Məlumat

Qanlı agarda Neisseria becərilməsi üçün Staph zolaq üsulundan istifadə etmək olarmı?

Qanlı agarda Neisseria becərilməsi üçün Staph zolaq üsulundan istifadə etmək olarmı?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Sinifdə öyrəndiklərim: Normalda şokoladlı agar yetişdirmək üçün lazımdır HemofilNeisseria. Staph zolaq texnikası kultivasiya üçün istifadə edilə bilər Hemofil Stafın qanı hemolizə etməsinə icazə verərək qan ağarı üzərində Hemofil ətrafında böyüyə bilər.

Sualım: Bu metodun istifadə olunmamasının bir səbəbi varmı? Neisseria həmçinin?


Neisseria növündən asılıdır.

N. meningitidis koloniyalar boz və piqmentsiz görünən yuvarlaq, hamar, nəmli, parıldayan və qabarıq, aydın şəkildə müəyyən edilmiş bir kənar ilə BAP (Blood Agar Plate) üzərində böyüyür.

Bu barədə daha ətraflı burada oxuya bilərsiniz.

N. gonorrhoeae BAP üzərində böyümədiyi məlumdur. Daha çox burada.


Fəsil 6: İbtidai Mədəniyyət və Güman edilən Tanınma Neisseria meningitidis, Streptococcus sətəlcəm, və Haemophilus influenzae

Mikrobiologiya laboratoriyaları ümumiyyətlə menenjit, sətəlcəm və ya açıqlanmayan qızdırma xəstəliyi olan xəstələrdən serebrospinal maye (CSF) və ya qan nümunələri alır. Laboratoriyalar bu xəstələrdən birgə maye, plevral maye və ya digər steril sahə nümunələri də ala bilərlər. Ehtimal identifikasiyası N. meningitidis, S. sətəlcəm, və H. qrip CSF-nin sitoloji müayinəsi, qan və/və ya şokoladlı agarda xüsusi koloniya morfologiyası, Qram boyasında boyanma xassələri və ya lateks aglütinasiya testi ilə və ya sürətli testdən istifadə etməklə CSF-də spesifik antigenlərin aşkarlanması əsasında edilə bilər. diaqnostik test (RDT). Təsdiqedici identifikasiya üsulları N. meningitidis, S. pneumoniae,H. qrip bu laboratoriya dərsliyinin sonrakı fəsillərində təqdim olunur (Fəsil 7: Tanıma və Səciyyələndirmə N. meningitidis, 8: Tanınması və xarakteristikası S. sətəlcəm, və 9: Tanıma və Səciyyələndirmə H. qrip).

Aerozollu maddələrə müntəzəm məruz qalma riski olan personal N. meningitidis peyvənd etməyi ciddi şəkildə düşünməlidir. Əlavə sağlamlıq və təhlükəsizlik məlumatlarını Fəsil 4: Biyogüvenlikdə tapa bilərsiniz. İlə laboratoriya yoluxucu infeksiyalar S. sətəlcəm və ya H. qrip bu qədər geniş məlumat verilmirsə, bu bakteriyalarla ölümcül infeksiyalar meydana gələ bilər və bəzi laboratoriyalarda bu orqanizmlərə qarşı aşılama tövsiyə edilə bilər.

Çünki bu təlimatın əsas məqsədi onların müəyyən edilməsinə kömək etməkdir N. meningitidis, S. pneumoniae, və H. qrip bakterial meningit şübhəsi hallarından toplanmış klinik nümunələrdən burada təsvir edilən üsullar klinik əhəmiyyəti ola bilən, lakin rast gəlinmə ehtimalı az olan digər izolatların müəyyən edilməsinə imkan verməyəcək. Mikrobioloqlar Amerika Mikrobiologiya Cəmiyyəti və rsquos kimi klinik mikrobiologiya təlimatlarına müraciət etməlidirlər. Klinik Mikrobiologiya Təlimatı, digər bakteriyaların müəyyən edilməsi prosedurları üçün.

  1. CSF nümunələrinin işlənməsi Mərkəzdənqaçma haqqında qeyd: g (1 x çəkisi) nisbi mərkəzdənqaçma qüvvəsini (RCF) təmsil edir, lakin tövsiyə olunan mərkəzdənqaçma sürəti tez-tez protokollarda dəqiqədə dövriyyə (RPM) kimi qeyd olunur. RCF, rotorun yarıçapının uzunluğundan asılıdır, buna görə də eyni RPM başqa bir santrifüjdə eyni g qüvvəsini yarada bilməz. Buna görə də, santrifüj sürətini təsvir etmək üçün RCF istifadə edilməlidir. Yalnız RPM verilirsə, RCF bu formula ilə hesablana bilər: RCF = 0.00001118 x r x RPM 2
    r = santimetrlik rotor radiusu CSF mikrobiologiya laboratoriyasına gəldikdən sonra analiz üçün mövcud olan BOS həcmi qeyd edilməlidir. Əgər 1 ml -dən çox CSF varsa, bunun yerinə santrifüj edilməməlidir, CSF birbaşa qan agar plakasına (BAP) və şokoladlı agar plakasına (CAP) qoyulmalı və həmçinin Gram boyası üçün istifadə edilməlidir. Əgər > 1 ml CSF varsa (yəni, nümunənin həcmi sentrifuqa üçün kifayətdirsə), o, bakteriyaları çökdürmək üçün kifayət qədər qüvvə ilə sentrifuqa edilməlidir. Tipik olaraq, bakteriyaların çökməsi üçün 10-15 dəqiqə 1000 x g-də sentrifuqalama kifayətdir. Nümunə sentrifuqa edildikdən sonra, supernatant Pasteur pipeti ilə çıxarılmalı və lateks aglütinasiyası ilə antigenin aşkarlanması planlaşdırılırsa, saxlanmalıdır. Çöküntü güclü şəkildə qarışdırılmalıdır (məsələn, burulğan maşını istifadə edərək qapalı bir boruda). Yaxşı qarışdırıldıqdan sonra, Gram ləkəsini hazırlamaq üçün bir və ya iki damla çöküntü istifadə edilməli və bir damla ilkin mədəniyyət mühitini silmək üçün istifadə edilməlidir.
    1. CSF-nin sitoloji müayinəsi
      CSF-nin laboratoriya müayinəsi adətən bakterial meningitin varlığını təsdiqləmək üçün ilk addımdır. Diqqət yetirin ki, sitoloji müayinə CSF -nin mərkəzdənqaçma və istiləşməsindən əvvəl olmalıdır. Bakterial meningitlə əlaqəli tipik CSF anomaliyalarına aşağıdakılar daxildir:
      • Bulanıqlıq
      • Artan açılış təzyiqi (>180 mm su)
      • Pleositoz (adətən polimorfonükleer (PMN) leykositlərdən) WBC sayı > 10 hüceyrə/mm3
      • Qlükoza konsentrasiyasının azalması (& lt45 mg/dl)
      • Artan protein konsentrasiyası (& gt45 mg/dl)

    Qeyd: Körpənin CSF-nin normal sitologiyası 10-30 WBC/mm3 (50% PMN) təşkil edir.

      Qram ləkəsinin aparılması
      Gram boyası, hüceyrə divarlarının kimyəvi və fiziki xüsusiyyətlərinə görə bakteriya növlərini iki böyük qrupa ayırmaq üçün empirik bir üsuldur. Qram-müsbət bakteriyalar əsas ləkəni saxlayır, qram-mənfi bakteriyalar isə əks ləkənin rəngini alır. Qram boyası həmçinin klinik nümunənin keyfiyyətini qiymətləndirməyə xidmət edə bilər. Prosedur üçün çöküntü əldə etmək üçün CSF düzgün şəkildə santrifüj edilməlidir. CSF çöküntüsünü istifadə edərək düzgün yaxma hazırlanması asan vizuallaşdırmaq üçün kifayət qədər sıx, lakin morfoloji xüsusiyyətləri aşkar etmək üçün kifayət qədər nazik olan orqanizmlərin monolayını əmələ gətirməlidir. Təmiz, yeni şüşə slaydlardan istifadə edilməlidir. Müsbət və mənfi keyfiyyətə nəzarət (QC) suşları naməlum nümunələrlə birlikdə sınaqdan keçirilməlidir. Məlum istinad suşlarına əlavə olaraq N. meningitidis, S. sətəlcəm, və H. qrip, istifadə edilə bilən digər istinad suşları daxildir Staphylococcus aureus qram pozitiv kokklar üçün və Escherichia coli qram-mənfi çubuqlar üçün.

    CSF üçün qram boyama proseduru
    1. & Gt 1 ml (yuxarıya bax) varsa, CSF-ni 1000 x g-də 10-15 dəqiqə santrifüj edin.
    2. Bir markerdən istifadə edərək bir şüşə slaydı iki hissəyə bölün. Bir bölməni naməlum CSF üçün, digər bölməni isə QC üçün məlum orqanizm üçün istifadə edin.
    3. Slaydın üzərinə 1-2 damcı yaxşı qarışdırılmış CSF çöküntüsünü qoyaraq, damcı (ların) bir az bulanıq, vahid bir süspansiyon meydana gətirməsinə icazə verərək bir smear hazırlayın.
      • Bir izolatdan istifadə edərək bir smear hazırlamaq üçün, slayda kiçik bir damla steril su və ya fizioloji şoran əlavə edin və bir gecəlik mədəniyyətdən hüceyrələrin bir az bulanıq, vahid bir süspansiyonu yaradın.
    4. Süspansiyon havasını qurudun. Davam etmədən əvvəl süspansiyon tamamilə qurudulmalıdır.
    5. Ləkəni minimum 2 dəqiqə 95% metanol ilə dolduraraq düzəldin (3). Distillə edilmiş su ilə yuyun. Artıq suyu çıxarın.
      • Metanol yoxdursa, ləkəni üç dəfə tez bir alovdan keçirərək qızdırın. Slaydı çox qızdırmayın, çünki həddindən artıq istiləşmə hüceyrələrin əhəmiyyətli dərəcədə təhrif edilməsinə və ya məhv olmasına səbəb olacaqdır.
      • Bütün Qram boyama proseduru üçün distillə edilmiş su olmadıqda sadə sudan (filet d&rsquoeau de robinet) istifadə etmək mümkündür.
    6. Ləkələmək üçün slaydı 1 dəqiqə ərzində kristal bənövşəyi ammonium oksalatla doldurun. Distillə edilmiş su ilə yuyun. Artıq suyu çıxarın.
      • Reagent şüşəsinin ucu ilə slaydlara toxunmaqdan və ya mayeni birbaşa yaxmanın üzərinə sürtməkdən çəkinin.
    7. Slaydı 1 dəqiqə Gram & rsquos yod ilə doldurun. Yod, qələvi kristal bənövşəyi boyanı hüceyrə divarına bağladığı üçün mordan rolunu oynayır. Distillə edilmiş su ilə yuyun. Artıq suyu çıxarın.
    8. Ləkə yuyulmayana qədər 95% etanol ilə rəngsizləşdirin (5-10 saniyə kifayət edə bilər). Distillə edilmiş su ilə yuyun. Artıq suyu çıxarın.
      • Rəngsizləşdirməyə yaxından baxmaq vacibdir: qram-müsbət bakteriyalar həddindən artıq rəngsizləşdirmə ilə qram-mənfi, qram-mənfi bakteriyalar isə rəngsizləşdirmə altında qram-müsbət görünə bilər.
    9. 30 saniyə safranin və ya 10-15 saniyə carbol-fuchsin ilə əks-ləkə çəkin. Distillə edilmiş su ilə yuyun. Artıq suyu çıxarın.
    10. Müqəddəs bir kağız və ya təmiz bir kağız dəsmal ilə slaydı yumşaq bir şəkildə silin. Hava qurusun.
    11. Quruduqda, 100X yağ daldırma obyekti olan mikroskop altında ləkələnmiş ləkəni yoxlayın.
    Qram boyama nəticələrinin oxunması (mikroskopik müayinə altında):
    • Qram-pozitiv orqanizmlər tünd bənövşəyi və ya bənövşəyi görünəcək.
    • Qram-mənfi orqanizmlər qırmızı və ya çəhrayı görünəcək (əks ləkədən).

    Şəkil 1. Qram boyaması N. meningitidis əlaqəli PMN ilə CSF -də.


    Fəsil 7: Tanınması və xarakteristikası Neisseria meningitidis

    N. meningitidis PMN lökositlərində hüceyrədaxili və ya hüceyrə xaricində meydana gələ bilən qram-mənfi, qəhvə dənəsi şəkilli diplokoklardır. N. meningitidis 35-37 ° C temperaturda ən yaxşı böyüyən titiz bir orqanizmdir

    5% CO2 (və ya şam qabında). O, həm qanlı ağar boşqabında (BAP), həm də şokoladlı agar boşqabında (CAP) böyüyə bilər. Koloniyalar N. meningitidis boz rəngdədir və BAP üzərində piqmentsizdir və yuvarlaq, hamar, nəmli, parıldayan və qabarıq görünür, kənarları aydın şəkildə müəyyən edilmişdir. N. meningitidis CAP-da böyük, rəngsizdən boza qədər qeyri-şəffaf koloniyalar kimi görünür. Tanıma və xarakterizasiya test prosedurlarından əvvəl, izolatlar həmişə böyümənin təmizliyi üçün yoxlanılmalı və təmiz bir mədəniyyət əldə etmək üçün lazım olduqda tək bir koloniya yenidən zolaqlanmalıdır. Aşağıdakı identifikasiya və səciyyələndirmə prosedurları üçün sınaq BAP (Şəkil 1) və ya CAP (Şəkil 2) ilə 35-37°C-də 18-24 saatlıq böyümə üzərində aparılmalıdır.

    Morfoloji olaraq görünən mədəniyyətlərin şəxsiyyətini təsdiqləmək üçün aşağıdakı testlər tövsiyə olunur N. meningitidis (Şəkil 3). N. meningitidis Kovac rsquos oksidaz testi və karbohidrat istifadəsi ilə müəyyən edilə bilər. Oksidaz testi müsbət olarsa, karbohidratdan istifadə testi aparılmalıdır. Karbohidrat istifadə testi, izolyatın ola biləcəyini göstərirsə N. meningitidis, seroloji qrupu təyin etmək üçün seroloji testlər aparılmalıdır. Bu test ardıcıllığı bahalı antisera və vaxta qənaət etmək üçün təsirli bir yoldur. Tanı və xarakterizə üçün əlavə üsullar N. meningitidis molekulyar vasitələrdən istifadə Fəsil 10: PCR Metodları və Fəsil 12: Molekulyar Metodlarda təsvir edilmişdir.

    İzolyatları əhatə edən işlər üçün Bioloji Təhlükəsizlik Səviyyə 2 (BSL-2) təcrübələri tələb olunur N. meningitidisçünki bu orqanizm laboratoriya işçiləri və ətrafdakı iş mühiti üçün potensial təhlükə yaradır. Zəhmət olmasa BSL-2 qurğularında işləyən laboratoriya işçiləri üçün qurulan təlimatlara riayət etmək üçün 4-cü Fəsil: Bioloji Təhlükəsizliyə baxın, çünki bu fəsildə təsvir olunan bir çox testlər canlı mədəniyyətlərə malik boşqabların açılmasını tələb edir və tez-tez bioloji təhlükəsizlik kabinetinin xaricində aparılır ( BSC). molekulyar vasitələr Fəsil 10: PCR Metodları və Fəsil 12: Molekulyar Metodlarda təsvir edilmişdir.

    Şəkil 1. N. meningitidis BAP-da koloniyalar

    Şəkil 2. N. meningitidis CAP üzərində koloniyalar

    Şəkil 3. a-nın identifikasiyası və xarakteristikası üçün axın sxemi N. meningitidis təcrid

    1. Kovac & rsquos oksidaz testi Kovac & rsquos oksidaz testi sitokrom oksidazın varlığını təyin edir. Kovac & rsquos oksidaz reaktifi, tetrametil-p-fenilenediamin dihidroklorid, tənəffüs zəncirinin bir hissəsi olaraq sitokrom c ehtiva edən orqanizmlər tərəfindən bənövşəyi bir birləşməyə çevrilir. Bu test tanınmasına kömək edir N. meningitidis, lakin cinsin digər üzvləri Neisseria, qohum olmayan bakteriya növləri də müsbət reaksiya verə bilər. Oksidaza reagentinin düzgün işləməsini təmin etmək üçün naməlum izolatlar ilə birlikdə müsbət və mənfi keyfiyyətə nəzarət (QC) ştammları sınaqdan keçirilməlidir.
      1. Oksidaz tozundan 1% oksidaz reagentinin hazırlanması Stok oksidaz tozunun pisləşməsinin qarşısını almaq üçün toz sıx bağlanmış quruducuda saxlanılmalı və qaranlıq və sərin yerdə saxlanılmalıdır. Kovac & rsquos oksidaz reagenti yalnız üçündür in vitro diaqnostik istifadə. Qıcıqlanmaya səbəb ola biləcəyi üçün göz və dəri ilə təmasdan çəkinin. Təsadüfən təmasda olduqda, dərhal gözləri və ya dərini ən azı 15 dəqiqə su ilə yuyun.
        1. 0,1 q tetrametil-p-fenilendiamin dihidroxloridi 10 ml steril distillə edilmiş suda həll edərək 1.0% Kovac & rsquos oksidaz reagenti hazırlayın.
        2. Yaxşı qarışdırın və sonra 15 dəqiqə dayanmasına icazə verin.
          • Məhlul hər gün təzə hazırlanmalı və istifadə olunmamış hissəsi atılmalıdır.
          • Alternativ olaraq, reagent 1 ml alikvotlara paylana və dondurulmuş halda -20°C-də saxlanıla bilər. Alikotlar dondurucudan çıxarılmalı və istifadə etməzdən əvvəl əridilməlidir. Reagent əridilərkən hər gün istifadə olunmamış hissəni atın.
        Filtr kağız üsulu

        Şəkil 4. Kovacın oksidaz testi: filtr kağız üzərində mənfi və müsbət reaksiya Plaka üsulu

        Plitə üsulu
        • Reaktivə məruz qalan bakteriyalar ümumiyyətlə subkultura üçün yararlı olmadığından bütün plitəni su basmayın.
        • Müsbət reaksiyalar 10 saniyə ərzində bakteriyaların təmizlənmiş filtr kağızına tətbiq edildiyi bənövşəyi rəng şəklində inkişaf edəcək. ilə gecikmiş reaksiyalar mümkün deyil N. meningitidis.
        • Mənfi reaksiyalar işlənmiş filtr kağızında rəng dəyişikliyi yaratmayacaq.

        Şəkil 5. Üçün CTA şəkər reaksiyaları N. meningitidis turşu istehsalı ilə göstərilən qlükoza (dekstroz) və maltozun istifadəsi ilə (rəngi sarıya dəyişir) və laktoza və saxaroza istifadə edilmədən

        Cədvəl 1. Bəziləri tərəfindən karbohidrat istifadəsi NeisseriaMoraxella spp.

        Asid istehsalı:
        Cədvəl 1. Bəzi Neisseria və Moraxella spp. Tərəfindən karbohidrat istifadəsi.
        Orqanizm Qlükoza 1 Maltoza Laktoza saxaroza
        Neisseria meningitidis + + & ndash & ndash
        Neisseria lactamica + + + & ndash
        Neisseria gonorrhoeae + 2 & ndash & ndash & ndash
        Neisseria sicca + + & ndash +
        Moraxella catarrhalis & ndash & ndash & ndash & ndash

        Dipnotlar

        • 1 Qlükoza həmçinin dekstroza da adlandırıla bilər.
        • 2 Bəzi suşlar N. gonorrhoeae zəif turşu istehsalçılarıdır və CTA mühitində qlükozenegativ kimi görünə bilər.
        • Hər bir təcrid, slaydda test ediləcək fərdi seroqrupa xas antiseriya və şoran mənfi nəzarət kimi bir çox bölmə tələb edəcək.
        • Təlimatlar, bakteriyaların dayandırılması üçün 5% formalaşdırılmış duzun 10 mikronunu ölçmək üçün sterilizasiya edilmiş süzülmüş ucları olan bir mikropipetorun istifadəsini göstərir. Mikropipettor düzgün SASG reaksiyası üçün dəqiq və bərabər ölçüləri köçürəcək.
        • Mikropipetator və uclar mövcud deyilsə, steril, birdəfəlik istifadə edilə bilən 10 mikrorol peyvənd ilmələri 5% formalinləşdirilmiş şoran məhlulunun 10 mikrorolunu köçürmək üçün istifadə edilə bilər, lakin çox vaxt dəqiq miqdarları (5-10 mikrorol arasında) çatdırmır.
        • Bakteriyaların birbaşa slaydda dayandırılması çətindirsə, 250 ml və 5% formalaşdırılmış duzlu kiçik bir flakonda test mədəniyyətinin orta dərəcədə südlü bir süspansiyonunu (McFarland 6 standartına bənzər) hazırlayın və qarışdırmaq və parçalamaq üçün süspansiyonu qısa müddətdə vorteks edin. hər hansı qranullar. Slaydın aşağı hissəsinə bu suspenziyadan 10 mikrorol əlavə edin.
        • Antiserum ilə təmin edilən damcıdan istifadə etməyin, çünki o, adətən lazım olduğundan daha böyük miqdarda verir və asanlıqla çirklənə bilər.
        • Mikropipetor və uclar olmadıqda, steril, birdəfəlik 10 və mikrollu aşılama döngələri antiseriyanın 10 mikronunu köçürmək üçün istifadə oluna bilər, lakin çox vaxt dəqiq miqdarda çatdırmır (5-10 mikrol arasında).
        • Antiserumun çirklənməsinin qarşısını almaq üçün hər istifadədən sonra antiseranı slaydlara köçürmək üçün istifadə olunan uc və ya ilməni tullantı qabına atın. Antisera mənbəyi çirklənirsə, yeni bir flakon istifadə edilməlidir.

        Şəkil 6. Aqqlütinasiya reaksiyasının intensivliyinin qiymətləndirilməsi

        • Müsbət nəticə, 2+ və ya daha yüksək reytinqdə müsbət sayılan B qrupu istisna olmaqla, 1-2 dəqiqə ərzində 3+ və ya 4+ (güclü birləşmə) ilə təyin olunur.
        • Mənfi nəticə 0 (şoran), +/-, 1+ və ya 2+ (zəif aglütinasiya) ilə təyin olunur.
        • Serogrup, şoran ilə deyil, yalnız bir antiseriya ilə müsbət nəticə əldə edildikdə təyin olunur.
        • Əgər seroqrup müəyyən edilməzsə, izolat NG hesab olunur. Aşağıdakı nəticə birləşmələrinin hamısı NG olaraq bildirilir:
          • Şoran məhlulda aglütinasiya, digər antiserumlarla güclü reaksiyalardan asılı olmayaraq, mədəniyyəti autoaglutinating kimi xarakterizə edir.
          • Duzlu suda aglutinasiya olmadıqda birdən çox serogrupa xas antiseriya ilə aqqlütinasiya mədəniyyəti poliaqlutinləşdirici və ya çarpaz reaktiv olaraq xarakterizə edir.
          • Antiserumların və ya şoran məhlulların heç biri ilə aglütinasiya olmaması ştammın qeyri-reaktiv olduğunu xarakterizə edir.
          1. Eyni boşqabın başqa bir hissəsindən böyüməni istifadə edərək testi birbaşa slaydda təkrarlayın.
          2. Kiçik bir boruda hüceyrə süspansiyonunu hazırlayın və birbaşa slaydda SASG-nin nəticəsi aydın deyilsə, burulğan edin və testi təkrarlayın.
          3. Doğrudan sürüşmək üçün 20 mikron antisera əlavə edin və sonra nümunəni 5% formalaşdırılmış duzlu su ilə seyreltmədən orqanizmlə dolu bir döngə əlavə edin.
          4. Subkultura və ertəsi gün təzə böyüməni yenidən yoxlayın.
          5. Orijinal lövhədə müxtəlif ölçülü koloniyalar varsa, hər bir koloniya növü üçün bir subkultura hazırlayın və ertəsi gün hər iki mədəniyyəti sınaqdan keçirin. Böyük koloniyalar ümumiyyətlə daha yaxşı kapsul istehsalını və buna görə də daha yaxşı reaktivliyi göstərir. Ancaq kiçik koloniyalar bəzən daha yaxşı bir nəticə verəcəkdir.
            • Uyğunsuzluqlar dərhal həll edilməzsə, sonrakı SASG təkrarları nəzarət suşları ilə birlikdə istifadə edilməlidir.
          • Laboratoriyada alınan hər yeni antiseriya partiyası üçün aparılır.
          • İllik QC testindən sonra iki ildə bir dəfə həyata keçirilir.
          • Flakonun 4°C-dən yuxarı temperaturlara məruz qalması və ya ilkin QC aparıldıqdan sonra flakonun çirklənməsindən şübhələnmək üçün əsas olduqda təkrarlanır.

          Laboratoriyada mövcud olan bütün istinad ştammlarından istifadə edərək hər bir antiserumu QC üçün SASG sınaq proseduruna əməl edin. Şəkil 7 -də nümunə QC vərəqində verilən nəticələri qeyd edin.

          QC test nəticələrinin oxunması
          • Antiserum 1-2 dəqiqə ərzində homolog antigenlərlə 3+ və ya 4+ aglütinasiya verməlidir.
          • Antiserum heterolog ilə reaksiya verməməlidir N. meningitidis seroqruplar, NG istinad ştammı ilə və ya şoran içində.
          • Antiserum bir və ya bir neçə istinad ştammı ilə və/yaxud NG istinad ştammı ilə və/yaxud şoran içində aglütinasiya edir.

          Şəkil 7. Antiserumların hamısına qarşı sınaqdan keçirilməsi üçün nümunə QC hesabatı N. meningitidis seroqruplar


          Laboratoriya diaqnozu Neisseria meningitidis:

          Nümunə

          Serebrospinal maye (CSF), hallardan petexial döküntülərdən qan və dəri qırıntıları və daşıyıcılardan nazofarengeal çubuqlar. Nümunələr steril qablarda toplanmalı və gecikmədən dərhal nəql edilməlidir.

          CSF etməlidir heç vaxt soyuducuya qoymayın menenjitin şübhəli agentləri olaraq (pnevmokoklar, meningokoklar və Haemophilus influenzae) incədir və soyuducuda ölə bilər).

          Qram Ləkə

          Santrifüj edilmiş nümunənin (CSF və ya steril bədən mayesi) qram boyalı ləkəsi, N. meningitidis PMN leykositlərində hüceyrədaxili və ya hüceyrədənkənar olaraq meydana gələn qram-mənfi, qəhvə lobya formalı diplokoklar kimi görünür.

          Mədəniyyət

          İzolyasiya N. meningitidis (qan, BOS və ya normal olaraq steril olan digər yerdən) qızıl standart olaraq qalır, çünki eyni zamanda suş fərqliliyi və həssaslıq testləri üçün də izolatlar təqdim edir.

          Meningokoklar cəld olduğundan, steril bədən yerlərindən nümunələr ya qan, ya da şokoladlı agarda aşılanır. Şokoladlı agar bazası daha da selektiv izolyasiya üçün vankomisin, kolistin, nistatin və trimetoprim kimi antibiotiklərlə zənginləşdirilə bilər. N. meningitidis. Nazofarenks kimi qeyri-steril yerlərdən mədəniyyət üçün Modified New York City və ya Modified Thayer Martin mühiti kimi selektiv mühit tələb olunur. Kültür lövhələri 5% CO2 mənbəyi ilə minimum 48 saat inkübe edilməlidir.

          Neisseria meningitidis Qan Ağarında

          Qan agarda, gənc koloniyalar N. meningitidis yuvarlaq, hamar, nəmli, parıldayan və qabarıqdır, kənarları aydın şəkildə müəyyən edilir, aktiv böyüyən koloniyalar boz və piqmentsizdir. Köhnə mədəniyyətlər (> 24 saat) daha qeyri -şəffaf boz rəngə çevrilir və bəzən altdakı ağarın qaralmasına səbəb olur.

          Dəyişdirilmiş New York City və Thayer Martin mühitlərində, Neisseria meningitidis böyük rəngsiz-mavi-boz rəngli mukoid koloniyalar kimi görünür.

          İdentifikasiya

            Müsbət müsbət.
        • Qlükoza və maltozadan turşu istehsal edin, lakin laktoza və ya saxarozadan deyil. mənfi
        • Qamma-glutamil aminopeptidaz istehsal edin
        • Kolistinə davamlıdır: meningokoklar kolistinə davamlıdır və VCN inhibitoru olan seçici mühitdə böyüyür.
        • DNAse reaksiyası: mənfi
        • Superoksol Testi (30% hidrogen peroksid ilə reaksiya): güclü reaksiyaya qədər zəif göstərə bilər.
        • Piqmentasiya: çəhrayı-qəhvəyi piqmentlər əmələ gətirir.
        • Serogruping

          Müxtəlif seroqruplar N.meningitidis monovalent antiserumlardan istifadə edərək slayd aglütinasiya testi ilə fərqləndirilir.

          Seroloji testlər

          Kapsül antijenlərinə qarşı antikorların aşkar edilməsi üçün ferment immunoassay, lateks aglütinasiya və sürətli diaqnostik testlər kimi bir neçə seroloji test mövcuddur. Neisseria meningitidis. Seroloji testlər xəstəliyin retrospektiv diaqnozuna kömək edir. Vaksinasiya müvəffəqiyyətli olduqda və xroniki meningokokemiya hallarında da antikorlar görülür.

          Molekulyar diaqnoz

          PCR əsaslı diaqnoz, qan əsaslı, BOS və ya digər steril olan yerlərdən meningokok xəstəliyinin təsdiqini, mədəniyyətə əsaslanan diaqnozla müqayisə oluna bilər.


          Qanlı agarda Neisseria becərilməsi üçün Staph zolaq üsulundan istifadə etmək olarmı? - Biologiya

          Bakteriyaların izolyasiyası onları bərk qida mühitinin səthində böyütməklə ("kultura" etməklə) həyata keçirilir. Belə bir mühit normal olaraq 1,5% agar əlavə edilərək bərkidilmiş zülal həzmləri (pepton, tripton) və qeyri -üzvi duzların qarışığından ibarətdir. Standart nümunələri general geniş çeşidli bakteriyaların böyüməsini dəstəkləyəcək məqsədli vasitələr arasında qida agarı, triptik soya agarı və beyin ürək infuziyası agarı var. Bir vasitə ola bilər zənginləşdirilmişdirqan və ya serum əlavə etməklə. Zənginləşdirilmiş media nümunələrinə qoyun qanı agarı və şokolad (qızdırılmış qan) agar daxildir.

          Seçici media bəzi orqanizmlərin böyüməsini maneə törədən, digərlərinin isə böyüməsinə imkan verən maddələr ehtiva edir. Məsələn, mannitol duzlu agarda əksər orqanizmlərin böyüməsini maneə törədən, lakin stafilokokların böyüməsinə imkan verən yüksək konsentrasiyalı natrium xlorid var.

          Diferensial media, ümumiyyətlə iki qrup arasındakı bəzi biokimyəvi fərqlərə görə, mikroorqanizm qruplarının koloniya və ya ətraf mühitin görünüşü ilə vizual olaraq fərqlənməsinə imkan verən birləşmələr ehtiva edir. Qanlı agar bakteriyaların istehsal olunan hemoliz növü ilə fərqlənməsinə imkan verən diferensial mühitin bir növüdür. Bəzi diferensial mühitlər də seçicidir, məsələn, qram-mənfi koliformalar üçün selektiv olan və laktoza fermentləşdirən və qeyri-laktoza fermentləşdirən bakteriyaları fərqləndirə bilən MacConkey və EMB aqarları kimi standart bağırsaq agarları.

          Tez -tez istifadə olunan bakterioloji mühitin bir neçə nümunəsi, həmçinin üzərində becərilən bir və ya daha çox bakteriya növü olan nümunələr aşağıda göstərilmişdir. Plitələri diqqətlə araşdırın və meydana gələn koloniya morfologiyasını, rənglərini və böyümə nümunələrini (və ya böyüməməsini) müşahidə edin. Bu məlumatlar, nümunə tədqiqatlarında patogenlərin ilkin müəyyənləşdirilməsində dəyərli ola bilər.


          Medianı 15 dəqiqə ərzində 121 0 C -dən yuxarı bir temperaturda sterilizasiya etmək, demək olar ki, bütün canlı hüceyrələri və sporları məhv edir. Vida qapaqlı şüşələr istifadə olunarsa, sterilizasiya prosesindən əvvəl qapaq gevşetilməlidir. Media hazırlamaq üçün istifadə olunan qablar havalandırılan zirvələrə malik olmalıdır və sterilizasiya prosesi zamanı genişlənməyə imkan vermək üçün mühitin təmin edilmiş həcmindən ən azı 20% daha çox tutmağa adekvat olmalıdır. Böyük miqdarda hazırlamaq üçün 1L qapalı şüşələrdən istifadə etmək rahatdır. Soyutma, işlətmə və tökmə prosesini təşviq etmək üçün biz onları adətən 500 ml mühitlə hazırlayırıq. Agar əridilmiş zaman vahid şəkildə çatdırılmır. Boşqaba və ya borulara tökmənin vahid paylanmasını təmin etmək üçün kolbaya və ya şüşəyə maqnit qarışdırma çubuğunu atmaq, sonra sterilizasiyadan sonra mühiti yumşaq bir şəkildə qarışdırmaq lazımdır, bu zaman media soyudulur. Qarışdırmaq, agarı bərabər şəkildə yayır.

          Aqar dərhal steril, quru bir petri boşqabına tökülür, eyni zamanda çirklənmənin qarşısını almaq üçün üstü petri plitəsinin dibinin üstündən diqqətlə tutulur. Üstünü dəyişdirin, agarın soyumasına və sərtləşməsinə icazə verin və petri plitələrini tərs vəziyyətdə saxlayın. Petri lövhələri saxlayarkən, onları üçdən çox hündür yerə yığmayın və ya xüsusi bir petri boşqab saxlama tutacağı istifadə etməyin. Ağar daha sonra aseptik üsulla, tercihen steril bir şkafda (laminar hava axını kabineti) istifadə edərək lövhələrə tökülür.


          Bakterial Mədəniyyətin Tanıma Proseduru

          Aşağıdakı nöqtələr bakteriya mədəniyyətinin tanınması üçün dörd əsas proseduru vurğulayır. Prosedura aşağıdakılardır: 1. Bərk mühitin müayinəsi 2. Maye mühitin müayinəsi 3. İlkin diaqnoz 4. Bakteriyaların yekun identifikasiyası/təsdiqi.

          Bakterial Mədəniyyət: Prosedur # 1. Qatı Medianın Müayinəsi:

          Bakteriya artımının orta və kolonial görünüşü müəyyən edilməlidir. Bakteriyaların müvəqqəti tanınması üçün faydalıdır. Bakteriyaların Gram-ləkələnmiş yaxmasını öyrənin və bakteriyaların boyanma reaksiyasını və mikroskopik morfologiyasını müşahidə edin.

          Adətən qida agar, qan agar və ya MacConkey ’s agar.

          2. Koloniya morfologiyası (Şəkil 6.2):

          Nöqtə (streptokok), pinhead (staph.), Böyük (Klebsiella), orta böyük (E. coli), Kiçik (Shigella) və s.

          Günbəz (Staph), düz (vibrio), aşağı qabarıq (Salmonella, Shigella), quraqlıq (S. pneumoniae), qabarıq (Klebsiella, E.coli) düzensiz (Bacillus) və s.

          Kobud (Bəzi Neisseria, Bacillus), tutqun (E. coli), silsiləli (Pseudomonas) hamar (Salmonella) və s.

          Bütün (Salmonella), irregu & shylar (Pseudomonas), crenated (Bacillus), spre & shyading (Proteus) və s.

          Şəffaf (Staph), şəffaf (Vibrio), yarı şəffaf (Salmonella).

          Qızıl sarı (Staph aureus), mavi-yaşıl (Pseudomonas), kərpic-qırmızı (Serratia marcescens).

          vii. Piqment koloniya ilə məhdudlaşır - Staph, Micrococcus, Serratia.

          viii. Piqment orta yayılmışdır - Pseudomonas.

          ix. Hemoliz — Beta hemoliz (S. pyogenes), alfa hemoliz (S. pneumoniae).

          x. Qan həzmi - Proteus, Pseudomonas və s.

          xi. Tutarlılıq - Mukoid (Klebsiella), butyrous (Staph), yumşaq (bəzi Neisseriae), möhkəm (Bacillus), Yapışqan (V. parahaemolyticus).

          3. Qram boyalı smear müayinəsi:

          (i) Boyanma reaksiyası:

          (ii) Mikroskopik morfologiya (Şəkil 6.1) - Aşağıdakılara diqqət yetirin:

          a. Forma— çubuq (E. coli və s.), sferik və ya kokklar (Staph və s.), kokkobasillər (Brucella və s.), vergül (Vibrio).

          b. Uzunluq/Ölçü— uzun (E. coli), qısa (Klebsiella və s.), böyük (Mikrokok), kiçik (Streptococcus) və s.

          c. Eni — qalın (E. coli, Bacillus), nazik (Salmonella) və s.

          (iii) Spora üçün ləkələnməmiş yer (Bacillus, Clostri­dium).

          (iv) Bitir - yuvarlaq (E. coli), kvadrat kəsik (bacillus), konik (difteroid).

          (v) Tərəflər-paralel, paralel olmayan və nizamsız.

          (vi) Daxil olan qranullar.

          Bakterial Mədəniyyət: Prosedur # 2. Liquid Mediumun Müayinəsi:

          i. Maye mühitini müəyyənləşdirin.

          ii. Bakteriyaların çoxalma modelinə diqqət yetirin.

          iii. Asma damlasının hazırlanmasında hərəkətliliyini və morfologiyasını (mümkünsə) yoxlayın.

          1. Maye mədəniyyət mühitinin müəyyən edilməsi:

          i. Pepton suyu:

          Rəng çalarları yoxdur. Qeyri-sabit bakteriyaların çoxu orada yetişdirilir və tədarük edilir.

          ii. Qidalı bulyonda qlükoza:

          Bütün bulyonlar saman/sarı-mavi rəng göstərir. Adətən Streptococcusun böyüməsi bu mühitdə təmin edilir.

          2. Bakterial artım modeli (Şəkil 6.3):

          i. Vahid bulanıklıq: Ümumi qram -mənfi çubuqların əksəriyyəti.

          ii. Səthi pellicle meydana gəlməsi ilə vahid bulanıklıq: Nümunələr - Vibrio, Pseudo & shymonas və Bacillus kimi sərt aeroblar səthə yaxın konsentrə olur.

          iii. Alt hissədə çöküntü: Ağır bakteriyalar çöküntü əmələ gətirir və yuxarıda yüngül bir duman buraxır. Misal - Strepto və shycoccus.

          3. Asma damla hazırlığı:

          i. Həqiqi/aktiv hərəkətlilik və ya yayılmayan qəhvəyi hərəkət.

          ii. Hərəkətlidirsə, hərəkətlilik üçün xarakterikdir (məsələn, Vibrio cholerae tərəfindən ovçuluq və axar balıqlar, Y. enterocolitica tərəfindən yuvarlanan hərəkətlilik və s.)

          iii. Morfologiya - çubuqlar eyniləşdirilə bilər, lakin çoxluqlu, diskret və ya qısa zəncirli kokkları təsəvvür etmək çətindir (Şəkil 6.4).

          Bakterial Mədəniyyət: Prosedur # 3. İlkin Diaqnoz:

          Böyümənin tətbiq olunduğu və çəkildiyi mühit, maye mühitdə böyümə nümunəsi, qram boyalı morfologiya və hərəkətlilik tədqiqatı ilkin diaqnoz üçün ipuçları yaradır və təsdiqləyici və ya son diaqnoz üçün sxem hazırlamağa kömək edir.

          Bakterial Kultura: Prosedur № 4. Bakteriyaların Yekun İdentifikasiyası/Təsdiqi:

          Şəkər fermentasiya testləri, amin turşularının istifadə sxemi, bəzi fermentlər və maddələr mübadiləsi üçün testlər, sintetik mühitdə böyümə qabiliyyəti, H.2S istehsalı, indol istehsalı, MR-VP testi, üreaz məhsulu və qarışığı, P.P.A deaminaz testi və s.

          2. Yüksək titrə malik antiserumlardan istifadə edərək sürüşdürmə aqlütinasiya testi.

          3. Toksigenlik testi və ya heyvan patogenliyi testi.

          4. Molekulyar üsul (DNT probu ilə hibridləşmə, DNT-də və 16S rRNT-də imza ardıcıllığının aşkarlanması).


          Kök hüceyrələri

          11.3 Kök Hüceyrə Kulturası Metodları

          Hüceyrə kulturası üsulları kök hüceyrələrin toxuma və molekulyar səviyyələrdə fizioloji, farmakoloji və bioloji qiymətləndirilməsi üçün vacibdir. Kök hüceyrələr ümumiyyətlə 5% CO ilə inkubatorda 37 ° C -də yetişdirilir2 və 95% O2. Hüceyrə mədəniyyət mühitinin tərkibi kök hüceyrələrin fərqlənməmiş vəziyyətdə saxlanılması üçün vacibdir. Kök hüceyrə mədəniyyətində ən çox istifadə edilən komponentlərdən biri də fetal inək serumu (FBS) dir. Bununla belə, bunun bir sıra problemləri var: partiyadan partiyaya dəyişkənlik, hormonlar və böyümə faktorları kimi müəyyən edilməmiş komponentlərin olması (hüceyrə mədəniyyətində problemlər yarada bilər) və s. Digər əsas narahatlıq heyvan mənşəli zülalların xəstəyə ötürülməsi riskidir. Elm adamları, kök hüceyrə mədəniyyətini klinik istifadə üçün daha uyğun hala gətirmək üçün serumsuz mədəniyyət şərtlərindən istifadə etməyə keçdilər [36].

          Kök hüceyrələrin saxlanması və saxlanması üçün müxtəlif mədəniyyət sistemləri mövcuddur. Məsələn, MSC -ləri BM stromasından ayırmaq üçün təklif olunan üsullardan biri, 10% FBS ehtiva edən 20 ml DMEM -ə (Dulbecco'nun dəyişdirilmiş əsas mühiti) 10 ml BM süspansiyonunun əlavə edilməsidir ki, bu həll yağ qatını ayırmaq üçün santrifüjləşdirilə bilər və hüceyrə pelleti daha sonra 70% Percoll məhlulu istifadə edərək 13.000 q -da 20 dəqiqə sıxlıq gradientli santrifüjə məruz qala bilər. MSC ilə zənginləşdirilmiş aşağı fraksiya 10% FBS ilə əlavə edilmiş DMEM-də, 37 °C-də nəmləndirilmiş inkubatorda və 5% CO-da yetişdirilə bilər.2 və 95% O2. Əlavə keçid üçün hüceyrələr 0,25% tripsin və 1mM EDTA (etilenediaminetetraasetik turşusu) istifadə edərək tək hüceyrələrə enzimatik şəkildə dağılır və sonrakı qulluq üçün FBS ilə əlavə edilmiş DMEM -də təkrarlana bilər [37]. Krio-konservasiya üçün, MSC-lər yavaş-yavaş dondurularaq 90% FBS və 10% DMSO (dimetilsülfoksid) ilə yenidən dayandırıla bilər və uzun müddət saxlama üçün maye azotda saxlanıla bilər [38]. Regenerativ tibbdə tətbiqlər üçün MSC-lər serumsuz MesenCult-XF™, TC-protector™ və rekombinant tripsin (TrypLESelect™) kimi kseno-sərbəst materiallardan istifadə etməklə təcrid oluna, saxlanıla və becərilə bilər [39].

          Fetal kök hüceyrələr üçün, hüceyrə tipinə görə mədəniyyət üsulları fərqlənir. Məsələn, kordon qanı normal tam müddətli hamiləliklərin neonatal göbək kordonundan toplana bilər. Daha sonra 40-60 dəqiqə ərzində hidroksietil nişasta ilə çökdürülə bilər. Mononükleositlər 30 dəqiqə ərzində 400 q -da sıxlıq qradiyentli santrifüjlə, fosfat tamponlu duzlu suda daha da yuyulmaqla və tampon həllində yenidən süspansiyonla təcrid oluna bilər. CD34+ hüceyrələri, kommersiya olaraq mövcud olan immunomaqnit ayırma sistemlərindən istifadə edərək müsbət seçimlə daha da təcrid edilə bilər. Bu təcrid olunmuş hüceyrələr, 10% FBS ilə əlavə edilmiş Iscove Modified Dulbecco's Medium (IMDM) hesablanaraq becərilə bilər [40]. Göbək qanının qanından MSC -lərin ayrılması üçün göbək kordonu fosfat tamponlu duzlu su ilə yuyula bilər, 75% etanolda dezinfeksiya oluna bilər və daha sonra doğranaraq həzm oluna bilər. Hüceyrələr daha sonra 10% FBS və 10 ng/ml epidermal böyümə faktoru (EGF) ilə əlavə edilmiş DMEM/F-12 mühitində becərilə və tripsinlə keçə bilər. Krio-konservasiya üçün hüceyrələr 90% FBS və 10% DMSO-dan ibarət olan adi krio-qoruyucu məhlulda yenidən dayandırıla bilər [41].

          ES hüceyrələri vəziyyətində, qulluq, mədəniyyət və krio-konservasiya üçün bir neçə üsul mövcuddur. ES hüceyrə mədəniyyəti üçün istifadə olunanlar adətən iPS hüceyrələrinin mədəniyyətinə də tətbiq oluna bilər. Originally, human ES cells were derived and maintained in basal medium, which could be supplemented with fetal calf serum and grown on mouse embryonic fibroblast feeder layer (MEF). However, many factors in the serum are undefined and the quality of serum may vary across batches during production. Apart from this, the use of animal components in culture medium can pose a barrier for potential use of these cells for clinical applications.

          To overcome these problems, researchers have developed more defined medium conditions for stem cell culture and maintenance. These conditions include hESF9 (consisting of basal medium supplemented with FGF-2 (fibroblast growth factor 2) and heparin sulfate), mTeSR1™, and STEMPRO™, which are commercially available and utilize several chemicals and growth factors to facilitate signaling in the promotion of human ES cell growth. The media are often supplemented with several components such as FGF, transferrin, albumin, cholesterol, and lipid mixtures [42] . ES cells can be passaged enzymatically, such as with dispase, accutase, collagenase, and trypsin, or mechanically, for example, STEMPRO ® EZPassage™ disposable stem cell passaging tool, Life Technologies). Human ES cells are mostly frozen and thawed by the usual slow freezing and rapid thawing and subsequent addition of the ROCK inhibitor (Y-27632), which significantly improves recovery of the cryo-preserved cells [43] . The cells can be frozen in 60% KOSR (knockout serum replacement), 20% DMSO, and 20% DMEM in liquid nitrogen.

          For parthenogenetic ES cells, the isolated ICMs can be cultured on mitomycin-C–treated mouse embryonic fibroblast cells (MEFs) for about 5–9 days primary ES cell colonies can then be dissociated mechanically and cultured in human ES cell culture medium consisting of 80% knockout-DMEM, 20% serum-replacement, 1 mM glutamine, 1% nonessential amino acid, 0.1 mM 2-mercaptoethanal, 50 UI/ml penicillin, and 50 UI/ml streptomycin [25] .

          Human germ cells can be cultivated in gelatin-coated dishes in DMEM with high glucose, supplemented with 15% knockout serum replacement, 2 mM L-glutamine, 0.1 μM β-mercaptoethanol, 100 × nonessential amino acids, 1 × penicillin-streptomycin, 10 ng/ml bFGF (basic fibroblast growth factor), and 0.12 ng/ml TGF-β (transforming growth factor-β). These conditions lead to the formation of small ES cell-like colonies after four days of culture that are pluripotent [44] . The pES, gPS, and iPS cells can be cryo-preserved in ways similar to human ES cells.


          Culture of Bacteria

          Bacterial culture provides isolation and identifica­tion of bacterial strains from patients’ specimens, and also for assessing antimicrobial sensitivity. Cultures require a minimum of 12-18 hours of incubation before reports are made.

          Culture media employed for the isolation of common bacteria are shown in Table 5.2.

          1. General purpose media:

          Blood agar is the most widely used media, and chocolate agar are used in special cases. Both media support the growth of most organisms. Colonial mor­phology, haemolysis, pigmentation can be determined from the bacterial colonies in blood agar.

          Use of enriched medium (e.g. chocolate agar) facilitates the growth of some organisms (e.g. H. influenzae), selective medium (Thayer-Martin agar) for Neisseria gonorrhoeae, and differential media (e.g. Mac- Conkey’s agar) for culture of gram-negative enteric bacilli.

          3. Anaerobic culture media (Robertson’s cooked meat medium) are nutritionally enriched and pre-reduced of molecular oxygen to enhance recovery of anaerobic organisms (Clostridium) from specimens of patients and environment. RCM does not support growth of Non Clostri­dium anaerobes, which requires pre-reduced lacked blood agar supplemented with vit K1, haemin cystein.

          The isolated organism is identi­fied by:

          (a) Presumptive identification by growth characte­ristics in media, gram stained morphology and motility test, oxidase test and catalase tests.

          (b) Results of biochemical tests (carbohydrate utili­sation, indole production, urease production, phenylalanine production, and nitrate redu­ction). Test media are inoculated with bacte­rial culture and incubated for 18-24 hours.

          (i) End products of fermentation (acid, gas production) vary with different species of bacteria.

          (ii) End products can also be studied by gas- liquid chromatography for identification of non-clostridium anaerobes and myco-bacterium.

          (c) Slide agglutination test with high titre sera.

          (d) Test for toxin production.

          B. Antimicrobial susceptibility testing:

          The isola­ted organism is tested for antimicrobial suscepti­bility testing for which the organism must be isolated in pure culture.

          Microscopic examination:

          A. Unstained preparation:

          Unstained preparations (wet mounts) are useful in motility study of bacteria, examinations of deposits of urine, cerebrospinal fluid, faeces and vaginal secre­tions.

          B. Stained smears/sections:

          Staining is the classic approach for making rapid presumptive diag­nosis:

          1. Common stains include Gram and Ziehl-Neelsen stains, and sometimes Giemsa and Methenamine silver-staining.

          2. Fluorescent dyes (fluorochromes):

          Bacteria stained with fluorescent dye become visible as a bright object against dark background when examined in UV light under a fluore­scent microscope.

          (a) Commonly used fluorochromes:

          (i) Auramine rhodamine that binds mycolic acid in mycobacterial cell walls.

          (ii) Acridine orange, which binds nucleic acid in bacteria and yeast.

          (iii) Calcofluor white, which binds cellu­lose fungal cell walls.

          When examination of stained smear it is necessary.

          C. Dark ground illumination (DGI):

          DGI, also called dark-field microscopy uses a dark ground condenser on a microscope that illuminates the object. Bacteria is illuminated over a dark background.

          This method is extensively used to identify spirochaetes in wet mount, which are too thin to be seen in 1000 x magnification (resolution < 200 nm).

          D. Direct immunofluorescence (DIF):

          To a tissue or cell suspension, fluorescein-labelled mono­clonal or polyclonal antibodies against specific microbial antigens are added and allowed some­time for reaction to occur to be followed by washing with phosphate buffer. Antigen- antibody complex fluoresces when viewed under fluorescent microscope.

          E. Culture, growth character, biochemical tests — are discussed in chapter 6 and 7.

          Detection of pathogen-specific molecules:

          A. Detection of bacterial antigens is done by:

          1. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Fig. 5.3):

          ELISA kits are now commercially available and most tests use antibodies absorbed or cross-linked to a solid phase (e.g. a micro-titre polyvinyl plate, polystyrene tube, a bead or a membrane) that captures antigen in a liquid specimen. The solution to be tested for antigen is placed on the antibody-coated well (or membrane) and incubated.

          After the antigen has been bound by the immobilised antibody, an enzyme-linked antibody of the same specificity is added to the mixture and incubated. The antigen, in positive case, is thus sandwiched between the first antibody and the enzyme-linked antibody. Then a specific substrate is added, which produces a visible (coloured) product if the first antibody has successfully captured the antigen.

          ELISA kits are available for streptococcal antigens, HCG (pregnancy test), toxins (CI. difficile), C. trachomatis and many viruses. These rapid tests require only 10 minutes to 1 hour for completion and easy to perform. Their sensitivity is excellent (greater than 95%).

          2. Particle agglutination:

          These agglutination tests use antibody-coated latex particles, which are stable for long periods of time. Soluble antigens in the specimen react with antibody-coated particles in the form of cross- linking resulting into visible aggregates.

          The Fc regions of IgG antibodies are bound by latex particles or by protein A in killed Staphylococcus aureus, so that the Fab regions remain available for the antigens. These rapid tests are easy to perform and require only 10 minutes to 1 hour for comple­tion. Agglutination assays can be performed with tubes or slides.

          (i) Latex agglutination test kits are now routinely used for detection of soluble anti­gens in urine, CSF and serum from patients with infections due to Streptococcus pneu­moniae. Haemophilus influenzae, group A, and group B streptococci, Neisseria meningitidis, and Cryptococcus neoformans.

          (ii) Slide agglutination tests are also done for rapid identification of organisms grown in culture.

          B. Antibody detection in serum:

          Qualitative and quantitative Ab titre is detected by whole bacterial agglutination (e.g.. Widal test, Weil-Felix reaction, Brucella agglutination test), Latex agglutination test (e.g.. A.S.O. titre detection), Microscopic Agglutina­tion Test (MAT in leptospirosis), ELISA (e.g. in leptospirosis, Vi-Ag detection), Slide flocculation test (e.g. VDRL test in syphilis), Ag coated R.B.C. agglutination (e.g. T.P.H.A. in syphilis), etc.

          C. Molecular detection of microorganisms:

          Involve DNA probes and PCR.

          1. Nucleic acid probe tests:

          Every species of living being has on its chromosome a unique DNA sequence that distinguishes it from every other species. Gene probes are cloned fragments of DNA that recognise complementary sequences of nucleic acid of microorganisms. These are biochemically synthesised or obtained by cloning specific genomic fragments into bacterial vectors (plasmids).

          Bacterial restriction endonucleases cleave double- stranded DNA at specific oligonucleotide sequences and produce discrete fragments. These fragments are further separated to single-stranded fragment by electrophoresis.

          Tagging probe with marker:

          The gene probe thus prepared is tagged or labelled either with radio­isotopes (e.g. 32 P), or an enzyme that gives colour reaction (e.g. alkaline phosphatase) after reacting with substrate.

          The single-stranded DNA probe recognises a complementary strand with which it hybridizes under controlled conditions. An instru­ment that measures chemiluminescence emitted by a molecule attached to the probe is used to detect the probe-target hybrid.

          In the detection of an unknown micro­organism, its nucleic acid needs to be extracted before they can be hybridized with the probes. The target DNA is readily extracted with the help of NaOH.

          There are three formats of nucleic acid hybridi­sation: liquid phase (hybridisation reaction in solu­tion), solid phase (hybridisation in a fixed support such as nitrocellulose or nylon filter, e.g., colony hybridisation), or spot blots, dot blots, or slot blots.

          Hybridisation in liquid phase is widely used. When a probe is mixed with test sample, it seeps out and binds to its complementary nucleic acid sequence.

          The double-stranded nucleic acid thus formed (capture hybrids) (Fig. 5.1) then gets separated from the rest of the sample. Multiple alkaline-phosphatase conjugates bind to the hybrid amplifying the signal. A chemiluminescent substrate emits light which is measured with a luminometer.

          Clinical applications (Table 5.3):

          A number of commercially prepared DNA probes for the identi­fication of infectious agents are now available.

          (a) DNA probes permit rapid identification of bacteria in patient specimens where reliable culture systems are not practical, such as HPV, hepatitis B virus (HBV), Epstein-Barr virus, N. gonorrhoeae and C. trachomatis.

          (b) These are useful culture confirmation probes in problematic cases, such as Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, and Cryptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis etc.

          Other uses of gene cloning:

          (a) Production of mammalian proteins, e.g. stomatostatin, human growth hormone, insulin, several interferon’s, and tissue plas­minogen activator.

          (b) Preparation of vaccines, e.g. HBV, Rabies, B. pertussis and malaria.

          2. Polymerase chain reaction (PCR):

          PCR has dramatically changed the technique of detection and characterisation of nucleic acids. The credit for development of this new technology in 1985 goes to its inventor Kary B Mullis (and associates) working at the Cetus Corporation and the Depart­ment of Human Genetics, Emerysville, California. For this discovery, Mullis was awarded the Nobel Prize for Medicine in 1993.

          PCR is based on the ability of DNA polymerase to synthesise a large amount of specific DNA signature sequence from a single large piece of DNA. Primers required for PCR are usually synthesised using a nucleotide synthesizer.

          Technique (Fig. 5.2):

          1. Two short DNA primers, which are themselves short complementary oligonucleotides, are selected, which flank the portion of the DNA segment one wishes to identify. A heat-resistant polymerase (taq polymerase, extracted from thermophilic bacterium Thermus aquaticus), and free nucleotides are mixed together. The primers and nucleotides are present in excess.

          2. The entire mixture is put into a special heating block (thermo-cycler), which raises and lowers the temperature to permit and regulate the three steps of PCR.

          (a) DNA denaturation step:

          Two double-stranded DNA is dissociated to a single-stranded DNA at a denaturing temperature between 90°-95°C.

          (b) Primer annealing step:

          As the mixture cools to approximately -50°-60°C, the primers will anneal wherever they complement the target DNA strands (annealing temperature 50°-70°C). Their presence in large numbers ensures that hybridisation with primers will take precedence over hybridisation with homologous strand.

          (c) An extension reaction step:

          In this step, temper­ature rises to 72°C (polymerisation temp.), the Taq polymerase adds exogenous nucleotides to the primers, which have hybridized with each original strand.

          Elongation — the addition of nucleotides in both the 5′ direction of longer target strand DNA and 3′ direction of short primer— results in the duplication of the target sequence in each chromo­some. Thus, at the end of each cycle, which consists of above referred 3 steps, the PCR products are doubled (i.e. four copies are obtained from the original two).

          3. The whole procedure is repeated in a progra­mmable thermal cycler. Generally, 30-50 thermal cycles produce millions of copies of the chosen section of the target organism DNA. PCR is extre­mely powerful and sensitive enough to detect presence of microorganism in a patient specimen.

          However, the test should be done carefully, because contamination with microbial DNA from the envir­onment and commensals can lead to false-positive results.

          Clinical applications:

          PCR techniques are now widely used in the de­tection of infective agents which include:

          (a) Viruses: HIV, HCV, CMV, entero-viruses, HBV, HI N1 (swine flu).

          (b) Bacteria: Chlamydia trachomatis, Neisseria gono­rrhoeae, Mycobacterium tuberculosis.

          Reverse transcriptase (RT)-PCR is a variation of the PCR, and it involves the use of reverse transcriptase of retroviruses to convert viral RNA or messenger RNA to DNA before PCR amplification. It has been successfully done with Hantavirus sequences as primers for RT-PCR to detect the agent responsible for an outbreak of haemorrhagic fever in New Mexico. The infectious agent was found to be a Hantavirus.

          Detection of proteins:

          Some viruses and certain other infectious agents have been identified on the basis of certain characteristic enzymes or specific proteins, e.g. presence of reverse transcriptase enzyme in a specimen (serum, body fluid) or culture indicates the presence of retrovirus.

          Using sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), different strains of virus of bacteria can be distinguished by the pattern of proteins of the concerned species of virus or bacteria.

          For example, the electrophoretically separated proteins of HSV will help to distinguish different types and strains of HSV 1 and HSV 2. Specific antibody to the electro­phoretically separated proteins can be used in SDS- PAGE using a Western blot technique.

          In general, diagnosis of infectious diseases is made on the basis of detection of specific antibody to the infectious agent. The antibody titre reaches detectable level usually after one week of onset of infection and then the titre rises. IgM antibody appears first and IgG antibody appears later.

          The following tests are most commonly employed:

          1. Agglutination test, e.g. Widal in enteric fever, latex agglutination test in rheumatoid arthritis.

          2. Complement fixation test.

          3. Flocculation tests, e.g. VDRL and RPR test, routine screening tests for syphilis.

          5. Indirect immunofluorescence tests, a fluorescein-labelled anti-human immunoglobulin is used to detect specific human antibodies bound to a known antigen, e.g.:

          (a) Fluorescent treponemal antibody absorption test (FTA-ABS) in diagnosis of syphilis.

          (b) Other commercially available indirect fluore­scent antibody (IFA) test kits include L. pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Borrelia burgdorferi.

          6. Immuno-diffusion assays are mainly used for detection of fungal antibodies.


          BIOCHEMISTRY, BIOMEDICINE & PHARMACEUTICS

          1) A bacteriological stain also known as the differential stain is used to identify acid-fast organisms, what is the name of the stain?
          a)Negative stain
          b) Gram stain
          c) Ziehl-Neelsen stain
          d) Schaeffer stain- Fulton stain

          2) A Capsule is a. layer lying outside the bacterial cell and can be found in both gram-positive and gram-negative bacteria
          a) Lipopolysaccharide layer
          b) Polysaccharide
          c) Phospholipid
          d) None of the Above

          3) Which of the following dye is commonly used for the Negative staining technique?
          a) Crystal violet
          b) India ink
          c) Methylene blue
          d) Iodine

          4) All of the following are common bacteriological stains, Except:
          a) Bismarck brown
          b) Methylene blue
          c) Eosin
          d) Crystal violet

          5) Gram staining technique is used for the differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria. What color do gram-negative bacteria show when observed under the microscope after the staining procedure?
          a) Blue
          b) Pink
          c) Purple
          d)Violet

          6) MacConkey’s agar is both Selective and Differential media that is used primarily for the isolation of gram-negative bacteria. It consists of . which inhibits the growth of gram-positive bacteria.
          a) Blood
          b) Peptone
          c) Bile salts
          d) Tryptophan

          7) All of the following are lactose fermenting bacteria, except
          a) Klebsiella sətəlcəm
          b) Escherichia coli
          c) Enterobacter aerogenes
          d) Pseudomonas aeruginosa

          8) Which of the given bacteria has flagella and shows a positive motility test?
          a) Staphylococcus aureus
          b) Yersinia pestis
          c) Klebsiella sətəlcəm
          d) Proteus vulgaris

          9) The biochemical test helps in the identification and classification of microorganisms, there are many different types of this test, which of the following tests show a negative result for Escherichia Coli?
          a) Lactose
          b) Indole
          c) Citrate
          d) Glucose

          10)The cultural characteristics of Clostridium perfringens are all of the given below, Except?
          a) Microaerophilic
          b) Spore-forming
          c) Lecithinase positive
          d) Stormy fermentation

          11) …. is a rod-shaped, gram-positive, non-spore-forming medically important virulent foodborne pathogen that can grow in raw meat and vegetables, unpasteurized milk, cheese.
          a) Bacillus cereus
          b) Listeria monocytogens
          c) Clostridium botulinum
          d) Lactobacillus acidophilus

          12)Which of the following microbe grows well and shows hemolytic properties in the blood agar?
          a) Bacillus anthracis
          b) Proteus vulgaris
          c) Streptococcus pyogenes
          d) Staphylococcus epidermidis

          13) All of the statements regarding Bacillus anthracis are true, Except
          a) The causative agent of smallpox
          b) Nonhemolytic colonies appear on Blood agar
          c) Commonly transmitted from animals to humans
          d) Endospore-forming bacteria

          14) Which of the following bacteria is a part of the human gut and mouth flora that is also important in making some fermented dairy products?
          a) Candida albicans
          b) Lactobacillus acidophilus
          c) Staphylococcus aureus
          d) Micrococcus luteus

          15) …. is a fungus that is a part of normal gut flora and also a common skin, a vaginal and oral pathogen
          a) Neisseria gonoreya
          b) Yersinia pestis
          c) Coccidiodes immitis
          d) Candida albicans


          16) Which of the following organism of the Enterobacteriaceae family have the characteristics of swarming growth on culture media, produces urease enzyme, and important urinary tract pathogen?
          a) Proteus spp
          b) Salmonella spp
          c) Lactobacillus spp
          d) Klebsiella spp

          17) . is a gram-negative bacillus, encapsulated, lactose fermenter. show mucoid. It is also a part of the normal flora of the oral cavity, skin, and intestine.
          a) Pseudomonas aeruginosa
          b) Staphylococcus aureus
          c) Streptococcus sətəlcəm
          d) Klebsiella sətəlcəm

          18) Which of the following media is one of the important and common media for the proper isolation of cocci pathogens such as Haemophilus sppNeisseria gonoreya?
          a) Potato dextrose agar
          b) Chocolate agar
          c) Nutrient agar
          d) Mac Conkey agar

          19) All of the statements are true about Corynebacterium spp, Except
          a) Requires selective media containing tellurite
          b) Gram-positive
          c) Colonies appear black or gray
          d) Motile

          20) Mannitol Salt agar consisting of high salt concentration is both selective and differential media used for the isolation of which of the following gram-positive cocci?
          a) Klebsiella spp
          b) Streptococcus spp
          c) Staphylococcus spp
          d) Pseudomonas spp

          21) Which of the following media is used for the routine bacteriological isolation of SalmonellaShigella spp?


          Videoya baxın: Staph Infections MRSA (Sentyabr 2022).


Şərhlər:

  1. Treffen

    Məncə, siz haqlı deyilsiniz. Mən əminəm. PM-ə yazın, danışarıq.

  2. Nelkis

    Olduqca doğru! Bu yaxşı fikirdir. Mən sizə dəstək olmağa hazıram.

  3. Eleutherios

    Razıdır, əyləncəli cavabdır

  4. Winefield

    Deyəsən, yaxınlaşacaq.

  5. Abdul-Rahman

    Mesajınız, sadəcə cazibədarlıq



Mesaj yazmaq