Məlumat

Crisper Cas9 funksiyası necə kəşf edildi?

Crisper Cas9 funksiyası necə kəşf edildi?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hansı sənəd CRIPER DNA, CrRNA və Cas9 -un qarşılıqlı təsirinin kəşfini təsvir edir?


Crispr/Cas9 kəşfi baxımından istinad edilən iki "klassik" sənədlərə Doudna/Charpentier ilkin kəşfi və gen redaktəsi üçün Feng Zhang tətbiqi daxildir. Crispr/Cas9 gen redaktə texnologiyasını həqiqətən kimin kəşf etdiyi ilə bağlı davam edən məşhur patent mübahisəsi var.

Sualınıza daha yaxşı cavab verən sürətli bir zaman çizelgesi olaraq, yaxşı bir nəşr Cell Paper -dir və əslində əla bir podcast var, amma ümumiləşdirəcəyəm:

  1. Yoshizumi Ishino və digərləri. 1987 -ci ildə Crispr mexanizmini kəşf etdi - müəlliflər bakteriyalarda DNT -nin qəribə müntəzəm təkrarlanmasını fərq etdilər və qeyd etdilər: "Prokaryotlarda başqa yerdə homolog bir ardıcıllıq tapılmadı və bu ardıcıllığın bioloji əhəmiyyəti bilinmir".

  2. 1993-2005 -ci illərdə Francisco Mojica - CRISPR ilə əlaqədar araşdırmalar, bu anda terminlər Jansen tərəfindən hazırlanmışdır, lakin həqiqətən də bir neçə bakteriyada Crispr modelini görən və bunun immun cavabla əlaqəli olduğunu irəli sürən Mojicadır.

  3. 2005-ci ildə Alexander Bolotin - Streptococcus thermophilus bakteriyalarını araşdıran Bolotin, aralayıcılar arasında olan genetik materialın Crispr fərziyyəsinin qəti sübutunu təmin edən viral DNT olduğunu aşkar etdi.

  4. 2006-cı ildə Marakova - Cas9 zülalının bakterial adaptiv immun cavabında istifadə oluna biləcəyinə dair ilk təklif, baxmayaraq ki, Bolotin də Cas9-un istifadəsinə diqqət yetirdiyi üçün bu dövrdə hesablanır.

  5. 2006 -cı ildə Koonin - Viral DNT -nin Crispr anbarını və Cas9 hesabatlarını, immun sistemində Cas9 ilə Crispr DNT -dən istifadə edə biləcək əlaqəli bir sistem olaraq bir araya gələn bir immun reaksiya hesabatını verən ilk insan.

  6. 2007 -ci ildə Marraffini - Crispr -Cas9 sistemini daha da öyrənərək, Cas9 -un proqramlaşdırıla bilən bir məhdudiyyət fermenti olduğunu və RNT -ni deyil, DNT -ni hədəf aldığını göstərən ilk qəti mikrobioloji sübutları təqdim edir. Eyni zamanda Philippe Horvath, Danisco France da adaptiv immunitet sisteminin ən yaxşı sübutunu təqdim etdi.

  7. 2010 -cu ildə Doudna və Carpentier - Sıralama yolu ilə, Crispr və Cas9 sistemini qəti şəkildə bir araya gətirərək DNT -ni kəsə bilən tam bir vahid olaraq, tracRNA -nı da DNT kəsilməsini proqramlaşdırmaq üçün Cas9 ilə birləşən RNA parçası olaraq təsvir etdilər.

  8. 2013 -cü ildə Feng Zhang - Doudna əvvəllər Cas9 sisteminin məməlilərin DNT -sini hədəf almaq üçün istifadə edilə biləcəyini irəli sürsə də, Zhang həqiqətən mümkün olduğunu və buna görə də asanlıqla düzəldə bilən bir vasitə olaraq Crispr/Casa9 sistemi olaraq qapıya açılan ilk sistem idi. genomlar.

Mən bir neçə əsas addımı qaçırdım və Crispr/Cas9-un faktiki mexanizmini tam izah etməsəm də, düşünürəm ki, bu, layiqli bir qrafik təqdim edir. Faktiki mexanizm haqqında daha çox məlumat üçün bax: Harvard, Wired, Science News.


Bu məqalədə bu barədə sizə məlumat veriləcəkdir.

Tam mətni görməyə icazəm yoxdur, amma var.

Bu yazının tam mətn bağlantısı http://science.sciencemag.org/content/337/6096/816.full


CRISPR -ı kəşf edən İspan alim Frensis Mojika

Məşhur inancın əksinə olaraq, Francis Mojica CRISPR mexanizmini kəşf edən və ona adını verən ilk şəxsdir. Mənə kəşfin necə meydana gəldiyini, gen redaktə alətinin geniş potensialını müzakirə etdi və ən çox sevdiyi CRISPR tətbiqini paylaşdı.

Çox güman ki, CRISPR/Cas9 haqqında eşitmisiniz, dünyanı fırtına ilə ələ keçirən gen redaktə vasitəsi. DNT-ni redaktə etmək üçün ilk vasitə olmaqdan uzaq olsa da, CRISPR texnologiyası gen redaktəsini əvvəlkindən daha asan və sürətli edir. Son bir neçə ildə bütün dünyada laboratoriyalarda istifadəsi hər yerə yayılmışdır.

CRISPR/Cas9 dərman kəşfini sürətləndirmək və bütün növ xəstəlikləri öyrənmək üçün heyvan modellərinin yaradılması üçün istifadə olunur. Ancaq hər kəsin səbirsizliklə gözlədiyi və pul atdığı tətbiq insan xəstəliklərini müalicə etmək üçün CRISPR istifadə edir. İlk klinik sınaqlar artıq başlamışdır və onların nəticələri CRISPR -in bu böyük gözləntiləri ödəyə biləcəyini ortaya qoyacaq.

CRISPR/Cas9-un ortaq ixtiraçıları olan Jennifer Doudna, Emmanuelle Charpentier və Feng Zhang, bu gün hər kəsin gen tənzimləmə vasitəsi ilə əlaqəli olduğu üzlərdir. Alətin özəyində mexanizmi kəşf edən və CRISPR -ə adını verən, İspaniyanın Alikante Universitetinin professoru Francis Mojicadır.

İllər əvvəl, bu gün CRISPR ətrafında bütün hərəkəti cücərtmiş toxum əkən şəxslə danışmaqdan çox həyəcanlandım. Fürsətdən istifadə edərək ondan belə bir inqilabi alətin əsasını necə kəşf etməsi hekayəsindən tutmuş sevimli CRISPR tətbiqinə və onun terapiya kimi real potensialı haqqında nə düşündüyünə qədər hər şeyi soruşdum.

Əvvəldən başlayaq. CRISPR ilə ilk dəfə nə vaxt qarşılaşmısınız?

Tezis üzərində işləyərkən 1992 -ci ildə idi. Mən duzluluğu yüksək olan mühitlərdə yaşayan arxe qrupuna aid mikroorqanizmlərlə işləmişəm. Onlar həddindən artıq halofillər və ya "duz həvəskarları"dır. Duz konsentrasiyasındakı dəyişikliklərə uyğunlaşma mexanizmlərini araşdırdıq.

DNT -lərini sıralamağa başladıq. O vaxtlar ardıcıllığın başlanğıcı idi və siz yalnız 200-ə yaxın baza cütünü oxuya bilərdiniz, əgər bütün təcrübə həqiqətən yaxşı keçsəydi. Nəhayət, əvvəlcə tandem təkrarları və ya TREPs adlandırdığımız bu müntəzəm aralıklı təkrarları tapdıq. Digər mikroorqanizmlərdə də olub -olmadığını öyrənmək üçün ədəbiyyata baxdıq. İndiki vaxtda bunu axtarmaq çox asandır, amma o vaxt PubMed yox idi, buna görə əl ilə axtarmalı olduq, bu da olduqca mürəkkəb idi.

Sonda gördük ki, 1987 -ci ildə bir Yapon qrupu halofillərdə gördüklərimizlə eyni ölçüdə təkrar -təkrar qarşılaşdı və bu da özünəməxsus bir xüsusiyyət idi.

Bu, onların funksiyasının nə ola biləcəyini araşdırmaqda bizi maraqlandırdı. Prokaryotların genomunun ölçüsü çox məhduddur, özlərinə heç bir lüksə icazə verə bilməzlər. Bu o deməkdir ki, DNT-nin bu qədər böyük bölgələrini bu təkrarları saxlamaq üçün ayırıblarsa, onların mühüm funksiyası olmalıdır. Həm bakteriyalarda, həm də arxealarda olsaydı, bu təkrarların mənşəyi ata -baba olmalı idi.

Əvvəlcə bu təkrarların bir neçə fərqli adı var idi. Sonda niyə onlara CRISPR adını verdiniz?

İlk ad, dissertasiya rəhbərimin təklifi olan tandem təkrarlarından TREPs idi. Amma bunun düzgün ad olduğunu düşünmürdüm. Onlar həqiqətən tandemdə deyildilər, bu da onların bitişik olduqlarını, eyni ardıcıllığın aralarında heç bir şey olmadan təkrarlandığını göstərir. 2000-ci ildə biz ekvivalent təkrarların təkamül baxımından bir-birindən çox uzaq olan bir çox başqa orqanizmlərdə mövcud olduğunu təsdiqlədik və mən onları qısa müntəzəm aralıqlı təkrarlar və ya SRSR adlandırdım.

Eyni zamanda, bu bölgələri identifikasiya üsulu olaraq istifadə edən bu təkrarlamalarla işləyən yeganə tədqiqat qrupu var idi. mikobakteriya vərəmi, məhkəmə tibbinin insanın bioloji nümunəsinin kimə aid olduğunu müəyyənləşdirməsinə bərabərdir. Onlar birbaşa təkrarlar üçün DR terminindən istifadə edirdilər.

2001 -ci ildə mənimlə əlaqə qurdular ki, fərqli orqanizmlərdə bu təkrarların yanında bəzi genlər tapdıqlarını və ortaq bir terminlə razılaşmaq istədiklərini söylədilər. Bir neçə alternativ təklif etdim və CRISPR -ə getdik ki, bu da mütəmadi olaraq bir -birinə qarışan qısa palindromik təkrarları ifadə edir. Qısa müddət sonra, qrup bunu izah edən bir məqalə nəşr etdi cas genlər, CRISPR ilə əlaqəli üçün qısaldılmışdır.

İndi CRISPR və bunları bilirik cas Genlər, parazitlərdən DNT -ni kəsmək və öldürmək üçün bakteriyaların ibtidai immun sisteminin bir hissəsidir. Bunun onların funksiyası olduğunu necə başa düşdün?

Postdoc-dan sonra mən Alikanteyə qayıtdım və yalnız bu təkrarların funksiyasını öyrənmək üçün bir araşdırma qrupuna başladım. CRISPR -ni genetik marker olaraq öyrənirdik E. coli bakteriya. Nümunələrdən birində, virusla eyni olan bir DNT ardıcıllığı tapdıq. Və hər hansı bir virus deyil, normal yoluxduran bir virusdur E. coli , bu ardıcıllığın bu virusa yoluxduğu zaman bu bakteriyaların bir atası tərəfindən alındığını irəli sürdü.

Bunu tapmaq üçün bizə təxminən 6 il lazım oldu. Yalnız 1995 -ci ildə bir bakteriyanın bütün genomu sıralanır. 90-cı illərin sonunda 20-yə yaxın bakterial genom var idi, halbuki indi bizdə minlərlə var.

Ancaq 2003 -cü ildə DNT ardıcıllığı məlumat bazaları qat -qat artmağa başladı. Yalnız buna bənzər və ya eyni olan ardıcıllıqlar E. coli lakin bir çox digər, çox fərqli orqanizmlərdən ortaya çıxmağa başladı. Və bütün hallarda, onlar həmin dəqiq orqanizmi yoluxduran parazitlərin ardıcıllığı ilə üst-üstə düşürdülər.

Ədəbiyyata baxanda gördük ki, bu DNT ardıcıllığının varlığı, hüceyrəni genomunda eyni ardıcıllığa malik bir virusun infeksiyasından qoruyur. Virusların ardıcıllığı olan hüceyrələrə yoluxa biləcəyi hallarının olmadığını gördük. Bu, onu daşıyan bakteriya və ya arxeanı immunlaşdırdı.

Bu bizim üçün çox aydın idi, buna görə də Nature -da dərc etməyə çalışdıq, amma bunun o qədər də maraqlı olmadığını söylədilər. Mexanizmin nə ola biləcəyinə dair bir sübutumuz olsaydı, bu barədə düşünə bilərdilər. Razı olmadıq aydın.

Yaxşı, təbiət indi peşman olur ...

Əslində bunu dərc etmək istəməyən tək onlar deyildi. Daha dörd jurnala göndərdik və sonda, deyək ki, ilk 10 -luqda olmayan bir jurnalda nəşr etdik.

Yenə də bu kəşfi ilk nəşr edən bir yarış olduğu görünürdü.

Yaxşı, dörd jurnal bir -birinin ardınca heç kim demədi və nəşrini başa vuran jurnalın bizə qayıtması 6 ay çəkdi. O zamanlar internet vasitəsilə deyil, poçtla göndərilirdi. 6 aydan sonra tələb olunan dəyişiklikləri 2 və ya 3 gün ərzində etdik və bunu qəbul edənə qədər daha 3 ay çəkdilər. Sonra onu nəşr etmək üçün daha 3 ay çəkdilər.

Əlinizdə böyük olduğunu bildiyiniz bir şey olduğunu düşünün və işinizin orijinallığını özündə əks etdirən başqa bir məqalənin dərc olunma ehtimalı var. Xatırlayıram ki, hər ay redaktora məktub göndərərək, "Zəhmət olmasa mənə deyin, başqa bir jurnala təqdim edə bilərikmi və ya verməyəcəksiniz" deyin. Mən tam ümidsizlik içində idim.

Əslində, nəşrdən bir ay sonra, ekvivalent DNT ardıcıllığının olduğunu söyləyən başqa bir məqalə var idi. Yersinia pestis vəba xəstəliyindən məsul olan bakteriyalar viruslardan qaynaqlanır. Bu yaxınlarda bu məqalənin müəllifləri ilə əlaqə saxladım və dedilər ki, bir ildən çoxdur nəşr etməyə çalışırlar.

Lakin digər məqalə yalnız bir növdə olduğu halda, biz müxtəlif taksonomiya qruplarının təxminən 50 növünün 60-dan çox ştamını təhlil etdik. Tam və tam bir analiz idi.

Charpentier və Doudna nəşrlərini nəşr etdikləri 2012-ci ili sürətlə davam etdirək kağız CRISPR -in bir gen redaktə vasitəsi olaraq istifadə edilməsi haqqında. Belə bir şey gözləyirdiniz?

Yox, qətiyyən yox. Əvvəlcə Nature -a göndərdiyimiz məqalədə, kəşfimizin biotexnologiya, biologiya və klinik elmlərə böyük təsiri olacağını söylədi. Bununla birlikdə, dərman istehsal etmək və ya qida fermentasiyası üçün istifadə olunan bakteriyalar haqqında düşünürdük, çünki bu kəşf bu bakteriyaların viruslara qarşı immunitetli olmasını seçməyə və ya proqramlaşdırmağa imkan verdi.

Lakin 2012-ci ildə onların genomun redaktəsi üçün proqramlaşdırıla bilən bir qayçı proqramlaşdırmaq üçün lazım olan komponentləri müəyyən etdiklərini görəndə məni çaşdırdı. Mən prokaryotların mikrobioloquyam. Bir bakteriyanın DNT -ni kəsəndə onu öldürürsən. Amma mən bilmirdim ki, eukariotlarda DNT-ni kəsəndə DNT-ni yenidən yazmaq imkanını açan təmir mexanizmini işə salırsan.

Jennifer və Emmanuelle bunu etdilər in vitro və gözəl işlədi. Bir neçə ay sonra, Feng Zhang və George Church tərəfindən eyni jurnalda ard-arda nəşr olunan iki məqalə var idi ki, bu vasitələrdən ilk dəfə siçanların və insanların genomunu redaktə etmək üçün istifadə edildiyini bildirdi.

Cərəyana münasibətiniz necədir? patent mübahisəsi aralarında?

Müəyyən dərəcədə başa düşüləndir. Ancaq bu, əsasən iki qurumun mübarizəsidir. Tədqiqatçıları şəxsən tanıyıram və əminəm ki, heç olmasa bu səviyyədə döyüşə başlamaq niyyətləri olmayıb.

Özünüz patent almaq barədə düşünmüsünüzmü?

Ağlımdan keçdi amma keçmədim. Mənim üçün heç vaxt prioritet olmayıb. Və hər halda mümkün olmazdı, lazımi iddiaları irəli sürmək üçün eksperimental sübutumuz yox idi. CRISPR adını patentləşdirə bilsəm də, bu halda indi milyarder ola bilərdim. Amma gecələr məni oyaq saxlamır, yəqin kimsə müdaxilə etməmək üçün adını dəyişəcəkdi.

CRISPR-ın cəlb etdiyi bütün populyarlıq və pullar əsasən ondan terapiya kimi istifadə etmək vədi ilə bağlıdır. Sizcə CRISPR həqiqətən genetik xəstəlikləri müalicə edə bilərmi?

Əmin olan budur ki, model heyvanlarda xəstəliyin səbəbləri haqqında bilikləri xeyli inkişaf etdirir. Bu, danılmaz reallıqdır və son bir neçə ildir ki, edilir.

CRISPR, heyvanlarda, xüsusən də siçanlarda, retinit pigmentozası, əzələ distrofiyası, Huntington xəstəliyi, hemofiliya və HİV -i aradan qaldırmaq üçün istifadə edilmişdir. Ancaq insanlarda hələ bir nəticə yoxdur. Bir neçə aydan sonra bir müalicə olaraq istifadə edilə biləcəyini biləcəyik.

Ən sevdiyiniz CRISPR tətbiqi hansıdır?

Yaxşı, hamı sağlamlıqdan narahatdır, amma mən bir mikrobioloq kimi qərəzliyəm. Mənim üçün ən maraqlı tətbiqlərdən biri bakteriyaları öldürmək üçün antimikrobiyal maddələrdir. Bu alətlər patogen olan bakteriyaların DNT-sini xüsusi olaraq hədəfləmək üçün proqramlaşdırıla bilər. Bunun bağırsaq mikrobiyotası üçün üstünlükləri var - bir antibiotik qəbul etsəniz, bağırsaqdakı bütün faydalı bakteriyaları öldürərsiniz.

Son bir neçə ildə CRISPR -in kəşfinə görə Nobel mükafatına namizəd ola bilərsiniz. Sizcə, CRISPR nəhayət Nobel mükafatı alacaq?

Əminəm ki, onu alacaq. Nə vaxt? Bilmirəm. Ertəsi gün Nobel mükafatları verilmir. Bəzi hallarda işin tanınması hətta onilliklər çəkir. Ancaq PCR vəziyyətində bir neçə ildən sonra verildi.

CRISPR -in gözlənilən bütün potensialı nümayiş etdirməsini gözlədikləri mümkündür, amma bu ədalətsizlik olar. CRISPR-ın artıq əldə etdiyi nailiyyətlər Nobel mükafatı almış digər vasitələrin əldə etdiklərindən qat-qat çoxdur. Mükafat, test borusundakı DNT -ni kəsmək və kopyalamaq üçün istifadə olunan vasitələrə verildi. CRISPR, genomları redaktə etmək, ifadə səviyyələrini dəyişdirmək, DNT-ni vizuallaşdırmaq, bakteriyaları öldürmək, diaqnostikanı inkişaf etdirmək və bir çox başqa proqramlar, hətta filmi DNT daxilində saxlamaq üçün istifadə edilə bilər.

Nobel alsanız, planlarınız nədir?

Əslində, arzulayıram ki, mükafatı artıq CRISPR -ə, hətta başqalarına versinlər, buna görə də içimdəki böyük təzyiqə son qoyulardı. İndi həyatımı davamlı olaraq gələn yüzlərlə istəkləri qəbul etməklə keçirirəm. Artıq bir neçə il keçib və sönmək əvəzinə daha da böyüyür.

Namizədliyimə dair heç bir sübut yoxdur, çünki bu, ictimai deyil, amma onu əldə etsəm, planetdən yox olacağam. İstirahət etməli və dincəlməliyəm və məni motivasiya edənə qayıtmaq və laboratoriyaya qayıtmaq üçün vaxt lazımdır.

Franco Mojica'nın Roberto Ruiz /Taller de Imagen de la Universidad de Alicante vasitəsilə şəkilləri NIK Spencer /Nature The Conversation Eligo Bioscience vasitəsilə. Bu məqalə ilk olaraq 2017-ci ilin noyabrında dərc edilmişdir.


CRISPR: Ümidlər, Qorxular və Biologiya

CRISPR -a ilk baxışımız çiyinlərimizlə nəticələndi. Klonlama və ardıcıllıqla həyata keçirilməsi iap daxil olan gen E. coli, İşino və Osaka Universitetindəki həmkarları 3-cü qanad bölgəsində əlaqəsiz qısa DNT parçaları ilə ayrılmış qəribə təkrarlanan ardıcıllıqla rast gəldilər (Ishino Y et al. 1987) iap. Bu quruluş öz məqalələrində qeyd olunmağa layiq olacaq qədər diqqətəlayiq idi, lakin İşino daha əvvəl heç bir oxşar quruluşun təsvir edilməməsindən və bu genetik elementin funksiyasının naməlum qalmasından başqa bir şey deyə bilməzdi.

25 il sonra bu sirli ardıcıllıqlar elmi kəşfin indiyə qədər gətirdiyi ən böyük ümid və qorxuların mərkəzindədir. Prestijli mükafatlardan yüz milyonlarla dollarlıq başlanğıc maliyyəsi və diqqət New York TimesWIRED jurnalı moratorium çağırışlarına və CRISPR -in sizin və mənim gələcək dizayner versiyalarına yol açan xəbərdarlıqlara reaksiyalar müxtəlifdir. Ancaq çox az adam çiyinlərinə bənzəyir.

CRISPR-Cas: Prokaryotik adaptiv immunitet sistemi

Ishino və başqaları, kəşf etdikləri qəribə təkrarlanan ardıcıllıqlar üçün bir funksiya təyin edə bilmədilər. Lakin ardıcıllıq texnologiyası kimi bir çox arxeada olduğu kimi uzaqdan əlaqəli bakteriyaların genomlarında da oxşar genetik elementlər tapıldı. 2002-ci ildə bu ardıcıllıqlara bir ad verildi: klasterləşdirilmiş müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrarlar və ya CRISPR. Jansen və digərləri (2002) müxtəlif növ CRISPR lokuslarının silik analizində istifadə edərək, bu ardıcıllığın bir neçə əsas xüsusiyyəti bölüşdüyünü göstərdilər: palindromik təkrarlarla əhatə olunmuş əvvəllər müəyyən edilmiş sirli qısa aralıq ardıcıllıqları, növ səviyyəsində qorunan bir lider ardıcıllığı və dörd CRISPR ilə əlaqəli və ya cas ekzonükleazlara və helikazlara homologiyası DNT metabolizmasında və ya gen ifadəsində rol oynayan genlər.

Bu tapıntılar, CRISPR ayırıcı sekanslarının məlum faj və plazmid ardıcıllıqlarına uyğun gəldiyinə dair məlumatlar ilə birlikdə (Bolotin və digərləri 2005, Mojica və digərləri 2005, Pourcel 2005), elm adamlarının CRISPR-in bakteriya və arxaya icazə verən prokaryotik RNAi kimi bir sistem ola biləcəyini fərz etməsinə səbəb oldu. nuklein turşularını işğaldan qorumaq üçün (Makarova et al 2006, Lillestøl et al 2006).

Bu fərziyyə Daniskoda qatıq mədəniyyətlərini vaxtaşırı məhv edən faglarla mübarizə aparan elm adamlarının diqqətini çəkdi. İmmunitet sistemi hipotezini yoxlamaq üçün özlərinə yoluxdurdular Streptococcus thermophilus məlum fajları olan mədəniyyətlər. Bakteriyaların çoxunun ölməsi təəccüblü deyil. Bugünkü CRISPR çılğınlığını açan şey, sağ qalan bakteriyaların CRISPR lokuslarına ayırıcı olaraq faj DNT -si daxil etmələri idi. Bu boşluqlar çıxarıldıqda, bakteriyalar CRISPR sisteminin prokaryotik adaptiv toxunulmazlığın bir forması kimi xidmət etdiyi fərziyyəsini dəstəkləyərək yenidən faqlara həssas oldu (Barrangou 2007). Danisko üçün daha vacib olan bu, seçdikləri ardıcıllıqları CRISPR lokuslarına daxil etməklə, məhsuldarlıq və mənfəətin yuyulmasına səbəb olan faq infeksiyalarına son qoymaq üçün bu bakterial immun sistemindən istifadə edə biləcəklərini təklif etdi.

CRISPR -ləri alətə çevirmək

Daniskonun faja davamlı suşlar yaratmaq fürsəti gördüyü yerdə, digər elm adamları son dərəcə dəqiq və asanlıqla proqramlaşdırıla bilən bir genom redaktə aləti potensialını gördülər. CRISPR-Cas əvvəlcədən müəyyən edilmiş yerlərdə hüceyrənin genomunu kəsmək üçün yenidən proqramlaşdırıla bilsəydi, o, homoloji olmayan son birləşmə (NHEJ) və ya homoloji yönümlü təmir (HDR) vasitəsilə genləri pozmaq və ya DNT ardıcıllığını daxil etmək üçün istifadə edilə bilər.

Doudna və Charpentier laboratoriyaları, belə bir genom redaktə sisteminə doğru əsas bir addım atdı, bu da proqramı yenidən proqramlaşdıra biləcəyinizi göstərdi. S. pyogenes CRISPR-Cas sistemi, Cas9 endonükleazını və müvafiq bələdçi RNT (gRNA) təmin etməklə istənilən in vitro üsulu in vitro olaraq kəsə bilər (Jinek et al 2012). MIT -dəki Zhang laboratoriyasının insan və siçan hüceyrə xətlərini düzəltmək üçün CRISPR sistemindən istifadə etməsindən yarım il keçməmişdi (Cong və digərləri 2013), bu sistemin canlı və növlər və sahələr arasında işlədiyini göstərir. Beləliklə, CRISPR əsaslı genom redaktəsinin sürətli yüksəlişi başladı.

CRISPRs hədəflərini necə tapıb məhv edir

CRISPR sistemi, bir prokaryotun daha əvvəl qarşılaşdığı nuklein turşularını işğal etmək üçün bir endonükleaz və ya endonükleaz kompleksini hədəf almaq üçün CRISPR RNA (crRNA) adlı qısa RNT -lərdən istifadə edir. Xarici DNT parçası tanındıqdan sonra məhv edilir.

Bu günə qədər müəyyən edilmiş CRISPR sistemləri I, II və III növləri olmaqla üç sinfə bölünür. Bütün CRISPR sistemləri keçmiş infeksiyalar və cas CRISPR əsaslı toxunulmazlığa vasitəçilik edən zülalları kodlayan genlər (Şəkil 1A). CRISPR lokusları, növündən asılı olmayaraq, qısa (

30 nt) nüfuz edən nuklein turşularından yaranan oxşar ölçülü spacer ardıcıllıqlarını əhatə edən palindromik ardıcıllıqlar. Baxmayaraq ki cas genlər adətən CRISPR lokusu ilə əlaqələndirilir, bəzi hallarda genomun başqa yerində tapılır.

Bütün CRISPR sistemləri eyni üç addımı paylaşır (Şəkil 1):

Uyğunlaşma - Cas1 və Cas2 -nin vasitəçiliyi ilə yeni spacer ardıcıllığının daxil edilməsi

İfadə -təkrar-aralıq-təkrarlama ardıcıllığının əvvəlcədən CRISPR RNT-lərinə (əvvəlcədən crRNA-lara) transkripsiyası, sonra bu sekansların növə xas Cas zülalları ilə yetkin crRNA-lara işlənməsi.

Müdaxilə -crRNA vasitəçiliyi ilə nuklein turşularının məhv edilməsi və məhv edilməsi

Şəkil 1. CRISPR-Cas Mexanizmi. CRISPR-Cas sistemi bir CRISPR lokusundan və bir neçə CRISPR ilə əlaqəli və ya ibarətdir cas genlər. Prokariot viruslar, plazmidlər və ya digər işğalçı mobil genetik elementlərlə qarşılaşdığı üçün Cas1 və Cas2 tərəfindən CRISPR lokusuna yeni spacer ardıcıllıqları əlavə edilir.A). CRISPR lokusu konstruktiv olaraq CRISPR tipinə xas şəkildə işlənən pre-crRNA-ya transkripsiya edilir. Nəticədə meydana gələn crRNA, RNA ilə idarə olunan endonukleaz kompleksi yaratmaq üçün tipik Cas proteinləri ilə birləşir (B). Xarici DNT bu kompleks tərəfindən crRNA ilə tamamlanması ilə tanınır. Tanınma protospacer adlanan hədəf ardıcıllığının endonukleaza və ya endonükleaza kompleksi tərəfindən parçalanmasına gətirib çıxarır (C). CRISPR sistemləri ifadə və müdaxilə addımlarındakı mexaniki fərqlərə görə Tip I, II və ya III kateqoriyalara bölünür. Tip I, Tip II və Tip III-A sistemləri ikiqat telli DNT-ni hədəf alır. III-B tipi, RNT-ni hədəf alır.

Üç növ CRISPR sistemi emal və müdaxilə mərhələlərində və parçalanma tələblərində (Şəkil 1A və 1B) fərqlənir ki, bu da bizə CRISPR funksiyalarının xəzinəsini təqdim edir. Fərqli növlərdən CRISPR sistemləri seçilərək spesifiklik dəyişdirilə bilər və CRISPR hətta RNT -ni hədəf almaq üçün istifadə edilə bilər.

Genomları redaktə etmək üçün CRISPR -dən istifadə

Xüsusi mutasiyalar və ya DNT ardıcıllığını hədəf genomlara daxil etmək üçün xarici DNT -ni məhv etmək üçün proqramlaşdırılmış bir sistemdən istifadə etmək üçün CRISPR genom redaktə texnologiyası DNT təmirindən faydalanır.

crRNA'lar, Cas9 zülallarını crRNA ilə tamamlayaraq tanınan ardıcıllıqlara istiqamətləndirir. Cas9 nukleazı daha sonra hədəf DNT-də cüt zəncirli qırılma yaradır. Bu fasilə iki yolla düzəldilə bilər-homolog olmayan son birləşmə (NHEJ) və ya homologiyaya yönəldilmiş təmir (HDR). Nəticə ya dəqiq təmir, ya da mutasiyaların tətbiqi ola bilər.

NHEJ, hədəf genini təsirsiz hala gətirən kiçik əlavə və ya silinmələrlə nəticələnə bilər. İki crRNA istifadə edərək, daha böyük silinmələr əmələ gələ bilər və iki fərqli xromosomdakı saytlar hədəf alınarsa, NHEJ xromosomal translokasiyalar və inversiya ilə nəticələnə bilər.

HDR donor DNT təmin etməklə xarici DNT parçaları daxil etmək üçün istifadə edilə bilər. Bu şərti allellər yaratmaq, zülalları etiketləmək, xüsusi mutasiyalar daxil etmək və ya mövcud mutasiyaları düzəltmək üçün istifadə edilə bilər (Harrison et al 2014). Cüt zəncirli DNT-nin yalnız bir zəncirini kəsən Cas9-un nikaza mutantından istifadə etməklə, tək zəncirli qırılmalar üstünlük təşkil edir və təmir HDR-ə doğru istiqamətləndirilə bilər.

Cas9-un (dCas9) katalitik cəhətdən ölü versiyaları, əksinə, CRISPR tətbiqlərini genom redaktəsindən kənara çıxaran RNT-i idarə edən DNT bağlayıcı zülallar kimi istifadə edilə bilər. dCas9-u transkripsiya aktivatoruna birləşdirərək və genin promotor bölgəsini hədəf alan bir bələdçi RNT (gRNA) istifadə edərək, CRISPR sistemi transkripsiyanı aktivləşdirmək və ya artırmaq üçün istifadə edilə bilər (Gilbert et al 2013). Eynilə, bir repressora birləşdirilmiş dCas9, bir genin tənzimlənməsində istifadə edilə bilər (Gilbert və digərləri 2013). Bir floresan müxbiri ilə birləşdirildikdə, dCas9 maraq doğuran genomik yerlərin vizuallaşdırılmasına imkan verən bir mayak rolunu oynayır (Chen et al 2013).

CRISPR -in eukaryotlarda işlənməsi

CRISPR prokaryotik sistem olsa da, genomu redaktə edən texnologiya kimi sürətli yüksəlişinin bir hissəsi onun zebra balığından tutmuş düyü və meymuna qədər demək olar ki, hər hansı bir model orqanizmdə işləmək üçün uyğunlaşdırılmış olmasıdır.

Tip II CRISPR-Cas9 sistemi, ən çox genom tənzimləmə tətbiqləri üçün seçim sistemi olmuşdur, çünki I və Tip III sistemlərdən fərqli olaraq ən sadə sistemdir, crRNA olgunlaşması, hədəflənməsi və hədəf DNT parçalanması. Bu sistem, olgunlaşma və hədəflənmə üçün əlavə transaktivləşdirici CRISPR RNA (tracrRNA) tələb edir, lakin tracrRNA və crRNA demək olar ki, hər hansı bir ardıcıllığı hədəfləmək üçün xüsusi olaraq dizayn edilə bilən tək bir gRNA -ya birləşdirilə bilər (Şəkil 2) (Jinek et al 2012). RNase III tracrRNA: pre-crRNA emal mərhələsinə ehtiyacın aradan qaldırılması o deməkdir ki, bu sistem həm prokaryotlarda, həm də eukariotlarda asanlıqla istifadə edilə bilər. Beləliklə, eukariotlarda gen redaktəsi sadəcə Cas9 və müvafiq gRNT təmin etməklə əldə edilə bilər.


A.
B.

Şəkil 2. Sadələşdirilmiş CRISPR-Cas9 sistemi. CRISPR-Cas9 sistemi (A) tələb olunan tracrRNA və crRNA-nı tək bələdçi RNT-də (gRNA) birləşdirərək daha da sadələşdirilə bilər (B). Bu, sadəcə Cas9 və uyğun bir gRNA təmin etməklə ökaryotların və prokaryotların gen redaktəsinə imkan verir.

CRISPR -in eksponensial artımı yaxındır

CRISPR heç bir şəkildə ilk genomu redaktə vasitəsi deyil, lakin bu, ən sadə, ən sürətli və ucuzdur, buna görə də o, sink barmaq nükleazları (ZFNs) və transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor nüvələri (TALENs) kimi texnikaları artıq qabaqlamışdır. daha uzun müddətdir mövcud olan.

Həm ZFN, həm də TALEN-lər zülal əsaslı redaktə vasitələridir. CRISPRs kimi, proqramlaşdırıla bilərlər. Lakin hər bir yeni hədəf üçün yeni bir zülal hazırlanmalıdır ki, bu da vaxt aparan, zəhmət tələb edən və ZFN vəziyyətində bahalı bir prosesdir.

Digər tərəfdən, CRISPR, yeni bir geni hədəf almağa və ya minimum bir səylə yeni bir allel yaratmağa imkan verir: sadəcə pulsuz alqoritmlərdən istifadə edərək yeni bir qRNA ardıcıllığı tərtib edin və onlayn sifariş verin. Bir neçə gün sonra sevdiyiniz model orqanizmin genomunu düzəltməyə imkan verən bir plazmid gəlir. GRNA -lar qısa ardıcıllıqlar olduğundan, genom redaktəsinin dəyəri minimaldır - bir neçə primerin qiyməti üçün seçdiyiniz mutasiyanı həyata keçirmək üçün bir gRNA -ya sahibsiniz. Beləliklə, CRISPR, əvvəllər ağlasığmaz olan orqanizmlərdə mutasiyalar yaratmaq üçün daha sadə və daha sərfəli üsuldur.

* PubMed məlumatlarına əsaslanır. Rəylər və əsas ədəbiyyat daxildir.
** Cari nəşrlərin sayından ekstrapolyasiya edilmişdir.

Şəkil 3. İldə CRISPR nəşrlərinin sayı demək olar ki, misli görünməmiş dərəcədə artmışdır.

Zərərvericilərə davamlı buğdadan daha sağlam qırmızı qan hüceyrələrinə qədər

Beləliklə, yeni CRISPR tətbiqlərinin həftəlik dərc olunması təəccüblü deyil. Mühəndislik toz küfünə davamlı çörək buğdasından (Wang və digərləri 2014) CRISPR multiplexingdən istifadə etməklə illər ərzində bir neçə gendə mutasiyalar üçün homozigotlu siçanlar yaratmaq üçün (Bolcun-Filas et al 2014), CRISPR-in genom redaktəsini bir sadə kəsmə və yapışdırma oyunu və tədqiqat və kəşf sürətini görünməmiş bir şəkildə sürətləndirir.

CRISPR, insan xəstəliyi ilə nəticələnən mutasiyaları düzəltmək üçün də qapı açır. Bu yeni bir fikir deyil-Richmond, CA-nın Sangamo Bioscience, ZFN-vasitəçiliyi ilə HİV müalicəsi üçün bir mərhələ 2 klinik sınağı tamamladı-ancaq ümid CRISPR sisteminin sadəliyinin və əlverişliliyinin genom redaktəsindən istifadə yolunu sürətləndirəcəyinə ümid edir. insan xəstəliklərini müalicə etmək. CRISPR əsasında bir neçə şirkət yaradılıb və bu startaplar birlikdə bu günə qədər 170 milyon dollardan çox vəsait toplayıblar (Lauerman and Chen 2015).

CRISPR -in digər redaktə texnologiyalarını əvəz edəcəyinə inanmaq üçün yaxşı bir səbəb var. Siçanlar üzərində aparılan erkən bir araşdırma, CRISPR -in zərərli mutasiyaları in vivo düzəltmək üçün istifadə edilə biləcəyini göstərdi: Wu et al (2013), Crygc gen, bununla da katarakt siçanlarını müalicə edir. San-Fransiskodakı Kaliforniya Universitetinin alimləri bu yaxınlarda CRISPR-dən insan tərəfindən induksiya olunan pluripotent kök hüceyrələrdə (iPSCs) β-talassemiyaya səbəb olan mutasiyaları düzəltmək üçün istifadə etdilər (Xie et al 2014), bizi kök hüceyrə üçün redaktə edilmiş xəstələrdən əldə edilən iPSC-lərdən istifadə etməyə bir addım yaxınlaşdırdı. müalicələr.

Hədəfdən kənar düzəlişlərin aradan qaldırılması

Klinik tətbiqlərdəki əngəllərdən biri, CRISPR-in spesifikliklə əlaqədar digər genom tənzimləmə üsulları ilə eyni narahatlıqları gətirməsidir. Əgər klinikada istifadə olunacaqsa, hədəfdən kənar redaktələrin edilməməsinə necə əmin ola bilərik? Bu, insan terapevtində istifadə edilməzdən əvvəl CRISPR biologiyasını daha yaxşı başa düşmək üçün bir çağırışla nəticələndi və daha böyük spesifikliyə malik olan CRISPR mühəndislik sistemləri üzərində bir araşdırma başlatdı.

Mövcud CRISPR sistemi CRISPR-Cas9 sistemidir S. pyogenes. Bu və digər Tip II sistemlər, parçalanmaq üçün protospacer bitişik motif (PAM) adlanan hədəf DNT ardıcıllığının yuxarı axınında xüsusi 3-9 nt ardıcıllıq tələb edir. Digər növlərdən olan Cas9 sistemləri daha yüksək sərtliyə malik PAM-lara malikdir və beləliklə, CRISPR spesifikliyinin artırılması tapmacasının bir hissəsi ola bilər. Başqa bir yanaşma, Cas9 fermentini daha konkret etmək üçün onu daha yaxşı başa düşməkdir (Kleinstiver et al 2015).

Genlərin necə miras qaldığını yenidən kəşf etmək

Ancaq CRISPR-ə gəldikdə, spesifiklik kiçik bir narahatlıqdır və birinin həll edilə biləcəyinə inanılır. Heç olmasa kəsişmənin bioloji versiyasını kəşf etməyin gücü, ən azından bu nöqtədə heç kimin adekvat şəkildə həll edə bilmədiyi narahatlıqlar yaradır.

Bu ilin əvvəlində nəşr olunan iki araşdırma elmi ictimaiyyəti həm şok, həm də qorxu içində buraxdı. Kaliforniya Universiteti, San Dieqo və Harvard Tibb Məktəbindəki qruplar gen sürücüsünün nəzəri konsepsiyasını reallığa çevirmək üçün CRISPR-dən istifadə etdilər. London İmperator Kollecindən Austin Burt, mayada qeyri -adi bir şəkildə miras qalan, təbii olaraq meydana gələn eqoist genlərə əsaslanan gen sürücülük konsepsiyasını 2013 -cü ildə irəli sürdü. Hər bir allelin övladlara ötürülmə şansının dörddə bir olduğu Mendel genetikası qaydalarına riayət etmək əvəzinə, eqoist genlər nəsillərə çox daha yüksək sürətlə ötürülür və beləliklə, çox qısa müddətdə bir populyasiyanı ələ keçirə bilər. vaxt.

CRISPR istifadə edərək, UC San Diego'dan Gantz və Bier, bir mutasiya təqdim etdilər Drosophila özünü nəslin 97%-nə ötürdü (Gantz and Bier 2015). Bizə başqa texnikaların çox az bir vaxtında yeni xəstəlik modelləri yaratmaq üçün bir vasitə təqdim etmənin yanında, başqa bir şəkildə seçiləcək zərərli mutasiyaların tətbiqini çox asanlaşdırır. George Church-in Harvarddakı laboratoriyası bu ilin əvvəlində CRISPR-ə əsaslanan gen mayasından maya miras almaq üçün oxşar əsərlər nəşr etdi (DiCarlo və digərləri 2015).

Belə bir sistemin faydaları göz qabağındadır-resesif genlərin yaratdığı xəstəliklər üçün model sistemlərinin yaradılması xeyli sadələşdiriləcək və məsələn, malyariyaya səbəb olan ağcaqanadları bir mövsümdə yox etmək üçün gen sürücüsündən istifadə edilə bilər (Bohannon 2015).

Ancaq təhlükələr bilinməyən yerdədir. Bir neçə ay ərzində bütün bir əhalini silməyin etik cəhətdən caiz olub -olmadığını müzakirə etməklə yanaşı, bir çoxları belə bir təşəbbüsə imkan verəcək qədər ekosistemləri yaxşı başa düşmədiyimizə inanırlar. And although Church’s group included genetic precautions meant to prevent the spread of his CRISPR gene drive, and both groups carried out their research in environments built to contain their genetically modified organisms, many in the scientific community point out the need for regulations around what constitutes safe gene drive research and some question whether gene drive experiments should continue.

The National Academy of Sciences has responded to these growing concerns by convening a committee to develop recommendations for responsible conduct of gene drive research. This committee met for the first time on July 30, 2015 and will work to identify techniques for reducing the risks associated with gene drive experiments.

Editing human embryos

This May a study was published that many scientists had dreaded — CRISPR had been used to edit human embryos (Liang et al 2015).

Unlike somatic mutations, mutations made in the germ line will be present in all cells of our body and passed on to our progeny, permanently integrating them into our collective human genome. One can argue that in gene therapy applications we are merely regenerating a wild-type sequence, not generating new genetic material. But part of the concern around CRISPR is that its ease of use and affordability, and differences in human germ line editing regulations in different countries, make it extremely challenging to ensure that correcting deleterious mutations will be CRISPR’s only use.

Another concern, much like that surrounding gene drive, is whether we truly understand biology well enough to intervene in such a drastic way. In a given individual the mutation we are seeking to correct could be a compensatory mutation, a mutation that prevents another, more severe disease. Similarly, being a carrier for one debilitating disease serves in some cases to protect us from another, as with sickle cell anemia and malaria. Correcting such mutations in the germ line could have devastating and irrevocable consequences, some scientists point out.

And then there is the concern about whether we should have a direct hand in our own evolution — should we speed evolution and bend it to what we believe will lead to a better human being? For some, however, the worry is not about speeding evolution. On the contrary, they fear that rather than accelerating or directing evolution, we could be reducing diversity and thus creating genetic bottlenecks.

Pausing to define a prudent path for CRISPR research

These and many similar concerns have led scientists who are using CRISPR and other genome-editing techniques to call not only for dialogue but also for action. From a flood of commentaries and letters in journals such as ElmTəbiət to a suggested voluntary moratorium on human germ line editing proposed by Sangamo’s CEO, the scientific community is calling for action.

This dialogue has grown beyond the scientific community, as the potential impacts of CRISPR are being outlined by media outlets such as The New York Times, Business Insider, və WIRED Magazine.

This past January experts in genome editing, bioethics, and law, as well as many of the researchers who pioneered CRISPR technology, attended the Innovative Genomics Initiative Forum on Bioethics in Napa, CA to discuss the future of CRISPR research. Their recommendations, published in the journal Elm, (1) strongly discourage human germ line modifications until we better understand the implications of such experiments, (2) call for the creation of a forum to discuss and advise on these implications, (3) encourage transparency in CRISPR research to determine the efficacy and specificity of CRISPR-based genome editing, and (4) ask for the formation of a global body that brings together scientists, bioethicists, lawyers, representatives of the public, and relevant government agencies to recommend policies when appropriate (Baltimore et al 2015).

The National Institutes of Health’s response is to not fund any research that involves editing of human embryos.

The future of CRISPR

We are clearly at only the beginning of the conversation about the future of CRISPR research, the conversation about its incredible potential and about whether and how regulations limiting CRISPR use could be enforced. We cannot unknow what is known, we cannot unpublish papers, or collectively agree to unremember CRISPR technology. And although most agree that a healthy dose of fear is appropriate, CRISPR’s potential to answer questions about biology at a pace none of us could have imagined and its ability to improve our lives lead many to point out that CRISPR should elicit more hope and excitement than dread and that we should not close the door on such a powerful technology.

Bioradiations would like to thank Yan Wang and Rongdian Fu for technical comments and resources.

İstinadlar

Baltimore D et al. (2015). A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification. Science 348, 36–38.

Barrangou R et al. (2007). CRISPR prokaryotlarda viruslara qarşı qazanılmış müqaviməti təmin edir. Science 315, 1,709–1,712.

Bohannon J (2015). Biologists devise invasion plan for mutations. Science 347, 1,300.

Bolcun-Filas E et al. (2014). Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway. Science 343, 533–536.

Bolotin A et al. (2005). Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology 151, 2,551–2,561.

Chen B et al. (2013). Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell 155, 1,479–1,491.

Cong L et al. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823.

Gilbert LA et al. (2013) CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell 154, 442–451.

Harrison MM et al. (2014). A CRISPR view of development. Genes Dev 28, 1,859–1,872.

Ishino Y et al. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol 169, 5,429–5,433.

Jansen R et al. (2002). Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol 43, 1,565–1,575.

Jinek M et al. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816–821.

Kleinstiver BP et al. (2015). Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature 523, 481–5.

Lauerman J and Chen C. (2015) The promise and peril of CRISPR. Bloomberg Businessweek. http://www.bloomberg.com/news/articles/2015-06-25/the-promise-and-peril-of-crispr, accessed 7/30/15.

Lillestøl RK et al. (2006). A putative viral defence mechanism in archaeal cells. Archaea 2, 59–72.

Liang P et al. (2015). CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell 6, 363372.

Makarova KS et al. (2006). A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol Direct 1, 7.

Mojica FJ et al. (2005). Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol 60, 174–182.

Pourcel C et al. (2005). CRISPR elements in Yersinia pestis bakteriofaq DNT -ni imtiyazlı şəkildə alaraq yeni təkrarları əldə edin və təkamül tədqiqatları üçün əlavə vasitələr təqdim edin. Microbiology 151, 653–663.

Sampson TR and Weiss DS (2014). Exploiting CRISPR/Cas systems for biotechnology. Bioessays 36, 34–38.

Wang Y et al. (2014). Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat Biotechnol 32, 947–951.

Weshra ER et al. (2014). CRISPR-Cas systems: beyond adaptive immunity. Nature Reviews Microbiology 12, 317-26.

Wu Y et al. (2013). Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell 13, 659–662.

Xie F et al. (2014). Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac. Genome Res 24, 1,526–1,533.


A guide to CRISPR gene activation

(BOSTON) &mdash The CRISPR-Cas9 system has come to be known as the quintessential tool that allows researchers to edit the DNA sequences of many organisms and cell types. However, scientists are also increasingly recognizing that it can be used to activate the expression of genes. To that end, they have built a number of synthetic gene activating Cas9 proteins to study gene functions or to compensate for insufficient gene expression in potential therapeutic approaches.

A Wyss Institute research team has rigorously compared various gene-activating Cas9 proteins across cell types from human tissues and animal species. Their study can serve as a guide in research and development of new therapies. Shown in the picture is one of the two co-first authors, Wyss Research Fellow Marcelle Tuttle, performing Cas9 experiments in the laboratory. Credit: Wyss Institute at Harvard University.

"The possibility to selectively activate genes using various engineered variants of the CRISPR-Cas9 system left many researchers questioning which of the available synthetic activating Cas9 proteins to use for their purposes. The main challenge was that all had been uniquely designed and tested in different settings there was no side-by-side comparison of their relative potentials," said George Church, Ph.D., who is Core Faculty Member at the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University, leader of its Synthetic Biology Platform, and Professor of Genetics at Harvard Medical School. "We wanted to provide that side-by-side comparison to the biomedical research community."

In a study published on 23 May in Təbiət üsulları, the Wyss Institute team reports how it rigorously compared and ranked the most commonly used artificial Cas9 activators in different cell types from organisms including humans, mice and flies. The findings provide a valuable guide to researchers, allowing them to streamline their endeavors.

The team also included Wyss Core Faculty Member James Collins, Ph.D., who also is the Termeer Professor of Medical Engineering & Science and Professor of Biological Engineering at the Massachusetts Institute of Technology (MIT)&rsquos Department of Biological Engineering and Norbert Perrimon, Ph.D., a Professor of Genetics at Harvard Medical School.

Gene activating Cas9 proteins are fused to variable domains borrowed from proteins with well-known gene activation potentials and engineered so that the DNA editing ability is destroyed. In some cases, the second component of the CRISPR-Cas9 system, the guide RNA that targets the complex to specific DNA sequences, also has been engineered to bind gene-activating factors.

"We first surveyed seven advanced Cas9 activators, comparing them to each other and the original Cas9 activator that served to provide proof-of-concept for the gene activation potential of CRISPR-Cas9. Three of them, provided much higher gene activation than the other candidates while maintaining high specificities toward their target genes," said Marcelle Tuttle, Research Fellow at the Wyss and a co-lead author of the study.

The team went on to show that the three top candidates were comparable in driving the highest level of gene expression in cells from humans, mice and fruit flies, irrespective of their tissue and developmental origins. The researchers also pinpointed ways to further maximize gene activation employing the three leading candidates.


March 2007 — Philippe Horvath from Danisco France SAS, experimentally demonstrated the working of CRISPR as adaptive immunity.

August 2008 — John van der Oost from University of Wageningen, Netherlands showed that spacer sequences acquired from viruses are transcribed into RNAs upon invasion.

Video: Was CRISPR Discovered or Invented?


Mücərrəd

Congenital malformations are the major cause of infant mortality in the US and Europe. Due to rapid advances in human genomics, we can now efficiently identify sequence variants that may cause disease in these patients. However, establishing disease causality remains a challenge. Additionally, in the case of congenital heart disease, many of the identified candidate genes are either novel to embryonic development or have no known function. Therefore, there is a pressing need to develop inexpensive and efficient technologies to screen these candidate genes for disease phenocopy in model systems and to perform functional studies to uncover their role in development. For this purpose, we sought to test F0 CRISPR based gene editing as a loss of function strategy for disease phenocopy in the frog model organism, Xenopus tropicalis. We demonstrate that the CRISPR/Cas9 system can efficiently modify both alleles in the F0 generation within a few hours post fertilization, recapitulating even early disease phenotypes that are highly similar to knockdowns from morpholino oligos (MOs) in nearly all cases tested. We find that injecting Cas9 protein is dramatically more efficacious and less toxic than cas9 mRNA. We conclude that CRISPR based F0 gene modification in X. tropicalis is efficient and cost effective and readily recapitulates disease and MO phenotypes.


Conclusions and perspectives

The advent of CRISPR technology has revolutionized the biological sciences and provided cancer biologists with a powerful gene-editing method that can alter the genetic make-up of cells in unprecedented ways. Indeed, promising results have been achieved in diverse disciplines, from basic research to the development of potential therapies against cancer, congenital defects, and other chronic diseases. Many challenges associated with CRISPR technology still exist, mainly in clinical use associated with delivery and safety. 69 Improved strategies will be required to increase the targeting efficiency and to minimize off-target effects. Ensuring that CRISPR/Cas9 has precise genome-editing ability is also important. Following CRISPR/Cas9 mediated DSBs, DNA repair can be achieved by either the “error-prone NHEJ” or “precise repair through HDR” in the genome. In an effort to promote HDR over NHEJ, a study by Maruyama et al. used the NHEJ inhibitor Scr7 and observed that Scr7 treatment did indeed increase the levels of HDR-mediated genome editing over NHEJ. 70 In addition to concerns regarding off-target effects, considerations regarding the immune response to CRISPR-mediated gene-editing must also be considered. The Cas9 protein is bacterial in origin and thus might elicit an immune response, which could in turn affect its gene-editing efficiency. Also, the exogenous sgRNAs may be cleared by immune cells like monocytes and macrophages. 71 The delivery approach for CRISPR/Cas9 thus depends upon the objective as well as the target. Transient expression of the sgRNA and the Cas9 protein through microinjection might be safer than other non-viral or viral delivery methods. Viral delivery has the highest efficiency for the expression of the Cas9 protein and sgRNA, but comes with risks. During one in vivo study, the lentivirus particles elicited a strong immune response in treated animals, which affected the efficacy of the lentiviral vector. 72 Another issue with lentiviral delivery is also the possibility that the lentiviral vector could randomly integrate into the cellular genome. To overcome this issue, integrase-deficient lentiviral vectors, nanoparticle carriers, or an inducible system could be used for delivery of CRISPR/Cas9.

The prohibitively high costs for CAR T-cell therapy have made this treatment unavailable to a large section of society. CAR T-cell therapy offered by Novartis, the first approved by the FDA, costs $475,000 per treatment however, further advances in CRISPR technology might help reduce costs and make CAR T-cell therapy available to more patients. So far, the majority of CRISPR clinical trials are being conducted in China. A recent article in the Wall Street Journal suggested that this may be due to the fact that fewer rules and restrictions exist in China. Indeed, Dr. Shixiu Wu from the Hangzhou Cancer Hospital, who was featured in the article, 73 has been able to use CRISPR technology-based treatments on his cancer patients, without the need for national regulatory approval and has few reporting requirements. Many scientists worry that the technology has the potential to harm patients and that unintended consequences from using CRISPR on patients without sufficient oversight could hinder progress in the whole field. Dr. Wu recognized that he was undertaking risks in using CRISPR-based treatments for his cancer patients, but was considering their limited available survival time. The thought is that being able to live for additional time is better than imminent death. Persistent post-treatment monitoring of patients could help to eliminate or treat any unwanted consequences. Indeed, treatment-related observations could potentially save many lives of those who are on the brink of death.

We need consider the limitation as seriously as the potential benefits of this technology. A new human trial, in which the team took a crash course in bioethics and created CRISPR babies, brought the ethical issues and controversies into the public. One hundred and twenty-two Chinese scientists and many other scientists worldwide have already condemned the trial. How to use this powerful without overstepping the ethical bottom line is a serious question that needs careful consideration. We might expect more positive reports from clinical trials as well as the development of improved approaches that will bring new hope for personalized therapy.


Metodlar

Plant materials, growth conditions and phenotype observation

Inbred lines B73 and M6007 corresponding to the WT lines of maize GMS mutants ms1-albms7-6007, respectively, were obtained from the Maize Genetics Cooperation Stock Center. All materials were planted in the experimental stations of the University of Sciences and Technology Beijing. T0 transgenic plants were grown in glasshouse with a photoperiod of 16 h/8 h (day/night) at 26 °C/22 °C. The images of tassels and anthers were taken with a Canon EOS 700D digital camera and a SZX2-ILLB stereomicroscope, respectively. Pollen grains stained with 1% I2-KI solution were imaged using a BX-53 microscope.

RNA-seq analysis

Twenty fresh anthers similar in length were collected for each sample, three of them were fixed in FAA solution for confirming the developmental stage by transverse section assay, and the rest were frozen immediately in liquid nitrogen and stored at −80°C until processing. Total RNAs of 32 samples from B73 (S5 to S12, 11 stages), 30 samples from Zheng58 (S5 to S12, 11 stages) and 31 samples from M6007 (S5 to S12, 11 stages) were isolated using TRIzol reagent (Invitrogen), respectively. Two to four biological replications were used for anther samples at each developmental stage in each genetic background (Figures S1-S3). RNA-seq libraries were constructed using NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, USA). mRNA was purified from total RNA using poly-T oligo-attached magnetic beads. 150 bp paired-end reads were generated by the Illumina Hiseq 4000 platform. Clean reads were mapped to the B73 reference genome (version 4) using TopHat2.0 with default parameters (Trapnell və b., 2009). Gene expression levels were estimated by Rsubread and edgeR (Liao və b., 2014 Robinson və b., 2010 ). Genes with more than a twofold change at the expression level and false discovery rate (FDR) < 0.05 were identified as DEGs. Maize TF gene family information was obtained from the Plant Transcription Factor Database (PlantTFDB, http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/). Gene co-expression analysis was performed by the K-means method in R (https://www.r-project.org/).

Plasmid construction

For mutagenesis of putative GMS TF genes, CRISPR-P 2.0 (http://crispr.hzau.edu.cn/ CRISPR2/) was used to choose specific sgRNAs that targeted genes. Off-target analysis of sgRNA sequences was carried out on a website (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). The pBUE411 vector (Xing və b., 2014 ) was used to construct CRISPR/Cas9 plasmid, and two 19-bp fragments in the exons of target gene were introduced into the vector. For assembly of two gRNAs, PCR fragments of each gene were amplified based on pCBC-MT1T2 (Xing və b., 2014 ) with gene-specific primer pair (Table S5), and then, purified PCR fragments were digested with BsaI and cloned into the pBUE411 vector. The CRISPR/Cas9 plasmids were confirmed by DNA sequencing and then used for maize transformation.

Maize transformation

Maize hybrid genotype Hi II was used as the transformation receptor. Aqrobakteriya-mediated transformation of the immature embryos of HiII was performed at the Plant Transformation Platform of USTB following previous protocols (Frame və b., 2002 ).

DNA extraction and genotyping

Genomic DNA of the maize seedlings was extracted using cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) method (Murray and Thompson, 1980 ). The examination of transgenic lines was performed by PCR with specific primer pair of Bar gene (Table S5). Specific primers spanning the target sites (Table S5) were designed to determine the mutations in the target gene of T0 və F1 nəsil bitkiləri. The PCR amplicons flanking the target sites were performed with high-fidelity DNA polymerase, and purified PCR products were cloned into the pEASY-T1 vector (TransGen Biotech, China) and followed by Sanger sequencing. For the determination of transgene-free plants in F1 generation, Cas9 gene and Bar gene fragments at the T-DNA region were amplified by PCR with the genomic DNA as the template. For genotyping of F2 generation plants, we designed molecular markers according to mutations of GMS genes (Table S4 and Figure S8), and the PCR products were analysed by agarose gel electrophoresis or polyacrylamide gel electrophoresis.

SEM observation

Anthers were collected directly into FAA solution (Coolaber, China) and stored at 4 °C until SEM analyses utilizing protocols described previously (An və b., 2019 , 2020 ). The fixed materials were dehydrated with 50, 70, 80, 90 and 100% ethanol series. The dehydrated samples were critical-point dried and coated with gold: palladium (3: 2) using an ion sputter coater (JFC-1100 JEOL). SEM images of anther and pollen were photographed under a HITACHI S-3400N scanning electron microscope.

Expression analysis by RT-qPCR

Total RNA was isolated from B73 anthers (S5 to S12) using TRIzol reagent (Invitrogen). The concentration and purity of the isolated RNA was measured by NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer. After removing genomic DNA with DNase I (Promega, USA), cDNA was synthesized using 5X All-In-One RT MasterMix (abm, Canada) as per the manufacturer’s instructions. RT-qPCR was performed on a QuantStudio 5 Real-Time PCR system (ABI, USA) using TB Green™ Premix EX Tag™ (TakaRa, Japan). The primers were listed in Table S5. For RT-qPCR, three technical replicates and three biological replicates were done on each sample, and the amplification data were analysed by the 2 −ΔΔCt method, and quantitative results were given as means ± SD.

Transient dual-luciferase assay

For transactivation assays of ZmbHLH51ZmbHLH122 promoters, we amplified the promoter regions of ZmbHLH51 (1653 bp before ATG) and ZmbHLH122 (2016 bp before ATG) and cloned to Kpn I/Bam HI-digested pEASY-LUC vector by homologous recombination to create pZmbHLH51:LUCpZmbHLH122:LUC plasmids used as reporters. For construction of the effector plasmids, the GAL4 DBD fragment was cut out from the pRTBD vector using Sac I and Xba I. The coding region of ZmbHLH51ZmbHLH122 was cloned into the Sac I/Xba I-digested pRTBD vector to generate 35S-Ω: bHLH5135S-Ω: bHLH122 constructs. The plasmids were cotransformed into maize leaf protoplasts isolated from 5-d-old etiolated seedlings. The relative LUC activity (LUC/REN) was detected using a Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, E1960) following the manufacturer’s instructions, and the data presented are the averages of 3 independent replicates. Primers used in transient dual-luciferase assay are provided in Table S5.

BiFC assay

For protein–protein interaction studies, BiFC assay was performed as previously described (Walter və b., 2004). Full-length cDNA of ZmbHLH51 was fused with the N-terminal of YFP (nYFP: 1-155 aa) and cloned into the vector pUC19-35S-FLAG-RBS (Li və b., 2005 ) in front of FLAG coding sequence by homologous recombination to generate 35S-ZmbHLH51-nYFP-Flag plasmid. Full-length cDNA of ZmbHLH122 was fused with the C-terminal half of YFP (cYFP: 156–239 aa) and 3 × Myc coding sequence. The resulted ZmbHLH122-cYFP-Myc fragment was cloned into the vector pUC19-35S-FLAG-RBS by replacing FLAG coding sequence to generate 35S-ZmbHLH122-cYFP-Myc plasmid. The BiFC constructs were cotransformed into maize protoplasts. The protoplasts were incubated at 28 °C for 12–16 hr in the dark. YFP fluorescence was detected using a confocal laser-scanning microscope (Leica TCS SP8) with 514 nm/525–565 nm excitation/emission wavelengths. The primers used are listed in Table S5.

Co-IP assay

For Co-IP assays using protoplast transient expression system, we created a 35S-nYFP-Flag vector by homologous recombination on the basis of 35S-ZmbHLH51-nYFP-Flag vector. The vectors 35S-nYFP-Flag, 35S-ZmbHLH51- nYFP-Flag35S-ZmbHLH122-cYFP-Myc in various recombination were cotransformed into maize leaf protoplasts. The protoplasts were incubated at 28 °C for 16 hr in the dark. The extraction of total protein was performed as described previously (Ma və b., 2018). The total protein immunoprecipitated with anti-c-Myc affinity gel (E6654, Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. The eluted immunoprecipitates were immunoblotted with anti-c-Myc (9E10, sc-40, Santa Cruz, 1:1000) and anti-FLAG (FLA-1, M185-3, MBL, 1:10 000) antibodies. Secondary goat anti-mouse-IgG-HRP antibody was used at 1:10 000 dilutions in PBS. The signals were detected using a SuperSignal West Pico kit (34080, Thermo Scientific).


What is CRISPR?

CRISPR is a technology that can be used to edit genes and, as such, will likely change the world.

The essence of CRISPR is simple: it’s a way of finding a specific bit of DNA inside a cell. After that, the next step in CRISPR gene editing is usually to alter that piece of DNA. However, CRISPR has also been adapted to do other things too, such as turning genes on or off without altering their sequence.

There were ways to edit the genomes of some plants and animals before the CRISPR method was unveiled in 2012 but it took years and cost hundreds of thousands of dollars. CRISPR has made it cheap and easy.

CRISPR is already widely used for scientific research, and in the not too distant future many of the plants and animals in our farms, gardens or homes may have been altered with CRISPR. In fact, some people already are eating CRISPRed food.

Reklam

CRISPR technology also has the potential to transform medicine, enabling us to not only treat but also prevent many diseases. We may even decide to use it to change the genomes of our children. An attempt to do this in China has been condemned as premature and unethical, but some think it could benefit children in the future.

CRISPR is being used for all kinds of other purposes too, from fingerprinting cells and logging what happens inside them to directing evolution and creating gene drives.

The key to CRISPR is the many flavours of “Cas” proteins found in bacteria, where they help defend against viruses . The Cas9 protein is the most widely used by scientists. This protein can easily be programmed to find and bind to almost any desired target sequence, simply by giving it a piece of RNA to guide it in its search.

When the CRISPR Cas9 protein is added to a cell along with a piece of guide RNA, the Cas9 protein hooks up with the guide RNA and then moves along the strands of DNA until it finds and binds to a 20-DNA-letter long sequence that matches part of the guide RNA sequence. That’s impressive, given that the DNA packed into each of our cells has six billion letters and is two metres long.

Bundan sonra baş verənlər fərqli ola bilər. The standard Cas9 protein cuts the DNA at the target. When the cut is repaired, mutations are introduced that usually disable a gene. This is by far the most common use of CRISPR. It’s called genome editing – or gene editing – but usually the results are not as precise as that term implies.

CRISPR can also be used to make precise changes such as replacing faulty genes – true genome editing – but this is far more difficult.

Customised Cas proteins have been created that do not cut DNA or alter it in any way, but merely turn genes on or off : CRISPRa and CRISPRi respectively. Yet others, called base editors, change one letter of the DNA code to another .

So why do we call it CRISPR? Cas proteins are used by bacteria to destroy viral DNA. They add bits of viral DNA to their own genome to guide the Cas proteins, and the odd patterns of these bits of DNA are what gave CRISPR its name: clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Michael Le Page


Nature-inspired CRISPR enzymes for expansive genome editing

In nature, bacteria use CRISPR as an adaptive immune system to protect themselves against viruses. Over the past decade, scientists have been able to successfully build upon that natural phenomenon with the discovery of CRISPR proteins found in bacteria — the most widely used of which is the Cas9 enzyme. In combination with a guide RNA, Cas9 is able to target, cut, and degrade specific DNA sequences.

With applications ranging from the treatment of genetic diseases to the nutritional potency of agricultural crops, CRISPR has emerged as one of the most promising tools for genome editing. Cas9 enzymes, however, rely on specific DNA ZIP codes to pinpoint where to cut and edit. The most widely-used Cas9 from Streptococcus pyogenes bacteria, SpCas9, requires two “G” nucleotides beside target sites. Less than 10 percent of DNA sequences meet this requirement.

In research published this month in both Təbiət BiotexnologiyasıTəbiət Əlaqələri, a team of computational biologists in the Media Lab’s Molecular Machines group and the MIT Center for Bits and Atoms have successfully engineered new proteins with enhanced genome editing capabilities, significantly broadening the spectrum of DNA sequences that can be accurately and effectively accessed.

This work was led by Pranam Chatterjee, who recently completed his PhD in media arts and sciences Noah Jakimo PhD '19, a Media Lab affiliate and Media Lab Associate Professor Joseph Jacobson, in collaboration with lab members and researchers at the University of Massachusetts Medical School.

These new findings stem from the group's earlier breakthrough work in the computational discovery of Cas9 proteins. The team identified and experimentally characterized the Cas9 from Streptococcus canis bacteria (ScCas9), which, while similar to SpCas9, had the ability to target a much broader range of target DNA sequences. That discovery expanded the number of locations that Cas9 enzymes could target from the original 10 percent of sites on the genome to nearly 50 percent. The team first reported those findings in 2018 in Elmdə irəliləyişlər.

To improve ScCas9 as a genome editing tool, the scientists computationally identified unique parts from similar Cas9 proteins to engineer an optimized version of ScCas9, which the team has named Sc++.

“Sc++ is the first known enzyme to simultaneously exhibit the three properties deemed essential for effective genome editing: broad targeting capability robust cutting activity and minimal errors due to off-targeting,” notes Chatterjee.

Concurrently, the team successfully used their previous SPAMALOT algorithm to discover Streptococcus macacae Cas9 (SmacCas9) that required two “A” nucleotides, rather than two “G”s. Through domain swapping and further engineering, the team presents the new iSpyMac enzyme as one of the first known Cas9 editors not requiring a “G,” enabling targeting of an additional 20 percent of the genome that was previously inaccessible.

"To engineer iSpyMac, we simultaneously made hundreds of changes to SpCas9, knowing even a single change can break it," says Jakimo, the senior author on this second study. "Our success is a testament to the wealth of microbial genomic data that can provide helpful clues about protein function with tools like SPAMALOT."

Erik Sontheimer, professor and vice chair of the RNA Therapeutics Institute at the University of Massachusetts Medical School, and a collaborator on the research, notes the significance of this work. “The fewer targeting limitations we encounter, and the fewer compromises and trade-offs that have to be made between activity and accuracy, the greater the impact that CRISPR genome editing can have on biotechnology and human health. This is why Sc++ and iSpyMac provide such valuable new additions to the CRISPR editing arsenal.”

As labs around the world have already begun to use the enzymes to successfully edit the genomes of various organisms, from rice to rabbits, the next goal for this research will be to develop tools to reach the remaining 30 percent of genome sequences. Chatterjee, in collaboration with the University of Zurich, is looking to unlock the final advances that will allow scientists to access any genomic sequence, and to address any type of gene mutation in the treatment of genetic diseases.

For now, however, as in many labs across the MIT campus, work has pivoted to address the Covid-19 pandemic. By applying computational design principles to engineer proteins that can target and bind to the invading SARS-CoV-2 virus, Chatterjee and the research team at the Media Lab are seeking to create enzymes to rapidly halt the virus, and enable cell recovery.

“We engineer proteins differently," Chatterjee adds. "Our ability to integrate computation and experimentation enables us to refine our algorithms and build impactful tools for a host of applications, from addressing genetic diseases to Covid-19, and beyond.”


Videoya baxın: CRISPR-Cas9 format selection guide (Sentyabr 2022).


Şərhlər:

  1. Kazrarr

    The admirable idea

  2. Duktilar

    Yaxşı nəticə çıxacaq

  3. Dishakar

    Mən buna əminəm.

  4. Adem

    In principle, I do not know much about this post, but I will try to understand all the same.

  5. Baldhere

    Nə lazımlı sözlər... Əla, parlaq fikirdir

  6. Gyuszi

    Bu qalmaqaldır!



Mesaj yazmaq