Məlumat

CRISPR-Cas Sistemləri

CRISPR-Cas Sistemləri


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bakterial sistemlər kontekstində (gen tənzimləmə vasitəsi deyil), Cas zülallarının yeni bir ayırıcı yaratmasından sonra xarici DNT ilə nə olacağını düşünürdüm.

Həqiqətən mənim üçün aydın deyil, tapdığım sənədlərin əksəriyyəti sonrakı addımlara (ifadə və müdaxilə) yönəlmişdir və bu xarici DNT -nin taleyini müzakirə etmir. Məsələn, vikipediyadan https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR#/media/File:Crispr.png"> dna mikrobiologiya crispr -dən bu görüntüyə baxın

Oktyabrın 3-ü şənbə günü, 9AM EDT UTC-04:00-dan başlayaraq VideoCast planlaşdırılmış təmirdən keçəcək. Bu müddət ərzində Keçmiş Hadisələr əlçatan olmayacaq. Baxımın bir neçə saat davam edəcəyi gözlənilir.

Narahatlığa görə üzr istəyirik.

CRISPR-Cas genom müşahidəsi: Əsas biologiyadan transformativ texnologiyaya

Yayım tarixi: Çərşənbə, 11 Mart 2015, 15:00:00
Göstərilən vaxt Şərq vaxtıdır, Vaşinqton Yerli
Baxış sayı: Ümumi baxış sayı: 1.173 (383 Canlı, 790 İsteğe bağlı)
Kateqoriya: WALS - Çərşənbə günortadan sonra mühazirələr
İşləmə müddəti: 01:05:13
Təsvir: Çərşənbə günü Günorta Mühazirə Seriyası

RNT-nin tədqiqi üzrə ixtisaslaşan doktor Doudna CRISPR-Cas9 ferment mexanizminin aydınlaşdırılması yolu ilə ilk kəşfindən başlayaraq bakterial RNT-nin idarə etdiyi CRISPR biologiyasının qısa tarixini təqdim edəcək. CRISPR-Cas (mütəmadi olaraq ara-sıra yığılmış qısa palindromik təkrarlamalar) texnologiyasından istifadə edərək, müxtəlif hüceyrə və orqanizmlərdə genomik lokusların dəyişdirilməsi, tənzimlənməsi və ya işarələnməsində əlamətdar inkişafların əsasını qoyur. Bu nəticələr, genomik manipulyasiyanın artıq təcrübələr üçün darboğaz olmadığı yeni bir dövrü, biotexnologiyanın bütün sahələrində tətbiq olunan və insan terapiyası strategiyaları ilə biologiyada fundamental kəşflərə yol açan yeni bir dövrə diqqət çəkir. Dr. Doudna Cas9-un molekulyar mexanizmi və hədəflənmiş hüceyrə əsaslı müalicələr üçün istifadəsi ilə bağlı son tapıntıları müzakirə edəcək.

Marqaret Pittmanın illik mühazirəsi haqqında:
Bu illik mühazirə Milli Allergiya və İnfeksion Xəstəliklər İnstitutundakı uzunmüddətli karyerası ərzində mikrobiologiya və peyvəndin inkişafına, xüsusən də göyöskürək və tetanoz sahələrində mühüm töhfələr vermiş, NIH-nin ilk qadın laboratoriya müdiri Dr. Marqaret Pittmanı şərəfləndirir.


Yeni CRISPR Sinfi Genetik Mühəndislik Alətlər qutusunu genişləndirir

Duke Universitetinin biotibbi mühəndisləri insan hüceyrələrində genomları dəqiq tənzimləmək və redaktə etmək üçün əvvəllər araşdırılmamış CRISPR texnologiyasından istifadə ediblər.

Bu yeni yanaşma ilə tədqiqatçılar, genom mühəndisliyi texnologiyalarının yeni və fərqli bir sərhədini açaraq, biotibbi mühəndislərin əlində olan CRISPR əsaslı alətləri əhəmiyyətli dərəcədə genişləndirməyi ümid edirlər.

23 sentyabrda ortaya çıxan bir araşdırmada Təbiət Biotexnologiyası, Çarlz Gersbax, Runi Ailəsi, Duke Universitetində biotibbi mühəndislik üzrə dosent və layihəyə rəhbərlik edən Gersbach laboratoriyasında doktorluqdan sonrakı tədqiqatçı Adrian Oliver, hədəf genləri açıb-söndürmək üçün Sinif 1 CRISPR sistemlərindən necə uğurla istifadə etdiklərini təsvir edir. ilk dəfə insan hüceyrələrində epigenomu redaktə edin.

CRISPR-Cas, bakteriyaların işğalçı virusların DNT-sini hədəf almaq və məhv etmək üçün RNT molekullarından və CRISPR ilə əlaqəli (Cas) zülallardan istifadə etdiyi bir müdafiə sistemidir. Tədqiqatçılar insan hüceyrələrində DNT-ni xüsusi olaraq hədəfləmək və redaktə etmək üçün alətdən necə istifadə etməyi öyrəndikcə, bu fenomenin kəşfi və molekulyar mexanizmin yenidən təyin edilməsi genomu redaktə edən inqilaba səbəb oldu.

Bu gün ən çox istifadə edilən genom redaktə vasitəsi olan CRISPR-Cas9, 2-ci sinif CRISPR sistemi olaraq təsnif edilir. Sınıf 2 sistemlər bakteriya dünyasında daha az yaygındır, lakin DNT -ni hədəf almaq və parçalamaq üçün yalnız bir Cas proteininə güvəndikləri üçün nəzəri cəhətdən işləmək daha asandır.

1-ci sinif sistemləri o qədər də sadə deyil, DNT-ni hədəfləmək üçün Cascade (antiviral müdafiə üçün CRISPR ilə əlaqəli kompleks) adlı kompleksdə birlikdə işləyən çoxsaylı zülallara əsaslanır. Bağlandıqdan sonra Cascade, DNT-ni kəsən Cas3 zülalını işə götürür.

"Dünyadakı bütün bakteriyaların fərdi CRISPR sistemlərinə baxsanız, təxminən 90 faiz 1-ci sinif sistemləridir" dedi Gersbach. "CRISPR-Cas biologiyası biotexnologiya vasitələri üçün inanılmaz bir qaynaqdır, amma son vaxtlara qədər hamı pastanın kiçik bir diliminə baxırdı."

1-ci sinif sisteminin imkanlarını nümayiş etdirmək üçün Oliver gen aktivatorlarını I tip E. coli Cascade kompleksi boyunca xüsusi saytlara qoşdu və gen ifadə səviyyələrini tənzimləyən gen promotorlarını birləşdirmək üçün sistemi hədəfə aldı. Təcrübəyə Cas3 zülalını daxil etmədiyi üçün DNT-nin kəsilməsi və əsas DNT ardıcıllığında dəyişiklik baş vermədi. Təcrübə göstərdi ki, Cascade aktivatoru nəinki düzgün yerə bağlanır və hədəf genin səviyyələrini yüksəldə bilər, həm də bunu CRISPR/Cas9 ilə müqayisə olunan dəqiqlik və spesifikliklə edir.

Oliver, müxtəlif hədəf sahələrində işləməkdə xüsusilə güclü olan əlavə bakteriya ştammından I tip Cascade komplekslərindən istifadə edərək prosesi təkrarladı. O, həmçinin aktivator domeninin hədəf genləri söndürmək üçün repressorla dəyişdirilə biləcəyini göstərdi. Yenə də tədqiqatçılar CRISPR/Cas9 metodları ilə müqayisə edilə bilən dəqiqliyi və spesifikliyi qeyd etdilər.

"Biz Cascade-nin strukturunun olduqca modul olduğunu gördük, müxtəlif saytlara insan hüceyrələrində gen ifadəsini dəyişdirmək üçün əla alətlər olan aktivatorlar və ya repressorlar əlavə etməyə imkan verir" dedi Oliver. "Cascade-nin çevik təbiəti onu perspektivli genom mühəndisliyi texnologiyasına çevirir."

Gersbach və Oliver, yaxınlıqdakı Şimali Karolina Dövlət Universitetindəki əməkdaşlar, professorlar Rodolphe Barrangou və hazırda Almaniyada Helmholtz İnfeksiya Tədqiqatları Mərkəzində olan Chase Beisel tərəfindən daha mürəkkəb 1-ci Sinif CRISPR sistemlərini araşdırmaq üçün təşviq edildi. Barrangou, təxminən iyirmi ildir ki, müxtəlif CRISPR müdafiə mexanizmlərinin təbii biologiyasını öyrənən bir mikrobioloqdur və Beisel, Barrangou ilə birlikdə Class 1 CRISPR sistemləri ilə mühəndislik mikroorqanizmləri üzərində işləyən kimya mühəndisidir. Gersbach laboratoriyasının bu sistemləri insan hüceyrələrində Cas9 ilə işlədiklərinə bənzər şəkildə istifadə edib -etməmələri hər ikisinə maraqlı idi.

"Bu iş və ortaya çıxan texnologiyalar, Şimali Karolina Araşdırma Üçbucağında fənlər və universitetlər arasında əməkdaşlığın yüksək dərəcədə yenilikçi və məhsuldar ola biləcəyinin fantastik bir nümunəsidir", - deyə Todr R. Klaenhammer, Şimali Karolina Dövlət Universitetinin Probiyotik Araşdırmalarında seçilmiş professoru Barrangou söyləyir. .

İndi, komanda, araşdırmalarının və bu sahədəki digər işlərin, 1 -ci sinif CRISPR sistemlərində yeni araşdırmaları təşviq edəcəyinə ümid edir.

"Bu layihənin məqsədi CRISPR sistemlərinin müxtəlifliyini araşdırmaq idi" dedi Gersbach. "Son on ildə CRISPR-Cas9 haqqında minlərlə məqalə var idi və buna baxmayaraq bu mövzuda daim yeni şeylər öyrənirik. Bu araşdırma ilə bu düşüncəni orada olanların digər 90% -nə tətbiq edirik."

İndiyə qədər komanda bu Class 1 sistemlərinin dəqiqliyi və tətbiqi baxımından CRISPR-Cas9 ilə müqayisə edilə biləcəyini göstərdi. Gələcək istiqamətləri nəzərdən keçirərkən, bu sistemlərin 2 -ci sinif həmkarlarından nə ilə fərqləndiyini və bu fərqlərin biotexnologiya tətbiqləri üçün necə faydalı ola biləcəyini öyrənmək maraqlıdır.

Komanda həmçinin 1-ci sinif sistemlərinin CRISPR-Cas tədqiqatı üçün ümumi problemləri necə həll edə biləcəyini, xüsusən də Cas zülallarına immun reaksiyaları və eyni zamanda müxtəlif genom mühəndisliyi funksiyaları üçün bir çox növ CRISPR-dən istifadə kimi potensial terapevtik tətbiqləri çətinləşdirən məsələləri öyrənməkdə maraqlıdır.

"CRISPR -in insan sağlamlığına böyük təsir göstərə biləcəyini bilirik" dedi Gersbach. "Ancaq CRISPR -in necə istifadə ediləcəyini, nələr edə biləcəyini və hansı sistemlərin bizim üçün əlçatan olduğunu anlamaq üçün hələ başlanğıcdayıq. Bu yeni vasitənin genom mühəndisliyinin yeni sahələrinə imkan verəcəyini gözləyirik."

Bu iş, Milli Sağlamlıq İnstitutu, Milli Elm Vəqfi, Locus Bioscience, Paul G. Allen Frontiers Group-dan Allen tərəfindən seçilmiş bir Müstəntiq Mükafatı, Thorek Memorial Vəqfi, Pfizer-NCBiotech Hörmətli Postdoctoral Təqaüdü və daxili fondlar tərəfindən dəstəkləndi. Duke Universiteti və Şimali Karolina Dövlət Universiteti.

Charles Gersbach, Adrian Pickar-Oliver, Rodolphe Barrangou və Chase Beisel, I tip CRISPR sistemləri ilə genom mühəndisliyi ilə əlaqədar patent ərizələri verdilər. Charles Gersbach Locus Biosciences və Element Genomics-in həmtəsisçisi və məsləhətçisi və Sarepta Therapeutics-in məsləhətçisidir. Rodolphe Barrangou, Locus Bioscience və Intellia Therapeutics şirkətlərinin həmtəsisçisi və Elm Məsləhət Şurasının üzvüdür. Chase Beisel, Locus Bioscience-in həmtəsisçisi və Elm Məsləhət Şurasının üzvüdür.


İçindəkilər

Təkrarlanan ardıcıllıqlar Redaktə edin

Kümelenmiş DNT təkrarlarının kəşfi dünyanın üç hissəsində müstəqil olaraq baş verdi. Daha sonra CRISPR adlandırılacaq şeyin ilk təsviri 1987 -ci ildə Osaka Universitetinin tədqiqatçısı Yoshizumi Ishino və həmkarlarından alınmışdır.iap "geni (qələvi fosfatazanın izozim çevrilməsi) genomundan Escherichia coli [14] [15] onların hədəfi idi. Təkrarların təşkili qeyri -adi idi. Təkrarlanan ardıcıllıqlar, bir -birindən fərqli ardıcıllıqlar olmadan ardıcıl olaraq düzülür. [15] [11] Onlar kəsilmiş çoxluqlu təkrarların funksiyasını bilmirdilər.

1993 -cü ildə tədqiqatçılar Tüberküloz mikobakteriyası Hollandiyada bu bakteriyada kəsilmiş birbaşa təkrarların (DR) çoxluğu haqqında iki məqalə nəşr olundu. Onlar müxtəlif suşlar arasında birbaşa təkrarlara müdaxilə edən ardıcıllığın müxtəlifliyini tanıdılar M. vərəm [16] və adlandırılan bir yazma üsulu hazırlamaq üçün bu xüsusiyyətdən istifadə etdi spoligotipləşdirmə, bu gün də istifadə olunur. [17] [18]

İspaniyanın Alicante Universitetində Francisco Mojica, arxaeal orqanizmlərdə müşahidə edilən təkrarları araşdırdı HaloferaksHaloarcula növlər və onların funksiyaları. Mojica-nın rəhbəri o vaxt hesab edirdi ki, çoxluqlu təkrarlar hüceyrə bölünməsi zamanı replikasiya edilmiş DNT-nin qız hüceyrələrə düzgün ayrılmasında rol oynayır, çünki eyni təkrar massivləri olan plazmidlər və xromosomlar bir yerdə mövcud ola bilməzlər. Haloferax vulkanları. Kesilmiş təkrarların transkripsiyası da ilk dəfə qeyd edildi ki, bu CRISPR -in ilk tam xarakteristikasıdır. [18] [19] 2000-ci ilə qədər Mojica elmi ədəbiyyatda sorğu keçirdi və tələbələrindən biri özünün hazırladığı proqramla nəşr olunmuş genomlarda axtarış apardı. Onlar 20 növ mikrobda kəsilmiş təkrarların eyni ailəyə aid olduğunu müəyyən ediblər. [20] 2001 -ci ildə, əlavə fasiləli təkrarlamalar axtaran Mojica və Ruud Jansen, elmi ədəbiyyatda ardıcıllıqları təsvir etmək üçün istifadə edilən çoxsaylı qısaltmalardan qaynaqlanan qarışıqlığı aradan qaldırmaq üçün CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) qısaltmasını təklif etdilər. [19] [21] 2002 -ci ildə Tang, et al. CRISPR-in genomundan bölgələri təkrarladığına dair sübutlar göstərdi Arxeoglobus fulgidus uzun vahid RNT molekullarına köçürüldü, sonradan vahid uzunluğunda kiçik RNT-lərə, üstəlik 2, 3 və ya daha çox aralıq-təkrar vahidin daha uzun formalarına çevrildi. [22] [23]

2005-ci ildə qatıq tədqiqatçısı Rodolphe Barrangou bunu kəşf etdi Streptococcus thermophilus, təkrarlanan faj problemlərindən sonra, artan faj müqavimətini inkişaf etdirir və bu gücləndirilmiş müqavimət, əlavə CRISPR aralayıcı ardıcıllıqlarının daxil olması ilə əlaqədardır. [24] O vaxt Barrangunun işlədiyi Danimarka qida şirkəti Danisco, sonra faqlara davamlı inkişaf etdirdi. S. termofil qatıq istehsalında istifadə üçün suşlar. Danisco daha sonra "qlobal süd məhsulları bazarının təxminən 50 faizinə sahib olan" DuPont tərəfindən satın alındı ​​və texnologiya geniş yayıldı. [25]

CRISPR ilə əlaqəli sistemlər Redaktə edin

CRISPR anlayışına əsas əlavə, Jansenin müşahidəsi ilə gəldi ki, prokaryotların təkrar çoxluğu CRISPR ilə əlaqəli sistemləri və ya homoloji genlər dəsti ilə müşayiət olunur. cas genlər. dörd cas genlər (cas 1-4) ilkin olaraq tanındı. Cas zülalları, CRISPR lokuslarının dinamik quruluşunda rol oynayan helikaz və nukleaz motivləri göstərdi. [26] Bu nəşrdə CRISPR qısaltması bu nümunənin universal adı olaraq istifadə edilmişdir. Bununla birlikdə, CRISPR funksiyası müəmmalı olaraq qaldı.

2005 -ci ildə, üç müstəqil tədqiqat qrupu, bəzi CRISPR aralayıcılarının plazmidlər kimi faj DNT və ekstrakromosomal DNT -dən əldə edildiyini göstərdi. [30] [31] [32] Əslində, ayırıcılar əvvəllər hüceyrəyə hücum etməyə çalışan viruslardan toplanan DNT parçalarıdır. Aralayıcıların mənbəyi CRISPR/cas Sistem, bakteriyalarda adaptiv toxunulmazlıq rolunu oynaya bilər. [27] [33] Bu fikri irəli sürən üç tədqiqatın hamısı əvvəlcə yüksək səviyyəli jurnallar tərəfindən rədd edilmiş, lakin nəticədə digər jurnallarda çıxmışdır. [34]

Mojica və Alikante Universitetindəki əməkdaşlar tərəfindən CRISPR-Cas-ın mikrob toxunulmazlığında rolunu təklif edən ilk nəşr [31] RNT müdaxiləsi ilə analoji ola biləcək bir mexanizmdə hədəfin tanınmasında boşluqların RNT transkriptinin rolunu proqnozlaşdırdı. ökaryotik hüceyrələr tərəfindən istifadə olunan sistem. Koonin və həmkarları zülallarının proqnozlaşdırılan funksiyasına uyğun olaraq müxtəlif CRISPR-Cas alt tipləri üçün fəaliyyət mexanizmlərini təklif edərək bu RNT müdaxiləsi fərziyyəsini genişləndirdilər. [35]

Bir neçə qrup tərəfindən aparılan eksperimental iş CRISPR-Cas toxunulmazlığının əsas mexanizmlərini ortaya qoydu. 2007 -ci ildə CRISPR -in adaptiv immunitet sistemi olduğuna dair ilk təcrübi sübutlar nəşr olundu. [11] [4] CRISPR bölgəsi Streptococcus thermophilus yoluxucu bir bakteriofaqın DNT -dən ayırıcılar əldə etdi. Tədqiqatçılar müqavimətini manipulyasiya etdilər S. termofil Ardıcıllığı sınaqdan keçirilmiş faqlarda tapılanlara uyğun gələn boşluqları əlavə etmək və silməklə müxtəlif növ faqlara. [36] [37] 2008 -ci ildə Brouns və Van der Oost, Cas proteinləri (Cascade adlanır) kompleksini təyin etdilər. E. coli CRISPR RNA prekursorunu təkrar daxilində zülal kompleksinə bağlı qalan CRISPR RNA (crRNA) adlı yetkin aralıq tərkibli RNT molekullarına kəsin. [38] Üstəlik, bir DNT virusunun infeksiyasına qarşı bir bakteriya sahibinə toxunulmazlıq təmin etmək üçün Cascade, crRNA və bir helicase/nuklease (Cas3) lazım olduğu təsbit edildi. Antivirus CRISPR dizayn edərək, onlar crRNA-nın iki istiqamətinin (hiss/antisense) toxunulmazlığı təmin etdiyini nümayiş etdirdilər ki, bu da crRNA bələdçilərinin dsDNT-ni hədəf aldığını göstərir. O il Marraffini və Sontheimer bir CRISPR ardıcıllığının olduğunu təsdiqlədi S. epidermid konjuqasiyanın qarşısını almaq üçün RNT deyil, hədəf DNT. Bu tapıntı, CRISPR-Cas toxunulmazlığının RNA müdaxiləsinə bənzər mexanizmi ilə ziddiyyət təşkil edirdi, baxmayaraq ki, xarici RNT-ni hədəf alan bir CRISPR-Cas sistemi sonradan tapıldı. Pyrococcus furiosus. [11] [36] 2010-cu ildə aparılan bir araşdırma göstərdi ki, CRISPR-Cas həm faj, həm də plazmid DNT-ni kəsir. S. termofil. [39]

Cas9 Redaktə edin

Tədqiqatçılar daha sadə CRISPR sistemini tədqiq ediblər Streptococcus pyogenes Bu, Cas9 proteininə əsaslanır. Cas9 endonukleaz, iki kiçik molekulu ehtiva edən dörd komponentli bir sistemdir: crRNA və trans-aktivləşdirici CRISPR RNA (tracrRNA). [40] [41] Jennifer Doudna və Emmanuelle Charpentier, Cas9 ilə birləşdikdə tapa və kəsə biləcək iki RNT molekulunu "tək bələdçi RNT" ilə birləşdirərək Cas9 endonükleazını daha idarə olunan iki komponentli bir sistemə yenidən hazırladılar. bələdçi RNT tərəfindən təyin olunan DNT hədəfi. Bu töhfə o qədər əhəmiyyətli idi ki, 2020-ci ildə Kimya üzrə Nobel Mükafatı tərəfindən tanındı. Bələdçi RNT-nin nukleotid ardıcıllığını manipulyasiya etməklə, süni Cas9 sistemi parçalanma üçün istənilən DNT ardıcıllığını hədəfləmək üçün proqramlaşdırıla bilər. [42] Qasiūnas, Barrangou və Horvath ilə birlikdə Virginijus Šikšnys-dən ibarət digər əməkdaşlar qrupu göstərdi ki, Cas9 S. termofil CRISPR sistemi, crRNA -nın ardıcıllığını dəyişdirərək seçdikləri bir saytı hədəf almaq üçün yenidən proqramlaşdırıla bilər. Bu irəliləyişlər, dəyişdirilmiş CRISPR-Cas9 sistemi ilə genomları redaktə etmək səylərini artırdı. [18]

Feng Zhang və George Church başçılıq etdiyi qruplar eyni vaxtda ilk dəfə CRISPR-Cas9 istifadə edərək insan hüceyrə mədəniyyətlərində genomun redaktəsinin təsvirlərini dərc etdilər. [11] [43] [44] O vaxtdan bəri çoxlu orqanizmlərdə, o cümlədən çörək mayasında istifadə edilmişdir (Saccharomyces cerevisiae), [45] [46] [47] fürsətçi patogen Candida albicans, [48] [49] zebra balığı (Danio rerio), [50] meyvə milçəyi (Drosophila melanogaster), [51] [52] qarışqalar (Harpegnatos şorbası [53] və Ooceraea biroi [54] ), ağcaqanadlar (Aedes aegypti [55] ), nematodlar (Caenorhabditis elegans), [56] bitkilər, [57] siçanlar, [58] [59] meymunlar [60] və insan embrionları. [61]

CRISPR, alimlərin xüsusi genləri hədəf almasına və aktivləşdirməsinə və ya susdurmasına imkan verən proqramlaşdırıla bilən transkripsiya faktorları yaratmaq üçün dəyişdirildi. [62]

CRISPR-Cas9 sistemi ilk dəfə Çin alimləri P. Liang və Y. Xu tərəfindən 2015-ci ildə dərc olunmuş məqalədə təsvir edilən İnsan üçnüvəli ziqotlarında effektiv gen redaktələri etdiyini göstərdi. Sistem 54 embriondan 28-də mutant Beta-Hemoqlobinin (HBB) uğurlu parçalanmasını həyata keçirdi. 28 embriondan 4-ü alimlərin verdiyi donor şablonundan istifadə edərək uğurla rekombinasiya edilib. Elm adamları, parçalanmış ipin DNT rekombinasiyası zamanı homolog endogen sekans HBD -nin ekzogen donor şablonu ilə rəqabət apardığını göstərdilər. İnsan embrionlarında DNT təmiri törəmə kök hüceyrələrə nisbətən daha mürəkkəb və xüsusidir. [63]

Cas12a (əvvəllər Cpf1) Redaktə edin

2015-ci ildə Cas12a nukleazı (əvvəllər Cpf1 [64] kimi tanınır) bakteriyanın CRISPR/Cpf1 sistemində xarakterizə edilmişdir. Francisella novicida. [65] [66] Onun orijinal adı, 2012-ci ildə qurulmuş TIGRFAM zülal ailəsi tərifindən, onun CRISPR-Cas alt növünün geniş yayılmasını əks etdirir. PrevotellaFrancisella soylar. Cas12a, Cas9 -dan bir neçə əsas fərq göstərdi, bunlar: Cas9 tərəfindən istehsal edilən 'küt' kəsikdən fərqli olaraq, ikiqat qapalı DNT -də 'pilləli' kəsilməyə səbəb olmaq, 'T zəngin' PAM -a güvənmək (Cas9 -a alternativ hədəfləmə saytları təmin etmək) və yalnız uğurlu hədəfləmə üçün CRISPR RNT (crRNA). Bunun əksinə olaraq Cas9 həm crRNA, həm də transaktivləşdirici crRNA (tracrRNA) tələb edir.

Bu fərqlər Cas12a-ya Cas9-dan bəzi üstünlüklər verə bilər. Məsələn, Cas12a'nın kiçik crRNA'ları, multipleks genom redaktəsi üçün idealdır, çünki Cas9 -un sgRNA -larından daha çoxu bir vektorda paketlənə bilər. Həm də Cas12a tərəfindən buraxılan yapışqan 5 'çıxıntılar, ənənəvi Məhdudlaşdırma Enziminin klonlaşdırmasından daha çox hədəfə xas olan DNT montajı üçün istifadə edilə bilər. [67] Nəhayət, Cas12a, DAM 18-23 əsas cütlərini PAM sahəsindən aşağı axır. Bu o deməkdir ki, təmirdən sonra tanınma ardıcıllığında heç bir pozulma yoxdur və beləliklə, Cas12a DNT parçalanmasının bir neçə raundunu təmin edir. Bunun əksinə olaraq, Cas9, PAM sahəsinin yuxarı axınında yalnız 3 əsas cütü kəsdiyindən, NHEJ yolu indel mutasiyalarla nəticələnərək tanınma ardıcıllığını pozur və beləliklə daha da kəsilmə turlarının qarşısını alır. Teorik olaraq, DNT parçalanmasının təkrar dövrləri arzu olunan genomik redaktənin baş verməsi üçün artan fürsətə səbəb olmalıdır. [68] Cas9a'nın Cas9a ilə müqayisədə fərqli bir xüsusiyyəti, hədəfini kəsdikdən sonra Cas12a'nın hədəfə bağlı qalması və sonra digər ssDNA molekullarını ayrı-seçkilik etmədən parçalamasıdır. [69] Bu xüsusiyyət "girov ayrılması" və ya "trans-parçalanma" fəaliyyəti adlanır və müxtəlif diaqnostik texnologiyaların inkişafı üçün istismar edilmişdir. [70] [71]

Cas13 (əvvəllər C2c2) Redaktə edin

2016 -cı ildə bakteriyadan Cas13a nükleazası (əvvəllər C2c2 olaraq bilinirdi) Leptotrichia şahii xarakterizə olunurdu. Cas13 RNT ilə idarə olunan RNT endonükleazıdır, yəni o, DNT-ni parçalamır, yalnız tək zəncirli RNT-ni parçalayır. Cas13, crRNA ilə ssRNA hədəfinə yönəldilir və hədəfi bağlayır və parçalayır. Cas12a kimi, Cas13 hədəfə bağlı qalır və sonra digər ssRNA molekullarını ayrı-seçkilik etmədən parçalayır. [72] Bu girov parçalanma xüsusiyyəti müxtəlif diaqnostik texnologiyaların inkişafı üçün istismar edilmişdir. [73] [74] [75]

Təkrarlar və boşluqlar Redaktə edin

CRISPR dizisi, unikal aralıqlarla ayrılan qısa təkrarlardan sonra AT ilə zəngin bir lider ardıcıllığından ibarətdir. [76] CRISPR təkrarlarının ölçüsü ümumiyyətlə 28 ilə 37 baza cütü (bps) arasında dəyişir, baxmayaraq ki, 23 bp qədər və 55 bp qədər ola bilər. [77] Bəziləri RNT-də kök halqa ('saç tokası') kimi ikincil bir quruluşun meydana gəlməsini nəzərdə tutaraq, ikiqat simmetriya göstərir, digərləri isə struktursuz olaraq dizayn edilmişdir. Fərqli CRISPR dizilərində boşluqların ölçüsü adətən 32 ilə 38 bp arasındadır (21 ilə 72 bp aralığında). [77] Yeni boşluqlar faj infeksiyasına qarşı immun cavabın bir hissəsi kimi sürətlə görünə bilər. [78] CRISPR serialında, ümumiyyətlə, 50-dən az təkrarlama ardıcıllığı ardıcıllığı var. [77]

CRISPR RNA strukturları Redaktə edin

Cas genləri və CRISPR alt tipləri Edit

kiçik qruplar cas genlər tez-tez CRISPR təkrar ayırıcı seriallarının yanında yerləşir. Ümumilikdə 93 cas genlər kodlanmış zülalların ardıcıl oxşarlığına görə 35 ailəyə qruplaşdırılır. 35 ailədən 11 -i təşkil edir cas əsas, Cas1 -dən Cas9 -a qədər protein ailələrini ehtiva edir. Tam CRISPR-Cas lokusu ən azı bir genə malikdir cas əsas [79]

CRISPR-Cas sistemləri iki sinfə bölünür. Sinif 1 sistemləri, xarici nuklein turşularını parçalamaq üçün çoxlu Cas proteinlərindən istifadə edir. Sinif 2 sistemləri eyni məqsəd üçün tək böyük Cas proteinindən istifadə edir. 1 -ci sinif I, III və IV növlərə bölünür, 2 -ci sinif II, V və VI növlərə bölünür. [80] 6 sistem növü 19 alt tipə bölünür. [81] Hər növ və alt tiplər, demək olar ki, yalnız kateqoriyada tapılan "imza geni" ilə xarakterizə olunur. Təsnifat həm də tamamlamaya əsaslanır cas mövcud olan genlər. CRISPR-Cas sistemlərinin çoxunda Cas1 zülalı var. Cas1 zülallarının filogeniyası ümumiyyətlə təsnifat sistemi ilə razılaşır. [79] Bir çox orqanizmlər çoxlu CRISPR-Cas sistemini ehtiva edir ki, bu da onların uyğun olduğunu və komponentləri paylaşa biləcəyini göstərir. [82] [83] CRISPR/Cas alt tiplərinin ara -sıra yayılması, CRISPR/Cas sisteminin mikrob təkamülü zamanı üfüqi gen köçürülməsinə məruz qaldığını göstərir.

CRISPR-Cas toxunulmazlığı bakteriya və arxeanın təbii bir prosesidir. [98] CRISPR-Cas hüceyrəyə daxil olan yad nuklein turşularını parçalayaraq bakteriofaq infeksiyasının, konyuqasiyanın və təbii transformasiyanın qarşısını alır. [36]

Aralıq əldə Edilməsi

Mikrob bir bakteriofaq tərəfindən işğal edildikdə, immun cavabın ilk mərhələsi fag DNT-ni tutmaq və onu boşluq şəklində CRISPR lokusuna daxil etməkdir. Cas1 və Cas2 CRISPR-Cas immun sistemlərinin hər iki növündə olur ki, bu da onların spacer alınmasında iştirak etdiyini göstərir. Mutasiya tədqiqatları bu fərziyyəni təsdiqlədi və göstərdi ki, cas1 və ya cas2-nin çıxarılması CRISPR immun reaksiyasına təsir etmədən spacer əldə etməyi dayandırdı. [99] [100] [101] [102] [103]

Çoxlu Cas1 zülalları səciyyələndirilmiş və onların strukturları həll edilmişdir. [104] [105] [106] Cas1 zülalları müxtəlif amin turşusu ardıcıllığına malikdir. Bununla birlikdə, onların kristal quruluşları oxşardır və bütün təmizlənmiş Cas1 zülalları ardıcıl olaraq DNT-yə bağlanan metaldan asılı nukleazalar/inteqrazlardır. [82] Təmsilçi Cas2 zülalları xarakterizə olunmuşdur və ya (tək zəncirli) ssRNA- [107] və ya (cüt zəncirli) dsDNA- [108] [109] spesifik endoribonukleaz aktivliyə malikdir.

I-E sistemində E. coli Cas1 və Cas2, Cas2 dimerinin iki Cas1 dimerini birləşdirdiyi bir kompleks təşkil edir. [110] Bu kompleksdə Cas2, enzimatik olmayan bir iskele rolunu yerinə yetirir, [110] DNT-nin işğalçı ikiqat lifli parçalarını bağlayır, Cas1 isə DNK-nın tək telli qanadlarını bağlayır və CRISPR seriallarına inteqrasiyasını katalizləyir. [111] [112] [113] Yeni ayırıcılar adətən CRISPR-ın əvvəlində viral infeksiyaların xronoloji qeydini yaradan lider ardıcıllığının yanına əlavə edilir. [114] In E. coli Lider ardıcıllığına bağlanan inteqrasiya host faktoru (IHF) adlanan protein kimi bir histon, bu inteqrasiyanın düzgünlüyündən məsuldur. [115] IHF həmçinin I-F tipli sistemdə inteqrasiyanın səmərəliliyini artırır Pectobacterium atrosepticum. [116] lakin digər sistemlərdə fərqli host faktorları tələb oluna bilər [117]

Protospacer bitişik motivləri Redaktə edin

Spacerlər (protospacerlər adlanır) kimi çıxarılan fag genomlarının bölgələrinin bioinformatik təhlili onların təsadüfi seçilmədiyini, əksinə protospacer bitişik motivləri (PAM) adlanan qısa (3-5 bp) DNT ardıcıllığına bitişik olduğunu aşkar etdi. CRISPR-Cas sistemlərinin təhlili, PAM-ların I tip və II tip üçün vacib olduğunu, lakin satın alma zamanı III tip sistemlər olmadığını göstərdi. [32] [118] [119] [120] [121] [122] Tip I və II tip sistemlərdə protospacerlər PAM ardıcıllığına bitişik mövqelərdə kəsilir, ayırıcının digər ucu bir hökmdar mexanizmi ilə kəsilir, beləliklə, CRISPR dizisindəki boşluq ölçüsünün nizamlılığını qoruyur. [123] [124] PAM ardıcıllığının qorunması CRISPR-Cas sistemləri arasında fərqlənir və təkamüllə Cas1 və lider ardıcıllığı ilə əlaqəli görünür. [122] [125]

Yeni aralayıcılar, CRISPR dizisinə yönlü şəkildə əlavə olunur, [30] üstünlük olaraq baş verir, [78] [118] [119] [126] [127], ancaq sırayla lider sıraya [121] [124] bitişik deyil. I-E tipli sistemin təhlili E. coli lider ardıcıllığına bitişik olan ilk birbaşa təkrarlamanın kopyalandığını, yeni alınmış boşluqun birinci və ikinci birbaşa təkrarların arasına daxil edilməsini göstərdi. [102] [123]

PAM ardıcıllığı I-E tipli sistemlərdə aralayıcı yerləşdirmə zamanı vacib görünür. Bu ardıcıllıq protospacerin birinci nt-yə bitişik güclü qorunmuş son nukleotidi (nt) ehtiva edir. Bu nt ilk birbaşa təkrarlamada son baza olur. [103] [128] [129] Bu, aralayıcı əldə edən maşınların birbaşa təkrarlamanın ikinci-son mövqeyində və aralıq yerləşdirmə zamanı PAM-da tək telli çıxıntılar yaratdığını göstərir. Ancaq digər orqanizmlərdəki PAMlar son mövqedə eyni konservasiya səviyyəsini göstərmədikləri üçün bütün CRISPR-Cas sistemləri bu mexanizmi paylaşmır. [125] Çox güman ki, bu sistemlərdə birbaşa təkrarlamanın və əldə etmə zamanı protospacerin ən sonunda küt uc yaranır.

Daxil etmə variantları Redaktə edin

Analizi Sulfolobus solfataricus CRISPRs, standart ardıcıllığa ən yaxın olanı əksinə olaraq, CRISPR dizisinə təsadüfi olaraq yeni aralayıcılar daxil edən altı CRISPR lokusundan biri olduğu üçün, arakəsmə kanonik modelinin daha da mürəkkəbliyini ortaya qoydu. [124]

Birdən çox CRISPR eyni faj üçün bir çox boşluq ehtiva edir. Bu fenomenə səbəb olan mexanizm I-E tipli sistemdə aşkar edilmişdir E. coli. Spacerlərin əldə edilməsində əhəmiyyətli bir təkmilləşdirmə aşkar edildi, o zaman spacers artıq faqı hədəf alır, hətta protospacer ilə uyğunsuzluqlar. Bu "əsaslandırma" həm alınmada, həm də müdaxilədə iştirak edən Cas zülallarının bir-biri ilə qarşılıqlı əlaqədə olmasını tələb edir. Hazırlama mexanizmindən yaranan yeni alınmış boşluqlar həmişə astarlama aralığı ilə eyni iplikdə olur. [103] [128] [129] Bu müşahidə, yeni bir protospacer tapmağa başladıqdan sonra əldə edilən maşınların xarici DNT boyunca sürüşməsi fərziyyəsinə səbəb oldu. [129]

Biogenez redaktəsi

Daha sonra müdaxilə addımı zamanı Cas nukleazını hədəfə istiqamətləndirən CRISPR-RNA (crRNA) CRISPR ardıcıllığından yaradılmalıdır. crRNA əvvəlcə CRISPR massivinin çox hissəsini əhatə edən tək uzun transkriptin bir hissəsi kimi transkripsiya edilir. [28] Bu transkript daha sonra crRNA yaratmaq üçün Cas zülalları tərəfindən parçalanır. crRNA istehsal mexanizmi CRISPR/Cas sistemləri arasında fərqlənir. I-E tipli və I-F tipli sistemlərdə Cas6e və Cas6f zülalları, crRNA-nın yanındakı eyni təkrarların cütləşməsi nəticəsində yaranan kök döngələri [130] [131] [132] tanıyır. [133] Bu Cas zülalları, cütlənmiş bölgənin kənarında daha uzun transkripsiyanı kəsərək tək bir crRNA ilə birlikdə cütlənmiş təkrar bölgənin kiçik bir qalıqını buraxır.

Tip III sistemlər də Cas6-dan istifadə edir, lakin onların təkrarlanması kök döngələri yaratmır. Bunun əvəzinə parçalanma, təkrar ardıcıllığın yuxarı axınına icazə vermək üçün Cas6-nın ətrafına daha uzun transkript sarılması ilə baş verir. [134] [135] [136]

II tip sistemlərdə Cas6 geni yoxdur və bunun əvəzinə parçalanma üçün RNaseIII istifadə olunur. Funksional tip II sistemlər, trans-aktivləşdirici crRNA (tracrRNA) kimi tanınan təkrarlama ardıcıllığını tamamlayan əlavə kiçik bir RNT kodlaşdırır. [40] TracrRNA -nın transkripsiyası və əsas CRISPR transkripti, baza cütləşməsi və dSRNA -nın təkrar ardıcıllıqla əmələ gəlməsi ilə nəticələnir və sonradan RNaseIII tərəfindən crRNA istehsal etmək üçün hədəflənir. Digər iki sistemdən fərqli olaraq crRNA-da bir ucunda kəsilmiş tam boşluq yoxdur. [91]

CrRNA-lar Cas zülalları ilə birləşərək yad nuklein turşularını tanıyan ribonukleotid kompleksləri əmələ gətirir. CrRNA-lar kodlaşdıran və kodlaşdırmayan zəncirlər arasında heç bir üstünlük göstərmir ki, bu da RNT ilə idarə olunan DNT hədəfləmə sisteminin göstəricisidir. [5] [39] [99] [103] [137] [138] [139] I-E tipli kompleksə (adətən Kaskad deyilir) tək crRNA-ya bağlanmış beş Cas zülalı lazımdır. [140] [141]

Müdaxilə Redaktəsi

I tip sistemlərdə müdaxilə mərhələsində PAM ardıcıllığı crRNA-tamamlayıcı zəncirdə tanınır və crRNA-nın yumşaldılması ilə birlikdə tələb olunur. I tip sistemlərdə crRNA və protospacer arasında düzgün baza cütləşməsi Cascade-də DNT deqradasiyası üçün Cas3-ü işə götürən uyğunlaşma dəyişikliyinə siqnal verir.

II tip sistemlər müdaxilə addımı üçün tək çoxfunksiyalı zülal Cas9-a əsaslanır. [91] Cas9 həm crRNA, həm də tracrRNA-nın işləməsini tələb edir və ikili HNH və RuvC/RNaseH kimi endonükleaz domenlərindən istifadə edərək DNT-ni parçalayır. II tip sistemlərdə PAM ilə faj genomu arasında təməlləşmə tələb olunur. Bununla belə, PAM crRNA ilə eyni zəncirdə tanınır (I tip sistemlərin əksi).

Tip III sistemlər, I tip kimi, crRNA-lara bağlanan altı və ya yeddi Cas zülalını tələb edir. [142] [143] Təhlil edilən III tip sistemlər S. solfataricusP. furiosus hər ikisi də faj DNT genomundan daha çox fajların mRNA-nı hədəf alır [83] [143], bu sistemləri RNT əsaslı faj genomlarını bənzərsiz şəkildə hədəf ala bilər. [82] III tip sistemlərin, Cas10 kompleksində fərqli bir Cas proteini istifadə edərək RNT -dən başqa DNT -ni də hədəf aldığı təsbit edildi. [144] DNT parçalanmasının transkripsiyadan asılı olduğu göstərildi. [145]

Müdaxilə zamanı özünü xarici DNT -dən ayırmaq mexanizmi crRNA -ların içərisində qurulmuşdur və bu səbəbdən hər üç sistem üçün ümumi haldır. Hər bir əsas növün fərqli yetişmə prosesi boyunca bütün crRNA-lar bir boşluq ardıcıllığını və bir və ya hər iki ucunda təkrarın bir hissəsini ehtiva edir. Bu, CRISPR-Cas sisteminin xromosomu aralayıcı ardıcıllığın kənarında öz-özünə siqnal verdiyini və DNT parçalanmasını maneə törətməsini maneə törədən qismən təkrar ardıcıllığıdır. [146] RNA rəhbərliyindəki CRISPR fermentləri V tipli məhdudlaşdırıcı fermentlər kimi təsnif edilir.

CRISPR-Cas sisteminin adapter və effektor modullarında olan cas genlərinin iki fərqli ata modulundan əmələ gəldiyinə inanılır. Cas1-ə bənzər inteqraza və uyğunlaşma modulunun potensial digər komponentlərini kodlayan kaspozon adlı transpozona bənzər element, çox güman ki, müstəqil fitri immun sistemi kimi fəaliyyət göstərən əcdad effektor modulunun yanına daxil edilmişdir. [147] Adapter modulunun yüksək konservasiya olunmuş cas1 və cas2 genləri ata -baba modulundan, müxtəlif sinif 1 effektli cas genləri isə ata -baba efektor modulundan əmələ gəlmişdir. [148] The evolution of these various class 1 effector module cas genes was guided by various mechanisms, such as duplication events. [149] On the other hand, each type of class 2 effector module arose from subsequent independent insertions of mobile genetic elements. [150] These mobile genetic elements took the place of the multiple gene effector modules to create single gene effector modules that produce large proteins which perform all the necessary tasks of the effector module. [150] The spacer regions of CRISPR-Cas systems are taken directly from foreign mobile genetic elements and thus their long term evolution is hard to trace. [151] The non-random evolution of these spacer regions has been found to be highly dependent on the environment and the particular foreign mobile genetic elements it contains. [152]

CRISPR/Cas can immunize bacteria against certain phages and thus halt transmission. For this reason, Koonin described CRISPR/Cas as a Lamarckian inheritance mechanism. [153] However, this was disputed by a critic who noted, "We should remember [Lamarck] for the good he contributed to science, not for things that resemble his theory only superficially. Indeed, thinking of CRISPR and other phenomena as Lamarckian only obscures the simple and elegant way evolution really works". [154] But as more recent studies have been conducted, it has become apparent that the acquired spacer regions of CRISPR-Cas systems are indeed a form of Lamarckian evolution because they are genetic mutations that are acquired and then passed on. [155] On the other hand, the evolution of the Cas gene machinery that facilitates the system evolves through classic Darwinian evolution. [155]

Coevolution Edit

Analysis of CRISPR sequences revealed coevolution of host and viral genomes. [156] Cas9 proteins are highly enriched in pathogenic and commensal bacteria. CRISPR/Cas-mediated gene regulation may contribute to the regulation of endogenous bacterial genes, particularly during interaction with eukaryotic hosts. Misal üçün, Francisella novicida uses a unique, small, CRISPR/Cas-associated RNA (scaRNA) to repress an endogenous transcript encoding a bacterial lipoprotein that is critical for F. novicida to dampen host response and promote virulence. [157]

The basic model of CRISPR evolution is newly incorporated spacers driving phages to mutate their genomes to avoid the bacterial immune response, creating diversity in both the phage and host populations. To resist a phage infection, the sequence of the CRISPR spacer must correspond perfectly to the sequence of the target phage gene. Phages can continue to infect their hosts given point mutations in the spacer. [146] Similar stringency is required in PAM or the bacterial strain remains phage sensitive. [119] [146]

Rates Edit

A study of 124 S. termofil strains showed that 26% of all spacers were unique and that different CRISPR loci showed different rates of spacer acquisition. [118] Some CRISPR loci evolve more rapidly than others, which allowed the strains' phylogenetic relationships to be determined. A comparative genomic analysis showed that E. coliS. enterica evolve much more slowly than S. termofil. The latter's strains that diverged 250 thousand years ago still contained the same spacer complement. [158]

Metagenomic analysis of two acid-mine-drainage biofilms showed that one of the analyzed CRISPRs contained extensive deletions and spacer additions versus the other biofilm, suggesting a higher phage activity/prevalence in one community than the other. [78] In the oral cavity, a temporal study determined that 7–22% of spacers were shared over 17 months within an individual while less than 2% were shared across individuals. [127]

From the same environment a single strain was tracked using PCR primers specific to its CRISPR system. Broad-level results of spacer presence/absence showed significant diversity. However, this CRISPR added 3 spacers over 17 months, [127] suggesting that even in an environment with significant CRISPR diversity some loci evolve slowly.

CRISPRs were analysed from the metagenomes produced for the human microbiome project. [159] Although most were body-site specific, some within a body site are widely shared among individuals. One of these loci originated from streptococcal species and contained ≈15,000 spacers, 50% of which were unique. Similar to the targeted studies of the oral cavity, some showed little evolution over time. [159]

CRISPR evolution was studied in chemostats using S. termofil to directly examine spacer acquisition rates. In one week, S. termofil strains acquired up to three spacers when challenged with a single phage. [160] During the same interval the phage developed single nucleotide polymorphisms that became fixed in the population, suggesting that targeting had prevented phage replication absent these mutations. [160]

Başqa S. termofil experiment showed that phages can infect and replicate in hosts that have only one targeting spacer. Yet another showed that sensitive hosts can exist in environments with high phage titres. [161] The chemostat and observational studies suggest many nuances to CRISPR and phage (co)evolution.

CRISPRs are widely distributed among bacteria and archaea [87] and show some sequence similarities. [133] Their most notable characteristic is their repeating spacers and direct repeats. This characteristic makes CRISPRs easily identifiable in long sequences of DNA, since the number of repeats decreases the likelihood of a false positive match. [162]

Analysis of CRISPRs in metagenomic data is more challenging, as CRISPR loci do not typically assemble, due to their repetitive nature or through strain variation, which confuses assembly algorithms. Where many reference genomes are available, polymerase chain reaction (PCR) can be used to amplify CRISPR arrays and analyse spacer content. [118] [127] [163] [164] [165] [166] However, this approach yields information only for specifically targeted CRISPRs and for organisms with sufficient representation in public databases to design reliable polymerase chain reaction (PCR) primers. Degenerate repeat-specific primers can be used to amplify CRISPR spacers directly from environmental samples amplicons containing two or three spacers can be then computationally assembled to reconstruct long CRISPR arrays. [166]

The alternative is to extract and reconstruct CRISPR arrays from shotgun metagenomic data. This is computationally more difficult, particularly with second generation sequencing technologies (e.g. 454, Illumina), as the short read lengths prevent more than two or three repeat units appearing in a single read. CRISPR identification in raw reads has been achieved using purely de novo identification [167] or by using direct repeat sequences in partially assembled CRISPR arrays from contigs (overlapping DNA segments that together represent a consensus region of DNA) [159] and direct repeat sequences from published genomes [168] as a hook for identifying direct repeats in individual reads.

Another way for bacteria to defend against phage infection is by having chromosomal islands. A subtype of chromosomal islands called phage-inducible chromosomal island (PICI) is excised from a bacterial chromosome upon phage infection and can inhibit phage replication. [169] PICIs are induced, excised, replicated and finally packaged into small capsids by certain staphylococcal temperate phages. PICIs use several mechanisms to block phage reproduction. In first mechanism PICI-encoded Ppi differentially blocks phage maturation by binding or interacting specifically with phage TerS, hence blocks phage TerS/TerL complex formation responsible for phage DNA packaging. In second mechanism PICI CpmAB redirect the phage capsid morphogenetic protein to make 95% of SaPI-sized capsid and phage DNA can package only 1/3rd of their genome in these small capsid and hence become nonviable phage. [170] The third mechanism involves two proteins, PtiA and PtiB, that target the LtrC, which is responsible for the production of virion and lysis proteins. This interference mechanism is modulated by a modulatory protein, PtiM, binds to one of the interference-mediating proteins, PtiA, and hence achieving the required level of interference. [171]

One study showed that lytic ICP1 phage, which specifically targets Vibrio vəba serogroup O1, has acquired a CRISPR/Cas system that targets a V. vəba PICI-like element. The system has 2 CRISPR loci and 9 Cas genes. It seems to be homologous to the I-F system found in Yersinia pestis. Moreover, like the bacterial CRISPR/Cas system, ICP1 CRISPR/Cas can acquire new sequences, which allows phage and host to co-evolve. [172]

Certain archaeal viruses were shown to carry mini-CRISPR arrays containing one or two spacers. It has been shown that spacers within the virus-borne CRISPR arrays target other viruses and plasmids, suggesting that mini-CRISPR arrays represent a mechanism of heterotypic superinfection exclusion and participate in interviral conflicts. [166]

CRISPR gene editing Edit

CRISPR technology has been applied in the food and farming industries to engineer probiotic cultures and to immunize industrial cultures (for yogurt, for instance) against infections. It is also being used in crops to enhance yield, drought tolerance and nutritional value. [173]

By the end of 2014 some 1000 research papers had been published that mentioned CRISPR. [174] [175] The technology had been used to functionally inactivate genes in human cell lines and cells, to study Candida albicans, to modify yeasts used to make biofuels and to genetically modify crop strains. [175] Hsu and his colleagues state that the ability to manipulate the genetic sequences allows for reverse engineering that can positively affect biofuel production [176] CRISPR can also be used to change mosquitos so they cannot transmit diseases such as malaria. [177] CRISPR-based approaches utilizing Cas12a have recently been utilized in the successful modification of a broad number of plant species. [178]

In July 2019, CRISPR was used to experimentally treat a patient with a genetic disorder. The patient was a 34-year-old woman with sickle cell disease. [179]

In February 2020, progress was made on HIV treatments with 60-80% of the DNA removed in mice and some being completely free from the virus after edits involving both LASER ART, a new anti-retroviral therapy, and CRISPR. [180]

In March 2020, CRISPR-modified virus was injected into a patient's eye in an attempt to treat Leber congenital amaurosis. [181]

In the future, CRISPR gene editing could potentially be used to create new species or revive extinct species from closely related ones. [182]

CRISPR-based re-evaluations of claims for gene-disease relationships have led to the discovery of potentially important anomalies. [183]

CRISPR as diagnostic tool Edit

CRISPR associated nucleases have shown to be useful as a tool for molecular testing due to their ability to specifically target nucleic acid sequences in a high background of non-target sequences. In 2016, the Cas9 nuclease was used to deplete unwanted nucleotide sequences in next-generation sequencing libraries while requiring only 250 picograms of initial RNA input. [184] Beginning in 2017, CRISPR associated nucleases were also used for direct diagnostic testing of nucleic acids, down to single molecule sensitivity. [185] [186]

By coupling CRISPR-based diagnostics to additional enzymatic processes, the detection of molecules beyond nucleic acids is possible. One example of a coupled technology is SHERLOCK-based Profiling of IN vitro Transcription (SPRINT). SPRINT can be used to detect a variety of substances, such as metabolites in patient samples or contaminants in environmental samples, with high throughput or with portable point-of-care devices. [187] CRISPR/Cas platforms are also being explored for detection [188] [189] [190] [191] [192] and inactivation of SARS-CoV-2, the virus that causes COVID-19. [193]


Nəticələr

The CRISPR-Cas systems are extremely variable in their gene composition, and most of the cas genes evolve fast compared to other genes in prokaryotes. Accordingly, the comparative analyses of the Cas protein sequences and structures present a history of progressive detection of increasingly subtle relationship leading to unification of protein families previously thought to be unrelated ([2, 5, 19, 20]. and see Figure 4). The observations described here take this unification a step further. In particular, we substantially expanded the class of RAMPs and showed that at a high level the Cas proteins can be classified into no more than a dozen major groups of families including the Cas1-Cas10 proteins, another group of small subunits (Cas11?) and additionally a few regulatory protein families such as csm6. The majority of the families that have been left with historical "legacy" names in the recently published CRISPR-Cas classification scheme [20] now can be assigned to well-defined, "numbered" groups of cas genes (see Additional File 7). The results of this analysis emphasize that the CRISPR-Cas systems are built around RRM domains that reach extreme diversification in the RAMPs. This diversity along with recombination between different CRISPR-Cas loci makes more detailed classification and functional prediction for the CRISPR-Cas systems in the rapidly growing collection of archaeal and bacterial genomes a difficult challenge.

The unification of numerous Cas proteins into the three major groups of RAMPs and the more tentative demonstration of the probable origin of large subunits of diverse CRISPR-Cas systems from CRISPR polymerases together suggest a simple scenario for the origin and evolution of the CRISPR-Cas machinery in thermophilic archaea. Under this scenario, the CRISPR-Cas systems started from a large protein that combined the polymerase and HD hydrolase domain and might have functioned as a stand-alone antivirus defense system. The next step of evolution might have involved duplication of the RRM portion of the polymerase followed by inactivation that produced the ancestral, Cas7-like RAMP or a recruitment of a distinct RRM-domain protein that became the ancestral RAMP. Regardless of the origin of the ancestral RAMP genes, it has undergone a series of additional duplications and rapid diversification that yielded the stand-alone Cascade complex. The formation of the ancestral CRISPR-Cas system was then completed through the unification of Cascade with Cas1 and Cas2. The central theme of this scenario is the origin of the components of the CRISPR-Cas system from different classes of mobile elements. Other prokaryotic defense systems such as restriction-modification [56, 57] and toxin-antitoxin systems [58, 59] also comprise of such elements, indicating a major trend in the relationships between prokaryotes, viruses that infect them, other classes of selfish element and defense mechanisms.


CRISPR-Cas System Mechanism

The CRISPR-Cas system functions through three different steps: adaptation (or spacer acquisition), crRNA maturation, and interference (Figs. 2 and 3).

Uyğunlaşma

In the adaptation stage, Cas1 and Cas2 are the two main protein components which play roles in three main types (I, II, and III) of CRISPR-Cas systems. Both of these proteins are dimers that can form a complex together in order to undergo acquisition of foreign DNA [30]. Cas1 has both nuclease and integrase activity and can cut the viral genome and integrate a specific piece of the viral genetic element into the spacer DNA, whereas Cas2 is an endoribonuclease that mainly cuts RNAs [30, 75]. Since the subtype I-E of the CRISPR-Cas system of E. coli has been well-studied and characterized, it has become the best model for analysis of the adaptation mechanism of type I systems. In CRISPR-Cas type I and II systems, a short sequence named the protospacer-adjacent motif (PAM) exists in the foreign genome that leads Cas1 and Cas2 to recognize the protospacer flanked region. In subtype I-E of E. coli, in the presence of PAM, Cas1 and Cas2 recognize the adjacent sequence to the PAM. Cas1 and Cas2 dimers cut the PAM-adjacent sequence. After adjusting the size of the protospacer, the presence of the integrated host factor (IHF) protein is required for integrating the spacer into the host genome. By bending the host DNA near the insertion site, IHF guides Cas1 and Cas2 to the correct position of the CRISPR array for integrating the spacer [30, 75]. However, in the CRISPR-Cas system of Streptococcus pyogenes (subtype II-A), other Cas proteins including Cas9, Csn2 (whose function is related to Cas1 and Cas2 in DNA acquisition process [85], trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) and the leader-anchoring site (LAS) element in place of IHF are required for correct integration of the spacer sequence by Cas1 and Cas2 [75].

CrRNA Maturation

In the crRNA maturation step, transcription begins in the CRISPR array. The RNA transcribed by this process is termed pre-crRNA and contains complementary sequences of the repeats at the 3′ end and the spacers at the 5′ end. The maturation process of pre-crRNA occurs differently in various types of CRISPR-Cas systems [75]. In type I CRISPR-Cas systems, palindromic repeat sequences of pre-crRNA located at the 3′ end of the transcript, transform these parts of pre-crRNA into a hairpin-like structure. Following pre-crRNA transcription, Cas6 endoribonuclease attaches to the hairpin-like structure and cuts the 5′ end of the spacer sequence adjacent to that hairpin-like sequence. At the end of this process, there are several mature crRNAs that enable a Cas6 protein to remain bound to each one. An exception to this is seen with processes involving types I-A and I-B where the repeat sequences are not palindromic and Cas6 releases the crRNA [30]. This product is a ribonucleoprotein that identifies a specific phage genome [29].

In type II CRISPR-Cas systems, tracrRNA binds to the repeat sequence on the crRNA and transforms the 3′end of crRNA into a double-strand RNA. This double-strand RNA is called single guide RNA (sgRNA). In this type, RNase III and Cas9 catalyze the cleavage of pre-crRNA that yield to maturation crRNAs [12].

In type III systems, a dimer of Cas6 cleaves the 3′end of the repeat sequences adjacent to the spacers within the pre-crRNA. Once the cleavage process is complete the mature crRNA is then released.

crRNA maturation in type IV CRISPR systems is unknown at present. Cas12 and Cas13 carry out the cleavage of pre-crRNA and maturation of crRNA in types V and VI, respectively [75].

Müdaxilə

During the final step of interference, type-specific Cas proteins together with crRNA form a complex that recognizes and cuts the invader’s genome. In types I and II, the PAM plays an important role to increase the specificity of recognizing the invader’s genetic elements because not only can the crRNA identify the phage’s DNA sequence but the Cas enzyme can distinguish the PAM sequence [80].

In type I systems, interference occurs through a complex involving crRNA and Cas6, which acts as a scaffold for attaching other Cas proteins (including Cas5, Cas7, Cas8, and Cas11) to form CRISPR-associated complex for antiviral defense (Cascade). This in turn recognizes the invader’s genome. Moreover, recognition of the PAM sequence by Cas8e as the large subunit of Cascade increases the specificity of target recognition. After binding between crRNA of complex and target DNA the complex recruits Cas3 which functions as the nuclease that cleaves the non-target DNA strand to make an intermediated product. The ultimate cleavage of target DNA seems to occur by another nuclease provided either by the host cell or by utilizing the cascade-independent activity of Cas3 [7, 30].

In type II interference, a complex consisting of sgRNA and Cas9 recognizes the target DNA and cleaves it. This particular types has been utilized extensively for the purpose of gene editing in addition to diagnostics [16].

Type III interference is similar to that of type I systems where a complex of Cas proteins (involving Cas5, Cas7, Cas10, and Cas11) named Csm (subtype III-A) and Cmr (subtype III-B) accompanied by crRNA, recognizes the RNA that is transcribed from target DNA. After binding to this single-strand RNA, cleavage is carried out by subunits of Cas7. Alternatively, Cas10 can catalyze dsDNA cleavage and by transforming ATP into cyclic AMP as a second messenger, can activate the Csm6 protein which is an RNase. Csm6 then cleaves remaining RNAs in a nonspecific manner [30].

Type IV interference has not undergone characterization [30]. Interference in type V systems is divided into three subtypes: A, B, and C, in which the effector proteins in interference processes are Cas12a, Cas12b, and Cas12c, respectively. Similar to Cas9, Cas12b and Cas12c need the tracrRNA for their interfering activity while Cas12a does not. Cas12 proteins have a collateral nuclease activity which has been used in diagnostic applications such as the DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter (DETECTR) method. During the interference step, recognizing the target double-strand DNA (dsDNA) and PAM sequence is accomplished by crRNA and Cas12, respectively. After binding this complex to the target, Cas12 cuts the dsDNA and by its collateral nuclease activity also cuts surrounding single-strand DNAs nonspecifically. Both of these nuclease activities are catalyzed by the RuvC domain of Cas12a protein [46].

In type VI system interference, Cas13, which has higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide (HEPN)-binding domains [30], which has collateral nuclease activity like Cas12 acts as the effector protein. This system is utilized in specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking (SHERLOCK) technology. Cas13 does not require tracrRNA and PAM. The target of the Cas13-crRNA complex is single-strand RNAs (ssRNAs). In addition to crRNA guidance, the Cas13-crRNA complex requires a protospacer flanking site (PFS) for binding to the complementary ssRNA. PFS is an analogue of the PAM sequences on the RNA targets and is required for Cas13a activity in Leptotrichia shahii [30]. After binding, the complex cleaves the target and non-target ssRNAs [46, 75].


Strategies to Increase Specificity

Controlling Cas9/sgRNA abundance and duration

Typically Cas9 and sgRNA are expressed in cells by transient transfection of expressing plasmids. Titrating down the amount of plasmid DNA used in transfection increases specificity, although there is a trade-off for decreased efficiency at the on-target site. This is particularly an issue when the promoter is very strong, i.e. successfully transfected cells express a large amount of Cas9 and sgRNA leading to off-target effects. More recently, sgRNA has been expressed by RNA Pol II transcription and processed from introns, microRNAs, ribozymes, and RNA-triplex-helix structures, providing more flexible control of the sgRNA abundance [64,65].

Alternative delivery methods have also been developed to increase specificity. Compared to plasmid transfection based delivery, direct delivery of recombinant Cas9 protein and in vitro transcribed sgRNA, either individually or as purified complex, reduces off-targets in cells [66,67]. This is likely due to the rapid degradation of the protein and RNA in cells, which would lower the effective concentration of the Cas9-sgRNA effector complex and its duration in cells.

Paired nickase

The Cas9 “nickase” generated by mutating only one nuclease domain can only cleave one strand of the target DNA, which creates a nick thought to be repaired efficiently in cells. When the nickase is targeted to two neighboring regions on opposite strands, the offset double nicking leads to a double stranded break with tails that are degraded and subsequently indels in the target region. The requirement of dual Cas9 targeting to a nearby region dramatically increases the specificity, since it is generally unlikely that two guide RNAs will also have nearby off-targets. The limitation of this strategy is that nicks induced by Cas9 could still lead to mutations in off target sites via unknown mechanisms [13,29,60,63].

DCas9-FokI dimerization

FokI nuclease only cuts DNA when dimerized [68]. Fusion of dCas9 to FokI monomers creates an RNA-guided nuclease that only cuts the DNA when two guide RNAs bind nearby regions with defined spacing and orientation, thus substantially reducing off-target cleavage [69,70]. It has been reported that RNA-guided FokI nuclease is at least four fold more specific than paired Cas9 nickase [69], likely due to FokI nuclease only functioning when dimerized whereas Cas9 nickase can cleave as a monomer [70]. Similar to paired nickases, the requirement of two nearby PAM sites with defined spacing and orientation reduces the frequency of target sites in the genome.


Next Big Thing in Genome Modification: the CRISPR/Cas9 System

Ever since the discovery of the double-helix structure of DNA, scientists have sought ways to edit the genome. Altering gene expression partially and transiently via small interfering RNA has come a long way, and the progress has been spectacular. However, achieving complete and sustained modification of gene expression in a cell remains a tedious procedure that is often costly and time-consuming. For molecular biologists working with cell lines, quick and efficient knock out of one or more genes would provide a powerful tool for their studies. The CRISPR technology arrived two years ago to potentially fulfill that need.

CRISPR stands for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat and is based on bacterial and archaeal adaptive immune systems. I recently used CRISPR technology in one of my experiments. My goal was to achieve efficient gene silencing of my gene of interest. Several attempts using transient transfection of various siRNAs had failed initially. While I was trying to understand what was going wrong and design new strategies, I went to a conference about RNA Biology. After talking with different fellow investigators, I received a lot of suggestions about using CRISPR technology.

The recently developed CRISPR/Cas technology enables precision genome modification.

A New Way to Get A Knockout

CRISPR elements were originally observed in E.coli and later in other bacteria and archaea as repetitive DNA elements where viral or other foreign DNA integrated. Once a foreign DNA is identified by the host cell, it is cleaved and produces short sequences (

20 nucleotides) that integrate into CRISPRs. Those new sequences are then transcribed into RNAs, which complex with Cas nucleases and scan the genome of viruses or other foreign DNA to guide the nucleases on the cleavage site and protect the host cell from the foreign genome. This process provides a quick response and destruction of viral DNA, acting as a molecular vaccine.

CRISPR takes advantage of its simple principle to target specific genes in the genome of eukaryotic cells for efficient gene knockout. A Cas9/single guide (sg)RNA sequence can be easily delivered into cells. Since Cas genes do not exist in eukaryotic genomes, a Cas9 protein has to be ectopically expressed (expression of a gene in an abnormal place in an organism). Once a double-strand break is created by the nuclease, the Non-Homologous End Joining (NHEJ) machinery is recruited, causes insertions or deletions, and eventually changes the open reading frame of the gene. Taking it a step further, homology-directed repair can be used to insert any sequence that might be requested into the site of the break, thus allowing for inherent modifications in a simple and fast way. For further information, the CRISPR/Cas9 technology and its applications were recently reviewed.

Possibilities For Multiple Fields

The CRISPR technology is the next best thing in several fields. Whole-genome screening of cells by using lentiviral-based CRISPR libraries was recently published. Moreover, genome engineering in germ lines can lead to easier and more efficient generation of animal models (mice, rats, flies, nematodes, zebrafish), and it can allow knocking-out of multiple genes using different sgRNA, each targeting a different gene. Corrections of genetic mutations related to disease (e.g., the CFTR gene) also represent promising clinical applications of CRISPR. In addition, viral and pathogen gene disruption can be achieved to provide immunization and to render plants and animals resistant to pests and disease.

After the conference, I went back to lab with excitement and ready to learn about the new technology to make my experiment work. Eventually, with careful experimental design, I achieved the gene silencing I was looking for. It is a great feeling to reach your goal and see a working result after a few failed attempts. I really appreciated the breakthrough discovery of CRISPR/Cas9, and I am happy I had the opportunity to interact with other scientists to keep myself updated on the latest technologies.

To explore how researchers at the NIH IRP use the CRISPR technology, visit the “Research in Action” story and video featuring Dr. Rafael Casellas and read Dr. Karen Usdin’s blog entry on “Why Studying Bacteria Matters.”


CRISPR-Cas Systems - Biology

Streptokok is a diverse genus of Gram-positive bacteria commonly found in multiple locations of their human and animal hosts e.g. the oral cavity and the upper respiratory tract. Many streptococci are commensals thus play a role in colonization resistance of the host. Others, however, are pathogenic and are responsible for a range of invasive and noninvasive diseases with high morbidity and mortality worldwide. Streptococci undergo frequent and extensive horizontal gene transfer leading to the emergence of drug resistant strains. This, combined with the current lack of effective anti-streptococcal vaccines, has led to a huge amount of research into the genomics to systems biology of these important bacteria.

This timely review, edited by Yuqing Li and Xuedong Zhou, provides a comprehensive overview of the current knowledge of the most important hot-topics in streptococcal research. Topics covered include: CRISPR-Cas systems genetic regulation by small RNAs signal transduction by cyclic dinucleotide second messengers the VicRK and ComDE two-component systems mobile genetic elements regulation of cell division application of omics and bioinformatics tools intrageneric and intergeneric interactions by oral streptococci the hypervirulent M1T1 clone of GAS Streptococcus suis adhesion and invasion mechanisms molecular evolution of pathogenic streptococci novel antimicrobials vaccine development.

This volume is essential reading for everyone working with streptococci from the PhD student to the experienced scientist, in academia, the pharmaceutical or biotechnology industries and for those working in clinical environments.

(EAN: 9781912530229 9781912530236 Subjects: [bacteriology] [medical microbiology] [microbiology] [molecular microbiology] )


  • Renewable Energy, Sustainability and the Environment
  • Molekulyar biologiya
  • Struktur biologiya
  • Biomedical Engineering
  • APA
  • Standart
  • Harvard
  • Vankuver
  • Müəllif
  • BIBTEX
  • RIS

Systems Biology 2014 - Topical Conference at the 2014 AIChE Annual Meeting. AIChE, 2014. p. 3-12 (Systems Biology 2014 - Topical Conference at the 2014 AIChE Annual Meeting).

Research output : Chapter in Book/Report/Conference proceeding › Conference contribution

T1 - Homology-integrated CRISPR-cas (HI-CRISPR) system for one-step multigene disruption in saccharomyces cerevisiae

N2 - One-step multiple gene disruption in the model organism Saccharomyces cerevisiae is a highly useful tool for both basic and applied research, but it remains a challenge. Here, we report a rapid, efficient, and potentially scalable strategy based on the type II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-CRISPR associated proteins (Cas) system to generate multiple gene disruptions simultaneously in S. cerevisiae. A 100 bp dsDNA mutagenizing homologous recombination donor is inserted between two direct repeats for each target gene in a CRISPR array consisting of multiple donor and guide sequence pairs. An ultrahigh copy number plasmid carrying iCas9, a variant of wild-type Cas9, trans-encoded RNA (tracrRNA), and a homology-integrated crRNA cassette is designed to greatly increase the gene disruption efficiency. As proof of concept, three genes, CAN1, ADE2, and LYP1, were simultaneously disrupted in 4 days with an efficiency ranging from 27 to 87%. Another three genes involved in an artificial hydrocortisone biosynthetic pathway, ATF2, GCY1, and YPR1, were simultaneously disrupted in 6 days with 100% efficiency. This homology-integrated CRISPR (HI-CRISPR) strategy represents a powerful tool for creating yeast strains with multiple gene knockouts.

AB - One-step multiple gene disruption in the model organism Saccharomyces cerevisiae is a highly useful tool for both basic and applied research, but it remains a challenge. Here, we report a rapid, efficient, and potentially scalable strategy based on the type II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-CRISPR associated proteins (Cas) system to generate multiple gene disruptions simultaneously in S. cerevisiae. A 100 bp dsDNA mutagenizing homologous recombination donor is inserted between two direct repeats for each target gene in a CRISPR array consisting of multiple donor and guide sequence pairs. An ultrahigh copy number plasmid carrying iCas9, a variant of wild-type Cas9, trans-encoded RNA (tracrRNA), and a homology-integrated crRNA cassette is designed to greatly increase the gene disruption efficiency. As proof of concept, three genes, CAN1, ADE2, and LYP1, were simultaneously disrupted in 4 days with an efficiency ranging from 27 to 87%. Another three genes involved in an artificial hydrocortisone biosynthetic pathway, ATF2, GCY1, and YPR1, were simultaneously disrupted in 6 days with 100% efficiency. This homology-integrated CRISPR (HI-CRISPR) strategy represents a powerful tool for creating yeast strains with multiple gene knockouts.

KW - Multiple gene disruption

KW - Saccharomyces cerevisiae

M3 - Conference contribution

T3 - Systems Biology 2014 - Topical Conference at the 2014 AIChE Annual Meeting

BT - Systems Biology 2014 - Topical Conference at the 2014 AIChE Annual Meeting

T2 - Systems Biology 2014 - Topical Conference at the 2014 AIChE Annual Meeting