Məlumat

NMDA reseptorlarını ifadə edərkən HEK hüceyrələrini necə canlı saxlaya bilərəm?

NMDA reseptorlarını ifadə edərkən HEK hüceyrələrini necə canlı saxlaya bilərəm?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tək kanallı qeyd təcrübələri üçün HEK293 xətt hüceyrələrində funksional NMDA reseptorlarını ifadə etməyə çalışıram.

HEK hüceyrələri standart şəkildə saxlanılır (Thomas & Smart 2005) və ya lipofektamin və ya kalsium fosfat çöküntüsündən istifadə edərək NR1 və NR2x subunit cDNA-ları və həmçinin GFP ilə transfeksiya edilir. GFP ifadəsi müvəffəqiyyətli bir transfeksiyanı təklif edir, ancaq yaşıl floresans göstərən hüceyrələr eyni dərəcədə şişir və ölüdür və müvəffəqiyyətli bir yamaq əldə etmək az və ya çox qeyri -mümkündür. İnfeksiya edilməmiş hüceyrələr mükəmməl canlı olaraq qalır.

Zəhərliliyin Ca-nın nəticəsi ola biləcəyinə əsaslanaraq2+ açıq NMDAR-lar vasitəsilə axını, mən AP5, kinurenik turşusu və Mg daxil olmaqla, böyümə mühitinə blokerlər kokteyli daxil etməyə çalışdım.2+, lakin transfeksiya edilmiş hüceyrələr ölməyə davam edir.

Hüceyrələri canlı saxlamaq üçün mənə başqa bir şey təklif edə bilərmi? Yoxsa heç nəyə sığınmıram? Digər tədqiqatçılar bunu bacardılar (məsələn, Medina və digərləri 1995, Vicini və digərləri 1998) və əhəmiyyətli dərəcədə fərqli bir şey etmədikləri üçün bir az itki verdim.


Quruluşunuzun ifadə səviyyəsini aşağı salmağa çalışın. HEK hüceyrələri çoxlu miqdarda transfeksiya edilmiş əlavənizi ifadə etmək üçün məşhurdur. Bir CMV tanıtıcısı altında varmı? Ubiquitin promotoru və ya bənzəri və ya daha yaxşısı, doksisiklinlə induksiya olunan sistem (məsələn, klontech tet off) kimi daha yumşaq birini sınayın ki, doks konsentrasiyası/induksiya vaxtı vasitəsilə ifadə səviyyələrini idarə edə biləsiniz.


Mücərrəd

Kəskin işemik beyin zədəsi və xroniki neyrodejenerasiya zamanı eksitotoksikliyə və hüceyrə ölümünə səbəb olan əsas addım glutamat (Glu) reseptorlarının həddindən artıq və/və ya uzun müddət aktivləşməsi, sonra hüceyrədaxili kalsiumun (Ca 2+) həddindən artıq yüklənməsidir. Bu addımlar bir neçə təsirə səbəb olur: neyronların davamlı depolarizasiyası, enerji çatışmazlığı ilə nəticələnən mitokondrial disfunksiya, reaktiv oksigen növlərinin (ROS) istehsalının artması, sitozolik Ca 2+ [Ca 2+] konsentrasiyasının artması.i, mitoxondrial Ca 2+ qəbulunun artması və özünü məhv edən enzimatik mexanizmlərin aktivləşdirilməsi. NMDA reseptorları (NMDAR) üçün antaqonistlərin neyroprotektiv təsir göstərməsi gözlənilir, lakin bu fərziyyəni dəstəkləmək üçün heç bir dəlil hələ bildirilməyib. NMDAR antaqonistlərini istifadə edən bir sıra klinik sınaqlar, beyin zədəsini azaltmaqla və ya nörodejenerasiyanı qarşısını almaqla neyroprotektiv təsir göstərə bilməmişdir. NMDAR tədqiqatında son nailiyyətlər bu fenomen üçün bir izahat verdi. Sinaptik və ekstrasinaptik NMDARlar, əks təsir göstərən müxtəlif alt bölmələrdən (GluN2A və GluN2B) ibarətdir. Sinaptik GluN2A ehtiva edən və ekstrasinaptik GluN2B tərkibli NMDAR-lərin fərqli ko-agonistləri vardır: sinaptik NMDARlar üçün d-serin və ekstrasinaptik NMDARlar üçün glisin. Hər iki birgə agonist glial mənşəlidir.

NMDAR reseptorlarının aktivləşməsinə cavab olaraq hüceyrələrin məhv edilməsi və ya hüceyrələrin sağ qalma mexanizmləri qismən [Ca 2+]i və bu ionun giriş marşrutu və NMDAR -ların alt birliyinin tərkibinə və lokalizasiyasına görə. Sinaptik NMDAR aktivləşdirilməsi nöroproteksiyada iştirak edərkən, GluN2B alt bölmələrindən ibarət olan ekstrasinaptik NMDARların stimullaşdırılması hüceyrələrin məhv olma yollarını tetikler və Glu ilə əlaqəli eksitotoksikliklə əlaqəli nörodejenerasiyada əsas rol oynaya bilər. Bundan əlavə, sinaptik və ekstrasinaptik NMDA reseptorlarının neyronların taleyini təyin etməkdə əks təsir göstərdiyi aşkar edilmişdir. Bu nəticə qeyri-sinaptik GluN2B tərkibli NMDAR-ların narkotik tədqiqatları üçün perspektivli namizədlər kimi hədəflənməsinə səbəb olmuşdur. Hipoksik şəraitdə, ehtimal ki, sinaptik glutamaterjik ötürülmənin uğursuzluğu, GluN2A ilə aktivləşdirilmiş nöroprotektiv kaskadın pozulması və ekstrasinaptik GluN2B tərkibli NMDARların həddindən artıq aktivləşməsi eksitotoksisitəyə səbəb ola bilər. Klinik praktikada antidepresan olaraq geniş istifadə olunan fluoksetinin, GluNR2B tərkibli NMDAR-ları seçici şəkildə blokladığı aşkar edilmişdir. Buna görə də, nöroproteksiya üçün potensial namizəd kimi görünür.

Vurğulananlar

► Eksitotoksiklikdə ekstrasinaptik GluN2B subunit tərkibli NMDA reseptorlarının rolu. ► Sinaptik GluN2A subunit tərkibli NMDA reseptorlarının neyroproteksiyada rolu. ► Fluoksetinin təsiri. ► Müxtəlif glutamat reseptor antaqonistləri ilə klinik tədqiqatlar. ► Seçici GluN2B alt birliyi olan NMDA reseptor antaqonistləri.


Giriş seçimləri

1 il ərzində jurnala tam giriş əldə edin

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.
ƏDV daha sonra ödəniş zamanı əlavə olunacaq.
Vergi hesablanması ödəniş zamanı yekunlaşacaq.

ReadCube -də vaxt məhdud və ya tam məqalə əldə edin.

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.


Giriş

İnsan embrion böyrəyi 293 (HEK-293) və Çin hamster yumurtalığı (CHO) hüceyrələri kimi məməli hüceyrələr onların struktur, biofiziki və farmakoloji xüsusiyyətlərini öyrənmək üçün rekombinant zülalları ifadə etmək üçün ev sahibi kimi geniş istifadə olunur (Baldi et al., 2007 Dalton). və Barton, 2014). Xüsusilə HEK-293 hüceyrələri, membran zülallarını ifadə etmək üçün cəlbedici bir heterolog sistemdir, çünki hədəf zülalların düzgün qatlanması və/və ya optimal bioloji aktivliyi üçün lazım olan post-translational modifikasiya maşınlarına malikdir. Digər məməlilər hüceyrələrinə, məsələn, CHO hüceyrələrinə (Bollin et al. , 2011). Bu xüsusiyyətlər, hüceyrə ölçüsü, morfologiyası, sürətli bölünmə dərəcəsi, saxlanmanın asanlığı və yerli kanalların aşağı ifadəsi ilə yanaşı transgen reseptor zülallarını və ion kanallarını yüksək sədaqətlə ifadə etmək qabiliyyəti ilə birlikdədir (Thomas və Smart, 2005), HEK-293 hüceyrələrini struktur tədqiqatlar üçün membran zülallarının keçici heteroloji ifadəsi üçün bir seçim kimi qurmuşlar (Nettleship et al., 2008 Chaudhary et al., 2011 Andrell and Tate, 2013), biofarmasevtik (Thomas and Smart, 2005 Jager et al. al., 2013) və elektrofizyoloji tətbiqləri (Lemtiri-Chlieh və Ali, 2013).

Bu üstünlüklərə baxmayaraq, cərəyan gərginliyi ölçmələri üçün fərqli bir növdən qaynaqlanan ion kanalları və trans-membran reseptorları kimi kompleks membran zülallarının yüksək səviyyəli ifadəsi problem olaraq qalmışdır (Gan və digərləri, 2006 Allen və digərləri, 2009). Xüsusilə elektrofiziologiya üçün zülalların yüksək ifadəsi bütün hüceyrə rejimində tək hüceyrəli cari qeydlər üçün vacibdir. Ev sahibindəki membran zülal biosintezi, insan və digər növlər arasındakı fərqli lipid təbəqələrinin tərkibi ilə məhdudlaşır ki, bu da ifadə olunan zülalların öz funksional doğma üçölçülü uyğunlaşmalarına düzgün şəkildə qatlanmasının qarşısını ala bilər. Beləliklə, membran zülallarının ifadəsini artırmaq üçün plazmidlərin, mədəniyyət mühitinin, böyümə şəraitinin və ya onların birləşmələrinin optimallaşdırılması keçmişdə həyata keçirilmişdir (nəzərdən keçmək üçün bax: Jäger et al., 2015). Bunlara yüngül hipotermiyanın tətbiqi (Wulhfard et al., 2008 Lin et al., 2015) və histon deasetilaz inhibitorlarının mədəniyyət mühitinə əlavə edilməsi (Fan və digərləri, 2005 Backliwal və digərləri, 2008b) daxildir. Rekombinant zülalın ifadəsi üçün lazım olan əsas elementlərə əlavə olaraq, vektorlar da optimallaşdırılmış intronlar və kodon istifadəsini (Gustafsson və digərləri, 2004) və transkripsiya sonrası tənzimləyici elementləri (Mariati və digərləri, 2010) daxil etmək üçün sintetik olaraq tərtib edilə bilər. rekombinant transkriptləri sabitləşdirməklə məhsuldarlığı artırmaq.

Rekombinant vektorun ana hüceyrəyə çatdırılması və ifadə olunan zülalların aşkarlanması, HEK-293 hüceyrələrində rekombinant zülalların ifadəsi və öyrənilməsi üçün vacib olan iki kritik mərhələdir. Müvəqqəti olaraq köçürülən hüceyrələrdə ifadə olunan rekombinant zülallar, maraq genini ehtiva edən ikinci bir ifadə vektoruna əlavə olaraq, lenfosit səthi marker antijeni (CD8-alfa) və ya floresan protein plazmidinin eyni vaxtda birgə köçürülməsini tələb edən bir üsulla müəyyən edilə bilər. Lemtiri-Chlieh və Əli, 2013). Bu üsul, işıq mikroskopu və ya flüoresan zülalları birgə ifadə edən hüceyrələrin flüoresan aşkarlanması altında anti-CD8 antikoru ilə örtülmüş polistirol muncuqlarla bəzədilmiş fərdi hüceyrələrin vizual identifikasiyasına imkan verir (Bestvater et al. , 2002 Lin et al., 2015) və məməli N-metil-D-aspartat (NMDA Ehlers et al., 1996) və α-amino-3- daxil olmaqla, ion kanallarının və reseptor zülallarının öyrənilməsi üçün istifadə edilmişdir. hidroksi-5-metil-4-izoksazolpropion turşusu (AMPA) reseptorları (Swanson və digərləri, 1997 Lin və digərləri, 2015), Arabidopsis thaliana siklik nukleotid qapılı ion kanalları (AtCNGCs) (Leng et al., 2002 Hua et al., 2003) və Arabidopsis K + daşıyıcıları (AKTs) (Lacombe və digərləri, 2000 Cherel və digərləri, 2002). Sadə, sürətli və ucuz olsa da, transfeksiya edilmiş hüceyrələrdə CD8-alfa marker antigeninin və ya flüoresan zülalın ifadəsi həm bu markerin, həm də hədəfin tətbiqinin müvəffəqiyyət dərəcəsi kimi rekombinant zülalın transfeksiya effektivliyi və ifadəsi ilə birbaşa əlaqəsi yoxdur. hüceyrələrə gen ifadə vektorları çox dəyişkən ola bilər. Boyaya həssas epitop (Tour et al., 2003 Rudner et al., 2005) və ya flüoresan zülal birləşməsi (Snapp, 2005) kimi flüoresan etiketlərdən istifadə edən son üsullar flüoresan siqnal və transfeksiya səmərəliliyi və zülal arasında birbaşa və daha yaxşı korrelyasiya təmin edir. ifadə səviyyəsi, flüoresan zülallar kimi qaynaşma etiketləri, protein funksiyasına mane olan struktur məhdudiyyətlərinə səbəb ola bilər. Bu flüoresan aşkarlama yanaşmaları, connexin-43 (Gaietta və s., 2002), AMPA reseptorları (Ju və digərləri, 2004), G zülalına bağlı reseptorlar (Hoffmann et al. ., 2005) və sonradan protein lokalizasiyası və alveri, eləcə də cərəyan gərginliyi üçün istifadə olunan insan eter-a-go-go ilə əlaqəli gen (hERG) kanalı (Claassen et al., 2008 Huang et al., 2011). ölçmə işləri.

HEK-293 hüceyrələrində bir neçə membran zülalının və ion kanalının ifadəsi əvvəllər bildirilsə də, tək hüceyrəli tətbiqlər üçün optimallaşdırılmış rekombinant zülalların keçici transfeksiya və hüceyrədaxili aşkarlanmasının əsas mərhələlərini təsvir edən ətraflı səlahiyyətli protokol hazırda çatışmayan. Burada a-nın keçici ifadəsindən istifadə edirik A. thaliana mühafizə hücrəsi, HEK-293 hüceyrələrindəki K + kanalını xaricə düzəldən AtGORK (At5G37500) hal-hazırda istifadə olunan transfeksiya reaktivlərini və floresan aşkarlama metodlarını qiymətləndirmək və ümumi ifadəsi üçün asanlıqla əldə edilə bilən xüsusi bir protokol təmin etmək. bioloji xarakteristikaya uyğun HEK-293 hüceyrələrində membran zülalları. Nümunə olaraq, AtGORK aşağıdakıları təmsil edir: (1) çox keçidli membran zülalını ifadə etmək çətin, (2) fərqli növdən yaranır və (3) funksionallıq əldə etmək üçün heteromerik kompleksə yığılmalıdır. Bu üç xüsusiyyət HEK hüceyrələrində membran zülallarının optimal ifadəsini maneə törədə bilər. Bu səlahiyyətli addım-addım protokola əlavə olaraq, ehtiyat tədbirləri də daxil edirik və fərqli tətbiqlər və ya zülallar üçün genişləndirilə bilən və dəyişdirilə bilən optimallaşdırma strategiyaları və tövsiyələr təklif edirik.


Nəticələr

NPA-nın N2A tərkibli reseptorlara inhibitor təsiri.

GluN1-1a və GluN2A alt hissələrini müvəqqəti olaraq bütün hüceyrəli yamaq bağlama üsulu ilə ifadə edən HEK293 hüceyrələrindən gələn cərəyanları qeyd etdik. Hüceyrədənkənar məhlullar maksimum effektiv agonist konsentrasiyaları (hər biri 1 mM glutamat və 0,1 mM glisin) ehtiva edir.50) 0,01 mM-də EDTA və aşağı proton konsentrasiyası (pH 8, 10 mM HEPBS) idi. İnhibisyon, NPA (0 � mM) əlavə edildikdən sonra glutamat tərəfindən yaranan sabit vəziyyət cərəyanının azalması kimi ölçülmüşdür. NPA -nın məhdud həllolma qabiliyyəti daha yüksək konsentrasiyaları araşdırmamıza mane oldu. Verilənlərin Hill tənliyi ilə uyğunlaşdırılması 1.9 mM NPA ilə yarı-maksimal inhibəni yaradan �% maksimal inhibisyonu proqnozlaşdırdı (Şəkil 1). Bu IC50 dəyəri əvvəllər ölçüləndən daha böyükdür Ksenop oositlər (Costa et al., 2010), burada 0,1 mM NPA 30% inhibə yaradır. Biz bu uyğunsuzluğu eksperimental şəraitdəki fərqlərlə əlaqələndiririk, çünki bu əvvəlki ölçmələr pH = 7.4-də aparılmışdır, burada 2A reseptorları tonik olaraq �% inhibə olunur (Traynelis və Cull-Candy, 1990) və xelatatorlar olmadıqda, sink və maqnezium ionları 2A cərəyanlarını daha da maneə törədir (Nowak et al., 1984 Paoletti et al., 1997).

Qlutamatın yaratdığı N1/N2A reseptor cərəyanlarının NPA inhibisyonu. (Solda) N1/N2A reseptorlarını ifadə edən insan embrion böyrəyindən 293 hüceyrədən tam hüceyrə cavabları qeydə alınıb. Barlar glutamat (1 mM) tətbiqlərini (ağ) və NPA birləşmələrini (boz) göstərir. (Sağda) Hər bir NPA konsentrasiyasından sonra ölçülən tarazlıq reaksiyalarının səviyyələri yalnız glutamat tətbiq edildikdə verilən reaksiyalara normallaşdırılır. Dairələr hüceyrələr arasında normallaşdırılmış dəyərlərin vasitələrini təmsil edir. Xətt, logistika funksiyasının hər bir konsentrasiya üçün normallaşdırılmış cavab vasitələrinə uyğunluğunu əks etdirir: 0.4 mM (n = 4), 1 mM (n = 4), 2 mM (n = 4), 4 mM (n = 5), 10 mM (n = 4). İ C50 95% etibar intervalı olaraq ifadə edilir.

NPA ilə əlaqəli N2A tərkibli reseptorların bir kanallı kinetikası.

NPA inhibə mexanizmini araşdırmaq üçün biz 4 mM NPA ("qat IC") olan hüceyrədənkənar (pipet) məhlulu ilə N1/N2A reseptorlarını ifadə edən HEK293 hüceyrələrinin bir kanallı hüceyrəyə bağlı yamaqlarından cərəyanları qeyd etdik.50). Bütün hüceyrə qeydlərimizə bənzər olaraq, hüceyrədənkənar məhlulda iz ikivalentli kationları çıxarmaq üçün glutamat (1 mM), glisin (0.1 mM) və EDTA (1 mM) də var. Biz proton konsentrasiyalarını 10 nM (pH 8) ilə 10 mM HEPBS ilə bağladıq (Şəkil 2A). Nəzarət olaraq, eyni şərtlərdə və NPA (CTR) olmaması halında əldə edilən bir sıra qeydlərdən istifadə etdik (Şəkil 2B). Hər iki məlumat dəstinə yalnız bir aktiv kanaldan qaynaqlanan qeydlər daxil idi və biz bütün qeydləri əvvəllər ətraflı təsvir edildiyi kimi emal və təhlil etdik (Kussius et al., 2009).

NPA-nın N1/N2A reseptorlarının tək kanallı fəaliyyətinə təsiri. İzlər, qeyd pipetində aktiv bir N1/N2A kanalı olan (A) NPA (4 mM) olan və (B) NPA (CTR) olmayan hüceyrəyə bağlı yamaqlardan qeydə alınmış sabit vəziyyətdə daxili natrium axınlarını təmsil edir. Hər bir şərt üçün 20 saniyəlik seqment yuxarı və orta panellərdə iki vaxt ayırdında təsvir olunur, müvafiq olaraq alt panellər altı çizili seqmenti genişləndirir və təhlillərdə olduğu kimi 12 kHz-də süzülmüş şəkildə göstərilir. Bütün izlər Na + cərəyanlarını sıfır cərəyanlı bir başlanğıc P-dən aşağıya doğru əyilmə kimi göstəriro bütün ana qeyd üçün hesablanmış açıq ehtimalı göstərir.

4 mM NPA-nın orta tarazlığın açıq ehtimalını azaltdığını aşkar etdik (Po) 2A reseptorlarının CTR-nin 38%-nə qədər, tək kanallı amplituda heç bir dəyişiklik olmadan (Cədvəl 1). Beləliklə, seçilmiş NPA konsentrasiyası kanal keçidinə əhəmiyyətli təsir göstərmək üçün kifayət idi və tək kanal keçiriciliyinə heç bir təsir göstərmədi. Bundan əlavə, biz P-nin azalması ilə əlaqələndirə bildiko orta qapalı vaxtda �% artım və orta açıq vaxtda �% azalma. Sonra, bu kinetik təsirlərin ortaya çıxma mexanizmini daha ətraflı araşdırdıq.

Cədvəl 1

NPA -nın fərdi 2A reseptorlarının orta kinetik xüsusiyyətlərinə təsiri

AmplitudaPoMCTMOTnMüddətHadisələr × 10 6
pA XanımXanım dəq
CTR10.9 və#x000b1 0.80,53 ± 0,044.7 və#x000b1 0.65.4 və#x000b1 0.751722.0
NPA10 ± 0.90,2 ± 0,3 * 9.8 ± 0.8 * 2,5 ± 0,4 * 61171.0
%Dəyişiklik +109

NPA-ya bağlı reseptorların daha tez-tez uzun-bağlanması və qısa açılışları var idi.

2A tipli NMDA reseptorlarının keçid mexanizmi kinetik cəhətdən yaxşı xarakterizə edilmişdir. Bu işdə istifadə olunan şərtlərdə, sabit vəziyyət qapısı reaksiyası beş qapalı və iki açıq vəziyyət arasındakı keçidlərdən və ara-sıra qapı rejimi dəyişmələrindən ibarətdir. NPA-nın ortalama bağlanma müddətini necə artırdığını və MOT-un azaldığını müəyyən etmək üçün tək kanallı qeydlərimizdə mövcud olan qapalı və açıq hadisələrin paylanmasını araşdırdıq.

Jurnal ehtimalı meyarına əsasən, NPA ilə əldə etdiyimiz bütün bir kanallı qeydlər (n = 6) beş qapalı komponentlə (E1 – E.5), əvvəllər 2A reseptorları üçün bildirdiyimiz kimi (Kussius et al., 2009). Bu nəticə, NPA bağlamasının əlavə qapalı uyğunluqlar yaratmadığını göstərir. Bunun əvəzinə, xüsusi qapalı komponent sahələrini dəyişdirdi: E3 və E.5 𢏂 qat artdı və E4 qısa E-də 2 dəfə azalma hesabına 𢏅 dəfə artdı1 komponent sahəsi. Bundan əlavə, E müddəti3 1,6 dəfə artıb (şək. 3, A və B). Ümumiyyətlə, qısa qapalı komponentlər E1𠄾3 partlayışlar daxilində qısa qapalı hadisələri əhatə edir və aktivləşmə yolu boyunca baş verir. Buna görə də, bu nəticələr NPA-nın reseptorların aktivləşdirilməsinə təsir göstərə biləcəyini göstərir. Xüsusilə, NPA ən uzun qapalı komponentin (E5), ən uzun desensitizasiya edilmiş hadisələri əhatə edir (Şəkil 3, A və B), lakin sahəsini artırdı və desensitizasiya edilmiş hadisələrin bolluğuna �% daha qısa partlayışlar (0.9 saniyə ilə 0.4 saniyə) yoldaşlıq etdi. Qeyd edək ki, E.-də müşahidə olunan artım5 sahə mütləq NPA -nın təsirsiz hala düşmüş vəziyyət (lər) ini ifadə etmir. Desensitizasiya, daha sonra müzakirə ediləcəyi kimi, bitişik dövlətlərin işğalının artması halında daha tez baş verəcəkdir (Şəkil 4A).

NPA xüsusi qapalı komponentlərin sahələrini artırdı. (A) N1/N2A reseptorlarından (CTR, 416,413 hadisələr) və NPA (4 mM, 1,347,473 hadisələr) varlığında əldə edilən iki qeyddə müşahidə olunan qapalı fasilələr. Ehtimal sıxlığı funksiyaları (boz xətlər) kinetik 5C4O vəziyyət modellərini (bax. Şəkil 4) göstərilən məlumatlara uyğunlaşdırmaqla hesablanmışdır.τ, milisaniyə (ms)] və sahələr (a, %) daxil olaraq verilir. (B) İki şəraitdə qapalı vaxt sabitlərinin və sahələrin xülasəsi (CTR, n = 5 NPA, n = 6). CTR üçün orta dəyərlər hər bir komponentin altında verilir (ms). *P < 0.05 (Tələbə’s t test).

Qapalı hadisələr üçün yuxarıda təsvir edilən spesifik və möhkəm təsirlərdən fərqli olaraq, NPA bağlanması dörd açıq komponentdən hər hansı birinin müddətinə əhəmiyyətli təsir göstərməmişdir. Ən qısa açıq komponentin tezliyinin 3 qat artmasına səbəb olaraq MOT-un ümumi azalmasına səbəb oldu (Şəkil 3, C və D).Aktivləşdirmə zamanı NMDA reseptorları iki növ açıq vəziyyətə baş çəkir: əvvəlcə qısa 𢏀,2 millisaniyəlik vəziyyət, sonra müddəti açılış rejimini təyin edən daha uzun bir vəziyyət: aşağı üçün 2 millisaniyə, orta üçün 6 millisaniyə və 11 millisaniyə üçün müvafiq olaraq yüksək rejimlər (Popescu və Auerbach, 2003). NPA ilə aşağı, orta və ya yüksək açıq vəziyyətlərin nə müddəti, nə də nisbi sahələri dəyişmədiyi üçün (Şəkil 3D) NPA bağlanmasının reseptorun modal keçidlərinə təsir etmədiyi qənaətinə gəlirik. Əksinə, ümumi daha qısa orta açıq müddətlər rejimdən asılı olmayaraq iki açıq vəziyyətdən daha qısa müddətdə daha tez-tez qalma meylini əks etdirir.

NPA -nın kanal keçiriciliyini dəyişdirmədiyi müşahidəsi ilə birlikdə, bu nəticələr, NPA -nın məsaməni bağlayaraq və ya duyarsızlaşdırılmış hadisələri uzadaraq NMDA reseptor cərəyanlarını azaltma ehtimalını istisna edir və NPA -nı əsasən NMDA reseptorlarının aktivləşməsinə təsir edən allosterik modulyator kimi güclü şəkildə təklif edir.

2A Reseptorlarında NPA Fəaliyyətlərinin Kinetik Modelləri.

Yuxarıda təsvir edilən kinetik dəyişiklikləri şərh etmək üçün, hər bir kanal qeydində aşkar edilən hadisələrin ardıcıllığına uyğun olaraq qurulmuş 5C2O kinetik sxemindən istifadə etdik və hər bir məlumat dəsti daxilində optimallaşdırılmış nisbət sabitlərini ortalamışıq. Bu model, NMDA reseptor qapısı zamanı meydana gələn kompleks yenidən qurulmaların sadələşdirilməsi olsa da, əvvəllər onun mikroskopik və makroskopik davranışlarının əsas xüsusiyyətlərini dəqiq şəkildə təkrarladığı göstərilmişdir (Popescu və digərləri, 2004 Zhang və digərləri, 2008 Kussius et al. , 2009). Uyğun nəticələr NPA-nın modelə daxil olan 12 dərəcə sabitindən yalnız üçünü əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdiyini göstərdi: kC1-C2, kO1-C1, və kC1-O1. Bu üç nisbət sabitindən, kC1-C2kO1-C1 müvafiq olaraq 1,4 və 2 dəfə artdı, kC1-O1 2 dəfə azaldı (Şəkil 4A). Beləliklə, bu mexanizm cərəyanın azalmasını C dövlətlərinin işğalının artması ilə izah edir3 və C2, aktivləşdirmə yolu boyunca yerləşən (şək. 4B). Daha sonra, NPA-nın olmaması və varlığında NMDA reseptorlarının yaşadığı nisbi sərbəst enerji dalğalanmalarını müqayisə etmək üçün CTR və NPA şərtləri üçün çıxarılan reaksiya mexanizmlərindən istifadə etdik. İki profili özbaşına olaraq uzun açıq vəziyyətin sərbəst enerji səviyyəsinə uyğunlaşdırdıq2, hər iki şəraitdə açılışların eyni müddətə malik olması müşahidəsinə əsaslanır. Bu təqdimata görə, NPA mövcud olduqda, subsaturating konsentrasiyalarda olsa da, reseptorların aktivləşdirilməsi üçün sərbəst enerji maneəsi daha sabit, əvvəlcədən açıq vəziyyətlərə görə daha yüksəkdir (Şəkil 4C). Başqa sözlə, NPA mövcud olduqda reseptorların açılması üçün daha çox enerji tələb olunur və onlar əvvəlcədən açıq vəziyyətdə daha uzun müddət yaşadıqları üçün desensitizasiya üçün daha çox şansa malikdirlər.

Yuxarıdakı təsvir NPA-nın subsaturasiya konsentrasiyalarının mövcudluğunda reseptor davranışının orta mənzərəsini təqdim edir və NPA-sız və NPA-ya bağlı reseptorların dinamik qarışığını əks etdirir. NPA ilə əlaqəli reseptorların keçidini daha dəqiq təsvir etmək üçün 5C2O modelini hər biri NPA olmayan (yuxarıda) və NPA ilə əlaqəli (aşağıda) vəziyyətlər üçün iki pillədən ibarət olaraq genişləndirdik. İlk təxmin olaraq, biz pillələri yalnız bir NPA assosiasiya/dissosiasiya addımı ilə birləşdirdik, bu addımı növbə ilə aktivləşdirmə yolu boyunca oxşar vəziyyətlərin hər biri arasında yerləşdirdik. Əsasən, modelləşdirmə əvvəllər təsvir edildiyi kimi aparıldı (Amico-Ruvio et al., 2012). NPA olmayan qol boyunca, bütün nisbət sabitlərini CTR məlumat dəsti üçün əldə edilən dəyərlərə təyin etdik, NPA ilə əlaqəli qol boyunca yalnız olan sabit sabitləri təyin etdik. yox NPA məlumatlarında əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdi, CTR qolu ilə eyni dəyərlərə (Şəkil 4A). Bağlama addımının yerləşdiyi yerə görə fərqlənən beş pilləli modellərin hər birini ayrıca quraşdırdıq (C3, C2, C1, O1, və O2), NPA məlumat dəstindəki fərdi tək kanallı qeydlərə. Bu modellərlə təxmin edilən NPA dissosiasiya dərəcəsi sabitlərinin iki kateqoriyaya düşdüyünü müşahidə etdik: səviyyələr C vasitəsilə birləşdirildikdə onlar yavaş idi.3 C -yə2və səviyyələr C bağlandıqda 𢏅 qat daha sürətli idi1 vasitəsilə O2. Fərqli əyalətlərdə tək bağlantısı olan modellər LL meyarı (O1>O2Ϭ1Ϭ2Ϭ3). O1 bağlı model, ən yüksək LL-ni (Şəkil 5A) qaytardı, bu, əlaqənin O-da olduğu ikinci dərəcəli modeldən 41 ədəd daha böyükdür.2. Bu nəticələr NPA bağlamasının dövlətdən asılı ola biləcəyini, bağlanma və ayrılmanın açıq dövlətlərdən üstünlük təşkil etdiyini göstərir. Bu model NPA-nın qapalı vəziyyətlərə bağlanmasına imkan vermədiyi üçün, dərman qlutamatla stimulyasiya zamanı deyil, dərhal əvvəl tətbiq olunarsa, reseptorun NPA-ya həssas olmamasını proqnozlaşdırır.

NPA bağlama kinetikası. (A) NPA-sız (yuxarı) və NPA ilə əlaqəli reseptorları (aşağı) təmsil etmək üçün səviyyəli model istifadə edilmişdir. Silahlar arasında keçid yalnız O arasında icazə verildi1 dövlətlər. Bu model 4 mM NPA (n = 6) və ən yüksək log ehtimalını verdi. Sürət sabitləri (tünd rəng) Şəkil 4-də göstərildiyi kimi əldə edilmiş CTR dəyərlərinə sabitlənmişdir, qırmızı rəngdə olan sürət sabitlərinin dəyişməsinə icazə verilmişdir. Birlik dərəcəsi sabit (küzərində) və tarazlıq dissosiasiyası sabitidir (KD) göstərilir. Simulyasiya üçün istifadə olunan glutamat bağlama addımları göstərilmişdir (boz). (B) 1 mM Glu (qara xətt) uzun (5 saniyə) nəbzinə makroskopik cavablar simulyasiya edilmiş və 4 mM NPA əvvəlcədən tətbiqi olmadıqda (qara) və ya mövcudluğunda (qırmızı) bütün hüceyrə cərəyanları ilə müqayisə edilmişdir. 5 saniyə).

Bu proqnozu yoxlamaq üçün, biz glutamat tətbiqindən əvvəl NPA tərkibli məhlul (4 mM) ilə perfuziya edilmiş hüceyrələrdən qlutamat reaksiyalarını ölçdük, lakin glutamata məruz qalma zamanı yox. Nəticələr göstərdi ki, NPA yalnız glutamatdan əvvəl tətbiq edildikdə belə NMDA reseptorlarının bütün hüceyrə cərəyanlarını azaldır (Şəkil. 5B, bütün hüceyrə), beləliklə bunu şiddətlə göstərir: 1) NPA istirahət edən, glutamatsız NMDA reseptorlarına bağlana bilər və 2) NPA Bağlı olaraq qalır və artıq NPA yuyulduqdan sonra da glutamatdan qaynaqlanan reseptor aktivləşməsini çətinləşdirə bilər. Eynilə, Şəkil 1-də təqdim olunan nəticələrimiz, NPA-nın reseptorları aktiv şəkildə bağlaya biləcəyini göstərir, çünki NPA tətbiqi qlutamat konsentrasiyalarının doyması nəticəsində yaranan sabit vəziyyət cərəyanlarını maneə törədir.

Bütün bu məlumatları hərtərəfli bir model halına gətirmək üçün, NPA -nın bağlama zamanı hər hansı bir anda reseptorlardan bağlana biləcəyi və ayrışa biləcəyi bir mexanizm irəli sürdük, lakin bağlanma və ayrılma kinetiği hər bir dövlət üçün fərqli olacaq. Yuxarıda təqdim olunan nəticələrə əsasən, statistik fitinqlər zamanı hesablanmış sərbəst parametrlərin sayını məhdudlaşdırmağı qarşıya məqsəd qoymuşuq ki, daha sonra təklif edirik: 1) reseptor uyğunluqları yalnız iki NPA yaxınlıq sinfinə təyin edilə bilər: aşağı və ya yüksək 2) NPA yaxınlığında dəyişiklik baş verir. C ilə eyni vaxtda2𠄼1 keçid və 3) ilk növbədə dissosiasiya nisbətinin 𢏅 qat dəyişməsi ilə bağlıdır. Bu fərziyyələrlə və əvvəlki model üçün təsvir olunduğu kimi NPA-invariant dərəcələrini CTR dəyərlərinə təyin etdikdən sonra biz bu genişləndirilmiş modeli ayrı-ayrılıqda NPA ilə əldə edilmiş tək kanallı qeydlərə uyğunlaşdırdıq. Nəticədə sürət sabitləri Şəkil 6A-da verilmişdir.

NPA tərəfindən N1/N2A inhibəsinin kinetik mexanizmi. (A) C-dən başqa bütün ştatlarda keçidlərə icazə verilən pilləli model4 və C5. Mavi ilə göstərilən nisbət sabitlərinin dəyişməsinə icazə verilir. Bütün qapalı əyalətlər üçün dərəcələr, göstərilən dəyərlər üçün sabitdir, C-dən olan dərəcələr1, O1və O2 (mavi) C-dən 5 qat daha böyükdür2 və C.3 (yaşıl). Bu model 4 mM NPA (n = 6) və simulyasiya üçün də istifadə olunur. Simulyasiya üçün istifadə olunan glutamat bağlama addımları göstərilmişdir (boz). (B) 1 mM Glu (qara xətt) uzun (5 saniyə) nəbzinə makroskopik cavablar simulyasiya edilmiş və Şəkil 5B-də göstərildiyi kimi bütün hüceyrə cərəyanları ilə yaxşı razılaşdırılmışdır. (C) Simulyasiya edilmiş doza-inhibisyon əyrisi (qırmızı) bütün hüceyrə məlumatları ilə müqayisə edildi (IC)50 95% etibar intervalı olaraq ifadə edilir). Təpənin yamacı simulyasiyalar üçün 1,0, eksperimental izlər üçün isə 1,2 idi.

NPA Fəaliyyətinin Təklif olunan Mexanizmi üçün Eksperimental Qiymətləndirmə.

Daha sonra, Şəkil 6A-dakı modelin aktiv reseptorlara tətbiq edildikdə (Şəkil 1) və ya istirahət reseptorlarına tətbiq edildikdə (şəkil 5B) glutamatla yaranan cərəyanların müşahidə edilən inhibisyonunu düzgün proqnozlaşdıra biləcəyini soruşduq. Model Şəkil 1-də təsvir olunan sabit vəziyyət cərəyanlarının inhibəsini sədaqətlə təkrarladı və eksperimental olaraq qeydə alınmış bütün hüceyrə cərəyanlarından hesablanandan fərqlənməyən bir doza-cavab əyrisini proqnozlaşdırdı (1,5 mM-ə qarşı 1,9 ½ 0,8 mM) (Şəkil 2). 6C). Bundan əlavə, NPA-ya əvvəlcədən məruz qalmış NMDA reseptorundan simulyasiya olunan cərəyanlar da eksperimental olaraq müşahidə edilən makroskopik davranışları uğurla təkrarlayır (Şəkil 5B). Bu nəticələrə əsaslanaraq, bir neçə sadələşdirilmiş fərziyyələr əsasında əldə edilməsinə baxmayaraq, iki NPA yaxınlığını (Şəkil 6A) ehtiva edən pilləli bir modelin təcrübədə müşahidə olunan tək kanallı və makroskopik davranışları nəzərə almaq üçün lazımi detalları ələ keçirməsini təklif edirik. Nəhayət, NPA-nın sinaptik və ekstra sinaptik reseptorlardan gələn reaksiyalara necə təsir edə biləcəyini proqnozlaşdırmaq üçün bu modeli istifadə etdik.

Sinaptik və ekstrasinaptik reseptorlara proqnozlaşdırılan NPA təsirləri.

NPA -nın NMDA reseptor sinaptik reaksiyalarına təsirini, glutamatın (1 mM) qısa (1 milisaniyəlik) nəbzlərini izləyən Şəkil 6B -də CTR və səviyyəli NPA modeli ilə simulyasiya edilmiş izləri müqayisə edərək qiymətləndirdik. Yaranan izlər, NPA (4 mM), N2A ehtiva edən reseptorlardan sinaptik bənzər reaksiyaları ən yüksək cərəyan amplitüdünü 2 dəfə azaltmaqla və həmçinin deaktivasiya müddətini və#x0223c2 dəfə (400 milisaniyə qarşı 200 milisaniyə) azaltmaqla inhibə edəcəyini göstərdi. . Bu dəyişikliklər birlikdə bir sinaptik hadisəyə cavab olaraq ümumi yük transferində �% azalma verəcəkdir (Şəkil 7A).

Sinaptik və ekstrasinaptik N1/N2A makroskopik cavablara proqnozlaşdırılan NPA effektləri. (A) 1 mM Glu (qara ox) (sol) qısa (1 milisaniyəlik) nəbzinə makroskopik reaksiyaların simulyasiyaları, simulyasiya edilmiş izlər zirvəyə qədər normallaşdırılır və deaktivasiya müddətinin müqayisəsi üçün örtülür (sağda). Qırmızı ox 4 mM NPA varlığında NMDA reseptor reaksiyasının zirvəsini göstərir. (B) 1 mM Glu (qara xətt) uzun (5 saniyəlik) nəbzinə makroskopik cavablar Şəkil 4B-dəki modellərlə simulyasiya edilmiş və olmadıqda (qara) və ya mövcudluqda (qırmızı) bütün hüceyrə cərəyanları kimi qeydə alınmışdır. ) 4 mM ətraf mühit NPA (sağda) əlavələri desensibilizasiya müddəti kursunun müqayisəsi üçün zirvəyə normallaşdırılmış (solda) və deaktivasiya müddəti kursunun müqayisəsi üçün sabit vəziyyət səviyyəsinə normallaşdırılmış eyni izləri göstərir (sağda).

Bütün reseptorları qlutamatsız vəziyyətdə (C) işə salmaqla, Şəkil 6B-dəki səviyyəli modellə NPA-nın ekstrasinaptik reseptorlara təsirini təqlid etdik.0) və NPA konsentrasiyasını 4 mm -ə təyin etmək. Aktivləşdirmə, glutamat konsentrasiyasının sıfırdan 0.1 mM -ə dəyişdirilməsi ilə başladı, bundan sonra reseptorların bütün 18 əyalətdə 5 saniyə ərzində tarazlaşmasına icazə verildi. Nəticələr 4 mM NPA -nın həm pik, həm də sabit vəziyyət cərəyanlarını zəiflədəcəyini və sabit vəziyyət cərəyanına təsirinin bir az daha böyük olacağını göstərdi (Şəkil 7B, simulyasiya), lakin makroskopik desensitizasiya üçün vaxt kursu əsasən dəyişməyəcək ( NPA ilə CTR: 2.5 saniyə qarşı 2.0 saniyə) (Şəkil 7B, simulyasiya, daxil edin). Həmçinin, nəticələr 4 mM NPA (CTR-ə qarşı NPA: 430 millisaniyə ilə 190 milisaniyə qarşı) iştirakı ilə#x0223c2 qat daha sürətli deaktivasiyanı proqnozlaşdırdı (Şəkil 7B, simulyasiya, əlavə). Bu nəticələr oxşar bir protokolla qeydə alınan bütün hüceyrə cərəyanları ilə çox uyğun gəldi: desensitizasiya üçün 4 mM NPA varlığında və varlığında reseptorların zaman sabitləri 1.1 ± 0.1 saniyə və 1.2 ± 0.1 saniyədir (P = 0.54), sırasıyla deaktivasiya üçün zaman sabitləri sırasıyla 720 ± 50 millisaniyə və 350 ± 20 milisaniyədir (P < 0.01) ( Şəkil 7B ). Təqdim olunan bütün nəticələrə əsaslanaraq, NPA-nın həm sinaptik, həm də ekstrasinaptik N2A reseptorlarını əhəmiyyətli dərəcədə inhibə edəcəyini və qısa sinaptik bənzər stimullara reaksiyalara daha böyük təsir göstərəcəyini təklif edirik.


Məlumat Təhlili

Qeyd olunan cərəyanlar əvvəllər ətraflı təsvir edildiyi kimi təhlil edildi (Kussius et al. 2009). Eyni anda açılmalarla göstərildiyi kimi birdən çox aktiv kanal olan mikroskopik qeydlər atıldı və seçilmiş bir kanallı fayllar işləndi, ideallaşdırıldı və QUB-da kinetik modellərə uyğunlaşdırıldı. Müvafiq bölgəni ya qapalı, ya da açıq cərəyan səviyyəsinə təyin etməklə ara-sıra yaranan səs-küy sıçrayışları silindi, baza xəttinin sıfır cərəyan səviyyəsinə sıfırlanması ilə ilkin sürüşmə düzəldildi. Əvvəlcədən işlənmiş məlumatlar daha sonra segmental ilə ideallaşdırıldı k-150 μs qətnamə alqoritmi deməkdir və maksimum interval günlük ehtimal alqoritmi ilə modelləşdirilir. Son modeldəki qapalı və açıq vəziyyətlərin sayı tədricən qapalı və açıq vəziyyətlərin ilkin 1C1O modelinə əlavə edilməsi (C -nin bağlanması və O -nun açıq olması) və log ehtimalının artmasının ixtiyari 10 vahid həddinə təyin edilməsi ilə müəyyən edilmişdir. vəziyyət (iki əlavə dərəcə sabiti). Hər bir qeyddə kinetik parametrlər üçün hesablanmış dəyərlər hər bir məlumat dəsti üçün orta hesablanmış və ± SE vasitəsi olaraq bildirilmişdir.

Makroskopik izlər (3-10 iz/hüceyrə) orta hesablanmış və pik cərəyanı ölçməklə qiymətləndirilmişdir (Mənpk) və tarazlıq [sabit vəziyyət cərəyanı (Mənss)] amplitüdləri və monoeksponensial funksiyanı cərəyanın çürümə mərhələsinə uyğunlaşdırmaqla (Clampfit 10.2 proqramı, Molekulyar Cihazlar). Bu təhlillər zaman sabit olaraq makroskopik desensitizasiya üçün ölçüləri təmin etdi (τD) və olduğu kimi Mənss-ə-Mənpk nisbəti (Isspk). Dəyərlər ± SE kimi bildirilir və 6-15 hüceyrə/şərt üçün əldə edilmişdir.

Simulyasiya edilmiş makroskopik cavablar əvvəllər təsvir edildiyi kimi QUB -da yaradılmışdır (Kussius et al. 2009). Stasionar tək kanal qeydlərindən əldə edilən modellər C-yə aparan iki ardıcıl qlutamat bağlayan addımı əhatə edəcək şəkildə genişləndirildi.3 hər bir modelin glutamat birləşməsinin vəziyyəti və ayrılma dərəcəsi sabitləri rekombinant N1/2A (Popescu et al. 2004) və N1/2B (Amico-Ruvio və Popescu 2010) reseptorları üçün verilənlərə bərabər hesab edilmişdir. Uzun (5 s) glutamat tətbiqləri ani konsentrasiyaların 0 və 1 mM glutamat arasında sıçrayışları kimi modelləşdirilmişdir.

Vasitələr arasındakı müşahidə edilən fərqlərin əhəmiyyəti iki quyruqlu Tələbə ilə qiymətləndirildi t-test, fərqliliklərin fərqliliyinin əhəmiyyətini iki quyruqlu ilə qiymətləndirdi F-test. üçün fərqlər əhəmiyyətli hesab edildi P & lt0.05 dəyərləri.


Hipokampal plastisiyada GluN2A və GluN2B alt birliyi olan NMDA reseptorları

N.-Metil-d-aspartat reseptoru (NMDAR)-asılı sinaptik plastiklik, hipokampa ehtiyac duyan öyrənmə və yaddaş proseslərinə vasitəçilik etmək üçün güclü bir namizəddir. Bu plastiklik iki yönlüdür və eyni reseptorun sinaptik çəkilərdəki əks dəyişikliklərə necə vasitəçilik edə biləcəyi bir problem olaraq qalır. NMDAR subunit kompozisiyasının cəlb oluna biləcəyi irəli sürüldü. Xüsusilə, NMDAR-ların bir alt bölmə tərkibi uzunmüddətli potensialın (LTP) induksiyasına cavabdeh olardı, halbuki fərqli bir alt vahid tərkibi olan NMDAR-lar uzunmüddətli depressiyanın (LTD) induksiyasında iştirak edəcəkdir. Təəssüf ki, bu fərziyyəni araşdıran tədqiqatların nəticələri, xüsusən də LTD ilə bağlı ziddiyyətlidir. Buna baxmayaraq, mövcud sübutlar göstərir ki, GluN2B alt bölməsi plastiklik üçün xüsusilə vacib ola bilər və sinapsı iki istiqamətli elastik edə bilər. Xüsusilə, belə nəticəyə gəlirik ki, postsinaptik sıxlıqda GluN2B subunit tərkibli NMDAR-ların olması fərdi sinapsların gücləndirilməsi üçün kifayət olmasa da, zəruri şərt ola bilər. Bu, GluN2B-nin kalsium/kalmodulinə bağlı protein kinaz II (CaMKII) ilə qarşılıqlı təsirindən qaynaqlanır və ion kanalı kimi qatqılarından fərqlənir.

1. Giriş

Hətta bir öyrənmə epizodundan sonra neyron şəbəkələrinin məlumatı necə möhkəm saxlaya biləcəyini deşifrə etmək neyroelmdə ən böyük problemlərdən birini sübut etdi. Öyrənmə və yaddaş üçün ən yaxşı dəstəklənən mobil model, əlaqəli neyron fəaliyyətinin, şəbəkə boyunca paylanan sinaptik ağırlıqlarda uzunmüddətli dəyişikliklərə səbəb olduğunu irəli sürür [1]. Belə "sinaptik plastisite", əksər plastiklik formalarının, xüsusi olaraq bilinən bir növ glutamat reseptorunun aktivləşdirilməsini tələb etdiyi hipokampal eksitator sinapslarda geniş şəkildə öyrənilmişdir. N.-metil- d -aspartat reseptoru (NMDAR) induksiyası üçün [2]. NMDARlar, Ca 2+ keçiriciliyinə və eyni zamanda gərginliyə bağlı Mg 2+ blokundan əmələ gələn təsadüf detektor xüsusiyyətlərinə görə plastisiyanın molekulyar vasitəçiləri kimi xüsusilə cəlbedicidir [3]. Plastiklik sinaptik gücdə həm artımları (uzunmüddətli potensiasiya, LTP) və azalmaları (uzunmüddətli depressiya, LTD) əhatə edir və α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolpropion turşusu reseptorlarında (AMPAR) dəyişikliklərlə ifadə edilir. ) postsinaptik elementdə və/və ya presinaptik ötürücü buraxılışında dəyişikliklər. Nəhayət, bu cür dəyişikliklər struktur dəyişiklikləri ilə birləşdirilir. Bununla birlikdə, neyron fəaliyyətinin mənalı plastisiyanı necə tetiklediği in vivo qeyri -müəyyən olaraq qalır. Üstəlik, əgər plastiklik öyrənmə və yaddaşı dəstəkləyirsə, öyrənmə epizodunun müxtəlif sinaps dəstləri arasında paralel olaraq həm potensiasiya, həm də depressiyaya səbəb olub-olmadığı hələ aydın deyil.

Bu icmalın fərqli subunit kompozisiyaları olan NMDAR-ların plastikliyin iki əks formasının induksiyasına cavabdeh olduğu və bu subunit balansının dəyişdirilməsinin sinaptik gücü tənzimləmək üçün vacib mexanizm olduğu fərziyyəsi ətrafında mübahisəli sahəyə toxunulur. Birincisi, müxtəlif subunit kompozisiyalarının NMDAR-ın funksional və dinamik xüsusiyyətlərinə necə təsir etdiyini və onun siqnal ötürülməsindəki rolunun nəticələrini təsvir edir. İkincisi, bu NMDAR alt bölmələrinin plastikliyin fərqli formalarına töhfə verib-vermədiyini qiymətləndirir. Nəhayət, NMDAR-ın vasitəçilik etdiyi plastisiyanın öyrənmə və yaddaşla əlaqəli olduğu düşünüldüyündən [4,5], fərqli subunit kompozisiyaları ilə fərqli öyrənmə və yaddaş növlərinin NMDARlar tərəfindən dəstəklənə biləcəyinə dair sübutları ümumiləşdirir. Bir neçə mexanizm müxtəlif beyin bölgələrində plastisiyaya kömək edə bilər və bunlardan bəziləri NMDAR-dan müstəqildir, məsələn, CA3-də mamırlı lif sinapsındakı LTP [6] və CA1-də metabotropik qlutamat reseptorundan asılı LTD [7]. Bundan əlavə, sinapsdakı plastik dəyişikliklər həm qısamüddətli, həm də uzunmüddətli komponentlərə malik ola bilər [8] və bunlar fərqli proseslərlə dəstəklənə bilər və induksiya üçün fərqli NMDAR alt birliyinə asılı ola bilər [9].Bu araşdırma eksperimentlər arasında müqayisəni asanlaşdırmaq üçün hipokampusda, xüsusən də CA3-CA1 sinapsındakı uzunmüddətli plastikliyin NMDAR-dan asılı formalarına diqqət yetirir və çünki bu sinaps xüsusilə hipokampusdan asılı assosiativ öyrənmədə iştirak edir.

2. Fərziyyə

Hər iki plastiklik forması eyni tip reseptorlardan asılı olduqda fərqli sinir aktivliyi nümunələrinin sinaptik qüvvəyə necə əks təsir göstərə biləcəyini izah etmək üçün bir sıra nəzəriyyələr irəli sürülmüşdür. Postsinaptik ifadə nəzəriyyələrinin birləşdirici tərəfi budur ki, postsinaptik element olan NMDAR-ın vasitəçiliyi ilə Ca 2+ axını, 'onurğa', nəticədə sinaptik çəkilərdəki dəyişikliklərə vasitəçilik edən müxtəlif hüceyrədaxili siqnal kaskadları ilə birləşməlidir.

LTP-ni induksiya etmək üçün istifadə olunan ənənəvi yüksək tezlikli paradiqmalarda NMDAR-lar vasitəsilə Ca 2+ axınının böyüklüyünün aşağı tezlikli LTD paradiqmaları ilə müqayisədə daha böyük olduğu tez bir zamanda müəyyən edildi. Buna görə də, müxtəlif səviyyəli Ca 2+ axınının, sinapsda iki plastisiyanın istiqamətinin əsasını təşkil edən molekulyar və son nəticədə struktur dəyişikliklərə səbəb olmaq üçün hüceyrədaxili siqnal yolları ilə birləşə biləcəyi irəli sürüldü [10]. Bu, sünbülün dəqiq vaxtı ilə plastisiyanın induksiyasına qədər uzadıldı [11]. Bununla belə, görünürdü ki, təkcə Ca 2+ səviyyələrinə əsaslanan mexanizm kifayət qədər möhkəm olmaya bilər və o, bəzi eksperimental müşahidələri də nəzərə ala bilməz, beləliklə, Ca 2+ zaman kursunun vacib olduğu təklif edilmişdir [12,13]. Postsinaptik Ca 2+ dinamikası kiçik keçiricili Ca 2+ aktivləşdirilmiş K+ kanalları [14,15], gərginliyə bağlı Ca 2+ kanalları [16,17] və hüceyrədaxili Ca 2+ buraxılması [18] Ca 2 ilə sıx şəkildə tənzimlənir. + bunların yaratdığı mikro alanlar, ikitərəfli plastisiyanı tənzimləməkdə daha yaxşı bir nəzarət səviyyəsi təmin edə bilər.

Ca 2+ dinamikasını və iki istiqamətli plastisiyanı əlaqələndirən nəzəriyyədəki təkmilləşdirmələrə paralel olaraq, NMDAR -ın fəaliyyət nümunələrinə cavab olaraq sinaptik gücləndirmə və zəifləməni mahiyyətcə ayıra biləcəyi fikri ortaya çıxdı. NMDAR alt vahidləri tərəfindən verilən fərqli kinetik xüsusiyyətlər, NMDAR kompozisiyasının postsinaptik Ca 2+ dinamikası üzərində daha yaxşı bir səviyyədə nəzarət etməyə imkan verə bilər. Həm də fərqli molekulyar birləşmələr qururlar və beləliklə, hər bir plastisiyanı tənzimləmək üçün qurulmuş aşağı kinaz və fosfataz yolları ilə müstəqil şəkildə birləşə bilərlər (nəzərdən keçirmək üçün bax [19]). Bundan əlavə, sinaptik yerlərdə bu alt birimlərin nisbi bolluğu inkişaf boyunca sıx tənzimlənir və alt birliyin dominantlığına keçid, plastiklik induksiyasındakı dəyişikliklərlə əlaqələndirilir [20]. Bütün bu sübutlar cazibədar təkliflə birləşdi ki, induksiya olunan plastisiya növü, bəlkə də fərqli siqnalların ötürülməsinə imkan verməklə və onları müxtəlif aşağı axın siqnal molekullarına sıx birləşdirməklə aktivləşdirilmiş NMDAR alt bölməsinin növü ilə müəyyən edilə bilər. Bununla belə, bu fərziyyəni araşdırmaq üçün nəzərdə tutulan tədqiqatların nəticələri qeyri-müəyyən olmuşdur.

3. NMDA reseptorları

NMDAR'lar həm pre-həm də postsinaptik olaraq tapılır (şəkil 1a) və neokortikal sahələrdən əldə edilən sübutlar, bu fərqli NMDAR populyasiyalarının fərqli plastiklik mexanizmlərini dəstəkləyə biləcəyinə bir nümunə yaratdı [21-23]. Bu, hipokampda da tətbiq oluna bilər, çünki plastisiyaya presinaptik olaraq ifadə olunan hipokampal LTP -nin daha da müzakirəsi üçün bəzi təcrübi şərtlər altında [24-26] presinaptik sərbəst buraxılma ehtimalının dəyişməsi səbəb ola bilər, oxucular Bliss & amp Collingridge tərəfindən edilən son araşdırmaya yönəldilmişdir [27]. ]. Baxışımız sinaptik, perisinaptik və ekstrasinaptik olaraq tapıla bilən postsinaptik NMDAR -lara yönəlib. Bu üç reseptor populyasiyası, fərqli funksional rollar oynaya biləcəyini irəli sürən neyronal aktivlik nümunələri ilə fərqlənir, lakin subunit kompozisiyanın və sinaptik yerin necə əlaqəli olması mübahisəli olaraq qalır.

Şəkil 1. NMDA reseptorlarının yeri və sinaptik plastisiyadakı alt hissələr. (a) NMDAR'lar həm pre-həm də postsinaptik olaraq tapılır və bu iki NMDAR populyasiyası sinaptik plastisiyada fərqli rollar oynaya bilər. Postsinaptik membranda NMDAR-lar sinaptik, perisinaptik və ekstrasinaptik olaraq tapılır, burada da müxtəlif funksiyaları yerinə yetirmək ehtimalı var. (bSünbül vaxtından asılı LTP induksiyası zamanı, GluN2B alt birliyi olan NMDARlar (narıncı ox) vasitəsilə Ca 2+ axını, LTP tetiklemek üçün CaMKII-ni birbaşa aktivləşdirir. Tetanik aktivasiya, GluN2B alt birliyinin C-terminalı ilə postsinaptik sıxlığa (PSD) bağlanmış CaMKII-ə çatan və aktivləşdirən GluN2A alt birliyi olan NMDAR (boz oxlar) vasitəsilə daha böyük bir Ca 2+ axını yaradır. Hər iki halda, LTP ifadəsinə vasitəçilik edən aşağı axın siqnal kaskadlarını tetikleyen CaMKII aktivasiyasıdır ki, bu da PSD-də GluN2B alt bölməsinin olmasının Ca 2+ axınının əksəriyyətini dəstəkləməsindən asılı olmayaraq LTP induksiyası üçün vacib olduğunu göstərir.

NMDAR-lar iki məcburi GluN1 alt bölməsindən və reseptorun xüsusi xüsusiyyətlərini təmin edən iki əlavə GluN2 və ya GluN3 alt bölməsindən ibarətdir. Hər bir alt bölmə dörd əsas domendən ibarətdir: Zn 2+ kimi allosterik modulyatorlar üçün bağlama yerlərini ehtiva edən N-terminal domen və qlisin/d-serin (GluN1-də) və qlutamat üçün bağlanan yerlər olan ifenprodil agonist-bağlayıcı domen. GluN2-də) və rəqabətli antaqonistlərin fenisiklidin (PCP) və MK801 və son olaraq fərqli hüceyrədaxili vasitəçilərə bağlanan C-terminal domeni (CTD) kimi məsamə blokerləri üçün əlçatan olan gözenek sahəsinin hərəkət etdiyi yerlərdə yerləşir. Hippokampdakı iki əsas GluN2 alt birimi GluN2A və GluN2Bdir, baxmayaraq ki, GluN2C və GluN2D, xüsusən inkişafın əvvəlində, həm də yetkinlikdə az miqdarda mövcuddur [28]. Hipokampal NMDAR-lar diheteromerik (GluN1/GluN2A və GluN1/GluN2B) və ya triheteromerik (GluN1/GluN2A/GluN2B) ola bilər. GluN2B ifadəsi doğumda yüksəkdir, lakin yetkinlik yaşına çatdıqda azalır, GluN2A ifadəsi isə yaşla artır [20,28-30]. Yetkinlərin beynində sinaptik NMDARların böyük bir hissəsini meydana gətirən triheteromerik populyasiyanın getdikcə daha çox tanınması [9,31-33], lakin bu reseptorların farmakoloji olaraq seçici olaraq sorğu -suala tutula bilməməsi səbəbindən, triheteromerik reseptorların xüsusiyyətlərindən yalnız nəticə çıxarmaq olar. Beləliklə, onların dəqiq rolu, ehtimal ki, əhəmiyyətli olsa da, müəmmalı olaraq qalır.

(a) Funksional və dinamik xüsusiyyətlər

Kanal cərəyanlarının və ya tək stimullara postsinaptik reaksiyaların ölçülməsi GluN2A və GluN2B subunit tərkibli NMDAR-ların kinetikasında nəzərəçarpacaq fərqləri aşkar etdi və bu, bu kanal alt tiplərinin plastikliyin induksiyasına təsir göstərə biləcəyi üsullardan biridir. İnsan embrion böyrəyi (HEK) hüceyrələrindəki tək kanallı qeydlər göstərdi ki, GluN1/GluN2A reseptorlarının qlutamata cavab olaraq daha yüksək açılma ehtimalı və həmçinin GluN1/GluN2B reseptorlarından daha yüksək pik açıq ehtimalı var [34]. Bu tapıntılar, HEK hüceyrələrində [35] bütün hüceyrə ölçüləri ilə dəstəklənir və kanal açılma ehtimalının MK801 ilə NMDARların istifadəyə bağlı bloku ilə qiymətləndirildiyi kəskin hipokampal dilimlər [31] ilə dəstəklənir. GluN1/GluN2A-dan ibarət olan fərdi NMDAR-ların daha sürətli aktivləşmə və deaktivasiya dərəcələri, GluN1/GluN2B tərəfindən dəstəklənənlərə nisbətən daha sürətlə yüksələn və çürüyən bütün hüceyrə cərəyanları ilə nəticələnir və triheteromerik bir populyasiyada zahirən ara çürümə müddəti sabitidir [36].

NMDAR -ların müxtəlif müddətlərdə müxtəlif tezliklərdə çoxsaylı stimullara cavabı sinaptik plastiklik kontekstində xüsusilə vacibdir. Tək kanallı qeydlərdən alınan ölçülər, GluN2A və GluN2B alt birliyi olan NMDAR-ların presinaptik fəaliyyət qatarlarına reaksiyalarını simulyasiya etmək üçün istifadə edilmişdir və bu, iki alt hissə arasında fərqlənən stimullaşdırma tezliyi ilə ümumi yük ötürülməsi arasında bir əlaqə olduğunu göstərdi [34]. Bəzi plastiklik protokollarında istifadə edilən çox aşağı tezliklərdə (0.1-0.3 Hz), GluN1/GluN2B kanallarının daha yavaş deaktivasiya dərəcəsi səbəbindən iki dəfə çox yük ötürülməsini dəstəklədiyi məlum oldu. LTD induksiyası üçün üstünlük verilən 1 Hz stimulyasiyasında, GluN1/GluN2B kanalları vasitəsi ilə yüklərin ötürülməsi hələ də GluN1/GluN2A ilə müqayisədə çox azdır və 2 Hz -də kanallar arasında ekvivalent idi. Modelləşdirmə, həmçinin yüksək tezlikli induksiya protokollarında tez-tez istifadə olunan 100 Hz tezliyi üçün stimullaşdırmanın yüksək tezliklərində fəaliyyət müddətinin vacib olduğunu ortaya qoydu, stimullaşdırıcı qatarın müddəti GluN2A və GluN2B subunit tərkibli NMDAR-lar vasitəsilə yük transferini kəskin şəkildə dəyişdirdi. İki kanal alt növü, 100 ms stimulyasiya üçün ekvivalent yük ötürülməsinə icazə verdi, lakin 1000 ms -lik bir stimul qatarı üçün LTP, GluN1/GluN2A -nı indükləmək üçün istifadə olunan tipik müddət GluN1/GluN2B -dən iki dəfə çox yük ötürülməsini dəstəklədi [34]. GluN2A və GluN2B subunit tərkibli NMDAR-ların desensibilizasiyası onların yük ötürülməsinə vasitəçilik etmək qabiliyyətinə də töhfə verəcək, lakin bu təsirə postsinaptik onurğada alt bölmənin tərkibindən çox təsirlənəcək modelləşdirmə, GluN2A alt bölməsini ehtiva edən NMDAR-ların daha böyük bir hissəsinin olacağını irəli sürdü. 5 -dən 100 Hz -ə qədər olan stimullaşdırma tezliklərində həssaslıq azalır, lakin GluN2A ilə GluN2B arasındakı fərq 1000 ms üçün 100 Hz -də ən aşağı olacaq [37]. Bu modelləşdirmə tədqiqatları subunit tərkibinin və plastiklik protokollarının necə qarşılıqlı təsir göstərə biləcəyini proqnozlaşdırmaq üçün faydalı məlumat təqdim etsə də, fizioloji şəraitdə onların proqnozlarını yoxlamaq üçün əlavə eksperimental araşdırma vacibdir.

Ümumiyyətlə güman edilir ki, Ca 2+ axınının miqyası yük ötürülməsi ilə bağlıdır, bu da kanalın alt tipləri arasında yük ötürülməsindəki fərqlərin onların müxtəlif postsinaptik Ca 2+ dinamikasını tələb edən fərqli plastiklik formalarını işə salmaq qabiliyyətində vacib olacağını göstərir. Bununla belə, əlaqə daha mürəkkəb ola bilər, çünki onurğaların Ca 2+ görüntüləri glutamat tətbiqinə cavab olaraq Ca 2+ axınının böyüklüyünün NMDAR vasitəçiliyi ilə yük ötürülməsi ilə mütləq korrelyasiya olmadığını ortaya qoydu [38]. Bundan əlavə, bir GluN2B subunit-seçmə antagonisti, müəlliflərin GluN2B alt birliyi ehtiva etdiyi qənaətinə gəlməsinə səbəb olan qıcıqlanmayan həyəcan verici postsinaptik cərəyan (EPSC) üçün Ca 2+ 'da daha yüksək bir dəyişikliyi dəstəkləyən bu tikanlarda Ca 2+ axınının daha çox azalmasına səbəb oldu. NMDAR-lar cərəyan vahidi üçün daha çox Ca 2+ axını dəstəkləyir [38]. Bu, əvvəllər heteroloji sistemlərdə [28] rekombinant GluN2A və ya GluN2B subunit tərkibli NMDAR-larda müşahidə olunmamışdı ki, bu da metodoloji fərqlər, triheteromerik NMDAR-ların mövcudluğu və/və ya kəskin beyin dilimlərində NMDAR-ların posttranslational modifikasiyaları və s. araşdırma tələb olunur. Buna baxmayaraq, GluN2B alt bölməsi olan NMDAR-lar vasitəsilə bu daha yüksək Ca 2+ axını davam edərsə, bu, bu alt bölmənin plastikliyə qeyri-mütənasib təsir göstərə biləcəyini göstərir.

(b) NMDA reseptorlarının hüceyrədaxili birləşmələri

NMDAR alt bölmələrinin plastisiya istiqamətinə təsir göstərə biləcəyi digər yollar onların uzun CTD-lərinə aiddir, çünki bunlar bir çox hüceyrədaxili qarşılıqlı təsirlərə və fosforlaşma ilə modifikasiyalara imkan verir. Bu birbaşa və dolayı molekulyar birləşmələrin bir çoxu bənzərsizdir, çünki CTD GluN2A və GluN2B arasında yüksək ardıcıllıq fərqliliyini göstərir. Bu, onların sinapsda mövcudluğunun və ya olmamasının ayrıca tənzimlənməsinə imkan verir və həmçinin hər bir alt bölməni LTP və ya LTD-ni dəstəkləyən müxtəlif aşağı axın siqnal kaskadlarına birləşdirə bilər, bu qarşılıqlı əlaqənin plastikliyə aid bir neçə əsas nümunəsi aşağıda verilmişdir.

Sinapsda GluN2A və GluN2B subunit tərkibli NMDAR-ların olması onların PSD-95, PSD-93, SAP103 və SAP103]97 daxil olan membranla əlaqəli guanilat kinazların postsinaptik sıxlıq (PSD) alt ailəsi ilə qarşılıqlı təsiri ilə sabitləşir. Posttranslational modifikasiyalar GluN2A və GluN2B subunitlərinin bu PSD zülallarına nə qədər güclü bağlandığını dəyişə bilər və bu, sinapsda bu alt bölmələrin mövcudluğunu tənzimləyən mexanizmlərdən biridir: bu da öz növbəsində plastikliyin induksiyasına təsir göstərə bilər. Məsələn, Cdk2 Ser1480-də GluN2B-ni fosforiləşdirir və PSD-95 və SAP102 ilə qarşılıqlı əlaqəsini pozur və sinaptik GluN2B-nin azalmasına gətirib çıxarır [40,41]. Bu fosforlaşma hadisəsi təkcə GluN2B [41] üçün unikal deyil, həm də sinaptik fəaliyyətlə tənzimlənir [40]. GluN2B-nin səth səviyyələri, Tyn1472-də Fyn tərəfindən fosforilləşmə ilə tənzimlənə bilər və Src fosforilasyonu, GluN2B internalization motifi YEKL ilə bağlanan clathrin adapter protein AP-2-nin qarşısını alır və bununla da endositozu maneə törədir. Cdk5 bu tənzimləyici kaskadın əlavə komponenti ola bilər, çünki onun inhibə edilməsi Src və PSD-95 arasında qarşılıqlı əlaqəni təşviq edir və nəticədə Tyr1472 fosforlaşmasını artırır [42]. Başqa bir nümunə, fərqli bir yerdə (Leu1319 və Leu1320) bir dileucin motivi ilə idarə olunan GluN2A endositozudur [43] və beləliklə onun səthi ifadəsi müstəqil olaraq tənzimlənə bilər. GluN2B alt bölmələrinin GluN2A -dan daha tez -tez endositoz keçirməsi və bu iki alt birliyin fərqli hüceyrədaxili yollara girməsi, GluN2B -nin geri çevrilmə endosomlarına və GluN2A -nın gec endosomlara daxil olması diqqət çəkir [43]. Bu, GluN2B fəaliyyətinin və ya neyromodülatördən asılı tənzimlənməsinin bir sinaps vəziyyətini dəyişdirmək üçün daha sürətli və ya daha həssas bir yol ola biləcəyini göstərir.

Sinaptik GluN2A və GluN2B səviyyələrini idarə etmək üçün ayrı-ayrı tənzimləmə yollarına əlavə olaraq, müxtəlif fermentlərlə unikal assosiasiyalar da alt bölmələrə plastisiyanın əks formalarına töhfə verə bilər. Ən mühüm nümunə, ehtimal ki, GluN2B CTD ilə Ca 2+/kalmodulindən asılı protein kinaz II (CaMKII) katalitik domeni arasında yüksək yaxınlıqlı bağlanmadır [44]. PSD -də NMDARs [45] ilə əlaqəli bazal bir CaMKII səviyyəsi mövcuddur, lakin bu, LTP induksiyasından sonra PSD -yə köçən aktiv, fosforlanmış CaMKII ilə tamamlanır [46,47]. CaMKII və GluN2B arasındakı qarşılıqlı əlaqə CaMKII-ni aktiv konformasiyasında sinapsda bağlayır [48]. LTP aktiv CaMKII ([49] da nəzərdən keçirilmişdir), daha doğrusu, GluN2B ilə aktiv CaMKII [50,51] arasındakı əlaqə tələb edir. Buna görə də, GluN2B-nin Ca 2+ axını ilə CaMKII arasında sıx birləşməyə vasitəçilik etmək və sinaptik güclənməni dəstəkləyən fosforlaşma hadisələrini başlatmaq üçün AMPAR kimi substratlarının yaxınlığında əlavə aktiv CaMKII saxlamaq qabiliyyəti bu alt bölmənin oynaya biləcəyini göstərir. LTP-də mühüm rol oynayır. Postsinaptik onurğada digər diqqətəlayiq bir protein qarşılıqlılığı, GluN2B ilə Ras-GRF1 arasında, sinaptik plastisiyaya təsir edən Ca 2+ /kalmodulinə həssas, Ras-spesifik guanosin difosfat /guanosin trifosfat mübadiləsi faktorudur [52,53]. NMDAR -larla dolayı yolla əlaqələndirən, lakin hələ də alt birliyə üstünlük verən, NMDAR funksiyasının modulasiyasında alt birliyin tərkibinə görə əlavə bir mürəkkəblik səviyyəsinə malik olan zülallar da var.

4. Plastiklikdə GluN2A və GluN2B NMDA reseptor alt bölmələri

İndiyə qədər göstərildiyi kimi, diferensial alt vahid tərkibinin induksiya edilmiş plastikliyin növünə təsir göstərə biləcəyi üç əsas yol var. Birincisi, bu iki alt vahid tərəfindən verilən fərqli kanal xüsusiyyətləri, ayrı -ayrı aşağı plastiklik yollarını tetiklemek üçün kifayət qədər fərqli postsinaptik onurğa Ca 2+ dinamikasını təşviq edə bilər. İkincisi, GluN2A və GluN2B alt bölmələrinin CTD-ləri tərəfindən yaradılmış unikal birləşmələr, alt bölmələrin müstəqil hüceyrədaxili siqnal kaskadlarına birləşə biləcəyi birbaşa mexanizm təmin edir və beləliklə, sinaptik plastisiyada müxtəlif rol oynayır. Nəhayət, bu alt birləşmələrin miqdarında və ya hüceyrədaxili yerində dəyişikliklər onurğanın bazal vəziyyətini dəyişə bilər və bu da gələcəkdə plastisiyanın induksiyasına təsir göstərə bilər. Bu imkanları nəzərə alaraq, eksperimental sübutların müxtəlif NMDAR alt vahid kompozisiyalarının plastisiya protokolunun nəticəsini müəyyən etdiyi fərziyyəsini nə dərəcədə dəstəklədiyini soruşmaq maraqlıdır.

(a) Sinaptik plastiklik protokolları

Hipokampdakı sinaptik dəyişiklikləri induksiya etmək üçün müxtəlif induksiya protokollarından istifadə etmək olar və əsas paradiqmalar Cədvəl 1 -də göstərilmişdir. bu cür müxtəlif paradiqmaların yaratdığı dəyişikliklərin fərqli mexaniki əsasları var. Plastisiyada iştirak edən NMDAR alt bölmələrini təsvir edərkən bunu nəzərə almaq vacibdir, çünki nəticələr yalnız eyni protokol tətbiq edildikdə həqiqətən müqayisə edilə bilər.

Cədvəl 1. LTP və LTD-ni induksiya etmək üçün istifadə edilən müxtəlif protokollar.

LTP və LTD-də müxtəlif NMDAR alt bölmələrinin potensial rolunu araşdırmaq üçün farmakoloji və genetik manipulyasiyalarla birlikdə müxtəlif plastiklik protokolları istifadə edilmişdir. İki istiqamətli plastiklikdə fərqli NMDAR alt populyasiyalarının rolları ilə bağlı ilk araşdırma, geniş spektrli antagonistlərdən istifadə edərək GluN2A/B və GluN2C/D alt birləşmələrinin mümkün qatqılarını müqayisə etdi [54,55]. Sonrakı tədqiqatlar GluN2A və GluN2B arasında fərqlərin olub-olmadığını tədqiq etməyə yönəldilib, çünki bunlar yetkinlik yaşına çatmayan və yetkin CA3-CA1 sinapslarında mövcud olan üstünlük təşkil edən alt bölmələrdir. Hazırda GluN1/GluN2B reseptorlarını, ilk növbədə ifenprodil və onun daha güclü törəməsi Ro 25-6981-i bloklamaq üçün yüksək selektiv farmakoloji vasitələr mövcuddur [56]. Buna baxmayaraq, bunlar fəaliyyətdən asılı blokerlərdir və agonist konsentrasiyası bu antaqonistlərin GluN2B subunit tərkibli NMDAR-ları inhibə etmə dərəcəsinə təsir göstərir, məsələn, 3 µM Ro 25-6981 100 µM NMDA varlığında 93% inhibəyə nail olur, lakin yalnız 62% 10 uM NMDA -da [57]. GluN2A tədqiqatı, bu alt birliyin seçmə antagonistlərinin olmaması ilə daha da məhdudlaşır. NVP-AAM077 (bundan sonra NVP olaraq adlandırılacaq) ümumiyyətlə GluN2A-ya üstünlük verən bir antagonist olaraq istifadə olunur, lakin indi gəmiricilərdə rekombinant insan zülallarından güman edildiyindən daha az seçici olduğu bilinir və əslində yalnız 10 qat üstünlük verir. GluN2A üzərində GluN2A [56,58]. Buna görə də, NVP-dən istifadə etməklə toplanmış məlumatlar həmişə GluN2B-nin də müəyyən blokuna malikdir, lakin bu blokun miqyası istifadə olunan konsentrasiya ilə əhəmiyyətli dərəcədə dəyişir.

Farmakoloji və genetik manipulyasiyalar NMDAR funksiyasının müxtəlif aspektlərini araşdırmağa imkan verir. Farmakoloji yanaşmalar, NMDAR -ın ion kanalı rolu haqqında məlumat verir və hüceyrədaxili birləşmələrin əhəmiyyətinə birbaşa toxunmur. Onlar həmçinin fərqli rol oynaya biləcəkləri interneyronlar və piramidal neyronlar kimi bütün hüceyrə tiplərində xüsusi NMDAR alt tipinə ayrı-seçkilik etmədən təsir edəcəklər. Öz növbəsində, bu, həm dövrədə, həm də davranış səviyyəsində özünü göstərən şəbəkə üçün təsir göstərə bilər [59].Bunun əksinə olaraq, qurucu və induksiyalı genetik nokautlar, NMDAR kanalının xüsusiyyətlərinin və sinaptik varlığın birləşmiş rolu haqqında məlumat verir və inkişaf dövründə və hətta qısa müddətdə alt tipdəki dəyişikliklər nəzərə alınmaqla müəyyən bir hüceyrə tipinə yönəldilə bilər. Reseptorların tarazlığını pozan metaplastikliyin zaman miqyası çox güman ki, şəbəkədə digər dəyişikliklərə səbəb ola bilər və ya uzun müddət ərzində kompensasiya proseslərini işə götürə bilər. Bundan əlavə, farmakoloji manipulyasiyalar tez-tez siçovullarda aparılmışdır, halbuki aşağıda müzakirə edilən demək olar ki, bütün genetik manipulyasiyalar siçanlardan istifadə edilmişdir və növ fərqləri istisna edilməmişdir.

(b) Uzunmüddətli potensiasiya

Tez-tez LTP və LTD-nin induksiyasında NMDAR alt bölmələrinin diferensial iştirakını mübahisə etmək üçün istinad edilən erkən bir araşdırma, NVP tərəfindən GluN2A-nın farmakoloji blokunun üç-dörd həftəlik siçovullarda tetanoz və cütləşmə ilə əlaqəli LTP-nin qarşısını aldığını, lakin GluN2B-nin antaqonizmini aşkar etdi. ifenprodil/Ro 25-6981 tərəfindən yox, LTD induksiyasını blok etdi [60]. Eyni farmakoloji konsentrasiyalarını və siçovulların yaşını istifadə edən başqa bir araşdırma, NVP-nin tetanoz səbəb olan LTP-ni tamamilə blokladığını aşkar etdi, baxmayaraq ki, bu işdə ifenprodil və Ro 25-6981 bu LTP formasını qismən blok etdi [61]. Bununla birlikdə, hər iki tədqiqatın məlumatları nisbətən yüksək bir NVP konsentrasiyasından istifadə etməklə toplanmışdır, buna görə də yuxarıda göstərilən NVP spesifikliyinin olmamasına əlavə olaraq, nəticədə NMDAR vasitəçiliyi ilə mövcud cərəyan bloku NVP ilə daha çox olmuşdur (cərəyanın azalması: 53 ± 3.0% [60] və [61]-də 81 ± 3%) Ro 25-6981-in yaratdığı kiçik azalmalarla müqayisədə ([60]-da 36 ± 5% və [61]-də 32 ± 3%). Buna görə də, GluN2A alt birliyinin bu seçici rolu, daha çox ümumi NMDAR vasitəçiliyində olan cərəyanı maneə törətmək, xüsusən ənənəvi olaraq LTP induksiyası üçün yüksək səviyyəli Ca 2+ axınının tələb olunduğu nəzərə alınmaqla, LTP-ni blok edə biləcək bir eşik effektindən irəli gələ bilər. . Həqiqətən, siçanlarda aparılan bir araşdırma NMDAR-vasitəçili cərəyanı bərabər şəkildə azaltmaq üçün antaqonist konsentrasiyaları seçməklə (Ro 25-6981 ilə mümkün olana uyğunlaşmaq üçün 40% azalma), istifadə edilən antaqonistdən (NVP) asılı olmayaraq cütləşmə ilə bağlı LTP pozulmadı. , Ro 25-6981 və ya geniş spektrli NMDAR antagonisti 2-amino-5-fosfonopentanoat (AP5)) [62]. Yuxarıda qeyd olunan tədqiqatda NMDAR cərəyanının azalması üçün titrlənmiş eyni antaqonist konsentrasiyaları da böyüklər siçanlarında teta-partlayış paradiqması ilə törədilən LTP-ni pozmadı [63], baxmayaraq ki, bu aşağı NVP konsentrasiyası tetanozun səbəb olduğu LTP-ni qismən blokladı. ifenprodil etməmişdir [64]. Bu, tetanoza bağlı LTP-nin GluN2A blokuna ən həssas olduğunu göstərir. Cari azalmanın miqyasına əlavə olaraq, inkişaf mərhələsi də çox güman ki, bildirilmiş müxtəlif nəticələrin bəzilərini nəzərə alacaq. İki həftəlik siçovulların istifadə edildiyi bir araşdırmada, LTP həm GluN2A, həm də GluN2B antaqonizmi [65] tərəfindən pozulmuşdur, ehtimal ki, siçovullarda alt vahid tərkibində inkişaf keçişi hələ tam olmamışdır, çünki GluN2B antaqonizmi LTP-ni iki həftəlik siçovullarda, lakin altı həftədən çox olanlarda deyil [66]. Bəzi farmakoloji tədqiqatlar da aparılmışdır in vivo, burada CA3-CA1 sinapsının məruz qaldığı dəqiq konsentrasiyaları müəyyən etmək daha çətin olsa da, müxtəlif dilimləmə bucaqları, üsulları və inkubasiya məhlulları tərəfindən təqdim edilən dəyişkənliyin qarşısı alınır. Ro 25-6981 və ya NVP-nin intrahipokampal infuziyaları bloklanmış tetanozun səbəb olduğu LTP in vivo dörd-altı həftəlik siçovullarda [67], halbuki dərmanlar intraperitoneal yolla verildikdə, yalnız NVP heç bir təsiri olmayan Ro 25-6981 ilə LTP-ni bloklayır [67,68] bu aşkar uyğunsuzluğun müxtəlif səviyyələrdə olması nəticəsində yarana bilər. NMDAR bloku. Buna görə də, hətta in vivo tədqiqatlar dəqiq bir nəticə verməmişdir.

Bu farmakoloji tədqiqatlar, LTP induksiyasında hər iki alt birliyin yüksək seçici rolu üçün az inandırıcı dəlil təqdim etdiyindən, hər iki alt bölmənin kifayət qədər Ca 2+ girişinə icazə verdiyi halda LTP -ni dəstəkləyə biləcəyi alternativ bir hipotez düşünülməlidir. Ca 2+ axını daha böyük əhəmiyyət kəsb edəcək. Bu alt bölmə qərəzinə heyvanların davranışındakı neyronal fəaliyyət nümunələri təsir edəcək, induksiya protokolu isə sinaptik plastisiya tədqiqatlarında alt bölmənin meylinə təsir edəcəkdir. Erregerin yük transferinin modelləşdirilməsi və b. [34], stimullaşdırma tezliyinin xüsusi olaraq hansı alt bölmənin üstünlük təşkil etməsinə təsir etdiyini təklif edir, GluN2A tetanik səbəb olan LTP-də cərəyanın əksəriyyətini daşımalıdır, GluN2B isə daha aşağı tezlikli protokollarda daha çox cərəyan keçirə bilər [34]. Həqiqətən də, Ro 25-6981, aşağı tezlikli bir paradiqma səbəb olan yetkin siçanların kəskin hipokampal dilimlərində sünbül vaxtından asılı LTP (t-LTP) induksiyasını maneə törətdi [69,70], bu da tetanozu pozmadı. induksiya edilmiş LTP [70]. Ancaq bu təfsiri çətinləşdirən Zhang və b. [70] NVP-nin t-LTP-ni də blok etdiyini, yüksək və buna görə də daha az seçici konsentrasiyaya malik olmasına baxmayaraq tapdı. Bundan əlavə, Gerkin və b. [71] müəyyən etdi ki, Ro 25-6981-in ekvivalent konsentrasiyası mədəni hipokampal neyronlarda t-LTP-ni bloklamadı, lakin NVP 0,1-0,2 Hz deyil, 1 Hz-də əvvəlcədən sonrakı cütləşmələr etdi və mədəni neyronların istifadəsi, bu fərqli nəticəyə səbəb ola bilər. Digər tədqiqatlar, yük transferi səbəbiylə bir alt quruluşa meylli olduğuna dair əlavə sübutlar təqdim etdi. Məsələn, qoşalaşma protokolu subunit kinetikasının əhəmiyyətini məhdudlaşdırmalıdır, çünki postsinaptik neyron Mg 2+ blokunu çıxarmaq üçün depolarizasiya edilmiş potensialda saxlanılır. Buna görə də, heç bir alt birliyin üstünlük təşkil edəcəyi proqnozlaşdırılmayacaq və hər hansı bir önyargı daha çox sinapsda mövcud olan hər bir alt birimin sayı ilə təyin ediləcəkdir. Doğrudan da, Berberich və b. [72], induksiya zamanı yük ötürülməsinə minimal təsir göstərmək üçün kifayət qədər aşağı konsentrasiyalarda istifadə edildikdə, antaqonist konsentrasiyaları əhəmiyyətli dərəcədə azalan səviyyəyə yüksəldikdə cütləşmə ilə induksiya olunan LTP-nin NVP, Ro 25-6891 və ya AP5 tərəfindən bloklanmadığını aşkar etdi. yük ötürülməsi, həm GluN2A, həm də GluN2B antaqonistləri LTP-nin böyüklüyündə ekvivalent azalmaya səbəb oldu. NMDARların böyük triheteromerik populyasiyasının gətirdiyi komplikasiyanı da nəzərə almaq vacibdir, bu yaxınlarda aparılan bir araşdırma, yalnız yüksək miqdarda Ro 25-6981-in teta-partlamadan qaynaqlanan LTP-ni poza biləcəyini, ehtimal ki, antaqonistin bu triheteromerləri inhibə etməsinə başladığı üçün aşkar etmişdir [9].

Ümumiyyətlə, buna görə də, mövcud bir farmakoloji məlumatdan, heç bir alt birim seçici GluN2A antaqonistinin olmaması ilə bağlı nəticə, hər iki alt bölmənin kifayət qədər yük ötürülməsinə (və əlaqəli Ca 2+ axını) vasitəçilik edə biləcəyi təqdirdə LTP induksiyasını dəstəkləməyə qadir olmasıdır. . Hansı alt bölmənin daha çox yük ötürülməsinə vasitəçilik etdiyi yaşdan təsirlənəcək, çünki bu iki alt bölmənin nisbi bolluğu inkişafa görə dəyişir [20,28,30]. Müəyyən bir yaş aralığında istifadə olunan induksiya protokolu iki alt bölmənin fərqli kinetikası səbəbindən hansı alt bölmənin daha çox töhfə verdiyini dəyişdirə bilər. Xüsusilə, iki həddindən artıq tezlikdə t-LTP, GluN2B alt bölməsini ehtiva edən NMDAR-lardan daha çox töhfə verə bilər, tetanozun səbəb olduğu LTP isə GluN2A alt bölməsini ehtiva edən NMDAR-lardan daha böyük töhfə verə bilər [34] GluN2A alt bölməsinin daha böyük qabiliyyəti. Tetanik LTP induksiyasını idarə etmək üçün NMDAR ehtiva edən modelləşdirmə işindən əlavə dəstək aldı [73]. İnduksiya zamanı stimullaşdırma tezliyinin potensial əhəmiyyəti o deməkdir ki, GluN2A və GluN2B-nin plastiklikdəki rolunu tam araşdırmaq üçün heyvanların davranışında sinaptik dəyişikliklərə səbəb olan fəaliyyət nümunələrinin növlərini daha da araşdırmaq çox vacibdir.

Bununla birlikdə, farmakoloji antaqonistlər yalnız NMDAR -ın ligand bağlama və kanal xüsusiyyətlərini bloklayır və buna görə də farmakoloji tədqiqatlar, sinapsda NMDAR alt birimlərinin fiziki varlığının Ca 2+ axınına vasitəçilik etməkdə əlavə rol oynaya biləcəyini birbaşa həll etmir. Plastiklikdəki ən vacib digər funksiya, çox güman ki, GluN2 CTD tərəfindən yaradılmış birbaşa və dolayı hüceyrədaxili birləşmələrlə əlaqəli ola bilər. GluN2 alt bölmələrini çıxaran və ya dəyişdirən genetik manipulyasiyalar LTP induksiyasında alt bölmənin seçiciliyinin bu qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə yaranıb-yaramayacağına aydınlıq gətirə bilər ki, GluN2B alt bölməsinin CaMKII ilə əlaqəsi sayəsində həlledici rol oynayıb-oynamaması xüsusi maraq doğurur.

CA3 alt sahəsində GluN2B alt bölmələrinin şərti genetik nokautu komissural-CA3 və komissural/assosiasiyalı-CA3 sinapslarında tetanozun yaratdığı LTP-ni ləğv etdi [74]. CA1 və neokorteksdə GluN2B olmayan siçanlarda iki tetaninin yaratdığı LTP pozulmuşdur, lakin bu çatışmazlığı birdən çox tetani verməklə aradan qaldırmaq olar [75]. LTP üzərində daha kiçik bir təsir, ön beyinə xas olan başqa bir GluN2B siçanında görüldü, burada LTP yalnız iki tetani istifadə edən daha güclü bir protokolla deyil, bir cütləşmə protokolu ilə induksiya edildikdə çatışmaz idi [76]. GluN2B səviyyələrinə dolayı təsir göstərən digər genetik manipulyasiyalar da LTP-nin əhəmiyyətli dərəcədə pozulduğunu göstərmişdir. Məsələn, kinesinəbənzər protein KIF17 GluN2B subunit tərkibli NMDAR-ları sinapsa nəql edir və KIF17-ni nokaut edən siçanlar [77] və ya KIF17-də GluN2B-nin yüklənməsini və ya boşaldılmasını pozan mutasiyaları daşıyan siçanlar [78] sinaptik GluN2B-nin azaldığını göstərir. və həmçinin tək tetanozun yaratdığı LTP ləğv edilmiş (KIF17 nokaut) və ya pozulmuş (KIF17 mutant) LTP. Bununla belə, genetik manipulyasiyaların nəticələrini LTP-də GluN2B rolunun sübutu kimi şərh edərkən yadda saxlamaq lazımdır ki, bu cür uzunmüddətli manipulyasiyalar hüceyrə səviyyəsində kompensasiya dəyişikliklərinə səbəb ola bilər, məsələn, digər PSD komponentləri tərəfindən CaMKII-nin artması və ya hətta. şəbəkə səviyyəsində, məsələn, inhibisyonda dəyişikliklər vasitəsilə. Xüsusi qeyd etmək lazımdır ki, GluN2B nokaut xətləri də GluN2A [77,78], GluN1 [74] və ya onurğa sıxlığında [74,75] kiçik azalmalar göstərir. Buna görə GluN2B alt bölmələrinin NMDAR səviyyələrinin tənzimlənməsinə və postsinaptik struktur bütövlüyünə töhfə verməli olduğunu nəzərə alaraq, GluN2B -nin xroniki azalmasından sonra tapılan LTP pozuntularını LTP -də GluN2B CTD -nin bənzərsiz struktur/qarşılıqlı təsir roluna bağlamaq çətindir.

Buna görə də maraqlıdır ki, qısamüddətli manipulyasiyalar, yalnız GluN2B tərkibini azaltsa da, tam genetik nokautlardan daha güclü təsirlər yaratmışdır. Məsələn, RNT müdaxiləsi (RNAi) ilə GluN2B yıxılması, çox güclü LTP protokolundan (dörd tetani) istifadə olunsa da, iki aylıq siçovullarda induksiya olunan LTP-nin böyüklüyündə dərin azalmaya səbəb oldu [79]. LTP, GluN2B-PSD qarşılıqlı təsirini pozan və nəticədə sinaptik GluN2B məzmununun azalmasına səbəb olan membran keçirici GluN2B C-terminal peptidi ilə 2 saat inkübe edilmiş dilimlərdə də ləğv edildi [80]. Buna baxmayaraq, azalmış sinaptik GluN2A [81] və ya GluN2A nokautu [82] olan siçanlar da çoxlu tetani olan daha güclü bir induksiya protokolu ilə bərpa edilə bilən azalmış LTP nümayiş etdirdikləri üçün [83], bu təcrübələr təkcə GluN2B tərəfindən edilən hüceyrədaxili qarşılıqlı təsirlərin bənzərsiz rolu.

Alt vahid-selektiv həddən artıq ifadədən istifadə edən əks təcrübələr göstərir ki, LTP böyüklər [84] və yaşlı [85] siçanlarda və yetkin siçovullarda [86] GluN2B-ni artıraraq artır. Sinaptik GluN2B səviyyəsi yüksək olan Cdk5 nokaut siçanları da inkişaf etmiş LTP göstərir [87]. Bunun əksinə olaraq, GluN2A həddindən artıq ifadə edən siçanlar artan LTP göstərmir [88], bu da GluN2B-nin bənzərsiz bir rol oynaya biləcəyini göstərir. Bununla birlikdə, GluN2A vasitəçiliyində cərəyanları olan disbindin sıçanlarında yüksək LTP müşahidə edildi [89], buna görə də GluN2B-ni həddindən artıq ifadə edən gəmiricilərdə inkişaf etmiş LTP-nin, artan NMDAR səbəbiylə Ca 2+ axınının daha yüksək səviyyəsindən qaynaqlandığı tam aydın deyil. -vasitəçi cərəyan və ya GluN2B alt bölməsinin özünün mühüm töhfəsi səbəbindən. Buna görə də, nokaut və həddindən artıq ifadə işlərindən əldə edilən məlumatlar, GluN2B alt biriminin LTP induksiyası üçün əhəmiyyətli olduğunu göstərir, lakin GluN2B-nin sinapsdakı bənzərsiz rolu və ya ümumi eşik effekti arasında inandırıcı şəkildə fərq qoymur. Sonuncu halda, bu genetik manipulyasiyalar nəticəsində yaranan sinaptik NMDAR məzmununun azalması və ya artması induksiya zamanı Ca 2+ axınının miqdarında qeyri-spesifik dəyişikliklər səbəbindən LTP-nin miqyasını dəyişdirəcəkdir.

Bu eşik ehtimalını istisna edərək GluN2B üçün bənzərsiz bir rol nümayiş etdirmək cəhdi əvəzinə, tədqiqatlar GluN2B alt birliyinin fərqləndirici xüsusiyyətlərini, xüsusən də hüceyrədaxili qarşılıqlı təsirlərini manipulyasiya etməyə yönəltdi. LTP -də GluN2B və CaMKII arasındakı qarşılıqlı əlaqənin bənzərsiz əhəmiyyətli rolunun ən inandırıcı sübutu, bu əlaqəni birbaşa pozan təcrübələrdən gəlir. İlk məlumatlar Barria & amp Malinow [50] tərəfindən işdən alındı ​​və LTP -nin CaMKII -yə bağlanması pozulmuş bir GluN2B quruluşu ilə transfekte edilmiş orqanotipik hipokampal dilimlərdə bloklandığını göstərdilər. Üstəlik, sinaptik NMDAR məzmununun GluN2B -dən GluN2A -ya keçməsini təmin edən rekombinant GluN2A -nın transfecting səbəbiylə meydana gələn LTP dəyərsizləşməsi, CaMKII -ni bağlama qabiliyyəti ilə mutasiya edilmiş bir GluN2A formasını transfeksiya etməklə yaxşılaşdırıla bilər [50]. Bu daha da göstərir ki, yabanı tipli GluN2B-nin vacib bir funksiyası sinapsda kifayət qədər CaMKII saxlamaqdır. Bu tapıntılar o vaxtdan bəri həm tetanik, həm də 10 Hz protokolu [51] tərəfindən induksiya edilən GluN2B-CaMKII qarşılıqlı təsirini pozan LTP-ni zəiflədən induksiya edilə bilən mutasiyaya, GluN2B-CaMKII-ni azaldan iki nöqtəli mutasiyaya malik siçanlara da genişləndi. qarşılıqlı təsir də iki tetaninin səbəb olduğu LTP-də böyük azalma göstərdi [90]. Bu qarşılıqlı əlaqə hər iki komponent tərəfindən tənzimlənir, çünki əvvəlcə GluN2B -CaMKII assosiasiyasını pozan CaMKII -ni inhibə edir, 2 saat ərzində sinaptik GluN2B tərkibinin aşağı tənzimlənməsinə və LTP -də eyni vaxtda pozulmasına gətirib çıxarır [80]. CaMKII inhibisyonu aradan qaldırıldı və LTP induksiyasından əvvəl CaMKII kinaz aktivliyi bərpa edildi və buna görə Gardoni tərəfindən müşahidə edilən LTP çatışmazlığı və s. [80] dəyişdirilmiş sinaptik subunit tərkibinə aid edilə bilər.

GluN2B -CaMKII qarşılıqlı təsirinin LTP üçün bu qədər vacib olmasının bir səbəbi, AMPAR -lara təsiri ola bilər. AMPAR -ın daxil edilməsi üçün GluA1 üzərində Ser831 -in fosforlaşması lazım ola bilər və GluN2B -CaMKII qarşılıqlı əlaqəsi bloklandıqda [90] bu fosforlaşma baş vermir ki, bu da sinaptik möhkəmlənməni maneə törədə bilər. Beləliklə, CaMKII -yə olan güclü yaxınlığı sayəsində GluN2B -nin ion kanalı funksiyasına əlavə olaraq sinapsda xüsusi rol oynaya biləcəyi görünür. Bu, Ro 25-6981 ilə GluN2B-nin farmakoloji inhibisyonunun artıq cütləşmədən qaynaqlanan LTP-ni bloklamadığı bir yaşda, GluN2B-nin RNAi sökülməsi ilə LTP-nin pozulduğu zaman xüsusilə aydın idi [91]. Bu fərq GluN2B CNT-nin bənzərsiz bir rolu ilə birbaşa əlaqəli görünür, çünki GluN2B-nin RNAi yıxılmasından və nəticədə LTP dəyərsizləşməsindən sonra, LTP bir RNAi-müqavimətli GluN2B və ya GluN2A quyruğu olan GluN2A chimaera ilə bərpa oluna bilər. GluN2A quyruğu olan GluN2B chimaera [91]. Beləliklə, GluN2B-nin fiziki mövcudluğu Ca 2+ axınına töhfəsindən asılı olmayaraq vacib ola bilər. Bu, GluN2B-nin farmakoloji blokunun müəyyən paradiqmaların yaratdığı LTP-ni pozmamasına baxmayaraq, LTP induksiyasında necə unikal və əsas rol oynaya biləcəyini izah edir.

Ancaq bu, GluN2A CTD -nin LTP -yə heç bir töhfə vermədiyi anlamına gəlmir. Yalnız GluN2A alt birliyi olan NMDAR-ların, Ras-GRF2/Erk Map Kinase yolundan [52] asılı LTP formasını tetikleyebileceği, bənzərsiz qarşılıqlı təsirlərin meydana gələ biləcəyini göstərdi. Həqiqətən də, GluN2A C-terminalının kəsilməsi olan siçan xətti, tetanozun səbəb olduğu LTP pozğunluğunu göstərdi, qalan LTP isə GluN2B-alt birliyi olan NMDAR-lar tərəfindən dəstəklənir [66,92]. Bununla birlikdə, kəsilmə mutasiyası bu siçan xəttində GluN2A səviyyələrində ümumi bir azalmaya və təmiz triheteromerik NMDAR populyasiyasına keçməyə səbəb olduğu üçün, LTP dəyərsizləşməsinin Ca 2+ axınının azalması eşik təsirindən yarandığı mümkündür. GluN2A CTD -nin bənzərsiz bir rolu deyil. Eşik təfsirini dəstəkləyərək, Ca 2+ axınının daha yüksək səviyyələrini təşviq etməsi gözlənilən daha güclü induksiya protokolları həm bu [66], həm də başqa bir araşdırmada [93] GluN2A C-terminal kəsilməsi ilə siçanlarda LTP çatışmazlıqlarını aşa bilər. Beləliklə, LTP induksiyasında GluN2A -nın imtiyazlı rolunun sübutu daha zəifdir.

LTP-də NMDAR alt bölmələrinin seçici rolunu araşdırarkən vacib bir məqam, CA3-CA1 sinapslarının vahid populyasiya olmamasıdır. Hüceyrədənkənar sahədə dəyişikliklər və ya plastisite protokoluna bütün hüceyrə reaksiyası, buna görə də eyni fəaliyyət modelinə fərqli reaksiya verə biləcək heterojen bir sinaps populyasiyasından toplanan dəyişikliklərdir. Struktur görüntüləmə və molekulyar etiketləmə tədqiqatları, hətta böyüklərin beynində də fərqli reseptor imzalarına malik postsinaptik onurğa formasının müxtəlif kateqoriyalarının olduğunu aşkar etdi [94]. Fərdi onurğaların görüntülənməsi göstərdi ki, GluN2B antaqonistləri kiçik tikanlarda glutamatın açılmamış EPSC-lərini və Ca 2+ keçidlərini [38] seçici şəkildə azaldırlar ki, bu da GluN2B-nin bu cür tikanlarda cəmləndiyini göstərir. Bu, xüsusi maraq kəsb edir, çünki xroniki görüntüləmə təcrübələri, LTP induksiya protokolundan sonra bütün onurğaların həcminin artmasına baxmayaraq, bu genişlənmənin yalnız əvvəlcə kiçik kimi təsnif edilən onurğalarda qorunub saxlanıldığını, digərlərində isə keçici olduğunu ortaya qoydu [95]. Bu, fərqli NMDAR alt birliyi kompozisiyalarına malik olan bu fərqli tikan növlərinin, plastiklik proseslərində fərqli şəkildə iştirak edə biləcəyini və beləliklə, hətta yetkin beyində də müstəqil rol oynaya biləcəyini göstərir. Buna görə də, sinaps quruluşu və kompozisiyasındakı dəyişkənliyi istifadə etmək, NMDAR alt bölmələrinin LTP -də və ümumiyyətlə məlumat emalında rolunu öyrənmək üçün səmərəli əlavə bir yanaşma ola bilər. Elektron mikroskopiya və immunobelinqlər göstərdi ki, bu müxtəlif onurğa populyasiyaları xüsusi olaraq yetkin siçan beynində asimmetrik olaraq paylanmışdır, sol CA3-dən daxil olan postsinaptik CA1 tikanları əsasən kiçikdir və GluN2B subunit tərkibli NMDAR-larla zəngindir, sağdan isə CA3-dən daxil olanlar. AMPAR-larda daha böyük və zəngin olmağa meyllidirlər [94,96]. Bu, fərqli GluN2B məzmunu ilə bu fərqli onurğa tiplərinin, GluN2B alt bölmələrinin LTP induksiyası üçün xüsusilə vacib olduğu hipotezini sınamaq üçün optogenetik olaraq hədəf alınmasına imkan verdi. CaMKII-Cre siçanlarının sol və ya sağ CA3-ə Cre-dən asılı bir təşviqçinin nəzarəti altında kanalrhodopsin-2 (ChR2) enjekte edilərək, CA1-ə sol və ya sağ həyəcan verici CA3 girişi seçmə şəkildə cəlb edilə bilər. Müəyyən edilmişdir ki, yalnız sol CA3-CA1 sinapsları sünbül vaxtından asılı və ya teta əsaslı protokollar tərəfindən induksiya edilən LTP-ni göstərmişdir [69]. Üstəlik, bu, çox güman ki, sol CA3 proyeksiyalarını alan onurğaların daha yüksək GluN2B tərkibinin nəticəsidir, çünki Ro 25-6981 sol enjeksiyonlu siçanlarda NMDAR vasitəsi ilə cərəyanın daha çox azalmasına səbəb olur və eyni zamanda müşahidə olunan plastisiyanı da maneə törədir [69].Bəzi GluN2B, düzgün CA3-CA1 sinapslarında mövcud olsa da, LTP-ni ifadə edə bilmədiklərini, onlarda saxlanıla biləcək maksimum sinaptik gücdə olduqlarını izah etdi. Piramidal neyronların kifayət qədər yüksək tezlikdə idarə edilməsində ChR2 kinetikasının mövcud məhdudiyyətləri bunun birbaşa sınaqdan keçirilməsinə mane olsa da, tetanozun səbəb olduğu LTP kimi daha güclü induksiya paradiqmalarından sonra oxşar asimmetriyanın aşkar edilib-edilmədiyini yoxlamaq maraqlı olacaq.

Xülasə (şəkil 1)bMövcud dəlillərdən əldə edilən ən əsaslı nəticə ondan ibarətdir ki, həm GluN2A, həm də GluN2B subunitləri LTP-ni induksiya etmək üçün lazımi Ca 2+ axınını dəstəkləyə bilər. Bununla birlikdə, bu Ca 2+ axınının vasitəçiliyində hansı alt birliyin üstünlük təşkil etməsi və beləliklə LTP induksiyasına daha çox töhfə verməsi protokoldan və inkişaf mərhələsindən asılıdır, çünki sonuncusu postsinaptik onurğada subunit bolluğuna təsir göstərir. NMDAR -ların kifayət qədər Ca 2+ axınını dəstəkləyə biləcəyi təqdirdə, GluN2B alt birimi CaMKII ilə əlaqəsi olduğu üçün bənzərsiz bir əlavə rol oynayır. Bu qarşılıqlı əlaqə CaMKII-ni PSD-də Ca 2+ axınının yaxınlığında hədəfləyir və həmçinin LTP induksiya protokolundan sonra işə götürülən əlavə aktivləşdirilmiş CaMKII üçün bağlama yeri təmin edir. Nəhayət, GluN2B, CaMKII aktivləşdirilməsini qorumağa və LTP ifadəsinə vasitəçilik edən aşağı axın yollarını tetiklemesine imkan verən hüceyrə substratlarının yaxınlığında PSD -də lokallaşdırmağa kömək edir.

(c) Uzun müddətli depressiya

GluN2B alt biriminin LTP induksiyasına əhəmiyyətli bir töhfə verə biləcəyi ehtimalını nəzərə alsaq, NMDAR-dan asılı olan LTD-nin əks tərəfi gözlənilə bilər. Bununla belə, LTD-nin NMDAR alt bölməsindən asılılığına dair tədqiqatlar LTP üçün olanlardan daha ziddiyyətli nəticələr çıxarıb və bu, birləşdirici nəticələr çıxarmağı çətinləşdirir. Fərqli tapıntı növləri aşağıda göstərilmişdir və mübahisələr üçün mümkün izahatlar verilmişdir. Bu sahədəki böyük bir komplikasiya, LTD induksiyasının inkişaf yaşından güclü asılılığıdır, çünki yaşda kiçik dəyişikliklər LTD -nin böyüklüyünə və ya hətta mövcudluğuna təsir göstərir [97]. Buna baxmayaraq, bu, xüsusən inkişaf dövründə alt birim ifadəsinin dəyişən modelini nəzərə alaraq, cəlb olunan mexanizmlər haqqında məlumat verə bilər [20,30]. Çox az tədqiqat, hipokampdakı sünbül vaxtına bağlı LTD-də subunitlərin iştirakını araşdırdı və buna görə də aşağıdakı müzakirə aşağı tezlikli induksiyalı LTD üzərində olacaq. Buna baxmayaraq, LTD-nin bu formasını araşdıran qruplar, çox oxşar eksperimental preparatlardan istifadə etmələrinə baxmayaraq, tez-tez alt vahidin spesifikliyi ilə bağlı ziddiyyətli nəticələr çıxarmışlar. Məsələn, bəzi farmakologiyaya əsaslanan tədqiqatlar, LTP-ni bloklayan NVP konsentrasiyasının mədəniyyətdə [71], kəskin dilimlərdə [60] və ya LTD-ni pozmadığını müəyyən etmişdir. in vivo [68], LTD induksiyası üçün GluN2A alt bölmələrinin tələb olunmadığını irəli sürür. Əksinə, digər tədqiqatlar LTP -ni pozan NVP konsentrasiyalarının LTD -ni də blokladığını aşkar etdi [61,65]. NVP-nin LTP-ni maneə törədən NMDAR vasitəçiliyi ilə cərəyanın əhəmiyyətli dərəcədə azalmasına səbəb olması mümkündür və istifadə olunan dəqiq konsentrasiyalardan asılı olaraq LTD-yə vasitəçilik edən aşağı axın molekulyar kaskadlarını işə salmaq üçün kifayət qədər Ca 2+ axını qalır. Eksperimental nəticələrin təyin olunmasında antaqonist konsentrasiyasının əhəmiyyəti Foxun tapıntıları ilə göstərilmişdir və b. [67], LTP -ni bloklayan intraperitoneal olaraq tətbiq olunan iki NVP konsentrasiyasından in vivo, yalnız yüksək konsentrasiyası LTD -ni blok etdi. Ümumiyyətlə, buna görə də, GluN2A alt birimlərinin fizioloji şəraitdə LTD induksiyası ilə nə dərəcədə məşğul olduqları hələ aydın deyil, lakin şübhəsiz ki, onların məcburi və ya unikal rol oynadığına dair heç bir farmakoloji dəlil yoxdur.

LTD-də GluN2B subunit tərkibli NMDAR-ların mümkün roluna xüsusi diqqət yetirilmişdir. Bəzi qruplar müəyyən edirlər ki, GluN2B-ə xas olan Ro 25-6981 antaqonistləri və ifenprodil kəskin dilimlərdə [60,64], mədəniyyətdə [71] və LTD-ni bloklayır. in vivo [67,68], NVP ilə daha böyük bir NMDAR vasitəçiliyi ilə cərəyanın azalması heç bir təsir göstərməsə belə [60,68,71]. Bununla belə, GluN2A antaqonizmi ilə bağlı bildirilən ziddiyyətli tapıntılarda olduğu kimi, bir çox digər tədqiqatlar GluN2B antaqonistlərinin ekvivalent və ya daha yüksək konsentrasiyalarından istifadə etməsinə baxmayaraq, eyni manipulyasiyanın kəskin dilimlərdə LTD induksiyasına heç bir təsir göstərmədiyini müəyyən etmişdir [61,65,98,99]. İstifadə olunan dilim istiqaməti, Bartlettdən bəri bu tapıntılar arasındakı uyğunsuzluğu qismən izah edə bilər və b. [100] koronal dilimlərin ([60]-da istifadə edildiyi kimi) Ro 25-6981-ə həssas olan LTD formasına malik olduğunu, sagittal dilimlərin isə ([65]-də istifadə edildiyi kimi) GluN2B-dən asılı olmayan LTD formasına malik olduğunu aşkar etmişlər. sagittal kəsmə açısı olan xolinergik proyeksiyaların daha güclü qorunması sayəsində. Həqiqətən, onlar muskarinik asetilkolin reseptorlarını bloklayanda, GluN2B-dən asılı LTD-nin maskasını çıxardı [100]. Tədqiqatların LTD-nin GluN2B-asılılığını [53,64] və ya GluN2B-müstəqilliyini [98,99] tapdığı transvers bucaqda kəsilmiş dilimlərdə tapılan ziddiyyətli nəticələr xolinergik liflərin bütövlüyünün incə dəyişkənliyi ilə nəticələnə bilər.

LTD-nin GluN2B antaqonizminə həssaslığının dəyişkənliyinə səbəb olan digər bir faktor, ekstrasinaptik GluN2B alt birliyi olan NMDAR-ların işə götürülmə dərəcəsi ola bilər. Ənənəvi aşağı tezlikli induksiya protokolu bəzən glutamat-udma inhibitorunun tətbiqi ilə birləşdirilir üç-β-hidroksiaspartat (TBOA), ehtimal ki, ekstrasinaptik reseptor populyasiyasının aktivləşməsini artıracaq. TBOA tətbiqindən sonra ziddiyyətli təsirlər bildirildi: LTD-də GluN2B iştirakına təsir etmədi [65], GluN2B-dən asılı LTD [101] istehsal etdi və ya hətta LTD-nin böyüklüyünü [98] azaltdı. Son tapıntı göstərir ki, ekstrasinaptik, ola bilsin ki, GluN2B alt vahidi olan NMDAR-lar bəzi eksperimental şəraitdə LTD-də mənfi modulyasiya rolunu oynaya bilər. Bu təklif GluN2B ifenprodil blokunun həqiqətən LTD -nin böyüklüyünü artırdığını göstərən bir araşdırma ilə dəstəklənir [102]. Bununla birlikdə, bu tapıntılar arasındakı uyğunsuzluğun rəqabət qabiliyyəti olmayan GluN2B antaqonistlərinin kompleks hərəkət üsulundan qaynaqlandığını istisna etmək olmaz, çünki blokunun əhatə dairəsi agonist konsentrasiyasına görə dəyişir [57] və bu konsentrasiyalar çox güman ki, daha dəyişkəndir. glutamatın qəbulu bloklanır. Ümumilikdə, buna görə də, ziddiyyətli tapıntılar LTD-də GluN2B subunit tərkibli NMDAR-ların oynadığı rolun dəqiq xarakterini ifadə edir və LTD-nin induksiyası eksperimental şəraitə xüsusilə həssas ola bilər.

Transgenik yanaşmalar da LTD-də hər iki alt bölmənin unikal rolu üçün qəti dəstək verməmişdir və əslində, tapıntıların əksəriyyəti mənfi olmuşdur. GluN2B-nin PSD-95 ilə birləşməsini kəskin şəkildə pozmaqla əldə edilən sinaptik GluN2B səviyyəsindəki azalma, LTP-ni pozmaq üçün kifayət qədər olmasına baxmayaraq LTD-ni dəyişmədi [80]. GluN2A açılan siçan da LTD dəyərsizləşməsini göstərməmişdir, eyni araşdırmada LTP-də heç bir azalma aşkar edilməmişdir [103]. Bundan əlavə, GluN2B-nin həddən artıq ifadəsi ənənəvi 1 Hz stimulyasiya ilə induksiya olunan LTD [86]-nın böyüklüyünə təsir etmədi və nə birbaşa [88], nə də dolayı [89] GluN2A həddindən artıq ifadə etmədi, baxmayaraq ki, GluN2A həddindən artıq ifadəsi 3 və ya 5 Hz stimullaşdırma ilə səbəb olan LTD-ni azaltdı. LTP təsir etmədən [88]. Yeganə aydın müsbət tapıntılar, GluN2B siçanlarının [75] və KIF17-in sinaptik GluN2B-nin [77] azalmasına səbəb olan siçanların hər ikisinin LTD-nin dəyərinin aşağı olmasıdır. Bununla belə, bu, LTD-də GluN2B-nin subunit-selektiv rolunun sübutu deyil, çünki bu manipulyasiyalar LTP-nin azalmasına da səbəb olub. Ümumiyyətlə, hər iki alt birliyin LTD induksiyasında əvəzedilməz rol oynadığına dair transgenik yanaşmalardan aydın bir dəlil yoxdur, baxmayaraq ki, pozuntular daha çox GluN2B-ə aid manipulyasiyalarla əlaqələndirilir.

Son ehtimal odur ki, bir alt bölmə özünəməxsus hüceyrədaxili qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə LTD-yə daha mühüm töhfə verir. Bu, Ca 2+ axınının sinaptik gücün azalmasına vasitəçilik edən aşağı axın yollarına birləşməsini asanlaşdırdığı üçün ola bilər. Alternativ olaraq, NMDAR-lar LTD-də fərqli rol oynaya bilər, burada onların aktivləşdirilməsi hələ də aşağı axın siqnal kaskadlarını işə salmaq üçün tələb olunur, lakin Ca 2+ axınına vasitəçilik etmir. Bu sonuncu təklifin sübutu NMDAR-dan asılı LTD-nin NMDAR vasitəçiliyi ilə ion axınının bloklanmasına baxmayaraq hələ də induksiya oluna biləcəyinin nümayişidir [104]. Bu onu göstərir ki, NMDAR-lar vasitəsilə Ca 2+ axını deyil, bazal Ca 2+ səviyyəsi LTD induksiyası üçün zəruridir və subunit-spesifik farmakoloji antaqonistlərdən istifadə edilən tədqiqatlardan nə üçün heç bir aydın nəticələrin ortaya çıxmadığını izah edə bilər. Bu, həmçinin NMDAR-ların hər hansı subunit-selektiv funksiyasının yalnız onların unikal hüceyrədaxili assosiasiyaları vasitəsilə ortaya çıxacağını nəzərdə tutur. Təkcə LTP induksiyasında CaMKII tələbi ilə proqnozlaşdırıldığı kimi, GluN2B-CaMKII assosiasiyasının genetik pozulması LTD-yə xələl gətirməmişdir [51]. Bununla belə, vacib ola biləcək digər qarşılıqlı əlaqələr müəyyən edilmişdir. Məsələn, tək LTD, p75 nörotrofin reseptorunun genetik nokautu olan siçanlarda pozulmuşdur [105]. Bu çatışmazlıqdan məsul olan spesifik mexanizmin beyin mənşəli neyrotrofik faktorun LTD-ni işə salmaq üçün p75 nörotrofin reseptorunu aktivləşdirə bilməməsi və siçan xəttinin də GluN2B səviyyələrində ümumi bir azalma olduğu üçün mümkün bir siqnal rolunu ortaya qoyduğu bildirildi. GluN2B -dən. Digər vacib bir əlaqə, Ras-GRF1 və GluN2B CTD arasında ola bilər, çünki LTD Ras-GRF1 sökülmüş siçanlarda pozulur [53]. Ras-GRF1 səviyyəsi fizioloji şəraitdə yaranan depressiyanın növünü müəyyən edə bilər, çünki bu assosiasiya üstünlük təşkil etdikdə LTD GluN2B-dən asılıdır [100]. Bundan əlavə, asetilkolin konsentrasiyası, GluN2B-Ras-GRF1 qarşılıqlı təsirinin səviyyəsi ilə tərs əlaqələndirilir [100], bu, xolinerjik sistemin aktivliyinin LTD induksiyasının alt birimdən asılılığını modulyasiya edə biləcəyini göstərir.

Xülasə olaraq, məlumatlar qeyri -müəyyəndir, lakin nə GluN2A, nə də GluN2B alt birliyi LTD -nin induksiyasında məcburi rol oynamır. Buna baxmayaraq, GluN2B alt bölməsi, bəlkə də LTD-ni modulyasiya edən və ya vasitəçilik edən yolların komponentləri ilə unikal assosiasiyalarına görə daha tez-tez təsirlənmişdir.

5. Metaplastiklik

Sinapsın bazal vəziyyəti çox güman ki, müəyyən bir girişə cavab olaraq onun dəyişikliklərinin xarakterini müəyyən etməkdə həlledici rol oynayacaq. Hətta LTP ifadə mexanizminin əvvəlcədən və ya postsinaptik olmasına təsir göstərdiyi irəli sürülmüşdür [24]. Nəzərə alsaq ki, plastisiyanın hər iki istiqamətinin induksiyasında tam subunit seçiciliyi üçün inandırıcı dəlil yoxdur, GluN2A və GluN2B alt bölmələrinin sinapsı LTP və ya LTD induksiyasına yönəldərək daha incə rol oynaması düşünülə bilər. Beləliklə, hər iki alt bölmənin nisbi və ya mütləq səviyyələrinin dəyişdirilməsinin gələcək plastikliyin induksiyasına təsir etmək üçün sinapsın bazal vəziyyətini kifayət qədər dəyişib-dəyişdirmədiyi araşdırılmışdır.

İnkişaf zamanı ön beyində aktivlikdən asılı olan dəyişikliklər ön beyində baş verir [20,30] və hətta qısa bir sinir aktivliyi tarixi gənc gəmiricilərdə CA3-CA1 sinapsında alt birim balansını dəyişə bilər [106-108]. . Subunit tərkibindəki dəyişikliklərin sinapsın sonrakı fəaliyyətə reaksiyasını dəyişdirib-dəyişdirmədiyini araşdırmaq üçün Xu və b. [109] sinapsın "astarlanması" üçün müxtəlif tezliklərdə 600 aşağı intensivlikli impuls istifadə etdi, bu astarlama sinaptik ağırlıqları dəyişdirmək üçün kifayət etmədi, lakin GluN2A/GluN2B nisbətini dəyişdirdi. Bu astarlamadan sonra müxtəlif plastiklik protokolları tətbiq edildi. GluN2A/GluN2B nisbətini azaldan aşağı tezlikli astarlama ilə LTP böyüklüyü artırıldı və LTD azaldıldı. Əksinə, sinaps GluN2A/GluN2B nisbətini artıran yüksək tezlikli stimulyasiya ilə astarlansaydı, yüksəlmiş LTD və basdırılmış LTP görüldü. Onlar həmçinin "sadəlövh" bir dilimdə sinaptik çəkiləri dəyişdirməyən plastiklik protokolundan istifadə etdilər və bu hədd protokolunun aşağı tezlikli astarlamadan əvvəl LTP-yə səbəb ola biləcəyini, lakin yüksək tezlikli astarlamadan əvvəl LTD-yə səbəb ola biləcəyini tapdılar. Üstəlik, bu hədd protokolunun nəticəsinə ilkin təsir, farmakoloji antaqonistlər tərəfindən qismən blokdan istifadə etməklə GluN2A/GluN2B nisbətinin birbaşa manipulyasiyası ilə təkrarlana bilər (AP5 ilə titrləşdirilmiş konsentrasiyalara malikdir ki, NMDAR vasitəsi ilə cərəyan azalması özünü izah edə bilməz. təsiri) [109]. Bu nəticə, sinapsın nisbi GluN2B məzmununu artıran sinaptik fəaliyyətin onu LTP -yə yönəltdiyini, GluN2A -nın nisbi artmasının LTD -nin induksiyasını təşviq etdiyini göstərir. Əvvəlki fəaliyyətin təsiri də tək sinaps səviyyəsində ölçülür [110]. Presinaptik veziküllərin buraxılmasını bloklayan konstruksiya ilə neyron mədəniyyətlərin seyrək transfeksiyası bəzi girişləri susdurmaq üçün istifadə edildi, biri susdurulmuş giriş, digəri isə aktiv giriş ilə ölçüyə uyğun postsinaptik tikanlar, sonra glutamatın açılmasına əsaslanan LTP induksiya protokoluna məruz qaldı. . Susdurulmuş sinapslar LTP və aşağı intensivlik protokolu ilə onurğanın böyüməsini göstərdi, halbuki aktiv giriş qəbul edən onurğalarda LTP və struktur dəyişiklikləri yaratmaq üçün daha yüksək sayda və daha uzun müddət glutamatın açılması hadisələri tələb olunurdu. Üstəlik, GluN2B-nin vasitəçilik etdiyi cərəyan səssiz sinapslarda artdığından potensiyalaşdırma meylinin artmasına vasitəçilik edirdi [110]. Buna görə də, bu iki araşdırma, sinaptik GluN2B məzmununda nisbi və ya mütləq bir artıma səbəb olan metaplastik dəyişikliklərin LTP -yə qarşı bir sinaps yaratacağını göstərir.

Neyromodülatör faktorların, sinapsın müəyyən bir fəaliyyət modelinə necə reaksiya verdiyini təsir etdiyi bilinir və sinapsın bazal vəziyyətini subunit-selektiv şəkildə dəyişməsi mümkündür. Dopamin səviyyələri plastisiyanı modullaşdırır, məsələn, dopamin tətbiqi D-ni əhatə edən bir kaskad vasitəsilə tetanozun səbəb olduğu LTP-ni artırdı.1/5 reseptor, PKA və Src ailəsi kinazları [111]. Bu LTP genişləndirilməsi Ro 25-6981 [111] tərəfindən bloklandı, bu da fəaliyyətə əsaslanan metaplastiklik tədqiqatlarının nəticələrinə uyğun olaraq GluN2B alt birliyi olan NMDAR-ların artmasının dopamindən asılı metaplastikliyin ifadə mexanizmi ola biləcəyini göstərir. Bununla birlikdə, bütün metaplastiklik tədqiqatları GluN2B -nin LTP -ni təşviq etdiyi qənaətinə gəlməmişdir. Src kinazlar ailəsində G zülalı ilə birləşmiş reseptorların və onların aşağı axın aktuatorlarının aktivləşdirilməsi yolu ilə işə salınma göstərdi ki, GluN2B-ni artıran metaplastik dəyişikliklər yuxarıda qeyd olunan tədqiqatlarla müqayisədə plastisiyaya əks təsir göstərir [112]. Bunun əvəzinə, Src kinazının (hipofiz adenilat siklaz aktivləşdirici peptid 1 reseptoru PAC1R tərəfindən aktivləşdirilmiş) GluN2A-nı fosforiləşdirdiyi və bununla da GluN2A ilə əlaqəli cərəyanları artırdığı, Fyn kinazının (D tərəfindən aktivləşdirildiyi) göstərildi.1/5 reseptor) fosforlu GluN2B ilə GluN2B vasitəsi ilə gedən cərəyanları gücləndirir. Öz növbəsində, bu, bir sıra fərqli tezlik induksiya protokollarına reaksiyanı təsir etdi: LTD-dən LTP induksiyasına keçid əvvəlcədən dərman müalicəsi olmadan 10-20 Hz-də baş verdi, lakin PAC1R-aktivləşdirici dərmanlara məruz qalma və bunun nəticəsində GluN2A-nın artması LTP-nin əksinə daha aşağı tezliklərdə induksiya edildikdə, LTP induksiya həddi D olarsa daha yüksək tezliklərə keçirildi1/5 reseptor aktivləşdirildi və buna görə GluN2B artırıldı [112]. Bu, GluN2A -nın LTP induksiyasını təşviq etdiyini irəli sürdü. Ümumiyyətlə, metaplastikliklə bağlı əlavə araşdırmalar, neyronal aktivliyin sinaptik ağırlıqları necə dəyişə biləcəyini və NMDAR alt birliyinin tərkibindəki dəyişikliklərin sinaptik astarlama effektlərinə bir töhfə olub olmadığını anlamağa kömək edə bilər. Öyrənmə və yaddaşın təcrid olunmuş şəkildə deyil, əvvəlki neyronal fəaliyyət və neyromodulyator giriş fonunda baş verdiyini nəzərə alsaq bu xüsusilə vacibdir.

6. Davranışda NMDA reseptor alt bölmələri

Sinaptik plastiklik öyrənmə və yaddaş üçün çox geniş yayılmış bir mobil model sayılır [3,113] və müəyyən öyrənmə və yaddaş formalarında NMDAR -ların əhəmiyyətli rolunun erkən əlamətləri var idi [4,5]. LTP və LTD-yə subunit-seçici töhfə olub-olmadığı ilə bağlı araşdırmalara paralel olaraq, GluN2A və GluN2B alt bölmələrinin fərqli idrak tələbləri olan davranış vəzifələri üçün vacib olub-olmadığını sorğu-suala çəkmək üçün alt hissəyə xas manipulyasiyalar da istifadə edilmişdir. Bəzi hallarda, plastisiyanın bir istiqamətindəki pozğunluqlar performans kəsirləri ilə əlaqələndirilə bilər.

GluN2A sökülmüş siçanlar davranışla öyrənilən ilk insanlar idi. Bu siçanların ilkin xarakteristikası C57BL/6 nəzarətləri ilə müqayisədə nisbətən geniş yayılmış yaddaş çatışmazlıqlarını təklif edirdi [82], lakin bu, daha sonra onların genetik fonunda qalan CBA gərginliyinin yüksək dərəcəsi ilə əlaqələndirildi, Morris suyunda daha pis performans göstərdiyi bilinən bir xətt. labirent (MWM) vəzifəsi [114]. Bir zamanlar demək olar ki, saf C57 fonunda tapılan davranış çatışmazlıqları nisbətən məhdud idi: GluN2A siçanları və GluN2A CTD olmayan siçanlar uzun müddətli yaddaş çatışmazlığına dair heç bir dəlil göstərməmişdi, çünki siçanlar bir sıra vəzifələrdə əldə edilmiş məkan vəzifələrində pozulmamışdır. günlər (MWM və radial qol labirint) [115]. NMDAR protein kompleksinin bir komponenti olan Neuropilin və tolloidə bənzər protein 1 (Neto1) nokautu olan siçanlar, PSD-də GluN2A-nın təxminən üçdə bir azalmasına və LTP dəyərsizləşməsinə malikdir, eyni zamanda MWM-ni normal nisbət [81]. Bundan əlavə, farmakoloji manipulyasiyalar Ge oxşar bir nəticə verdi və b. [68], LTP-ni pozan bir konsentrasiyada intraperitoneal olaraq vurulan GluN2A alt birliyinə üstünlük verən antagonist NVP istifadə etdi. in vivo, və MWM əldə etmə və ya konsolidasiyada NVP ilə müalicə olunan siçovulların heç bir çatışmazlığı görmədi. Beləliklə, GluN2A tədricən əldə edilən uzunmüddətli yaddaş vəzifələri üçün lazımlı görünmür.

Bununla belə, GluN2A manipulyasiyaları qısa müddətli məkan yaddaş çatışmazlığı ilə əlaqələndirilmişdir, çünki GluN2A nokaut siçanları və GluN2A CTD-si olmayan siçanlar yerinə uyğun gəlməyən T-labirint tapşırığında və həmçinin onları ayırd etmək qabiliyyətində zəifləmişlər. silahlar, radial qol labirintinin sınanması çərçivəsində nə qədər yaxın ziyarət edildiklərinə əsaslanır [115]. Qısa müddətli məkan yaddaşında GluN2A rolunun daha da dəstəklənməsi üçün, NVP-nin CA1-ə tökülməsi gecikmiş T-labirent tapşırığının performansını pozur [116]. Həmçinin görünür ki, GluN2A subunit tərkibli NMDAR-lar kontekst və ya obyekt təsvirlərinin sürətli formalaşmasına kömək edə bilər. LTP induksiyası üçün artan bir eşikə malik olan GluN2A sıçanları, hipokampa bağlı kontekstual qorxu kondisioner paradiqmasında, vəzifə tələbləri şok çatdırılmadan əvvəl kontekstə məruz qalma [83] artırılarkən pozulur. tez bir kontekstin formalaşması.Neto1 sökülən siçanlar yerdəyişmiş bir obyekt tanıma vəzifəsində pozulmuşdu, lakin yeni bir obyekt tanıma vəzifəsində [81] hər iki vəzifə bir obyekt haqqında nisbətən sürətli öyrənmə tələb edir, ancaq yalnız yerdəyişmə vəzifəsinin aydın bir məkan komponenti və aydın hipokampal iştirakı vardır. (lakin həm də bax [117]). Ümumilikdə, GluN2A olmayan və ya azaldılmış siçanlar qısamüddətli yaddaş və məkan məlumatının sürətlə mənimsənilməsi ilə məhdudlaşan bəzi öyrənmə pozğunluqlarını göstərir. Bunun GluN2A-nın xüsusi rolu və ya azalmış NMDAR-vasitəçili cərəyanların qeyri-spesifik təsiri olub-olmadığını yoxlamaq üçün (xüsusilə NVP seçiciliyinin olmaması nəzərə alınmaqla), bu nəticələr ekvivalent genetik və farmakoloji manipulyasiyalara malik siçanların nəticələri ilə müqayisə edilməlidir. GluN2B səviyyələri.

GluN2A alt biriminin farmakoloji və genetik manipulyasiyalarının yuxarıda təsvir edilənlərə bənzər pozuntular meydana gətirdiyinə dair əhəmiyyətli dəlillər vardır ki, bu da GluN2A çatışmazlığı olan siçanlarda müşahidə olunan qısa müddətli yaddaş çatışmazlıqlarının əsasən NMDAR-vasitəçiliyində olan cərəyanın ümumi azalması səbəbindən olduğunu göstərir. Məsələn, CA1-in piramidal neyronlarında və hipokampusun dişli girusunda (DG) postnatal GluN2B nokautu olan siçanlar qlobal GluN2A siçanlarına çox oxşar pozğunluqlar, yəni kortəbii yerdəyişmədə qısamüddətli məkan yaddaş çatışmazlığı göstərdi. T-labirent lakin MWM-də normal performans [76]. Bu tapıntı siçovulların farmakoloji məlumatları ilə təsdiqlənir, burada Ro 25-6981 və ya ifenprodilin hipokampusun CA1 bölgəsinə infuziyası qısamüddətli məkan yaddaşı tələb edən tapşırıqlarda performansı zəiflətdi, baxmayaraq ki, uzunmüddətli yaddaş sınaqdan keçirilməmişdir [116]. Siçovullar 5 və 30 saniyəlik gecikmələrlə T-labirentin gecikdirilmiş işində zəifləmişlər, ancaq 30 saniyəlik gecikmədən sonra nəzarətdən daha əhəmiyyətli dərəcədə daha çox qələbə dəyişmə səhvləri etmişlər. Siçovullar, gecikmə ilə uyğunlaşan su labirent tapşırığının 2-ci sınağında daha uzun qaçış gecikmələrinə sahib idi, ancaq tutma aralığı 30 saniyə deyil, 10 dəq [116]. Bu iki tapıntı, GluN2B alt bölmələrinin gecikmə müddətləri artdıqca daha əhəmiyyətli ola biləcəyini göstərir. Qeyd etmək lazımdır ki, NMDARların farmakoloji antaqonizmi interneuronlara da təsir edəcək [59]. Ümumiyyətlə, GluN2A və ya GluN2B alt bölməsini çıxaran və ya azaldan manipulyasiyalardan sonra müşahidə olunan oxşar qısamüddətli yaddaş pozğunluqları, bu fenotipin hər iki alt bölmənin seçici töhfəsi deyil, əsasən NMDAR vasitəçiliyi ilə əlaqəli cərəyanların azalması ilə əlaqəli olduğunu göstərir.

Buna baxmayaraq, GluN2B alt bölmələrinin qısa müddətli yaddaşda GluN2A ilə paylaşılanlara əlavə bir rol oynaya biləcəyinə dair sübutlar var, çünki digər tədqiqatlar GluN2B pozulmasından sonra daha geniş yayılmış pozuntular aşkar etmişdir. Məsələn, nəqliyyat pozğunluğu səbəbiylə sinaptik GluN2B səviyyələrini azaldan KIF17 nokaut siçanları MWM tapşırığında [77,78], uzun gecikmələrlə yeni bir obyekt testi [77] və kontekstli qorxu kondisionerində [77] daha pis çıxış etdilər. ]. CA1 və neokortikal GluN2B siçan xətti MWM əldə etmə, qorxu kondisioneri və T labirintinin spontan alternativində çatışmazlıqlara malik idi [75]. Bununla birlikdə, bu pozğunluqlar hipokampal ekstra çatışmazlıqlara aid ola bilər [76]. Buna görə də, siçovulların hipokampisində RNAi vasitəçiliyi ilə GluN2B-nin vurulmasını ehtiva edən daha kəskin bir manipulyasiyanın da MWM vəzifəsinin daha yavaş alındığını göstərdiyinə əminlik verir [79]. Müəlliflər, yaşlı siçovul populyasiyasında GluN2B səviyyəsi ilə MWM performansı arasında bir əlaqə tapdılar [79]. Bununla belə, GluN2B iştirakının təbiəti bir plastisiya istiqaməti ilə əlaqələndirilə bilməz, çünki RNAi LTP defisitinə səbəb oldu, lakin LTD araşdırılmadı, halbuki yuxarıda qeyd olunan genetik olaraq dəyişdirilmiş siçan xətlərinin hər ikisində həm LTP, həm də LTD-də çatışmazlıqlar var idi. Buna baxmayaraq, bu tədqiqatlar GluN2B-nin GluN2A sökülməsi və ya azalması ilə siçanlarda görülməyən uzun müddətli yaddaşda rol oynaya biləcəyini göstərir, baxmayaraq ki, bu nəticəni təsdiqləmək üçün hipokamp ilə məhdudlaşdırılmış kəskin manipulyasiyalardan istifadə etməklə əlavə tədqiqatlar tələb olunur.

GluN2B -nin öyrənmə və yaddaşdakı bəlkə də bənzərsiz bir rolunu daha da araşdırmaq üçün, bir istiqamətdə elastikliyin selektiv pozulması ilə əlaqəli davranış çatışmazlıqlarını araşdırmaq faydalıdır. LTP üçün CaMKII və GluN2B arasındakı əlaqə zəiflədikdə selektiv bir dəyərsizlik yaranır. Bu manipulyasiyanın həm MWM tapşırığının əldə edilməsində çatışmazlıqlara səbəb olduğu müəyyən edilmişdir ki, bu da uzun məşqlə aradan qaldırıla bilər, həm də siçanların yemlənmiş qolları yadda saxlamalı olduğu səkkiz qollu radial labirintdə gecikmiş fəzada qazanma növbəli tapşırıqda. ilk seans, sonra yemək mükafatını tapmaq üçün növbəti sınaqda onlardan qaçın [51]. Müəlliflər bu çatışmazlığı bir məkan xəritəsinin formalaşmasında dəyərsizləşmə ilə əlaqələndiriblər. CaMKII-GluN2B qarşılıqlı əlaqəsinin fərqli bir şəkildə qurulmuş başqa bir siçan xətti, məşqdən 1-2 saat sonra MWM əldə etmə və sınaq sınağı performansında normal olan daha az davranış pozuntusu göstərdi, lakin maraqlıdır ki, uzun müddətli konsolidasiya nümayiş etdirdi. təhsildən 24 saat sonra bir testdə daha pis performans göstərdikləri üçün çatışmazlıqlar [90].

Bundan əlavə, GluN2A həddindən artıq ifadesinin [88] ardınca görülən pozğunluqların əksinə olaraq, GluN2B həddindən artıq ifadesinin, böyüklər [84] və yaşlı siçanlar [85] və siçovulların [86] performansını kontekst və qorxulu qorxu daxil olmaqla bir test batareyasında yaxşılaşdırdığını göstərmişdir. kondisioner, daha uzun saxlama aralığında obyekt tanıma yaddaşı, MWM əldə etmə və məkan qısa müddətli yaddaş. Deqradasiyasının azalması səbəbindən sinaptik GluN2B-ni artıran Cdk5 nokaut siçanlarının da kontekstdən asılı olan qorxu-kondisioner paradiqmasında kontekstli öyrənməni yaxşılaşdırdığı aşkar edilmişdir [87]. Bütün bu davranış təkmilləşdirmələri LTP-nin artması ilə əlaqələndirildi, LTD isə araşdırıldıqda dəyişməyib [86]. LTP-də alt birliyin spesifikliyi ilə öyrənmə arasındakı əlaqənin daha güclü sübutları, öyrənmə və postsinaptik cavabların eyni vaxtda ölçülə biləcəyi vəzifələrdən gəlir. Valenzuela-Harrington, siçovullarda iz-kondisioner paradiqmadan istifadə edərək və b. [118] bu vəzifənin əldə edilməsinin medial perforant yolun-hipokampın DG sinapsının artan gücü ilə əlaqəli olduğunu göstərdi. Bundan əlavə, Ro 25-6981-in sistemli idarəsi həm tapşırıqların alınmasını, həm də sinaptik gücdəki dəyişiklikləri blokladı. Buna görə də, bəlkə də CaMKII vasitəsilə LTP induksiyasına verdiyi töhfə ilə GluN2B öyrənmə və yaddaşda mühüm rola malikdir.

Bəzi davranış çatışmazlıqları da GluN2B-dən asılı LTD dəyərsizləşməsi ilə əlaqədardır. Ge və b. [68], LTD-ni pozan, lakin LTP-ni pozan siçovullara intraperitoneal olaraq Ro 25-6981 tətbiq etdi. in vivovə MWM tapşırığının əldə edilməsinin bu manipulyasiya ilə pozulmadığını, təlim günündə Ro 25-6981 alan siçovulların konsolidasiya ilə əlaqədar kəsir səbəbindən 24 saat sonra platformanın yerini xatırlaya bilmədiklərini təsbit etdi. Bu pozulmuş performans AMPAR endositozunun qarşısını alan bir peptid inyeksiyası ilə təqlid edilə bilər (Tat-GluA23Y), dəyərsizləşmənin LTD-yə bənzər proseslə bağlı olduğunu göstərir. Bununla belə, alternativ şərh budur ki, bu manipulyasiya şəbəkənin homoeostatik sıfırlanmasını pozdu və bu proses konsolidasiya üçün tələb olunur.

Bir çox qrup tərəfindən bildirilən bir nəticə, LTD ilə geri öyrənmə arasında mümkün bir əlaqədir. Duffy və b. [101], Ro 25-6981-in dərialtı tətbiqinin LTD-ni blokladığını və siçanlarda geri çevrilmə öyrənməni pozduğunu və LTD sınaqdan keçirilməsə də, hipokampusda GluN2B nokautu olan siçanlarda da MWM-də əks öyrənmənin zəif olduğunu aşkar etdi [76]. Siçovullarda GluN2B-dən asılı LTD sadəlövh heyvanlarda induksiya oluna bilməz in vivo, lakin əvvəllər MWM əldə etmiş siçovullar geri dönmə mərhələsində sınaqdan keçirildikdə, heyvanlar MWM təhsili aldıqdan sonra induksiya oluna bilər, bu siçanlar ya Ro 25-6981 ya da Tat-GluA2 ilə müalicə olunur3Y peptid tərs öyrənmədə pozulmuşdur [119]. GluN2B-dən asılı LTD-nin geri çevrilmə öyrənilməsində rolunun daha da dəstəklənməsi üçün d-serinin subkutan administrasiyası ilə LTD-nin gücləndirilməsi siçanların MWM-də geri çevrilmə mərhələsini öyrənmə sürətini artırdı [101], gücləndirilmiş GluN2B- ilə siçan xətti. vasitəçi cərəyanlar MWM tapşırığının əldə edilməsində heç bir irəliləyiş göstərmədi, lakin daha sürətli tərsinə öyrənmə göstərdi [87]. Beləliklə, NMDAR alt bölmələrinin davranışdakı rolunu araşdıran bir çox tədqiqat GluN2B-dən asılı LTD-də dəyərsizləşmə ilə əlaqəli bir "əzm fenotipi" tapdı.

Sinaptik plastisiyanın öyrənmə və yaddaşı dəstəklədiyini irəli sürən bir çox sübut var [4,5,118,120], lakin bu əlaqə hələ həll olunmamışdır [121,122]. Buna görə də, plastikliyin və davranışın əlaqələndirdiyi tədqiqatlar, əsas, ehtimal ki, alt vahid-seçmə mexanizmlərinin məlum olub-olmamasından asılı olmayaraq məlumatlı olmuşdur. Buna baxmayaraq, plastisiya çatışmazlığı ilə öyrənmə və yaddaş pozğunluqları arasındakı əlaqə səbəbkar əlaqəni təmin etmir. Üstəlik, bu cür tədqiqatların burada təsvir edilən eksperimental manipulyasiyaların səbəb ola biləcəyi mümkün kompensasiya mexanizmləri və şəbəkə dəyişiklikləri nəzərə alınmaqla qəti sübutlar təmin etdiyi qənaətinə gəlməkdə ehtiyatlı olmalıyıq. Əlbəttə ki, plastiklik öyrənmə və yaddaşı dəstəkləsə də, biz hələ də bilmirik ki, fərqli idrak tələbləri olan işlərdə hansı plastiklik növləri ilə məşğul olacaq və buna görə də bütün bunları nəzərə alsaq, bu tədqiqatların nəticələrinin təəccüblü olmaması mürəkkəb və çox vaxt ziddiyyətlidir. Bəzi hallarda, plastisiya və tapşırıqların yerinə yetirilməsinin bir istiqamətində dəyərsizləşmə, bəzən isə xüsusi alt bölmələr arasında korrelyasiya aşkar edilmişdir. Bununla belə, eyni zamanda, plastikliyin miqyasında böyük pozulmalara səbəb olan bəzi manipulyasiyalar seçilmiş davranış testlərinə çox az təsir göstərmiş və ya heç bir təsir göstərməmişdir, yalnız tapşırıqların müəyyən aspektlərinə təsir göstərmiş və ya hətta yalnız tapşırıq çətinliyi artdıqda və ya tələblər dəyişdirildikdə, pozğunluğa səbəb olur, bir gecikmə tətbiq etməklə. Siçan CA3-CA1 sinapsındakı GluN2B alt bölməsinin və LTP-nin paylanmasında yuxarıda qeyd olunan yarımkürə asimmetriyası öyrənmə və yaddaşda sinaptik plastisiyanın rolunu daha da aydınlaşdırmağa kömək edə bilər, həmçinin müəyyən bir alt bölmənin iştirakının olub olmadığını müəyyən edə bilər. Bu asimmetriyanın inkişafda necə yarandığı və yetkinlik dövründə necə qorunduğu bilinməsə də, yaddaşın işlənməsində vacib ola biləcəyinə dair sübutlar inversus vicerum pozulmuş asimmetriya göstərən və yaddaş pozğunluqlarını göstərən siçanlar [123].

7. Xülasə

Fərqli GluN2 alt bölmələrinin müxtəlif plastiklik istiqamətlərinə seçici vasitəçilik etməsi fərziyyəsi mövcud tədqiqatlar tərəfindən dəstəklənmir. Xüsusi GluN2A antaqonistlərinin olmaması bu fərziyyənin qəti sınaqdan keçirilməsini qadağan etsə də, manipulyasiyalar NMDAR vasitəçiliyi ilə cərəyan azaldılmasının miqyasına nəzarət etdikdə, hələlik hər iki alt bölmənin LTP induksiyasında əvəzedilməz rol oynadığına dair heç bir aydın sübut yoxdur. Buna baxmayaraq, GluN2A və GluN2B alt bölmələri tərəfindən NMDAR-a verilən fərqli kinetik o deməkdir ki, hər bir alt bölmənin yük ötürülməsinə töhfəsi presinaptik fəaliyyət modelinə görə dəyişə bilər və buna görə də onlar fizioloji şəraitdə potensiallaşmada bərabər rol oynaya bilməzlər.

İstifadə olunan induksiya paradiqmasından asılı olmayaraq, əksər sübutlar göstərir ki, GluN2B alt bölməsi LTP induksiyası üçün daha böyük əhəmiyyətə malikdir. GluN2B-nin inkişafın əvvəlindən daha kiçik bir hissəsini təşkil etməsinə baxmayaraq, yetkin hipokampusda LTP-yə nə üçün güclü təsir göstərə biləcəyinin izahı, GluN2B alt bölməsini ehtiva edən NMDAR-ların cərəyan vahidinə daha çox Ca 2+ axını daşımasıdır [38]. ]. Mövcud dəlillərə daha çox uyğun gələn alternativ bir izahat budur ki, GluN2B LTP induksiyası üçün xüsusi əhəmiyyət kəsb edir, çünki onun onurğa sütununda CaMKII-ni PSD-də lövbər salır. Beləliklə, GluN2B alt birliyi olan NMDARlar, Ca 2+ axınının əksəriyyətini dəstəkləyib-dəstəkləməməsindən asılı olmayaraq, sinaptik gücləndirməyə vasitəçilik edən aşağı siqnal kaskadlarının aktivləşdirilməsinə imkan verir. Bu, GluN2B -nin naturalist şəraitdə LTP induksiyası üçün zəruri bir faktor olduğunu göstərir, lakin ən əsası, lazım olan Ca 2+ axınının dəstəklənməsinin kifayət olub -olmaması presinaptik fəaliyyət modelindən asılı ola bilər. Üstəlik, onurğa əsaslı görüntü araşdırmaları və asimmetriya tədqiqatları, GluN2B ilə zəngin olan kiçik tikanların LTP-nin induksiyası və saxlanması üçün daha çox meylli olduğunu irəli sürsə də, aşağı siqnal yolları və GluN2B varlığı kifayət etməyəcək. struktur dəyişiklikləri artıq doymuşdur.

LTD ədəbiyyatı qeyri-müəyyəndir, baxmayaraq ki, daha çox tədqiqatlar və LTD-nin inkişaf profili onun induksiyasında GluN2B-nin daha mərkəzi rolunu dəstəkləyəcək. Bunun tam olaraq niyə ola biləcəyi aydın deyil, lakin CaMKII ilə olandan fərqli hüceyrədaxili birləşmələrlə əlaqəli ola bilər. Əksər plastiklik tədqiqatları ya hüceyrə, ya da hüceyrə xaricindəki sahə potensialı səviyyəsindəki induksiya protokollarına cavabı araşdırır və beləliklə bir çox sinapsda toplanan dəyişiklikləri qeyd edir. Bununla belə, sinapslar bərabər deyil və bunun əvəzinə fərqli struktur və molekulyar imzalara malikdir və bu, plastiklik ədəbiyyatında ən azı bəzi ziddiyyətli tapıntıları izah etməyə kömək edə bilər. Ümumiyyətlə, GluN2B -nin həm LTP, həm də LTD üçün vacib göründüyünü nəzərə alsaq, bu alt bölmənin çevik xüsusiyyətlərə malik sinaps verməsi ilə bağlı bir fərziyyə var.

Plastiklik tədqiqatlarının ziddiyyətli nəticələrini nəzərə alsaq, heç bir alt bölmənin öyrənmə və yaddaşda aydın rolunun hələ aşkar edilməməsi təəccüblü deyil. Mövcud ədəbiyyatın təklif etdiyi budur ki, həm GluN2A, həm də GluN2B qısa müddətli yaddaş proseslərini dəstəkləyir. GluN2B alt bölməsini ehtiva edən NMDAR-ların məlumatın daha uzun gecikmə üçün saxlanmalı olduğu və ya bir neçə gün ərzində artan tapşırıqların əldə edilməsi zamanı öyrənməyə daha çox töhfə verə biləcəyinə dair bəzi sübutlar var.

Qısamüddətli yaddaş tapşırıqlarının NMDARların genetik lezyonlarına və ya farmakoloji blokuna ən çox həssas görünməsi təəccüblü görünə bilər, xüsusən də NMDAR-dan asılı olan LTP-nin tədricən öyrənmə yolu ilə tapşırıq əldə etməsini dəstəklədiyi təklifi işığında [124]. Bununla birlikdə, bir çox amillər, plastisiyanı öyrənmə ilə əlaqələndirən nəzəriyyənin yenidən nəzərdən keçirilməsini zəruri hesab edir. Birincisi, NMDAR -lərin daha sonra təsvir edildiyi kimi, plastisiyaya cəlb olunmalarına əlavə rollar var. İkincisi, qlobal nokaut həm də interneyronlarda yerləşən NMDAR-ları aradan qaldıracaq və beləliklə, qısamüddətli yaddaş üçün vacib olan şəbəkə dinamikasını dəyişə bilər [125]. Üçüncüsü, alt bölmənin nokautunun hipokampdakı piramidal hüceyrələrlə məhdudlaşdığı bir neçə araşdırmada, naviqasiya sistemləri hələ də təsirlənə bilər və bunun qısamüddətli və uzunmüddətli yaddaş vəzifələrinin bilişsel tələbləri ilə necə qarşılıqlı əlaqəsi olduğu bilinmir. Dördüncüsü, hətta lokallaşdırılmış manipulyasiyalar da xroniki olub və buna görə də kompensasiya mexanizmlərinin işə salınması ehtimalı var ki, qısamüddətli yaddaş daha çox onlayn emal gücü və ya sürətli, geniş miqyaslı şəbəkə dəyişiklikləri tələb edir, bunlardan hər hansı biri daha yüksək Ca səviyyəsinə ehtiyac duya bilər. Onları idarə etmək üçün 2+ axını və beləliklə, NMDAR-ları və deməli, ümumi Ca 2+ axınını azaldan manipulyasiyalara daha həssas olardı. Nəhayət, bu manipulyasiyaların LTP-ni də tez-tez pozması faktı LTP ilə qısamüddətli yaddaş arasında əlaqəni nəzərdə tutmur, yalnız hər iki prosesin NMDAR-lara əsaslandığını göstərir. Həqiqətən də, qısamüddətli potensiasiya da NMDAR-ları tələb edir və alt bölməyə üstünlük verə bilər [9].

Bəzi tədqiqatlarda, bir davranış pozğunluğunu bir plastiklik istiqamətindəki selektiv çatışmazlıqla əlaqələndirmək mümkün olmuşdur. Xüsusilə, məlumatın tədricən əldə edilməsi və konsolidasiyasının LTP üçün də vacib olan GluN2B-CaMKII qarşılıqlı əlaqəsi tərəfindən dəstəklənə biləcəyinə dair sübutlar var. Başqa bir ümumi tapıntı, geri öyrənməni dəstəkləyən mexanizmlərin GluN2B-dən asılı LTD-yə bənzər bir prosesi əhatə edə bilməsidir. Öyrənmə pozğunluqları ilə LTD çatışmazlığı ilə bağlı araşdırmaların bir xəbərdarlığı ondan ibarətdir ki, bir çox laboratoriyalar həmin yaşda olan gəmiricilərin hələ də əlaqəli yaddaş tapşırıqlarını yerinə yetirə bilmələrinə baxmayaraq, onların yetkin gəmiricilərdə LTD-yə səbəb ola bilməyəcəyini müəyyən edir. Bu, LTD-ni induksiya etmək üçün istifadə olunan aşağı tezlikli paradiqmaların sinaptik çəkilərin azalmasına səbəb olan fəaliyyət növünü uğurla təqlid etmədiyini göstərir. in vivovə ya hətta sinapslara xas gücün azalmasının öyrənmənin əsasını təşkil etməməsi, inkişaf zamanı dövrə təmizlənməsi üçün daha əhəmiyyətli ola bilər. Bu müşahidələri uzlaşdırmağın bir yolu, sinaptik güclənmənin hər zaman yeni məlumatların əldə edilməsini dəstəkləməsidir, lakin artırmaq üçün yenidən öyrənmə (tərs öyrənmə, yox olma) və ya öyrənmənin incələşdirilməsi (tanıma yaddaşı) tələb edən davranış vəzifələrində eyni zamanda depressiya da lazımdır. səs -küydən və ya 'fondan' yeni güclənmiş sinapsların mənfəəti. Bu ssenaridə məhdud sayda sinaps güclənəcək və yeni məlumat daşıyacaq, lakin sinapsların populyasiyalarını qeyd edən hüceyrədənkənar sahədə və ya bütün hüceyrə ölçmələrində ümumi depressiya müşahidə olunacaq. Sinaptik depressiyanın belə bir forması, məlumatların kodlaşdırılmasına töhfə verəcəyi üçün sırf homoeostatik mexanizmlərdən funksional olaraq fərqli olardı.

8. Gələcək istiqamətlər

Alt bölmənin seçicilik fərziyyəsini tam araşdırmaq üçün gələcək üçün prioritetlərə GluN2A subunit tərkibli NMDAR-ları selektiv şəkildə bloklamaq üçün vasitələrin hazırlanması daxil edilməlidir. Bundan əlavə, triheteromerik NMDAR -ları hədəfə almaq üçün üsullar qurmaq, onların rolunu araşdırmaq üçün əsasdır, ehtimal ki, mövcud ədəbiyyatda bəzi qarışıqlıqların, bu reseptorların istifadə edilən manipulyasiyalardan təsirləndiyi fərqli ölçülərdən qaynaqlana biləcəyi görünür. Alt birim etiketini floresan problar və yüksək qətnamə ilə canlı görüntüləmə ilə birləşdirmək, bu populyasiyanı tək bel əsaslı plastisite tədqiqatlarında öyrənməyə kömək edə bilər. Alternativ olaraq, kinetik xüsusiyyətlərini pozmadan GluN2A və GluN2B alt birləşmələrini bağlamaq üçün disulfid körpü kimi bir transtranslyasiya modifikasiyası tətbiq oluna bilərsə, bu, bütün hüceyrə və ya hüceyrədənkənar sahə qeydləri səviyyəsində araşdırmaya kömək edər. Bir sıra tədqiqatlar, triheteromerik populyasiyanın yetkin beyində əhəmiyyətli və ya hətta dominant ola biləcəyini irəli sürdüyünü nəzərə alsaq, ehtimal ki, bu NMDAR kompozisiyasının əhəmiyyətli bir funksiyası vardır. Bunun səbəbi, triheteromerlərin ara kanal kinetikasına malik olması və buna görə də GluN2A alt bölməsi tərəfindən təmin edilən daha sürətli reaksiya və inteqrativ xüsusiyyətləri GluN2B alt bölməsi tərəfindən ötürülən mühüm hüceyrədaxili birləşmələrlə birləşdirir, xüsusən Ca 2+ axınının aşağı axın siqnal molekulları ilə sıx birləşməsinə imkan verir. , CaMKII kimi.

Plastiklik paradiqmalarında alt birliyin iştirakı ilə davranış arasındakı əlaqələrin mənalı olub olmadığını başa düşmək üçün sinaptik çəkilərdəki dəyişikliklərin öyrənmə və yaddaşı dəstəklədiyini qəti şəkildə nümayiş etdirmək vacibdir.Bu, daha sonra müxtəlif idrak tələbləri ilə davranış tapşırıqlarını dəstəkləyən plastikliyin növlərini və sinaptik yerini müəyyən etmək üçün daha da parçalana bilər. Keçmişdə texniki məhdudiyyətlər plastiklik və öyrənmə və yaddaş arasında səbəb-nəticə əlaqəsinin araşdırılmasına mane olurdu. Bununla birlikdə, yeni irəliləyişlər bu hipotezi daha birbaşa test etməyə kömək edə bilər. Sinir kodu hələ həll olunmadığından, təcrübəni süni şəkildə tətbiq etməklə kompleks bir davranışa istiqamət verməyi öyrənmək, sinaptik çəkilərdəki xüsusi dəyişikliklər bu yaxınlarda əhəmiyyətli addımlar atılmasına baxmayaraq, dərhal üfüqdə olmayacaq [126]. Digər yanaşmalar hələ də məhsuldar ola bilər: yeni işlənmiş optogenetik və farmakogenetik texnologiyalar fərqli molekulyar və struktur tərkibli sinapsları hədəfləmək üçün istifadə edilə bilər və molekulyar hiylə ilə birlikdə istifadə edildikdə, müxtəlif növ sidik-cinsiyyətlərin olub olmadığını araşdırmaq üçün xüsusilə güclü bir üsul ola bilər. sinaps fərqli hesablama rolları oynayır. Bu cür kəskin manipulyasiyalar, hipokampal funksiya haqqında, farmakoloji lezyon tədqiqatları ilə [127] təklif olunanlardan fərqli olan yeni məlumatlar ortaya çıxardı. Bundan əlavə, simsiz qeyd cihazlarındakı texnoloji inkişaflar nəzərə alınmaqla, postsinaptik cavabları qeyd etmək vacib olacaq in vivo davranış zamanı edilən manipulyasiyaların oxunmasını təmin etmək. Bu cür qeydlər həm də geri qaytarma tapşırıqlarında sinaptik zəifləmənin dərəcəsini göstərəcəkdir. Subunit-selektivlik hipotezi baxımından, mövcud sübutlar, hər bir alt birliyin plastisiyadakı iştirakının dərəcəsinin fərqli kinetikası səbəbiylə istifadə edilən induksiya protokolundan təsirləndiyini göstərir. Bu səbəbdən, GluN2A və GluN2B-nin fizioloji şəraitdə və öyrənmə və yaddaşla əlaqəli əhəmiyyətini anlamaq üçün davranış zamanı meydana gələn və sinaptik gücdə uzunmüddətli dəyişikliklərə səbəb olan təbii fəaliyyət nümunələrini araşdırmağa xüsusi diqqət yetirilməlidir.

Bununla belə, yadda saxlamaq lazımdır ki, NMDAR-lar təkcə plastisiyada deyil, həm də sinir fəaliyyətinin yavaş və ya tonik reaksiya komponentlərində rol oynayır, məsələn, onların talamusda yavaş reaksiyaları və neokorteksdə həssas tənzimləməni dəstəklədiyi göstərilmişdir. Üstəlik, NMDAR-lar müəyyən öyrənmə formaları üçün belə tələb olunmaya da bilər, bu yaxınlarda DG və dorsal CA1-də NMDAR nokautu olan siçanların hələ də NMDAR-dan asılı olan vəzifələri yerinə yetirə biləcəyi, məsələn MWM [121] göstərilmişdir. . Bu o demək deyil ki, normal şəraitdə NMDAR-lar bu tip öyrənmədə iştirak etmir, çünki uzun müddət silindikdən sonra digər mexanizmlər və ya hipokampal bölgələr öz üzərinə götürə bilər. Buna baxmayaraq, bütün hipokampal sinapslarda NMDAR -ların öyrənmə və yaddaşla əlaqəli olub -olmadığını və ya alternativ olaraq yalnız bir alt qrupun olub -olmadığını araşdırmaq vacib olacaq, qalan hipokampal NMDARlar isə sensor neokorteksdə olanlara bənzər hesablamalar aparır. İnsanlarda [128] və son zamanlarda siçanda [69,94,96] bildirilən hipokampal asimmetriya, hipokampın paralel şəbəkələrdən ibarət olmasını mümkün edir, bunlardan biri əsasən sensor kodlaşdırma və naviqasiya ilə məşğul olan cavab şəbəkəsidir. digəri assosiasiyaların öyrənilməsini dəstəkləyir. Hipokampal funksiyanı başa düşməyimizdə böyük irəliləyişlərə baxmayaraq, görünür ki, hələ açmaq üçün daha çox şey var.


NƏTİCƏLƏR

AMPA Reseptorlarının Açıq Kanal Konformasiyasını hədəfləyən Aptamerin Kəşfi üçün Dizayn Strategiyası

Bu işdə GluA2Q istifadə etməyi seçdikçevirmək İn vitro seçimin hədəfi olaraq AMPA reseptoru (Eksperimental Prosedurlar və Şəkil S1, Dəstəkləyici Məlumat). GluA2, dörd AMPA reseptor alt birimindən biridir və digər AMPA reseptor alt bölmələri kimi homomerik, funksional bir kanal meydana gətirə bilər (9). GluA2 eksitotoksikliyə vasitəçilik edən əsas alt birlik hesab olunur (25). GluA2Q və ya GluA2Q-nin 𠇏lip” izoformuçevirmək, alternativ birləşmə nəticəsində yaranan, 𠇏lop ” izoformundan daha az sürətlə desensitizasiya etdiyi bilinir (5, 26). Redaktə edilmiş və ya Q izoformu (yəni, glutamin/arginin və ya Q/R redaktə yerindəki glutamin) kalsium keçiricidir, R izoformu isə (27). GluA2 Q izoformunun anormal ifadəsi ALS (28) kimi nevroloji xəstəliklərlə əlaqədardır.

AMPA reseptorlarının açıq kanal konformasiyasına qarşı aptamerləri müəyyən etmək üçün in vitro təkamül yanaşmasını tətbiq etməyi praktiki olaraq mümkün etmək üçün aşağıdakı təcrübələri xüsusi olaraq hazırladıq. Birincisi, GluA2Q-nin açıq kanallı konformasiyasının payını maksimuma çatdırmaq üçün reseptor populyasiyasını �ititrasiya etmək üçün doyurucu bir agonist konsentrasiyasından istifadə etdik.çevirmək. Başqa sözlə, biz xüsusi olaraq GluA2Q-nun açıq kanal uyğunluğunu təqdim etmək istədikçevirmək Xüsusilə açıq kanal konformasiyasını tanıyacaq aptamerlərin tapılmasını gözləyərək seçimin hədəfi olaraq. İkincisi, açıq kanal konformasiyası qlutamatın bağlanmasından (5) sonra bir millisaniyədən çox (qlutamat konsentrasiyasından asılı olaraq) davam edir, halbuki reseptor və RNT kitabxanası arasında bağlanma reaksiyasının tamamlanması üçün ən azı 30 dəqiqə lazımdır (19) (19) Eksperimental Prosedurlar və Şəkil S1, Köməkçi Məlumat). Beləliklə, bağlama reaksiyası üçün kifayət qədər uzun müddət açıq kanal konfiqurasiyasını “trap etməliyik. Bunu etmək üçün agonist olaraq kainateni seçməyə qərar verdik. Kainate, kainat ona bağlandıqdan sonra GluA2 ilə qeyri-sensibilizasiya edən cərəyan reaksiyası yarada bilir ki, bu da açıq kanal konformasiyasının davamlı mövcudluğunun göstəricisidir (29). Təcrübə olaraq, GluA2Q ehtiva edən hüceyrə membranını əvvəlcədən inkubasiya etdikçevirmək 1 mM kainat ilə reseptor (yəni, bu doyma konsentrasiyası idi). Üçüncüsü, eyni yerə və ya bir -birini istisna edən saytlara bağlana bilən ehtimal olunan RNT -ləri çıxarmaq üçün rəqabətsiz bir inhibitordan, yəni GYKI 47409 istifadə etdik (Şəkil S1, Dəstəkləyici Məlumat). GYKI 47409 2,3-benzodiazepin törəməsidir və inhibisyon sabitinə malikdir (KMən) -dan

GluA2Q-nin açıq kanal konformasiyası üçün 3 μMçevirmək və ya

Qapalı kanal uyğunluğuna nisbətən 2 dəfə yüksək yaxınlıq (Pei və Niu, dərc olunmamış məlumatlar). Təcrübələrimizin ümumi dizaynı, açıq kanal konformasiyasını rəqabətsiz bir sahəyə bağlayaraq hədəf alan bir aptameri xüsusi olaraq təyin etmək idi.

AMAP reseptorlarını inhibə edən bir RNT Aptamerinin müəyyən edilməsi

GluA2Qçevirmək kanallar keçici olaraq HEK-293S hüceyrələrində ifadə edildi və bütün funksional reseptorları saxlayan membran parçaları in vitro seçim üçün istifadə edildi (19). Lipidlər kimi digər hər hansı bir hədəfə bağlı olmayan qeyri -spesifik RNT -lərin potensial təhlükəli zənginləşdirilməsinin qarşısını almaq üçün 5, 10 və 13 -cü turlarda olduğu kimi mənfi HEK -in olduğu 14 seçim dövrü ərzində mənfi seçim apardıq. -293 hüceyrə membranında yalnız GluA2Q yoxdurçevirmək Bu qeyri-spesifik RNT-ləri udmaq üçün reseptorlardan istifadə edilmişdir. Bunun əksinə olaraq, müsbət seçim turları, əvvəllər qeyd edildiyi kimi, GYKI 47409 -un potensial faydalı RNT -lərin ayrılması üçün istifadəsini əhatə edir. Yuyulan RNT-lər RT-PCR ilə gücləndirildi və zənginləşdirilmiş RNT kitabxanası daha sonra yeni bir seçim turu üçün köçürüldü (Şəkil S1, Dəstəkləyici Məlumat). 14 dövrdən sonra bəzi zənginləşdirilmiş ardıcıllıqları müəyyən etdik (Şəkil 1A). Zənginləşdirilmiş ardıcıllıq 83 klondan ibarət bütün ardıcıllıq hovuzunda ən azı iki nüsxədən ibarət idi (yəni, 12-ci raunddan 43 klon və 14-cü raunddan 40 klon). Bu zənginləşdirilmiş ardıcıllığın ehtimal olunan inhibitor xüsusiyyəti daha sonra GluA2Q ilə bütün hüceyrə cərəyan qeydinin istifadəsi ilə funksional olaraq sınaqdan keçirildi.çevirmək HEK-293 hüceyrələrində ifadə olunur. Bütün hüceyrə qeydinin nəticələrinə (Şəkil 1B-də təmsil olunan izlərə baxın) və ya aptamer A/A(I) olmadığı və mövcudluğu zamanı cərəyan amplitüdlərinin nisbətinə (Şəkil 1A-da sağ sütunda göstərilmişdir) əsaslanaraq, biz AG1407, ən zənginləşdirilmiş ardıcıllığın ən güclü inhibitorlardan biri olduğu qənaətinə gəldi. Eyni aptamer konsentrasiyasında, lakin artan glutamat konsentrasiyasında AG1407-nin başqa bir sınağı göstərdi ki, AG1407, GluA2Q-nin açıq kanal konformasiyasını maneə törədir.çevirmək (Şəkil S2, Dəstəkləyici Məlumat).

Minimal, Funksional Aptamer Ardıcıllığının İdentifikasiyası

Bundan sonra, minimum, lakin funksional ardıcıllığı müəyyən etmək üçün aptamer AG1407 -ni sistematik olaraq kəsdik. Mfold proqramını (30) istifadə edərək ikincil quruluş proqnozunu rəhbər tutaraq AG1407 -nin daha qısa versiyalarını qurduq və funksional olaraq sınaqdan keçirdik (Şəkil 2A). A/A(I) dəyərinə (Şəkil 2A-da hər bir proqnozlaşdırılan strukturun altındakı qırmızı rənglə göstərilmişdir) əsaslanaraq, biz tapdıq ki, AG1407-nin 56-nukleotid (nt) versiyası AG56 olaraq adlandırılır və funksional aptamer minimaldır. ardıcıllığın uzunluğu. Bunun əksinə olaraq ya UUGUGA ardıcıllığını (yəni 46 nt RNT) silməklə, ya da U50 mövqesindəki qabarıqlığı çıxarmaqla (yəni 45 nt RNT) və ya ilk kök döngəsindəki baza cütlüyünü kəsməklə üç tərəfli qovşağı qısaltmaq. bölgə (yəni, 48 nt RNT) (Şəkil 2A) qeyri-funksional RNT-lərlə nəticələndi. Buna görə də AG56 -nın funksional aptamer kimi qatlanmasında bu struktur elementləri vacibdir. Nəticədə AG56 -dan aşağıda təsvir olunan bütün funksional xüsusiyyətlər üçün minimal aptamer olaraq istifadə etdik.

Aptamer və AMPA reseptor alt növü seçiciliyinin minimal, funksional ardıcıllığı. (A) Minimal, funksional 56 nt ardıcıllığı və ya AG56-nı müəyyən etmək üçün AG1407 ardıcıllığını kəsərkən, Mfoldun proqnozuna əsaslanaraq, bu quruluşun altında sadalanan sərbəst enerjisi olan hər bir ardıcıllığın yalnız ən sabit ikincil quruluşu nəzərə alınmışdır. . Qara və qəhvəyi rəngli hərflər müvafiq olaraq sabit və dəyişən ardıcıllıq bölgələrini təmsil edir. “scissor”, müəyyən bir ardıcıllığın harada kəsildiyini, yaşıl hərflər isə kəsilmiş nukleotidləri təmsil edir. A/A (I) dəyəri olaraq göstərilən inhibitor funksiyası hər kəsilmiş quruluşun altındadır. (B) Bütün hüceyrəli cari qeyd təhlili ilə AG56, bütün AMPA reseptor alt bölmələrinin (sol panel) açıq kanal konformasiyasını seçici şəkildə maneə törətdi (Şəkil S3-də daha çox izahat və statistik təhlilə baxın, Məlumatları dəstəkləyin). Bununla belə, AG56 GluK1Q və GluK2Q, iki təmsilçi kainat reseptor kanalları, nə də GluN1A/2A və GluN1A/2B NMDA reseptor kanallarına təsir göstərməmişdir. Test edilmiş reseptor növlərinin hər biri üçün glutamat konsentrasiyası ekvivalent olaraq seçilmişdir

Açıq kanalların 95% -i. Xüsusilə, glutamat konsentrasiyası 0.04 mM (qapalı kanal konformasiyası üçün)/3 mM (açıq kanal konformasiyası üçün) GluA1 idi.çevirmək, GluA2Q üçün 0,1 mM/3 mMçevirmək, GluA3çevirmək, və GluA4çevirmək, həmçinin GluK1 və GluK2Q üçün 0,04 mM/3 mM.

Aptamer AG56-nın Bütün Hüceyrə Qeydləri ilə Funksional Səciyyələndirilməsi

AG56 funksional olaraq bir sıra təcrübələrdə xarakterizə edildi. Birincisi, AG1407 (Şəkil S2, Məlumatları Dəstəkləyən) əvvəlki ardıcıllıq kimi, GluA2Q-nin qapalı kanal deyil, açıq kanal seçicidir.çevirmək (Şəkil 2B, sol panel). Bundan əlavə AG56, AG56-nın GluA4 üzərindəki inhibitor təsiri zəif olsa da, bütün digər AMPA reseptor alt bölmələrinin, yəni GluA1, 3 və 4-ün açıq kanal konformasiyasını inhibə edirdi (Şəkil 2B sol panel və Şəkil S3, Dəstəkləyici Məlumat). Bununla belə, AG56 qapalı kanal konformasiyalarının heç birinə heç bir inhibitor təsiri göstərməmişdir (Şəkil 2B sol panel). AG56 nə kainat reseptor kanallarına (yəni GluK1 və GluK2), nə də NMDA reseptor kanallarına (yəni GluN1A/2A və GluN1A/2B) təsir etməmişdir (Şəkil 2B sağ panel). Qeyd etmək lazımdır ki, GluN1A/2A və GluN1A/2B in vivo iki dominant NMDA reseptor kompleksidir (31) və nə GluN1A, nə də GluN2A və ya GluN2B öz-özünə funksional kanal yarada bilməz (32). Bu nəticələr, AG56-nın açıq kanal uyğunluqlarını hədəf alaraq bir AMPA reseptor-alt tipli seçici inhibitoru olduğunu və AG56-nın digər glutamat reseptor alt tiplərinə qarşı heç bir arzuolunmaz, aktiv fəaliyyət göstərmədiyini göstərir.

GluA2Q üzərində AG56 -nın inhibe mexanizmiçevirmək: Homoloji Bağlama Tədqiqatları

AG56-nın GluA2Q üzərində təsir mexanizmini daha da aydınlaşdırdıqçevirmək HEK-293 hüceyrələrində ifadə olunan reseptor kanalı. Bu işdə, əvvəlcə GluA2Q-nin açıq kanallı konformasiyası üçün AG56-nın inhibisyon sabitinin 0.95 ± 0.20 μM (Şəkil 3A-da olan düz xətt) olduğunu təyin etdik.çevirmək demək olar ki, bütün kanalların açıq kanal konformasiyasında olduğu 3 mM glutamat konsentrasiyasında (bu, EC50 GluA2Q dəyəriçevirmək glutamat ilə 1,3 mM və GluA2Q-nin kanal açma ehtimalıçevirmək birliyə yaxın idi (21)). Bunun əksinə olaraq, AG56 GluA2Q-nun qapalı kanal uyğunlaşmasını maneə törətməmişdirçevirmək, bir sıra aptamer konsentrasiyası ilə təsdiqləndiyi kimi (Şəkil 3A), lakin reseptorların əksəriyyətinin qapalı kanal konformasiyasında olduğu 100 º03bcM glutamat konsentrasiyasında (21). Bu nəticə, AG56-nın tənzimləyici bir sahəyə və ya rəqabətsiz bir sahəyə bağlandığı rəqabətsiz bir mexanizmlə izah edilə bilər və belə bir sayta həm qapalı kanaldan, həm də açıq kanal vəziyyətlərindən və ya uyğunluqlardan daxil olmaq mümkündür, ancaq aptamerin açıq kanal konformasiyası inhibe ilə nəticələndi. Alternativ olaraq, bu nəticə, AG56-nın yalnız açıq kanal konformasiyasını maneə törətdiyi açıq kanal blokadası modeli kimi rəqabətsiz bir mexanizmlə izah edilə bilər, çünki rəqabət apara bilməyən sahəyə yalnız açıq kanal konfiqurasiyası ilə daxil olmaq olar (33) (Əlavədəki iki mexanizmə baxın). Bu iki mexanizmi fərqləndirmək üçün əvvəlcə homoloji bir rəqabət bağlama testi (20) apardıq və AG56-nın nəinki qapalı kanal konformasiyasına (yəni bağlanmamış, qapalı kanal reseptor formasına) bağlı olduğunu, həm də bunu bir yaxınlıq ilə etdiyini gördük. yəni, Kd = 68 ± 40 nM (Şəkil 3B sol panel) açıq kanal konformasiyasına bənzəyir, yəni. Kd = 80 ± 23 nM (Şəkil 3B sağ panel). Bu nəticə, AG56-nın açıq kanal konformasiyasına bağlanmasından əlavə, qapalı kanal konformasiyasına bağlanmasının aşkar edilməsinə əsaslanan rəqabətsiz mexanizmə uyğun idi. Lakin bu nəticə rəqabətsiz mexanizmlə ziddiyyət təşkil edirdi.

AG56-nın GluA2Q ilə inhibə sabitinin, bağlanma yaxınlığının və təsir mexanizminin xarakteristikası.çevirmək HEK-293 hüceyrələrində ifadə olunur. (A) Tam hüceyrəli cari qeyd analizi ilə, AG56 açıq kanalı (3 mM glutamat konsentrasiyasında ölçülür) GluA2Q-nin qapalı kanalını (0.1 mM qlutamat konsentrasiyası ilə ölçülür) konformasiyasını maneə törədirdi.çevirmək (nöqtəli xətt inhibə olmadığını və ya A/A(I) = 1 olduğunu göstərir). İnhibisiya sabitliyi, KMən, GluA2Q-nun açıq kanal uyğunluğu üçünçevirmək AG56 tərəfindən 0.95 ± 0.20 μM (yəni üst qatı xətt) olduğu təyin edildi. (B) AG56-nın GluA2Q ilə homoloji rəqabət bağlanmasıçevirmək reseptor həm işarəsiz, qapalı kanal forması (qatı dairə), həm də açıq kanal forması (içi boş dairə) üçün tərtib edilmişdir. Bağlayıcı sabit, Kd, AG56-dan GluA2Q-nun qapalı kanal (sol panel) və açıq kanal (sağ panel) formalarınaçevirmək üçqat məlumat dəsti əsasında 68 ± 40 nM və 80 ± 23 nM olaraq təyin edildi. Bağlama sabitliyi eq istifadə edərək hesablandı. Eksperimental Prosedurlarda 1. (C) AG56-nın kanalın bağlanma sürəti sabitinə və ya təsirinin lazer-nəbz fotoliz ölçümü kcl (sol paneldə) və kanal açma dərəcəsi sabit və ya kop (orta panel) GluA2Q iləçevirmək HEK-293 hüceyrələrində ifadə edilir. Xüsusilə, 100 μx003bcM fotolitik olaraq buraxılan qlutamat konsentrasiyasında, kobs əks etdirən dəyər kcl, 2,200 s 𢄡 -dən (idarəetmə və ya 𢄠.5 μM AG56, qara iz, sol panel) 1,600 s 𢄡 -ə (+0,5 μM AG56, qırmızı iz, sol panel) endirildi. 340 μM -də fotolitik olaraq ayrılan glutamat konsentrasiyasında kobs əks etdirən dəyər kop (orta panel), 0,5 μM AG56 olmadıqda və mövcud olduqda 5,128 s 𢄡 və 4,405 s 𢄡 idi. Ancaq fərq və ya Δkobs = kobskobs’ = Δkcl glutamat konsentrasiyası artdıqda belə dəyişməz idi (sağ panel). Budur Δkcl = kclkcl’ harada kcl’ inhibe edilmişdir kcl dəyəri və kcl AG56 olmadan kanalın bağlanma sürəti sabitidir (Əlavədəki ekv. 9-a bax). Hər bir məlumat nöqtəsi, tək bir hüceyrədən ən azı bir ölçməni təmsil edir kobs nəzarət dərəcəsi sabitdir və kobs’, 0,5 μM AG56 olduqda sürət sabitidir.

GluA2Q üzərində AG56-nın inhibə mexanizmiçevirmək: AG56-nın Kanalın Açılma Sürəti Prosesinə Təsirinin Lazer-Puls Fotolizinin Ölçüsü

GluA2Q kanal açma kinetik prosesində AG56-nın inhibe mexanizmini daha da xarakterizə etdikçevirmək. Lazer-nəbz fotoliz texnikasından istifadə edərək, fotolabil glutamat və ya qəfəsli qlutamatın öncülləri ilə birlikdə,

30 mikrosaniyə (22), biz xüsusi olaraq AG56-nın hər iki kanalın bağlanmasına təsirini ölçdük (kcl) və kanalın açılması (kop) nisbət sabitləri (23) (Şəkil 3C sırasıyla sol və orta panellər). Bu təcrübə, kanalın həssaslaşmasından əvvəl kanalın açılma sürətini deyil, həm də mövcud amplitudunu eyni vaxtda izləməyimizə imkan verdi (23) (Şəkil 3C, sol və orta panellər). miqyası kcl açıq kanalın ömrünü (τ) əks etdirir (yəni τ = 1/kcl) və bir inhibitorun təsiri kcl beləliklə, onun açıq kanallı konformasiyaya mane olub-olmadığını aşkar edir (23). Əksinə, kop bağlı kanal konformasiyasını və təsirini əks etdirir kop inhibitorun qapalı kanal konformasiyasını (23) inhibe edib-etmədiyini ortaya qoyur (Əlavədəki nisbət tənlikləri və nisbət məlumatlarının kəmiyyət müalicəsi). Eksperimental olaraq, aşağı qlutamat konsentrasiyasında (yəni, 100 º003bcM fotolitik olaraq ayrılan qlutamat) burada kcl ölçüldü (23), AG56 açıq kanal konformasiyasını maneə törətdiyi rəqabətsiz bir mexanizmlə uyğun olaraq kanal bağlanma sürətini maneə törətdi. Yenə də AG56 cari amplituda təsir etmədi (Şəkil 3C sol panel). Bu təəccüblü deyildi, çünki bu aşağı glutamat konsentrasiyasında (yəni 100 μM fotolitik olaraq ayrılan glutamat) müşahidə olunan amplituda qapalı kanallı reseptor populyasiyası üstünlük təşkil edirdi (bu, Şəkildəki qırmızı kəsikli xətt olaraq göstərilən amplituda ölçüsünə uyğun idi) 3A).

Lakin, qlutamatın konsentrasiyası artdıqda və kop ölçülə bilən oldu (23) (Əlavə bax), AG56 inhibə etmədi kop (Şəkil 3C orta və sağ panellər).Bu nəticə, sürətin AG56 tərəfindən inhibə edilməsinin tamamilə inhibe edilməsinə aid edilə biləcəyini təklif etdi kcl AG56 tərəfindən kanalın açılmasının müşahidə olunan sürət sabiti arasındakı fərq və ya Δkobs eyni AG56 konsentrasiyasında AG56 olmadıqda və varlığında glutamat konsentrasiyasının artmasına baxmayaraq dəyişməz idi (Şəkil 3C sağ panel, və nisbət məlumatlarının mexaniki işlənməsinə baxın, xüsusən Ek 9 -da). Başqa sözlə, fakt Δkobs eyni qaldı (və ya Δkobs = sabit), bir sıra artan glutamat konsentrasiyalarında təsdiqlənmiş, bərabərlik proqnozuna tamamilə uyğundur. 9 (Əlavədə 9-cu ekv. haqqında əlavə izahata baxın). AG56-nın inhibitor təsirinin olmaması kop (Şəkil 3C orta və sağ panellər) AG56-nın qapalı kanal konformasiyasını maneə törətmədiyini daha da nümayiş etdirdi.

Digər tərəfdən, AG56 daha yüksək bir glutamat konsentrasiyasında cərəyan amplitüdünü azaldıb (Şəkil 3C orta panelindəki qırmızı və mavi izlər arasındakı pik cərəyan amplitüdlərindəki fərqə baxın və daha yüksək bir cərəyan üçün Şəkil S4 -də Əlavə Məlumata baxın) daha yüksək glutamat və inhibitor konsentrasiyasında amplituda inhibisyon). Yenə də daha yüksək bir glutamat konsentrasiyasındakı mövcud amplitüdün açıq kanallı reseptor populyasiyasını daha çox əks etdirməyə başladığı üçün bu gözlənilən idi. Bundan əlavə, AG56 -nın sürət ölçməsindən cari amplituda təsiri (Şəkil 3C orta panel və Şəkil S4, Dəstəkləyici Məlumat) sürətli bir həll axını metodu (Şəkil 3A) istifadə edərək amplituda ölçülməsi ilə tamamilə uyğun idi. Birlikdə götürüldükdə, bağlanma yeri/yaxınlıq qiymətləndirməsinin nəticələri (Şəkil 3B) və AG56 -nın hər ikisinə təsirinin kimyəvi kinetik xarakteristikası kclkop (Şəkil 3C) və amplituda ölçümü (Şəkil 3A) yalnız AG56-nın açıq kanal reseptor konformasiyasına qarşı seçici olmayan rəqabətsiz bir inhibitor olması ilə uyğundur. Əksinə, rəqabətsiz bir fəaliyyət rejimi məlumatlarımızla uyğun gəlmir, yəni AG56 yalnız açıq kanal uyğunluğuna bağlanacaq, lakin qapalı kanal uyğunluğu deyil. Rəqabətli fəaliyyət rejimi də məlumatlarımızla uyğun gəlmir, yəni AG56 yalnız aşağı liqand konsentrasiyasında inhibitor kimi təsirli olacaq və inhibə edəcək kop, amma yox kcl.


7. CB1R-nin fizioloji və patoloji rolları

CB1R -lərin insan orqanizmində geniş yayılması nəzərə alınmaqla, CB1R -in geniş fizioloji rolları haqqında fikir yürütmək məqsədəuyğundur [3,9,63,126]. Həqiqətən də, CB1R və ​​endokannabinoid sistemi əsasən iştah, öyrənmə və yaddaş, narahatlıq, depressiya, şizofreniya, insult, çox skleroz, nörodejenerasiya, epilepsiya və asılılıq daxil olmaqla mərkəzi sinir fəaliyyəti və pozğunluqlarının müxtəlif aspektlərində iştirak edir [3,9,126,127] . CB1R, ağrı, enerji mübadiləsi, ürək -damar və reproduktiv funksiyalar, iltihab, qlaukoma, xərçəng, qaraciyər və kas -iskelet sistemi xəstəlikləri də daxil olmaqla PNS və periferik toxumalarda fizioloji və patoloji şərtlərdə iştirak edir [63]. CB1R ifadəsi bir çox patoloji şəraitdə əhəmiyyətli dərəcədə dəyişir və geniş bioloji fəaliyyət spektrində onun kritik rolunu vurğulayır [69]. Maraqlıdır ki, bəzi hallarda CB1R ifadəsində və funksionallığında həm müsbət, həm də mənfi dəyişikliklər bildirilmişdir [69]. Üstəlik, CB1R agonistlərinin tətbiqi bir neçə şəraitdə ikifazalı təsir göstərir [128]. Digər tərəfdən, CB1R -nin geniş yayılması, müxtəlif yan təsirlərə görə CB1R ligandlarının müalicəvi tətbiqini məhdudlaşdırır. Bu faktlar, endokannabinoid sistemini şəraitə uyğun şəkildə başa düşməyin və manipulyasiya etməyin əhəmiyyətini göstərir.

CB1R -nin, CB1R -ni nörotransmisyonu modulyasiya etmək qabiliyyəti ilə təmin edən presinaptik terminallardan GABA və glutamatın salınmasını maneə törətdiyi aşkar edilmişdir [60,129]. Bu, epilepsiya və neyrodegenerativ xəstəliklər də daxil olmaqla, bir çox nevroloji xəstəliklərin görkəmli patoloji prosesi olan eksitotoksisite qarşı CB1R vasitəçiliyi ilə neyroqorumanın məqbul əsas mexanizmi kimi təklif edilmişdir [34,130,131]. Bu günə qədər çoxsaylı tədqiqatlar göstərir ki, CB1R müxtəlif stimulların yaratdığı eksitotoksisitəyə qarşı nöroprotektiv rol oynayır [131,132,133,134]. Bu yaxınlarda, siçan beynində, CB1R tərəfindən eksitotoksisiteye qarşı tətbiq edilən nöroprotektiv təsirin glutamaterjik terminallarda yerləşən CB1R populyasiyası ilə məhdudlaşdığı sübut edilmişdir [130]. Ca 2+ axını və glutamatın sərbəst buraxılmasında görkəmli inhibitor təsirlərə əlavə olaraq, CB1R vasitəçiliyi ilə neyroproteksiyaya nitrik oksid (NO) istehsalının inhibe edilməsi, sink səfərbərliyinin azalması və BDNF ifadəsinin artması da daxildir [134,135,136]. Son tədqiqatlar, CB1R-lərin NMDAR fəaliyyətini mənfi tənzimləməsinə imkan verən və sinir hüceyrələrini eksitotoksiklikdən qoruyan histidin triadası nukleotid bağlayan zülal 1-in varlığında CB1R və ​​NMDAR-lar arasında birbaşa fiziki qarşılıqlı təsir göstərmişdir [136,137].

Xüsusilə, CB1R və ​​endokannabinoid sistemin digər elementlərinin dəyişmiş ifadəsi Alzheimer xəstəliyi (AD), Parkinson xəstəliyi (PD) və Huntington xəstəliyi (HD) kimi müxtəlif nörodejenerativ xəstəliklərdə müşahidə edilmişdir [3]. . CB1R və ​​endokannabinoid sistem fəaliyyətinin tənzimlənməsi, əsas nigranın dejenerasyona uğramış dopaminerjik neyronlarını və ya xəstəliyin pisləşməsinə səbəb olan bir patoloji prosesi kompensasiya edə biləcək PD -nin eksperimental modellərinin bazal ganglionlarında müşahidə edilmişdir. [138]. Maraqlıdır ki, PD modellərində endokannabinoid sistem aktivliyinin azalması da bildirilmişdir [128]. Bundan əlavə, həm FAAH inhibitorlarının, həm də CB1R antaqonistlərinin PD modellərində motor simptomlarını yüngülləşdirdiyi göstərilmişdir [128]. Eynilə, AD xəstələrində və ya heyvan modellərində CB1R ifadəsindəki dəyişikliklər hələ də mübahisəli olsa da, CB1R-in aktivləşdirilməsinin bir neçə hüceyrə modelində amiloid və#x003b2 ilə əlaqəli neyrotoksisitənin qarşısını aldığı göstərilmişdir [139,140,141,142,143,144]. Bundan əlavə, CB1R-nin aktivləşdirilməsinin yaddaş çatışmazlığı və koqnitiv pozğunluqları olan AD heyvan modellərində faydalı olduğu bildirildi [145,146,147]. Digər tərəfdən, tədqiqatlar CB1R -nin HD patogenezində faydalı potensialını vurğuladı. 1993 -cü ildə, CB1R -nin azalmış ifadəsi ilk dəfə HD xəstələrində, autoradioqrafiya vasitəsi ilə, nigrada bildirildi [148]. Əlavə tədqiqatlar, HD -nin erkən bir əlaməti olaraq CB1R -lərin mütərəqqi itkisini ortaya qoydu, bu da əsl nörodejenerasiya başlamazdan əvvəl meydana gəldi və HD -nin pisləşməsini sürətləndirdi [149]. Bu müşahidə mRNA səviyyəsində və CB1R immunoreaktivliyi ilə bir neçə transgenik HD siçan modelində təsdiqləndi ([3] də nəzərdən keçirilmişdir). Bu yaxınlarda aparılan bir araşdırma, CB1R-nin yalnız orta tikanlı proyeksiya neyronlarında (MSN) deyil, həm də transgenik HD siçanlarında və HD xəstələrində selektiv şəkildə qorunan interneyronların subpopulyasiyasında aşağı tənzimlənməsini təsvir etdi [150]. HD transgenik siçanlarda CB1R-nin gecikmiş itkisi R6/1 zənginləşdirilmiş mühitdə, motor pozğunluqlarının və xəstəliyin irəliləməsinin gecikməsi ilə müşayiət olundu [151]. Bundan əlavə, HD transgenik siçanlarda R6/2, CB1R nokautu motor performansının pisləşməsinə, 3-nitropropion turşusuna həssaslığın artmasına və striatal atrofiyanın və Huntingtin (Htt) aqreqatlarının kəskinləşməsinə səbəb olur [133,152]. MSN-lərdə CB1R ifadəsinin selektiv artması həyəcanverici proyeksiya neyronlarının sağ qalmasını yaxşılaşdırır, lakin HD transgen R6/2 siçanlarının motor performansını təşviq etmir [153]. THC administrasiyasının transgenik siçanlarda motor pozğunluqlarını, striatal atrofiyanı və Htt aqreqatlarını yaxşılaşdırdığı bildirilmişdir, baxmayaraq ki, mübahisələr [133,154]. CB1R-nin aktivləşdirilməsi siçanlarda presinaptik terminallardan BDNF salınmasını artırarkən glutamatın sərbəst buraxılmasını maneə törədir [131]. HD hüceyrə modellərində əlavə araşdırmalar göstərdi ki, CB1R aktivasiyası PI3K/Akt yolu [133] vasitəsilə artan BDNF ifadəsi vasitəsilə striatal hüceyrələri eksitotoksisitedən qoruya bilər. Bu müşahidələr CB1R-nin neyrodegenerativ xəstəliklərdə kritik və bəlkə də faydalı rolunu dəstəkləyir.

CB1R-nin epileptik əleyhinə təsirlərinin tarixi qeydləri əsrlərə gedib çıxır [1]. Kannabinoidlərin epilepsiya xəstələrinə faydalı təsirləri haqqında hesabatlar yalnız THC [155,156] müəyyən edildikdən sonra əldə edildi. Bununla birlikdə, araşdırmalar, marixuana çəkdikdən sonra nöbet tezliyinin artdığını da irəli sürdü [157]. Kannabinoidlərin epilepsiyaya bu paradoksal təsiri təkcə insan tədqiqatlarında deyil, heyvan modellərində də bildirilmişdir [158,159]. CB1R-nin AEA tərəfindən aktivləşdirilməsinin siçovullarda elektroşokun səbəb olduğu nöbetlərin qarşısını aldığı göstərilmişdir [159]. Əksinə, FAAH nokaut siçanlarında CB1R aktivasiyası kain turşusunun səbəb olduğu nöbetlərə qarşı artan həssaslığı göstərir [158]. Epilepsiyadan sonra endokannabinoid sistemin dəyişməsi hüceyrə tipinə xasdır. Bu konsepsiya CB1R retrograd siqnalının inhibeedici, lakin həyəcanlandırıcı sinapslarda seçici şəkildə gücləndirildiyini göstərən əvvəlki heyvan tədqiqatları ilə dəstəklənir, nəticədə DSİ-nin davamlı potensiasiyası ilə nəticələnir, lakin febril tutmalarda DSE deyil, neyronların hiper həyəcanlılığına səbəb olur və beləliklə, kəskinləşməyə kömək edir. nöbet [160,161]. Üstəlik, inhibitor neyronların CB1R vasitəçiliyi ilə gücləndirilmiş bastırılması da fazadan asılıdır. Epilepsiya təzahürünün kəskin mərhələsindəki epileptik xəstələrin hipokampal toxumaları CB1R sıxlığını, xüsusən də dentat girusda azaldır, halbuki epilepsiyanın xroniki mərhələsində olan xəstələrdə CB1R -nin yüksəlməsi müşahidə olunur [162,163,164,165].

Hipotalamusda CB1R-nin aşağı ifadəsinə baxmayaraq, kannabinoidlər uzun müddətdir ki, CB1R-dən asılı olaraq iştahı stimullaşdıran təsirləri ilə tanınırlar [166]. Endokannabinoidlərin səviyyəsi oruc zamanı siçovulların hipotalamusunda artır və qida qəbulundan sonra normal səviyyəyə qayıdır [167]. İştah və qidalanma davranışının stimullaşdırılması endokannabinoidlərin birbaşa enjeksiyonundan sonra müşahidə olunur və CB1R antaqonistlərinin tətbiqi ilə ləğv edilir [167]. Bundan əlavə, ventral striatal CB1R -lərin aktivləşməsi GABAergic nöronlarını inhibə edir, nəticədə hipofajik, lakin oreksinerjik təsir göstərmir [168]. Son bir araşdırma, CB1R-in səbəb olduğu qidalanma davranışının hipotalamik POMC neyronlarının aktivləşməsi ilə inkişaf etdiyini göstərdi [81]. Hipotalamusa əlavə olaraq, CB1R vasitəsi ilə qida qəbulunun pozitiv tənzimlənməsində olfaktor prosesinin iştirak edəcəyi irəli sürülmüşdür [169]. Üstəlik, CB1Rs və grelin, leptin və oreksin də daxil olmaqla iştahın tənzimlənməsində iştirak edən vacib hormonlar arasında geniş çaplı məlumat verilmişdir [68,166]. Əvvəlki bölmədə müzakirə edildiyi kimi, mədə-bağırsaq traktında ifadə olunan CB1R-lər metabolik prosesdə və enerji balansında da iştirak edir. Bu tədqiqatlar CB1R vasitəsi ilə iştahın tənzimlənməsinin ən azı iki aspekti ehtiva etdiyini göstərir: iştaha bağlı CNS bölgəsinin tənzimlənməsi və yerdəki metabolik hormonların və həzm funksiyalarının modulyasiyası yolu ilə. CB1R antaqonisti olan Rimonabant, diqqətəlayiq piylənmə əleyhinə təsir göstərdi, lakin müşayiət olunan psixiatrik yan təsirlər onun bazardan çıxarılmasına səbəb oldu [170]. Koch tərəfindən müasir bir araşdırma iştahın idarə edilməsində CB1R rolunun aydınlaşdırılmasında son irəliləyişləri ümumiləşdirdi [171].

Ağrının tənzimlənməsi kannabinoidlərin ən erkən tibbi tətbiqlərindən biridir [1,2]. Çoxsaylı tədqiqatlar kimyəvi, mexaniki və istilik ağrıları, həmçinin nöropatik, iltihablı və xərçəng ağrıları da daxil olmaqla müxtəlif növ ağrılarda kannabinoidlərin analjezik təsirini sənədləşdirmişdir [172,173]. Endokannabinoid sistemi də nosisepsiyonun tənzimlənməsində iştirak edir [3]. Yeni nəşr olunmuş araşdırma yazısı, iltihablı və nöropatik ağrıların idarə edilməsində endokannabinoidlərin roluna dair preklinik və klinik tədqiqatları ətraflı şəkildə müzakirə etmişdir [173]. CB1R-ə əlavə olaraq, CB2R və TRPV1-in kannabinoid vasitəçiliyi ilə ağrının tənzimlənməsində iştirakını dəstəkləyən sübutlar da mövcuddur [174,175]. Bundan əlavə, fitokannabinoidlər bu gün antinosiseptiv və digər nevroloji pozğunluqlar sahəsində çox diqqət çəkmişdir. CBD, məsələn, bir çox araşdırmada xroniki ağrını modulyasiya etdiyi göstərilmişdir [173]. Eyni miqdarda THC və CBD ehtiva edən Sativex markalı dərman, xroniki ağrı da daxil olmaqla bir neçə növ sklerozla əlaqəli simptomları müalicə etmək üçün istifadə olunur [176]. CBD -nin CB1R və ​​CB2R -ə əhəmiyyətsiz yaxınlıq göstərməsinə baxmayaraq, son tədqiqatlar bunun THC -nin təsirini gücləndirmək qabiliyyətinə malik olan allosterik modulator və CBR -lərin dolayı antaqonisti olduğunu irəli sürmüşdür [177].

Xərçəngdə istifadə olunan kannabinoidlər, ürəkbulanma və qusmanı azaltmaq, xərçəng ağrısını yüngülləşdirmək və iştahı stimullaşdırmaq da daxil olmaqla palliativ təsirləri ilə ən çox tanınırlar [178,179]. Kannabinoidlərin birbaşa hüceyrə yayılması və apoptozun induksiyası yolu ilə və ya dolayı yolla angiogenez, istila və metastazın inhibə edilməsi yolu ilə şiş əleyhinə təsir göstərə biləcəyi iddia edilmişdir [180]. Müxtəlif xərçəng hüceyrə xətlərində sintetik/endo-/fito-kannabinoidlər və endokannabinoid sistem tənzimləyicilərindən istifadə edilən çoxsaylı tədqiqatlar bu fikri dəstəkləyir [181]. Kannabinoidlərin antitümör təsirləri müxtəlif heyvan şiş modellərində də müşahidə edilmişdir [180]. Ümumiyyətlə, şiş toxumalarında inkişaf etmiş bir endokannabinoid sistemi görünür [179,182,183]. Bununla belə, yuxarı tənzimlənən endokannabinoid sistem fəaliyyətinin rolu hələ də mübahisəlidir, çünki xərçəng hüceyrələrində kannabinoidlərin proliferativ və anti-proliferativ rolunu dəstəkləyən ziddiyyətli nəticələr bildirilmişdir [180,181]. Maraqlıdır ki, kannabinoidlərin xərçəng hüceyrələrinin böyüməsinə bimodal təsiri də müşahidə edilmişdir, aşağı konsentrasiyalar proliferativ və yüksək konsentrasiyalar pro-apoptotikdir [184].


Ekstrasinaptik NMDA reseptorlarının təşkili, nəzarəti və funksiyası

N.-metil d -aspartat reseptorları (NMDAR), funksional reseptora birləşə bilən çoxlu alt birləşmələr sayəsində müxtəlif formalarda mövcuddur. Bundan əlavə, onlar yalnız sinapslarda deyil, həm də ekstrasinaptik yerlərdə yerləşirlər. Son on il ərzində xüsusi NMDAR alt tiplərinin və/və ya yerlərinin sinaptik plastisiyanı və eksitotoksisitəni induksiya etməkdən məsul olub -olmaması ilə bağlı sıx spekulyasiyalar olmuşdur. Burada, ekstrasinaptik yerlərdə NMDAR-ların təşkili, subunit tərkibi və endogen nəzarəti ilə bağlı ən son tapıntıları nəzərdən keçiririk və onların ehtimal olunan funksiyalarını nəzərdən keçiririk. Astrositlər qliotransmitterlərin sərbəst buraxılması vasitəsilə NMDAR-ları idarə edə bildiyi üçün biz bu reseptorların fəaliyyətinin tənzimlənməsində glial mühitin rolunu da müzakirə edirik.

1. Giriş

N.-metil d -aspartat reseptorları (NMDARs), inkişaf və yetkinlik dövründə sinir fiziologiyasına çoxlu təsirləri səbəbiylə nevrologlar üçün uzun müddətdir böyük maraq kəsb edir. Bliss və Lomo [1] tərəfindən uzunmüddətli sinaptik plastisiyanın əsas kəşfindən sonra NMDAR-lar sinaptik ötürülmənin uzunmüddətli potensiasiyasında (LTP) və uzunmüddətli depressiyasında (LTD) əsas rolu ilə tanınır [2]. Bununla belə, bu qlutamat qapalı ion kanalları kalsium üçün yüksək keçiricilik qabiliyyətinə malik olduğundan, onlar nəinki fizioloji siqnalı neyronlara ötürür, həm də nəticədə hüceyrə ölümünə səbəb ola biləcək hüceyrədaxili siqnal kaskadlarını işə sala bilər. Əslində, eksitotoksisite [3] fenomeni və həddindən artıq glutamat salınması ilə əlaqəli səbəb əlaqəsi [4] sinaptik plastisiyanın mövcudluğunun qurulmasından bir neçə il əvvəl təsvir edilmişdir, lakin NMDAR-ların yalnız glutamata bağlı olan əsas kalsium mənbəyi olduğu sübut edilmişdir. 1980 -ci illərin sonlarında eksitotoksiklik [5-7]. O vaxtdan bəri, bu reseptorlar ikililiyi ilə məşhurdur. Həm zəruri, həm də potensial zərərli reseptorlardır ki, onların fəaliyyəti incə və sıx nəzarət edilməlidir. Bu cür tənzimləmə, hüceyrədaxili ortaqlar, maqnezium bloku, endogen allosterik modulyatorlar, həmçinin agonist və ko-agonist bağlama daxil olmaqla bir çox hüceyrədaxili və hüceyrədaxili amillərlə təmin edilir. Maraqlıdır ki, bu tənzimləyici hərəkətlərin çoxu reseptorun alt birliyinə çox həssasdır [8,9]. Subunitlərə xas farmakoloji antaqonistlərin inkişafı ilə yanaşı, son onilliklər ərzində xüsusi olaraq GluN2B ehtiva edən heterodimerlərə xüsusi diqqət yetirilərək NMDAR alt növlərinin xüsusi rollarına dair sübutlar toplanmışdır [8,9]. 1995-ci ildə, digər ötürücü qapalı ion kanalları kimi, NMDAR-ların da ekstrasinaptik yerlərdə əhəmiyyətli nisbətdə mövcud olduğu aşkar edilmişdir [10-13]. Reseptorların yeri, onların GluN2B məzmunu və sinaptik plastiklik istiqamətindəki və hüceyrə ölümündəki rolları arasındakı əlaqələr tezliklə qəbul edildi [14,15]. Bu, NMDARs üçün yeni bir çılğınlıq yaratdı və bu reseptorların hüceyrə fiziologiyası və patologiyasına necə təsir etdiyini anlamlı bir şəkildə anlamaq üçün zəmin yaratdı. Bu yaxınlarda NMDAR-lar yeni maraq qazandı, çünki astrositlər tərəfindən buraxılan potensial qliotransmitter olan d-serin ([16], lakin [17] bax) onların qlisin bağlayan yerində endogen ko-aqonist kimi fəaliyyət göstərdiyi aşkar edilmişdir [16]. ,18–21]. Bu kəşf qlianı NMDAR funksiyasının mümkün tənzimləyicisinə çevirdi və NMDAR sahəsi ilə glial hüceyrələrin genişlənən sahəsi arasında maraqlı çarpaz söhbətin yaranmasına işarə etdi. Bu araşdırmada, ekstrasinaptik yerlərdə NMDARların təşkilatı, endogen nəzarəti və funksiyaları və bu reseptorların fəaliyyətində glianın hansı rol oynaya biləcəyi ilə bağlı ən son tapıntıları müzakirə edirik.

2. Ekstrasinaptik məkanın müəyyən edilməsi

Sinaptik və ekstrasinaptik boşluqların kəskin şəkildə müəyyən edilməsi, xüsusən də mikroskopiya və elektrofizyoloji məlumatlarını uzlaşdırmağa çalışdıqda çətindir. Bu çətinlik, morfoloji ipuçlarına əsaslanan ekstrasinaptik hesab etdiyi şeyin hələ də sinaptik boşluğun bir hissəsi ola biləcəyindən irəli gəlir. Morfoloji baxımdan, reseptorlar, post-sinaptik sıxlıqdan (PSD) 100 nm-dən çox uzağa gedərsə, çox vaxt ekstrasinaptik hesab olunur [22,23]. Bununla birlikdə, bu morfoloji tərif, sinaptik ötürmə zamanı glutamatın dağılmasını nəzərə almır və bu, ehtimal ki, dendritik onurğaların boynunda (yəni perisinaptik reseptorlar) və ya dendritik şaftda yerləşən reseptorları aktivləşdirir. Elektrofizioloji baxımdan, sinaptik fizioloqlar konvensiyası, sinaptik NMDAR -ları aşağı tezlikdə (0,05 Hz -dən az) afferent stimullaşdırma zamanı və ya miniatür həyəcanlandırıcı reaksiyalar verən spontan glutamatın salınmasına cavab olaraq qəbul edilənlər kimi təyin edir [24-29]. Ekstrasinaptik NMDAR-lar belə şəraitdə aktivləşdirilməyən reseptorlara uyğun gəlir [24-29].Sinaptik NMDAR-ların bu elektrofizyoloji tərifi, yalnız sinapslarda deyil, həm də aşağı tezlikli sinaptik ötürülməyə mülayim olsa da kömək edə bilən peri və ya ekstrasinaptik yerlərdə yerləşən reseptorları əhatə edə bilər. Bazal sinaptik ötürülmə zamanı glutamatın nə dərəcədə töküldüyünü təyin etmək çətin olduğundan, sinaptik və ekstrasinaptik boşluqların morfoloji və elektrofizioloji tərifinin nə dərəcədə üst -üstə düşdüyü məlum deyil. Əslində, sinaptik-ekstrasinaptik sərhədin dəqiq təsviri nəzərə alınan parametrə xas görünür və çox güman ki, bu sərhədin hərtərəfli tərifini tapmaq mümkün deyil.

3. Ekstrasinaptik yerlərdə NMDAR təşkilatı

NMDAR-ların ekstrasinaptik yerlərdə [10-13,30-36] bəzi təsadüfi müşahidələrinə baxmayaraq, ekstrasinaptik yerlərdə post-sinaptik NMDAR-ların təşkilini birbaşa və geniş şəkildə araşdırmaq üçün ilk tədqiqat 2010-cu ildə nəşr edilmişdir [22]. Maraqlıdır ki, ekstrasinaptik NMDAR -lar perisinaptik zona (45%) və dendritik şaft (55%) boyunca diskret paylanmaqla qruplar şəklində təşkil olunmuşdur [22]. Xüsusilə, bu qruplar tez-tez dendrit və ona bitişik hüceyrə prosesləri, o cümlədən glial (təxminən 25%), aksonal (təxminən 50%) və ya dendritik (təxminən 25%) proseslər arasında əlaqə sahəsinə uyğun gəlir. Bu ekstrasinaptik yerlər orta hesabla 100 nm-dən az genişliyə yayılır, yəni CA1 bölgəsində təxmin edilən eni 195 nm olan sinaptik yerlərdən əhəmiyyətli dərəcədə dardır [37]. Maraqlıdır ki, ekstrasinaptik NMDAR çoxluqları β-kateninlər və mədəniyyətdə SAP102 və PSD95 kimi bəzi iskele zülalları [22] kimi hüceyrələrarası yapışma molekulları ilə birləşir, baxmayaraq ki, bu işdə hər hansı bir xüsusi MAGUK-ların NMDARsynaptic ilə üstünlük təşkil edib-etməyəcəyi aydın deyil. . Bu müşahidələr, ekstrasinaptik NMDAR -ların sinaptik homologlarına bənzər şəkildə plazma membranında qruplaşdırıldığını və təşkil edildiyini güclü şəkildə göstərir. NMDARlar nə bərabər, nə də təsadüfi olaraq dendritik şaft boyunca paylanmır və ehtimal ki, mədəniyyətlərdə göstərildiyi kimi yayılmaqda sərbəst deyillər [38-40]. Bu, ekstrasinaptik NMDAR-ların mahiyyətcə sinapslara cəlb olunmağı gözləyən ehtiyat reseptor hovuzu olması ilə bağlı ümumi fikrə qarşı çıxır. Əslində, bu reseptorların çox spesifik hüceyrə təmas sahələrinə toplandığının tapılması onların sinaptik homoloqlarından asılı olmayaraq fərqli bir siqnal funksiyasını yerinə yetirə biləcəyini göstərir. Harris və Pettitin işi [26] artıq sinaptik və ekstrasinaptik NMDAR-ların hipokampal dilimlərdə CA1 neyronlarının səthində fərqli və sabit reseptor hovuzlarını təmsil etdiyini nümayiş etdirməklə bu fikri dəstəklədi.

4. Ekstrasinaptik yerlərdə GluN2B-NMDARlar

Ümumiyyətlə ekstrasinaptik NMDAR-ların GluN2B tərkibli heterodimerlərlə (GluN2B-NMDARs) zənginləşdirildiyinə inanılır. Bu, ekstrasinaptik NMDAR -ların müəyyən bir funksiyanı yerinə yetirən fərqli bir əhali təşkil etdiyi fikrinə uyğun gəlir. GluN2B-NMDAR-ların konsentrasiyası ekstrasinaptik məkanda daha aşağı olan qlutamat üçün daha yüksək yaxınlığa malik olduğunu nəzərə alsaq, bu fikir də olduqca qənaətbəxşdir [8,9,41,42]. Nəhayət, GluN2B-NMDAR-lərin bu lokalizasiyası, NMDAR-ların hüceyrədaxili tərəfdaşları ilə qarşılıqlı əlaqəsi baxımından da məntiqli olardı. Həqiqətən də, GluN2 alt birimlərinin C terminal terminalı (CTD), reseptorun qarşılıqlı təsir göstərə biləcəyi iskele zülalını diktə edir və beləliklə, NMDAR alt tiplərinin səthi lokalizasiyasına güclü təsir göstərir ([8,9] -da ətraflı şəkildə nəzərdən keçirildiyi kimi). GluN2A-NMDAR-lərin PSD95 ilə əlaqəli olması məsləhət görülür ki, bu da PSD ilə fəaliyyət sahəsini məhdudlaşdırır və təkrar emaldan əvvəl yarı ömrünü artırır [38,43-47]. PSD95 ilə deyil, SAP102 ilə əlaqə qurmağa meylli olduqları üçün GluN2B-NMDARların daha hərəkətli, geniş yayılmış və böyüklərdə sinapsla məhdudlaşmadığı düşünülür [45,47]. Əslində, GluN2A və GluN2B alt bölmələrinin ifadəsi inkişaf zamanı müvafiq olaraq PSD95 və SAP102 ifadəsini yaxından izləyir [47] və sübutlar göstərir ki, (i) neonatal GluN2B-NMDAR-ların erkən mərhələlərdə SAP102 ilə qarşılıqlı əlaqəsi vasitəsilə sinapslarda saxlanılır. inkişafın (ii) PSD95 ifadəsi doğuşdan sonrakı inkişaf müddətində artır və PSD -yə daxil olmaq üçün SAP102 ilə rəqabət aparır və (iii) bu, SAP102 və GluN2B alt hissələrini sinaps xaricində yerdəyişdirir, PSD95 və GluN2A isə sinaptik yerlərdə üstünlük təşkil edir [22,45, 48,49]. Vizual korteks və üstün kollikulus nöronlarının hələ də yetkinlik dövründə SAP102 və GluN2B alt birləşmələrinin [45,47] əhəmiyyətli ifadəsini nümayiş etdirmələri ilə yanaşı [45,47], bu müşahidələr GluN2B-NMDAR-ların GluN2A- dan daha çox ekstrasinaptik yerlərdə mövcud olduğu fikrini gücləndirir. Tercihen sinapslarda olan NMDAR-lar.

Bununla birlikdə, yalnız bir neçə tədqiqat beyin dilimlərində bu xüsusiyyəti funksional olaraq və çox vaxt dolayı yolla araşdırmışdır. Bu sualı xüsusi olaraq həll edən Harris & amp Pettit [26], hər ikisində də böyük miqdarda GluN2B-NMDAR təyin etdikləri üçün siçovul hipokampının CA1 bölgəsində ekstasinaptik bir yerdə sinapslarla müqayisədə GluN2B-NMDARların xüsusi bir zənginləşdirilməsini tapmadılar. yerlər. Əksinə, Fellin və s. [50], glia mənşəli glutamat tərəfindən aktivləşdirilən ekstrasinaptik NMDARlar üzərində qabaqcıl işlər görən, oxşar müşahidələrə uyğun olaraq sinaps xaricində GluN2B-NMDAR nisbi zənginləşməsini müşahidə etdi [51-53]. Təəssüf ki, bu tədqiqatların hamısı gənc gəmiricilərdən (P10-P22) əldə edilən dilimlərdə, inkişaf zamanı, GluN2B- dən GluN2A-alt birliyi olan NMDARlara keçidin hələ də sinapslarda baş verdiyi zaman həyata keçirildi [9]. Məsələn, Harris və Pettit, gözlənildiyi kimi, GluN2B-NMDARların ilk ay ərzində sinapslardan yoxa çıxdığını tapdılar, lakin təəssüf ki, yetkinlik yaşına çatmamış heyvanlarda sinaptik və ekstrasinaptik kompozisiyanın müqayisəsini apardılar (P15) [26] GluN2B məzmunundakı fərq. Əlavə olaraq, ekstrasinaptik NMDAR -ların da alt birləşmə tərkibində inkişaf dəyişikliyinə məruz qalıb -qalmadığı bilinmir. Buna görə də, əsasən yetişməmiş heyvanların dilimlərində və ya mədəniyyətlərdə aparıldığı üçün, sinaptik və ekstrasinaptik yerlərdə NMDAR alt birliyi kompozisiyasının öyrənilməsi indiyə qədər əslində ziddiyyətli nəticələrə və qarışıqlığa səbəb olmuşdur.

Yetkin gəmiricilərlə mübarizə aparılsa belə, vəziyyət daha aydın görünmür. Yetkin siçovulların hipokampal CA1 piramidal neyronlarında GluN2B-NMDAR-ların sinapslarda olmadığı, lakin hələ də ekstrasinaptik yerlərdə tapıla biləcəyi göstərilmişdir [19]. Bununla birlikdə, GluN2B-nin sinapslarda GluN2A-NMDAR ilə əvəz edilməsi hər yerdə və tam deyil və GluN2B-NMDAR hələ də yetkin mərkəzi sinir sisteminin (CNS) bir çox digər bölgələrində sinaptik NMDARların böyük bir hissəsini təmsil edir [16,54]. [9]-da nəzərdən keçirilmişdir. Buna görə də, geniş şəkildə qəbul olunsa da, ekstrasinaptik reseptorların mahiyyətcə GluN2B-NMDAR olması və ya ən azı sinaptik həmkarı ilə müqayisədə GluN2B-NMDAR-larla zəngin olması fikri hələ də müzakirə üçün açıqdır.

5. Ekstrasinaptik yerlərdə NMDAR-ın agonist nəzarəti

1989 -cu ildə, mülayim depolarizasiya şəraitində hipokampın əsas neyronlarında NMDAR -ın vasitəçiliyi ilə bir tonik cərəyanının mövcudluğu bildirildi [55]. GABAR-vasitəçili tonik cərəyanlar [56] üçün məlum olana bənzər, NMDAR vasitəçiliyi ilə tonik cərəyanı kifayət qədər ətraf aqonist konsentrasiyası [42,55] və sinapslardan kənarda yerləşən reseptorlar tərəfindən yaradılan [55,57,58] kimi görünür. . Həqiqətən də, sinaptik aktivlik tetrodotoksin ilə bastırıldıqda NMDAR vasitəçiliyində olan tonik cərəyanı davam edir və əksinə sinaptik NMDAR aktivliyi, bu reseptorları sinaptik reseptorlardan fərqli və bir qədər uzaq olan MK801 [58] ilə bağlandıqdan sonra sinaptik NMDAR aktivliyinə təsirsiz qalır. . Bununla belə, bu cür tonik aktivləşdirməyə imkan verən ətraf mühit qlutamatın mənşəyi hələ də aydın deyil və onun qeyri-sinaptik mənşəli olduğu müşahidəsindən başqa, mənbəyə dair çox az dəlil mövcuddur [58,59]. Maraqlıdır ki, NMDAR vasitəçiliyində olan tonik cərəyanının amplitudası, əsasən glial hüceyrələrdə olan və glutamat nəqlinin 95% -nə vasitəçilik edən glutamat daşıyıcısı 1 (GLT1) [58,60] vasitəsilə glutamatın geri alınmasını bloklayaraq güclü şəkildə artır. glial toksinlərlə mübarizə aparırlar [60]. Əlavə olaraq, son bir araşdırma göstərdi ki, NMDAR vasitəçiliyində olan tonik cərəyanının həcmi hipotalamusun supraoptik nüvəsindəki glial əhatə dairəsindən asılıdır [60]. Beləliklə, tonik cərəyana vasitəçilik edən NMDAR-ların fəaliyyəti, ehtimal ki, glia tərəfindən ekstrasinaptik glutamat tonunun tənzimlənməsinə əsaslanır. Bu müşahidələrin nəticəsi ondan ibarətdir ki, ekstrasinaptik NMDAR-ların bu alt çoxluğu konstruktiv olaraq aktivləşir. Bununla birlikdə, ekstrasinaptik NMDARlar ekzogen NMDA və ya glutamat tətbiqləri ilə də təcrübə yolu ilə cəlb edilə bilər. Bu, qeyri-aktiv zona sahələrindən glutamatın fazik, 'ektopik' salınması ilə aktivləşdirilə bilən ekstrasinaptik NMDAR-ların başqa bir alt populyasiyasının olduğunu göstərir (lakin aşağıya baxın). Ekstrasinaptik NMDAR-ların bu cür faz fəaliyyətinin əsas təzahürü CA1 bölgəsinin əsas neyronlarında əmələ gələn ləng (saniyələrlə parçalanma müddəti), nadir (təxminən 0,05 Hz) böyük amplituda (yüzlərlə pA) daxili cərəyanlardır. hipokamp [50,51,53] və dorsal buynuzun səthi təbəqələrində [52,61]. Yavaş daxili cərəyanlar (SIC) adlandırılan bu cür cərəyanlar, sinir və/və ya sinaptik aktivlik olmadıqda da davam edir [51] və glial inhibitorlar [52] tərəfindən tamamilə yatırılır. Sübutlar, bu cür cərəyanların glutamatın gliyadan ekstrasinaptik NMDARlara [33,41,50,62,63] salınmasından qaynaqlandığını göstərir. Bununla birlikdə, bu prosesin dəqiq yolu araşdırılır. Göstərilmişdir ki, PAR1 reseptorları [53] kimi hipokampusda [50,51] astrositik G-proteinlə əlaqəli reseptorların (GPCR) aktivləşdirilməsi ilə SIC tezliyi və amplitudası artır. Eyni zamanda, astrositlərdə PAR1 reseptorunun stimullaşdırılmasının hipokampusdakı Best1 kanalları vasitəsilə kalsiumdan asılı olaraq qlutamatın sərbəst buraxılmasını tetiklediyi göstərilmişdir [64-66]. Beləliklə, SIC-lər PAR1-in aktivləşdirilməsindən sonra ekstrasinaptik NMDAR-lara Best1 kanalları vasitəsilə astrositdən əldə edilən glutamatın salınması nəticəsində yarana bilər. Baxmayaraq ki, bu cəlbedici nəzəriyyə SIC-lərin meydana gəlməsi üçün astrositlərdə kalsium aktivliyinin lazım olduğuna dair əvvəlki müşahidələrə uyğun gəlsə də [50,53,61], astrositlərdən vezikulyar yüklənmənin tələb olunduğu fikri ilə tamamilə ziddiyyət təşkil edərdi [50]. Əlavə olaraq, endogen PAR1 fəaliyyətinin ekzogen eksperimental stimullaşdırma olmadan SIC-ləri tetikleyebileceği aydın deyil. Beləliklə, metabotropik qlutamat reseptorları, prostaqlandin reseptorları və ya digər astrositik GPCR-ləri əhatə edən və vezikulyar sərbəst buraxılmağa əsaslanan digər yollar oyunda ola bilər [50,51].

Mexanik əhəmiyyətindən başqa, bu müşahidələr maraqlıdır, çünki ekstrasinaptik NMDAR-ların iki funksional olaraq fərqli hovuzda mövcud olma ehtimalını açırlar: (i) həddindən artıq miqdarda glutamat və ko-agonistlərlə üzləşən toniklə aktivləşdirilmiş reseptorlar və (ii) ümumi səssiz ekstrasinaptik Ekzogen və ya endogen (sinaptik olmayan) glutamat salınması ilə kəskin şəkildə cəlb edilə bilən NMDAR-lar. Əgər doğrudursa, bu, glutamatın mövcudluğunun sinaps xaricində homojen olmadığını və məkan baxımından tənzimlənə biləcəyini, fərqli alt hissələrə səbəb ola biləcəyini ifadə edə bilər. Başqa bir şərh, tonik və fazik ekstrasinaptik NMDAR reaksiyalarının eyni reseptor populyasiyasının vasitəçiliyi ola bilər: tonik cərəyanı bu reseptorlar tərəfindən glutamata bağlanma yerinin qismən tutulması altında həyata keçirilə bilər və əlavə (yəni fazik) glutamatın sərbəst buraxılmasına səbəb ola bilər. müvəqqəti doyma və əlavə reseptorların cəlb edilməsi. Bu, sırf spekulyativ olsa da, burada təklif edirik ki, ekstrasinaptik məkanı ən azı glutamat nöqteyi-nəzərindən, bir böyük homojen həcm əvəzinə ayrı-ayrı domenlərdən ibarət kimi nəzərdən keçirmək məqsədəuyğun ola bilər (şəkil 1). Hüceyrədənkənar məkanda glutamatın salınmasını, udulmasını və yayılmasını tənzimləyən qaydaları başa düşmək, əlbəttə ki, bu vəziyyətə və ekstrasinaptik NMDAR -ların nəzarət və rollarına aydınlıq gətirəcəkdir.

Şəkil 1. Ekstrasinaptik yerlərdə NMDAR təşkilatının sadələşdirilmiş görünüşü. Astrositik proseslər glutamatı GLT1 və qlisini GlyT1 vasitəsi ilə alır, sinapslarda d -serin (d -ser) buraxır. Astrocytic GLT1, ekstrasinaptik NMDARların yaxınlığındakı glutamat konsentrasiyasını da azaldır (ətrafdakı glutamat konsentrasiyaları mavi rəngdə solğun şəkildə təsvir edilmişdir: tünd mavi daha yüksək glutamat konsentrasiyalarını təmsil edir). Bu, astrositik GPCR-lərin aktivləşməsi ilə post sinaptik neyronda SIC-lərin yaranmasına səbəb olaraq, reseptorların vezikulyar (ves.) Və ya astrositlər tərəfindən Best1 vasitəsi ilə glutamatın sərbəst buraxılması yolu ilə kəskin aktivləşməsinə imkan verə bilər. Digər tərəfdən, glial proseslərə və/və ya GLT1 -ə yaxın olmayan ekstrasinaptik NMDARlar, həddindən artıq glutamat konsentrasiyası ilə üzləşə və tonik cərəyanına vasitəçilik edə bilər. Ədəbiyyat, ekstrasinaptik NMDAR -ların sinaptik homologlarından (PSD95) fərqli olaraq hüceyrədaxili tərəfdaşlarla (SAP102) qarşılıqlı təsir göstərə biləcəyini irəli sürdü, lakin bu cəhət tam aydın deyil. Eynilə, sinaptik və ekstrasinaptik NMDAR -ların eksitotoksisiteye töhfəsi hələ də mübahisəlidir. Əksinə, görünür, sinaptik NMDAR -lar LTP -yə töhfə verir, LTD üçün isə ekstrasinaptik və sinaptik NMDAR -lar tələb olunur. Yapışma molekullarının (məsələn, β-kateninlər) olması təsvir edilmişdir. Mübahisəyə qarışıqlıq əlavə etməmək üçün NMDAR alt birliyi tərkibi məqsədli olaraq buraxıldı (əsas mətnə ​​baxın).

6. Ekstrasinaptik NMDARların birgə agonist nəzarəti

25 ildən çox əvvəl göstərildiyi kimi, NMDAR -ların bir deyil, iki agonistin aktivləşdirilməsini tələb edən unikal xüsusiyyəti var [67]. Ko-aqonist adlandırılan ikinci agonistin şəxsiyyəti yaxın vaxtlara qədər çətin idi, baxmayaraq ki, qlisinin əvvəlcə ko-aqonist sahəsinə bağlandığı göstərilmişdir [67-69]. Yetkin siçovul hipokampının CA1 bölgəsində, d -serinin sinaptik NMDARların endogen ko -agonisti olduğu, lakin qlisinin tonik cərəyanına vasitəçilik edən və ekzogen tətbiq nəticəsində yaranan reaksiyaya töhfə verən ekstrasinaptik NMDARları bağladığı bu yaxınlarda nümayiş etdirildi. NMDA [19]. Bu işdə SIC -lər araşdırılmamışdır və SIC -lərə vasitəçilik edən NMDAR -ların da glisin və ya d -serin ilə bağlanması hələ də bilinmir. Bu potensial olaraq böyük maraq doğurur, çünki SIC -lərin glutamatın sərbəst buraxılmasından qaynaqlandığına dair heç bir faktiki sübut yoxdur. Bunun əvəzinə, ətraf glutamatın həddindən artıq səviyyəsi ilə üzləşən NMDAR -larda astrositlər tərəfindən d -serin və ya glisinin salınması ilə SIC -lər yarana bilər. Heç vaxt nəzərə alınmamış bu fərziyyə, SIC-lərdə artıq mövcud olan məlumatların məcmusuna uyğun gəlir (lakin hüceyrədənkənar məkanda qlisinin konsentrasiyası ilə bağlı aşağıdakı mülahizələrə baxın) və glutamat daşıyıcılarının bloklanmasının niyə SIC amplitüdünü və ya tezliyini mütləq artırmadığını izah edəcək. SIC vasitəçiliyi edən NMDAR-lar artıq glutamatın doymuş səviyyələri ilə üzləşmişdilər [50].

Maraqlıdır ki, NMDAR -ların sinaptik və ekstrasinaptik yerlərdə istifadə etdiyi co -agonistdəki fərq, ilk növbədə d -serinin sinapslarda sərbəst buraxılmasına və glial glisin daşıyıcısının 1 (GlyT1) aktivliyinin glisinə daxil olmasını maneə törətdiyinə əsaslanır. sinaptik yarıq [19]. Beləliklə, NMDAR -lərin birgə agonist nəzarəti ilə əlaqədar olaraq sinaptik və ekstrasinaptik məkan arasındakı fərq d -serin və qlisin bolluğu ilə müəyyən edilir. Bununla belə, ko-aqonistlər tərəfindən təsvir olunan domenlərin qlutamat yayılması ilə müəyyən edilmiş domenlərə uyğun olub-olmaması aydın deyil (“Ekstrasinaptik məkanın müəyyən edilməsi” bölməsinə baxın).

Ekstrasinaptik NMDAR-lar üçün mövcud olan glisinin mənşəyi daha da aydın deyil. Retina və onurğa beyni kimi glisinerjik innervasyonun bol olduğu strukturlarda, NMDARsda endogen bir ko-agonist kimi xidmət edən glisin glisinerjik terminallardan qaynaqlanır [70,71]. Bu preparatlarda, inhibitor sinapslarda sərbəst buraxılan glisinin töküldüyü və uzaq NMDAR -lara bağlanmaq üçün yayıldığı nümayiş etdirildi. Bununla belə, yetkin hipokampusda ekstrasinaptik qlisin reseptorlarının (GlyRs) mövcudluğu sənədləşdirilsə də [72,73], glisinergik terminalların mövcudluğu heç vaxt müəyyən edilməmişdir. Əslində, inhibitor ötürülmə bu quruluşdakı GABA reseptor antagonistləri tərəfindən tamamilə ləğv edilir [74] və funksional GlyR -lərin ifadəsinin doğumdan sonra dayandığı düşünülür [74-76]. Mikrodializ, sərbəst glisin miqdarının olduğunu ortaya qoydu in vivo hipokampda 10 uM qədər yüksəkdir [77,78]. İn vivo, MSS -də hüceyrədaxili qlisinin əsas mənbəyi qan axını ola bilər. Həqiqətən də qanda təxminən 200 µM qlisin var [79] və qlisin qlisin daşıyıcıları [80,81] vasitəsilə kapilyarların endotel divarından keçə bilir. Dilimlərdə isə qan damarları əsasən ilkin məzmunundan boşalır, qlisin mənbəyini beyin parenximasının özünə qədər daraldır. 3-6 mM glisin ehtiva etdikləri üçün [82], glial hüceyrələr beyin dilimlərində əsas glisin mənbəyi ola bilər. Göstərilmişdir ki, kalium kalsiumdan müstəqil mexanizm vasitəsilə mədəniyyətdə glial hüceyrələr tərəfindən qlisinin sərbəst buraxılmasını stimullaşdırır [83-85]. Bundan əlavə, GlyT1 aktivliyi müəyyən şərtlərdə geri çevrilə bilər ki, bu da hüceyrədənkənar boşluğa qlisinin axmasına səbəb olur [86,87]. Məsələn, serebellumda, Bergmann glial hüceyrələrinə hipokampal astrositlərdə [82] təxmin edilən konsentrasiyası olan 4 mM glisin vurulub yumşaq bir membran depolarizasiyasına (təqribən -50 mV) məruz qalarsa, GlyT1 məsullaşır. glisin axını. Hipokampusda başqa bir diqqətəlayiq glisin mənbəyi GABA interneurons ola bilər. Mahnı və s. [88] həqiqətən CA1 bölgəsində GABA internöronlarının tərkibində glisin və ekspres glisin daşıyıcısı 2 (GlyT2) olduğunu göstərdi. Qlisinin, talamus, beyin sapı, onurğa beyni və korteksdə baş verənlərə bənzər inhibitor sinapslarda GABA ilə birlikdə sərbəst buraxıla biləcəyini irəli sürdülər [89-94].

Glisinin mənşəyindən asılı olmayaraq, in vivo mikrodializ göstərir ki, ekstrasinaptik NMDAR-lar üçün mövcud olan qlisinin miqdarı doymaq üçün kifayət qədər yüksək olmalıdır [77,78], xüsusən bu reseptorlar GluN2B = NMDAR (EC) olduqda50 < 1 µM). Bu fikrə uyğun olaraq, co-agonistin ekzogen tətbiqlərinin NMDAR-ın vasitəçilik tonik cərəyanının amplitüdünü artırmadığı müşahidə edildi [58]. Doğrudur, bu, ekstasinaptik yerlərdə birgə agonist bağlayıcı sahə vasitəsi ilə NMDAR fəaliyyətinin tənzimləyici mexanizmləri və modulyasiyası üçün çox az yer olduğu deməkdir, lakin bu heç vaxt SIC-lər və ya ekstrasinaptik NMDAR fəaliyyətinin hər hansı digər təzahürü üçün nəzərdə tutulmamışdır. Bu təəccüblü məqam əlavə araşdırmaya ehtiyac duyur.

7. Yavaş içəri axınların və tonik cərəyanın fiziologiya və patologiyada rolu

Ekstrasinaptik NMDAR -ların oynadığı rollar hələ də çox çətin olur, çünki onları araşdırmaq üçün xüsusi və etibarlı vasitələr indiyə qədər çatışmır. Bəzi tədqiqatlar sinaptik olmayan NMDAR-ların ekstrasinaptik inhibisyon [95] və ya dinamik diapazon sıxılma [96] kimi müxtəlif funksiyalarda rol oynadığını bildirmişdir. Lakin, bu icmalda toxunulmayan presinaptik NMDAR-lardan [97,98] başqa, əksər tədqiqatlar tonik cərəyanlar və SIC kimi ekstrasinaptik NMDAR fəaliyyətinin təzahürlərinə yönəlmişdir. Ekstrasinaptik NMDAR -ın vasitəçilik etdiyi tonik cərəyanın əsas neyronların həyəcanlanmasında və dendritik girişlərin modulyasiyasında rol oynadığı qəbul edilir [99]. NMDAR vasitəçiliyində olan tonik cərəyanının kokain asılılığından [100] Alzheimer xəstəliyinə [101] qədər dəyişən patoloji şəraitdə tənzimlənə biləcəyi də getdikcə aydınlaşır. Bununla belə, bu cür tonik cərəyanın neyron fiziologiyasına uyğunluğu və onun patoloji pozulmasının təsiri əlavə araşdırma tələb edir. Bunun əksinə olaraq, SIC -lər olduqca yaxşı xarakterizə olunmuşdur (yuxarıya bax) və eyni vaxtda bir -birindən 100 mikron məsafədə fərqli neyronlarda meydana gəldiyi göstərilmişdir [51]. Bu, SIC-lərin anatomik ərazisi təxminən 50-100 mikron diametrli bir ərazini əhatə edən astrositlərdən glutamat (və ya ko-agonist) salınması nəticəsində yarandığı fikrinə uyğundur. Bu müşahidələrə əsaslanaraq, SIC -lərin neyron sinxronizasiyasında və şəbəkə həyəcanında rol oynaması təklif edilmişdir [51,52]. Bununla birlikdə, bu günə qədər yalnız dilimlərdə, çox vaxt fizioloji olmayan şərtlərdə (aşağı maqnezium, GLT1 blokerləri) müşahidə edilmişdir. SIC -lərin neyron -glia siqnalının vacib bir xüsusiyyətini ifadə edib -etməməsi də baş verir in vivo, qurulmaqda davam edir, ancaq qeyd etmək lazımdır ki, SIC amplitudasının heyvan iltihab modellərində artdığını nümayiş etdirmişdir [61].

8. Uzun müddətli potensiya və uzun müddətli depressiya: alt birliyin tərkibinin və/və ya lokalizasiyanın əhəmiyyəti haqqında?

Həm genetik, həm də farmakoloji yanaşmalardan istifadə edərək, spesifik NMDAR alt tiplərinin LTP və ya LTD -ni seçici şəkildə induksiya etməkdən məsul olduğuna dair sıx fərziyyələr və bir çox nümayişlər olmuşdur [102-107]. GluN2A-NMDAR-lərin LTP-ni işə salacağı, GluN2B-NMDAR-lərin LTD ilə əlaqəli olması təklif edildi. Bununla birlikdə, bu ikiləşmə əhəmiyyətli dərəcədə və dəfələrlə etiraz edilmişdir [106,107] (cədvəl 1) və NMDAR-ın müəyyən bir alt tipinin glutamaterjik sinapslarda potensiasiya və ya depresiyaya səbəb olmaqda xüsusi rol oynadığı fikri çox ətraflı şəkildə nəzərdən keçirildiyi üçün çox sadələşdirilmiş görünür. Paoletti və s. [9]. Bu, subunit tərkibinin deyil, NMDAR yerinin sinaptik plastikliyin istiqamətini təyin edən amil ola biləcəyi sualını doğurur [117]. Təəssüf ki, çox az tədqiqat bu aspektə birbaşa toxunub. Bunun əvəzinə, sinaptik və ekstrasinaptik NMDAR-lərin plastisiyadakı rolu, əsasən LTP və LTD-də NMDAR alt quruluşunun (xüsusən GluN2B-NMDARs) rolu ilə bağlı əldə edilən nəticələrdən irəli gəlir. Bununla birlikdə, xüsusən də bu tədqiqatlarda ən çox istifadə edilən yaşlarda hüceyrə yeri və alt birim tərkibi arasında sadə bir əlaqə olmadığı görünür (təqribən P20 -P25, yuxarıdakı müzakirəyə baxın). GluN2B farmakoloji profilinə əsaslanaraq ekstasinaptik NMDAR -ların sinaptik plastisiyaya (və əslində hər hansı bir xüsusi funksiyaya) cəlb edilməsini öyrənən işlərdən nəticə çıxarmaq çox təhlükəlidir. Xüsusilə sinaptik və ya ekstrasinaptik NMDAR -ların aktivləşdirilməsi və ya susdurulması, beləliklə alt birliyin tərkibinə güvənməyən digər yanaşmalar tələb edir. Əsas alternativ, səssiz/işə qəbul edilməyən reseptorları pozulmadan tərk edərkən işə götürülən NMDAR-ların inaktivasiyasına imkan verən MK801 açıq kanal blokerinin istifadəsidir. Afferent liflərin aşağı tezlikli stimullaşdırılması ilə birləşdirildikdə, bu üsul sinaptik NMDAR-ların selektiv blokadasına imkan verir və onların ekstrasinaptik həmkarlarının əksəriyyətini bütöv şəkildə buraxır [19,26,27,118,119]. Əksinə, bu yanaşma tonik cərəyanlara vasitəçilik edən ekstrasinaptik NMDAR -ların blokadasına imkan verir, eyni zamanda sinaptik NMDAR -ları sağlam olaraq tərk edir [58]. İstənilən halda, bu metodun üstünlüyü ondan ibarətdir ki, o, yalnız MK801 tətbiqi zamanı reseptorların aktiv olub-olmamasına əsaslanır və buna görə də subunit-selektiv reagentlərin və ya yetişməmiş heyvanların istifadəsi ilə bağlı xəbərdarlıqlardan yayınır. Maraqlıdır ki, belə bir yanaşmadan istifadə edən Liu və b. [120] ekstrasinaptik NMDARların selektiv stimullaşdırılmasının CA1 neyronlarında LTD -ni tetiklediğini tapdı. Alternativ olaraq, bu yaxınlarda nümayiş etdirildi ki, d-serin və qlisin müvafiq olaraq sinaptik və ekstrasinaptik NMDAR-ları açır [19]. Müəlliflər, bu ayrılıqdan istifadə edərək, böyüklər siçovullarında hipaptamp dilimlərini sinaptik, lakin ekstrasinaptik olmayan, LTP induksiyası üçün NMDARların, LTD üçün isə hər iki növ reseptorun aktivləşdirilməsinin lazım olduğunu göstərə bildilər. Bu tapıntılar Rusakovun irəli sürdüyü ideyanı gücləndirir və s. [117], LTP və LTD induksiyasında vacib olanların, işə götürülmüş NMDAR -ların alt növü deyil, yeri ola biləcəyi.

Cədvəl 1. Sinaptik və ekstrasinaptik NMDA reseptorlarının hüceyrə mədəniyyətində, beyin dilimlərində və eksitotoksisitedə rolu in vivo. Araşdırmalar nəşr edildiyi tarixə görə təşkil edildi. OGD, oksigen qlükoza çatışmazlığı NVP, NVP-AAM077, GluN2A-NMDARs DL-TBOA üçün mülayim üstünlük verilən bir NMDAR antaqonisti, glutamat daşıyıcısının 1 (GLT1) 4-AP, 4-aminopiridin, gərginlikli qapalı kalium kanallarının blokeridir. .

bir Katsuki və b., eləcə də Shleper və s., sinaptik və ekstrasinaptik NMDARların rolunu xüsusi olaraq araşdırmamış, əksinə eksitotoksiklikdə d -serin qapalı NMDARların rolunu araşdırmamışdır.


Videoya baxın: NMDA receptors and learning Part 2: NMDA and AMPA (Oktyabr 2022).