Məlumat

Qlükokinazanın fəaliyyəti

Qlükokinazanın fəaliyyəti


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Solomon və digərlərindən, 2013 ACC Sintetik biologiyadan və bu videodan:

Burada qlükoza üçün 2 rəqabət reaksiyası var - biri ferment olaraq glk, digəri isə gdh ilə ferment.

Qrafikdə y oxu qlükonat məhsuldur və x oxu glk aktivliyidir. Məntiqlə glk aktivliyi artdıqca qlükonat məhsuldarlığı azalmalıdır.

Qrafikin əksəriyyəti üçün belədir. Bəs niyə ilkin olaraq qlükonat istehsalında artım var (glk aktivliyi 0,2 ilə 0,27 arasında olduqda)?


Əvvəlcə bu adamların nəyə nail olmaq istədiklərinə bir nəzər salaq: Müəyyən məhsullar hazırlamaq üçün bakteriyalardan istifadə etmək istəyirlər. Bunun üçün onlar bakterial metabolizmdən alternativ yolların olmadığı addımlarda istifadə etmək istəyirlər. Bu addımlardan biri, qlükoza qlükoza-6-fosfata (G6P) fosforilləşdiyi zaman qlikolizin ilk addımıdır. Bakteriyalarda fosforlaşma, fosfat mənbəyi olaraq fosforenolpiruvatı istifadə edən "fosfoenolpiruvat (PEP): karbohidrat fosfotransferaz sistemi" tərəfindən hüceyrəyə qlükoza idxalı zamanı aparılır. Bunun dezavantajı var ki, hüceyrənin içərisində demək olar ki, sərbəst qlükoza yoxdur, lakin əsasən G6P.

Bu problemin öhdəsindən gəlmək üçün qrup hüceyrələrin sağ qalmasını təmin etmək üçün alternativ daşıyıcılar (qlükozanı hüceyrəyə daşıyan) və Qlükokinazı (Glk) ifadə etdi. Bu addımlar qlükoza idxalını və fosforlaşmasını ayırdı və hüceyrə daxilində sərbəst qlükoza ilə nəticələndi. Bu pulsuz qlükoza artıq müxtəlif proseslərdə istifadə edilə bilər. Glik qlükozanı fosforiləşdirdiyi üçün glikoliz yoluna daxil olduğu üçün glikolizə də icazə verir. Glk-in fərqli ifadəsinin hüceyrələrin canlılığına necə təsir etdiyini yoxlamaq üçün fərqli mutantlar yaratmaq üçün Glk müxtəlif promotorların altına qoyuldu.

Qlükozanı da metabolizə edən başqa bir fermenti gətirmək üçün güclü, IPTG induksiya edən promotoru olan plazmiddən ifadə edilən qlükoza dehidrogenazdan (Gdh) istifadə etdilər. Daha sonra qlükonat istehsalına və hüceyrə canlılığına təsirini yoxlamaq üçün fərqli konsentrasiyalarda IPTG istifadə etdilər (buna girməyəcəyəm).

Yuxarıdakı rəqəm kağızdakı rəqəm 5-dir və Gdh ifadəsini induksiya etmək üçün istifadə olunan üç fərqli IPTG konsentrasiyasının təsirini göstərir. 10 və 25uM IPTG üçün qlükonatın məhsuldarlığı azalır, Glk aktivliyi bir o qədər yüksək olur. Yalnız kiçik fəaliyyət daha az məhsuldarlıq göstərir. Bu, ən yüksək konsentrasiya üçün tamamilə fərqlidir, lakin burada hüceyrələr çox güman ki, Gdh-nin yüksək ifadəsi ilə qarışır (bu da çox enerji sərf edir).

Məqalədə onlar heç bir izahat vermirlər və ya ən azı ən kiçik Glk fəaliyyətində qlükonatın əmələ gəlməsinin davranışını müzakirə edirlər (bu barədə rəyçilərin şərhlərini oxumaq istərdim). Məlumatlardan daha yüksək bir istehsal gözləyirdim. Düşük enerji istehsalının (az miqdarda G6P az glikoliz deməkdir) hüceyrələrə mənfi yan təsirləri olması mümkündür. Gdh, hüceyrədəki bəzi digər maddələr tərəfindən aşağı Glk fəaliyyətlərində inhibe edilə bilər. Gdh aktivliyi, məsələn, daha yüksək nukleotidtrifosfatlar (ATP və s.) Glk -in kofaktor olaraq ATP -yə ehtiyacı olduğundan, aşağı Glk fəaliyyətlərində ATP konsentrasiyasının Gdh fəaliyyətinə mənfi təsir göstərməsi mümkündür (öz fərziyyəm).

Yoxsa bu, sadəcə təcrübədən bir əsərdir. Bunun tənqid oluna biləcək bəzi məqamları var (mən burada rəyçilərin şərhlərini də görmək istərdim). Birincisi, səhv çubuqları olduqca böyükdür, buna görə də bu, bir qədər fərqli ola bilər. Mətndə məlumatların əldə edildiyini qeyd edirlər

Təmsilçi bir təcrübədə ən azı 2 paralel mədəniyyət

Mən məlumatları daha etibarlı edəcək bir neçə təkrarlama (ən azı üç müstəqil təcrübə) gözləyərdim. Sonra (və bu nöqtə daha vacibdir) aşkarlama sistemindəki məhdudiyyətlər səbəbindən Glk və Gdh'in eyni mədəniyyətdəki fəaliyyətini ölçə bilmirlər. Glk aktivliyinin ölçülməsi sonda NADH-də konsentrasiya dəyişikliyini ölçən birləşdirilmiş sistemdən istifadə edir, Gdh isə NADPH-ni ko-faktor kimi istifadə edir. Hər iki versiya bir spektri ölçməklə fərqləndirilə bilməz, buna görə də Glk -in aktivlik ölçüləri yalnız yoluxmamış hüceyrələrdə baş verə bilər. İfadə xanadakı şərtləri dəyişdiyindən (və necə olduğunu bilmirik), mən bu barədə ən azı bir qədər müzakirə gözləyərdim, lakin o, yoxdur.


Qlükokinaz aktivliyinin qısa müddətli nəzarəti: tənzimləyici bir proteinin rolu

Qlükokinaz, məməlilərin toxumalarında mövcud olan dörd heksokinazdan biridir. Qan qlükoza konsentrasiyasındakı dəyişikliklərə cavab verməli olan iki hüceyrə tipində, qaraciyərin parenximal hüceyrəsində və pankreas adacıqlarının β-hüceyrələrində ifadə edilir. Birincilər qəbul edilən qlükozanın mühüm hissəsinin metabolizmi və saxlanmasından məsuldur, ikincisi isə qanda qlükoza səviyyəsinin artmasına cavab olaraq insulin ifraz edir. Qlükokinazanın əsas xüsusiyyətlərindən biri onun qlükoza üçün nisbətən aşağı yaxınlığına malik olması və monometik ferment olmasına baxmayaraq, bu substrat üçün müsbət əməkdaşlıq nümayiş etdirməsidir. Bundan əlavə, digər heksokinazalardan fərqli olaraq, qlükoza 6-fosfatın mikromolyar (fizioloji) konsentrasiyası ilə deyil, fruktoza 6-fosfat və fruktoza 1-fosfatın təsirini ötürən tənzimləyici zülal tərəfindən inhibə edilir. Bu araşdırmanın məqsədi qlükokinazın tənzimlənməsinin bu aspektlərini təsvir etməkdir.- Van Schaftingen, E., Detheux, M., Veiga da Cunha, M. Bir tənzimləyici proteinin qlükokinaz aktivliyi rolunun qısa müddətli nəzarəti. FASEB J. 8: 414-419 1994.


PERSPEKTİF məqalə

  • 1 Tərcümə Biyomedikal Elmlər Proqramı, Graduate College, Ohio Universiteti, Afina, OH, Amerika Birləşmiş Ştatları
  • 2 Diyabet İnstitutu, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio Universiteti, Afina OH, Amerika Birləşmiş Ştatları
  • 3 Biomedikal Elmlər Bölümü, Osteopatik Tibb Heritage College, Ohio Universiteti, Afina, OH, Amerika Birləşmiş Ştatları

Pankreas beta hüceyrələri, insulini sintez və ifraz edə bilən bədəndəki yeganə hüceyrələrdir. Qlükoza ilə stimullaşdırılan insulin ifrazı prosesində, beta hüceyrələri insulini dövriyyəyə buraxır və GLUT4-dən asılı olan qlükoza periferik toxumaya daxil olmasını stimullaşdırır. İnsülin normal olaraq qaraciyərdə siqnal verməyə kömək edən nəbzlərdə ifraz olunur. Tip 2 diabet diaqnozu qoyulmazdan çox əvvəl, beta-hüceyrələri qlükoza həddindən artıq həssas olur, pulsasiya qabiliyyətinin pozulmasına və aclıq qlükoza səviyyələrində həddindən artıq stimullaşdırmaya səbəb olur. Nəticədə insulinin hipersekresiyası qaraciyərdə zəif insulin siqnalına və klirensə səbəb ola bilər ki, bu da hiperinsulinemiya və insulin müqavimətinə səbəb olur. Davam edən həddindən artıq aktivlik, nəticədə beta 2 hüceyrələrinin tükənməsinə və tip 2 diabetin başladığı uğursuzluğa səbəb ola bilər. Həddindən artıq stimullaşdırmanın mənfi təsirlərinin qarşısını almaq və ya ləğv etmək üçün beta hüceyrə aktivliyi azalda bilər. Klinik tədqiqatlar, yeni diabet hallarını geri qaytarmaq üçün beta hüceyrə istirahətinin potensialını ortaya qoydu, lakin müalicələrin davamlı faydaları yoxdur. Bu perspektivdə biz beta-hüceyrədə həddindən artıq aktiv qlükokinaz fəaliyyətini azaldan bir müdaxilə təklif edirik. Qlükokinaza insulin ifrazına yüksək nəzarət etdiyi üçün beta hüceyrənin qlükoza sensoru kimi tanınır. Buna görə də, glikolitik həddindən artıq aktivlik xəstəliyin erkən mərhələsində hiperinsulinemiyaya səbəb ola bilər və normal stimul-sekresiya birləşməsini bərpa etmək üçün azaldıla bilər. Əvvəllər diabetik siçan adacıklarında glukokinaz aktivliyinin azalmasının pulsatiliyi bərpa edə biləcəyini və insulin ifrazını artıra biləcəyini bildirmişdik. Bu əks-intuitiv tapıntıya əsaslanaraq, biz pulsatil insulin ifrazının əhəmiyyətini nəzərdən keçiririk və prediyabetik hiperinsulinemiya zamanı beta hüceyrəsində qlükoza qəbulunun normallaşdırılmasının pulsatilliyi bərpa edə və qlükoza homeostazını necə yaxşılaşdıra biləcəyini vurğulayırıq.


Nəticələr

Qlükokinaz β-hüceyrələrdə argininlə qarşılıqlı təsir göstərir

Arjininin GSIS-i nə dərəcədə dəstəklədiyini qiymətləndirmək üçün NIT-1 β-hüceyrələri arginin tükənmiş mühitdə 30 dəqiqə əvvəlcədən kultivasiya edilmişdir. Bundan sonra, qlükoza ortama əlavə edildi və insulin ifrazı analiz edildi (Şəkil 1a). Argininin tükənməsi, NIT-1 β-hüceyrələrindən GSIS-ni əhəmiyyətli dərəcədə kökündən kəsdi. Maraqlıdır ki, G6P administrasiyası həm arginin tükənməsi ilə, həm də olmadan dozadan asılı insulin sekresiyasına səbəb oldu (Şəkil 1b). G6P tətbiqi ilə hüceyrədaxili G6P artımı kütlə spektrometriyası ilə təsdiq edildi (Əlavə şəkil 1a, b). Beləliklə, arginin qlükozaya cavab olaraq insulin ifrazı üçün lazımdır, lakin G6P-yə deyil, bu arginin β-hüceyrələrində GCK tərəfindən G6P istehsalında rol oynaya biləcəyini göstərir.

a, b Qlükoza-6-fosfat (G6P) insulin ifrazının azalmasından xilas oldu. LNIT-1 hüceyrələrində arginin. iştirakı ilə L-arginin, qlükoza və G6P-nin səbəb olduğu insulin ifrazı. Yoxluğunda L-arginin, yalnız G6P (açıq dairə b), lakin qlükoza deyil (açıq dairə a) səbəb olan insulin ifrazı. Məlumatlar ortalama ± S.E. (n = 4). c Arginin-immobilizə edilmiş maqnit nanomuncuqların hazırlanması 18 . FG muncuqlarında olan epoksi qrupları NH tərəfindən aminolizə edilmişdir4OH və EGDE ilə birləşdirilir. Epoksi qrupları NH tərəfindən yenidən aminolizə edildi4OH. Muncuqlar daha sonra karboksil qrupları ilə birləşdirildi LEDC, trimetilamin və DMAP ehtiva edən DMF -arginine (Əlavə Şəkil 1). d qlükokinaza bağlanır L-arginin və qlükoza birbaşa. Qlükokinaz-HA ekspressor vektoru ilə transfekte edilmiş HEK293 hüceyrəsində istehsal olunan qlükokinaz, mənfi nəzarət olaraq arginin və ya qlükoza olmayan muncuqlardan istifadə edərək, arginin və ya qlükoza ilə immobilizasiya edilmiş muncuqlarla qarışdırılır. Hər ikisi L-arginin və qlükoza qlükokinaz-HA bağlayır. e İmmobilizasiya olunmuş qlükoza bağlı olan qlükokinaz-HA elutasiya edilmişdir L-arginin və qlükoza. Qlükokinaz-HA-ya bağlıdır L-argin muncuqları ilə elüsyon edilmişdir L-arginin, lakin qlükoza ilə deyil. f Qlükokinaza insulinlə NIT-1 hüceyrələrində endoplazmatik retikulumda (ER) və Qolji aparatında deyil, ifrazat qranulunda birgə lokallaşdırılır. Qlükokinaz (yaşıl), insulin (magenta), ER (magenta, KDEL), cis-Golgi (magenta, GM130) və nucleolus (mavi) ləkələnmiş və birləşdirilmiş şəkillər altda göstərilmişdir. Qlükokinaza insulinlə yüksək kolokalizasiya göstərdi və ER və Golgi şəbəkəsi ilə daha az kolokalizasiya etdi, bu da qlükokinazanın əsasən ifrazat veziküllərində yerləşdiyini göstərir. Ölçü çubuğu 20 μm.

Daha əvvəl HeLa hüceyrə ekstraktında PFK1, PFK2 və HXK1-in argininlə immobilizasiya edilmiş maqnit nanobaz texnologiyasından istifadə edərək arginin bağlayan zülallar olduğunu göstərdik (Şəkil 1c, Əlavə Şəkil 1 və ref. 18). PFK1/2 və HXK1-in 22,23 qlikoliz fermentləri olduğunu nəzərə alsaq, arginin qlikolizin əsas tənzimləyicisi kimi xidmət edə bilər. Beləliklə, argininin GCK-ni bağladığını və β-hüceyrələrdə GCK aktivatoru kimi işlədiyini fərz etdik. Qlükoza və ya argininlə immobilizasiya edilmiş maqnit nano muncuqları istifadə edərək sınaqdan keçirildikdə (Şəkil 1c, Əlavə Şəkil 1 və istinad 18), GCK həm qlükoza, həm də argininə bağlanır (Şəkil 1d). Sonra, qlükoza və argininin GCK-nın hərəkətsizləşdirilmiş maqnit nanoboncuklara bağlanması üçün rəqabət edib-etmədiyini yoxladıq (Şəkil 1e). İmmobilizə edilmiş qlükoza ilə bağlanmış GCK qlükoza və arginin tərəfindən elüt edilmişdir, baxmayaraq ki, GCK-nin immobilizə edilmiş argininlə bağlanması qlükoza ilə daha az rəqabət aparırdı (Şəkil 1e), bu da GCK-nın qlükoza ilə müqayisədə argininə daha güclü bağlandığını göstərir. Sonra, GCK-nın hüceyrədaxili lokalizasiyası NIT-1 hüceyrələrində immunohistokimya ilə təhlil edildi (Şəkil 1f). GCK siqnalı əsasən əvvəlki hesabat 24,25 ilə razılaşdırılaraq ER -də sekretor veziküllərdə insulin və qismən proinsulin ilə birləşdirilmişdir.

L-Arginin G6P istehsalını və insulin ifrazını stimullaşdırır

Şəkil 1, argininin GCK ilə birbaşa qarşılıqlı əlaqə vasitəsi ilə GSIS -i təbliğ etdiyini göstərir. Növbəti addım olaraq, argininin NIT-1 β-hüceyrələrində GCK aktivliyini dəyişdirib-dəyişdirmədiyini təhlil etdik. Qlükoza qəbulu və ya L-arginindən NIT-1 hüceyrələrinə G6P artdı, lakin stereoizomer D-arginin G6P-ni artıra bilmir (Şəkil 2a). Maraqlıdır ki, insulin ifrazının induksiyası 7 mmol/l qlükozada 0,5-1,5 dəqiqədə insulin sekresiyasında fərq olaraq görülür. L-argininin tətbiqi ilə müqayisədə D-arginin (şəkil 2b). L-Argininin insulin ifrazını daha güclü stimullaşdırdı D-arginin qlükoza varlığında, lakin qlükoza olmadıqda deyil (arginin yoxdur və Şəkil 2c, d). GCK bağlandı L-arginine tərəfindən elüsyon edilmişdir L-arginin, lakin deyil D-argininin yalnız olduğunu ifadə edir L-arginine GCK ilə qarşılıqlı təsir göstərir (Şəkil 2e). Birlikdə çəkilmiş, L-arginin stereospesifik olaraq GCK-ni bağlayır, G6P tərkibini artırır və insulin ifrazını təşviq edir. Qeyd edək ki, qlükozadan asılı olmayan insulin ifrazı hər ikisi tərəfindən stimullaşdırıla bilər L- və D-arginine, ehtimal ki, hər ikisini bağlayan başqa bir arginin bağlayan protein UGGT1 səbəbiylə L- və D-arginin (Əlavə şəkil 2a – d) 26.

a L-Arginine (2 mmol/l) və qlükoza (7 mmol/l) NIT-1 β-hüceyrələrində G6P istehsalını stimullaşdırdı, lakin stereoizomer D-arginin (2 mmol/l) G6P istehsalına səbəb olmamışdır. Məlumatlar orta ± S.E. (n = 6). b Bir mmol/l L-argininin səbəb olduğu insulin ifrazı bir mmol/l-dən bir qədər çoxdur D-arginin NIT-1 β-hüceyrələrində olur. L- və ya D-arginine tətbiq edildi L-argininin tükənmiş NIT-1 hüceyrələri. Məlumatlar orta ± S.E. (n = 3). *səh & lt 0.05 (n = 6). c Qlükoza varlığında, L-arginine daha çox insulin ifrazını stimullaşdırdı D-arginin. Qlükoza olmadıqda hər ikisi də L- və D-arginine eyni şəkildə insulin ifrazını stimullaşdırdı. Məlumatlar ortalama ± S.E. (n = 3). *səh & lt 0.05 (n = 6). d Bir mmol/l L-arginin qlükozadan asılı insulin ifrazını artırır. Məlumatlar orta ± S.E. (n = 3). *səh < 0,05 (n = 6). e Qlükokinaza ilə bağlıdır L-arginine amma bağlanmadı D-arginin. Qeyd edək ki, UGGT1 ilə bağlanır L- və D-arginine (Əlavə şəkil 2a və ref. 26).

Arginin siqnalında üç glutamat qalığı iştirak edir

GCK daxilində bağlanmaq üçün lazım olan qalıqları müəyyən etmək L-argininin və insulin ifrazını stimullaşdırır L-arginin, beş GCK mutantı (Y214C, E256K, A456V, E157T və E443Δ) hazırlanmış və təhlil edilmişdir (Şəkil 3 və Əlavə Şəkil 3). Qalıqlar MODY2 xəstə mutasiyaları 11,26,27,28,29,30 və katyonik amin turşusu argininin turşu glutamat qalığı 26 ilə qarşılıqlı təsirini göstərən əvvəlki məqaləmizə əsasən seçilmişdir. Vəhşi tipli və E443Δ GCK bağlıdır L-arginine, buna baxmayaraq bağlayıcıdır L-arginine E256K və E157T GCK mutantları üçün çox az müşahidə edildi (Şəkil 3a və Əlavə Şəkil 3a, b). cavab olaraq insulin ifraz olunduqda L-arginin bütün beş mutant üçün müqayisə edildi, insulin ifrazı üç GCK mutantları, yəni E256K, A456V və E443Δ üçün pozuldu (Şəkil 3b). Beləliklə, E256 qalığı hər ikisi üçün kritik görünür L-argininin bağlanması və L-argininin səbəb olduğu insulin ifrazı. Digər tərəfdən, E443 qalığı üçün lazımdır L-argininin səbəb olduğu insulin ifrazı, lakin bağlanması üçün deyil L-GCK üçün arginin. Baxmayaraq ki, E443Δ bağlanmasının qarşısını almaq üçün kifayət deyildi L-arginine to GCK, GCK 26-nın C-terminal bölgəsində E qalıqlarının (E442 və E443) bir qrupunun olduğunu qeyd etdik. GCK quruluş məlumatlarını (ref. 31, PDB-1V4S və 1V4T) istifadə edərək, bu üç E qalıqının (E256, E442 və E443) GCK zülalında (Əlavə şəkil 3c, d) üçölçülü mövqeyini proqnozlaşdırdıq və tapdıq Bu qalıqlar üçün bağlayıcı cib rolunu oynaya biləcək qapıya bənzər bir quruluş meydana gətirir L-arginin. Buna görə də, üçlü E256/442/443R mutantı hazırladıq (Şəkil 3e – g) və bu GCK mutantının argininin bağlanmasında nəzərəçarpacaq dərəcədə pozulduğunu (Şəkil 3e), G6P -nin artdığını gördük. L-arginin (Şəkil 3f), və argininin səbəb olduğu insulin ifrazı (Şəkil 3g). Birlikdə götürüldükdə, GCK-nın E256, E442 və E443 qalıqları L-argininin bağlanması və insulinin ifrazı.

a E256K, E440/442/3R və E442* qlükokinaz mutantları ilə bağlanmanın azaldığını göstərdi. Lbir neçə qlükokinaz zülalları təhlil edildikdə -arginin-immobilizasiya edilmiş muncuqlar (Əlavə Şəkil 2b). b E256K, E443Δ və A456V-qlükokinaz mutantlarını ifadə edən NIT-1 hüceyrələri insulinin ifrazını azaldır. LWT qlükokinazını ifadə edənlərlə müqayisədə -arginin. Məlumatlar ortalama ± S.E. (n = 3, ab). c, d Qlükokinazın E256, E442 və E443 üç glutamat qalığı yaxından yerləşir və bağlanması üçün qapıya bənzər bir quruluş meydana gətirir. Lqlükokinaz zülalının struktur məlumatlarına əsaslanan -arginine (PDB-1V4S 31). Argininin bağlanması pozulmuşdur (e), G6P istehsalı (f) və insulin ifrazı (g) E256/442/443R mutant qlükokinazı ifadə edən NIT-1 hüceyrələrində. Məlumatlar ortalama ± S.E. (n = 3). *səh < 0,05 (n = 6, fg).

E442* MODY2 xəstələrində insulin ifrazının pozulması

Biz 489 Yapon MODY xəstəsini E442 və E443-ü əhatə edən GCK variantları üçün yoxladıq və GCK E442* variantı olan subyekti müəyyən etdik (Əlavə Şəkillər 3a, S4a və istinadlar 27,28,29). GCK E442* variantı olan bir mövzu (Şəkil 4a, b və Əlavə Şəkil 4b) və digər iki sağlam mövzu test edildikdə, E442* mövzusu β-hüceyrənin homeostatik model qiymətləndirilməsi üçün daha aşağı bir dəyər nümayiş etdirdi (Şəkil 4a) . GCK E442* variantı olan mövzu, oruc zamanı insulin ifrazının azaldığını göstərdi. Bir arginin tolerantlıq testində, E442* variantında argininə cavab olaraq insulin ifrazının pozulduğunu göstərən daha aşağı C-peptid-qlükoza nisbəti (ref. 32 və Şəkil 4b) göstərildi. NIT-1 hüceyrələrində ifadə edildikdə, E442 * və oxşar E442/443R GCK mutantları arginin varlığında arginin tərəfindən induksiya olunan insulin ifrazının azaldığını (Şəkil 4c), GSIS (Əlavə Şəkil 4c) və G6P səviyyələrini göstərdi (Şəkil 2). 4d). GCK E442* mövzusundan və NIT-1 hüceyrələrində tədqiq edilmiş oxşar mutantlardan əldə etdiyimiz məlumatlardan belə nəticə çıxardı ki, L-arginin GCK-dan asılı insulin sekresiyasını modulyasiya edir, bu, Pueyo 16 araşdırması tərəfindən tədqiq edilən bir qrup mutasiyadan aydın deyildi.

Β-hüceyrənin homeostatik model qiymətləndirilməsi (HOMAβ, a) və C-peptid-qlükoza nisbəti (b) WT qlükokinaz ilə iki nəzarətlə müqayisədə E442* qlükokinaz mutasiyası olan bir mövzuda azaldı. Aşağı HOMAβ, oruc tutduqdan sonra insulin ifraz etmək qabiliyyətinin azaldığını göstərir (a). C-peptid-qlükoza nisbəti, insulin ifrazının səmərəliliyini göstərən göstəricilərdən biridir.b). c LpCDNA-GCK-HA və insulin ifraz vektorları ilə transfeksiya etməklə E442* və E442/3R mutant qlükokinazı ifadə edən NIT-1 hüceyrələrində -argininin səbəb olduğu insulin ifrazı azaldı. d Buna cavab olaraq G6P istehsalı LpCDNA-GCK-HA və insulin vektorları ilə transfekte edilərək E442* və E442/3R mutant qlükokinazı ifadə edən NIT-1 hüceyrələrində -arginin azalmışdır. Məlumatlar orta ± S.E. (n = 3). *səh < 0,05 (n = 6).

Arginin GCK -ni hər yerdə və tənəzzüldən qoruyur

Daha sonra, argininin GCK-ya bağlanmasının β-hüceyrələrdəki G6P səviyyələrini artırdığı bir mexanizmi nəzərdən keçirdik. Qeyd etdik ki, GCK, E442 qalığının yaxınlığındakı C-terminal 35,36-da ubiquitinlə qarşılıqlı əlaqəli motivə (UIM 33,34) malikdir. Ubiquitin-Myc ifadə vektorundan istifadə edərək ubiquitinated zülallar aşkar edildikdə, arginin varlığında və ya olmamasında lizatlarda ümumi ubiquitinated zülallarda heç bir fərq müşahidə etmədik (Şəkil 5a). Bununla belə, ubiquitinated GCK yalnız arginin tükənməsindən sonra müşahidə edilmişdir (Şəkil 5a) arginin GCK-nın ubiquitination qarşısını aldığını göstərir. (Uzun) oruc zamanı qanda arginin səviyyəsinin azaldığını nəzərə alsaq, oruc zamanı qlükoza mövcudluğu və insulin ifrazına tələbat azaldıqda, GCK-dan argininin sərbəst buraxılması GCK-nın ubiquitin vasitəçiliyi ilə proteolizini artıra bilər. NIT-1 hüceyrələrinin proteazom inhibitoru MG132 ilə on iki saatlıq müalicəsi WT GCK səviyyəsini təxminən on qat artırdı, lakin E256K mutant zülalının səviyyəsini dəyişmədi (Şəkil 5b). Insulin ifrazı səbəb olur L-arginine, WT GCK-nı ifadə edən NIT-1 hüceyrələrində MG132 varlığında da artdı, lakin E256K-ı ifadə edənlərdə deyil (Əlavə şəkil 5a). Məlumatlar bunu göstərirdi

WT GCK -nın 90% -i, arginin tükənməsinin, hər yerdə mövcud olması yolu ilə GCK -nın tənəzzülünü sürətləndirdiyi hipotezini dəstəkləyən 24 saat ərzində pozulur. Bununla birlikdə, aşağı səviyyəli GCK -nın olması, buna cavab olaraq insulin ifrazını artırmaq üçün kifayətdir L-arginin arasında birbaşa qarşılıqlı əlaqə olduğunu ifadə edir L-arginine və GCK GSIS -i kəskin şəkildə artırır (Əlavə şəkil 5b, c). Daha sonra, arginin olmadıqda GCK-nın ubiquitinasiyasının necə sürətləndirildiyini həll etmək üçün 500-1000-dən çox E3 ubitin arasında dərman (talidomid və onun analoqları, immunomodulyator imid dərmanları) tərəfindən induksiya edilə bilən yeganə E3 ubiquitin ligaz olan sereblonun rolunu sınaqdan keçirdik. insanlarda ligazalar 19,20,21 . Sereblonun söküldüyü HEK293 hüceyrələrində, sereblonun GCK -nın hər yerdə olması müşahidə olunmasının vacib olduğunu gördük (Şəkil 5c və Əlavə Şəkil 5d). Mutagenez analizindən istifadə edərək, K458 və K459-un iki lizin qalığının arginin tərəfindən azaldılan sereblondan asılı ubiquitinasiyadan məsul olduğu göstərilir (Şəkil 5d). K458/459R mutasiyası arginin olmadığı halda ubiquitinasiyanın qarşısını aldı ki, bu qalıqlar GCK-da 26 lizin qalığından arginindən asılı ubiquitinasiyadan məsuldur (Şəkil 5d). HEK293 hüceyrələri GCK, ubiquitin və sereblon ifadə vektorları ilə transfeksiya edildikdə, həm Western blot, həm də G6P məzmunu ilə müəyyən edilən GCK ifadəsi WT ifadə edən hüceyrələrdə arginin tükənməsi altında 4 saat ərzində azaldı, E256K ifadə edən hüceyrələrdə isə hər iki səviyyə dəyişməz qaldı (Şəkil 5e). , f). Əlavə olaraq, L-argininin GCK ilə sereblon arasındakı qarşılıqlı təsiri azaltdığı göstərilmişdir (Şəkil 5g). Üstəlik, L-arginine in vitro GCK fəaliyyətini stimullaşdırır (Şəkil 5h və Əlavə Şəkil 5e). Birlikdə götürdükdə, belə görünür ki, sereblon arginin olmadıqda GCK-ya bağlanır və GCK-nı ubiquitinates edir, arginin administrasiyası isə GCK-ni sereblondan ayırır və insulin ifrazını stimullaşdırmaq üçün GCK tərəfindən qlükozanın fosforlaşmasını təşviq edir (Əlavə Şəkil 5f).

a Arginin, qlükokinazın hər yerdə udulmasını maneə törədir. NIT-1 hüceyrələri ubiquitin-Myc ifadə vektoru ilə transfeksiya edildi və arginin tükənməsinə məruz qaldı. Lizat, nəzarət və qlükokinazla əlaqəli ekstraktlar anti-Myc antikoru ilə görüntüləndi. b MG132 proteazom inhibitoru ilə iyirmi dörd saatlıq inkubasiya WT qlükokinazasının azalmasının qarşısını aldı, lakin E256K mutant qlükokinazanın ifadə və ubiquitinasiya səviyyəsinə az təsir etdi. c Qlükokinaz-HA-nın ubikuitinasiyası WT HEK293 hüceyrələrində görülür, sereblon KO HEK293 hüceyrələrində yox. Sereblon KO hüceyrələrində sereblonun azalması Əlavə Şəkil 5a-da göstərilmişdir. d Qlükokinazanın K458 və K459 qalıqları arginin olmadığı halda arginin azalda bilən və sereblondan asılı ubiquitinasiya üçün tələb olunur. WT, E442*və ya K458/459R ilə transfekte edilmiş NIT-1 hüceyrələri, sereblon-FLAG və ubiquitin-Myc ekspressiya vektorları ilə birlikdə qlükokinaz ekspressiya vektorları arginin tükənmiş mühitdə inkübe edildi. Arginin tükənməsi WT qlükokinaz zülalını azaldır (e) və fəaliyyət (f). Məlumatlar orta ± S.E. (n = 3). *səh & lt 0.05 (n = 6). g Arginin qlükokinaz və sereblonun qarşılıqlı təsirini maneə törədir. h Arginin hüceyrəsiz sistemdə rekombinant qlükokinaz zülalı ilə G6P istehsalını artırır. (n = 6).


NƏTİCƏLƏR

GFP etiketli GK MIN6-da ifadə edildikdə katalitik aktivdir.

NK -də GFP ilə etiketlənmiş GK ilə MIN6 -nın keçici köçürülməsi2-və ya COOH-terminalı, gözlənildiyi kimi, 62-64 kDa-da GK-ya qarşı immunoreaktivlik və GK aktivliyinin 7-10 dəfə artması ilə əlaqələndirildi və GFP-etiketli GK-nın katalitik aktiv olduğunu təsdiqlədi (Şəkil 1).A). Floresans mikroskopiyası keçici transfeksiyadan sonra GFP ifadəsində böyük hüceyrələrarası heterojenlik göstərdiyinə görə biz G418 seçimi ilə sabit qeyri-klonal hüceyrə xətləri yaratdıq. GFP etiketli GK tərəfindən verilən GK aktivliyi erkən keçidlərdə sabit idi (& ltp9), lakin sonrakı keçidlərdə azaldı (Şəkil 1)B). Eyni şəkildə, insan GK-mRNA mütərəqqi keçidlə azaldı (p9 ilə p19 arasında beş-səkkiz qat). Endogen (siçan) GK-mRNA-nın ifadəsi transfeksiya edilməmiş MIN6-da olduğu kimi GK GFP və GFP GK hüceyrə xətlərində (müvafiq olaraq 125 və 93%) oxşar idi. GK -nın qlükoza yaxınlığı (mmol/l) GK GFP və GFP GK hüceyrələrinin ekstraktlarında oxşar idi (sırasıyla 8.9 ± 0.3 və 8.9 ± 0.8), MIN6 -da adenoviral vektorla (8.5 ± 0.6) etiketlənməmiş GK -ni həddindən artıq ifadə edir. O, eyni şəkildə hüceyrə xətlərində (2.3 ± 0.3 və 2.1 ± 0.1) transfeksiya edilməmiş MIN6-da (2.8 ± 0.3) olduğu kimi GKA (32) ilə artırılmışdır ki, bu da GFP etiketinin qlükoza və ya GKA-nın aktivləşməsinə təsir göstərmədiyini göstərir. .

GK aktivləşdirilməsinin və həddindən artıq ekspressiyanın insulin ifrazına təsiri.

Qlükoza səbəb olduğu insulin ifrazı GK GFP və GFP GK hüceyrə xəttlərində transfeksiya edilməmiş erkən keçid MIN6-da olduğu kimi oxşar idi (Şəkil 2).A). Β-hüceyrələrdə insulin ifrazı GK aktivliyinə (36) və MIN6-da keçidlə (37) azalan fərqli vəziyyətə bağlıdır. Yalnız GFP ilə transfeksiya edilmiş klonal hüceyrə xətləri qeyri-adekvat nəzarət hesab olunurdu, çünki onlar aşağı səviyyədə daha çox artım göstərmişlər. Km GFP GK hüceyrə xəttlərinə nisbətən artan keçidlə heksokinaz, daha çox fərqlənməni göstərir (nəticələr göstərilmir). Əksinə, transfeksiya edilməmiş erkən keçid MIN6 GFP GK hüceyrə xətlərindən daha fərqli bir vəziyyəti təmsil edə bilər ki, bu da oxşar qlükoza səbəb olan insulin ifrazını izah edə bilər (Şəkil 2).A). Keçid sayından və ya MIN6-nın differensiallaşdırılmış vəziyyətindən asılı olmayaraq GK aktivliyinin və konsentrasiyasının insulin ifrazına təsirini araşdırmaq üçün biz etiketlənməmiş GK-nın titrlənmiş adenoviral həddindən artıq ekspressiyasının təsirini farmakoloji GK aktivasiyası ilə müqayisə etdik. Qlükoza konsentrasiyasından asılı olmayaraq, GK-nın həddindən artıq ekspressiyası insulin ifrazına az təsir göstərmişdir (Şəkil 2).A), GKA 3 mmol/l qlükozada böyük stimullaşdırmaya səbəb oldu (Şəkil 2B). Oxşar nəticələr siçan adacıqlarında insulin ifrazı təyin edildikdə əldə edildi. GKA 2.6 qat stimullaşdırmaya səbəb oldu (P < 0,01), halbuki GK həddindən artıq ifadəsi (immunoblotinqlə təsdiqlənir) əhəmiyyətli təsir göstərməmişdir (Şəkil 2).C).

GFP etiketli GK kimeralarının MIN6 və hepatositlərdə hüceyrədaxili yeri.

Pankreasın β-hüceyrələrində insulin qranulları ilə GK-nın kolokalizasiyası immunofluoressensiya mikroskopiyası (38-41) ilə göstərilmişdir (Şəkil 3).A), elektron mikroskopiyası (38,41) və hüceyrəaltı fraksiya (31). GFP etiketli GK-nın insulin qranulları ilə kolokalizasiya olub-olmadığını müəyyən etmək üçün GFP GK hüceyrə xətləri və GFP GK ilə keçidli MIN6 hüceyrələri insulinə (qırmızı) boyanmış və konfokal mikroskopiya ilə görüntülənmişdir. Endogen GK, endogen insulin ilə aydın kolokalizasiya göstərdi (Şəkil 3A), GFP GK keçici olaraq ifadə edildikdə, əhəmiyyətsiz kolokalizasiya göstərdi (Şəkil 3B) və stabil ifadə olunan GFP GK insulin ilə qismən kolokalizasiya göstərdi (Şəkil 3C).

GK GFP və GFP GK konstruksiyaları keçici olaraq hepatositlərə köçürüldükdə, hər iki zülal da 5 mmol/l qlükoza ilə inkubasiya zamanı nüvədə toplanır (nəticələr göstərilmir) və bu, GFP etiketinin nüvə GKRP ilə bağlanmasına mane olmadığını göstərir. NH ilə əvvəlki tapıntılarla2-terminal GFP etiketi (42).

MG132-nin GFP etiketli GK kimeralarının ifadəsinə təsiri.

Gec keçidlərdə transgen ifadəsinin azalmasının MG132 istifadə edərək proteosomal deqradasiyanı inhibə etməklə qarşısını ala biləcəyini sınadıq. MG132 -nin nə transfekte edilməmiş MIN6 -da, nə də MIN6 -da etiketlənməmiş GK -ni həddindən artıq ifadə etməsində heç bir təsiri olmamışdır, lakin GK GFP hüceyrə xətlərində GK aktivliyini və immunoreaktivliyi (64 kDa) artırmışdır (Şəkil 4)A). GK aktivliyində və immunoreaktivliyindəki bu artımın zülalın deqradasiyasının qarşısının alınması ilə bağlı olub-olmadığını yoxlamaq üçün MG132-nin zülal sintezini maneə törətmək üçün sikloheksimidin iştirakı ilə təsirini təyin etdik. GK aktivliyi sikloheksimidin iştirakı ilə azalsa da, bu azalma zülalın deqradasiyasına təsiri istisna olmaqla, MG132 tərəfindən qarşısı alınmadı (Şəkil 4).B). MG132 GFP GK hüceyrə xətlərində (100-dən 200-ə qədər) insan GK mRNT-də böyük artıma səbəb oldu (Şəkil 4).C). Bu transkripsiya inhibitoru aktinomisin D tərəfindən ləğv edildi (Şəkil 4C), MG132-nin transgen ifadəsini artırdığını göstərir. MG132 transgen ifadəsini artırmaq üçün işin qalan hissəsində istifadə edildi.

GK -nın farmakoloji aktivasiyası.

Təmizlənmiş GST-GK füzyon zülalları üzərində əvvəlki ferment kinetik tədqiqatları göstərdi ki, V62M və G72R mutantları daha aşağı S0.5 qlükoza üçün yabanı tipli GK-dan daha çoxdur və GKA tərəfindən aktivləşdirilməmişdir [24,25]. MG132 ilə əvvəlcədən yetişdirilmiş klonal hüceyrə xətlərinin hüceyrə ekstraktlarında GFP V62M və GFP G72R-nin qlükozaya yaxınlığını təyin etdik (yuxarıya bax). Hər iki mutantın daha aşağı səviyyəsi var idi S0.5 vəhşi növdən daha çox qlükoza üçün (yabanı tip, 9.0 ± 1.0 V62M, 5.2 ± 0.4 G72R, 4.6 ± 1.0 mmol/l) və heç biri GKA tərəfindən əhəmiyyətli dərəcədə aktivləşdirilməmişdir (32) (Şəkil 5AC). MG132 -nin qlükoza yaxınlığına heç bir təsiri olmadı (Şəkil 5D).

Klon hüceyrə xətlərində GFP V62M və GFP G72R -nin GK aktivliyi və immunoreaktivliyi.

Mutantların katalitik aktivliyi və GK immunoreaktivliyi GFP V62M və GFP G72R klonal hüceyrə xətlərində təyin edilmiş və vəhşi tipli GFP GK (WT3B və WT10B) ifadə edən iki klonal hüceyrə xətti ilə müqayisə edilmişdir. GK aktivliyi, immunoreaktivlik və mRNA, transgen mRNA, GK zülalı və aktivliyində böyük bir artıma səbəb olan MG132 ilə və ya olmadan preultulturadan sonra təyin olundu (Şəkil 6)AC). GFP V62M və GFP G72R vəhşi tipli klonlardan daha az GK aktivliyinə malik idi (Şəkil 6).D) ya immunoreaktivliyə, ya da mRNT-yə nisbətən ifadə edildikdə (şəkil 6E.F). Vəhşi tipli klonlarla müqayisədə hər iki mutant üçün mRNT səviyyələrinə nisbətən GK immunoreaktivliyində əhəmiyyətli fərq yox idi, bu da katalitik aktivliyin qeyri-sabitliyini göstərir, lakin immunoreaktiv zülal deyil.

GFP V62M və GFP G72R ilə keçici transfeksiya tədqiqatları.

Fəaliyyət-immunoreaktivlik nisbəti, həmçinin GFP GK (vəhşi tip), GFP V62M və GFP G72R-nin müxtəlif plazmid miqdarları ilə MIN6-nın keçici transfeksiyasından sonra müəyyən edilmişdir (Şəkil 7).AB). İmmunoreaktivliyə qarşı GK aktivliyi sahələri, həm GFP V62M, həm də GFP G72R üçün aktivlikdən immunoreaktivlik nisbətini vəhşi tipli GFP GK ilə müqayisədə daha aşağı göstərdi (Şəkil 7).C), bu, klonal hüceyrə xətlərinin tapıntılarına uyğundur.

GKA -nın (35) insulin sekresiyasına təsiri ya GFP konstruksiyaları ilə ya köçürülməmiş, ya da keçici olaraq köçürülmüş MIN6 -da müəyyən edilmişdir. GKA artdı (P < 0,05) bütün dörd sınaqdan keçirilmiş şəraitdə 5 mmol/l qlükozada insulin ifrazı (transfektasiya olunmamış, 1,7 ± 0,2 - 2,7 ± 0,1 GFP GK, 1,8 - ± 0,1 - 3,6 ± 0,1 GFP V62M, 1,10 ± 0,1 GFP və GFP V62M, 1,10 ± 0,2 F , 1,5 ± 0,1 - 3,7 ± 0,2 μg · h -1 · mg protein -1).

Qaraciyər PFK2/FDP2 və GKRP ilə GK -nın sabitləşməsi.

GK bağlayan zülallar PFK2/FDP2 və GKRP müvafiq olaraq pankreas β-hüceyrələrində və qaraciyərdə GK fəaliyyətini modulyasiya edir. Bu zülallar heteroloji olaraq MIN6 hüceyrələrində ifadə edildikdə mutantların dəyişmiş aktivləşmə və ya stabilizasiya göstərib -göstərmədiklərini sınadıq. Klonal hüceyrə xətlərində adenoviral vektor istifadə edərək PFK2/FDP2-nin ifadəsi yabanı tipli klonlarda və GFP V62M-də GK aktivliyini artırdı, lakin GFP G72R-də və ya köçürülməmiş hüceyrələrdə yox idi (Şəkil 8).A). Transfeksiya edilməmiş hüceyrələrdə təsirin olmaması, endogen PFK2/FDP2 -nin endogen GK üzərində doyurucu təsirindən qaynaqlana bilər.

Qaraciyərin GKRP zülalının həddindən artıq ifrazı, mutant hüceyrə xətlərində və ya MIN6-da yox olan vəhşi tip GFP GK-da GK aktivliyinin kiçik, lakin əhəmiyyətli dərəcədə artması ilə nəticələndi (Şəkil 8).B). Mutantların GKRP ilə qarşılıqlı əlaqəsi, həmçinin hepatositlərdə GFP konstruksiyalarının keçici transfeksiyası ilə sınaqdan keçirilmişdir. Nüvədə 5 mmol/l qlükozada toplanan və 25 mmol/l qlükozada sitoplazmaya köçən GFP GK-dan fərqli olaraq, nə GFP V62M, nə də GFP G72R 5 mmol/l qlükozada nüvədə yığılmadı (Şəkil 8).C).


İçindəkilər

Qaraciyər hüceyrələrindəki qlükokinaz (GK) qlükozanı fosforilləşdirir, onu glikogenə və ya glikolizə hazırlayır. During periods of ample glucose supply, most GK activity can be found in the peripheral cytoplasm where glycogen synthesis is occurring. [5] As the glucose supply declines during periods of fasting, GK activity in the cytoplasm diminishes. GKRP participates in this modulation of GK activity and location by binding free cytoplasmic GK as glucose levels decline, and moving it into the nucleus, where it is held in reserve in an inactive form. [6] As glucose and insulin levels rise, as during digestion of a meal, GK is released from GKRP and moves back to the cytoplasm, where much of it associates with the bifunctional enzyme. [7]

In hepatocytes of various mammals, GKRP has always been found in molar excess of the amount of GK, but the GKRP:GK ratio varies according to diet, insulin sufficiency, and other factors. Free GKRP shuttles between the nucleus and the cytoplasm. It may be attached to the microfilament cytoskeleton. [8]

GKRP competes with glucose to bind with GK, but inactivates it when bound. In conditions of low glucose, GKRP then pulls the GK into the nucleus. Rising amounts of glucose coming into the hepatocyte prompt the GKRP to rapidly release GK to return to the cytoplasm.

GKRP itself is subject to modulation. Fructose and sorbitol can both be converted to fructose-1-phosphate, which inhibits GKRP and frees GK. [1] Fructose 6-phosphate binds to the same site of GKRP, but enhances the ability of GKRP to bind and inactivate GK. In contrast, phosphorylation of GKRP by AMP-activated protein kinase, induced by elevated levels of AMP, reduces its capacity to inactivate GK. [9]

A presence and role of GKRP in other organs and tissues beyond the liver remains uncertain. Some researchers have finding small amounts of GKRP, or at least RNA coding for it, in small amounts in certain rat lung cells, in pancreatic islet cells, and in periventricular neurons of the hypothalamus in rats, [10] but physiological function and significance in these organs are unknown.

GKRP was originally discovered in rat liver. GKRP was found to serve a similar function in livers of mice and humans as well as other animals. [11] Cats are unusual in lacking GK activity, and have also been found to lack GKRP, though the genes for both GK and GKRP can be identified in the feline genome. [12]

Many mutant forms of human GK are associated with impaired or amplified insulin secretion or action, resulting in higher or lower blood glucose levels, and either diabetes (MODY2) or hyperinsulinemic hypoglycemia, respectively. Some of these variants have altered interaction with GKRP, which may contribute to the hyperglycemia. [13] [14] [15] [16]

The glucokinase of "knockout mice" who lack GKRP has a reduced expression and is entirely found in the cytoplasm. The knockout mice do not respond rapidly to glucose, exhibiting impaired glucose tolerance. [17] Mutations of the GKRP gene (GCKR) in humans have been sought as possible causes of monogenic diabetes (MODY), but no examples have yet been discovered. However, variant forms of GCKR have been found to be associated with small differences in levels of glucose, insulin, triglycerides, C-reactive protein, and higher or lower risks for type 2 diabetes mellitus. [18] [19] [20] [21]

Activators of GK are being investigated as possible medicines for type 2 diabetes. One of the mechanisms of activation may be protection from binding by GKRP. [22]


Molecular mechanism of catalysis: critically dependent on sulfhydryl groups

The sulfhydryl groups of several cysteines surround the glucose binding site. All except cys 230 are essential for the catalytic process, forming multiple disulfide bridges during interaction with the substrates and regulators. At least in the beta cells, the ratio of active to inactive glucokinase molecules is at least partly determined by the balance of oxidation of sulfhydryl groups or reduction of disulfide bridges.

These sulfhydryl groups are quite sensitive to the oxidation status of the cells, making glucokinase one of the components most vulnerable to oxidative stress, especially in the beta cells.


Correlation Between the Presence of GCK and Glucose Response by Cells Contributing to Glucose Homeostasis

Many different, functionally specialized glucose sensing cell types have evolved to assure blood glucose is maintained within a narrow, physiologically safe range of 4𠄸 mM. These cells complement each other in providing continuous measure and adjustment of the concentration of glucose in blood. We hypothesize that GCK is the primary glucose sensor utilized for maintaining glucose homeostasis, i.e., GCK is responsible for sensing blood glucose not only by β-cells but also by other cells involved in regulating blood glucose. In the case of α-cells, a recent and striking advance was made by specifically deleting GCK from the α-cells in mice, the deletion resulting in substantial loss of glucose induced suppression of glucagon release (Basco etਊl., 2018). The resulting hyperglucagonemia causes overactive glucagonogenesis, consistent with metabolism of glucose by GCK having a central role in α-cell function in glucose homeostasis. The authors conclude that glucose sensing is by GCK and that downstream signaling in α-cells is similar to that of β-cells: increased glucose increases the [ATP]/[ADP] ratio leading to closure of ATP-regulated K + channel and membrane depolarization. In α-cells, however, depolarization leads to voltage-dependent inactivation of voltage-gated Na + channels involved in action potential firing. Diminution of action potential height decreases activation of the P/Q Ca 2+ channels that mediate Ca 2+ entry, and this decreases glucagon release. Note that Le Marchand and Piston (2012), have provided evidence that glucose induced suppression of glucagon secretion does not involve decreased intracellular [Ca 2+ ].

Pancreatic δ-cells respond to increased glucose by releasing somatostatin which acts locally as a paracrine inhibitor of insulin and glucagon release rather than a systemic hormone (Boden etਊl., 1981, Gylfe, 2016 Rorsman and Huising, 2018). Glucose sensing by δ-cells most likely involves GCK for sensing as indicated by substantial expression of the gene as measured by single cell RNA-seq. It should be noted that pancreatic α-, β-, and δ-cells have a common progenitor cell (Sosa-Pineda etਊl., 1997 Gradwohl etਊl., 2000 Chung and Levine, 2010) which could help explain the obvious similarities in their glucose sensing pathways. δ-cells also respond directly to a physiological amino acid mixture independently of glucose, perhaps the consequence of membrane depolarization caused by sodium co-transport being sufficient to reach the threshold for secretory response (Boden etਊl., 1981 Rorsman and Huising, 2018).

Similar GCK-dependent sensing paths have been proposed for glucose excited (GE) and glucose inhibited (GI) neurons of the CNS. Dunn-Meynell etਊl. (2002) reported that GCK mRNA is expressed in norepinephrine neurons of locus ceruleus, and in hypothalamic neuropeptide Y, pro-opiomelanocortin, and γ-aminobutyric acid neurons. Moreover, in GE neurons intracellular Ca 2+ oscillations were inhibited and in GI neurons Ca 2+ oscillations were stimulated by four selective GCK inhibitors. Lamy etਊl. (2014) studied GLUT2-expressing excitatory neurons (GE) in the nucleus of tractus solitarius of the vagus nerve. These neurons form a distinct population of hypoglycemia-activated neurons. The authors concluded that glucose is sensed through GCK because hypoglycemia decreases energy state and increases [AMP]. Increased [AMP] then activates AMP-dependent protein kinase and this suppresses a K + leak current, hyperpolarizes the cells, and increases afferent electrical activity. Similar results have been presented for GI neurons of the hypothalamic arcuate nucleus (Burdakov etਊl., 2005 Routh, 2010 Hussain etਊl., 2015). There are a large number of different types of neurons for which glucose sensitivity has been reported (Levin etਊl., 2004 Jordan etਊl., 2010 Thorens, 2012 Lamy etਊl., 2014 Steinbusch etਊl., 2015, 2016) and in most of these neurons glucose sensing appears to be through GCK, although orexin neurons of the hippocampus are apparently an exception (see section on alternate glucose sensors).

GCK has also been implicated in glucose sensing in the anterior pituitary gland of rat and monkey (Zelent etਊl., 2006 Sorenson etਊl., 2007). GCK activity was measured spectrophotometrically in whole pituitary extracts and identified as a generalized cytoplasmic staining co-localized in cells with follicle-stimulating hormone (FSH) or luteinizing hormone (LH). In addition to gonadotropes, GCK was observed in a minor subpopulation of corticotropes and thyrotropes (Sorenson etਊl., 2007). It is puzzling, however, that in gonadotropes of the cynomolgus monkey GCK appeared to be clearly confined to cytosolic substructures, tentatively identified as Golgi complex (Sorenson etਊl., 2007). Pulsatile stimulation of the gonadotropes FSH and LH is mediated by GNRH released from GNRH neurons of the preoptic nucleus, which in turn are regulated by hypothalamic Kisspeptin neurons. GNRH receptor activation results in phospholipase C activation, IP3 mediated ER-calcium release causing secretion of the hormones (Stojilkovic etਊl., 2005). It remains to be tested whether, and if so how, glucose might influence these cells as they control puberty and/or reproduction. Nutrient supply profoundly influences reproductive biology, and GCK-dependent glucose regulation at the level of the pituitary might play a hitherto not considered role. Note that in the case of gonadotropes, glucose sensing might influence the release of FSH and/or LH which would impact glucose homeostasis directly vasitəsilə sex steroids or indirectly through increased nutrient consumption due to the pubertal growth spurt or pregnancy.

A case can also be made that GCK is the glucose sensor for cells in the adrenal gland which secrete epinephrine and corticosteroids to counteract hypoglycemia. Three lines of evidence support this contention. A rather mild form of hypoglycemia, observed clinically, later found to be caused by an activating mutation of GCK (M197 T?), was initially diagnosed as adrenal insufficiency. The patient was treated for 12 years with a maintenance dose of 10 mg cortisol to ameliorate hypoglycemia symptomatology (Morishita etਊl., 2017). After reevaluation of the original diagnosis, steroid treatment was discontinued because hypertension had developed and adrenal insufficiency was discounted. It is noteworthy that this particular GCK mutation increases activity of the enzyme only moderately as indicated by a thorough kinetic analysis (Sayed etਊl., 2009). It is therefore not unreasonable to hypothesize the clinical presentation resulted from complex additive effects of GCK activation that involved altered glucose sensing by both pancreatic α- and β-cells as well as cells of the adrenal gland. This interpretation is strengthened by a recent demonstration of GCK mRNA in mouse adrenal glands (see Supplement figure in Steinbusch etਊl., 2016) and immunohistochemical data indicating GCK is present in cells of the human adrenal gland (online Human Atlas showing histochemical staining of GCK).

These examples illustrate that each cell type having a role related to blood glucose levels expresses GCK and there is evidence that glucose is sensed through the activity of GCK. Our hypothesis predicts that all utilize similar metabolism to couple GCK activity to energy state and their metabolic response to changes in glucose concentration closely approximate those in pancreatic α- and β-cells and in glucose sensing neurons. The mechanism and metabolism related to glucose sensing is similar for all of the cells, while differences in coupling of energy state to membrane permeability, specific hormone and/or neurotransmitter released determining outcome and role in glucose/energy metabolism regulation. Examples of how similar changes in energy state elicit different cell specific responses have been presented for β-cells, α-cells, and glucose sensing neurons.

It is also important that GCK is absent or very low in cells and tissues that do not serve as glucose sensors as defined. These cells express hexokinase instead of GCK and the higher affinity for glucose (0.05𠄰.2 vs 1.5� mM, (Cárdenas, 2004)) results in cellular metabolism being insensitive to changes in glucose concentration in the physiological ranges found in different species. Zelent etਊl. (2006), for example, measured expression of GCKmRNA in islets of Langerhans (pancreas), pituitary, adrenal gland, whole brain, acinar pancreas, liver, skeletal muscle, adipose tissue, lung, kidney, and spleen. Of these, GCK mRNA was expressed in substantial amounts in the islets of Langerhans, pituitary, and liver with only trace amounts in the other tissues. Even more telling is that in brain, GCK mRNA is expressed in only a very small fraction of neurons and then only in neurons that respond to changes in physiological glucose concentrations (see Hussain etਊl., 2015 De Backer etਊl., 2016).


Giriş

Glucokinase (GK) * activity is a major determinant of β cell glucose metabolism and insulin secretion (Sweet et al., 1996 Matschinsky et al., 1998 Matschinsky, 2002). Thus, a complete model of its regulation is central to our understanding of glucose homeostasis and the pathogenesis of diabetic disease states. To maintain physiological glucose responsiveness, GK activity needs to be constrained within a very narrow range (Wang and Iynedjian, 1997 Matschinsky et al., 1998). Regulation of GK expression in β cells has been widely studied and is induced mainly by glucose, although it can be modulated by other factors, including insulin (Leibiger et al., 2001 Matschinsky, 2002). Posttranslational regulation of GK has only more recently been described, and the mechanisms involved in this mode of regulation are not well known. Recent studies have shown that low levels of glucose cause an association of GK with secretory granules (Toyoda et al., 1999 Stubbs et al., 2000 Rizzo et al., 2002) and that this association correlates with a decrease in GK activity (Rizzo et al., 2002). Prolonged exposure to high glucose (>20 min) causes dissociation of GK from the granule along with conformational changes associated with activation. Glucose-stimulated GK regulation is blocked by inhibitors of insulin secretion, and insulin by itself can rapidly (<2 min) induce similar changes to GK localization and activity (Rizzo et al., 2002). This suggests that minute-to-minute regulation of GK activity and localization occurs through receptor-mediated signaling and not by interaction between glucose and GK.

The molecular mechanism of GK association with secretory granules and the processes that modulate this association are unknown. To address the mechanism of GK association with secretory granules, we examined the role of nitric oxide synthase in this regulation. Neuronal nitric oxide synthase (nNOS) is activated by a rise in intracellular calcium, which is a known response of β cells to glucose or insulin stimulation (Aspinwall et al., 2000) and nNOS is also known to be localized on insulin secretory granules (Lajoix et al., 2001). Nitric oxide (NO) has also been shown to have a stimulatory affect on glucose-stimulated insulin secretion from both cultured β cell lines and pancreatic islets (Smukler et al., 2002 Kaneko et al., 2003). However, these findings are highly controversial, and an inhibitory effect on insulin secretion has also been shown using a variety of experimental approaches. (Salehi et al., 1996 Lajoix et al., 2001 Henningsson et al., 2002). This controversy points to the need for more careful consideration of potential targets for NO in the regulation of glucose-stimulated insulin secretion in order to understand the role of NO synthase (NOS) in β cell function. GK is one potential target for regulation by NO, since GK contains several cysteines that have been shown to be critical for maintaining catalytic activity (Tiedge et al., 2000).


Loss of function mutations cause diabetes

Over 190 of these mutations reduce the functional efficiency of the glucokinase molecule. Heterozygosity for alleles with reduced enzyme activity results in a higher threshold for insulin release and persistent, mild hyperglycemia. This condition is referred to as maturity onset diabetes of the young, type 2 (MODY2).

Homozygosity for GCK alleles with reduced function can cause severe congenital insulin deficiency resulting in persistent neonatal diabetes.

Gain of function mutations cause hyperinsulinemic hypoglycemia

As of 2004, 5 mutations have been found to enhance insulin secretion. Heterozygosity for gain of function mutations reduces the threshold glucose that triggers insulin release. This creates hypoglycemia of varying patterns, including transient or persistent congenital hyperinsulinism, or fasting or reactive hypoglycemia appearing at an older age.



Şərhlər:

  1. Zarek

    all staff leave today?

  2. Kippie

    Səlahiyyətli mesaj :), cazibədar bir şəkildə ...

  3. Cale

    This idea has to be purposely

  4. Zachaios

    What a necessary sentence ... great, excellent idea

  5. Fausho

    Bütün ən qadağan olunmuşlar indi ictimai mülkiyyətdədir, yalnız bizdə!

  6. Sheridan

    Ən böyük mesaj

  7. Rayburn

    I apologize for interfering, but, in my opinion, there is another way to resolve the issue.



Mesaj yazmaq