Məlumat

CRISPR funksiyası haqqında bu illüstrasiyada bu obyektlər nə deməkdir (şəkil təqdim olunur)?

CRISPR funksiyası haqqında bu illüstrasiyada bu obyektlər nə deməkdir (şəkil təqdim olunur)?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

CRISPRs haqqında məqalədə aşağıdakı rəqəm göstərilir:

Açıq-yaşıl qutuları əlavə etdim.

Qırmızı oxlar və ən solda doldurulmuş dairə olan xətt nə deməkdir? Ortadakı ox (həmçinin cas9-un qarşısında) nə deməkdir? Bənövşəyi kvadrat B planında (mavi ox) RNT bölməsi kimi başa düşülməlidirmi?

Burdan alınıb.

Başlıq (sitat gətirilir):

Nümunə olaraq S. pyogenes-dən II-A tipli sistem göstərilir. (A) tracrRNA və CRISPR massivi ilə cas geni operonu. (B) Virus əleyhinə müdafiənin təbii yolu Cas9-un təkrar-təkrar əleyhinə RNT (tracrRNA:crRNA) dupleksləri ilə birləşməsini, RNT-nin ribonukleaza III tərəfindən birgə emalını, daha da kəsilməsini, R-dövrəsinin formalaşmasını və hədəf DNT-nin parçalanmasını əhatə edir. (C) Dupleks tracrRNA:crRNA ilə təbii DNT parçalanmasının təfərrüatları.


Ox istiqaməti transkripsiyanın istiqamətini, yeri isə transkripsiyanın başlanğıc yerini bildirir. Çox güman ki, çevrə transkripsiya terminatorudur (Hazırda bu məqaləyə daxil ola bilmirəm, lakin bunun mənası budur).

Bənövşəyi qutular xarici DNT-dən əldə edilən protospacerlərə aiddir. Bu elementlər xarici DNT-nin tanınmasına və parçalanmasına kömək edir. Bunlar öz növbəsində Cas kompleksini hədəf DNT-yə istiqamətləndirən RNT kimi transkripsiya edilir. Bir növ, bu protospacerlər bakteriyalara bir növ immunoloji yaddaş təmin edir. Aşağıdakı şəklə baxın (Kimdən Nuñez və başqaları. 2015 ):


MAGECK-VISPR ilə CRISPR ekranlarının keyfiyyətinə nəzarət, modelləşdirmə və vizuallaşdırma

Yüksək məhsuldarlığa malik CRISPR ekranları funksional genomikada böyük vədlər verib. Biz CRISPR ekranları üçün hərtərəfli keyfiyyətə nəzarət (QC), təhlil və vizuallaşdırma iş axını olan MAGECK-VISPR təqdim edirik. MAGECK-VISPR eksperimentin keyfiyyətini qiymətləndirmək üçün bir sıra QC tədbirləri müəyyən edir və bir çox şəraitdə eyni vaxtda əsas genləri çağırmaq üçün maksimum ehtimal alqoritmini ehtiva edir. Alqoritm müxtəlif effektləri dekonvolyutsiya etmək üçün ümumiləşdirilmiş xətti modeldən istifadə edir və sgRNA-nın nokaut effektivliyini və gen vacibliyini təkrar-təkrar qiymətləndirmək üçün gözləmə-maksimumlaşdırmadan istifadə edir. MAGECK-VISPR həmçinin VISPR, QC və təhlil nəticələrinin interaktiv vizuallaşdırılması və tədqiqi üçün çərçivə daxildir. MAGECK-VISPR sərbəst şəkildə http://bitbucket.org/liulab/mageck-vispr saytında mövcuddur.


Fon

Quraqlıq bitkilərin böyüməsini, inkişafını və sağ qalmasını məhdudlaşdıran ən sərt ekoloji amillərdən biridir [1]. Qlobal istiləşmə ilə əlaqədar olaraq quraqlıq kənd təsərrüfatı istehsalında təcili həllini tələb edən problemə çevrilmişdir [2]. Pomidor (Solanum lycopersicum) bütün dünyada becərilən əhəmiyyətli bir tərəvəz məhsuludur, lakin ən qənaətcil sortları quraqlığa çox həssasdır [3, 4]. Beləliklə, pomidor bitkisinin quraqlığa dözümlülüyünün tənzimləmə mexanizmlərinin daha dərindən araşdırılması quraqlıqdan təsirlənmiş mühitlərdə itkiləri azaltmaq üçün ən cəlbedici və mümkün variantdır.

Quraqlıq stressində iştirak edən və ya ondan təsirlənən bir sıra fizioloji və biokimyəvi yollar müəyyən edilmişdir [5]. Mənfi ekoloji şərait ilk növbədə reaktiv oksigen növlərinin (ROS) həddindən artıq yığılması səbəbindən bitkilərə ciddi təsir göstərir [6]. Askorbat peroksidaz (APX), superoksid dismutaz (SOD), peroksidaz (POD) və katalaz (CAT) daxil olmaqla antioksidan fermentlər, davamlı ROS istehsalının öhdəsindən gəlməkdə mühüm rol oynayır [7, 8]. Elektrolit sızması və malondialdehidin (MDA) yığılması quraqlıq stresindən hüceyrə membranının zədələnməsini göstərə bilər [9].

Patogenezlə əlaqəli genin ekspressoru olmayan 1 (NPR1, başqa adla NIM1), xüsusi bir salisilik turşusu reseptoru (SA) sistematik müqavimətin (SAR) ayrılmaz hissəsi hesab olunur [10]. NPR1, Geniş Kompleks, Tramtrack və Bric-a-brac/poxvirus və Sink barmaq (BTB/POZ) və Ankirin-təkrar domeninə malik konservləşdirilmiş zülaldır, hər ikisi zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsi və NPR1-i təmin etmək üçün vacibdir. birgə aktivator kimi fəaliyyət göstərir [11]. Filogenetik analiz NPR1 kimi zülal ailəsinin üç funksional fərqli təbəqəsinin olduğunu aşkar etdi [12]. AtNPR1 və AtNPR2 daxil olmaqla qrup üzvləri SAR tənzimləməsində çox vaxt müsbət iştirak edirlər [12, 13]. Bununla belə, AtNPR3 və AtNPR4 daxil olmaqla qrup üzvləri həmişə mənfi SAR tənzimlənməsi ilə əlaqələndirilir, lakin SAR-ın quraşdırılmasında tələb olunur [14]. Bundan əlavə, başqa bir sinfə aid olan AtBOP1 və AtBOP2 yan orqanların inkişafı ilə əlaqələndirilir [15].

Əvvəlki hesabatlar bunu göstərdi Arabidopsis thaliana NPR1 (AtNPR1) bitkilərin biotik stresə reaksiyasını müsbət tənzimləyir [16, 17]. İnfeksiyadan əvvəl NPR1 proteini sitoplazmada oksidləşmiş oliqomerik formada olur [17]. Patogenlər yoluxduqdan sonra SA yığılması hüceyrədaxili redoks potensialının dəyişməsinə gətirib çıxarır ki, bu da NPR1-in nüvəyə köçürülməsinə və çoxsaylı patogenezlə əlaqəli (PR) genləri aktivləşdirmək üçün TGA-bZIP transkripsiya faktorları ilə qarşılıqlı əlaqədə olmasına imkan verir [18, 19]. Həddindən artıq ifadə AtNPR1 və ya onun ortoloqları transgenlərdə xəstəliyə qarşı müqaviməti artırır A. thaliana [13], yerkökü [20], sitrus [21], alma [22] və üzüm [23] bitkiləri. Bununla belə, NPR1-in bitkilərin abiotik stresə reaksiyasında təsiri haqqında məlumat hələ də məhduddur [24]. Son hesabatda A. thaliana göstərdi ki, AtNPR1 HSFA1 faktorları ilə qarşılıqlı təsir göstərərək soyuqlara uyğunlaşma prosesində iştirak edir [24]. NPR1-dən asılı SA siqnal yolu duz və oksidləşdirici stresslərə qarşı dözümlülüyün artırılması üçün çox vacibdir. A. thaliana [25]. Heteroloji ifadəsi AtNPR1 tütün bitkisində oksidləşdirici stresə qarşı dözümlülüyü artıra bilər [26]. Üstəlik, bastırılmış MdNPR1 transkripsiya quraqlıqla müalicə olunan alma ağaclarının yarpaqlarında göstərilir [27]. Bunun əksinə olaraq, həddindən artıq ifadə AtNPR1 düyüdə duz və quraqlıq streslərinə qarşı həssaslıq göstərdiyi göstərilir [28]. Göründüyü kimi bu ziddiyyətli nəticələr rolunu şübhə altına alır NPR1 bitki quraqlığa dözümlülük vasitəçiliyində gen.

Pomidor böyük qida və kommersiya dəyərlərinə görə çox məşhur bir məhsuldur və gen funksiyasını öyrənmək üçün də tez-tez istifadə olunur [29]. Beləliklə, funksiyası haqqında anlayışımızı daha da təkmilləşdirmək NPR1 bitkilərdə xarakterizə etmək lazımdır SlNPR1Pomidor bitkisinin quraqlığa dözümlülüyündə funksiyaları. Bu araşdırmada təcrid etdik SlNPR1 pomidordan 'Ailsa Craig', onun bütün bitki toxumalarında və quraqlıq stressi altında ifadə profilini araşdırdı. Kümelenmiş müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrarlar (CRISPR)/ CRISPR ilə əlaqəli protein-9 nukleaz (Cas9) texnologiyası yüksək səmərəliliyi, aşağı qiyməti və aşağı qiymətinə görə fundamental elmdə, tibbdə və kənd təsərrüfatında müxtəlif tədqiqat və kommersiya inkişafı sahələrində istifadə edilmişdir. və dizayn çevikliyi [30]. Funksiyasını proqnozlaşdırmaq üçün bioinformatik analizindən istifadə etdik SlNPR1, və sonra yaradıldı slnpr1 CRISPR/ Cas9 sistemindən istifadə edən mutantlar. Bundan əlavə, vasitəçiliyi ilə mümkün tənzimləmə mexanizmini kəşf etmək SlNPR1, quraqlığa dözümlülüyünü müqayisə etdik slnpr1 stomatanın bağlanması, membranın zədələnməsi, antioksidant-ferment fəaliyyəti və quraqlıqla əlaqəli gen ifadəsini təhlil edərək, mutantlar (L16, L21 və L62) və yabanı tip (WT) bitkiləri fizioloji və molekulyar səviyyədə. Bu nəticələr əsas haqqında məlumat verir SlNPR1 Pomidor bitkilərində vasitəçilik quraqlığın tənzimləmə mexanizmi.


Novartis PARKİN nəzarətini təkmilləşdirməyə diqqət yetirir

Keçən həftə, hər kəs Milad bayramına hazırlaşarkən, Novartis əczaçılıq şirkətinin tədqiqatçıları PARKIN (və ya PARK2) adlı Parkinson xəstəliyi ilə əlaqəli bir gen haqqında yeni araşdırma dərc etdilər.

PARKIN aktivləşdirilməsi ilə məşğul olan zülalları müəyyən etmək üçün böyük bir tarama işi aparmaq üçün CRISPR adlı yeni bir gen tənzimləmə texnologiyasından istifadə etdilər.

Bugünkü yazıda biz PARKIN-in nə etdiyinə baxacağıq, araşdırma hesabatını nəzərdən keçirəcəyik və bu nəticələrin Parkinson cəmiyyəti üçün necə çox faydalı ola biləcəyini müzakirə edəcəyik.

Parkinson cəmiyyətindəki bir çox insanın bildiyi kimi, 2017-ci il Ceyms Parkinson tərəfindən Parkinson xəstəliyi haqqında ilk hesabatın 200-cü ildönümünü təmsil etdi.

Bu həm də Parkinson xəstəliyinin inkişaf riskini artıran ilk genetik mutasiyanın (və ya variantın) kəşfinin 20-ci ildönümüdür. Bu genetik variasiya ‘alfa sinuklein’ adlanan DNT (bir gen) bölgəsində baş verir. Bəli, Parkinson xəstəliyində belə kritik rol oynayan eyni alfa sinüklein (20-ci ildönümü haqqında daha çox oxumaq üçün buraya klikləyin).

2018-ci ildə Parkinsonla əlaqəli ikinci genetik variasiyanın 20-ci ildönümünü qeyd edəcəyik.

Bu gen PARKIN adlanır:

Başlıq: Parkin genindəki mutasiyalar otosomal resessiv gənc parkinsonizmə səbəb olur.
Müəlliflər: Kitada T, Asakawa S, Hattori N, Matsumine H, Yamamura Y, Minoshima S, Yokochi M, Mizuno Y, Shimizu N
Jurnal: Təbiət. 1998 9 aprel 392 (6676): 605-8
PMID: 9560156

1998-ci ildə yapon tədqiqatçıları bu hesabatı gənc yaşda başlayan Parkinson xəstəliyindən təsirlənən 4 yapon ailəsindən olan 5 fərd əsasında dərc etdilər. 1-ci ailədə zərər çəkmiş şəxs 43 yaşlı qadın idi, birinci əmisi oğlu valideynlərindən doğulmuşdur və onun iki kiçik qardaşı sağlamdır. Onun vəziyyəti yeniyetmələrində diaqnoz qoyuldu və sonradan çox yavaş irəlilədi. Onun L-dopaya reaksiyası çox müsbət idi, lakin L-dopanın yaratdığı diskineziya tez-tez olurdu. 2-4-cü ailədə təsirlənmiş fərdlər (qohum olmayan valideynlərdən doğulmuş) 1-ci ailədəki mövzuya çox oxşar klinik əlamətlər nümayiş etdirdilər. Başlanma yaşı 18-27 yaş arasında idi.

Əvvəlki tədqiqatlardan və müxtəlif üsullardan istifadə edərək, müstəntiqlər təsirlənmiş 5 fərd arasında paylaşılan genetik variasiyaları təcrid edə bildilər. Nəticədə 465 amin turşusu zülalını kodlayan 2960 baz cütü olan DNT hissəsinə qədər axtarışlarını daraltdılar.

Bu proteini PARKIN adlandırmağa qərar verdilər.

Parkinson xəstəliyinin nə qədəri genetikdir?

Parkinson xəstəliyindən əziyyət çəkən insanların təxminən 15%-nin ailə tarixi var – baba, xalası və ya əmisi oğlu.

Hal-hazırda Parkinson xəstəliyi hallarının təxminən 10-20%-i xəstəliyin inkişaf riskini daha yüksək qiymətləndirən genetik dəyişikliklərlə izah edilə bilər. 'Yetkinlik yaşına çatmayan' (20 yaşın altında diaqnoz qoyulur) və ya 'erkən başlayan' Parkinson xəstəliyi olan (40 yaşın altında diaqnoz qoyulmuş) insanlarda genetik dəyişikliklər əksər hallarda, sonrakı başlanğıc hallarda (& gt40 yaş) yaş) genetik variasiyaların tezliyi daha çox dəyişkəndir.

Parkinson xəstəliyinin genetikasına dair çox yaxşı OPEN ACCESS icmalı üçün buraya klikləyin.

Mütləq DNT bölgələri var ki, orada genetik varyasyonlar Parkinson xəstəliyinə tutulma riskini artıra bilər.

Bu bölgələr adlanır PARK genləri.

PARK nədir genes?

Hal-hazırda Parkinson xəstəliyi ilə səbəb-əlaqələri olan mutasiyaları ehtiva edən DNT-nin 23 bölgəsini bilirik. Bu bölgələrə PARK genlərinin adı verilmişdir. Bölgə həmişə müəyyən bir genə istinad etmir, məsələn, köhnə dostumuz alfa sinuklein vəziyyətində, DNT uzantısında alfa sinüklein adlandırdığımız iki PARK gen bölgəsi var. Odur ki, lütfən, hər PARK genini xüsusi bir gen kimi düşünməyin.

Bundan əlavə, bir PARK genində Parkinson xəstəliyinin inkişaf riski ilə nəticələnə bilən çoxlu genetik varyasyonlar ola bilər. Artan risk həmişə PARK gen bölgəsində müəyyən bir mutasiyanın nəticəsi deyil.

PARKIN PARK2 adlanır.

PARKIN genində mutasiya harada yerləşir?

Beləliklə, burada işlər bir az daha mürəkkəbləşir.

Parkinson xəstəliyi ilə əlaqəli tək bir genetik variasiya yoxdur. Əslində, hazırda PARKIN genində erkən başlanğıc Parkinson xəstəliyinə səbəb ola biləcək 10 ümumi mutasiya var. PARKIN müxtəlif xərçəng növləri ilə də əlaqələndirilmişdir - xərçənglə əlaqəli 13 variant var. Əhəmiyyətlisi, yalnız iki Parkinsonla əlaqəli variantlar xərçəng riskinin artması ilə əlaqələndirilir (onlar R24P və R275W – aşağıdakı şəkildəki qırmızı+qara ox başları).

PARK2 Xərçəng və PD ilə əlaqəli mutasiyaların müqayisəsi. Mənbə: Təbiət

Beləliklə, mutasiyanızın harada olduğunu dəqiq bilmək vacibdir, əgər sizdə varsa. R24P və R275W mutasiyanız varsa, bu, müəyyən bir xərçəngə yoluxacağınız demək deyil. Bu, sadəcə olaraq, ona bir az daha çox meylli olduğunuzu göstərir. Buna görə də bunu bilmək və mütəmadi olaraq yoxlamalardan keçmək yaxşıdır.

PARKIN nə edir?

PARKIN zülalının hüceyrə daxilində çoxlu funksiyaları var. Lakin o, ilk növbədə hesab olunur E3 ubiquitin ligaza – bu adlanan bir prosesdə iştirak edən bir neçə fermentdən biridir ubiquitination.

Ubiquitination nədir?

Ubiquitin kiçik bir proteindir, adından da göründüyü kimi, bütün hüceyrələrdə mövcuddur və hüceyrə biologiyasının bütün aspektlərinə təsir göstərir. PARKIN kimi fermentlər ubiquitini xüsusi zülallara bağlayır (zülal ubiquitinasiya prosesindən keçir) və bunun həmin zülal üzərində fərqli təsiri var. Ubiquitination bir zülalın fərqli bir hüceyrə yerinə köçürülməsinə səbəb ola bilər və ya bu protein üçün fəaliyyət səviyyəsinə təsir göstərə bilər və hətta müxtəlif zülallar arasında müəyyən qarşılıqlı əlaqəni təşviq edə və ya qarşısını ala bilər.

Lakin ubiquitinasiya ilə bağlı ən çox öyrənilən proses müəyyən zülalların utilizasiya üçün işarələnməsidir. Müəyyən bir şəkildə ubiquitin ilə etiketlənmiş bir zülal utilizasiya üçün göndəriləcək və adlanan strukturda parçalanacaq. Proteazom:

PARKIN Ubiquitin-E3 addımında iştirak edir. Mənbə: 2bscientific

Ubiquitin Proteasome yolunun daha ətraflı izahı üçün Şotlandiya Müəssisəsi tərəfindən təqdim olunan bu videoya baxın:

Yaxşı, amma siz dediniz ki, PARKIN zülalının çoxlu funksiyaları var. Başqa nə edir?

Köhnə və ya funksional olmayanların atılması prosesi ilə də məşğul olur mitoxondriya.

M itochondria –, siz əvvəlki SoPD yazılarından xatırlayırsınız –, hər bir hüceyrənin elektrik stansiyalarıdır. Onlar işıqları yandırmağa kömək edirlər. Onsuz partiya bitər və hüceyrə ölür.

Mitoxondriya və onların hüceyrədəki yeri. Mənbə: NCBI

Liseyin biologiya dərsindən xatırlaya bilərsiniz ki, mitokondriya hüceyrə daxilində kiçik lobya şəkilli cisimlərdir. Onlar qidadan qida maddələrinə çevrilirlər Adenozin trifosfat (və ya ATP). ATP hüceyrələrin işlədiyi yanacaqdır. Enerji təchizatındakı kritik rolunu nəzərə alaraq, mitoxondriyalar çoxdur (bəzi hüceyrələr minlərlədir) və hüceyrə daxilində yüksək səviyyədə təşkil olunur və lazım olan yerə köçürülür.

Siz, mənim və həyatdakı bütün başqa şeylər kimi, mitoxondriyanın da istifadə müddəti var.

Zamanla mitoxondriyalar köhnəldikcə (və ya zədələndikcə) hüceyrə onları təkrar emal edəcək. mitofaqiya (sözlərin qarışığı mitoxondriyaautofagiya – hər bir hüceyrənin tullantı atma sistemi).

PARKIN mitofagiyada mühüm rol oynayır.

PARKIN Mitofagiyada nə edir?

PARKİN adlı başqa bir Parkinsonla əlaqəli zülalla qarşılıqlı əlaqədə olur PINK1.

PINK1 mitoxondriyanın səthində bir növ tutacaq kimi fəaliyyət göstərir. Normal, sağlam mitoxondriyada PINK1 zülalı mitoxondriyanın səthinə yapışır və o, səthdən tamamilə yox olana və parçalanana qədər yavaş-yavaş udulur. Sağlam olmayan mitoxondriyalarda isə bu proses maneə törədilir və PINK1 mitoxondriyanın xarici səthində yığılmağa başlayır.

Mitoxondriyanın səthindən çıxan çoxlu tutacaqlar.

İndi, əgər PINK1 bir tutacaqdırsa, o zaman PARKIN PINK1 sapından tutmağı sevən bayraqdır. PINK1 mitoxondriyanın səthinə məruz qaldıqda PARKIN zülalını tutmağa başlayır. Bu cütləşmə (bir qədər ubiquitination ilə birlikdə) hüceyrəyə bu xüsusi mitoxondrinin (tək) sağlam olmadığına və çıxarılmalı olduğuna dair bir siqnaldır.

Normal (sağda) və qeyri-sağlam (solda) vəziyyətlərdə Pink1 və Parkin. Mənbə: Hindawi

Normal PINK1 və ya PARKIN zülalları olmadıqda, tutacaq-bayraq sistemi yoxdur və xəstə/zədələnmiş mitoxondriyalar yığılmağa başlayır. Onlar lazımi şəkildə atılmır və nəticədə hüceyrə xəstələnir və nəticədə ölür.

Mitofagiya ilə yanaşı, PARKIN həm də şiş bastırıcı zülal kimi çıxış edə bilər, yəni o, hüceyrələrin çox sürətlə və ya nəzarətsiz şəkildə böyüməsinin və bölünməsinin qarşısını alır (Bu barədə ətraflı oxumaq üçün buraya klikləyin). Və PARKIN həmçinin sinir hüceyrələrindən kiçik nörotransmitter kisələrinin (sinaptik veziküllər adlanır) tədarükünü və sərbəst buraxılmasını tənzimləyə bilər (Bu barədə ətraflı oxumaq üçün buraya klikləyin).

PARKIN mutasiyası necə yaranır?

PARK2 ilə əlaqəli Parkinson xəstəliyinin yetkinlik yaşına çatmayan forması səbəb olur. autosomal resessiv mutasiya – o deməkdir ki, vəziyyətin inkişafı üçün mutasiyanın bir nüsxəsi hər iki valideyn tərəfindən təmin edilməlidir.

Autosomal resessiv genetik köçürmə. Mənbə: Vikipediya

OK, nə var Novartisin bu yaxınlarda dərc etdiyi bu araşdırma?

Bu, CRISPR adlı yeni gen redaktə texnologiyasını əhatə edir.

CRISPR nədir?

Mən əvvəllər CRISPR-in arxasındakı elmi izah edən uzun bir yazı yazmışdım (Onu oxumaq üçün bura klikləyin).

Qısaca, Cparıldadı Rmüntəzəm olaraq Iboşluq Short Palindromik Repeats (və ya CRISPR) pis viruslardan infeksiyaya qarşı cəbhədə müdafiə mexanizmi təşkil edən xüsusi bakteriyalarda aşkar edilmiş DNT-nin təkrarlanan ardıcıllığıdır (dəqiq təkrarlar).

Bakteriyaya yoluxma zamanı faj (bakteriyaları yoluxduran virus) DNT-ni hüceyrəyə yeridəcək. Bu DNT iki zülal (Cas1 və Cas2 adlanır) tərəfindən xarici DNT olaraq tanınacaq və onu kiçik parçalara ayıracaq, sonra bakterial DNT -yə (CRISPR lokusu olaraq adlandırılan bölgəyə) daxil edəcəklər. Və DNT-yə daxil olduqdan sonra, bu CRISPR lokusu, əgər bakteriya bölünməyə qərar verərsə, başqa hüceyrələrə ötürülə bilər.

DNT -nin CRISPR bölgələri mütəmadi olaraq transkripsiya olunur (bu, RNT istehsal prosesidir). Hər bir boşluq bölgəsi üçün RNT deyilir crRNA (CRISPR-RNA) və bu, əsasən, ardıcıllığı fag DNT bölgəsinə uyğun gələn kiçik bir RNT molekuludur. Bu crRNA daha sonra başqa bir RNA parçasına bağlanaraq a adlandırılır tracrRNA.

Bu tracrRNA daha sonra Cas9 zülalına qoşulur və onlar birlikdə həmin crRNA-nı yoxlamaq üçün DNT hissələrini axtaran bakteriyaların ətrafında dolaşmağa başlayırlar. Patrul vəzifəsində dolaşan gözətçi kimi həbsxanada problem əlaməti axtarır.

CRISPR bakteriyalarda necə işləyir. Mənbə: Sciencedirect

Bir saniyə gözləyin. Cas9 nədir?

Cas9 (və ya CRISPR kimiassosiasiya edilmiş protein 9) tapmacanın vacib hissəsidir. Sehrli olan zülaldır.

Endonükleaz nədir?

Yuxarıda təklif etdiyim kimi, DNT-nin təkrarlanması heç vaxt mükəmməl olmur və bəzən səhvlər olur. Milyonlarla illik təkamül hüceyrələr daxilində çox mürəkkəb, lakin son dərəcə təsirli bir DNT monitorinq sistemini yaratdı. Bu prosesdə çoxlu müxtəlif zülallar iştirak edir və endonükleazlar mühüm rol oynayır.

Endonükleazlar DNT-yə bağlanan və onu kəsən bir fermentdir. Əhəmiyyətli olan odur ki, DNT zəncirinin ortasında fəaliyyət göstərir, digər ferment sinfi (eksonükleazlar adlanır) zəncirlərin sonundan fəaliyyət göstərir.

Yəni Cas9 DNT zəncirinin ortasında DNT-ni kəsə bilən bir fermentdir?

Tam olaraq. Və bunu bakterial DNT-nin CRISPR bölgələrindən istehsal olunan RNT parçaları (yuxarıda qeyd olunan crRNA) rəhbər tutaraq çox məqsədyönlü şəkildə edir. İndi crRNA tez-tez "bələdçi RNT" adlanır.

Cas9 zülalının DNT ilə qarşılıqlı əlaqəsi. Mənbə: Stackexchange

Müəyyən bir Cas9 fermenti tracrRNA ilə qüvvələri birləşdirirsə və sonra bakteriyaların içərisində üzən uyğun bir fag DNT parçası tapırsa, o zaman bakteriyalar bu xüsusi növ fagın onu yoluxdurduğunu biləcəklər və faj DNT-si tez bir zamanda məhv edilməlidir. . Əlavə etməliyəm ki, bu bakteriyalar üçün şüurlu bir proses deyil - sadəcə olaraq bakteriyaları qorumağa kömək edən qazanılmış, avtomatik immun cavabdır.

Maraqlıdır ki, sıralanan bakteriyaların yalnız 40% -i və arxeanın 90% -i (bakteriyalardan ayrı olan tək hüceyrəli orqanizmlər) bu CRISPR-Cas9 sisteminə malikdir. Bakteriya dünyasının qalan hissəsinin özlərini fag və digər iyrənc xəstəliklərdən necə qoruduğu çox böyük tədqiqatların aparıldığı bir sahədir.

Maraqlı səslənir, amma bu insanlara necə tətbiq olunur?

Köhnə vaxtlarda (2013-cü ili düşünün) iki tədqiqat hesabatı CRISPR-Cas9 sisteminin insan hüceyrələrində uğurla istifadə edildiyini bildirdi:


Başlıq: CRISPR/Cas sistemlərindən istifadə edərək multipleks genom mühəndisliyi.
Müəlliflər: Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F.
Jurnal: Elm. 2013 fevral 15339(6121):819-23.
PMID: 23287718 (Oxumaq istəyirsinizsə, bu məqalə AÇIQ ACCESS-dir)


Başlıq: Cas9 vasitəsilə RNT-yə rəhbərlik edən insan genomu mühəndisliyi.
Müəlliflər: Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM.
Jurnal: Elm. 2013 Fevral 15339(6121):823-6.
PMID: 23287722 (Bu məqaləni oxumaq istəyirsinizsə AÇIQ ERİŞİMdir)

Bu iki araşdırma hesabatında tədqiqatçılar iki fərqli bakteriyadan bir CRISPR bölgəsi götürdülər Streptococcus thermophilusStreptococcus pyogenes, və daha sonra həmin CRISPR bölgəsinə müəyyən insan geni üçün spacers/crRNA hazırlayıb daxil etdilər. Daha sonra bu CRISPR bölgəsini və Cas9 zülalını insan hüceyrələrinə daxil etdilər və həmin genlə nə baş verəcəyini izlədilər.

Nəticələr çox aydın idi - insan DNT -nin çox dəqiq düzəldilməsini nümayiş etdirmişdilər.

Və bu tapıntıların dünyanı sözün əsl mənasında dəyişdirdiyini söyləmək saxta xəbər deyil.

2013-cü ildən CRISPR-Cas9 bütün dünyada laboratoriyalarda gündəlik müzakirə olunan mövzuya çevrilib. Biotibbi tədqiqatda hər kəs indi bu texnologiyanı işlərinin bəzi aspektlərinə daxil etməyə çalışır. Və yanaşma çox sadələşdirildi: indi tədqiqatçılar sadəcə hüceyrəyə mutasiya etmək istədikləri hədəf gen üçün Cas9 zülalını və xüsusi bələdçi RNT -lərini daxil edir və sonra qalanını hüceyrəyə buraxırlar.

Və CRISPR-Cas9 texnologiyası da alternativ funksiyaların tətbiqinə imkan vermək üçün müxtəlif üsullarla yenidən işlənib. Məsələn, Cas9 zülalı yenidən dizayn edilmişdir ki, DNT-ni kəsmək əvəzinə, Cas9 zülalı indi DNT-nin bələdçiRNA olmağa yönəldilmiş bölgəsini aktivləşdirir (Bu barədə ətraflı oxumaq üçün buraya klikləyin).

Texnologiyanın potensialının həqiqətən olduğunu yazarkən şişirtdiyimi düşünmürəm sərhədsiz (Cell press-də bu faktı vurğulayan müxtəlif OPEN ACCESS məqalələrini oxumaq üçün buraya klikləyin). Bizi məhdudlaşdıran yeganə amil təsəvvürümüzdür.

Bəs biz bu texnologiyanı Parkinson xəstəliyi üçün necə istifadə edə bilərik?

CRISPR-Cas9 texnologiyasının Parkinson xəstəliyindən əziyyət çəkən insanlara çatdırılması gələcəkdə uzun bir yol olsa da (ümumiyyətlə mümkündürsə), bu texnologiyanın cəmiyyət üçün faydalı təsirləri ilə tətbiq oluna biləcəyi çoxlu üsullar hələ də mövcuddur.

Novartis əczaçılıq şirkətinin tədqiqatçıları bu yaxınlarda PARKIN geninin müsbət və mənfi tənzimləyicilərini müəyyən edərək bunun çox gözəl nümunəsini təqdim etdilər.

İşdə onların araşdırma hesabatı:


Başlıq: PARKIN tənzimləyiciləri üçün genom miqyaslı CRISPR ekranı mitofagiyanın determinantı kimi transkripsiya repressiyasını aşkar edir.
Müəlliflər: Potting C, Crochemore C, Moretti F, Nigsch F, Schmidt I, Manneville C, Carbone W, Knehr J, DeJesus R, Lindeman A, Maher R, Russ C, McAllister G, Reece-Hoyes JS, Hoffman GR, Roma G, Müller M, Sailer AW, Helliwell SB.
Jurnal: Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 dekabr 21. pii: 201711023.
PMID: 29269392 (Oxumaq istəyirsinizsə, bu tədqiqat hesabatı AÇIQ ACCESS-dir)

Novartis tədqiqatçıları öz araşdırmalarında ilk olaraq PARKIN geni aktivləşdirildikdə yaşıl flüoresan zülal istehsal edən bir hüceyrə hazırladılar. Daha sonra həmin hüceyrələrə Cas9 zülalını daxil etdilər. Sonra hüceyrələri böyük bir virus hovuzu ilə yoluxdurdular - bir kritik fərq istisna olmaqla, viruslar eyni idi: hər bir virusun tək bələdçiRNT-si var idi. Böyük viruslar hovuzunun kollektiv olaraq 18.360 geni əhatə edə biləcək qədər bələdçi RNT -ləri var idi (əslində hər bir gen üçün orta hesabla beş bələdçi RNT var idi) və bir çox virus. BÖYÜK hovuz!

Hüceyrələri yoluxdurduqdan sonra, hər bir hüceyrə yalnız bir virus alsın, tədqiqatçılar hüceyrələri 8 gün ərzində mədəniyyətdə böyütdülər və sonra hüceyrələri yaşıl flüoresanlıq səviyyəsinə görə sıraladılar. Hüceyrə nə qədər yaşıl olarsa, bir o qədər PARKIN aktivləşir. Yaşıl flüoresan yoxdur, PARKIN aktivasiyası yoxdur. Onlar həmçinin CRISPR prosedurunun zamandan asılı mümkün təsirlərini nəzərə almaq üçün hüceyrə mədəniyyətində 15 gündən sonra bu analizi etdilər.

Yaşıl flüoresanlığın ən aşağı 25%-ni və ən yüksək 25%-ni daşıyan hüceyrələr hüceyrədə hansı bələdçiRNA-ların mövcud olduğunu müəyyən etmək üçün analiz edilib. Bu təhlil sonda tədqiqatçılara PARKIN-in 53 müsbət və mənfi tənzimləyicisinin siyahısını verdi. Aşağıdakı şəkildə RNT -ləri hədəf alan genləri görə bilərsiniz. CRISPR-Cas9 tərəfindən mutasiya edildikdə daha az yaşıl floresan zülal (PARKIN aktivləşməsi yoxdur) ilə nəticələnən sol ad genlərindəki qrafiklər və sağdakı qrafiklər yaşıl flüoresan zülal səviyyələrini artıran genləri (daha çox PARKIN aktivasiyası) adlandırır. Qeyd edək ki, PARK2 (və ya PARKIN) sol tərəfdəki hər iki qrafikdə mövcuddur, yəni PARKIN mutasiyaya uğradıqda PARKIN daha az aktivləşir.

Novartis tədqiqatçıları xüsusilə üç geni sıfırladılar – THAP11, HCFC1, və ya OGT – ki, mutasiyaya uğradıqda daha çox yaşıl flüoresan zülal (və ya daha çox PARKIN aktivləşməsi) ilə nəticələnir. Bu üç genin hamısı həm 8 gün, həm də 15 günlük analizdə mövcud olub və bu, onların PARKİN-in mənfi tənzimləyiciləri olduğunu göstərir. Və nəzərə alsaq ki, əvvəlki araşdırma faktiki olaraq THAP11-in tükənməsinin yüksək səviyyələrə səbəb olduğunu bildirdi PARK2 (Həmin hesabat üçün bura klikləyin) tədqiqatçılar diqqətlərini THAP11-ə yönəldiblər.

Tədqiqatçılar müxtəlif hüceyrə növləri (insan beyni hüceyrə xətləri daxil olmaqla) ilə təcrübə aparmağa başladılar və THAP11 olmadıqda, PARKIN tərəfindən işlənmiş ubiquitin səviyyələri kimi PARKIN səviyyələrinin artdığını qeyd etdilər. Sonra hüceyrələrdə mitoxondrial zədələnməyə səbəb oldular və PARKIN səviyyələrinin və PARKIN tərəfindən işlənmiş ubiquitin səviyyələrinin nəzarət hüceyrələri ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artdığını aşkar etdilər, bu da THAP11-i inhibə edən bir dərmanın Parkinson xəstəliyi kimi bir vəziyyətdə PARKIN səviyyələrini artırmaq üçün yeni bir terapevtik yanaşma təqdim edə biləcəyini göstərir. 8217s.

Bütün bunlar nə deməkdir?

Parkinson xəstəliyi mitoxondrial disfunksiya və hüceyrə tullantılarının utilizasiyası da daxil olmaqla bir çox müxtəlif bioloji yollarda problemlər ilə xarakterizə olunur (autofagiya). Bu proseslərdə iştirak edən genləri aktivləşdirmək üçün nəzərdə tutulmuş dərmanlar Parkinson xəstəliyinin gələcək müalicəsində çox faydalı vasitələr ola bilər.

Novartis əczaçılıq şirkətinin alimləri bu yaxınlarda tullantıların utilizasiyası və sağlam mitoxondrilərin saxlanması aspektlərində iştirak edən Parkinson xəstəliyi ilə əlaqəli PARKIN geninin müsbət və mənfi tənzimləyicilərini müəyyən etmək üçün apardıqları kütləvi skrininq tədqiqatının nəticələrini əks etdirən araşdırma dərc ediblər. Onların nəticələri iki mühüm məlumat verir:

  1. Bu cür skrininq tədqiqatlarının maraqlı məlumatlar verə biləcəyi prinsipinin sübutu və
  2. Parkinson modellərində sınaqdan keçirilə bilən inhibitorlar hazırlamaq üçün onlar üçün çox maraqlı hədəflərin siyahısı

Bu tədqiqatın sonrakı tədqiqatını görmək çox maraqlı olacaq (inşallah 2018-ci ildə, çünki burada təqdim olunan bütün maraqlı hədəflər üçün şübhəsiz ki, patentləri olacaq). Yuxarıda qeyd etdiyim kimi, PARKIN xərçənglə də əlaqəlidir, ona görə də bu geni tənzimləyən dərmanlar üçün böyük qazanc potensialı var və Novartis kimi şirkətlər bunu yaxşı anlayacaq və bu istiqamətdə çox səy göstərəcəklər.

Bu tədqiqat həm də Parkinson cəmiyyəti üçün CRISPR-Cas9 gen redaktə texnologiyasının güclü tətbiqini təmsil edir və 2018-ci ildə bu cür tədqiqatların daha çox olacağına çox az şübhəm var. Bəzi hallarda həmin tədqiqat Ümid edirəm ki, Parkinson xəstəliyinə qarşı istifadə oluna bilən, hazırda mövcud olan dərmanlarla hədəf alına bilən bioloji yolları müəyyən edəcək.

Bir çox maraqlı terapevtik hədəflər müəyyən edilmək üzrədir. Bu məkana baxın.


O, hər bir embrion in vitro gübrələmə yolu ilə yaradılandan dərhal sonra CRISPR aparatının genlərini əlavə etdi, lakin slaydı yaxından tədqiq edən bir neçə tədqiqatçı Nananın embrionu artıq bir hüceyrəli mərhələni keçdikdən sonra onun redaktəsini etdiyinə diqqət yetirdi. Bu o deməkdir ki, o, normal olan bəzi təsirlənməmiş hüceyrələri olan genetik bir "mozaika" ola bilər CCR5- və nəticədə HİV -dən heç bir müdafiə oluna bilməz.

İmmunoloq Philip Murphy rolunu kəşf etməyə kömək etdi CCR5 1996-cı ildə HİV infeksiyasında və 32 əsas cüt mutasiyanın HİV müqavimətini necə göstərdiyini göstərən erkən tədqiqatlar dərc edilmişdir. Merilend ştatının Bethesda Milli Allergiya və Yoluxucu Xəstəliklər İnstitutundan Murphy, CRISPR -in hər iki qızda düzəltməsinin gözlənilməz funksiyaları olan dəyişdirilmiş bir protein istehsal edərək zərər verə biləcəyinə dair xəbərdarlıq edir. "Bu, potensial hədəfdən kənar redaktə və effektlərdən daha az diqqət çəkən redaktənin potensial mürəkkəbliyidir" dedi Murphy.

CCR5 zülalı təbii olaraq immun sisteminin xəbərçisi olan kemokinlər üçün reseptor kimi fəaliyyət göstərir, lakin zülalın dəqiq təsiri sirli olaraq qalır. Murphy, 2005-ci ildə nəşr etdiyi bir siçan təcrübəsində, CCR5-in Qərbi Nil virusu ilə yoluxma zamanı beyinə vacib immun hüceyrələrin ticarətini təşviq etdiyini göstərdi. Bunu sonradan tapdı CCR5Δ32 bu virusa yoluxmuş homozigot insanlar digər insanlara nisbətən ağır ensefalit və hətta ölümə daha çox həssasdırlar. Bəzi siçan və insan araşdırmaları da bunu tapdı CCR5Δ32 homozigotlar qrip virusundan daha ağır simptomlar alır, lakin digər tədqiqatçılar ziddiyyətli epidemioloji təhlillərə işarə edərək, bu narahatlığı rədd edirlər.

Təkamülçü bioloqlar bu mutasiyanın Şimali Avropa populyasiyalarında niyə sağ qaldığını - Şərqi Asiyada demək olar ki, yoxdur - və bəziləri bunu bubon vəba və çiçək kimi bəlalara qarşı keçmiş sağ qalma üstünlükləri ilə əlaqələndirdilər. Lakin bu arqumentlər az təsir bağışladı. “HİV/QİÇS istisna olmaqla, bütün CCR5 xəstəlik assosiasiyalarının riskləri azalda bilmədən əvvəl əhəmiyyətli dərəcədə daha çox eksperimental dəstəyə ehtiyacı var. CCR5 inamla redaktə etmək,” Mörfi deyir.

olub olmadığını daha yaxşı anlamaq cəhdi ilə CCR5Δ32 homozigotlar Nielsen mutasiyasından hər hansı bir zərər gördü Təbiət Təbabəti Tədqiqat, İngiltərənin Biobankına sıralanmaq üçün könüllü olaraq DNT təmin edən 400.000 İngilis atasının yaşamasını təhlil edir. Araşdırma bunu müəyyən etdi CCR5Δ32 homozigotların 76 yaşa çatma ehtimalı əhalinin qalan hissəsinə nisbətən təxminən 20% daha az idi. "Dünyada ilk gen redaktə edilmiş körpələrin gənc ölmə ehtimalı daha yüksəkdir". The Teleqraf elan etdi.

Lakin insanlar tədqiqata orta hesabla 56,5 yaşında qoşulublar, belə ki, onun təkliflərinə baxmayaraq Teleqraf hesabat və nüfuzlu nəşrlərdəki bir çox digər xəbərlər - tədqiqat mutasiyanın gənclərin və ya 76 yaşdan yuxarı olanların sağ qalmasına təsir göstərdiyi barədə heç nə demir. CCR5Δ32 Araşdırmada homozigotlar indiyə qədər ölmüşdü. Üstəlik, Lulu aydın deyil CCR5Δ32 homozygote, so the findings don’t apply to her. As for Nana, she doesn’t have the 32-base-pair mutation, and her Chinese genetic background means any changes to CCR5 might have a different impact, anyway.

The speculation about the twins’ enhanced brain functions has even shakier support. Researchers showed in 2016 that knocking out one or both CCR5s in mice enhances their memory and cognition. A subsequent study that crippled CCR5 in mice found that, compared with control animals, the mutants recovered from strokes more quickly and had improved motor and cognitive functions following traumatic brain injury. The later study, in the 21 February issue of Hüceyrə, also included an analysis of 68 stroke patients who had one copy of CCR5 with the HIV resistance mutation it concluded they had improved recovery, too. Extrapolating from this work, the MIT Texnologiya İcmalı headlined a story “China’s CRISPR twins might have had their brains inadvertently enhanced.”

Neurobiologist Alcino Silva of UC Los Angeles, a co-author of both mouse studies, says his team’s findings “strongly suggest that the CCR5 manipulation changed cognitive function,” but the researchers have seen both positive and negative effects. “It is unfortunate that there is the misperception that we know how to engineer ‘smarter’ babies,” Silva says—a point the MIT Texnologiya İcmalı article does underscore. He concludes it is “way too early” to conduct experiments like the one He did. “We do not know enough, and the consequences can be disastrous,” he says.

Or the editing of CCR5 in Lulu and Nana could have no detectable consequences at all. With no one providing updates on the health of the children, that outcome, perhaps the most likely one, may never be headline news.


Mammalian cells are constantly subjected to a variety of DNA damaging events that lead to the activation of DNA repair pathways. Understanding the molecular mechanisms of the DNA damage response allows the development of therapeutics which target elements of these pathways. Double-strand breaks (DSB) are particularly deleterious to cell viability and genome stability. Typically, DSB repair is studied using DNA damaging agents such as ionising irradiation or genotoxic drugs. These induce random lesions at non-predictive genome sites, where damage dosage is difficult to control. Such interventions are unsuitable for studying how different DNA damage recognition and repair pathways are invoked at specific DSB sites in relation to the local chromatin state. The RNA-guided Cas9 (CRISPR-associated protein 9) endonuclease enzyme is a powerful tool to mediate targeted genome alterations. Cas9-based genomic intervention is attained through DSB formation in the genomic area of interest. Here, we have harnessed the power to induce DSBs at defined quantities and locations across the human genome, using custom-designed promiscuous guide RNAs, based on in silico predictions. This was achieved using electroporation of recombinant Cas9-guide complex, which provides a generic, low-cost and rapid methodology for inducing controlled DNA damage in cell culture models.

One of the most critical processes for living organisms is to maintain genome integrity using DNA damage surveillance and repair mechanisms. These mechanisms prevent cells from progressing through cell division, which would propagate the defective genome to daughter cells [1]. If lesions are not repaired, mutations can accumulate, leading to cell senescence, ageing and the onset of disease, such as cancer.

Approximately 10� double-strand breaks (DSBs) occur per cell cycle in human cells [2,3]. DSBs are considered one of the most genotoxic types of DNA damage because both DNA strands are severed, and thus any error in correctly re-joining the broken ends may lead to insertions, translocations, deletions and chromosome fusions that further promote genome instability [4]. Multiple competing repair programmes exist in order to repair such lesions, including error-free (homologous recombination (HR)) and error-prone (non-homologous end joining (NHEJ), mismatch-mediated end joining (MMEJ)) pathways [4]. The choice of which repair pathway is invoked depends on the nature of the break, on the local chromatin context and on cell cycle stage. When the nature or level of DNA damage is beyond repair, apoptotic mechanisms are activated [5]. This apoptotic response is frequently exploited by cytotoxic drugs such as bleomycin or cisplatin, which induce severe aberrations within the DNA structure. Understanding the mechanisms involved in pathway choice for DSB repair is crucial to develop targeted therapeutic interventions in cancer cells, as, for example, is the case of poly-ADP ribose polymerase (PARP) inhibitors in Brca1-deficient cancers [6].

In order to study DSB response mechanisms, damage must first be induced. To date, this has largely been achieved using untargeted genotoxic drugs and/or irradiation. While this allows some definition of how DSB repair varies according to cell type, it does not allow interrogation of how repair is influenced by local chromatin states, which can alter upon damage [7]. More targeted approaches have also been developed for the study of DSBs, reliant upon the inducible expression of restriction endonucleases that sever the DNA helix at specific locations. These experimental systems encompass the use of Ppol [8], SceI [9] and AsiSI enzymes [10]�h of which cuts the DNA in different locations, and which may be introduced to cells either transiently, or via genomic incorporation of an inducible transgene. In particular, inducible expression of AsiSI using the DSB Inducible via AsiSI (DiVA) cell line has been instrumental in beginning to unpick the complexity of DNA repair pathway choice in different genomic contexts [10].

However, each of these systems only addresses a very limited selection of chromosome regions due to the requirement for specific restriction enzyme cut sites. SceI is a mega-nuclease with no endogenous recognition site in mammalian genomes, and thus its target sequence must be transgenically introduced into the desired location in the genome. Ppol has several recognition sites within ribosomal RNA repeats and thus only allows the study of the nucleolar DNA damage response. AsiSI is methylation-sensitive and cuts at non-methylated CpG-rich sequences, which are primarily located at promoters and enhancers [10]. There is an urgent need within the field to expand the toolbox to allow wider interrogation of DNA responses in different chromatin contexts, and𠅎qually importantly𠅍ifferent cell types.

Therefore, we wished to design a methodology to induce a tuneable number of DSBs in a broad range of genomic contexts. This can be used to probe the context specificity of DNA damage responses and pathway choice. Programmable endonucleases such as Transcription activator-like effector nucleases (TALENS) or Zinc finger nucleases (ZFNs), and CRISPR-Cas9, have all been widely used to allow DSB induction at arbitrary genomic loci. However, typically, these programmed approaches are designed to generate a single DSB at a single specific site for the purpose of gene targeting, with broader induction of DNA damage seen as a disadvantage [11,12,13,14,15]. Here, in contrast, we use electroporation of recombinant Cas9 and synthetic promiscuous guide RNAs to introduce multiple DSBs in mammalian cell culture, with both the number of breaks and the desired target context being tuneable (Figure 1A). This will allow us to assess the DNA damage response across a wide range of damage severity, at specified genomic locations, in any electroporatable cell type.


Challenges: Why Real Engagement on CRISPR Has Remained So Elusive

Regardless of any potential pitfalls, the mandate for public engagement is difficult to ignore. CRISPR is a prime example of postnormal science. Decision stakes are high, and margins of error are thin, especially once we cross the bright red line of editing the human germline and begin making edits heritable. At the same time, CRISPR raises a host of ethical, social, and regulatory conundrums that all introduce systems uncertainty that make it difficult to map the best paths forward.

This makes effective public engagement more important than ever before. Outside of the United States, increasing pressure to engage different publics on CRISPR has led to sporadic efforts, often funded or led by philanthropic organizations such as the United Kingdom’s Wellcome Trust. However, sporadic efforts likely will not be enough, and the question remains as to why increasing calls for action have not led to broader investment in sustainable infrastructures for public engagement, especially with an eye toward informing policy and rulemaking on technologies like CRISPR. We argue that at least three influences have slowed progress on this front and require attention from the scientific and policy-making community.

No One-Size-Fits-All Models: The Need for Systems Thinking.

Even if incentive systems and infrastructures were in place, a second challenge for scalable public engagement exercises remains: the absence of a single modality of engagement (Fig. 2) that can be deployed across intended outcomes and contexts. As a result, there are no blueprints with universal or even broad applicability. This does not mean, of course, that there are no commonalities. Public engagement efforts often share overlapping goals and, in many cases, try to adhere to the principles outlined in Fig. 2. But the concrete modalities employed by sponsors of public engagement exercises vary across at least five different dimensions: 1) intended outcomes, 2) (the stage of) the issue/controversy, 3) social and policy contexts, 4) intended participants/stakeholders, and 5) resources available.

Engagement exercises designed to create a consensus report on policy options, for instance, will require input from (and representation of) very different stakeholders than public engagement exercises with patient groups that are designed to cocreate agendas for developing CRISPR-based therapies. Similarly, engaging small groups of highly interested publics can help flag concerns or unintended outcomes early in the issue cycle. Those types of upstream initiatives, however, require a very different level of resources and attention to political context compared to public engagement later in the issue cycle, when visible public conflicts about values and other political considerations have already shaped the opinion landscape.

Designing effective public engagement, therefore, involves careful calibration along the five dimensions outlined above (and potentially more). Realistically, scientists and other sponsors of public engagement exercises have control over only some of the dimensions, such as timing, intended outcomes, or available resources. This makes it even more important to design public engagement exercises that are responsive—in both content and modality—to the realities of the policy environments, consumer concerns, or societal debates they are trying to inform. We thus need to apply integrated systems thinking (54) to improve our “science of public engagement.” Effective public engagement on CRISPR and other emerging genome editing technologies, in other words, will require sustained interdisciplinary collaborations across the social sciences and natural sciences to develop and evaluate modalities for public engagement that are responsive to stakeholder needs and designed to maximize intended outcomes.

The Need to Build Infrastructures and Incentive Structures for Scientists.

A second challenge involves incentive systems and infrastructures related to public engagement for scientists within academia, government, and the private sector. While industry scientists likely have a different balance between research and other responsibilities as compared to their academic colleagues, for example, there are no obvious incentives for either group to add public engagement to their existing workload. In fact, the absence of easy-to-follow blueprints for public engagement and the level of controversy that can surround engagement efforts (52) likely serve as disincentives for scientists worried about their personal careers. It is therefore both surprising and encouraging to see signs of a sea change.

In a recent large-scale census survey of science faculty at 73 colleges and universities within the US land-grant system, “a majority … indicated that pursuing public engagement activities is highly important to them, with younger science faculty … placing significantly higher importance on such activities” (55). The same survey, however, also showed very mixed perceptions of how valued public engagement and related activities were among colleagues and administrators at their university. Building both infrastructures for sustained public engagement and incentive structures for scientists to become active participants in these infrastructures is therefore in the self-interest of scientific institutions. Aside from achieving the goals for public engagement we discuss in Fig. 2, there may also be some collateral benefits from public engagement. As a report on a 2015 meeting at the University of Michigan on academic engagement in public and political discourse put it, “If academia does not embrace the opportunity represented by public engagement it runs the risk of losing the best and brightest young scholars who ‘want to make a difference’ through their work, further reducing diversity in its ranks” (56). Engagement, in other words, has to become part of the DNA of academic institutions.

Even if an openness to engage with public stakeholders were to become more prevalent among the scientific community, there are few existing mechanisms that scientists can easily leverage to get such efforts off the ground. This problem is further exacerbated by the fact that COVID-19 has made it impossible for scientists to utilize the face-to-face mechanisms that are in place in the foreseeable future. Building infrastructure—both offline and online—is therefore imperative. And models for doing this do exist. Anticipating a need for both academic and societal infrastructures to foster broader societal debates about emerging technologies, the US NSF funded two large collaborative Centers for Nanotechnology in Society in 2005 to study the ethical, legal, economic, and policy implications of the relatively new, nature-altering science called nanotechnology.

Calling for a similar harnessing of the work of social scientists, ethicists, bench scientists, and other societal stakeholders to help guide societal responses to CRISPR, some scholars have proposed the idea of “a global observatory for gene editing, as a crucial step to determining how the potential of science can be better steered by the values and priorities of society. This would be an international network of scholars … dedicated to gathering information from dispersed sources, bringing to the fore perspectives that are often overlooked, and promoting exchange across disciplinary and cultural divides” (57). Regardless of the specific form that such interdisciplinary infrastructure-building efforts might take, they will be crucial for providing equitable, inclusive, and legitimate platforms for the broad conversations about CRISPR that we know are on the horizon.

Engagement “with Teeth?”

A final challenge relates to the degree to which engagement efforts can and should provide meaningful input into formal policy making. Philosophically, many (if not all) of the goals of public engagement we outline in Fig. 2 are based on at least an implicit assumption that there will be some feedback loop from each modality of public engagement to the decisions made by legislative bodies, or other rulemaking at the policy level. The tricky part with this assumption is that that there is little evidence to support it. This is not too surprising for at least two reasons.

First, many federal agencies—at least in the United States—are limited by law in the degree to which they can provide the public with formal opportunities to make decisions: “In general, agencies are not permitted to delegate their decision authority to the public, and creating a fair, legitimate, and inclusive process for empowerment beyond basic voting is complex and challenging” (58). Within these legal frameworks, advisory bodies like NIH’s Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) for human genome editing trials have historically allowed for what could be called “passive” forms of engagement that provided opportunities to interested publics and stakeholders to overhear and provide public comment on parts of RAC meetings. Unfortunately, as the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine's consensus report on human genome editing put it, the RAC, “[i]n its current form … lacks scholarly expertise in public opinion or public engagement research, and is therefore not as well positioned to spearhead efforts to seek input from, or dialogues with, different communities of people at large who have an interest in the issue at hand” (9). Even with the Novel and Exceptional Technology and Research Advisory Committee that replaced the RAC as the “committee for advice and transparent discussions about the scientific, safety, ethical, and social issues associated with emerging biotechnologies” (59), that expertise, and therefore capacity constraints, remains in place.

Second, partly as a result of the constraints faced by federal agencies in integrating meaningful public engagement into their decision-making, some see federal bioethics commissions as a conduit between public views and the policy realm. Interestingly, both bench scientists and ethicists have questioned the ability of bioethics commissions to adequately represent public views. Biochemists Jennifer Doudna and Samuel H. Sternberg (60) call for a societal debate that goes beyond “researchers and bioethicists, but also [involves] a great range of stakeholders, including social scientists, policy-makers, faith leaders, regulators, and members of the public … [and] the conversation should begin immediately, before further applications of the technology thwar[t] any attempts to reign it in." Concerns about bioethics commissions being effective conduits for input from a broad range of publics are also raised by ethicists, who worry “that the structure of decision-making in those commissions means that the public is unlikely to have its values properly portrayed and, more problematically, the public cannot be portrayed as saying ‘no’” (61).

This is not to say that public engagement will or should replace policy making. But, in an ideal world, public policy on CRISPR should be responsive to the types of broad and inclusive engagement discussed in this essay. As John Holdren et al. (31) put it during the previous administration, “Public participation is important for promoting accountability, for improving decisions, for increasing trust, and for ensuring that officials have access to widely dispersed information.” As more and more CRISPR applications emerge in human, plant, and animal biology, one could envision a future in which regulation or even legislation explicitly responds to insights from public engagement efforts, even if it is just to outline reasons why they were not taken into account. Either way, future science policy should be informed at least as much by broad public engagement on CRISPR as it is informed by the science itself.


After the PTAB’s ruling, what next?

Although PTAB ruling may appear to have given the Broad Institute an outright win, the outlook is not quite so clear-cut. The battle over CRISPR-related IP rights looks far from over for various reasons.

First, UC Berkeley is weighing its decision to appeal the PTAB’s ruling. It remains convinced that “the Doudna/Charpentier team was the first group to invent this technology for use in all settings and all cell types, and was the first to publish and file patent applications directed toward that invention, and that the Broad Institute’s patents directed toward use of the CRISPR-Cas9 system in particular cell types are not patentably distinct from the Doudna/Charpentier invention.”

Second, various commentators consider it likely that the parties will eventually come to some sort of settlement involving the cross-licensing of their technology. Given unresolved issues of IP rights ownership of CRISPR vectors – which enable delivery of the mechanism to recipient DNA – this seems likely. “ If UC gets patent claims to CRISPR vectors granted, it would have rights to stop others from making, using, or selling them,” explains Phillip Webber, biotech patent attorney at the law firm Dehns in Oxford, UK. This would mean that even Editas Medicine, which holds an exclusive license to use Zhang’s CRISPR methods, would need to take a license from UC Berkeley.

Third, both the Broad Institute and UC Berkeley have filed and are defending patent applications in Europe. Catherine Coombes, a patent lawyer at HGF in New York notes in Təbiət that European case law may bring about a different outcome from that of the PTAB. If the European Patent Office finds that UC Berkeley’s research provided “sufficient motivation”, for other researchers to try the CRISPR-Cas9 system in mammalian cells then UC Berkeley’s patent may be judged to cover applications in all cell types, giving it the edge over the Broad Institute’s patents in Europe.

And finally, many other research groups are also getting in on the CRISPR-Cas9 patenting game. According to IPStudies, a Swiss-based IP management consultancy, more than 900 patent families currently exist, all claiming rights on different aspects of CRISPR-Cas9 systems. As these groups assert their rights, and demand royalties, many more legal battles are likely to ensue both for the Broad Institute and UC Berkeley.

But while the courts continue to grapple with these issues, the science continues to advance. Researchers at the Broad Institute, again led by Feng Zhang, have already identified – and submitted a patent application for – an interesting alternative to Cas9 called Cpf1. This new enzyme offers scientists greater scope to edit the genes of certain bacteria. While no CRISPR-therapy yet exists, there is talk of a number of trials starting this year. So watch this space.

The WIPO Magazine is intended to help broaden public understanding of intellectual property and of WIPO’s work, and is not an official document of WIPO. The designations employed and the presentation of material throughout this publication do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of WIPO concerning the legal status of any country, territory or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. This publication is not intended to reflect the views of the Member States or the WIPO Secretariat. The mention of specific companies or products of manufacturers does not imply that they are endorsed or recommended by WIPO in preference to others of a similar nature that are not mentioned.


Fon

CRISPR/Cas9 technology has enabled rapid genetic mutation in mammalian cells and the ability to conduct genome-wide screens using tailored lentiviral libraries [1,2,3,4,5,6,7,8,9]. The system consists of a sgRNA (single guide RNA) that directs the paradigm Cas9 nuclease from Streptococcus pyogenes to bind and cleave genomic DNA strands at the location corresponding to the guide sequence [10]. The resulting double strand cleavage triggers cellular repair mechanisms including non-homologous end-joining (NHEJ), which in the imperfect sense generates insertions or deletions (indel) mutations and associated nonsense transcripts. This technology makes pooled sgRNA libraries a powerful tool to perform genome-wide screens for both dominant and recessive genes. The resulting unique cellular subtypes generated are typically screened in pools for identifying hallmarks, i.e., survival or fluorescence reporter activation and guide distributions are then identified by next generation sequencing (NGS). Newer Cas9 technologies have also been developed to up- or down-regulate gene expression level, setting the stage for screens involving more subtle changes leading to desired phenotypic outputs [1, 11,12,13]. In addition, non-coding DNA is also rapidly becoming a popular target for such screens [14, 15].

In contrast to other methods such as near-haploid genetic screens where viral insertion sites must be determined by sequencing [16], the pooled library lentiviral-derived sgRNA sequences are pre-determined. Thus, guide sequences amplified from the genomic DNA of selected cells serve as a simple proxy to identify active genes or pathways in selected cells. However, as with other large scale technologies, the results of such screens are often primary next generation sequencing files, which unfortunately because of their size and format are unwieldy depots of information for bench scientists. Moreover, data processing, particularly from raw sequences to sgRNAs, often requires processing from different sources. An optimal solution is therefore to combine workflow steps into a single package. Here, we sought to create a complete CRISPR analysis software package with a simplified graphical workflow that can enable bench scientists to keep pace with large-scale data generation in by quickly processing NGS sequence files and generating graphical outputs with statistical representation. We demonstrate the power of ENCoRE to rapidly deliver results in a cell survival screen using Tumor Necrosis Factor-alpha (TNFa) challenge, which identified known members as well as two genes not yet implicated in the extrinsic apoptosis pathway, Smg7Ces2a. Further characterization of cell lines containing mutations in these genes shows that they lie predominantly in the extrinsic apoptosis pathway and are not generally protective against cell death stimuli. Both cell lines show an increase in p53 protein, consistent with an abrogated p53 pro-apoptotic signaling cascade, with Smg7 −/− cells showing the most substantial increase following TNFa treatment.


Şəxsi elmi, tədqiqat və təhsil məqsədləriniz üçün bu məqaləni yükləyin və çap edin.

Tək bir buraxılış alın Elm cəmi 15 ABŞ dolları üçün.

Elm

Vol 343, Issue 6166
03 January 2014

Məqalə Alətləri

Bu məqalə üçün xəbərdarlıq əlavə etmək üçün daxil olun.

By Ophir Shalem , Neville E. Sanjana , Ella Hartenian , Xi Shi , David A. Scott , Tarjei S. Mikkelsen , Dirk Heckl , Benjamin L. Ebert , David E. Root , John G. Doench , Feng Zhang

Elm 03 Jan 2014 : 84-87

Genome-editing technology allows improved positive or negative selection screens.


Videoya baxın: تقنية كريسبر (Dekabr 2022).