Məlumat

DNT bağlayan bir sahə nədir?

DNT bağlayan bir sahə nədir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

DNT bağlayan domen termini ilə qarışıqam. Bu, DNT-nin bükülməyə meylli bəzi hissələrinin olması deməkdirmi? Bəzi zülalların o bölgəyə yapışmağa meylli olması səbəbindən baş verirmi? Bəzi zülallarla DNT (məsələn, bakteriyalar üçün deyək) olduğunu da başa düşürəm E. coli) qıvrılmağa meyllidir. Bu rulonların təxminən ölçüsünün nə olduğunu bilirikmi? Bu kontekstdə “motiv” nədir?


Biology.SE -ə xoş gəldiniz!

Biyokimya və molekulyar biologiyada "sahə" termini ümumiyyətlə qorunmuş bir quruluşa və funksiyaya malik olan, əlaqəli zülallar arasında oxşar olan və ümumiyyətlə ayrılarsa öz -özünə mövcud ola və ya işləyə bilən bir zülalın bir hissəsinə istinad etmək üçün istifadə olunur. qalan protein. DNT bağlayan bir sahə, DNT-yə yüksək yaxınlığı olan bir protein quruluşudur və iki molekul eyni yaxınlıqda olduqda buna bağlanır. Bir nümunə, hüceyrənin nüvəsindəki DNT -yə bağlanan (ökaryotlarda, bakteriyalarda və arxealarda nüvələri yoxdur - DNT sadəcə sərbəst şəkildə üzür) və genlərin transkripsiyasında dəyişikliklərə səbəb olan transkripsiya faktoru adlanan bir zülal növüdür. WikiMedia-dan aşağıdakı şəkil transkripsiya faktorlarının ümumilikdə necə işlədiyini göstərir.

"DNT sarğı" bir çox fərqli şeyi təsvir edən çox ümumi bir termindir. DNT-nin özünün əsas quruluşu iki şəkər zəncirindən ibarət bir rulondur deoksiriboza Deoksiribonuklein turşusunda və ya DNT-də) bir-birinə dolanır və nuklein turşusu əsasları ilə bağlanır. Ökaryotik hüceyrədə, hər bir hüceyrənin nüvəsindəki xromosomları meydana gətirən xromatin yaratmaq üçün fərdi DNT ipləri struktur zülalları ilə əlaqələndirilir. Birinci mərhələdə, çılpaq DNT, histonlar adlanan struktur zülalların ətrafına bükülür və ya sarılır və nukleosom adlanır. Daha sonra bunlar, "rahat" xromatini - aktiv transkripsiyanın baş verdiyi genom bölgələrini meydana gətirən "solenoid" və ya lif quruluşuna yığılır. Bir xromosomun bir hissəsi qeyri -aktiv olaraq qeyd olunarsa və ya bir hüceyrə ikiyə bölündükdə (hüceyrə dövrü ərzində müəyyən addımlar atılarsa), liflər daha sonra xromosomlarla əlaqəli tipik bir quruluş meydana gətirərək qatılaşdırılmış xromatinə çevrilir. Vikipediyadan olan bu şəkil prosesin hər bir addımını vizuallaşdırır.

"Motiv" sözü bəzən domenlə eyni məna ifadə edə bilər - məsələn, kimsə zülaldakı "DNT bağlayan motivə" istinad edə bilər. Bununla birlikdə, bir motiv ümumiyyətlə bir sahədən daha kiçikdir, DNT, RNT və zülallarda meydana gələ bilər və xüsusi ardıcıllıqla əlaqəlidir. Bir zülaldakı "struktur motivi", bir çox fərqli zülal sahələrində görünə bilən və bu fərqli sahələrdə eyni funksiyanı yerinə yetirməyən bir helix-loop-spiral və ya beta-hairpin növbəsi kimi bir şeydir. adətən çox oxşar olan kifayət qədər qorunmuş bir ardıcıllığa malikdir. Nümunə olaraq, sink barmaq motivi DNT, RNT və digər zülalları bağlayan zülal domenlərində tapılır.

Bütün bu terminologiya əvvəlcə çox çaşqın ola bilər, lakin buna sadiq qalsanız, zaman keçdikcə daha asan olacaq. Biokimya və molekulyar biologiya maraqlı sahələrdir, buna görə də təhsilinizi davam etdirin!


Domen və motif həqiqətən əlaqəlidir, amma düşünürəm ki, domen funksiyanı yerinə yetirən bir zülalda (və ya DNT -də) nuklein turşuları üçün zülal / transkripsiya faktoruna bağlanma və s. Daxil olmaqla) bölgəni göstərir. həmin domendə/bölgədə tikinti bloklarının xüsusi ardıcıllığını təsvir etmək üçün istifadə olunur. Motif, adətən zülal sahəsində tapılan xüsusi amin turşularını göstərmək üçün, eyni zamanda bir DNT/RNT ipindəki xüsusi nukleotidləri göstərmək üçün istifadə olunur.


D4. DNT-ni bağlayan yerlər

  • Henry Jakubowski tərəfindən töhfə verildi
  • St. Benedict Kollecində professor (Kimya)/St. John Universiteti

RNT polimeraz bütün genlərin promoter yerində qarşılıqlı təsir göstərməli olduğundan, bütün genlərin promoter bölgəsində oxşar bir nukleotid ardıcıllığına sahib olacağını gözləmək olar. Bunun həm prokaryotik, həm də eukaryotik genlər üçün doğru olduğu aşkar edilmişdir. Ancaq bütün transkripsiya faktorlarının eyni DNT bağlama ardıcıllığına malik olmayacağını gözləyərdiniz. Zülalı bağlayan genin başlanğıc sahəsinin yuxarı tərəfindəki DNT ardıcıllığına (RNT polimeraz, transkripsiya faktorları və s.) Təşviqatçılar deyilir. Aşağıdakı cədvəldə adlanan ümumi DNT ardıcıllığı motivi göstərilir Pribnow və ya TATA qutusu Təxminən -10 baza cütü başlanğıc yerindən yuxarıda, digəri isə -35-də tapıldı. Proteinlər bu sahələrə bağlanır və RNT polimerazının bağlanmasını asanlaşdırır və gen transkripsiyasına səbəb olur.

Prokaryotik Promoter ardıcıllıqları
Promoter -35 Region Spacer -10 bölgə Spacer RNT başlanğıcı
trp operon TTGACA N17 TTAQT N7 A
tRNAtyr TTACA N16 TATGAT N7 A
& lambdaP2 TTGACA N17 GATACT N6 G
lak operon TTTACA N17 TATGTT N6 A
rec A TTGATA N16 TATAAT N7 A
lex A. TTCCAA N17 TATACT N6 A
T7A3 TTGACA N17 TACGAT N7 A
konsensus TTGACA TATAAT

Oxşar ardıcıllıq transkripsiyanın başlanğıc yerindən yuxarıda təxminən 25 nukleotiddə yerləşən eukaryotlarda (konsensus TATAAA) tapılır. Buna Qoldşteyn-Hoqness qutusu deyilir.

Jmol: Yenilənmiş TATA Box Bağlayıcı Zülal Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Bundan əlavə, ökaryotlarda, cavab elementləri adlanan daha yuxarıya doğru olan ardıcıllıqlar, gen transkripsiyasını daha da nəzarət etmək üçün xüsusi zülalları (məsələn, CREB və ya siklik AMP cavab elementini bağlayan zülalları) bağlayır.

Eukaryotic Promoter Database (EPD) - transkripsiyanın başlanğıc yeri eksperimental olaraq müəyyən edilmiş eukaryotik POL II promotorlarının şərhli lazımsız kolleksiyası. EPD və onun istifadəsini təsvir edən məqaləyə keçid.

Promotorlara əlavə olaraq, gen transkripsiyasına təsir edən proksimal promotordan daha çox transkripsiyanın başlanğıc yerində daha distal olan digər DNT ardıcıllıqları var. Bunlara gücləndiricilər, səsboğucular və izolyatorlar daxildir. Aşağıdakı şəkil, bir gücləndiricinin distal DNT -ni (bəlkə də transkripsiyanın başlanğıc yerindən minlərlə əsas cütü) bir genin təşviqçisinə yaxınlaşdıraraq gen transkripsiyasına necə təsir edə biləcəyini göstərir. Səsboğucunun analoji şəkildə necə işləyəcəyini asanlıqla təsəvvür etmək olar.

Şəkil: Transkripsiya gücləndiriciləri

Bir gücləndiricinin (və ya səsboğucunun) təsirlənməli olan yaxınlıqdakı başqa bir geni aktivləşdirməsini (və ya inhibə etməsini) qarşısını almaq üçün izolyatorlara ehtiyac var. Bunlar gücləndirici (və ya səsboğucu) ilə təşviqatçı və ya bir gen və ya bir gen qrupu arasındakı ardıcıllıqlardır. Ökaryotik izolyatorlar CCCTC bağlayıcı faktorları (CTCF) adlanan zülalları bağlayan bir CCCTC nukleotid sahəsinə malikdir.

Təbiətdən icazə ilə yenidən nəşr olunan aşağıdakı şəkil və başlıqlar (şəkildə göstərildiyi kimi), gen transkripsiyasını idarə edən sadə bir eukaryotik transkripsiya vahidinin daha ətraflı təsvirini göstərir.

Şəkil: Ökaryotik təbliğatçılar və tənzimləyici bölgələr

a. & quotSadə eukaryotik transkripsiya vahidi. Tipik olaraq birhüceyrəli eukariotlarda rast gəlinən TATA qutusundan 100�bp aralığında yerləşən sadə nüvə promouteri (TATA), yuxarı axın aktivator ardıcıllığı (UAS) və səsboğucu elementi".

b. "Kompleks metazoan (Animalia krallığına mənsub) transkripsiya idarəetmə modulları. TATA qutusu (TATA), Təşəbbüs ardıcıllığı (INR) və aşağı axın promouter elementləri (DPE) olan kompozit əsas promouterin 10� kb yuxarı və ya aşağı axınında yerləşə bilən səsboğucu və izolyator elementləri ilə kəsişmiş çoxlu qruplaşdırılmış gücləndirici modulların kompleks quruluşu. ) & quot.

Yenə Təbiətin icazəsi ilə çəkilmiş aşağıdakı şəkil və başlıq, toxumaya xas və genə görə seçmə alt vahidləri və transkripsiya başlanğıc kompleksləri də daxil olmaqla, çox bölmədən ibarət ümumi transkripsiya aparatının daha ətraflı görünüşünü göstərir.

Şəkil: Eukaryotik multisubunit ümumi transkripsiya aparatı

a. Ökaryotik transkripsiya aparatı, RNA polimeraz II nüvəli kompleksi və əlaqəli ümumi transkripsiya faktorlarını (TFIIA, -B, -D, -E, -F və -H) ehtiva edən çox geniş bir çox qruplu ansambllara bölünə bilər. subunit cofactors (vasitəçi, CRSP, TRAP, ARC/DRIP və s.) və müxtəlif xromatin dəyişdirən və ya yenidən quran komplekslər (SWI/SNF, PBAF, ACF, NURF və RSF).

b, c. & quotMetazoan orqanizmlər alternativ TAF-lar (TBP- [TATA Bağlayıcı Proteinlə əlaqəli faktorlar], məsələn yumurtalıqlara xas TAF105) və TRF-lər (TBP- [TATA Bağlayıcı Zülal ilə əlaqəli) istifadə edərək çoxlu gen seçici və toxuma xas TFIID-ə bənzər birləşmələr inkişaf etdirmişlər. faktorlar] ilə əlaqəli faktorlar, məsələn, Drosophila və siçanlarda TRF2) toxuma spesifik və gen-selektiv ifadə proqramlarının transkripsiyasını istiqamətləndirən xüsusi RNT polimeraza başlama komplekslərinin formalaşmasına vasitəçilik etmək." (Yuxarıdakı şəkildəki təbiətə istinad.)"

Ökaryotlarda gen tənzimlənməsi

Proteinlər elektrostatik, H-bağ və hidrofob qarşılıqlı təsirlər vasitəsi ilə xüsusi olaraq DNT ilə qarşılıqlı təsir göstərə bilər. AT və GC baza cütlərində, xüsusi zülal-DNT qarşılıqlı təsirinə imkan verən, ds DNA sarmalının böyük və kiçik bağında açılan mövcud H bağışçıları və qəbulediciləri vardır.

Şəkil: AT və GC baza cütlərində mövcud H istiqraz donorları və qəbulediciləri vardır

Jmol: Yenilənmiş Sadə DNA Tutorialı Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5) (böyük bağdakı H istiqraz bağışçılarını və qəbuledicilərini görmək üçün son seçim düymələrinə baxın.

Jmol: Yenilənmiş RNA Polimeraz II/DNA/RNA kompleksi Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)


Schneider, TD & amp Stephens, R.M. Ardıcıllıq Logoları: konsensus ardıcıllığını göstərmək üçün yeni bir yol. Nuklein turşuları Res. 18, 6097–6100 (1990).

Stormo, G.D. DNT bağlama saytları: təmsil və kəşf. Bioinformatika 16, 16–23 (2000).

İşçi, C.T. və s. EnoLOGOS: enerji normallaşdırılmış ardıcıllıq loqotipləri üçün çox yönlü bir veb vasitəsidir. Nuklein turşuları Res. 33 (Veb Server Problemi), W389 -W392 (2005).

Matys, V. və başqaları. TRANSFAC® və onun modulu TRANSCompel®: eukaryotlarda transkripsiya gen tənzimlənməsi. Nuklein turşuları Res. 34 əlavə Verilənlər bazası məsələsi, D108 -D110 (2006).

Vlieghe, D. et al. Yeni nəsil JASPAR, transkripsiya faktoru bağlayan sayt profilləri üçün açıq giriş anbarı. Nuklein turşuları Res. 34 əlavə. Verilənlər bazası məsələsi, D95 -D97 (2006).

Teixeira, M.C. və s. YEASTRACT verilənlər bazası: Saccharomyces cerevisiae -də transkripsiyanı tənzimləyən birliklərin təhlili üçün bir vasitədir. Nuklein turşuları Res. 34 əlavə Verilənlər bazası məsələsi, D446–451 (2006).

Zhu, J. & amp Zhang, M.Q. SCPD: mayanın tanıtıcı məlumat bazası Saccharomyces cerevisiae. Bioinformatika 15, 607–611 (1999).

Salgado, H. və digərləri. RegulonDB (versiya 5.0): Escherichia coli K-12 transkripsiya tənzimləmə şəbəkəsi, operonun təşkili və böyümə şərtləri. Nuklein turşuları Res. 34 əlavə. Verilənlər bazası məsələsi, D394 -D397 (2006).

Munch, R. et al. PRODORIC: gen tənzimlənməsi prokaryotik verilənlər bazası. Nuklein turşuları Res. 31, 266–269 (2003).


D5. DNT bağlayan zülallar

  • Henry Jakubowski tərəfindən töhfə verildi
  • St. Benedict Kollecində professor (Kimya)/St. John Universiteti

DNT-nin nisbi struktur sadəliyini və təkrarlığını nəzərə alsaq, ona xüsusi olaraq bağlanan zülalların ümumi DNT bağlayan domen motivləri ola bilər, lakin spesifik bağlanma qarşılıqlı təsirinə imkan verən xüsusi amin turşularının yan zəncirləri ola bilər.

Rəqəmlər iki belə zülalı göstərir: bakteriofaq 434 -dən cro repressor və bakteriofaq lambdanın lambda repressoru. (Bakteriofajlar, bakteyaya yoluxduran viruslardır.) Spesifikliyin, qismən, zülal və operator DNT-nin əsas bağları arasında spesifik H bağlarının meydana gəlməsi ilə necə əldə edildiyinə diqqət yetirin.

Şəkil: Lambda Repressor/DNT Kompleksi

Şəkil: H&lambda repressoru ilə DNT arasında əlaqə qarşılıqlı əlaqəsi

Jmol: Yenilənmiş Lambda Repressor/DNT kompleksi Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

  • sink barmaq: (eukaryotlar) Bu zülallar, X3-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X3-4-His-X4- ümumi bir ardıcıllıq motifinə malikdir və burada X hər hansı bir amin turşusudur. Zn2+, iki antiparallel beta zolağından birində olan Cys və Onun yan zəncirləri ilə tetrahedral olaraq əlaqələndirilir və bir alfa spiralidir. Sinklə sabitlənmiş sink barmağı, DNT -nin əsas yivinə bağlanır. ]

Jmol: Yenilənmiş Zif268: DNT Kompleksi Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

900-ü insan genomunda kodlanmış Zn barmaq zülalları (yuxarıda təsvir edilən CTCF zülalını birləşdirən eukaryotik izolyatorlar daxil olmaqla) hüceyrələrdə spesifik mutasiyaların faktiki təmiri üçün səfərbər edilə bilər ki, mutant hüceyrələrin kifayət qədər yüksək faizində həyata keçirilsə, spesifik mutasiyaları müalicə edə bilər. ağır birləşmiş immun çatışmazlığı xəstəliyinin bəzi formaları kimi genetik xəstəliklər. Bu yeni texnikada (Urnov və digərləri, 2005) çoxlu əlaqəli Zn barmaqlarını bağlayan domenlər (təbii əmələ gələnlərdən biri və ya laboratoriyada istehsal olunan mutant formalar), hər biri müəyyən bir nukleotid ardıcıllığı üçün spesifik olan qeyri-spesifik cərəyanla əlaqələndirilir. endonukleaz, FokI fermentindən əmələ gəlir. Nukleaz dimerik formada aktivdir, buna görə də aktiv kompleksin hədəf sahəyə yığılması üçün hər biri dörd fərqli Zn barmaq sahəsinə bağlı olan iki endonukleaz domeni tələb olunur. Bağlanmanın spesifikliyi Zn barmaq domenləri tərəfindən seçilməklə əldə edilir. Daha sonra nükleaz tərəfindən DNT tərəfindən bir ləqəb hazırlanır və ev sahibi hüceyrə təmir mexanizmləri meydana gəlir. Bu proses, iplərin ayrılmasını, hüceyrə daxilində tamamlayıcı DNT ilə nodlanmış bölgənin homolog rekombinasiyasını və nikin bərpasını əhatə edir. Həddindən artıq yabanı növ (mutasiyaya uğramamış) DNT hüceyrələrə əlavə olunar və şablon olaraq istifadə edilərsə, normal DNT təmir mutasiyası mutasiyanı düzəldir. Urnov və başqaları, bir mutasiya ehtiva edən mədəni hüceyrələrin 20% -ə qədərinin laboratoriyada təmir oluna biləcəyini göstərmişlər. Bu hüceyrələr selektiv bir artım əldə edərsə, mutasiyaya uğramış hüceyrələr nəticədə vəhşi tipli hüceyrələrlə əvəz olunacaq.

  • Steroid hormon reseptorları: (ökaryotlar) Hüceyrə səthi reseptorlarına bağlanan əksər hormonlardan fərqli olaraq, steroid hormonları (xolesterinin törəmələri) hüceyrə membranından keçir və bir hormon bağlayıcı sahə vasitəsilə sitoplazmik reseptorlara bağlanır. Bu, reseptorun formasını dəyişdirir və sonra DNT-də müəyyən bir yerə (hormona cavab elementi) bağlanır. Sink barmağına bənzər bir quruluşda, Zn 2+, əsas bağdakı iki eyni, lakin ters çevrilmiş DNT (palindrom) ardıcıllığına dimer olaraq bağlanan kürə bənzər bir quruluşda 4 Cys ilə tetrahedral olaraq koordinasiya edilmişdir. (Palindrom nümunələri: Elba Dennis və Ednanın nahar etdiyini görməmişdim, dedim, Enid və Edna günah işlədərkən.

Xüsusi bir nümunə olaraq qlükokortikoid reseptorunu (GR) nəzərdən keçirin. DNT -ni dimer kimi bağlayır. Dimerin iki DNT bağlayıcı sahəsi, DNT -nin bitişik iki böyük yivi ilə, GR bağlama ardıcıllığında (GBS) birləşir, bu, promoter içərisində qısa bir DNT ardıcıllığıdır. Meijsing və b. GBS -in yalnız genlərin transkripsiyasına imkan verən GR üçün bağlayıcı bir sahə rolunu oynadığını deyil, həm də reseptorun konformasiyasına təsir edərək gen transkripsiyasının başqa bir şəkildə tənzimlənməsinə səbəb olduğunu təsbit etdi. Qrup, GBS ilə transkripsiya olunarsa, zülal lusiferazanı (floresan) ifadə edəcək, protein lusiferazın geninə bağlı GBS -yə malik olan lusiferaza & quot; xəbər verənlər genləri ”qurdu. Nisbi transkripsiya fəaliyyətinin GR -nin GBS -ə nisbi bağlanma yaxınlığı ilə heç bir əlaqəsi olmadığını aşkar etdilər. Başqalarına nisbətən daha aktiv olan GBS-lər aşağı aktivliyə malik olanlarla, oxşar transkripsiya aktivliyi olan GBS-lər isə fərqli yaxınlıqlarla bağlanır. Bu, GBS -nin onunla əlaqəli GR -yə unikal bir funksiya verdiyini göstərir (yəni, GR -nin GBS -ə bağlı olub -olmamasından transkripsiyaya təsir etmir). Reseptorun bir � qolu �, DNT -yə bağlandıqda, bağlı olduğu ardıcıllığa xas olan dəyişikliklərlə uyğunlaşma dəyişikliklərinə məruz qaldı. Mutant zülal, GR-&qamma, vəhşi tipli zülal, GR-&alpha ilə eyni oldu, yalnız rıçaq qolunda DNT-də eyni yerə bağlansalar da, fərqli transkripsiya aktivliyi aşkar edildi. qolu və onun konformasiyası transkripsiyaya təsir edir.

  • lösin fermuarları (və ya qayçı): (eukariotlar) Bu zülallar 35 amin turşusundan ibarətdir, burada Leu 7 amin turşusu intervalında təkrar-təkrar tapılır. Zülalın bu bölgələri amfifilik sarmallar əmələ gətirir, bir üzündə Leu, bir spiralın iki növbəsindən sonra bir Leu olur. Bu zülallardan ikisi, polar olmayan, lösinlə zəngin olan amfifilik helikasların bir-birinə bağlanması ilə sabitləşən, əzələ zülalı miozinində olduğu kimi bükülmüş bir bobin meydana gətirən bir dimer meydana gətirə bilər. Lösin fermuarı zülalın zülal bağlayan sahəsini təmsil edir. DNT bağlama sahəsi, əsas olan və protein DNT-yə bağlandıqda alfa sarmalı əmələ gətirən ilk 30 N-terminal amin turşusunda olur. Lösin fermuarı daha sonra iki DNT bağlayan zülalı bir araya gətirərək N-terminal baza helikalarının DNT-nin əsas bağçası ilə təmələ xas şəkildə təmas etməsinə imkan verir. Valin və izolösin, lösin ilə birlikdə, digər növ qıvrımlar yaratmaq üçün qarşılıqlı təsir göstərə bilən amin turşularının tərkibində olur.

Şəkil: leysin fermuarlar (VMD ilə hazırlanmış)

Jmol: Yenilənmiş Leucine Fermuar Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Sink barmaqlarının nukleazaları mutasiyaların bərpasını stimullaşdırmaq üçün istifadə edildiyi kimi, siçovul genomunun başqa bir araşdırması, qeyri-dəqiq DNT təmir mexanizmindən (NHEJ tərəfindən) və buna görə də spesifik mutasiyalardan (Geurts) ibarət olan ds-DNA-da fasilələrə səbəb olmaq üçün xüsusi olaraq hazırlanmış ZFN-lərdən istifadə etmişdir. , et al. 2009). Bu proses, �genin nokautu�, normal olaraq hədəf gen tərəfindən transkripsiya edilmiş zülalın istehsalının qarşısını alır. Beş və altı barmaqlı ZFN-lər üç müxtəlif zülal üçün genlə hədəflənmiş bağlanmada yüksək spesifikliyə nail olmaq üçün istifadə edilmişdir: yaşıl floresan protein (GFP), immunoqlobulin M (IgM) və Rab38. Bu heyvanların yabanı tipli zülalı və ifadəsi yoxlanılan siçovulların 12% -ində nokaut uğurlu oldu. ZFN-lər kifayət qədər spesifik idi ki, proqnozlaşdırılan 20 hədəf olmayan saytın heç birində mutasiya müşahidə olunmadı. Bu tədqiqat, xəstəliyin müalicəsi üçün transkripsiya və ifadənin nəzarətinin canlılığını və xüsusi bağlanmanın əhəmiyyətini dəstəkləyir.

Gördük ki, iki əsas amil, DNT-nin zülallar tərəfindən spesifik olaraq tanınmasına, əsas yivdəki spesifik nukleotid donorlarına və qəbuledicilərinə hidrogen bağlarının əmələ gəlməsinə və zülal ligandlarının yaxınlığının artması ilə DNT sarmalının dəyişmiş formalara bağlı deformasiyalarına kömək edir. . Məsələn, Tata Binding Protein (TBP) TATA qutusundakı genişlənmiş kiçik bağ ilə qarşılıqlı əlaqədə ola bilər. Yeni tapıntılar əlavə olaraq zülalların, nukleotid ardıcıllığından asılı olaraq & quot; daralmış & quot; olan kiçik yivlərdə olan məlumatlardan istifadə edə biləcəyini dəstəkləyir.

A ilə zənginləşdirilmiş DNT izləri əsas yivlərdə əsas cüt-cüt hidrogen birləşməsinə səbəb olan bükülmə konformasiyalarına səbəb ola bilər, kiçik yivlərin daralması ilə nəticələnə bilər. Yüksək miqdarda AT əsas cütləri dar kiçik yivlərdə cəmlənir (eni & lt5.0 �) və CG baz cütləri daha geniş enli yivlərdə daha çox olur.

Kiçik yiv daralması DNT-nin tanınmasına necə təsir edir? Dar kiçik bağlar DNT -nin mənfi elektrostatik potensialını artıraraq onu daha spesifik və tanınan bir sahə halına gətirir. DNT-nin onurğa fosfatları dar olduqda yivin ortasına daha yaxın olur və beləliklə, dar kiçik yivləri daha mənfi elektrostatik potensialla əlaqələndirir.

Zülalların kiçik bağlarla qarşılıqlı əlaqədə olan hissələrində, yan zənciri daha dar və mənfi kiçik yivə yerləşdirilə bilən arginin var. Argininlər bağlaya bilər və bəzi hallarda özünü DNT formasının tanınmasının spesifikliyini artıran qısa ardıcıllıq motivləri kimi əlavə edə bilər. Arg-da yükün effektiv radiusu Lys-dəki yük daşıyıcısından daha böyük olduğundan, Arg-a Lys-dən daha çox üstünlük verilir. Bu, daralan böyük bağa bağlanmasını təşviq edəcək Arg üçün dağılma enerjisinin azalmasına səbəb olacaq. Bu kəşf, bütün genomu izah edərkən və transkripsiya faktoru bağlayan yerləri proqnozlaşdırarkən DNT şəklinin rolunun nəzərə alınması lazım olduğunu göstərir.

Şəkil: T3c Transpozonunun Dar Kiçik Qrupunda T3c Transposaza bağlanması


NƏTİCƏLƏR

SLED Domeni Metazoada Təkamüllə Qorunur

İnsan Scml2-nin ətraflı amin turşusu ardıcıllığı təhlili, Jpred serverindən (31) istifadə edərək ikincil quruluş proqnozu ilə birlikdə N-terminal MBT təkrarları ilə C-terminal SAM domeni arasında yerləşdirilmiş qatlanmış bir domenin olduğunu ortaya çıxardı. Domen qalıqları 354� əhatə edir və PDB-də məlum fəza quruluşuna malik hər hansı digər domenlə ardıcıl homologiyaya malik deyil. İnsan zülallarına qarşı BLAST ardıcıllığı bu domeni ehtiva edən beş zülal təyin etdi, Scml2, Scmh1, SFMBT1, SFMBT2 və SCML4. Bu zülalların domen quruluşu Şəkil 1 -də göstərilmişdir A, burada yeni təyin edilmiş domenlərin hizalandığı və göstərildiyi yer qırmızı, MBT domenləri göstərilir mavivə SAM domenləri var qara. Qeyd edək ki, müəyyən edilmiş beş zülalın hamısı orta ayaqda cinsi daraqdır, N-terminal MBT domenlərinin sayı dörddən (SFMBT1 və SFMBT2 üçün) sıfıra qədər (SCML4 üçün) dəyişir. Sahə yalnız MBT və SAM domenləri arasında yerləşən Scm-a bənzər bir ailədə olduğu üçün onu S sm- l ike e mbedded d omain və ya SLED olaraq təyin edirəm. SLED tərkibli zülalların beş üzvünün çoxsaylı ardıcıl düzülüşü Şəkil 1-də göstərilmişdir. B tamamilə qorunmuş qalıqların göstərildiyi yer qırmızıvə sistein qalıqları bir ilə işarələnir ulduz. Proqnozlaşdırılan ikinci dərəcəli struktur elementləri Scml2 ardıcıllığının yuxarısında göstərilir.

İnsanlarda SLED ehtiva edən zülalları təyin etdikdən sonra digər növlərdə SLED domenləri olan zülalları axtardım və SMART istifadə edərək onların arxitekturasını müqayisə etdim (27, 28, 32). Hər bir homoloq üçün domen arxitekturasının təsviri ilə nəticələnən filogenetik ağac Şəkil 2-də təsvir edilmişdir, burada SLED domenləri aşağıdakı kimi göstərilmişdir. qırmızı kvadratlar. Şəkil 2-dən aydın olur ki, SLED domenləri demək olar ki, yalnız C-terminal SAM domeni kontekstində mövcuddur (qara dairələr) və N-terminal MBT təkrarlanır (mavi kvadratlar) bütün çoxhüceyrəli növlərdə, bu onu unikal bir Scm-ə aid bir sahə halına gətirir. Diqqətəlayiq haldır ki, SLED sahəsinin təkamül yolu ilə meydana gəlməsi çox hüceyrəli eukaryotların inkişafı ilə üst-üstə düşür, çünki SLED tərkibli zülallar yalnız Metazoa (Şəkil 2), hüceyrə fərqlənməsində Scm kimi zülalların əsas roluna uyğundur. Qeyd edək ki, SAM domenlərindən fərqli olaraq, MBT domenləri SLED -lərlə eyni vaxtda yaranır və tez -tez birlikdə tapılır, bu da SLED -in funksiyasının MBT domeni ilə yaxından əlaqəli olduğunu göstərir.

Çoxhüceyrəli orqanizmlərdə SLED domeninin qorunması. Zülal ehtiva edən SLED sahəsinin filogenetik ağacı göstərilmişdir. Hər növ fərdi bir rənglə təmsil olunur (sağ). Hər bir homolog üçün domen quruluşu zülalın adından sonra göstərilir. SLED, MBT və SAM domenləri göstərilir qırmızımavi kvadratlarqara dairələrmüvafiq olaraq. Ağac iTOL (30) İnteraktiv Həyat Ağacı serverindən istifadə etməklə yaradılmışdır.

İnsan Scml2 SLED Domeninin Həll Strukturu

İnsan Scml2-dən (qalıqlar 354�) SLED domeninin həll strukturu NMR spektroskopiyasından istifadə etməklə müəyyən edilmişdir. CYANA-dan istifadə edərək 3491 NOE-dən əldə edilən proton-proton məsafəsi məhdudlaşdırıcıları və 182 TALOS+ ilə proqnozlaşdırılan dihedral bucaq məhdudiyyətləri əsasında cəmi 100 struktur yaradılıb (23, 33). 20 ən aşağı enerji strukturunun ansamblı daha da CNS (25, 26) istifadə edərək açıq həlledicidə r.m.s. onurğa sütunu və bütün ağır atomlar üçün sırasıyla 0.62 ± 0.08 və 1.11 ± 0.08 Å sapması. Ümumi struktur keyfiyyət balları daxil olmaqla tam NMR struktur statistikası Cədvəl 1-də təqdim olunur.

SLED sahəsinin 20 ən aşağı enerji quruluşundan ibarət ansambl Şəkil 3 -də göstərilmişdir A (yalnız onurğa sütunu). Ümumiyyətlə, qeyd olunan çevik N və C terminlərindəki bir neçə qalıq istisna olmaqla, quruluş yaxşı müəyyən edilmişdir maviqırmızımüvafiq olaraq. Domen 㬡-㬑-㬢-㬒-㬓-㬣-㬤-㬔-㬥 topologiyası ilə yeni bir bükülmə qəbul edir (Şəkil 1). B). Alanın nüvəsi, bir-birinə paralel olaraq hizalanmış iki 15-amin turşusu və#x003b12 (amin turşuları 388 �) və 㬔 (amin turşuları 442 �) tərəfindən əmələ gəlir. bir tərəfində üç telli antiparalel β vərəqə və digər tərəfdə α helix 4 ə qarşı yığılmış uzun bükülmüş β saç tokası (Şəkil 3 C). Uzun bükülmüş saç tokası 㬣 və 㬤 (müvafiq olaraq 422 � və 430 � amin turşuları) iplərindən əmələ gəlir. Üç telli β vərəq, dörd hidrogen bağı və qısa bir C-terminal ipi ilə sabitlənmiş 㬡 (356 �) və 㬢 (382 �) tellərindən ibarətdir və amin turşuları 462 və#x02013463 ) Ser-463-ü 㬡 ipinin Tyr-360-a bağlayan iki hidrogen bağı ilə sabitləşdi.

İnsan Scml2-dən SLED domeninin NMR strukturunun həlli (qalıqlar 354�). A, İnsan Scml2 SLED domeninin 20 ən aşağı enerji strukturunun NMR ansamblı (yalnız onurğa sütunu təmsili). Zülal zənciri göy qurşağı rənglidir mavi üçün qırmızı N və C termini etiketlidir. B, SLED domen topologiyasının sxematik təsviri. C, SLED domeninin lent təsviri iki oriyentasiyada göstərilir, ikinci dərəcəli struktur elementləri etiketlənir. D, SLED domeninin səthində yük paylanması (kimi ilə eyni oriyentasiyada göstərilir C).

Scml2 SLED domeninin səthində yük paylanması Şəkil 3-də göstərilmişdir D burada molekul iki istiqamətdə göstərilir. Molekulun bir tərəfi (sağ panel) müsbət yüklü Lys-414, Arg-418 və Arg-447 qalıqları ilə əhatə olunmuş əlamətdar hidrofobik boşluğa malikdir.

İnsan Scml2 SLED ardıcıllığının digər növlərdəki analoqlarının ardıcıllığı ilə müqayisəsi domen boyunca bir sıra qorunmuş qalıqları aşkar etdi. Təmsilçi növlərdən (balıqdan insana) Scml2 SLED domenlərinin çoxsaylı ardıcıllığı Şəkil 4 -də göstərilmişdir. A, burada konservasiyası 90% və daha çox olan qalıqlar vurğulanan və basdırılmış qalıqlar bir ilə işarələnir ulduz. Konservləşdirilmiş hidrofobik qalıqlar hidrofobik nüvəni təşkil edən SLED strukturunda basdırılmış amin turşusu qalıqları ilə yaxşı əlaqələndirilir. Bu qalıqlar ümumi SLED domen qatının saxlanmasından məsuldur. Səthə məruz qalmış təkamüllə qorunan qalıqlar xüsusi maraq kəsb edir, çünki onlar tez-tez zülal səthindəki funksional əhəmiyyətli bölgələrə, məsələn, qarşılıqlı əlaqə partnyorları üçün bağlanan yerlərə uyğun gəlir.

SLED domenlərində amin turşusu qalıqlarının qorunması. A, növlər arasında Scml2 SLED domeninin çoxsaylı ardıcıllığı. Default ClustalW (29) rəngləri hər qalıq üçün istifadə olunur. Konservasiyası 90% və ya daha yüksək olan qalıqlar vurğulanan, və domenin hidrofobik nüvəsini təşkil edən qalıqlar annotasiya edilir ulduz. B, SLED səthinin qorunması. Qorunmuş qalıqlar (çəhrayı) insan Scml2 SLED səthində xəritələnir. Konservləşdirilmiş qalıqların SLED domeninin səthində davamlı yamaq əmələ gətirdiyini göstərmək üçün iki istiqamət göstərilir. Üzərindəki molekul sağ üzərindəki molekula nisbətən 180° fırlanır sol.

Domenin səthinin qorunması təhlil edildi və yüksək dərəcədə qorunan amin turşusu qalıqları Scml2 SLED strukturunda xəritələndi (şək. 4). B). Maraqlıdır ki, qorunan səthə məruz qalan qalıqlar molekulun bir tərəfində davamlı bir çoxluqda düzülmüşdür (şəkildə göstərilmişdir) çəhrayı Şəkil 4 B). Bu saytın əksəriyyəti 㬡, 㬢 və 㬥 də daxil olmaqla, üç telli β-vərəqdən qalan qalıqlardan əmələ gəlir. Domen səthinin bu cür qorunması, molekulun bu tərəfinin funksional baxımdan əhəmiyyətli olduğunu və ya Scml2 daxilində digər bölgələr üçün bağlayıcı sahə ola biləcəyini və ya hələ bilinməyən digər substratlar üçün qarşılıqlı əlaqə interfeysi kimi xidmət edə biləcəyini göstərir.

Scml2 SLED dsDNA bağlaya bilər

SLED domeni təkamüllə MBT sahələri ilə əlaqəli olsa da və eukaryotlar arasında qorunsa da, bu domenin funksiyası naməlum olaraq qalır. Scml2 SLED üçün mümkün bir funksiyanı proqnozlaşdırmaq üçün, DALI serverindən istifadə etməklə SLED qatına bənzər ölçü quruluşlarına malik olan zülallar üçün PDB daxilində geniş axtarış aparılmışdır (34, �). Maraqlıdır ki, struktur olaraq SLED ilə əlaqəli olduğu aşkar edilən yeganə proteinZ-5,0 bal, 6% ardıcıllıq eyniliyi) 181 amin turşusu dsDNT-ni bağlayır E. coli bakteriyalarda replikasiyanın başlanmasının mənfi tənzimləyicisi (PDB ID 1LRR) kimi fəaliyyət göstərən SeqA proteini (38, �). SLED-ə bənzər olaraq, SeqA, özündə iki 15-amin turşusu və#x003b1-sarmalı ehtiva edir və 㬑/㬒/㬓/㬔 SLED paketinə bənzər bir sarmal dəstə təşkil edir. Ancaq SeqA-da üç telli β vərəqi yoxdur və bunun əvəzinə iki α-helikse malikdir. SLED qatının uzun β-saç tıxacının xarakteristikası SeqA-da daha qısadır və üç telli β-vərəq və α spiralın alternativ quruluşuna daxil edilmişdir (Şəkil 5).

Scml2 SLED və SeqA -nın struktur uyğunlaşdırılması. SLED domeni bir olaraq göstərilir qırmızı lentvə SeqA (PDB ID: 1LRR) göstərilir çəhrayı rəngdə. DNT-nin bağlanmasında iştirak edən SeqA döngəsi qalıqlarının yan zəncirləri kimi göstərilmişdir yaşıl çubuqlar (Asn-150, Thr-151) və SLED qalıqlarının yan zəncirləri DNT-yə bağlandıqdan sonra ən böyük kimyəvi yerdəyişmə dəyişiklikləri kimi göstərilmişdir. mavi çubuqlar (Asn-440, Ser-441).

Çünki yeganə DALI hit (çox məhdud struktur oxşarlığına baxmayaraq (Z-5.0 bal)) DNT-ni bağlayan zülal olduğu ortaya çıxdı, mən SLED-i dsDNT-ni bağlamaq qabiliyyətinə görə sınaqdan keçirmək qərarına gəldim. İnsan PRC1 kompleksində HMX2, ASCL-1 və digərləri də daxil olmaqla bir çox məlum gen var (41, �). Bu genlərin yuxarı axınındakı promotor bölgələrdə CpG ilə zəngin bölgələri tanıdığı düşünülür. Buna görə də mənim üçün in vitro DNA bağlama analizlərində, 12-ci xromosomda yerləşən ASCL-1 geninin promoter bölgəsindəki bir CpG adasının bir hissəsini istifadə etdim (103,351,246 ilə 103,351,256 arasında). Qeyd etmək vacibdir ki, ASCL-1 promotorunda yüzlərlə baza cütü var və mən bağlama təcrübələri üçün ortada bir CpG ardıcıllığı olan yalnız 11 nukleotiddən ibarət bir uzantı seçdim. ASCL-1, kiçik hüceyrəli ağciyər xərçəngi və bağırsaq xərçəngi zamanı çox yüksək dərəcədə metillənmiş, normal hüceyrələrlə müqayisədə daha çox gen ifadəsi ilə nəticələnən tanınmış PRC1 hədəf genidir.

Scml2 SLED domeninin DNT -ni bağlaya biləcəyi fərziyyəsini sınamaq üçün NMR kimyəvi keçid perturbasiya analizi istifadə edilmişdir. NMR kimyəvi dəyişikliklər protein quruluşundakı dəyişikliklərə çox həssasdır. Buna görə də, bir zülalın bağlanma ortağı ilə titrləşməsindəki dəyişikliklər, bağlanma sahəsinin dəqiq xəritələnməsinə və bağlanma yaxınlığının ölçülməsinə imkan verir. İki tamamlayıcı 5'AGGAGCGGGAG-3'ün və 5'CTCCCGCTCCT-3'ün N5 mm6-a titrlənmiş oliqonükleotda tavlanması ilə əldə edilən ASCL-1 promotor bölgəsindən (bundan sonra ASCL1) dsDNA 11-mer. SLED nümunəsi, ASCL1 -in SLED -ə 7: 1 nisbətində sonuna qədər etiketləndi. Titrləşdirmənin hər bir nöqtəsində SLED domeninin 15 N-1 H HSQC spektrinin toplanması ilə bağlanma nəzarət edildi. Seriyanın hər titrləmə nöqtəsi üçün bir olan səkkiz spektrin üst-üstə düşməsi Şəkil 6-da göstərilmişdir. A, burada pulsuz SLED domen spektri göstərilir mavi, və dsDNA-nın 7 molyar artıqlığının mövcudluğunda SLED spektri aşağıda göstərilmişdir. qırmızı. The iki giriş üstündə sağ iki seçilmiş spektral bölgəni təsvir edir və böyük kimyəvi dəyişiklik dəyişikliklərini (rəng gradientindən mavi üçün qırmızı) ASCL1 oligonükleotid əlavə edildikdə. Şəkil 6-da göründüyü kimi, AB, SLED və ASCL1 oliqonukleotidi arasında spesifik qarşılıqlı əlaqəni göstərən DNT əlavə edildikdən sonra zirvələrin yalnız bir alt çoxluğu öz mövqeyini dəyişdi.

Scml2 SLED domain and dsDNA binding. A, overlay of 15 N/ 1 H HSQC spectra of the free (mavi) and DNA-bound SLED domain. The two insets show gradual changes in peak positions (from mavi üçün qırmızı) in selected spectral regions upon the addition of ASCL1 dsDNA. B, NMR frequency difference Δω = (ΔωN. 2 + ΔωH 2 ) ½ (at 800 MHz for 1 H) between the first and the last points of DNA titration for each amino acid residue of SLED are shown as a histogram. Δω values for backbone HN groups are shown in mavi, and those for the HN groups of Gln and Asn side chains are shown in qırmızı. C, SLED amino acid residues that form the DNA-binding site (with Δω values > 30 Hz) are shown in qırmızı on a surface representation (sol) and ribbon representation (sağ) of the SLED structure. Selected DNA-binding residues are labeled. Proline residues within the DNA-binding site are shown in bənövşəyi on the SLED surface and labeled as P. Titration data for proline residues are not available because they are not present in the 15 N/ 1 H HSQC spectrum due to a missing HN group in their chemical structure.

Residues displaying the largest frequency changes (Δω > 30 Hz) were mapped onto the spatial structure of the SLED domain (shown in qırmızı in Fig. 6 C), revealing the SLED-binding site for ASCL1 oligonucleotide. A distinct binding interface is clearly located on the same face of the molecule (red patch). Specifically, it includes the N terminus (residues 353�) as well as residues forming the hydrophobic cavity (Leu-392, Val-388, Phe-448, and Phe-444), positively charged residues flanking the cavity (Lys-414 and Arg-447), and the loop region connecting 㬤 and 㬔 (residues 439�). The residues Asn-440 and Ser-441 from this loop exhibit the most pronounced chemical shift changes ( Fig. 6 B). Interestingly, the corresponding loop of the SeqA protein is also involved in DNA recognition. It is remarkable that all residues mentioned above are highly conserved ( Fig. 4 A) and the identified DNA-binding site constitutes a portion of the larger conserved surface patch shown in Fig. 4 B, suggesting that residues involved in SLED-DNA binding were preserved during evolution and are important for Scml2 function.

To confirm that the protein surface identified in Fig. 6 is indeed a DNA-binding site, Asn-440 located on this surface has been mutated into alanine, and the NMR titrations with ASCL1 oligonucleotide were repeated. This mutation is expected to compromise the DNA binding affinity of SLED. The result is shown in Fig. 7 A, where the HSQC spectra of the free N440A mutant (mavi) and N440A in the presence of 7 m excess of the oligonucleotide (qırmızı) are overlaid. As can be seen, binding was completely abrogated in the N440A mutant, confirming the relevance of this region in DNA binding.

Mutational analysis of Scml2 SLED. A, overlay of 15 N/ 1 H HSQC spectra of the free (mavi) N440A SLED domain and N440A in the presence of 7 m excess of ASCL1 oligonucleotide (qırmızı). B, DNA titration curves derived from the NMR chemical shift perturbation experiments. Cumulative chemical shift changes for all amino acid residues in the domain are plotted as a function of DNA to SLED ratio. Experimental data and fitting curves for three different double-stranded oligonucleotides (dsAGGAGCGGGAG, dsGGGCGCGCCC, and dsTTTATATAAA) are shown in qırmızı, bənövşəyi, və mavimüvafiq olaraq. Nəticədə Kd values are shown at the alt of the graph. C, the model of the C453Y mutant of the SLED domain. The packing of the Cys-453 (üst) qarşı Tyr-453 (alt) side chains within the hydrophobic core is shown. A portion of the protein is shown as a ribbon, and the side chains of the hydrophobic amino acid residues surrounding Cys-453 are shown as sticks. The side-chain atoms of the Cys-453 and Tyr-453 are shown as spheres. D, 15 N/ 1 H HSQC spectrum of the C453Y of the Scml2 SLED domain reveals that it is unfolded in solution.

Scml2 SLED DNA Binding Is Sequence-specific

Although I showed that the SLED domain of the Scml2 is capable of binding dsDNA, the question remains whether it has a preference toward specific DNA sequences. To answer this question, I tested whether SLED can preferentially bind CG-rich qarşı AT-rich DNA oligonucleotides. To this end, 0.25 m m 15 N SLED was titrated with an excess of either CG-rich (dsGGGCGCGCCC) or AT-rich (dsTTTATATAAA) double-stranded oligonucleotides. Their binding was monitored using NMR, and the binding affinities were compared.

SLED global chemical shift perturbations as a function of dsDNA concentration are shown in Fig. 7 B for ASCL1, GC-, and AT-rich oligonucleotides. The dissociation constant (Kd) for each complex was determined as described under 𠇎xperimental Procedures.” The best fits are shown as lines, and the resulting Kd values are listed at the bottom of the graph. The ASCL1 DNA binds to SLED the tightest among the three tested dsDNA sequences with Kd of 560.4 ± 27.4 μ m . The CG-rich dsDNA binds with Kd of 631.7 ± 165.9 μ m , and AT-rich sequence binds the weakest with Kd of 973.3 ± 288.9 μ m . The ASCL1 dsDNA causes significantly larger changes in the SLED spectrum when compared with either AT-rich or CG-rich oligonucleotides.

Taken together these results suggest that SLED can bind dsDNA in a sequence-specific manner and that CpG-containing DNA sequences (ASCL1 and CG-rich) are preferred ligands when compared with AT-rich DNA. A more global and systematic search for DNA motifs recognized by the SLED domain is needed to reveal the optimal DNA sequence recognized in vivo.


Methods for Detecting Protein–DNA Interactions

The chromatin immunoprecipitation (ChIP) method can be used to monitor transcriptional regulation through histone modification (epigenetics) or transcription factor–DNA binding interactions. The ChIP assay method allows analysis of DNA–protein interactions in living cells by treating the cells with formaldehyde or other crosslinking reagents in order to stabilize the interactions for downstream purification and detection. Performing ChIP assays requires knowledge of the target protein and DNA sequence that will be analyzed, as researchers must provide an antibody against the protein of interest and PCR primers for the DNA sequence of interest. The antibody is used to selectively precipitate the protein–DNA complex from the other genomic DNA fragments and protein–DNA complexes. The PCR primers allow specific amplification and detection of the target DNA sequence. Quantitative PCR (qPCR) technique allows the amount of target DNA sequence to be quantified. The ChIP assay is amenable to array-based formats (ChIP-on-chip) or direct sequencing of the DNA captured by the immunoprecipitated protein (ChIP-seq).

  • capture a snapshot of specific protein–DNA
    interactions as they occur in living cells
  • quantitative when coupled with qPCR analysis
  • ability to profile a promoter for different proteins
  • researcher needs to source ChIP-grade antibodies
  • requires designing specific primers
  • difficult to adapt for high-throughput screening

A step-by-step guide to successful chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays

This updated overview of the ChIP procedure includes additional detail about primary antibody selection (i.e., ChIP-validated antibodies). The application note also describes and provides examples of chromatin immunoprecipitation (ChIP) as a technique for studying epigenetics, as it allows researchers to capture a snapshot of specific protein–DNA interactions.

Our 72-page Protein Interaction Technical Handbook provides protocols and technical and product information to help maximize results for protein interaction studies. The handbook provides background, helpful hints and troubleshooting advice for immunoprecipitation and co-immunoprecipitation assays, pull-down assays, far-western blotting and crosslinking. The handbook also features an expanded section on methods to study protein–nucleic acid interactions, including ChIP, EMSA, and RNA EMSA. The handbook is an essential resource for any laboratory studying protein interactions.

Contents include: Introduction to protein interactions, Co-immunoprecipitation assays, Pull-down assays, Far-western blotting, Protein interaction mapping, Yeast two-hybrid reporter assays, Electrophoretic mobility shift assays [EMSA], Chromatin immunoprecipitation assays (ChIP), Protein–nucleic acid conjugates, and more.

Daha ətraflı

Məhsulları seçin

The DNA electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is used to study proteins binding to known DNA oligonucleotide probes and can be used to assess the degree of affinity or specificity of the interaction. The technique is based on the observation that protein–DNA complexes migrate more slowly than free DNA molecules when subjected to non-denaturing polyacrylamide or agarose gel electrophoresis. Because the rate of DNA migration is shifted or retarded upon protein binding, the assay is also referred to as a gel shift or gel retardation assay. Adding a protein-specific antibody to the binding components creates an even larger complex (antibody–protein–DNA), which migrates even slower during electrophoresis. This is known as a “supershift”, and it can be used to confirm protein identities. Until conception of the EMSA, protein–DNA interactions were studied primarily by nitrocellulose filter–binding assays using radioactively labeled probes.

  • detect low abundance DNA binding proteins from lysates
  • test binding site mutations using many probe configurations with the same lysate
  • test binding affinity through DNA probe mutational analysis
  • non-radioactive EMSA possible using biotinylated or fluorescently labeled DNA probes
  • analyze protein–DNA interactions in vitro
  • difficult to quantitate
  • need to perform supershift assay with antibody to be certain of protein identity in a complex

Traditionally, DNA probes have been radiolabeled with ³²P by incorporating an [γ-³²P]dNTP during a 3' fill-in reaction using Klenow fragment or by 5' end labeling using [γ-³²P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Following electrophoresis, the gel is exposed to X-ray film to document the results. The Thermo Scientific LightShift Chemiluminescent EMSA Kit is a non-radioactive assay that provides robust and sensitive performance. The kit includes reagents for setting up and customizing DNA-binding reactions, a control set of DNA and protein extract to test the kit system, stabilized streptavidin–HRP conjugate to probe for the biotin-labeled DNA target, and an exceptionally sensitive chemiluminescent substrate module for detection.

Chemiluminescent EMSA of four different DNA–protein complexes. Biotin-labeled target duplexes ranged in size from 21–25 bp. The Oct-1, AP1 and NF-κB transcription factors were derived from HeLa nuclear extract. EBNA-1 extract is provided as a control in the LightShift Chemiluminescent EMSA Kit. Unlabeled specific competitor sequences (where used) were present at a 200-fold molar excess over labeled target. X-ray film exposure times for each system ranged from 2 minutes for EBNA, Oct-1 and AP1, and 5 minutes for NF-κB.


DNA-binding Domain of lac Repressor

How could genetic experiments determine the amino acid residues that contact operator? Work by Miller and collaborators showed that non-sense mutations lying early in the lacI gene did not abolish expression of the entire gene. Although the ribosomes terminate translation on reaching the nonsense codon, often they do not dissociate from the mRNA before reinitiating translation at a site within the lacI gen. As a result, they synthesize a repressor molecule that lacks up to 61 of the amino acids normally found at the N-terminus. Most surprisingly, these truncated repressor polypeptides fold, associate as usual to form tetra-mers, and bind IPTG. They are, however, incapable of binding to DNA as shown in vivo by their inability to repress and in vitro by the DNA filter-binding assay. The simplest explanation of their inability to bind to DNA is that the amino acids missing from their N-terminus are the part of the wild-type repressor that recognizes and binds to operator. In addition, more detailed genetic analysis of the repressor have shown that the overwhelming majority of missense mutations affecting DNA binding by the repressor map in the region of the I gene coding for the first 60 amino acids.

A typical LacI - mutant is recessive to the wild-type lacI gen. The amino-terminal truncated repressors, however, are dominant negatives. That is, the diploid lacI + /lacI -d behaves like an I - . As explained, the dominance of I -d mutations to the I + allele results from the tetrameric structure of repressor and the fact that all four subunits are required for full repression.

The steps to combine to isolate a particular mutant sometimes are not apparent, so we will list and explain a series of genetics steps designed to isolate an I -d mutant.

1. Isolate I - mutations using phenyl- β -D-galactoside plates. Since phenyl-gal is not an inducer, but is a substrate of β -galactosidase, any cells growing on these plates must be constitutive.

2. Score to determine which are nonsense I - mutations. The muta-tions can be isolated on an episome, F’lac + pro +. To test, the episome can be mated into an F - su + strain. This strain should be deleted of lacpro genlər. To determine whether the episome in the suppressing strain

is I + or I - , the plates can include 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β− D-D-galactoside (X-gal). If X-gal is included in minimal glycerol plates, the constitutives will form deep blue colonies because the hydrolysis of this substrate by β -galactosidase produces an insoluble blue dye.

3. Map the locations of the I - mutations. This can be done using the ability of strains containing the mutation on an episome and a deletion into the I gene on the chromosome to reconstruct an I + gene (Fig. 11.11). A point mutation is able to recombine with deletion 1 but not deletion 2 to form I + recombinants. Although this type of mapping only positions the mutation to the left or right of the end point of the deletion, an ordered set of deletions can be used to locate the mutation to within about 10 base pairs.

How can the selective plates be arranged to permit growth of only the cells that can reconstruct a functional I gene? The plates must prevent growth of each of the parent types of cells as well as mated cells that are unable to form a wild-type lacI gen. This can be done by using phenyl-gal and glycerol in plates. The deletion mapping can be done in a GalE - strain. The resulting defective galactose epimerase gene renders the cells sensitive to galactose. The LacI - cells are constitutive and cleave the phenyl-gal to produce galactose, which then prevents their growth. A LacI + recombinant, however, represses β -galactosidase synthesis and does not generate galactose. Such cells can continue to grow in the presence of phenyl-gal.

4. Test the candidates for being trans-dominant repressor negative. This is done by mating the episome into an I + strain and selecting for transfer of the pro marker This strain is tested by spotting onto X-gal plates as before.

5. Physical studies of the repressor from the I -d mutants can test whether the repressor is a tetramer, and SDS gels can show that the mutated repressor is shorter than wild-type.

Protein sequencing can provide the final proof that the repressor synthesized in the nonsense I -d mutants results from translational restarts. The mutant repressor can be purified by precipitation with antibody, separated from the antibody by SDS gel electrophoresis, eluted from the gel, and the N-terminal amino acids sequenced.


Comparison of different type of DNA polymerase from NEB

NEB has a series of DNA polymerase that suitable for different users’ applications. Here, we’ll discuss some of them, including Q5 ® and Q5 ® U, Phusion ® and OneTaq.

What is Q5 ® high-fidelity DNA polymerase?

Q5 ® high-fidelity DNA polymerase is famous for its fidelity and robust performance. This is due to it is composed of a novel polymerase which is fused to the processivity-enhancing Sso7d DNA binding domain.

Up to date, Q5 ® has the highest fidelity amplification (

280 times higher than Taq) and hence has an ultra-low error rate. As a result, it is ideal for molecular cloning and can be used for long or difficult amplicons.

What are the advantages of using Q5 ® ?

Q5 ® is suitable for all PCR applications and a wide variety of target. This includes high AT to high GC amplicons, and up to 10kb of human genomic amplicons (for simple genomic amplicons: at least 20kb).

What are the applications of using Q5 ® ?

  1. Ultra high-fidelity PCR
  2. Long-range PCR
  3. Cloning from in vitro material for protein expression or gene analysis
  4. SNP analysis via cloning and sequencing
  5. Site-directed mutagenesis
  6. NGS Library prep

What is Q5U ® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase?

If you are working with uracil-containing DNA templates or using dUTP, you are recommended to use the new Q5U ® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase . What’s so special about the Q5U ® ? Q5U ® has the ability to read and amplify templates containing uracil and inosine bases. This is because Q5U ® contains a mutation in the uracil-binding pocket. Moreover, you can prevent carryover contamination when combined with dUTP and Uracil DNA Glycosylase (UDG) treatment.

What are the advantages of using Q5U ® ?

  1. Achieve superior amplification of bisulfite-converted, deaminated, or damaged DNA (e.g., FFPE)
  2. Prevent carryover contamination when combined with dUTP and Uracil DNA Glycosylase (UDG) treatment
  3. Generate higher assembly efficiency and improve accuracy in USER® cloning
  4. Enable room temperature setup with aptamer-based hot start formulation

What is the application of Q5U ® ?

  1. USER cloning
  2. High fidelity amplification of bisulfite converted or deaminated DNA substrates
  3. Carryover prevention

What is OneTaq ® DNA Polymerase?

birTaq ® DNA Polymerase is the fusion of Taq and Deep Vent ® DNA polymerase that suitable for most PCR application. birTaq ® is 2x higher fidelity than Taq. As a result, it has a lower error rate compared to Taq.

Tips: Did you know most OneTaq reactions amplify more efficiently and robustly when you use a 68°C extension temperature?


An Introduction to Genetic Analysis. 7th edition.

The inducer–repressor control of the lac operon is an example of negative control, in which expression is normally blocked. In contrast, the CAP-cAMP system is an example of positive control, because expression of the lac operon requires the varlıq of an activating signal—in this case, the interaction of the CAP-cAMP complex with the CAP region. Figure 11-13 distinguishes between these two basic types of control systems.

Figure 11-13

Comparison of positive and negative control. The basic aspects of negative and positive control are depicted. (a) In negative control, an active repressor (encoded by the R gene in the example shown here) blocks gene expression of the A𠁛𠁜 (daha çox.)

For activators or repressor proteins to do their job, each must be able to exist in two states: one that can bind its DNA targets and one that cannot. The binding state must be appropriate for a given set of environmental conditions. For many activator or repressor proteins, the way that DNA binding is regulated is through the interaction of two different sites in the three-dimensional structure of the protein. One site is the DNA-binding domain. The other site, the allosteric site, acts as a switch that sets the DNA-binding domain in one of two modes: functional or nonfunctional. The allosteric site interacts with small molecules called allosteric effectors. In regard to the lac operon, lac inducers are allosteric effectors. When allosteric effectors bind to the allosteric site, they cause a conformational change in the regulatory protein so that it alters the structure of the DNA-binding domain. Some activator or repressor proteins must bind to their allosteric effectors to bind DNA. Others can bind DNA only in the absence of their allosteric effectors. Figure 11-14 depicts these concepts.

Figure 11-14

The effects of allosteric effectors on the DNA-binding activities of activators and repressors.

By using different combinations of controlling elements, bacteria have evolved numerous strategies for regulating gene expression. Some examples follow.

Nəşriyyatla razılaşma əsasında bu kitab axtarış funksiyası ilə əldə edilə bilər, lakin gözdən keçirilə bilməz.


Functions of single-strand DNA-binding proteins in DNA replication, recombination, and repair

Double-stranded (ds) DNA contains all of the necessary genetic information, although practical use of this information requires unwinding of the duplex DNA. DNA unwinding creates single-stranded (ss) DNA intermediates that serve as templates for myriad cellular functions. Exposure of ssDNA presents several problems to the cell. First, ssDNA is thermodynamically less stable than dsDNA, which leads to spontaneous formation of duplex secondary structures that impede genome maintenance processes. Second, relative to dsDNA, ssDNA is hypersensitive to chemical and nucleolytic attacks that can cause damage to the genome. Cells deal with these potential problems by encoding specialized ssDNA-binding proteins (SSBs) that bind to and stabilize ssDNA structures required for essential genomic processes. SSBs are essential proteins found in all domains of life. SSBs bind ssDNA with high affinity and in a sequence-independent manner and, in doing so, SSBs help to form the central nucleoprotein complex substrate for DNA replication, recombination, and repair processes. While SSBs are found in every organism, the proteins themselves share surprisingly little sequence similarity, subunit composition, and oligomerization states. All SSB proteins contain at least one DNA-binding oligonucleotide/oligosaccharide binding (OB) fold, which consists minimally of a five stranded beta-sheet arranged as a beta barrel capped by a single alpha helix. The OB fold is responsible for both ssDNA binding and oligomerization (for SSBs that operate as oligomers). The overall organization of OB folds varies between bacteria, eukaryotes, and archaea. As part of SSB/ssDNA cellular structures, SSBs play direct roles in the DNA replication, recombination, and repair. In many cases, SSBs have been found to form specific complexes with diverse genome maintenance proteins, often helping to recruit SSB/ssDNA-processing enzymes to the proper cellular sites of action. This clustering of genome maintenance factors can help to stimulate and coordinate the activities of individual enzymes and is also important for dislodging SSB from ssDNA. These features support a model in which DNA metabolic processes have evolved to work on ssDNA/SSB nucleoprotein filaments rather than on naked ssDNA. In this volume, methods are described to interrogate SSB-DNA and SSB-protein binding functions along with approaches that aim to understand the cellular functions of SSB. This introductory chapter offers a general overview of SSBs that focuses on their structures, DNA-binding mechanisms, and protein-binding partners.


Videoya baxın: تنسخ تضاعف الدنا. DNA Replication (Sentyabr 2022).


Şərhlər:

  1. Vudoktilar

    Adətən yarım il çəkir

  2. Megedagik

    The choice you have is not easy

  3. Misida

    Belə olur. Bu mövzuda ünsiyyət qura bilərik. Burada və ya PM-də.

  4. Ruhleah

    Əla, bu gülməli ifadədir

  5. Culloden

    Böyük insan təşəkkürləri!



Mesaj yazmaq