Məlumat

Kolormetrik analizdə niyə müxtəlif sıxlıqdakı hüceyrələri boşqablara qoyursunuz?

Kolormetrik analizdə niyə müxtəlif sıxlıqdakı hüceyrələri boşqablara qoyursunuz?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Təcrübəmin məqsədi bir kinaz inhibitorunun xərçəng hüceyrələrinin canlılığını azaldıb azaltmadığını görməkdir. Mən 2 müxtəlif hüceyrə sıxlığı 50.000 hüceyrə/quyu və 100.000 hüceyrə/quyu və müxtəlif dozalarda kinaz inhibitorundan istifadə edirəm.


Verdiyiniz şərhlər bəzi səbəblərdir, baxmayaraq ki, onlar həm də hüceyrələrin birləşməsindən asılıdır. Müəlliminiz/professorunuz/məsləhətçiniz həmçinin dərmanın aşağı səviyyədə təsirini görə bildiyinizə əmin olur, həmçinin siqnalda dəyişikliklərin göründüyünə əmin olur - məsələn, dərman fəaliyyəti nəticəsində canlılığın 50% azalması hüceyrələrin sayını 50% azaltmaqla eyni siqnalın azalması? Hansı testin işlədiyini demirsiniz, amma olduqca yaygın və ucuz olan MTT analizidir, bu günlərdə bəzi dəstlər daha yüksək həssaslıq və analizdəki addımların sayını azaltmaq üçün XTT -ə keçid edir (nümunə dəsti) ThermoFisher -in MTT test dəsti ilə müqayisədə Cell Signaling -dən), çünki son kolorimetrik məhsul oxumadan əvvəl həll edilməsini tələb etmir. Nəhayət, olduğunuz laboratoriyadan asılı olaraq, analiz üçün şərtlər hələ optimallaşdırılmamış ola bilər, ona görə də müəlliminiz nəyin ən yaxşı olduğunu görmək üçün sizdən bir neçə fərqli sıxlıq test etməyinizi istəyir.


Hüceyrə Mədəniyyəti üçün Faydalı Nömrələr

Hüceyrə kulturası üçün istifadə olunan müxtəlif ölçüdə qablar və flakonlar var. Müxtəlif ölçülü mədəniyyət qabları üçün səth sahəsi və dissosiasiya məhlullarının həcmi kimi bəzi faydalı rəqəmlər aşağıda verilmişdir.

Kataloq nömrəsiSəth sahəsi (sm 2)Toxum sıxlığı*Birləşmə zamanı hüceyrələr*Versene
(ml 0,05% EDTA). təqribən. həcm
Tripsin
(ml 0,05% tripsin, 0,53 mM EDTA). təqribən. həcm
Böyümə mühiti
(ml). Təxminən. həcm
Yeməklər
35 mm1504601503188.80.3 x 10 6 1,2 x 10 6 112
60 mm15046215028821.50,8 x 10 6 3,2 x 10 6 335
100 mm15046415035056.72.2 x 10 6 8,8 x 10 6 5512
150 mm1504681683811455,0 x 10 6 20,0 x 10 6 101030
Mədəniyyət lövhələri
6-yaxşı1406759.60,3 x 10 6 1,2 x 10 6 111 -dən 3 -ə qədər
12-quyu1506283.50.1 x 10 6 0,5 x 10 6 0.4 - 10.4 - 11 - 2
24 - quyu1424751.90,05 x 10 6 0,24 x 10 6 0.2 ilə 0.3 arasında0.2 ilə 0.3 arasında0,5 ilə 1,0 arasında
48- quyu1506871.10,03 x 10 6 0.12 x 10 6 0.1 ilə 0.2 arasında0,1 - 0,20,2 ilə 0,4 arasında
96 - quyu1670080.320.01 10 6 0.04 x 10 6 0,05 - 0,10,05 - 0,10.1 ilə 0.2 arasında
Şişələr
T-25156367156340250.7 x 10 6 2.8 x 10 6 333–5
T-75156499156472752,1 x 10 6 8,4 x 10 6 558–15
T-1751599101599201754,9 x 10 6 23,3 x 10 6 171735–53
T-2251599341599332256,3 x 10 6 30 x 10 6 222245–68
*Toxum sıxlığı hər bir mədəniyyət qabı növü üçün aşağıdakı kimi verilir: Yeməklər və Şişələr: Hər gəmidə hüceyrələr Kültür lövhələri: Quyu başına hüceyrələr.

†Birləşən boşqab, qab və ya kolbadakı hüceyrələrin sayı hüceyrə növünə görə dəyişəcək. Bu cədvəl üçün HeLa hüceyrələrindən istifadə edilmişdir.


Sitotoksikliyi Ölçmək üçün Təhlil Protokolu

Tələb olunan əlavə reagentlər:

  • Mədəniyyət mühiti, məsələn, 10% istiliklə inaktivləşdirilmiş FCS (dölün dana serumu, 12106C), 2 mM qlutamin (G6392) və 1 mkq/ml aktinomisin C1 (aktinomisin D, A9415) ehtiva edən RPMI 1640 (R0883).
  • Bir antibiotik istifadə edilərsə, əlavə olaraq penisilin/streptomisin və ya gentamisin əlavə edin
  • Şiş nekroz faktoru-α, insan (hTNF-α) (10 μg/ml), steril (T6674).

Protokol:

İnsan şişi nekroz faktoru-α-nın (hTNF-α, T6674) WEHI-164 hüceyrələrinə (siçan fibrosarkomu, 87022501) sitotoksik təsirinin təyin edilməsi üçün (Şəkil 2).

  1. WEHI-164 hüceyrələrini 1 µg/ ml aktinomisin C1 ilə 3 saat ərzində 37 ° C və 5-6.5% CO ilə 1 × 10 6 hüceyrə/ ml konsentrasiyasında qablaşdırın.2.
  2. 1 μg/ml aktinomisin C1 və müxtəlif miqdarda hTNF-α (son konsentrasiya, məsələn, 0,001-0,5 ng/ml) olan 100 μl mədəniyyət mühitində 5 × 10 4 hüceyrə/ quyu konsentrasiyasında toxum hüceyrələri mikroplitələrə (toxuma kulturası dərəcəsi) , 96 quyu, düz dibi).
  3. Hüceyrə mədəniyyətlərini +37 ° C və 5-6,5% CO-da 24 saat inkübe edin2.
  4. İnkubasiya dövründən sonra hər quyuya 10 μl MTT etiketləmə reagenti (son konsentrasiya 0,5 mq/ml) əlavə edin.
  5. Mikroplakanı 4 saat nəmlənmiş bir mühitdə inkübe edin (məsələn, +37 ° C, 5-6.5% CO)2).
  6. Hər quyuya 100 μl Solubilizasiya məhlulu əlavə edin.
  7. Plitənin nəmlənmiş bir mühitdə (məsələn, +37 ° C, 5-6,5% CO) inkubatorda dayanmasına icazə verin.2).
  8. Bənövşəyi formazan kristallarının tam həll olunduğunu yoxlayın və mikroplate (ELISA) oxuyucusu ilə nümunələrin absorbsiyasını ölçün. Formazan məhsulunun absorbansını ölçmək üçün istifadə olunan ELISA oxuyucusu üçün mövcud olan filtrlərə görə dalğa uzunluğu 550 ilə 600 nm arasındadır. İstinad dalğa uzunluğu 650 nm -dən çox olmalıdır.

Şəkil 2. MTT analizindən istifadə edərək WEHI-164 hüceyrələrində (siçan fibrosarkoması) rekombinant insan TNF-α (hTNF-α) sitotoksik aktivliyinin təyini.


Ümumi baxış

Məhsul adı

Aşkarlama üsulu

Nümunə növü

Təhlil növü

Test vaxtı

Məhsula ümumi baxış

Hüceyrədənkənar Oksigen İstifadəsi Təhlil Kiti ab197243, hüceyrədənkənar oksigen istehlakı dərəcələrinin (OCR) real vaxt rejimində kinetik analizi üçün qarışdırılmış və oxunan, 96 quyulu flüoresan lövhə oxuyucu analizidir. Oksigen istehlakı, hüceyrə tənəffüs sürətinin və mitokondriyal funksiyanın bir ölçüsüdür.

Təhlil təcrid olunmuş mitoxondriya və hüceyrə kulturaları üçün optimallaşdırılıb və toxumalar, ferment preparatları və kiçik orqanizmlərlə istifadə oluna bilər.

Bu analiz dəstində istifadə olunan floresan boya oksigenlə söndürülür. Boya 360-380 nm-də (maksimum 380) həyəcanlandırır və 630-680 nm-də (maksimum 650) emissiya edir. Ab197242 olaraq ayrıca mövcuddur.

Analizdə, oksigenin analiz mühitinə yayılmasını məhdudlaşdırmaq üçün analiz mühitinin üstünə bir yağ təbəqəsi əlavə olunur. Mitoxondrial tənəffüs analiz mühitində oksigeni tükəndirdikcə, flüoresan boyanın söndürülməsi azalır və flüoresan siqnalı mütənasib olaraq artır.

Reaksiya dağıdıcı deyil və tamamilə geri çevrilir (oksigenə həssas boya istifadə edilmir), analiz müddətini və dərman müalicəsini təmin edir.

Qeydlər

Ya da metabolitlər, metabolik fermentlər, mitokondriyal funksiya və oksidləşdirici stres üçün digər analizlər üçün tam metabolizm təhlili bələdçisini nəzərdən keçirin.


Qeyri-ion mühitdə izopiknik sentrifuqasiya

Qradientlərin təhlilinə təsir edən amillər

Daha əvvəl qeyd edildiyi kimi, sakkarid məhlullar fermentlərin fəaliyyətini maneə törədir və bəzi fermentlər digərlərindən daha həssasdır. Buna görə də, marker fermentlərinin gradient üzrə paylanmasını öyrənərkən, hər bir analizdə saxaroza konsentrasiyaları oxşar olsun deyə tənzimlənməlidir. Saxaroza eyni zamanda glikogenin, RNT-nin orcinol qiymətləndirməsinin, DNT-nin difenilamin qiymətləndirilməsinin, zülalın mikro-biuret qiymətləndirilməsinin qarşısını alır və Lowry protein analizi prosedurunun həssaslığını azaldır (Hinton, Burge və Hartman, 1969 Hartman və b., 1974). Bununla belə, monosaxaridlər və disakaridlər, məsələn, nümunənin turşu ilə çökdürülməsi və ya seyreltildikdən sonra materialın qranullaşması və ya dializ yolu ilə asanlıqla çıxarıla bilər.

Qradient fraksiyaların radioaktivliyini ölçərkən, suda həll olunan sintillyantın əlavə edilməsi şəkərdə həll olunan maddənin çökməsinə səbəb ola bilər. Bununla birlikdə, nümunələri seyreltməklə və ya sintilantı diqqətlə seçməklə bu cür problemlərin qarşısını almaq olar (bax. S. 54). Yağış olmasa belə, nümunələrdəki saxaroza β-emitentlərini, xüsusən də 3 H işarəli birləşmənin zəif β-emissiyasını söndürə bilər (Dobrota və Hinton, 1973).


Hüceyrələrin klonogen analizi in vitro

Klonojenik analiz və ya koloniya meydana gəlməsi təhlili bir in vitro tək bir hüceyrənin koloniyaya çevrilmə qabiliyyətinə əsaslanan hüceyrə sağ qalma təhlili. Koloniyanın ən az 50 hüceyrədən ibarət olduğu təyin edilmişdir. Təhlil, mahiyyətcə, populyasiyanın hər bir hüceyrəsini "məhdud" bölünmə qabiliyyətinə görə yoxlayır. Klonogen analiz ionlaşdırıcı radiasiya ilə müalicədən sonra hüceyrə reproduktiv ölümünü təyin etmək üçün seçim üsuludur, lakin digər sitotoksik agentlərin effektivliyini müəyyən etmək üçün də istifadə edilə bilər. Toxumlanmış hüceyrələrin yalnız bir hissəsi koloniya istehsal etmək qabiliyyətini saxlayır. Müalicədən əvvəl və ya sonra, hüceyrələr 1-3 həftə ərzində koloniyalar meydana gətirmək üçün uyğun seyreltmələrlə toxumlanır. Koloniyalar qlutaraldehidlə (6.0% v/v) bərkidilir, kristal bənövşəyi (0,5% w/v) ilə boyanır və stereomikroskopla sayılır. Radiasiya dozasının sağ qalma əyrilərinin təhlili üçün bir metod daxildir.


Nəticələr və Müzakirə

Şəkil 2, alamarBlue ® -nin ortalamadan sonra və standart sapmalar daxil olmaqla faiz azalmasını göstərir. Bütün mədəniyyət dövründə A substratı üçün daha böyük alamarBlue ® azalması (yəni hüceyrə artımının daha yüksək səviyyələri) müşahidə olunur. Hər iki substratda da ilk 15 gün ərzində mədəniyyətin inkişafı ilə hüceyrə çoxalması artdı. Hər iki substratda böyüyən hüceyrələrin metabolik fəaliyyəti 15-ci günə qədər yavaşlayır və bu, səthlərin birləşməyə doğru irəlilədiyini göstərir.

Şəkil 2: A və B substratları üçün mədəniyyət vaxtının bir funksiyası olaraq alamarBlue faizinin azalması.

YEMƏK HİJYENİ YOXLANMASI ÜÇÜN TƏZİL METODLAR

Matthias Upmann, Christine Bonaparte, Qida Mikrobiologiyası Ensiklopediyasında, 1999

Optik üsullar

Kolorimetriya və fluorometriya: Mikrob metabolik aktivliyi ilə əlaqəli spesifik fiziki və ya kimyəvi dəyişikliklər (pH, oksidləşmə/azalma potensialı, enzimatik transformasiyalar) nümunə inkubasiyası zamanı əlavə edilmiş bir reagent boyanın rənginin dəyişməsi, floresans və ya rəng intensivliyi ilə göstərilə bilər. Göstərilməli olan metabolik dəyişikliyə bağlı olaraq bir çox xromogen və florojenik boyalar istifadə olunur. Saf mədəniyyətlər üçün bir çox minyatür və kompüter dəstəyi və ya hətta tam avtomatlaşdırılmış identifikasiya sistemi bu prinsipə əsaslanır.

Kolorimetriya və fluorometriya, rəng reaksiyası və ya florokrom meydana gəlməsi üçün lazım olan inkubasiya müddətini ölçməklə kəmiyyət məqsədləri üçün də istifadə edilə bilər. Geniş məlum olan göstəricilər oksidləşmə/reduksiya göstəriciləri kimi pH dəyişmələrini və ya rezazurin, metilen mavisi və trifeniltetrazolium xloridini aşkar etmək üçün lakmus və bromokrezol bənövşəyidir.

Yansıtma kolorimetrləri və ya flüorometrlərdən istifadə edən tam avtomatlaşdırılmış prosedurlar artıq mövcuddur. Bu üsullar ümumi mikrob sayılarının və ya xüsusi mikroorqanizmlərin sürətli qiymətləndirilməsi, məhsulun raf ömrü sabitliyi, başlanğıc mədəniyyət aktivliyi və antibiotik testi üçün tətbiq olunur. Daha ətraflı məlumat üçün Cədvəl 2 -ə baxın.

Turbidimetriya: Hüceyrə sayının artması maye artım mühitinin optik sıxlığının artmasına səbəb olur. Buna görə də, maye nümunə inkubasiya edildikdə, işıq şüası getdikcə transilluminasiyada zəifləyəcək. Nümunənin seyreltilməsini, böyümə mühitini və inkubasiya temperaturunu dəyişdirməklə nəticəni xüsusi bakteriya növlərinə və ya sayına qədər daraltmaq olar. Bəzi metodoloji xüsusiyyətlər Cədvəl 2 -də verilmişdir.

Turbidimetriya vitamin bioassaylarında və dezinfeksiyaedici testlərdə geniş tətbiq olunur. Qida keyfiyyətinə nəzarətdə sterillik testi üçün istifadə edilmişdir. Tətbiqi, qidaların (yağ kürəcikləri, qan hüceyrələri, qida hissəcikləri) fon bulanıklığı ilə məhdudlaşa bilər.

Piruvat təyini: Piruvat bakterial laktoza metabolizmində əsas birləşmədir və süd keyfiyyətinin monitorinqi üçün göstərici kimi xidmət edə bilər. Piruvat, piruvatın enzimatik parçalanmasında kofaktor olan azalmış nikotinamid -adenin dinükleotidin (NADH) spektrofotometrik aşkarlanması ilə dolayı yolla ölçülür. Somatik hüceyrələr südün piruvat tərkibinə qatqı təmin etdiyi üçün bütün bakteriyalar piruvat əmələ gətirmir, bu metabolitlə ümumi mikrob sayı arasındakı əlaqə məhduddur (bax: Cədvəl 2).


MTT və MTS Assay arasındakı oxşarlıqlar

  • MTT və MTS təhlili, hüceyrə canlılığını in vitro olaraq təyin edən iki növ analizdir.
  • Hər iki analiz test molekullarının hüceyrə yayılmasına və sitotoksisiteye təsirini qiymətləndirməyə kömək edir.
  • Həm də hər ikisi də kolorimetrik analizlərdir.
  • Bundan əlavə, onlar hüceyrələrin tetrazolium boyasını formazanına endirmək qabiliyyətinə əsaslanaraq hüceyrələrin metabolik fəaliyyətini qiymətləndirirlər.
  • Bundan əlavə, yuxarıdakı azalmadan məsul olan ferment, canlı hüceyrələrdə mövcud olan NAD (P) H-dən asılı olan hüceyrə oksidoredüktazadır.
  • Üstəlik, azalma reaksiyası hüceyrə xaricində plazma membranının elektron nəqli ilə baş verir.
  • MTT reaktifi işığa həssasdır, buna görə də bu analizlər qaranlıqda aparılmalıdır.
  • Bundan əlavə, tetrazolium boyası əlavə edildikdən sonra hər iki analiz üçün inkubasiya müddəti eynidır və 37 ° C -də 1 ilə 4 saat arasındadır.

Göbələk biofilmlərinin formalaşması və onun antifungal həssaslıq testinə tətbiqi üçün sadə və təkrarlana bilən 96 quyu boşqab əsaslı üsul

Mantar infeksiyası halları son onilliklərdə xeyli artmışdır. Çox vaxt bu infeksiyalar, implantasiya edilmiş biomateriallarda və/və ya ana səthlərdə biofilmin əmələ gəlməsi ilə əlaqədardır. Bunun mühüm klinik təsirləri var, çünki göbələk biofilmləri planktonik (sərbəst yaşayan) populyasiyalardan kəskin şəkildə fərqlənən xüsusiyyətlərə malikdir, o cümlədən antifungal agentlərə qarşı artan müqavimət. Burada, antifungal həssaslıq testləri üçün asanlıqla uyğunlaşan, göbələk biofilmlərinin əmələ gəlməsi üçün sürətli və yüksək dərəcədə təkrarlanan 96 quyulu mikrotiter əsaslı bir üsulu təsvir edirik. Bu model, metabolik cəhətdən aktiv olan oturaq hüceyrələrin tetrazolium duzunu (2,3-bis(2-metoksi-4-nitro-5-sulfo-fenil)-2H-tetrazolium-5-karboksanilid) suya salmaq qabiliyyətinə əsaslanır. həll olunan narıncı formazan birləşmələri, intensivliyi daha sonra mikrotitrəkilli lövhə oxuyucusu istifadə edərək təyin edilə bilər. Bütün prosedurun tamamlanması təxminən 2 gün çəkir. Bu texnika biofilmin əmələ gəlməsini və kəmiyyətini asanlaşdırır, onu müxtəlif laboratoriyalar arasında daha etibarlı və müqayisə edilə bilən edir, biofilmlərin antifungal həssaslıq testinin standartlaşdırılması istiqamətində zəruri addımdır.