düymə.

Yuxarıdakı açılan siyahıdan Qrafikə məlumat dəstləri əlavə edin informasiya qutusunda seçin . Xətti reqressiya: İnterpolyasiya edilmiş X dəyərləri. Basın Əlavə et, sonra Yaxın. Qrafikə daxil olan məlumat dəstlərinin siyahısı indi aşağıdakı pəncərəyə bənzəməlidir.

basın tamam qrafikə qayıtmaq üçün.

Əgər siz "unknowns"-in X oxuna (məlumat nöqtələri deyil) proyeksiya edilmiş sünbüllər kimi təqdim edilməsini istəyirsinizsə, Dəyişdir düyməsini klikləyin və Simvollar və Xəttləri seçin. "Data set" açılan siyahıdan seçin. Xətti reqressiya: İnterpolasiya edilmiş X dəyərləri. Simvol şəklini son 4 variantdan birinə (sünbüllərə) dəyişdirin və ölçüsünü 0 olaraq təyin edin.

Standart əyri nəticələr - Bilinməyənlər qrafikdəki sıçrayışlar kimi göstərilir, rəqəmsal nəticələr əlaqədar bir cədvəl kimi bildirilir. Təsvirə burada müzakirə olunmayan bəzi format dəyişiklikləri daxildir.


Müzakirə

  • Düşündüm ki, bu, nə edəcəyimi söyləmək əvəzinə, nə etdiyimi anlamağa kömək etmək üçün əla bir yoldur.
  • Əslində BİZ -in şəxsən etdiyimiz bir mutasiyanı seçmək, bütün karyeramda IUP -da ən maraqlı şey idi.
  • Öz mutasiyanızı seçmək başqasının seçdiyi bir mutasiyanı başa düşməkdən daha maraqlı idi.
  • Həqiqətən əla olduğunu düşündüm. Bu, məni əsl tədqiqatçı və kəşfiyyatçı kimi hiss etdirdi.

Bu tələbələr öz mutasiyalarını seçərək tədqiqatçılar rejiminə girirlər və bunu açıq şəkildə qarşıladılar. Bir tələbə laboratoriya kursunda bir tədqiqat vəziyyətini simulyasiya etməkdə bir təhlükə, "tələbə tərəfindən sınaqdan keçirilmiş" prosedurlarla müqayisədə optimaldan aşağı nəticələr üçün yüksək potensialdır. Həqiqətən də, BIOC 312 -dəki üç qrupdan yalnız biri analiz üçün mutant bir protein istehsalında müvəffəq oldu və bu zülal kursda istifadə edilən üsulla yalnız qismən təmizləndi. Mutasiyaya uğramış bir protein istehsal etməmək xəyal qırıqlığına səbəb olarkən, hər bir qrup yabanı tipli zülalını müvəffəqiyyətlə istehsal etmiş və təmizləmiş olacaq. Mutasiyaya uğramış zülalın analizinə sərf olunacaq kurs müddətləri, yabanı tipli formanın əlavə təhlili üçün asanlıqla istifadə oluna bilər.

Əvvəllər təsvir edilmiş iki layihənin xüsusiyyətlərini birləşdirməklə yanaşı, bu layihə yeni elementi, real vaxt rejimində PCR alətindən istifadə edərək zülal stabilliyinin tədqiqatları şəklində yüksək məhsuldarlıqlı analiz metodunun istifadəsini əhatə edir. Tədqiqatda yüksək məhsuldarlıq metodlarına artan diqqəti nəzərə alaraq, sadəcə olaraq tələbələrin bu cür metodlara məruz qalması arzuolunandır. Bu vəziyyətdə bir sıra əlavə üstünlüklər var. Real zamanlı PCR cihazından istifadə etməklə həm analiz olunan nümunələrin sayı, həm də hər bir qrup üçün cihaz seanslarının sayı tək nümunə spektroflorimetrinin analizi ilə müqayisədə xeyli artmışdır. Real vaxt PCR alətindən istifadə edən qruplar beş ayrı alət seansında vəhşi tipli zülalları üçün 36 ilə 76 ərimə əyrilərini ölçdülər. Əvvəlki ildə, spektroflorimetrdən istifadə edən üç tələbə qrupu 3 -dən 5 -ə qədər ərimə əyrisi ölçdü. Şagirdlər buna görə də texnikalarını inkişaf etdirmək, eksperimental dəyişənləri sınamaq və təqib təcrübələrini dizayn etmək üçün daha çox imkan əldə etdilər. Bundan əlavə, digər laboratoriya kurslarında adətən qarşılaşdıqlarından daha böyük məlumat dəstlərinin idarə edilməsi və təhlili ilə bağlı təcrübə qazandılar.

SYPRO narıncı kimi məruzəçi boya tərəfindən nəzarət edilən istilik denaturasiyasının dezavantajı Δ-nı qiymətləndirmək üçün daxili flüoresan məlumatlarla mümkün olan termodinamik analizdir.H o və ΔS açılmaq üçün 11 etibarlı deyil. Bu analiz, qatlanmış və açılmamış zülallar arasında sadə, geri çevrilə bilən bir tarazlığı nəzərdə tutur. Bu, termal denatürasiya şəraitində əksər zülallar üçün çox güman ki, doğru olmasa da, zülala fərqli bir şəkildə bağlanan bir müxbir boyasının iştirakı ilə doğru deyil. Bu halda əldə edilən termodinamik dəyərlər həm zülalın açılmasını, həm də məruzəçi boyanın bağlanmasını əks etdirəcək.

Sadə hesablamadan kənar təhlili daxil etmək istəsəniz, bir neçə variant mümkündür Tm ərimə əyrilərindən. Diferensial tarama florimetriyası (ligandın olmaması və mövcudluğunda ərimə əyrilərinin ölçülməsi) 7, 8 ligand ayrılma sabitlərini hesablamaq üçün istifadə edilə bilər. Bu analiz üçün zülalın əvvəlcə heç bir bağlı liqanı olmamalıdır. Alternativ olaraq, SYPRO portağalının iştirakı ilə real vaxtda PCR aləti ilə ölçülən ərimə əyriləri kimyəvi denatürantların iştirakı ilə açılan zülalın kinetik parametrlərini hesablamaq üçün istifadə edilə bilər. Genişləndirilmiş tərcümə faktoru layihəsinin ilkin sınaqlarında bu təhlillərin heç biri cəhd edilməmişdir. Üçüncü alternativ ayrı bir kurs şəraitində araşdırıldı. Bu, real vaxt PCR aləti ilə aşkar edilə bilən dalğa uzunluğunda təbii olaraq flüoresanlaşan zülal olan gücləndirilmiş GFP (EGFP) istifadə edərək reportyor boyasının aradan qaldırılmasına əsaslanır.

EGFP və əlaqəli floresan zülallar, zülal -protein qarşılıqlı təsirləri və uyğunlaşma dəyişiklikləri də daxil olmaqla geniş tətbiq sahələrində biosensor olaraq istifadə olunur. Bu mühüm zülalların qatlama/açılma prosesi bir sıra üsullarla tədqiq edilmişdir 15-17 . Bu zülallar normal fizioloji şəraitdə yüksək termal stabilliyə malikdir və onların qatlanması/açılması ilə bağlı bir çox tədqiqat aşağı pH və ya denaturantların iştirakı ilə aparılır. Ədəbiyyatın nəzərdən keçirilməsi göstərir ki, EGFP-nin termal denatürasiyası ilə bağlı bir neçə araşdırma aparılmışdır. Bu zülalların açılmaq üçün sadə iki vəziyyətli bir modeli izləmədikləri bilinsə də, bəzi şərtlər altında denaturasiya əyriləri bu modelə uyğun bir forma sahibdir və beləliklə ümumi gediş prosesi üçün termodinamik dəyərlər əldə etmək üçün istifadə edilə bilər. Şəkil 7 real vaxt PCR aləti ilə əldə edilən EGFP üçün ərimə əyrilərini göstərir. EGFP nəticələri, ümumiyyətlə bir laboratoriya komponenti olmayan bir semestrlik biokimya kursunda təhsil alan tələbələr tərəfindən hazırlanmışdır. EGFP -nin ifadəsi, təmizlənməsi və xarakterizasiyasını əhatə edən bir laboratoriya təcrübəsi, yay sessiyasında kiçik bir qeydiyyatla təqdim olunan kurs üçün daxil edildi. Real vaxt rejimində PCR alətindən istifadə etməklə EGFP-nin termal denaturasiyası üçün bu ilkin nəticələr göstərir ki, bu sistem bakalavr laboratoriyası təcrübəsinə daxil olmaq üçün perspektivli ola bilər.


Videoya baxın: BAKIDA DƏHŞƏT VERİCİ HADİSƏ HƏR KƏS ŞOK İÇİNDƏ İZLƏYİR!!! (Noyabr 2022).