Məlumat

Zülallar üçün NMR spektroskopiyası üsulları

Zülallar üçün NMR spektroskopiyası üsulları


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən NMR spektroskopiyasında müxtəlif aşkarlama üsullarının həssaslıqlarını müqayisə edən cədvələ rast gəldim: "Birbaşa", "DEPT" və "Tərs", burada "Tərs" ən həssas görünür.

Bu fərqli metodlar nələrdir və necə fərqlənir?


Əksər hallarda zülallar üzərində NMR təcrübələri apardığınız zaman protonların üzərindəki siqnalı aşkarlayırsınız. Başqa nüvələrə baxsanız belə, sonda maqnitləşməni protona köçürür və bu siqnalı aşkar edirsiniz. Bu, yüksək giromaqnit nisbətinə görə ən həssas üsuldur 1H və bu, rəqəminizdə "ters" etiketli üsuldur. Bu, heteronuklear spektrləri ölçmək üçün demək olar ki, standart üsuldur.

Birbaşa aşkarlama, daha az həssas olan nüvəni birbaşa müşahidə etməyiniz deməkdir 13C. Bunun xüsusilə böyük zülallar üçün müəyyən üstünlükləri var, burada faydalı bir şeyi ölçə bilmək üçün tez-tez protonları deyterasiya etməli olursunuz.

DEPT, maqnitləşmənin birbaşa bağlı protonlardan heteronukleusa köçürüldüyü bir təcrübə növüdür. Bu, həssaslığı artırır və CH və CH-ni ayırd etməyə imkan verir3 CH qrupları2 qruplar


NMR Spektroskopiyası ilə Dəmir Bağlayıcı Zülalların Struktur Biologiyası

Burada kiçik təcrid olunmuş metalloproteinlərin struktur və dinamik xassələrinin təyini üçün paramaqnit NMR məhdudiyyətlərinin ilkin istismarından başlayaraq qeyri-üzvi struktur biologiyada bəzi əsas suallara cavab vermək üçün laboratoriyamızda hazırlanmış NMR strategiyalarının icmalını təqdim edirik. heme və dəmir alverinin öyrənilməsinə qədər ultra zəif zülal-zülal qarşılıqlı təsirinin öyrənilməsi. Nəzərdən keçirilən nümunələr bəzi metalloproteinlərin və ya metal bağlayan zülalların əsas bioloji proseslərdə rolunu əhatə edir. Nümunələr mürəkkəbliyinə görə NMR tətbiqləri üçün xüsusilə çətin olan makromolekulyar birləşmələrə aiddir.

Mücərrəd

Müxtəlif NMR strategiyaları, ölçüləri və mürəkkəbliyi artan bir neçə dəmir bağlayıcı makromolekulyar birləşmələri araşdırmaq üçün istifadə olunur, məsələn, sitokrom c-asılı apoptoz, dəmir mənbəyi olaraq mikroorqanizmlər kimi heme alınması və ferritin kimi bəzi əsas bioloji proseslər üçün aktualdır. vasitəçi dəmir biomineralizasiyası.


Mücərrəd

Birölçülü (1D) NMR spektroskopiyasından istifadə edərək məhlulda zülal-zülal qarşılıqlı təsirini aşkar etmək üçün iki üsul təsvir edilmişdir. Hər iki üsul da ən çox zülal üçün 0,8-0,9 ppm -də müşahidə olunan ən güclü metil rezonansının (SMR) intensivliyinin ölçülməsinə əsaslanır. Bu bölgədəki şiddətli rezonans üst-üstə düşməsi aşağı mikromolyar və hətta submikromolyar protein konsentrasiyalarında SMR-nin aşkarlanmasını asanlaşdırır. Təcrid olunmuş zülalların əlavə SMR intensivliyi ilə müqayisədə zülal qarışığının 1H NMR spektrində SMR intensivliyinin azalması zülalların qarşılıqlı təsir göstərdiyini bildirir (SMR üsulu). Etiketlənməmiş zülallar və ya makromolekullar əlavə edildikdən sonra 13 C etiketli 13 zülalın 1D 13 C-redaktə edilmiş 1 H NMR spektrində SMR intensivliyinin azalması da bağlanma nümayiş etdirir (SMRC metodu). Apoptozda iştirak edən iki zülal olan XIAP və Smac arasındakı qarşılıqlı əlaqənin təhlili hər iki üsulu göstərir. Fosfolipidlərin presinaptik Ca 2+ -sensor sinaptotaqmin 1 ilə Ca 2+-dan asılı bağlanması üçün neyron nüvə kompleksi ilə rəqabət apardığını göstərən bir araşdırma çoxkomponentli sistemlərin öyrənilməsində SMRC metodunun faydalılığını göstərir.

Bu iş Welch Fondunun qrantı və NIH Grant NS40944 tərəfindən dəstəklənib.

Yazışmalar kimə ünvanlanmalıdır. Telefon: (214) 648-9026. Faks: (214) 648-8673. E-poçt: [email qorunan]


Zülallar üçün NMR spektroskopiyasının aşkarlanması üsulları - Biologiya

NMR spektroskopiyası dərmanların kəşfi və inkişafı prosesində mühüm rol oynayır. Burada, hitlərin tapılmasında istifadə edilən, təsdiqlənməsi və qurğunun optimallaşdırılması üçün daha da təkmilləşdirilməsi üçün istifadə olunan mövcud NMR əsaslı seçim strategiyalarını müzakirə edirik. NMR skrininq təcrübələri bioloji cəhətdən uyğun makromolekullar üçün yüksək yaxınlıqlı liqandların aşkar edilməsində, liqand bağlayan yerlərin aydınlaşdırılmasında, geniş diapazonlu bağlanma yaxınlığına malik kiçik molekulların müəyyən edilməsində və beləliklə, struktur əsaslı dərmanda qiymətli və möhkəm alət olduğunu sübut etməkdə çox səmərəli və çox yönlüdür. dizayn. Bu NMR skrininq metodologiyaları zəif bağlayıcı birləşmələri müəyyən etmək üçün aşkarlama üsulu kimi hədəf və liqand rezonanslarının müşahidəsinə əsaslanır və onların dərman kəşfində qurğuşun birləşmələri kimi istifadə üçün güclü dərmana bənzər inhibitorlara çevrilməsinə kömək edir.

Müasir dərmanların kəşfi və inkişafı hitlərin tapılmasından tutmuş aparıcı optimallaşdırılmasına qədər çox addımlı bir yanaşmadır. Bu yanaşma müəyyən bir xəstəlik üçün "dərman" hədəfinin müəyyən edilməsi və onun etibarlılığının yoxlanılması ilə başlayır. Hədəf seçildikdən sonra hədəfə bağlana bilən hitləri müəyyən etmək üçün birləşmələr kitabxanasında ilkin yoxlama aparılır. Sonra ilkin skrininqdən seçilmiş qurğuşun birləşmələri bu qurğuşun birləşmələrinin daha yaxşı potensial, metabolik sabitlik, yaxınlıq, seçicilik, oral bioavailability və azaldılmış yan təsirlərlə bağlı xüsusiyyətlərinin yaxşılaşdırılması əsasında əlavə optimallaşdırmaya məruz qalır. Bu xüsusiyyətlərin yerinə yetirilməsi ilə qısa siyahıya alınan qurğuşun birləşmələri daha sonra klinik sınaqlara məruz qalır.

Dərmanın kəşf edilməsi və inkişaf prosesini araşdırmaq üçün atom səviyyəsindəki bioloji molekulların quruluşunu anlamaq, bu bilikləri hədəf ala biləcək dərman namizədlərini dizayn etmək üçün istifadə etmək üçün vacibdir. Nüvə Maqnetik Rezonans (NMR) spektroskopiyası, xəstəliklərin müalicəsi üçün potensial dərman namizədləri kimi istifadə edilə bilən birləşmələrin skrininqində yüksək müvəffəqiyyət dərəcəsi ilə istənilən məqsədə çatmaqda mühüm rol oynayır. Son onillikdə NMR spektroskopiyası dərmanların kəşfi və inkişafında çox səmərəli və çox yönlü bir vasitə olmuşdur, çünki o, biomolekulların molekulyar quruluşunu işıqlandıra bilər, dərmanların strukturunu aydınlaşdıra və yoxlaya bilər və onların qarşılıqlı əlaqəsi haqqında struktur məlumat verə bilər. kiçik molekullu birləşmələr (liqandlar) ilə biomolekullar (hədəf) beləliklə NMR spektroskopiyası əczaçılıq tədqiqatlarında [1], məsələn, islatravirin biokatalitik istehsalı [2] üçün əla vasitədir. Kliniki olaraq istifadə edilən dərmanlar adətən təbii və ya sintetik birləşmələr olduğundan, məhlul vəziyyətində olan NMR ilə kəmiyyət təhlili dərmanların çirklənmə profilini qiymətləndirmək, dərman vasitələrinin tərkibini təsvir etmək və bədən mayelərində dərman metabolitlərini araşdırmaq və ya araşdırma aparmaq üçün olduqca faydalıdır. bərk səthlərdəki zülalların dinamikası və kinetikası [3, 4] və ya allostery enzim [5]. Bərk NMR üsulları dərmanların toz şəklində polimorfizmi və onların tabletlərdəki uyğunluqları və ya triptofan sintazanın aktiv sahəsi [6] və ya α-sinuklein oliqomerlərinin toksik və qeyri-toksik növlərinin struktur xüsusiyyətləri haqqında biliklər təklif edə bilər. ]. Mikrotəsvir tabletlərin həllini öyrənmək üçün faydalıdır [8].

Bu baxış, əsasən, dərmanların kəşfi və inkişafı sahəsində aparıcı optimallaşdırmanın ardınca hədəf dərman qabiliyyəti, vuruşun identifikasiyası və təsdiqlənməsi üçün həyata keçirilən həll vəziyyəti NMR metodlarına diqqət yetirəcəkdir. Yaxın keçmişdə hitlərin müəyyən edilməsi, təsdiqlənməsi və aparıcı optimallaşdırılması, eləcə də hədəf dərman qabiliyyətinin qiymətləndirilməsində daha yüksək məhsuldarlıq əldə etmək üçün metodların həssaslığını artırmaq üçün bir çox yeni NMR əsaslı strategiyalar təqdim edilmişdir. Dərman kəşfi və inkişafında tətbiq edilən NMR skrininq metodlarının icmalı Şəkil 1-də göstərilmişdir. NMR-əsaslı skrininq metodları əsasən hər ikisinə əsaslanan iki aşkarlama rejimini əhatə edir. hədəf rezonanslar və ya ligand rezonansları.

NMR skrininq üsulları kiçik molekulların identifikasiyası və hit-to-qurğuşun optimallaşdırılması üçün çox etibarlı və qiymətli bir vasitədir. Müəyyən bir hədəfə bağlana bilən hitləri tapmaq üçün birləşmələr kitabxanası yoxlanılır, sonra onların təsdiqi aparılır, bunun üçün NMR bağlama analizləri yüksək effektivliyə malikdir. Bu üsullara aşağıdakılar daxildir.

Kimyəvi yerdəyişmə pozğunluğu yanaşmasında [9], birləşmə (liqand) və zülal (hədəf) arasındakı molekullararası qarşılıqlı əlaqə haqqında məlumat sərbəst və bağlanmış zülal arasındakı kimyəvi sürüşmə fərqlərinə əsaslanaraq çıxarıla bilər. Bu kimyəvi sürüşmə fərqi birləşmənin hədəf zülala bağlanması səbəbindən yaranır ki, bu da bağlanma yerində maqnit nüvələrinin kimyəvi yerdəyişməsində narahatlığa səbəb olur. Bu üsul üçün hədəf zülal 15 N/1 H və 13 C/ 1 H ikiölçülü hetero-nüvə korrelyasiya NMR spektrlərinin əldə edilməsi üçün 15 N və/və ya 13 C sabit izotoplarla etiketlənməlidir. və zülalın bağlı formaları [10, 11]. Zülalın vahid izotop etiketlənməsi, NMR spektrlərinin mürəkkəbliyini azaltmaqla yanaşı həssaslığı və qətnaməni artırmaq üçün vacibdir. Bundan əlavə, çoxölçülü üçlü rezonans təcrübələrindən [12] istifadə edərək ardıcıl rezonans təyin edilməsinə kömək edir ki, bu da kimyəvi sürüşmə analizi ilə birlikdə hədəf zülal üzərində liqandın bağlanma yerinin yerini birmənalı olaraq müəyyən etməyə imkan verir.

Beləliklə, bu üsul bir çox üstünlüklərə malikdir. Çox etibarlı və təkrarlana bilən olmaqla yanaşı, liqand bağlayan yerdə mühüm struktur məlumatları təmin edə bilər. O, hədəf üçün aşağı və yüksək yaxınlıqlara malik birləşmələri aşkar edə bilər (ümumiyyətlə mM-dən nM diapazonunda dissosiasiya sabitləri olan birləşmələr), hətta son dərəcə zəif bağlanma da yoxlanıla bilər. Dissosiasiya sabiti (Kd) titrləmə təcrübələrində liqand konsentrasiyasından asılı olaraq hədəfin rezonansına riayət etməklə və fraksiya kimyəvi yerdəyişmə dəyişikliyini ümumi liqand konsentrasiyası ilə əlaqələndirməklə ölçülə bilər [13]. Əgər hədəfin strukturu NMR metodlarından istifadə etməklə aydınlaşdırılıbsa, liqand-zülal məsafəsi aşağıdakı üsulla əldə edilə bilər: nüvə Overhauser effekti (NOE) tipli təcrübələr [14] bu, liqandın bağlanma rejimini daha dəqiq müəyyən etməyə imkan verəcəkdir.

NMR tarama üsullarının mürəkkəbliyini azaltmaq və yüksək məhsuldarlıq taramasının səmərəliliyini artırmaq üçün Fesik və iş yoldaşlarının [15] təqdim etdiyi başqa bir NMR hədəf-rezonans əsaslı yanaşma mövcuddur. Bu NMR müayinəsində, metil qrupunun kimyəvi dəyişməsi dəyişikliklər müşahidə olunur. Ayrı-ayrı amin turşularındakı metil qrupları selektiv olaraq 13 C ilə etiketlənir və 2D 13 C- 1 H HSQC spektrlərində metil rezonanslarının 13 C/1 H kimyəvi yerdəyişmə dəyişiklikləri vasitəsilə nəzarət edilir [15]. Bu yanaşma 15 N/1 H kimyəvi yerdəyişmə dəyişikliyinə əsaslanan təcrübələrlə müqayisədə həssaslığı üç dəfə artırmaq baxımından sərfəlidir və xüsusilə ligandlar valin, lösin və ya izolösin metil qruplarına yaxın olduqda belə təcrübələrə tamamlayıcı yanaşma təklif edir. Bundan əlavə, yüksək molekulyar ağırlıqlı protein hədəflərinin (MW> 50 kDa) taranması, perdeterasiya edilmiş bir solventdə seçici metil qrupu etiketlənməsi ilə mümkündür.

Liqanda rezonansa əsaslanan NMR skrininq üsulları hədəfə əsaslanan yanaşmalardan daha müxtəlifdir və buna görə də əlavə üstünlüklərə malikdir, məsələn, bu təcrübələr izotop etiketli zülallara ehtiyac duymur, yalnız az miqdarda protein tələb olunur, əldə etmək üçün daha az vaxt tələb olunur. eksperimentlər, çünki onlar ümumiyyətlə birölçülüdür və hədəfə əsaslanan yanaşma üçün tələb olunan ikiölçülü təcrübələr deyil və skrininq üçün hədəfin ölçüsündə yuxarı həddi yoxdur. Bununla belə, flüor NMR spektroskopiyasında spektrometr dizaynı və daxili istinad olmadan heteronuklear NMR spektrlərinin kalibrlənməsi üçün miqyas sistemi səbəbindən təkrar istehsal problemi var [16].

Doyma Ötürmə Fərqi (STD) NMR təcrübəsi Gauss impuls qatarından istifadə edərək zülalın proton rezonanslarının seçici şüalanmasından ibarətdir. Doyma spin diffuziya effektinə görə bütün zülalda sürətlə yayılır. Əgər liqand zülala bağlanarsa, doyma da liqand-zülal interfeysində çarpaz relaksasiya yolu ilə bağlı liqandaya ötürülür, bu da liqand siqnalının intensivliyinin zəifləməsinə səbəb olur. Bağlayıcı liqandların siqnallarını ehtiva edən STD spektrləri, doyma olmadan yaranan spektri istinad spektrindən çıxarmaqla əldə edilir [17]. Bu üsul liqandın birbaşa bağlanan seqmentlərinin epitop xəritələşdirilməsinə (farmakofor qruplarının təyin edilməsinə) və birbaşa birləşmələrin qarışığından liqandın identifikasiyasına kömək edir.

Gradient SpectroscopY (WaterLOGSY) vasitəsilə müşahidə edilən su-liqand, hədəf biomolekuluna bağlanan liqandın identifikasiyası üçün qiymətli üsuldur. Bu NMR təcrübəsində maqnitləşmə zülal-liqand kompleksi vasitəsilə kütləvi sudan sərbəst liqandaya köçürülür. Bağlı liqandın rezonansları, bağlanmayan liqandların rezonanslarından əks işarə ilə görünür və buna görə də birincil NMR skrininqi üçün çox faydalıdır [18]. Bununla belə, bu metodun bəzi çatışmazlıqları var, məsələn, liqand bağlayan yer haqqında məlumat vermir. Ayrıca, hədəfə güclü bağlanma yaxınlığı və yavaş ayrılma nisbətləri olan ligandları müəyyən edə bilmir. Bu problemin öhdəsindən gəlmək üçün başqa bir bağlama təcrübəsi nəzərdə tutulmuşdur, yəni., Güclü bağlayıcıları aşkar etməyə imkan verən Gradient SpectroscopY (c-WaterLOGSY) [19] vasitəsilə Müşahidə olunan Rəqabət Su-Liqandı. Bu təcrübə, aşağı ligand konsentrasiyası tələb etdiyi üçün, az həll olunan potensial güclü inhibitorların müəyyən edilməsi üçün tətbiq edilir. Texnika əsasən kimyəvi qarışıqların və bitki və ya göbələk ekstraktlarının sürətli süzgəcindən keçirilməsi üçün uyğundur. Diqqətəlayiqdir ki, oxşar rəqabətə əsaslanan yanaşma bir çox digər liqandla aşkar edilmiş NMR skrininq metodlarına tətbiq edilə bilər. Rəqabətə əsaslanan eksperimentlərin [20] əsas prinsipi əvvəlcə hədəf zülala bağlanan hədəf üçün orta və aşağı yaxın yaxınlığa malik olan istinad birləşməsinin identifikasiyasını, ardınca isə onun eyni hədəfə bağlanan başqa sınaq liqandı ilə yerdəyişməsini nəzərdə tutur. daha yüksək yaxınlıq ilə. Beləliklə, bu rəqabətə əsaslanan skrininq üsulları ənənəvi üsullarla aşkar edilməyən yüksək yaxınlıqlı liqandların müəyyən edilməsinə kömək etmək, zülalın aktiv sahəsinə bağlanan liqandları aşkar etmək və beləliklə, qeyri-spesifik bağlanmadan qaçmaq kimi ənənəvi üsullarla bağlı əlavə üstünlüklərə malikdir. liqandlar.

Qarşılıqlı təsir göstərən birləşmələri müəyyən etmək üçün bir vasitə kimi zülal yan zəncirlərinə əlavə edilmiş spin etiketləri (SLAPSTIC) birləşmələrin NMR ilə ilkin skrininqi üçün faydalı və həssasdır, çünki liqand və zülal arasındakı molekullararası qarşılıqlı əlaqə spin etiketləri ilə müəyyən edilə və xarakterizə edilə bilər [21]. Spin etiketləri (məs., paramaqnit üzvi nitroksid radikalı TEMPO) zülala kovalent şəkildə bağlanır və etiket qruplarının fırlanmasına yaxın olduqda (ümumiyyətlə 15-20 Å məsafəyə qədər) liqand rezonanslarının paramaqnit rezonans gücləndirilməsinə (PRE) səbəb olur. Məsələn, məhluldakı kiçik bir ligand ümumiyyətlə kəskin NMR rezonanslarına malikdir. Paramaqnit spin etiketli zülal hədəfinə bağlandıqda, liqanddakı spin etiketinin PRE effektinə görə rezonans intensivliyində əhəmiyyətli dərəcədə azalma müşahidə olunur [22].

Hədəf Immobilized NMR Tarama (VÖEN) prosesi, ölçüsü və kimyəvi tərkibindən asılı olmayaraq hər bir hədəf üçün sürətli, həssas və eynidır. Bu üsulda liqandlar immobilizasiya olunmuş protein hədəfinə bağlanma qabiliyyətinə əsasən yoxlanılır. Kimyəvi kitabxanadan olan birləşmələrin qarışığı immobilizasiya edilmiş zülal hədəfinə tətbiq edilir və nəticədə əldə edilən 1D NMR spektrini uyğun nəzarət nümunəsi ilə müqayisə etməklə bağlanma aşkar edilir [23]. Bu üsul zülalları və nuklein turşularını K ilə hədəfləyən müxtəlif liqandlar üçün təsdiq edilmişdirD 60 ilə 5000 μM arasında. Liqand bağlayan yerin sürətli xarakteristikası üçün TINS ​​rəqabət rejimində istifadə edilə bilər. Bu üsul bir sıra üstünlüklərə malikdir. Bu, digər fraqment əsaslı yanaşmalarla müqayisədə daha az miqdarda hədəf zülal tələb edir, çünki zülal birləşmələr kitabxanasını yoxlamaq üçün təkrar istifadə edilə bilər. Geniş bir yaxınlıq diapazonu ilə bir liqandın hədəfə bağlanmasına həssasdır və buna görə də yeni hitləri gözdən qaçırma ehtimalı yoxdur. Bundan əlavə, zəif bağlayıcı qarşılıqlı təsir və ligandların digər aşağı afiniteli allosterik sahələrə bağlanması ortadan qaldırıla bilər. Nəzarət nümunəsini ehtiyatla seçməklə çox yüksək spesifikliyə nail olmaq olar. O, həmçinin istehsal etmək çətin olan və ya həll olunmayan membran zülalları kimi sərt hədəflərin skrininqi üçün faydalı ola bilər.

Relaxasiya ilə redaktə edilmiş NMR təcrübələri geniş spektrli liqand yaxınlığının monitorinqində mühüm rol oynayır. Bir liqandın hədəf zülala bağlanması relaksasiya vaxtını dəyişdiyindən, bu, yaxınlığın qiymətləndirilməsinə imkan verir və qarşılıqlı təsir edən funksional qruplar yığılma əyriləri ilə müəyyən edilir. Bu relaksasiya ilə redaktə edilmiş NMR yanaşması [24] fırlanan çərçivə nüvə spin uzununa relaksasiya vaxtını (T) ehtiva edir.1ρ) və Transvers nüvə spininin boşalma vaxtı (T2) aşkarlama üsulu kimi ölçmələr. Məsələn, bir hədəf (zülal) molekulu ümumiyyətlə böyükdür və buna görə də yavaş translyasiya diffuziyasına, yavaş yuvarlanmağa, sürətli relaksasiyaya, daha qısa T2, geniş xətlər və mənfi NOE, ligandlar isə kiçik molekullardır və sürətli translational diffuziya, sürətli yuvarlanma, yavaş gevşəmə, daha uzun T2, dar xətt genişlikləri və müsbət NOE. Liqand zülal ilə sürətli mübadilədə bağlandıqda, daha az sürətlə yayıldıqda və tez rahatlaşdıqda, hədəfinkinə bənzər NMR xassələri əldə etdiyi üçün liqand üçün mənfi NOE müşahidə ediləcək və rezonans xətləri genişlənərək aydın bir nəticə verəcəkdir. bağlamanın göstəricisi.

Diffuziya ilə redaktə edilmiş NMR təcrübələri, bağlanmış və sərbəst vəziyyətdə olan ligandların yayılma nisbətlərinin ölçülməsini əhatə edir. Sərbəst formada olan liqand ölçü fərqlərinə görə bağlı formadan daha sürətlə yayıldığı üçün bu xüsusiyyətdən hədəfə bağlana bilən liqandların süzgəcindən istifadə etmək olar. Bu tip təcrübə üçün impulslu sahə qradiyenti (PEG) ilə stimullaşdırılmış əks-səda (STE) təcrübələrinə əsaslanan diffuziya filtrlərindən [24] istifadə olunur. BT Falk və başqaları, məsələn, ultra sürətli fəaliyyət göstərən insulin formulasiyasını optimallaşdırmaq üçün 1D və diffuziya profilləşdirmə üsullarından istifadə etdilər [25].

Köçürülmüş Nüvə Overhauser effekti (Tr-NOEs) liqandları verilmiş hədəf zülala bağlana bilən birləşmələrin qarışığından ayırmaq və ya allosterik yerlərdə (interliqand NOE) eyni vaxtda zülala bağlanan molekul cütlərini müəyyən etmək üçün faydalı skrininq vasitəsidir. Əgər liqandın hədəf zülalı ilə aşağı yaxınlıqlı bağlanması və ya zəif qarşılıqlı təsiri varsa, köçürülmüş NOE (trNOE) spektroskopiya metodu [26] əla alternativ təmin edə bilər. TrNOE liqandın zülal bağlama yerində oriyentasiyası haqqında məlumat verir. Yuxarıda qeyd olunan üsullardan ikisi, STD və Water-LOGSY, transfer-NOE tipli təcrübələrə əsaslanır.

NOE Pumping izotopların etiketlənməsinə və ya kimyəvi ayrılmasına ehtiyac olmadan zülal-liqand qarşılıqlı əlaqəsi haqqında etibarlı məlumat verə bilər. Bu təcrübələrdə maqnitləşmə zülaldan bağlı liqandlara və ya əksinə ötürülür və onların arasında dipol-dipol qarşılıqlı təsirləri vasitəsilə zülal-liqand qarşılıqlı əlaqəsi haqqında məlumat alınır. Zülaldan ötürülən maqnitləşmə sərbəst (yavaş relaksasiya) və bağlı (sürətli relaksasiya) liqandlar arasında sürətli mübadilə nəticəsində sərbəst liqandlarda toplanır və NOE üçün nasos effektinə səbəb olur [27]. Bununla birlikdə, bu metodun bəzi məhdudiyyətləri var, məsələn, eninə boşalma vaxtlarında və ya hədəf və ligandlar arasında yayılma əmsallarında əhəmiyyətli bir fərq olması vacibdir və ligandın sərbəst və bağlanmış vəziyyətləri arasındakı bağlayıcı qarşılıqlı əlaqə sürətli bir mübadilə rejimində olmalıdır. NMR vaxt şkalası.

Yaxınlıq etiketləri NMR bağlama analizi yaxınlıq etiketlərindən istifadə etməklə zülal-zülal qarşılıqlı təsirini aşkar edə bilər [28]. Bu yanaşmada, zülal bağlayan tərəfdaşlardan biri liqand üçün orta yaxınlığa malik olan liqand bağlayan domenə bağlanır. Zülal və onun potensial bağlayıcı partnyoru arasındakı qarşılıqlı əlaqə, liqand bağlayan sahəyə geri dönən şəkildə bağlı olan liqandın relaksasiya sürətindəki dəyişikliklər vasitəsilə yoxlanılır. Liqandın relaksasiya sürətinin dəyişməsi üçlü zülal-zülal-liqand kompleksinin molekulyar çəkisi və molyar nisbəti ilə müəyyən edilir. Bu metodun əsas üstünlüyü tələb olunan etiketsiz zülalın nisbətən aşağı miqdarıdır.

Fluor kimyəvi keçid Anizotropiya və Tarama üçün mübadilə (FAXS) etibarlı, yüksək dərəcədə təkrarlanan, böyük dinamik diapazonlu, ligand əsaslı 19 F NMR tarama üsuludur [29]. Bu metodun əsas prinsipi odur ki, rəqabətli liqand hədəf zülala bağlandıqda, artıq ona bağlı olan flüorlu casus molekulunu yerindən çıxarır. Geniş olan flüorlu casus molekulunun siqnalı əvvəlcə reseptor zülallarından yerdəyişməsi səbəbindən kəskin olur və 19 F NMR ilə aşkarlanır. Bu metodun 1 H NMR istifadə edərək orijinal rəqabətə əsaslanan yanaşmalar üzərində əhəmiyyətli üstünlükləri var. Məsələn, spektral üst-üstə düşmə olmaması səbəbindən birləşmələrin qarışığının skrininqi asanlaşır və zülalın az istehlakı tələb olunur. Flüorun böyük kimyəvi sürüşmə anizotropiyası və əhəmiyyətli bir mübadilə töhfəsi zəif yaxınlıqlı casus molekulunun seçilməsinə kömək edir, beləliklə, müəyyən edilmiş NMR hitləri üçün daha aşağı bağlanma yaxınlıq həddinə səbəb olur.

Biokimyəvi skrininq üçün üç flüor atomu (3-FABS) substrat əsaslı 19 F NMR metodudur [30] əsasən ferment inhibə reaksiyalarının funksional skrininqi üçün istifadə olunur. Bu üsulda bir CF3etiketli substrat bir CF olan enzimatik reaksiyanı yerinə yetirmək üçün istifadə olunur3 hissə sensor qrupu kimi istifadə olunur. Substratın ferment tərəfindən kimyəvi modifikasiyası CF-nin elektron buludunda dəyişikliyə səbəb olur3 Substrat və enzimatik modifikasiya edilmiş reaksiya məhsulu üçün fərqli 19 F kimyəvi yerdəyişmələrə səbəb olan substratın hissəsi. Bu texnika əsasən enzimatik reaksiyaların monitorinqi üçün istifadə olunur. Kompleks kitabxanaların sürətli və etibarlı funksional taranmasına və IC50 dəyərlərinin dəqiq ölçülməsinə imkan verir [31].

NMR skrininq üsulları ligandın farmakokinetik xüsusiyyətlərini yaxşılaşdırmaq üçün aparıcı optimallaşdırma prosesində geniş tətbiqə malikdir. Əldə edilən zərbələr ümumiyyətlə zəif bağlayıcı olduğundan, onların optimallaşdırılması vacibdir, buna liqandları böyütməklə, birləşdirməklə və ya birləşdirməklə nail olmaq olar. NMR metodları zəif bağlanmış liqandların kompleksləri üçün yüksək keyfiyyətli struktur məlumatı təmin edə bilər, həmçinin kristallaşmayan zülalları xarakterizə etmək üçün istifadə olunur. Qurğuşun optimallaşdırılması üçün NMR üsulları da iki aşkarlama rejiminə malikdir, hədəf rezonansları və liqand rezonansları.

Hədəf rezonansa əsaslanan NMR tərəfindən Struktur-Aktivlik İlişkisi (SAR) daxildir [32, 33], ligandın bağlanma yaxınlığını artırmaq üçün əlaqəli bir parçalanma üsuludur. Bu metodda, ligandlar, hədəfə bağlanma yaxınlığına əsaslanaraq 1 H-15 N HSQC təcrübəsi ilə birləşmələr kitabxanasından müəyyən edilir və sonra kimyəvi modifikasiya yolu ilə optimallaşdırılır. Əvvəllər optimallaşdırılmış birinci liqandın doymuş miqdarları olduqda, ikinci liqandın identifikasiyası onun ikinci sahə üçün optimallaşdırılması ilə yanaşı həyata keçirilir. Nəhayət, iki qonşu sahəyə bağlana bilən yüksək yaxınlıqlı ligand əldə etmək üçün iki ligand kovalent şəkildə bağlanır və ligand bağlanması kimyəvi keçid xəritələşdirilməsi ilə yoxlanılır. Bu texnikanın geniş tətbiqi var, çünki iki qurğuşun birləşmələri üçün əldə edilən struktur məlumat daha yüksək yaxınlığa malik iki dişli liqandın kimyəvi sintezində olduqca faydalıdır.

H2O/D2O valyuta məzənnəsinin ölçülməsi bağlama epitopunu müəyyən etmək üçün faydalıdır [34]. Bu üsulda kovalent bağlı hidrogen atomunun (zülal onurğasının amid protonu) deyterium atomu ilə mübadilə sürəti və ya əksinə ölçülür. Bu məqsədlə sərbəst zülal və onun liqandla kompleksi üçün mübadilə reaksiyası aparılır. Əgər liqand hədəf zülala bağlanarsa, bağlanma yerindəki amid protonları kompleksdə qorunacaq və yavaş-yavaş mübadilə ediləcək. Beləliklə, mübadilə edən bölgələr müqayisə edilir və məzənnə ölçülə bilər.

Bir əlaqə prosesi vasitəsilə qurğuşun birləşməsinin optimallaşdırılması üçün iki liqandın bir-birinə yaxın məsafədə bağlanması lazımdır. Ümumiyyətlə, liqandlar zülalın ilkin bağlanma yerinə asanlıqla yapışırlar. Bununla belə, ikinci yer bağlayıcıları hədəf üçün birinci yer bağlayıcılarına nisbətən daha zəif yaxınlığa malikdir və buna görə də onların aşkarlanması çətinləşir. Aşağıda müzakirə olunan bir neçə NMR əsaslı metodlar var ki, onlar bu zəif qarşılıqlı təsirləri möhkəm şəkildə aşkar edə bilirlər, (ii) Liqand rezonansa əsaslanan yanaşma daxildir:

Birinci yerin spin etiketli liqand metodu ilə SLAPSTIC paramaqnit relaksasiya gücləndirilməsi (PRE) effektindən istifadə edir və liqanddakı paramaqnit spin etiketləri vasitəsilə ikinci sahə bağlayıcılarını müəyyən etməkdə çox faydalıdır. Bu üsulda birinci sahə liqandına paramaqnit agenti yazılır, məs., TEMPO və ikinci sahə bağlayıcıların yoxlanılması üçün zond kimi istifadə olunur. İkinci sahəyə bağlanan liqandlar birinci sayt liqandına yaxındır, buna görə də paramaqnit relaksasiyanın gücləndirilməsi səbəbindən NMR siqnallarında xəttin genişlənməsi müşahidə olunur. Bu üsul güclüdür, çünki PRE effekti yalnız hər iki ligandın eyni vaxtda və ya bir -birinə yaxın yerləşdiyi yerə bağlanması ilə aşkar edilə bilər ki, bu da taramanı daha etibarlı edir [35].

İkinci yer bağlayıcılarını müəyyən etmək üçün başqa bir üsul interliqandlararası NOE (ILOE) əsasındadır [36]. Bu üsulda birinci yerdəki bağlayıcıların yüksək konsentrasiyasında ikinci sahənin bağlayıcıları üçün skrininq aparılır və NOESY tipli təcrübələr molekullararası liqand-liqand NOE-ləri aşkar edir. ILOE yalnız birinci və ikinci sahə bağlayıcıları yaxın olduqda müşahidə olunur (

5 Å). Bununla belə, bu metodun dezavantajı var, çünki zəif ILOE-lər müşahidə olunur, çünki ikinci sahənin liqandları aşağı yaxınlıq ilə bağlanır və birinci yerdəki bağlayıcılar çox vaxt bağlanma sahəsinin doymasına mane olan zəif həllediciliyə malikdir. Daha uzun qarışdırma vaxtı (200-600 ms) olan ikinci sahə liqandlarının və NOESY-nin yüksək konsentrasiyaları tövsiyə olunur.

ILOEs tərəfindən SAR, eyni zülala bağlanan, lakin bitişik bölgələrə bağlanan iki ligand arasındakı qarşılıqlı əlaqəni təsbit edir [37]. O, kompleks qarışıqlarda zülal vasitəçiliyi ilə işləyən liqand-liqand NOE-lərdən (ILOEs) məlumatdan istifadə edərək, daha yüksək yaxınlığa malik iki dişli liqandlara kimyəvi modifikasiya yanaşmaları ilə təkmilləşdirilmiş ilk zəif zərbələri müəyyən edir. Bu üsulla bir NOESY təcrübəsindən həm bir-birinə bağlanan liqandlar, həm də bir-birinə proksimal bağlanan liqandların hissələri haqqında məlumat əldə etmək olar. Bununla belə, bu təcrübə ILOE aşkarlanmasını maksimum dərəcədə artırmaq üçün daha uzun qarışdırma vaxtı (300-800 ms) tələb edir.

ILOEs tərəfindən Pharmacophore, zülal vasitəçiliyi ilə ligand-ligand qarşılıqlı təsirini də algılar və ticari olaraq mövcud olan birləşmələrin böyük verilənlər bazalarından mümkün əlaqəli molekulların farmakofora əsaslanan axtarışı üçün məlumatlardan istifadə edir [38]. Zəif qarşılıqlı əlaqədə olan liqandların eksperimental bağlanma məlumatları ilə idarə olunan farmakofora əsaslanan bu axtarış yüksək yaxınlıqlı, seçici liqandların müəyyən edilməsində və ya sintezində yüksək effektivliyə malik ola bilər.

PHARmacophore Xəritəçəkmə (INPHARMA) üçün INter-liqand NOEs eyni bağlama yeri üçün iki liqand arasında rəqabətə əsaslanan zülal vasitəçiliyi ilə liqand-liqand qarşılıqlı təsirini aşkar edir [39]. Bu üsulda eyni hədəfə bağlanan iki rəqabətli A və B liqandları arasında interliqand NOE müşahidə edilir. Bu cür interliqandlararası NOE effektləri birinci yer liqandından zülal protonları vasitəsilə spin diffuziyası ilə və eyni bağlanma yeri üçün birinci yer liqandı ilə rəqabət aparan liqandlara qayıdır. Bu məlumat hədəf zülalın bağlayıcı cibindəki rəqabətli liqandların nisbi oriyentasiyasını müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər.

Yuxarıda qeyd olunan NMR skrininq üsullarına əlavə olaraq, qurğuşun optimallaşdırılması üçün bir qədər fərqli yanaşmalar tətbiq edən bəzi əlavə üsullar da mövcuddur. Bunlara daxildir

ŞƏKİLLƏRİN Skrinqi: Son illərdə bu seçim üsulu əczaçılıq tədqiqatlarında geniş yayılmışdır. Bu strategiya, kiçik dərmana bənzər molekullardan ibarət bir kitabxananın NMR taramasını, virtual tarama, yüksək məhsuldar enzim analizləri, kombinator kimyası, rentgen kristalloqrafiyası və yeni potensial axtarışlarda molekulyar modelləşdirmə kimi müxtəlif tamamlayıcı üsullarla birləşdirir. Bu yanaşmada, aparıcı tapmaq üçün kiçik, lakin müxtəlif dərmana bənzər molekulların hədəfə bağlanması qiymətləndirilir. Kiçik molekullar üçün iskele əsasən uğurlu dərmanlarda rast gəlinən forma və ya çərçivələrdən əldə edilir [40].

NMR Structurally Orientated Library Valency Engineering (NMR SOLVE) metodu ferment ailələri üçün liqandları müəyyən etmək üçün fraqmentləri birləşdirən yanaşmanı əhatə edir [41]. Bağlama yerində yalnız bir neçə kritik protonu müşahidə etmək və təyin etmək üçün zülalın xüsusi amin turşuları üzərində seçici izotop etiketlənməsinə əsaslanır. Buna görə də, bu yanaşma, tam bir tapşırıq olmasa belə, protein-ligand kompleksinin struktur məlumatlarının alınmasını asanlaşdırır. Bu texnika bütün ailədə qorunan, dəyişən bağlanma yerinə bitişik ümumi bağlanma yerinə malik böyük bir zülal ailəsinə tətbiq oluna bilər. Zülal ailəsinin nümayəndəsi seçilir və bu zülalın ümumi bağlanma yerində mövcud olan xüsusi amin turşuları üzərində selektiv izotop etiketlənməsi aparılır. Bu zülalın bağlanma yeri, bağlama yerində etiketlənmiş qalıqlar üçün rezonans təyinatlarını əldə etmək üçün ümumi istinad liqandı ilə xəritələnir, xüsusən də ümumi liqand bağlayan yer və substrat sahəsi arasındakı interfeysdə. Bağlayıcı, zülalın bağlanma yerində standart istinad liqandının təqlidinə əsaslanaraq hazırlanmışdır. Bu bağlayıcı bitişik substrat bağlayan sahəyə yönəldilir və obyekt yönümlü bi-liqand kitabxanası qurulur. Bu nəticələnən kitabxana ferment ailəsinin bütün üzvləri üçün istifadə üçün uyğundur. Texnika, xüsusi yüksək affinity bi-ligand inhibitorlarını təyin etmək üçün taranabilen bir kombinatorial bi-ligand kitabxanasının sintezində faydalıdır.


NOVEL NMR məcburi köçkünlərin/IDRS -in araşdırılması üçün yanaşmalar

Yaxın vaxtlara qədər, biomolekulyar NMR tədqiqatları üçün eksperimentlərin əksəriyyəti böyük proton giromaqnit nisbəti (24, 25) səbəbiylə yüksək 1 H həssaslığı sayəsində 1 H-nin birbaşa aşkarlanmasına əsaslanırdı. Bununla belə, protonlar 13 C-ə və 15 N-ə qədər artan, mahiyyətcə aşağı kimyəvi sürüşmə dispersiyası ilə xarakterizə olunanlardır (Şəkil 1). Bu, xüsusilə, sabit 3D strukturu olmadıqda kimyəvi yerdəyişmə dispersiyasını gücləndirərək, qonşu amin turşularının kimyəvi yerdəyişməsinə töhfələrdən daha çox təsirlənən onurğa nüvələri üçün doğrudur. 13 C və 15 N-də izotop zənginləşdirmənin istifadəsi, indiyə qədər müntəzəm olaraq istifadə olunur, beləliklə, məcburi köçkünlərin öyrənilməsi üçün xüsusilə vacib nəticələr var. The presence of solvent exposed conformations typical of IDP states also affect to a smaller extent the nonexchangeable heteronuclei compared to exchangeable protons, the latter being more prone to exchange broadening.

The intrinsically different properties of 1 H and 13 C nuclei are shown schematically. The increasing chemical shift dispersion of 13 C NMR compared to 1 H NMR as well as the reduced sensitivity to specific relaxation mechanisms that may cause extensive line broadening make them well suited to investigate IDPs.

Heteronculei were always exploited in indirect dimensions of NMR experiments through the so-called “indirect detection methods” based on 1 H detection ( 26 , 27 ). The recent improvements in instrumental sensitivity ( 28 ), in parallel to the development of suitable experimental schemes, have stimulated the development of a whole set of multidimensional NMR experiments based on 13 C direct detection, that take maximum advantage of the properties of heteronuclei as only heteronuclei are frequency labeled in all dimensions of the experiments and are thus generally referred to as “exclusively heteronuclear experiments” ( 29-31 ). To appreciate the improvement in the resolution and information content of the different experimental schemes, Fig. 2 compares the simplest 2D experiments correlating the backbone 15 N, with the directly bound 1 H or carbonyl 13 C. It is clear that the latter is characterized by improved chemical shift dispersion, and that also proline residues which are very abundant in IDPs/intrinsically disordered regions (IDRs) can be easily detected. These characteristics will of course propagate to the whole set of 3D experiments that can be designed ( 32-34 ). Indeed, by exploiting the multitude of spin–spin interactions, it is possible to design a whole suite of experiments that enable the identification of spin-systems as well as to link them in a sequence specific manner (Fig. 3). The suite of exclusively heteronuclear NMR experiments has by now been used to study several IDPs ( 35 , 36 ). Of course, in case of a complex system, it is important to combine all the information that can be accessible, so the best strategy consists in the combination of the 1 H- and 13 C-detected multidimensional NMR experiments ( 34 , 35 , 37 ).

The two NMR experiments correlating the backbone amide either to the directly bound proton (left panel – 1 H- 15 N HMQC) or to the directly bound carbonyl (right panel - 13 C- 15 N CON to obtain (right panel: 13 C- 15 N CON) acquired at 900 MHz on a 0.2 mM sample of 13 C, 15 N labeled synuclein are shown. The two spectra clearly show the large chemical shift dispersion in the nitrogen indirect dimension as well as the reduced cross-peak overlap in the CON spectrom.

The various scalar couplings that can be exploited to design multidimensional NMR experiments, as well as the correlations expected in several 13 C detected exclusively heteronuclear experiments are shown on the right panel. The increase in resolution by progressively expanding the dimensionality of NMR experiments is schematically depicted on the left.

The NMR experiments have been further improved by implementing several clever approaches to reduce the experimental time and/or increase the resolution of the experiments (Fig. 4). Indeed, the selective manipulation of the different sets of spins enables to accelerate the recovery of the magnetization along the z-axis (longitudinal relaxation enhancement, LRE), ( 32 , 38-40 ) drastically reducing the amount of time needed between acquisition of an free induction decat and the following one, which is generally the longest delay in any NMR pulse scheme. Therefore, through this approach, the overall experimental time to obtain a specific kind of information can be drastically reduced. The other feature that has a high impact on the overall duration of a multidimensional NMR experiment consists in the number of repetitions of the same basic experiment necessary to construct indirect dimensions, until recently implemented by increase of a specific delay by a determined value in a regular way (on-grid sampling). Indeed, to achieve a good resolution, a key aspect for IDPs, each additional dimension causes an increase of about two orders of magnitude in the experimental time which means that experimental times increase from seconds/minutes for 1D experiments to minutes/hours for 2D experiments, to several hours to a few days for 3D experiments and so on, making higher dimensionality experiments either very poorly resolved or impossible. Several alternates to conventional on-grid sampling of points in indirect dimensions have been proposed and implemented to reduce the time necessary for each additional indirect dimension, still retaining good resolution ( 41-44 ). The large heteronuclear chemical shift dispersion makes exclusively heteronuclear experiments particularly well suited for the exploitation of reduced or sparse sampling methods in the indirect dimensions ( 32 , 36 ). These approaches combined with the LRE enable acquisition of multidimensional experiments with each additional dimension providing an increase in cross peak dispersion and information content ( 45 ). All these features (Fig. 4) are being implemented in a variety of experiments that now provide a robust tool that enables the study at atomic resolution of IDPs as large as several hundreds of amino acids ( 34 , 37 , 46 ), something unthinkable until a few years ago.

A schematic representation of the key approaches recently proposed to reduce the experimental time and/or increase the resolution of NMR experiments. The main determinants of the overall duration of an experiment are the longitudinal relaxation delay as well as the number of data-points necessary (repetitions of the same basic pulse scheme) to construct indirect dimensions. The longitudinal relaxation delay can be drastically reduced by selective manipulation of a subset of spins, promoting faster recovery to equilibrium (top). As an experimental proof, inversion recovery profiles acquired on a standard protein sample (ubiquitin) are shown on the right hand side for the H N and H α of residue 56 with the selective (pink/purple) and non selective modes. The reduction in the number of data-points acquired to construct indirect dimensions of NMR experiments is also schematically depicted in the bottom of the figure. As an example, the (H)CANCO could be acquired in 15 h (right) instead of 72 h (left).


Solid-state NMR analysis of membrane proteins and protein aggregates by proton detected spectroscopy.

Solid-state NMR has emerged as an important tool for structural biology and chemistry, capable of solving atomic-resolution structures for proteins in membrane-bound and aggregated states. Proton detection methods have been recently realized under fast magic-angle spinning conditions, providing large sensitivity enhancements for efficient examination of uniformly labeled proteins. The first and often most challenging step of protein structure determination by NMR is the site-specific resonance assignment. Here we demonstrate resonance assignments based on high-sensitivity proton-detected three-dimensional experiments for samples of different physical states, including a fully-protonated small protein (GB1, 6 kDa), a deuterated microcrystalline protein (DsbA, 21 kDa), a membrane protein (DsbB, 20 kDa) prepared in a lipid environment, and the extended core of a fibrillar protein (α-synuclein, 14 kDa). In our implementation of these experiments, including CONH, CO(CA)NH, CANH, CA(CO)NH, CBCANH, and CBCA(CO)NH, dipolar-based polarization transfer methods have been chosen for optimal efficiency for relatively high protonation levels (full protonation or 100 % amide proton), fast magic-angle spinning conditions (40 kHz) and moderate proton decoupling power levels. Each H-N pair correlates exclusively to either intra- or inter-residue carbons, but not both, to maximize spectral resolution. Experiment time can be reduced by at least a factor of 10 by using proton detection in comparison to carbon detection. These high-sensitivity experiments are especially important for membrane proteins, which often have rather low expression yield. Proton-detection based experiments are expected to play an important role in accelerating protein structure elucidation by solid-state NMR with the improved sensitivity and resolution.


Homonuclear NMR

If the proteins of interest are unlabeled, correlation spectroscopy (COSY) is performed two types of COSY are total correlation spectroscopy (TOCSY) and nuclear Overhauser effect spectroscopy (NOESY). 12 These two-dimensional NMR&rsquos provide two-dimensional spectra. 12 Both axes are chemical shifts, in term of units. 12 These experiments build spin systems, a list of resonances of the chemical shift of protein&rsquos protons. 12 To link the spin systems in the right pathway, NOESY must be used, which uses spin-lattice relaxation. 12 Magnetization is transferred via space in NOESY, which can be used to calculate distance relations. 12 NOESY can also determine chemical and conformational changes. 12 Peak overlap is an issue with homonuclear NMR as a result, it is limited to small proteins. 12

Figure (PageIndex<1>)0. Comparison of two-dimensional COSY and two-dimensional TOCSY spectra for an amino acid (e.g. glutamate or methionine). TOCSY displays diagonal cross-peaks between all protons. COSY only displays cross-peaks between neighbors. This image is from: upload.wikimedia.org/wikiped. /Tocsycosy.jpg it was created by Kjaergaard using GIMP. Figure (PageIndex<1>)1. Two-dimensional NMR displaying the Nuclear Overhauser effect between two nuclei, G and R. The NOE is measured by the blue peak intensity at (r,g) and (g,r) This image is from: https://users.cs.duke.edu/


ASJC Scopus mövzu sahələri

  • APA
  • Standart
  • Harvard
  • Vankuver
  • Müəllif
  • BIBTEX
  • RIS

Tədqiqatın nəticəsi : Jurnalın töhfəsi › Məqalə › ekspert rəyi

T1 - Application of NMR methods to identify detection reagents for use in development of robust nanosensors.

AU - Krishnan, Viswanathan V

N2 - Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a powerful technique for studying bimolecular interactions at the atomic scale. Our NMR laboratory is involved in the identification of small molecules, or ligands, that bind to target protein receptors such as tetanus neurotoxin (TeNT) and botulinum neurotoxin, anthrax proteins, and HLA-DR10 receptors on non-Hodgkin lymphoma cancer cells. Once low-affinity binders are identified, they can be linked together to produce multidentate synthetic high-affinity ligands (SHALs) that have very high specificity for their target protein receptors. An important nanotechnology application for SHALs is their use in the development of robust chemical sensors or biochips for the detection of pathogen proteins in environmental samples or body fluids. Here we describe a recently developed NMR competition assay based on transferred nuclear Overhauser effect spectroscopy that enables the identification of sets of ligands that bind to the same site, or a different site, on the surface of TeNT fragment C (TetC) than a known "marker" ligand, doxorubicin. Using this assay, one can identify the optimal pairs of ligands to be linked together for creating detection reagents, as well as estimate the relative binding constants for ligands competing for the same site.

AB - Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a powerful technique for studying bimolecular interactions at the atomic scale. Our NMR laboratory is involved in the identification of small molecules, or ligands, that bind to target protein receptors such as tetanus neurotoxin (TeNT) and botulinum neurotoxin, anthrax proteins, and HLA-DR10 receptors on non-Hodgkin lymphoma cancer cells. Once low-affinity binders are identified, they can be linked together to produce multidentate synthetic high-affinity ligands (SHALs) that have very high specificity for their target protein receptors. An important nanotechnology application for SHALs is their use in the development of robust chemical sensors or biochips for the detection of pathogen proteins in environmental samples or body fluids. Here we describe a recently developed NMR competition assay based on transferred nuclear Overhauser effect spectroscopy that enables the identification of sets of ligands that bind to the same site, or a different site, on the surface of TeNT fragment C (TetC) than a known "marker" ligand, doxorubicin. Using this assay, one can identify the optimal pairs of ligands to be linked together for creating detection reagents, as well as estimate the relative binding constants for ligands competing for the same site.


Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy

NMR spectroscopy has proven to be a powerful technique to study the structure and dynamics of biological macromolecules. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy is a comprehensive textbook that guides the reader from a basic understanding of the phenomenological properties of magnetic resonance to the application and interpretation of modern multi-dimensional NMR experiments on 15N/13C-labeled proteins. Beginning with elementary quantum mechanics, a set of practical rules is presented and used to describe many commonly employed multi-dimensional, multi-nuclear NMR pulse sequences. A modular analysis of NMR pulse sequence building blocks also provides a basis for understanding and developing novel pulse programs. This text not only covers topics from chemical shift assignment to protein structure refinement, as well as the analysis of protein dynamics and chemical kinetics, but also provides a practical guide to many aspects of modern spectrometer hardware, sample preparation, experimental set-up, and data processing. End of chapter exercises are included to emphasize important concepts. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy not only offer students a systematic, in-depth, understanding of modern NMR spectroscopy and its application to biomolecular systems, but will also be a useful reference for the experienced investigator.


Future prospects

Isotopic labeling is an essential and versatile tool for NMR structural biology. Creative labeling of NMR-sensitive nuclei ( 13 C, 15 N, and 2 H), combined with strategic exploitation of naturally 100% abundant nuclei such as 19 F and 31 P, can advance the structural biology of many insoluble macromolecules important in biology.

For future progress in solid-state NMR structural biology, it will be important to develop a more diverse panel of isotopically labeled compounds and to produce the existing compounds at a more economical level. Since biosynthetically obtained 13 C-labeled precursors are ubiquitous and relatively simple to produce, one of the future challenges is a chemical one, which is to produce a diverse array of specifically labeled specifically labeled amino acids and other small biomolecules with isotopic labels at desired positions.


Videoya baxın: Zülallar (Dekabr 2022).