Məlumat

23.3: Metabolik Flux Analizi - Biologiya

23.3: Metabolik Flux Analizi - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Metabolik axın təhlili (MFA) müəyyən bir metabolik şəbəkədə sabit vəziyyətdə mümkün olan reaksiya axınının paylanmasının hesablanması üsuludur. Bir daha bu analiz sistemin xüsusi biologiyasından asılı deyil; daha doğrusu, yalnız sözü gedən reaksiyaların (universal) stokiometriyasından asılı olacaq.

Riyazi Təqdimat

M metabolitləri və n reaksiyaları olan bir sistemi nəzərdən keçirin. Substratın konsentrasiyası xi olsun, belə ki substrat konsentrasiyasının dəyişmə sürəti xi -nin zaman törəməsi ilə verilir. X xi elementləri olan sütun vektoru (m komponentləri ilə) olsun. Sadəlik üçün m = 4 A, B, C və D metabolitləri olan bir sistemi nəzərdən keçiririk. Bu sistem bu metabolitlər arasında bir çox reaksiyadan ibarət olacaq və nəticədə bu birləşmələr arasında mürəkkəb bir tarazlıq yaranacaq.

Bir daha A + 2B (sağ ox) 3C sadə reaksiyasını nəzərdən keçirək. Bu reaksiyanı vektor şəklində (-1 -2 3 0) şəklində təqdim edə bilərik. Qeyd edək ki, ilk iki metabolitin (A və B) mənfi əlamətləri var, çünki onlar reaksiyada istehlak olunur. Bundan əlavə, vektorun elementləri Bölmə 2.1 -də olduğu kimi reaksiyanın stokiometriyası ilə müəyyən edilir. Bu proseduru sistemdəki hər bir reaksiya üçün təkrar edirik. Bu vektorlar S stokiyometrik matrisinin sütunlarına çevrilir. Sistemdə m metabolit və n reaksiya varsa, S m n matris olacaq. Odur ki, v-ni hər reaksiyada axınların n-komponentli sütun vektoru olaraq təyin etsək, S vektoruv hər metabolitin konsentrasiyasının dəyişmə sürətini təsvir edir. Riyazi olaraq, bu, metabolik axın analizinin əsas tənliyi olaraq təqdim edilə bilər:

[frac{d x}{d t}=S v rəqəm]

S matrisi, bioloji sistemlərdə mümkün olan müxtəlif ssenariləri əks etdirə bilən qeyri -adi dərəcədə güclü bir məlumat quruluşudur. Məsələn, S -nin iki c və d sütunu c = d xüsusiyyətinə malikdirsə, sütunlar geri çevrilə bilən bir reaksiyanı təmsil edir. Üstəlik, əgər sütun yalnız bir komponentin sıfırdan fərqli olması xüsusiyyətinə malikdirsə, o, sıfırdan fərqli komponentin işarəsindən asılı olaraq, güman ki, sonsuz bir yuvaya (və ya mənbədən) axın olduğu mübadilə reaksiyasını təmsil edir.

İndi yuxarıdakı tənliyin sol ölçüsünün eyni olaraq sıfır olduğunu söyləyən sabit vəziyyət fərziyyəsini tətbiq edirik. Buna görə də S kriteriyasına cavab verən v vektorlarını tapmalıyıqv = 0. Bu tənliyin həlləri bu sistem üçün mümkün olan axınları təyin edəcək.

S -in boş boşluğu

Model sistemindəki reaksiyaların mümkün axını fəzası yuxarıda göründüyü kimi S-in sıfır fəzası ilə müəyyən edilir. Elementar xətti cəbrdən bir matrisin sıfır boşluğunun vektor boşluğu olduğunu xatırlayın; yəni boşluqda iki y və z vektorları verildikdə, ay + bz vektoru (həqiqi ədədlər üçün a, b) də boşluqdadır. Null boşluq bir vektor boşluğu olduğundan, xətti olaraq müstəqil olan və sıfır boşluğunu əhatə edən bir əsas bi var. S, sıfır boşluğunda hər hansı bir axın v üçün həqiqi ədədlərin mövcud olduğu xüsusiyyətinə malikdir ( alpha )i belə

[v = Sigma_ {i} alfa_ {i} b_ {i} qeyri -nömrəli ]

Bir matrisin sıfır boşluğu üçün bir əsas necə tapa bilərik? Faydalı bir vasitə, tək dəyər ayrılığıdır (SVD) [4]. S matrisinin tək dəyər ayrılığı S = UEV*ifadəsi olaraq təyin olunur, burada U m ölçülü vahid matrisdir, V n ölçülü vahid matrisdir və E mxn diaqonal matrisdir (mütləq müsbət ) azalan qaydada S-in tək qiymətləri. (Xatırladaq ki, vahid matris, ortonormal sütun və satırları olan bir matrisdir, yəni U * U = U U * = I şəxsiyyət matrisi). İstənilən matrisin SVD -si olduğunu göstərmək olar. Diqqət yetirin ki, SVD uS və V matrislərinin sütunları olan və tək bir dəyər olan (S v = sigma u ) tənliyinə yenidən düzülə bilər. Buna görə də, ( sigma ) = 0, v S -nin boş boşluğuna aiddirsə. Həqiqətən, sıfır tək dəyərlərə uyğun olan V sütunları, S -in boş boşluğu üçün ortonormal əsas təşkil edir. SVD, sistem üçün mümkün axınları tamamilə xarakterizə etməyə imkan verir.

Flux Məkanının Məhdudlaşdırılması

Yuxarıda qeyd olunan birinci məhdudiyyət ondan ibarətdir ki, bütün sabit vəziyyət axını vektorları sıfır fəzasında olmalıdır. Mənfi axınlar da termodinamik olaraq mümkün deyil. Buna görə əsas məhdudiyyət bütün axınların müsbət olmasıdır. (Bu çərçivədə biz geri çevrilən reaksiyaları iki bir istiqamətli axını olan stokiometrik S matrisində ayrı reaksiyalar kimi təqdim edirik.)

Bu iki əsas məhdudiyyət konveks analizi ilə həll edilə bilən bir sistem təşkil edir. Çözüm bölgəsi, Extreme Pathways unikal bir dəsti ilə təsvir edilə bilər. Bu bölgədə sabit vəziyyət axını vektorları v bu həddindən artıq yolların pozitiv xətti birləşməsi kimi təsvir edilə bilər. 25-ci slaydda bi vektorları kimi göstərilən Ekstremal Yollar qabarıq axın konusunu əhatə edir. Hər ölçü müəyyən reaksiya üçün bir dərəcədir. 25-ci slaydda z-ölçüsü v3 üçün reaksiya sürətini təmsil edir. Zamanın istənilən nöqtəsində orqanizmin axın konusunun bir nöqtəsində yaşadığını, yəni müəyyən bir axının paylanmasını nümayiş etdirdiyini tanıya bilərik. Akı konusundakı hər bir nöqtə mümkün bir sabit vəziyyət axını vektoru ilə təsvir edilə bilər, konus xaricindəki nöqtələr isə bunu edə bilməz.

Bir problem, axı konisinin sonsuzluğa doğru getməsidir, sonsuz axınlar fiziki olaraq mümkün deyil. Buna görə də əlavə məhdudiyyət, hər hansı bir reaksiyamızın maksimum axınlarını təyin etməklə axın konusunu bağlamaqdır (bu dəyərlər Vmax parametrlərimizə uyğundur). Bir çox metabolik reaksiya hüceyrə daxilində olduğu üçün hər bir axına bir qapaq qoymağa ehtiyac yoxdur. Bu məhdudiyyətlər maksimum axını ölçməklə və ya yayılma qaydaları kimi riyazi vasitələrdən istifadə etməklə eksperimental olaraq təyin edilə bilər.

Hüceyrələrimizə daxil olan və çıxan nəqliyyatı təmsil edən giriş və çıxış axınlarını da əlavə edə bilərik (Vin və Vout). Bunları ölçmək çox vaxt daxili axınlardan daha asandır və beləliklə daha bioloji cəhətdən daha uyğun bir axın məkanı yaratmağımıza kömək edə bilər. Bu problemi həll etmək üçün bir alqoritm nümunəsi simpleks alqoritmdir [1]. 24-27-ci slaydlar axınlara olan məhdudiyyətlərin axın konusunun həndəsəsini necə dəyişdiyini nümayiş etdirir. Əslində, biz daha yüksək ölçülü fəzalarda problemlərlə məşğul oluruq.

Xətti Proqramlaşdırma

Xətti proqramlaşdırma, xətti məhdudiyyətlər nəzərə alınmaqla optimallaşdırma problemlərini həll edə bilən ümumi bir həlldir. Bunlar bir neçə fərqli formada təmsil oluna bilər.

Kanonik forma:

• Maksimumlaşdır: (c^{T} x )
• Şərtlərə tabedir: (A x leq b )

Standart forma:

• Maksimum ( Sigma c_ {i} * x_ {i} )
• (a_ {i j} X_ {i} leq b_ {i} text {foralli,} j )
• Mənfi olmayan məhdudiyyət: (X_{i} geq 0)

Xətti Proqramlaşdırmaya qısa və aydın bir giriş burada mövcuddur: www.purplemath. com/modules/linprog.htm 3-cü bölmədə təsvir olunan məhdudiyyətlər bizə mühazirədə təsvir olunan xətti proqramlaşdırma problemini verir. Xətti proqramlaşdırma ilk yaxınlaşma hesab edilə bilər və optimallaşdırmada klassik problemdir. Mümkün axınımızı sınamaq və daraltmaq üçün sistemdəki istənilən sayda axının xətti kombinasiyası olan uyğunluq funksiyasının mövcud olduğunu güman edirik. Xətti proqramlaşdırma (və ya xətti optimallaşdırma) xətti və neqativ olmayan məhdudiyyətlərlə müəyyən edilmiş bir konveks çoxbucaqlı üzərində xətti funksiyanı maksimuma və ya kiçiltməyi əhatə edir.

Bu problemi, obyektiv funksiyanı maksimuma çatdıran axın paylanmasını müəyyən edərək həll edirik:

Xətti proqramlaşdırmada əsas məqam həllərimizin icazə verilən axın boşluğunun sərhədlərində olması və nöqtələrdə, kənarlarda və ya hər ikisində ola bilməsidir. Ancaq tərifinə görə, optimal həll (əgər varsa), icazə verilən axın boşluğunun bir nöqtəsində yatacaq. Bu anlayış 30 -cu slaydda göstərilmişdir. Bu slaydda A stokiyometrik matris, x axının vektoru və b maksimum icazə verilən axınların vektorudur.

Əl ilə həll edildikdə xətti proqramlar ümumiyyətlə Simplex üsulu ilə aparılır. Simplex metodu problemi matrisada qurur və problem ifadəsinin əsas dəyişənlərinə əsaslanaraq bir sıra döngələr həyata keçirir. Ancaq ən pis halda, bu, eksponensial vaxtda işləyə bilər. Xoşbəxtlikdən, bir kompüter varsa, digər iki alqoritm mövcuddur. Ellipsoid alqoritmi və Interior Point metodları hər iki xətti proqramı polinom vaxtında həll etməyə qadirdir. Maraqlıdır ki, zahirən çətin görünən bir çox problem xətti proqramlar kimi modelləşdirilə və səmərəli şəkildə həll edilə bilər (və ya ümumi bir həll konkret problemi həll edə bilər).

E. coli kimi mikroblarda, bu obyektiv funksiya, slayd 31 -də göründüyü kimi, biokütləyə töhfə verən axınların birləşməsidir. Ancaq bu funksiyanın tamamilə bioloji mənalı olması lazım deyil.

Məsələn, biz M. tuberculosis-də mikolatların maksimallaşdırılmasını simulyasiya edə bilərik, baxmayaraq ki, bu, bioloji olaraq baş vermir. Bu, həmin metabolitlərin istehsalını maksimuma çatdırmadıqda belə, mikolat sintezini pozacaq in vitro hansı pozğunluqların həyata keçirilə biləcəyi barədə mənalı proqnozlar verəcəkdir. Flux balans analizi (FBA) UCSD-də Palssons qrupu tərəfindən qabaqcıl olmuşdur və o vaxtdan bəri E. coli, M. tuberculosis və insan qırmızı qan hüceyrəsinə [? ].


İnteqrasiya olunmuş eksperimental-hesablama üsulları ilə xərçəngdə metabolik axının uyğunlaşmasının öyrənilməsi

Maddələr mübadiləsinin şişin yenidən qurulması tədqiqatı xərçəng metabolik tədqiqatlarının əsasını təşkil edir. Burada biz iki geniş istifadə olunan hesablama axınının nəticə çıxarma yanaşmasını nəzərdən keçiririk: izotop izləmə ilə birlikdə Metabolik Flux Analizi (13C-MFA) və Məhdudiyyətə əsaslanan Yenidənqurma və Analiz (COBRA). Genetik mutasiyalar və şiş mikro mühiti səbəbiylə xərçəng hüceyrələrində metabolik uyğunlaşmaları öyrənmək və xərçəng əleyhinə dərmanlar üçün yeni enzimatik hədəfləri müəyyən etmək üçün bu tamamlayıcı modelləşdirmə üsullarının tətbiqlərini təsvir edirik. COBRA və 13C-MFA-nın üstünlüklərini və məhdudiyyətlərini və qarşıda duran əsas problemləri daha da vurğulayırıq.


Akustik perfuziya bioreaktorunda hibridoma hüceyrələrinə qidalanma və qanama nisbətinin təsiri: Metabolik analiz

  • APA
  • Müəllif
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standart
  • RIS
  • Vankuver

In: Biotexnologiya Tərəqqi, Cild. 23, No 3, 2007, s. 560-569.

Tədqiqatın nəticəsi : Jurnalın töhfəsi › Məqalə › Akademik › ekspert rəyi

T1 - Akustik perfuziya bioreaktorunda qidalanma və qanaxma sürətinin hibridoma hüceyrələrinə təsiri: Metabolik analiz

N2 - Optimal perfuziya proseslərinin inkişafı üçün qidalanma və qanaxma sürətinin hüceyrə böyüməsinə, məhsuldarlığına və maddələr mübadiləsinə təsirini başa düşmək vacibdir. Burada təqdim olunan araşdırmada, yem və qanama nisbətinin hüceyrə metabolizmasına təsiri metabolik axın analizi istifadə edilərək araşdırıldı. Bütün sınaqdan keçirilmiş yemləmə və axıdma dərəcələrində, azot balansından (biokütlə-azot) hesablanan biokütlə konsentrasiyası, gözlənilən kimi, yem nisbətinin artması ilə xətti olaraq artmışdır. Bununla birlikdə, yemin miqdarına və qanama nisbətinə görə bu artıma iki fərqli yolla nail olundu. Aşağı yem və qanaxma nisbətlərində (Region I) artım, canlı hüceyrə konsentrasiyasının artması hesabına əldə edildi, hüceyrə-azot tərkibi sabit qaldı. Yüksək qidalanma və qanama nisbətlərində (Region II) artım hüceyrə-azot tərkibinin artması ilə əldə edildi, hüceyrə konsentrasiyası sabit qaldı. Bir qram biokütlə-azot üçün, qida və məhsulların əksəriyyətinin spesifik istehlakı və istehsal nisbətləri, axınların çoxu kimi hər iki bölgədə eyni idi. İki bölgə arasındakı əsas fərq, piruvatdan laktata axının artması və II bölgədə sitrata doğru piruvatın axınının azalması idi. Sitrat səviyyəsindəki axının azalması ya hüceyrədəki lipidlərin daha az bir hissəsinə gətirib çıxaran lipid biosintezinə doğru axının azalması, ya da limon turşusu dövrünə doğru gedən enerjinin azalması ilə balanslaşdırıla bilər. nəsil və ya bunların birləşməsi ilə. Nəhayət, xüsusi məhsuldarlıq II bölgədə hüceyrə başına azotun tərkibindən daha az artır, bu da o deməkdir ki, maksimum istehsal sürətini əldə etmək üçün təkcə biokütlə sıxlığını deyil, hüceyrə sıxlığını da artırmaq vacibdir.

AB - Optimal perfuziya proseslərinin inkişafı üçün qidalanma və qanaxma sürətinin hüceyrə böyüməsinə, məhsuldarlığına və maddələr mübadiləsinə təsirini başa düşmək vacibdir. Burada təqdim olunan araşdırmada, yem və qanama nisbətinin hüceyrə metabolizmasına təsiri metabolik axın analizi istifadə edilərək araşdırıldı. Bütün sınaqdan keçirilmiş yemləmə və axıdma dərəcələrində, azot balansından (biokütlə-azot) hesablanan biokütlə konsentrasiyası, gözlənilən kimi, yem nisbətinin artması ilə xətti olaraq artmışdır. Bununla birlikdə, yemin miqdarına və qanama nisbətinə görə bu artıma iki fərqli yolla nail olundu. Aşağı yem və qanaxma dərəcələrində (I Region) artım canlı hüceyrə konsentrasiyasının artması hesabına əldə edildi, hüceyrə-azot tərkibi isə sabit qaldı. Yüksək qidalanma və qanama nisbətlərində (Region II) artım hüceyrə-azot tərkibinin artması ilə əldə edildi, hüceyrə konsentrasiyası sabit qaldı. Bir qram biokütlə-azot üçün, qida və məhsulların əksəriyyətinin spesifik istehlakı və istehsal nisbətləri, axınların çoxu kimi hər iki bölgədə eyni idi. İki bölgə arasındakı əsas fərq, piruvatdan laktata axının artması və II bölgədə sitrata doğru piruvatın axınının azalması idi. Sitrat səviyyəsindəki axının azalması ya hüceyrədəki lipidlərin daha az bir hissəsinə gətirib çıxaran lipid biosintezinə doğru axının azalması, ya da limon turşusu dövrünə doğru gedən enerjinin azalması ilə balanslaşdırıla bilər. nəsil və ya bunların birləşməsi ilə. Nəhayət, xüsusi məhsuldarlıq II bölgədə bir hüceyrəyə düşən azot miqdarından daha az artır, bu da maksimum istehsal nisbətlərini əldə etmək üçün yalnız biokütlə sıxlığını deyil, hüceyrə sıxlığını da artırmağın vacib olduğunu bildirir.


Nəticələr

Genom ardıcıllığı, montaj və annotasiya

Qış şirinliyinin genom sıralaması üçün DNT, Huazhong Kənd Təsərrüfatı Universitetinin kampusunda əkilən bir üzvlükdən əldə edildi. DNT, Illumina HiSeq, 10X Genomics və PacBio SMRT sıralamasını ehtiva edən üç fərqli ardıcıllıq üsulunu birləşdirərək çıxarılmış və sıralanmışdır. Ümumilikdə 76.96 Gb PacBio uzun oxunuş əldə edildi (Əlavə fayl 1: Cədvəl S1), 778.71 Mb genomunun təxminən 98.83 qat yüksək keyfiyyətli ardıcıllığı (ölçüsü k-mer tezlik təhlili ilə təxmin edilir) (Əlavə fayl 2: Şəkil 2) S1a və Əlavə fayl 1: Cədvəl S2). Flow sitometriyası k-mer metodu ilə uyğun gələn 805,88 Mb təxmin edilən haploid genom ölçüsünü təyin etdi (Əlavə fayl 2: Şəkil S1b). İnteraktiv xətanın düzəldilməsindən sonra PacBio oxunuşları FALCON [18] istifadə edərək əsas kontiglərə yığıldı. Birincil yaradılan contigs daha sonra Quiver ilə cilalanaraq, N19 uzunluğu 2.19 Mb olan 1623 kontigur əldə etdi (Cədvəl 1). Final contigs -in ardıcıllıq səhvinin düzəldilməsi, pilon [19] tərəfindən 36.48 Gb (46.85X) Illumina qısa oxunuşları ilə həyata keçirildi. Konsensus ardıcıllığı 156,26 Gb (200,67X) 10X Genomics ilə əlaqəli oxunuşlarla inteqrasiya edilərək daha da gücləndirildi (Əlavə fayl 1: Cədvəl S1). Yekun məclis genom sorğusu ilə təxmin edilən genom ölçüsünün 89,2%-ni əhatə edən N50 ölçüsü 4,49 Mb olan 695,31 Mb-lik 1259 skafolddan ibarətdir (Cədvəl 1 və Əlavə fayl 1: Cədvəl S3). Montajı yaxşılaşdırmaq üçün montaj düzəltməsinə kömək etmək üçün 93 × Hi-C məlumatlarından istifadə etdik və 1259 iskeledən 1027-ni 763 super iskala bağladıq (Əlavə fayl 1: Cədvəl S4 və S5). Bütün super iskelelər dəqiq 695.31 Mb quruluşunun 99.42% -ni əhatə edən, 1150 yalançı xromosomlara (Əlavə fayl 2: Şəkil S2) dəqiq bir şəkildə yığılmış və N50 65.35 M olan və maksimum iskala uzunluğu 85.71 Mb olan bir psevdokromozoma bölünmüşdür. (Əlavə fayl 1: Cədvəl S5). Qrupların sayı, somatik hüceyrələrdə eksperimental olaraq təyin olunan xromosomların sayına uyğun gəlirdi (2n = 22) (Əlavə fayl 2: Şəkil S3). Əlavə olaraq, 185.93 Gb Illumina ardıcıllıq məlumatları da yaradıldı və yığmaq üçün istifadə edildi Calycanthus chinensis (eyni ailəyə aid qış şirininin yaxın qohumu) genomu (Əlavə fayl 1: Cədvəl S1). Yığılmış ölçü C. chinensis layihə genomu 767.4 Mb idi

Təxmin edilən genom ölçüsünün 92,78%-i (Əlavə fayl 1: Cədvəl S2), müvafiq olaraq 291,991 kontig (N50 = 38,7 kb) və 241,923 skafold (N50 = 20,34 Mb) ilə (Əlavə fayl 1: Cədvəl S3).

Genom yığımının keyfiyyətini qiymətləndirmək üçün BUSCO və CEGMA analizlərini apardıq və qış şirin genomunda sırasıyla 95% və 92.74% tam ökaryotik konservləşdirilmiş genlərin aşkarlandığını gördük (Əlavə fayl 1: Cədvəl S6), bu da son montajın yüksək səviyyədə tamamlandığını göstərir. . Əlavə olaraq, Illumina'dan əldə edilən yüksək keyfiyyətli qısa oxunuşlar, 99.95%xəritələmə nisbətində əla uyğunlaşmalar nümayiş etdirən yığılmış genomla xəritələndi. Yuxarıdakı nəticələr birlikdə götürüldükdə, qışın şirin genomunun yüksək dərəcədə bitişikliyini və tamlığını göstərir.

De novo və homologiyaya əsaslanan proqnozlara və transkriptom məlumatlarına əsaslanaraq, ortalama uzunluğu 9017 bp və CDS uzunluğu 1250 bp olan 23.591 zülal kodlaşdıran gen proqnozlaşdırılmışdır ki, bu da AmborellaLotus (Əlavə fayl 1: Cədvəl S7). Bu zülal kodlayan genlərin xromosom boyunca məkan bölgüsü, xromosom qollarının uclarında yerləşən daha yüksək sıxlıqlarla qeyri-bərabər idi (Şəkil 1b). Ümumilikdə 21.940 (93.1%) proqnozlaşdırılan protein kodlaşdırma funksional annotasiyaya malikdir (Əlavə fayl 1: Cədvəl S8). 245 ribosomal RNT (rRNA), 567 köçürmə RNT (tRNA), 909 mikroRNA və 1028 kiçik nüvə RNT (snRNA) (Əlavə fayl 1: Cədvəl S9) daxil olmaqla 2749 kodlaşdırılmayan RNT (ncRNA) təsbit edildi.

Qış və digər tipik çiçəkli bitki növlərinin müqayisəli təkamül təhlili

Gen ailələrinin genişlənməsi və ya daralması çiçəkli bitkilərdə fenotipik müxtəlifliyin və adaptiv təkamülün aparılmasında böyük rola malikdir [20]. Nisbi növlərində gen ailələri ilə müqayisədə C. chinensis, wintersweet müvafiq olaraq 12 və 45 gen ailəsinin əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdiyini və azaldığını nümayiş etdirdi (Şəkil 2a). Genişlənmiş gen ailələrinin KEGG funksional zənginləşdirmə təhlili göstərir ki, onlar əsasən “Sesquiterpenoid və triterpenoid biosintezi”, “Monoterpenoid biosintezi”, “Flavonoid biosintezi” və “Fenylpropanoid biosintezi” yollarında təyin edilmişdir (Əlavə fayl S14a və T. ), qış şirinliyinə xas olan əsas xüsusiyyətdən (güclü ətir) məsuldur.

Qış şirin genom və gen ailələrinin təkamülü. a 17 növ bitki filogenetik ağacı. Mavi rəqəmlər, hər bir qovşağın fərqlənmə vaxtını (MYA, milyon il əvvəl), mötərizədə olanlar isə, fərqli örtüklər arasındakı fikir ayrılığı zamanı üçün 95% etibarlılıq aralığını ifadə edir. Filialdakı qırmızı rəqəmlər bootstrap dəyərini göstərir. Ağacın hər budağında olan pasta diaqramı qazanc (qırmızı) və ya itki (yaşıl) hadisələrə məruz qalan gen ailələrinin nisbətini təmsil edir. Pasta diaqramının altındakı rəqəmlər gen genleşmə və daralma gen ailələrinin sayını ifadə edir. Bazal angiosperm (Ba). b 17 bitki növündə tək nüsxəli, çoxnüsxəli, unikal və digər orfoloqların paylanması. c Venn diaqramı, yaxından əlaqəli beş maqnoliid arasında paylaşılan və bənzərsiz gen ailələrini təmsil edir.C. praecox, C. kanehirae, L. chinense, P. nigrum, və C. chinensis). Hər bir rəqəm gen ailələrinin sayını göstərir

Çiçəkli bitki növləri arasında gen ailələrinin əlaqəsini müəyyən etmək bitki təkamülünün genetik əsaslarını araşdırmaqda güclü bir yanaşma olmuşdur. İkili ardıcıllıq oxşarlıqlarına əsaslanaraq, ehtimal olunan ortoloji gen qruplarını müəyyən etmək üçün qışda şirin və 16 ardıcıl növün proqnozlaşdırılan proteomlarını tətbiq etdik. 17 bitki növündən 554.042 gendən ibarət 37.137 ortolog gen ailəsi müəyyən edildi, onlardan ata -baba gen ailələrini təmsil edən bütün araşdırılan növlər tərəfindən 5339 gen qrupu paylaşıldı (Şəkil 2b). Digər tərəfdən, qışda 8733 gen ailəsi var idi. C. chinensis, L. chinensis, və C. kanehirae, çox güman ki, maqnoliidlərin "əsas" proteomunu təmsil edir (Şəkil 2c). Qış şirin genomuna xas olan 507 zülal ehtiva edən 339 gen ailəsi var (Əlavə fayl 1: Cədvəl S11). Gen Ontologiyası (GO) müddətli zənginləşdirmə təhlili, qış şirininə xas genlərin maddələr mübadiləsində iştirak edən "oksidoredüktaza aktivliyi" və "pektinesteraza fəaliyyəti" adlandırılan funksional kateqoriyaların zənginləşdiyini aşkar etdi (Əlavə fayl 2: Şəkil S4b).

Təkrarlanan məzmun və LTR retrotranspozonlarının son partlaması

Qış şirin genomunda, təkrarlanan elementlər genomun 45.73% -ni tuturdu, onlardan 96.69% -i transpozasiya edilə bilən elementlər (TE) olaraq qeyd edildi (Əlavə fayl 1: Cədvəl S12). Uzun terminal təkrar retrotransposons (LTR), montajın 36.2% -ni təşkil edən TE -lərin əsas sinfi idi. LTR -lər arasında ən çox LTR/Qaraçı elementləri var idi, genomun 23,3% -ni, sonra LTR/Copia elementlərini (8,6%, Əlavə fayl 1: Cədvəl S12) təşkil edirdi. LTR elementlərinin əsas qruplarından başqa, genomun 3,65% -i DNT elementləri, 3,45% -i uzun nüvə elementləri olaraq qeyd edildi, qalanları isə digər təkrar ailələrə verildi və ya təyin oluna bilmədi (Əlavə fayl 1: Cədvəl S12). Transpozasiya edilə bilən elementlər xromosomlar arasında qeyri -bərabər paylanmışdır və xüsusilə sentromerik bölgələrdə çoxdur (Şəkil 1b). TE -lərin paylanmasının daha müqayisəli təhlili, genetik bölgələrə (16.04%) və genlərə bitişik bölgələrə (4.77%) nisbətən genlərarası bölgələrdə (79.19%) daha yüksək bir nisbət göstərdi (Əlavə fayl 2: Şəkil S5a). Gen bölgələrində, TE -lər ekzonlar və intronlar arasında qeyri -bərabər paylanmışdır. Gen bölgələrində TE -lərin 98.98% -i intronlarda meydana gəldi və intronların ümumi uzunluğunun 25% -ni təşkil etdi (Əlavə fayl 2: Şəkil S5b). Gen quruluşunun digər növlərlə müqayisəsi, ekzonların orta uzunluğunun və sayının oxşar olduğunu, intronların orta uzunluğunun isə bir qədər uzandığını və müəyyən dərəcədə təkrar yığılma ilə əlaqəli olduğunu ortaya qoydu. Üstəlik, qışda LTR-RT-nin partlama vaxtı 8812 ehtimal tam LTR-RT-dən istifadə etməklə hesablanmış və 0,03 ətrafında pik əvəzetmə dərəcəsini aşkar etmişdir (Əlavə fayl 2: Şəkil S6). İl ərzində hər baza üçün 1.51 × 10-9 nisbətində bir mutasiya nisbətini [14] qəbul etdik, nəticədə təxminən 9.9 Ma daxil olma müddəti ilə nəticələndi.

Magnoliidlərdə TE -lərin təkamülünü araşdırmaq üçün hər ikisi üçün tərs transkriptaz genlərindəki filogenetik sahələr tikilmişdir. Ty1/CopiaTy3/Qaraçı super ailə. Filogenetik ağacında Ty3/Qaraçı superfamily, wintersweet-dən olan LTR-RT-lərin əksəriyyəti tork qrupuna yığılmışdır (Əlavə fayl 2: Şəkil S7a). İlə müqayisədə L. chinensisC kanehirae, qışda LTR-RT-lər və C. chinensis tork cinslərində daha yüksək müxtəliflik və bolluq nümayiş etdirdi, bu da qışda daha çox genişlənmə və fərqliliyi göstərir. C. chinensis genom. The Kopiya superfamily, bu dörd növün elementlərindən ibarət dörd əsas örtüklə fərqli bir nümunə nümayiş etdirdi (Əlavə fayl 2: Şəkil S7b), bu sistemin qorunmuş bir təkamül modelini göstərir. Kopiya superfamily, əvvəllər təsvir edildiyi kimi [21, 22].

Maqnoliidlərin eudikotlara filogenomik yerləşdirilməsi

Maqnoliidlərin, monokotların və eudikotların filogenetik əlaqələri bitki taksonomiyasında bir qədər mübahisəli olmuşdur. Magnoliidlərin monokotlara və eudikotlara nisbətən filogenetik mövqeyini çıxarmaq məqsədi ilə 5 monokotdan ibarət 17 çiçəkli bitki növündən genom məlumatları istifadə edərək 213 qiymətləndirilən tək nüsxəli ortoloji dəsti (OSCG) ilk dəfə OrthoMCL [23] ilə müəyyən edilmişdir. , 6 eudikot, 5 maqnoliid və 1 bazal angiosperm. 213-gen verilənlər bazasından istifadə edərək filogenetik ağacları yenidən qurmaq üçün həm birləşmə, həm də birləşmə yanaşmalarını tətbiq etdik. Həm birləşmə, həm də konkatenasiya analizləri monokotlardan ayrıldıqdan sonra eudikotlara bacı qrup kimi maqnoliidlərlə eyni yüksək dəstəklənən topologiya verdi (Şəkil 2a və Əlavə fayl 2: Şəkil S8a). Ortolog identifikasiyasında potensial səhvlərin qarşısını almaq üçün yuxarıda təsvir edilən 17 bitki genomundan tək nüsxəli genləri (SSCG) çıxarmaq üçün SonicParanoid [24] də istifadə etdik. Filogenetik ağacların inşası üçün ən azı 14 növdən nümunə götürülmüş genlərdən istifadə edilmişdir. 216 tək nüsxəli gen əsasında filogenetik ağaclar yuxarıda təsvir edilənlər kimi həm birləşmə, həm də birləşmə üsulları ilə eyni şəkildə nəticələndi. Yaranan ağac növləri, yuxarıda təsvir edilən OrtholMCL tərəfindən ortaya qoyulan filogenetik tapıntılarla topoloji cəhətdən eynidir (Əlavə fayl 2: Şəkil S8b).

Maqnoliidlər, monokotlar və eudikotlar arasındakı eyni filogenetik əlaqələr ardıcıl olaraq bərpa olunsa da, topoloji ziddiyyətlər həm də birləşmə əsaslı gen ağacları arasında müşahidə edildi (Əlavə fayl 2: Şəkil S8c). OSCG və SSCG məlumat dəstlərindəki gen ağacları arasındakı uyğunsuzluğu qiymətləndirmək üçün, Magnoliidlər, monokotlar və eudikotlar üçün üç fərqli budaqlanma əmrini dəstəkləmək üçün gen ağaclarının nisbətlərini göstərmək üçün ASTRAL [25] dördlüyü hesabından istifadə etdik (Əlavə fayl 2 : Şək. S8d) və aşkar etdi ki, Maqnolidləri və evdikotları birlikdə dəstəkləyən gen ağaclarının monokotlarla bir qardaş qrupu təşkil edən faizləri digər iki topologiyadan daha yüksəkdir (Əlavə fayl 2: Şəkil S8c). Bununla birlikdə, 26 takson üçün 38 xloroplast tək nüsxəli genin birləşdirilmiş ardıcıllıqla hizalanmasının filogenetik analizlərində maqnoliidlər eudikotlardan və monokotlardan ibarət olan qardaş qrupa yerləşdirildi (Əlavə fayl 2: Şəkil S9). Bundan əlavə, bu filogenetik genlərdə sürətli spesifikasiya hadisələrini təmsil edən maqnoliidlər, eudikotlar və monokotlar örtükləri arasındakı qısa filogenetik budaqlar da müşahidə edilmişdir. Nüvə və plastid genomları arasındakı filogenetik uyğunsuzluq, erkən mezangiospermlərin sürətli ayrılması zamanı daha tez -tez ortaya çıxan natamam nəsil çeşidlənməsi (ILS) səbəb ola bilər. Qeyri -kafi takson nümunələri uyğunsuz filogeniya ilə nəticələnə biləcəyi üçün, filogenetik ağacın yenidən qurulması üçün filogenetik cəhətdən əsas olan 11 növdən əlavə genom məlumatları və xlorantalların transkriptom məlumat dəsti əlavə etməklə takson nümunəsini yaxşılaşdırdıq. Bu yanaşma maqnoliidlər, eudikotlar və monokotlar arasındakı eyni filogenetik əlaqələri bərpa etdi (Əlavə fayl 2: Şəkil S10). Beləliklə, bu nəticələrdən, tədqiqatımızda təklif olunan filogenetik əlaqənin cari verilənlər bazası altında nisbətən dəqiq olduğuna inanırıq. Məqalələrdən və TimeTree veb saytından seçilmiş yüksək inamlı filogenetik ağaca və kalibrləmə nöqtələrinə əsasən, maqnoliidlər və evdikotlar arasında fərq müddəti 113,0-153,1 milyon (95% etimad intervalı) (Şəkil 2a) ilə üst-üstə düşür. son üç qiymətləndirmə (114.6-164 Ma, 117-189 Ma və 136.0–209.4 Ma) [13, 25, 26].

Bütün genomun duplikasiyası və genomun təkamül təhlili

Bütün genomun duplikasiyası (WGD) uzun müddət bitki təkamülünün əsas hərəkətverici qüvvəsi kimi qəbul edilmişdir [27]. WGD hadisələrini qış tətilinin təkamül gedişatında araşdırmaq üçün əvvəlcə genom genişliyindəki dublikatları axtardıq və onları MCScanX analizi ilə dörd fərqli rejimə təyin etdik (Əlavə fayl 2: Şəkil S11). WGD/seqmental dublikasiya 265 sintenik blokda 4511 paraloq gen cütünü özündə birləşdirən dominant tip kimi müəyyən edilmişdir. Bu sintenik bloklar arasında, 36.09% -nin genomdakı digər üç blokla əlaqələri paylaşdığı aşkar edildi (Əlavə fayl 2: Şəkil S12). Geniş yayılmış sinteniya və yaxşı saxlanılan birdən üçə qədər sintenik bloklar, iki WGD hadisəsinin qış şirin genom təkamülü zamanı baş verə biləcəyini göstərir. Bunu yaxşı qəbul edirlər Amborella angiospermlər daxilində bütün digər qrupların qardaş soyu olan tək bir canlı növüdür və angiospermlərin son ortaq atasından ayrıldıqdan sonra soyun xüsusi poliploidiyasına dair heç bir dəlil yoxdur [28]. Qış şirinliyi ilə kollinearlıq və sintez təhlili Amborella genom, eyni zamanda 1: 4 sintenik dərinlik nisbəti ilə qışda iki WGD üçün açıq struktur sübutlar təqdim etdi. Amborella-qış -şirin müqayisə (Şəkil 3a). Qış şirini genomlarının poliploidliyini daha da aydınlaşdırmaq üçün biz qış şirininin müqayisəli genomik analizini apardıq. C. kanehiraeL. chinensis. Sintetik dərinlik nisbətləri 4: 4 və 2: 4 qışda şirin hesab olunurdu.Cinnamomum və qış tatlısı-Liriodendron müqayisələr, müvafiq olaraq (Şəkil 3b). Hər növ arasında və içərisində olan sintenik əlaqələrə əsaslanaraq apardığımız təhlillər qışda iki WGD hadisəsi keçirdiyini göstərir.

Müqayisəli genomika təhlili. a Qış və Amborella'dan genomik bölgələr arasındakı sintez nümunələri. Bu model, bazal angiosperm Amborella'daki bəzi tipik ata -baba bölgələrinin qışda dörd uyğun nüsxə bölgəsinə sahib olduğunu göstərir. Bu əlaqəli əlaqə qırmızı və yaşıl rənglərdə göstərilən bir sintenik dəsti ilə vurğulanır. b Genomlar arasında sintenik bloklar. Ortologların nöqtə planları qış şirin genomu ilə 4-4 xromosom əlaqəsini göstərir. C. kanehirae genom və qış tatlı genomu ilə 2-4 xromosom əlaqəsi L. chinense genom. c Təkamül sürətinin korreksiyasından sonra sintenik ortoloji (kesikli əyrilər) və paraloq genlərin (bərk əyrilər) sinonim əvəzetmə səviyyələrinin (Ks) paylanması. d Laurales genomlarının təkamül modeli. Laurales əcdadlarının xromosomları on rənglə təmsil olunur. Poliploidləşmə hadisələri xromosom birləşmələri (Fu) və parçalanmalarla (Fi) birlikdə 3 fərqli rəngli nöqtə ilə göstərilir. Laurales genomlarının müasir quruluşu rəqəmin altında göstərilmişdir. Bəzi bölgələrdə onların hansı əcdad xromosomundan alındığını müəyyən edə bilmədik və bu bölgələr ağ boşluqlar şəklində təmsil olundu.

Qış şirin genomunda iki WGD hadisəsinin vaxtını qiymətləndirmək üçün qışda və ya digər üç növ daxilində kollinear homoeologlar arasında sinonim nukleotid sahələrində (K) sinonim əvəzləmələri xarakterizə etdik. C. chinensis, Cinnamomum kanehirae, və Liriodendron chinensis Magnoliidlərdən. Bir-bir ortologların Ks paylamaları arasında təsbit edildi Amborella və digər dörd növ fərqli Ks zirvələrini göstərir və bu dörd növ arasında fərqli təkamül nisbətlərini göstərir (Əlavə fayl 2: Şəkil S13). Təkamül dərəcəsi [29] üçün düzəliş edildikdən sonra, Laurales üçün hər il 4.21 × 10 - 9 olaraq sinonim əvəzetmə sintetik blokların ortalama Ks dəyərləri istifadə edilərək hesablandı, nəticədə WGD hadisəsinin təxmini vaxtı təxminən 77.8 milyon və 112.1 milyon il əvvəl (Ma), müvafiq olaraq (şək. 3c). Genomunun əvvəlki təhlili Cinnamomum qədim WGD hadisəsinin Magnoliales və Laurales [13] tərəfindən paylaşıldığını və müəyyən edilmiş WGD hadisələrinin mütləq tarixinin Liriodendron tulipifera bu fərziyyəni də dəstəklədi [14]. Tədqiqatımızda iki və bir poliploidləşmə hadisəsini də aşkar etdik CinnamomumLiriodendron müvafiq olaraq, lakin bu iki növ tərəfindən ortaq bir WGD hadisəsi paylaşılmadı. Bundan əlavə, qış şirin genomu qədim WGD hadisəsini paylaşır darçın amma ilə deyil Liriodendron. Üstəlik, qışdan şirin və sintenik gen qruplarının ağacları Liriodendron vs. Amborella qışın şirin olduğunu və Liriodendron ortaq əcdaddan ayrıldıqdan sonra müvafiq olaraq WGD hadisəsi yaşadılar (Əlavə fayl 2: Şəkil S14 və Əlavə fayl 3: Əlavə Qeyd 3). Beləliklə, bu nəticələrdən belə nəticəyə gəlirik ki, qədim qış şirin WGD hadisəsi Calycantaceae və Lauraceae-nin ayrılmasından əvvəl, lakin Calycantaceae və Magnoliaceae-nin ayrılmasından sonra baş verib.

Eyni zamanda qışın şirin və intergenomik və intragenomik analizlərindən əldə edilən ortoloji və paralel genlərdən istifadə etdik. C. chinensis həmçinin C. kanehirae Laurales bir ehtimal ata genomu qurmaq üçün genomlar və bu üç soyun on xromosom və 4216 gendən ibarət olan bir ehtimal atadan (Şəkil 3d və Əlavə 2: Şəkil S15) törədildiyi bir təkamül ssenarisi təklif etdi. Bu əcdad, 20 xromosomlu bir ara səviyyəyə çatmaq üçün bir WGD hadisəsindən keçdi və sonra indiki karyotipləri meydana gətirmək üçün xromosomların yenidən qurulmasını yaşadı. Qışda, bütün xromosomlar yenidən quruldu və hər bir xromosom ən azı iki qədim xromosomdan gəldi. 11 xromosomdan ibarət olan indiki quruluşa çatmaq üçün qışda ən az 49 xromosom parçalanması və 48 xromosom füzyonunun meydana gəldiyi təxmin edildi (Şəkil 3d).

Çiçək keçidinin, çiçək orqanlarının spesifikasiyasının və qışda erkən çiçəklənmənin genetik əsası

Wintersweet, qışın dərinliyində çiçək açan çoxillik ağaclardan biridir. Təxminən 10 ay çəkdi C. praecox reproduktiv inkişafını başa çatdırmaq üçün. Son çiçəkləmə vaxtına təsir göstərə bilən çiçəyin inkişafının bütün bu prosesini araşdırmaq üçün ilk növbədə müşahidə yolu ilə parafin kəsikləri ilə çiçəklərin ontogenez və inkişaf nümunələri üzərində sistemli bir araşdırma apardıq. Nəticələr göstərdi ki, çiçək qönçəsi aprel ayında başlamış, çiçək naxışları və çiçək orqanının spesifikasiyası aprel-iyul ayları arasında baş vermişdir, yayda yavaş böyümə, erkək və dişi gametofitlər müvafiq olaraq oktyabr və dekabr aylarında əmələ gəlmiş, çiçək qönçəsi dincəlməyə keçmiş, sonra fasilə dekabr ayında baş verdi və çiçək dərin qışda çiçək açdı (Şəkil 4a). Kritik çiçək inkişaf mərhələlərinin əsasını təşkil edən molekulyar mexanizmləri araşdırmaq üçün çiçək başlanğıcından olgunlaşmağa qədər çiçəklərin inkişaf mərhələləri üçün RNA-seq məlumatları hazırladıq və təhlil etdik.

Çiçək qönçəsinin əsas inkişaf mərhələlərinin sxematik təsviri və çiçək orqan kimliyinin və çiçəkləmə dövrü ilə əlaqəli genlərin təhlili. a Çiçəyin inkişafı mərhələləri, o cümlədən çiçək keçidi, meristem spesifikasiyası, çiçək orqanının spesifikasiyası, çiçək qönçələrinin yuxusuzluğu və sərbəst buraxılması və çiçəkləmə. Çiçək qönçəsinin inkişaf mərhələləri üçün qısaltmalar: fərqlənməmiş çiçək qönçəsi mərhələsi (FBS1) çiçək primordium meydana gəlməsi mərhələsi (FBS2) tepal primordiyumun formalaşma mərhələsi (FBS3) stamen primordiumun formalaşma mərhələsi (FBS4) pistil primordiyumun formalaşma mərhələsi (FBS5) çiçək orqanlarının inkişafı və fərqlənmə mərhələsi ( FBS6) yavaş böyümə mərhələsi (FBS7) ovulun görünüş mərhələsi (FBS8) polen meydana gəlməsi mərhələsi (FBS9), qışda çiçək açır. ap, tumurcuq apex fp, çiçəkli primordium t, tepals s, stamens p, pistil a, anther o, ovula po, polen es, embrion sac. b Fərqli çiçək inkişaf mərhələlərində çiçəkləmə vaxtı və çiçək orqan kimliyi ilə əlaqəli genlərin ifadə nümunələri. c MADS-box genlərinin filogenetik ağacı və müxtəlif çiçək orqanlarından B-/C-funksiyası genlərinin gen ifadəsi nümunələri. Qışda şirin olan MADS qutusu zülalları sarı qutu ilə işarələnir

Çiçəkli başlanğıc, müxtəlif yollarda çiçəkləmə ilə əlaqəli genlərin məkan və zaman ifadəsi ilə idarə olunur [11]. Bu yollardan gələn bir çox gen, müxtəlif otlu və çoxillik növlərdə müəyyən edilmiş və xarakterizə edilmiş və qorunmuş funksiyaya malik olduğu bildirilmişdir [30,31,32]. Bu yaxınlarda çiçəkləmə zamanı gen şəbəkələrinin məlumat bazası quruldu Arabidopsis thaliana [30]. Bu verilənlər bazasından istifadə edərək, səkkiz yolda 594 çiçəkləmə vaxtı genini müəyyən etdik (Əlavə fayl 1: Cədvəl S13). RNT-seq məlumatlarının təhlili göstərdi ki, çiçək keçidi zamanı giberellin biosintezi və siqnal ötürülməsi yolu ilə əlaqəli çiçəkləmə vaxtı genləri əhəmiyyətli dərəcədə aktivləşdi (padj < 0.01) və bəzi genlərin fotoperiodik və sirkadiyalı saat yollarında ifadəsi də yuxarı tənzimləndi ( Şəkil 4b və Əlavə fayl 1: Cədvəl S14) endogen hormonu (gibberellin) və ətraf mühit faktorunu (fotoperiod) təklif edən yazda vegetativdən reproduktiv böyüməyə keçmədə böyük rol oynaya bilər.

Çiçək naxışları və çiçək orqanlarının spesifikasiyasından sonra aprel -iyul aylarında çiçək orqanlarının inkişafı yaydan payıza qədər yavaş -yavaş gedir, bu müddət ərzində temperatur çox yüksəkdir və maksimum temperatur 39 ° C -ə çata bilər (Şəkil 4a və Əlavə fayl 1: Cədvəl) S15).Buna görə də, temperatur çiçək orqanının yavaş inkişafına təsir edən əsas amil ola bilər. Birbaşa əks olunma, istilik şoku protein genlərinin əhəmiyyətli dərəcədə artan səviyyəsidir (Şəkil 4b). Bundan əlavə, digər inkişaf mərhələləri ilə müqayisədə, hüceyrə bölünməsi ilə əlaqəli bir çox gen əhəmiyyətli dərəcədə aşağı tənzimlənmişdir (Şəkil 4b və Əlavə fayl 1: Cədvəl S16). İstilik stresinin transkripsiya faktorları (HSF) və istiliyə cavab verən genlər istilik stresinə reaksiyada mühüm rol oynayır [33]. HSF ailəsində 21 üzv tapdıq C. praecox. altı HsfA1sİstilik stresinə cavab olaraq əsas transkripsiya tənzimləyiciləri kimi xidmət edənlər müəyyən edilmişdir (Şəkil 4b və Əlavə fayl 1: Cədvəl S17). HsfA1-lər tərəfindən tənzimlənən DEHİDRASİYA RESPONSİYA Element BÜTÜN PROTEİN2A (DREB2A). Hər ikisi HsfA1-1DREB2A-1 hüceyrələrin bölünməsi ilə əlaqəli genlərlə əks ifadə nümunəsi göstərdi (Şəkil 4b və Əlavə fayl 1: Cədvəl S15). DREB2A tərəfindən tanınan DRE ardıcıllığı (CTAGA motivi) hüceyrə bölünməsi genlərinin promotorunda da aşkar edilmişdir (Əlavə fayl 2: Şəkil S16a). Bu nəticələr, istilik siqnallarının HSF -lər tərəfindən transkripsiya tənzimləyici şəbəkələrə inteqrasiya olunmasını, sonra hüceyrə bölgüsü ilə əlaqəli genlərin ifadə edilməsini tənzimləmək üçün çiçək orqanlarının yavaş böyüməsi ilə nəticələnə bilər.

Ümumilikdə qış şirin genomunda 58 MADS qutusu geni müəyyən edilmişdir, onlardan 31-i MIKC tipli MADS qutusu genləridir (Əlavə fayl 1: Cədvəl S13). Bu genlərin filogenetik və kollinearlıq təhlilləri ABCE model prototip genlərinin homologlarının istisna olmaqla AP1/FUL, hamısının təkrarlandığı təsbit edildi (Şəkil 4c). dörd AGL6sWGD hadisələri nəticəsində yaranan, sayı Arabidopsis və düyüdən daha çox olan qış -şirin məclisində təsbit edildi. Bu genlər arasında CpAGL6a həddindən artıq ifadə edildikdə çiçəklənməni təşviq etdiyi bildirildi Ərəbidopsis [34]. Eyni zamanda, ÇİÇƏKLİ LOCUS C (FLC), çiçəkli bir repressor [35] kimi xidmət edən qış şirinliyində itdi (Şəkil 4c). Çiçəkləmə dövrü ilə əlaqəli genlərin selektiv genişləndirilmiş təşviqçisi və repressor itkisi, qışın daha əvvəl çiçəklənməsi ilə əlaqələndirilə bilər. Qış şirinliyində daxili və xarici perianth arasındakı morfologiya, bəzi bazal eudikotlarda olduğu kimi kiçik bir fərq göstərdi (RanunculusAquilegia). Bu morfologiyanı izah etmək üçün "sürüşmə sərhəd" modeli təklif edildi RanunculusB-funksiyalı homologlar petaloid orqan istehsal edən fındıqlarda ifadə olunur [36]. Wintersweet-dəki B-funksiya homologları ilə geniş ifadə nümunəsi nümayiş etdirildi AP3b tercihen "sürüşmə sərhəd" modelini dəstəkləyən və qış aylarında sepals və ləçəklər arasında açıq bir morfoloji fərqin olmamasını tamamlaya bilən xarici perianth fırıldağında ifadə olunur (Şəkil 4c). C-funksiyası homologlarının güclü ifadəsi stamen və karpel ilə məhdudlaşır, bu da bu genlərin stamen və karpel spesifikasiyasında qorunmuş bir funksiyaya sahib olduğunu göstərir. Çiçəyin inkişafı zamanı qış şirin ABCE homoloqlarının ifadə profilləri onların müəyyən etdiyi çiçək orqanlarının tədricən formalaşması ilə əsasən razılaşır (Şəkil 4b).

Qışda nisbi daha erkən axma vaxtı yuxu rejiminin sərbəst buraxılması üçün daha qısa soyutma tələbini və qış şirinində qönçələrin daha erkən qırılmasını təklif etdi. Təşkilatının üzvləri QISA VEGETATİF MƏRHƏLƏ (SVP) SVP və DAM genləri də daxil olmaqla MADS-box gen ailəsinin kladəsinin yuxu rejiminin sərbəst buraxılması və qönçələrin qırılması ilə əlaqəli olduğu yaxşı bilinir [37, 38]. İki homoloq SVP genlər qış şirin genomunda təsbit edildi. Filogenetik analiz SVP -lər bu iki genin çox yaxın olduğunu ortaya çıxardı PtSVL (Əlavə fayl 2: Şəkil S16b), funksiyası hibrid ağcaqovaqda temperatur vasitəçiliyi ilə vegetativ qönçələrin qırılmasının genetik şəbəkəsində repressor kimi xarakterizə edilmişdir [39]. Aşağı axın genləri PtSVL daxil olmaqla şəbəkədə TEOSINTE ŞUBƏLİ1, CYCLOIDEA, PCF/BRANCHED1 (TCP18/BRC1) və ÇİÇƏKLİ LOCUS T (FT), temperatur vasitəçiliyi ilə idarə olunan qönçə qırılmasının mənfi və müsbət tənzimləyiciləri kimi fəaliyyət göstərən, qış şirin genomunda da müəyyən edilmişdir (Əlavə fayl 2: Şəkil S16c). Endodormansdan flush mərhələsinə keçid zamanı ifadənin artması CpFT1 və aşağı tənzimləmə CpTCP18/BRC1CpSVL1 qeyd edildi (Əlavə fayl 2: Şəkil S16d). Gibberellin turşusu (GA) və absis turşusu (ABA) müvafiq olaraq qönçələrin qırılmasının müsbət və mənfi tənzimləyiciləri rolunu oynayır [40] və məzmunu bir qədər biosintez və katabolizm genlərinin ifadə səviyyəsi ilə əlaqədardır. Kimi GA biosintez genlərinin artan ifadəsi GA20 oksidaz kimi ABA biosintez genlərinin ifadəsinin azalması NCED (Əlavə fayl 2: Şəkil. S16d) qönçələnmə mərhələsindəki rolu ilə üst -üstə düşə biləcək qönçələnmə mərhələsində də müşahidə edildi.

Güclü soyuq müqavimətinin genetik əsası

Wintersweet, qışın dərinliyində çiçək açan çoxillik ağaclardan biridir, bu müddət ərzində temperatur həmişə donma nöqtəsinin altına düşür. Buna görə də, qış şirinliyi soyuq stresə qarşı durmaq üçün sistematik bir mexanizm inkişaf etdirmişdir. Uçucu qlikozilləşmə bitki uçucu birləşmələrinin ümumi formasıdır və bitkilərdə abiotik stresə cavab olaraq mühüm rol oynayır [41]. Son tədqiqatlar göstərdi ki, UDP-qlikosiltransferazaların (UGTs) vasitəçilik etdiyi uçucu terpen qlükozilləşməsi çay bitkilərində soyuq stresə dözümlülüyün modulyasiyasında iştirak etmişdir [42]. Qışda çoxlu uçucu maddələr linalool glyukoside, benzaldehyde benzil spirti kimi glikozidlə bağlı formalarda mövcud idi (Əlavə fayl 2: Şəkil S17). UGT ailəsində nəzərəçarpacaq dərəcədə genişlənmə (Əlavə fayl 1: Cədvəl S10) və qış şirin çiçəklərində bol miqdarda terpen qlikozidləri qışın şaxtasının güclü soyuq tolerantlığının müəyyən dərəcədə uçucu qlükozilləşmə ilə əlaqəli olduğu hipotezinə səbəb olur.

Terpen biosintezi və tənzimləmə ilə əlaqəli genlərin təkamülü

Monoterpenlər qışda, xüsusən də çiçək qoxusunun yarıdan çoxunu təşkil edən linaloolda çiçəkli uçucu üzvi birləşmələrin (VOC) əsas komponentləridir [5]. Bitkilərdə monoterpenlər/diterpenlər və sesquiterpenlər adətən 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfat (MEP) yolu və mevalonat (MVA) yolu [43]. Bu iki yolda cəmi 46 gen müəyyən edilmişdir (Əlavə fayl 1: Cədvəl S18). MEP yolunda iştirak edən əsas genlər, məsələn, 1-deoksi-d-ksiluloza 5-fosfat sintaza (DXS), 1-deoksi-d-ksiluloz 5-fosfat redüktizomeraz (DXR) və izopentenil difosfat izomeraza (IDI) WGD hadisələri vasitəsilə yaradılmışdır (Şəkil 5a). Bu genlərdə yüksək nisbətdə paralel əmələ gəlməsi, dozaj effektləri ilə katalitik reaksiyanın səmərəliliyini artıra bilər və bununla da MEP yoluna gedən metabolik axını artıra bilər. Terpen sintazaları (TPSs) terpenoid birləşmələri yaratmaq üçün MVA və MEP yolunda son katalitik reaksiyadan məsul olan fermentlərdir. Montaj genomunun köməyi ilə cəmi 52 ədəd tamamlandı CpTPSs müəyyən edilmişdir (Əlavə fayl 1: Cədvəl S19), onların sayı əvvəlki tədqiqatımızda transkriptomika ilə aşkar ediləndən təxminən iki dəfədir [5]. Dörd növdən olan TPS-nin filogenetik analizi müəyyən etmişdir ki CpTPSs torpaq bitkiləri üçün təsvir edilən altı alt ailədən beşinə qruplaşdırılmışdır (Şəkil 5b). Əksəriyyəti CpTPSs əsasən angiosperm spesifik sesquiterpen və monoterpen sintazlarından ibarət olan TPS-a (18) və TPS-b (24) alt ailələrinə yerləşdirilmişdir [44]. Müqayisəli genomik təhlillər göstərdi ki, TPS genləri xüsusilə TPS-b alt ailəsində əhəmiyyətli dərəcədə genişlənir (Şəkil 5b və Əlavə fayl 1: Cədvəl S10). TPS-b alt ailəsindəki bu nəslə xas gen genleşmələri, qışda çiçəkli VOC-larda monoterpen yığılmasına kömək edə bilər.

Terpenes biosintezi qışda. a Ehtimal ki, monoterpen və sesquiterpen biosintezində iştirak edən fermentləri kodlayan genlərin ifadə profilləri. Hər bir katalitik mərhələdə fermentlərin qısaltmaları qalın rəngdə göstərilmişdir. Hər bir gen üçün gradient rəng üç çiçək inkişaf mərhələsindəki gen ifadə səviyyələrini təmsil edir (S1: qönçə mərhələsi S4: tam açıq çiçək mərhələsi S5: qocalma mərhələsi). Homoloji genlər bərabər rəngli üfüqi zolaqlarla təmsil olunur və ərəb ədədi ardıcıllığı ilə yuxarıdan aşağıya doğru adlandırılır. Fermentlərin tam adları Əlavə fayl 1: Cədvəl S18 -də verilmişdir. Yaşıl qutuda yuvarlanan genlər WGD hadisəsi tərəfindən yaradılmışdır. Qutusuz genlər bu hadisəyə məruz qalmadı. b TPS zülallarının filogeniyası qışda və a -g -dən subfamilyaları göstərən digər 5 ardıcıl bitki genomunda müəyyən edilir. c İfadəsi CpTPS üç fərqli çiçək inkişaf mərhələsində genlər. Bu genlər üç inkişaf mərhələsindən ən az birində ifadə edildi. d Birdən çox olan xromosomlar CpTPS gen. Qırmızı almazlar funksional olaraq xarakterizə olunan genləri təmsil edir. Yaşıl almazlar tandem çoxalma hadisələri nəticəsində yaranan genləri təmsil edir. Ox ilə müalicə iki təkrarlanan geni bağladı. e Rekombinant CpTPSs zülallarını geranil difosfat (GPP)/farnesil difosfat (FPP) ilə inkubasiya etdikdən sonra enzimatik məhsulların müəyyən edilməsi. Uçucu terpenlər GC-MS təhlili və orijinal standartlarla müqayisə edilməklə təhlil edilmişdir. f Linaloolun biosintezinin artması CpTPS4-yuxarıda qeyd olunur tütün vəhşi tip (WT) və boş vektor nəzarəti (EV) ilə müqayisədə. Məlumat üç bioloji təkrarın orta ± SD-lərini təmsil edir

52 -nin ifadə təhlili CpTPS RNA-seq genləri, altı genin əsas monoterpenlərin emissiyası ilə oxşar ifadə nümunələri göstərdiyini ortaya qoydu (Şəkil 5c və Əlavə fayl 2: Şəkil S18). İfadə nümunəsinə və filogenetik analizə əsaslanaraq, funksional xarakteristikalar üçün TPS-b/g alt ailəsindən üç gen seçdik və bütün genlərin çox yönlü fermentləri çoxlu məhsullarla kodladığını aşkar etdik (Şəkil 5e). Subcellular lokalizasiya təhlili bunu göstərdi CpTPS4CpTPS9 plastidə lokallaşdırılmışdır CpTPS42 sitozola yönəldilmişdir (Əlavə fayl 2: Şəkil S19). CpTPS42 digər sesquiterpenes ilə birlikdə nerolidolun əmələ gəlməsini kataliz edən bir sesquiterpen sintazı olduğu göstərildi (Şəkil 5e). CpTPS4CpTPS9 həm monoterpen sintazlarıdır, həm də əsas məhsul olaraq β-pinen və linalool istehsal edirlər (Şəkil 5e). Funksiyasını daha yaxşı başa düşmək üçün CpTPS4, biz də tütündəki geni həddindən artıq ifadə etmişik. Transgen tütün yarpaqlarında linalool, limonen, β-ocimene və trans-β-ocimene daxil olmaqla monoterpenlərin yüksək səviyyələri yabanı tip nəzarəti ilə müqayisədə aşkar edilmişdir (Şəkil 5f). Bu nəticələr onu göstərdi CpTPS4 çiçək qoxusunun əsas komponentləri olan linaloolun biosintezində əsas rol oynayır.

Mövcud genom quruluşu buna imkan verir CpTPSs genomik bir konteksti nəzərə almaq üçün ya xromosomlara, ya da iskele mövqelərinə lokallaşdırılmalıdır. The CpTPS genlər altı xromosomda yerləşən 44 gen və yeddi iskeledə səkkiz gen ilə xromosomlar boyunca bərabər paylanmır (Şəkil 5d). 52 -dən on dörd CpTPS genlərin ən azı iki nüsxəsi var və hər bir təkrarlanan gen nüsxəsi digərinin yanında yerləşirdi. Misal üçün, CpTPS4 iskele662 üzərində yerləşir və daxil olmaqla üç nüsxəsi var CpTPS17, CpTPS18, və CpTPS19. Bu üç gen 6-cı xromosomda tandem massivi kimi düzülmüş və tam açıq çiçək mərhələsində yüksək şəkildə ifadə edilmişdir ki, bu da eyni funksiyaya malik ola bilər. CpTPS4 və linalool istehsalına eyni dərəcədə töhfə verin.

Terpenoidlərin əmələ gəlməsi yalnız kodlanan fermentlərin biokimyəvi xüsusiyyətlərindən asılı deyil CpTPS genlər, həm də transkripsiya faktorlarının (TF) iştirakını tələb edir. Ləçəklərin inkişafı zamanı diferensial ifadə göstərən 1313 TF müəyyən edilmişdir. Bunlardan 99-u terpenlərin emissiyası ilə müsbət korrelyasiya göstərir və əsasən MYB, bHLH, WRKY və bZIP ailələrində paylanır (Əlavə fayl 2: Şəkil S20 və Əlavə fayl 1: Cədvəl S20). Terpen biosintezi genlərinin transkripsiya nəzarəti, spesifik transkripsiya faktorları tərəfindən tanınan və bağlanan promotor bölgələrində cis-elementlərin olması ilə əlaqədardır. 2000-bp bölgələrini tarayarkən 52-dən yuxarı CpTPS bHLH- və MYB bağlayıcı elementlər kimi genlər, bir neçə müdafiə və stresə cavab verən elementlərin əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirildiyi təsbit edildi (Əlavə fayl 2: Şəkil S21). Nəticələr, MYB/bHLH transkripsiyası faktorlarının tənzimlənməsində əsas faktor ola biləcəyini göstərdi CpTPS genlərin ifadəsini təmin edir və bizə bitki ikincil metabolitlərinin tənzimlənməsində və stress reaksiyalarında çarpaz söhbətləri aşkar etmək üçün gələcək tədqiqatlar üçün başlanğıc nöqtəsini təmin edir.

Benzenoid/fenilpropanoid biosintezi ilə əlaqəli genlərin təkamülü

Benzenoidlər/fenilpropanoidlər, aromatik turşu fenilalanindən əmələ gələn qışda çiçəkli VOC -ların ikinci ən böyük qrupudur. Fenilalanin iki yolla (fenilalanin yolu və aragenat yolu) [45] sintez olunur və bu iki yol plastidial şikimat yolundan [46] ayrılır. Şikimat yolunda (20), fenilpiruvat yolda (7) və arogenat yolunda (6) iştirak edən genlər Şəkil 6a-da göstərildiyi kimi müəyyən edilmişdir. Qış şirin genomunda, həm WGD, həm də tandem təkrarlanma hadisələri, fenilpropanoid yolundakı yuxarı axan genləri və xüsusi benzenoid (benzil asetat və metil salisilat) biosintezində iştirak edən aşağı genləri (Şəkil 6a, b) əhəmiyyətli dərəcədə təsir etmişdir. 15 gen ailəsində paralel əmələ gəlmə dərəcəsi (Əlavə fayl 1: Cədvəl S21).

Benzenoid/fenilpropanoid biosintezində iştirak edən əsas genlərin təkamülü və ifadəsi. a Qışda şimat/benzenoid yolunda iştirak edən fermentləri kodlayan genlərin ifadə profilləri. Hər bir katalitik mərhələdə fermentlər üçün qısaltmalar qalın hərflərlə göstərilmişdir. Hər bir gen üçün gradient rəng qış ləçəklərinin üç inkişaf mərhələsində gen ifadə səviyyələrini təmsil edir (S1: qönçə mərhələsi S4: tam açıq çiçək mərhələsi S5: qocalma mərhələsi). Homoloji genlər bərabər rəngli üfüqi zolaqlarla təmsil olunur və ərəb ədədi ardıcıllığı ilə yuxarıdan aşağıya doğru adlandırılır. Fermentlərin tam adları Əlavə fayl 1-də verilmişdir: Cədvəl S21. Qara və qırmızı qutularda dövrələnmiş genlər müvafiq olaraq WGD və tandem duplikasiya hadisələri tərəfindən yaradılıb. Qutusuz genlər bu hadisələrə məruz qalmamışdır. b Benzinoid/fenilpropanoid biosintezində iştirak edən əsas genlərin mövqeləri ilə birlikdə qış şirin xromosomlarının sxematik təsviri. Qəhvəyi və qırmızı ilə işarələnmiş genlər, sırasıyla WGD və tandem duplikasiya hadisələri nəticəsində yarandı. c 21-in ifadə profilləri QALİB GƏLMƏK üç fərqli mərhələdə (S1, S4 və S5) homolog genlər. Bu genlər üç inkişaf mərhələsindən ən azı birində ifadə edilmişdir

Çiçək qoxusunun qış mövsümündə hakim olan birləşmələri olan benzil asetat, benzil spirti ilə asetil-CoA ilə əlaqəli asetil-CoA: benzil spirti asetiltransferaza (BEAT) ilə reaksiya verərək sintez olunur [47]. Müqayisəli genomik analizlər qışın şirin genomunun 33 -ə malik olduğunu göstərdi QALİB GƏLMƏK homolog genlər (Əlavə fayl 1: Cədvəl S21), sayı ilə müqayisə oluna bilər Prunus mume, benzil asetat da çiçək qoxusunun əsas komponentidir. Kimi P. mume, genişlənməsi QALİB GƏLMƏK homolog genlər, əsasən, tandem və WGD cütləşmə hadisələrinə aid idi [47]. 33 -dən QALİB GƏLMƏK qış tatlı genomunda tapılan homolog genlər, 8 -i WGD hadisəsindən, 14 -ü isə tandem çoxalması yolu ilə gücləndirilmişdir. Transkriptom və metabolit korrelyasiya təhlili 4 nümunəsinin ifadə nümunəsini göstərdi CpBEATs benzil asetat emissiyası ilə üst-üstə düşür (Şəkil 6c və Əlavə fayl 2: Şəkil S18). Bu genlər qış şirin çiçəklərində benzil asetat biosintezindən məsul ola bilər. Metil salisilat da qışda çiçəkli VOC -ların əsas tərkib hissəsidir. Üç tandem dublikat mənşəli salisilik turşusu metiltransferaza (SAMTs) qış şirinliyində təsbit edildi (Əlavə fayl 2: Şəkil S22), bunlardan ikisi çiçəkdə çox ifadə edilmiş və onların ifadə nümunələri metil salisilat emissiyası ilə əlaqəlidir və bu iki genin əsasən metil salisilat biosintezindən məsul ola biləcəyini göstərir (Şəkil 6a). Yuxarıda göstərilən bu müşahidələr, spesifik genlərin genişlənməsi və çiçəkdə selektiv ifadənin müvafiq fermentlərin artan aktivliyinə səbəb ola biləcəyini göstərir ki, bu da qış şirininin çiçəklərində bol xarakterik aroma formalaşması ilə nəticələnir.


Nəticələr

GAPC fəaliyyətinin Tyr-Asp inhibisyonu qlikolitik axının PPP-yə doğru sürüşməsi və NADPH/NADP + nisbətinin artması ilə əlaqələndirilir.

İşimizin əsas məqsədi bu yaxınlarda verdiyimiz məlumatların bioloji əhəmiyyətini anlamaq idi in vitro dipeptid Tyr-Asp və GAPC arasında qarşılıqlı əlaqə (Veyel və b, 2018). Ən sadə hipotezlə başladıq və Tyr-Asp-in olmaması və varlığında GAPC fəaliyyətini sınadıq. Həqiqətən, Tyr-Asp tətbiqi (100 uM), tək amin turşuları (Tyr və Asp) və ya kimyəvi cəhətdən əlaqəsi olmayan dipeptidlə (Ile-Glu) fərqli olaraq GAPC enzimatik fəaliyyətini maneə törədir (Şəkil 1A). 23% azalma təvazökar görünə bilər, lakin qeyd etmək lazımdır ki, GAPC aktivliyi təhlili təkcə sitozolik GAPC-yə deyil, həm də GAPCp-ə və üstəlik NAD+ (Falini) ilə əhəmiyyətli aktivliyə malik GAPA/B-yə də aiddir. və b, 2003), işıqda yığılmış Arabidopsis rozetlərindən xam ekstraktlarda GAPCp aktivliyi əhəmiyyətsiz olsa da, GAPA/B (Munoz-Bertomeu) üçün belə deyil və b, 2009). GAPC və GAPA/B fəaliyyətlərini fərqləndirmək üçün təqdim etdik gapc1 gapc2 sitozolik GAPC aktivliyindən tamamilə məhrum olan ikiqat mutant (Guo və b, 2012). Bununla biz nümayiş etdirə bilərik ki, Tyr-Asp-in əlavə edilməsi nəticəsində yaranan GAPC aktivliyindəki azalma, müşahidə olunana oxşardır. gapc1 gapc2 dipeptid olmadıqda ikiqat mutant (Şəkil 1B). Üstəlik, boşluq1 boşluq2 ikiqat mutant (Guo və b, 2012) GAPC fəaliyyətinin Tyr-Asp inhibisyonuna həssas deyildi. Əldə edilən nəticələrə əsasən belə nəticəyə gəldik ki, GAPC1 və GAPC2 Tyr-Asp təsirinin əsas hədəfləridir və 100 µM Tyr-Asp konsentrasiyası glikolitik GAPC-nin fəaliyyətini tamamilə maneə törətmək üçün kifayətdir.Nəticələrimizi daha da əsaslandırmaq üçün biz yabanı tipli bitkilərdən xam ekstraktlarda GAPA/B və GAPN aktivliyini sınaqdan keçirdik. boşluq1 boşluq2 ikiqat mutant (Guo və b, 2012). Şəkil 1C və D göstərir ki, nə GAPA/B, nə də GAPN aktivliyi Tyr-Asp-dən təsirlənməmişdir. Tyr-Asp (100 uM) GAPC aktivliyini inhibə etmək üçün kifayət idi. Müqayisə üçün, Arabidopsis şitillərində ölçülən Tyr-Asp miqdarı (nəzarət şərtləri) orta hesabla 0,62 nmol g −1 FW −1 olmaqla 0,23 ilə 2,7 nmol g −1 FW −1 arasında dəyişmişdir.n = 20 Əlavə Şəkil S1). Daha sonra Tyr-Asp konsentrasiyasını qiymətləndirmək üçün Koffler və digərlərinin (2013) məlumatlarından istifadə etdik. planta. Tyr-Asp-in bütün bölmələrdə bərabər paylandığını düşünsək, hüceyrədaxili Tyr-Asp konsentrasiyası təxminən 1 uM olardı, halbuki bütün Tyr-Asp yalnız sitozolda yerləşsəydi 26.5 mM-ə yüksələrdi.

Şəkil 1. GAPC aktivliyinin Tyr-Asp inhibisyonu, glikolitik axının PPP-ə doğru dəyişməsi və NADPH/NADP + nisbətinin artması ilə əlaqədardır.

  • A. GAPC enzimatik aktivliyi H ilə işlənmiş yabanı tipli xam ekstraktlarda ölçülmüşdür2O (istehza), və 100 µM Tyr-Asp, Tyr, Asp və Ile-Glu.
  • B -D. GAPC (B), GAPA/B (C) və GAPN (D) fermentativ fəaliyyətləri yabanı tipli və ikiqat k.o.-da ölçüldü. mutant boşluq1 boşluq2 H ilə müalicə olunur2O (istehza), və 100 µM Tyr-Asp.
  • E. Qlikoliz və pentoza fosfat yollarının sxematik təsviri.
  • F. 10 günlük Arabidopsis şitillərində qlükoza etiketli C6 və C1 axını təcrübəsi. 35, 70 və 145 dəqiqədən sonra nəzarət (su ilə işlənmiş) və Tyr-Asp (100 uM) ilə işlənmiş yabanı növ fidanlar üçün C6/C1 nisbəti göstərilir.
  • G. NADPH/NADP + nisbəti.
  • H. NADH/NAD + nisbəti. Nisbətlər NAD +, NADH, NADP + və NADPH ölçmələrindən hesablanmışdır.

Məlumat məlumatları: Məlumatlar ± SEM -in ortalamasıdır n = 4 (A -D dörd texniki təkrar), n = 3 (F üç müstəqil kolba), və n = 5-6 (G-H beş-altı müstəqil fidan şüşəsi). (A-D, F) üçün əhəmiyyətsiz cüt quyruqlu Tələbə istifadə edərək qiymətləndirildi t-test. (G-H) üçün əhəmiyyət iki tərəfli ANOVA (P ≤ 0.05 hərf Tyr-Asp müalicəsi ilə əlaqəli əhəmiyyətini göstərir). G6P: qlükoza 6-fosfat F6P: fruktoza 6-fosfat FBP: fruktoza 1,6-bifosfat DHAP: dihidroksiaseton-fosfat G3P: qliseraldehid 3-fosfat 1,3bisPGA: 1,3bis-fosfoqliserat 3PGA: 3-fosfoqliserat PPP yolu: pentoz fosfat R5P: riboz 5-fosfat. (G) və (H) -də, (C) nəzarət ns -lərini bildirir: əhəmiyyətli deyil.

Heyvan və maya hüceyrələrində, glikolitik GAPDH -nin katalitik sistein redoks modifikasiyası ilə oksidləşdirici inaktivasiyasının qlikolitik axını PPP -yə yönləndirməklə NADPH/NADP + nisbətini artırdığı göstərilmişdir (Şəkil 1E) (Ralser və b, 2007). Üstəlik, Arabidopsis ikiqatdır boşluq1 boşluq2 nokaut mutantı NADPH/NADP + nisbətinin artması ilə xarakterizə olunur (Guo və b, 2014). Tyr-Asp ilə müalicə olunan Arabidopsis bitkilərinin oxşar təsirlərə sahib olub-olmadığını və GAPC-nin inhibəsi səbəbindən qlikolitik aralıq maddələrin PPP-yə keçib-keçmədiyini yoxlamaq üçün biz Arabidopsis köklərinin böyümə mühitindən dipeptidləri götürmək üçün sübut edilmiş qabiliyyətindən istifadə etdik (Komarova). və b, 2008). Fidanlar C mövqeyində etiketlənmiş 14 C qlükoza ilə qidalandı1 və ya C.6 100 μM Tyr-Asp (Nunes-Nesi) olmadıqda və ya mövcud olduqda və b, 2005). Biz 14 CO olan dərəcələri müqayisə etdik2 karbon 1 -dən (C1) və 6 (C.6) 14 C qlükoza əlavə edildikdən sonra 35, 70 və 145 dəqiqədə (Şəkil 1F Əlavə Şəkil S2A). 14 CO2 C -dən azad olun1 həm PPP, həm də glikolizin fəaliyyəti ilə əlaqədardır, C -dən isə6 yalnız glikoliz/TCA və nəticədə C -nin aşağı olması6-C1 nisbəti daha aktiv PPP -nin göstəricisidir (Əlavə Şəkil S2A). C -də əhəmiyyətli bir azalma6-C-yə1 Tyr-Asp ilə işlənmiş nisbətdə ölçülür qarşı nəzarət fidanları G6P-nin qlikolizdən PPP-yə yönləndirilməsini müdafiə edir (Şəkil 1F). PPP aktivliyində müşahidə edilən dəyişikliklərin dəyişdirilmiş NADPH/NADP+ nisbəti ilə nəticələnib-nəticəsini araşdırmaq üçün NAD+, NADH, NADP+ və NADPH hüceyrə konsentrasiyaları saxta (H) ilə ölçüldü.2O-müalicə olunmuş nəzarət) və Tyr-Asp ilə müalicə olunmuş 10 günlük Arabidopsis şitilləri, hədəflənmiş fermentativ analizdən istifadə edərək 1 və 6 saatda maye kulturada yetişdirilmişdir (Əlavə Şəkil S2B-F). Tyr-Asp əlavəsi, NAD +, NADH və NADP + səviyyələrində əhəmiyyətli bir azalma (Əlavə Şəkil S2B – F) ilə nəticələnən NADPH/NADP + nisbətində əhəmiyyətli bir artımla nəticələndi (Şəkil 1G), lakin dəyişməmiş NADH/NAD + nisbəti (Şəkil 1H).

Nəhayət, GAPC1 və GAPCp1/2-nin YFP və GFP marker xətlərindən istifadə etdik (Munoz-Bertomeu və b, 2009 Guo və b, 2012) Tyr-Asp müalicəsi zamanı GAPDH subhüceyrəvi lokalizasiyasını və buna görə də onun ay işığı fəaliyyətini təyin etmək (Zaffagnini) və b, 2013 Schneider və b, 2018). Bununla birlikdə və ən azından təcrübə şəraitimizdə Tyr-Asp müalicəsi GAPDH hüceyrədaxili lokalizasiyasını dəyişmədi (Əlavə Şəkil S3 və S4).

Tyr-Asp əlavəsi, Arabidopsis və tütün fidanlarında oksidləşdirici stresə qarşı müqavimət göstərir

GAPDH-nin inaktivasiyası NADPH (Ralser) ilə təmin etməklə həm maya, həm də heyvan hüceyrələrində oksidləşdirici stress tolerantlığını yaxşılaşdırır. və b, 2007). Burada, Tyr-Asp ilə müalicə olunan bitkilərdə ölçülən GAPDH aktivliyindəki azalmanın oksidləşdirici stres şəraitində də üstünlük qazanıb-verməyəcəyini araşdırdıq. Hipotezimizi sınamaq üçün oksidləşdirici stress reaksiyasına səbəb olan iki agentdən istifadə etdik: hidrogen peroksid (H2O2: 50 mM) və kateşin (0.175 mM) (Scarpeci və b, 2008 Kaushik və b, 2010). Tyr-Asp qidalanma təcrübələrinə uyğun olmaq üçün sintetik MS mühitində yetişdirilən bitkilərdən istifadə etdik və sonra oksidləşdirici stress və Tyr-Asp müalicələri üçün onları maye MS mühitinə köçürdük (Metodlar bölməsinə baxın). Üstəlik, həm Arabidopsis, həm də tütün fidanlarını sınaqdan keçirdik (bir neçə təcrübədə Dataset EV1), ikincisi normal şəraitdə daha homojen bir böyümə ilə xarakterizə olunur. Bitkilər bərk MS mühitində cücərdi və təbəqələşmədən (DAS) 12 gün sonra 24 quyulu bir lövhəyə köçürüldü. Əvvəlcə fidanlar ya 100 µM Tyr-Asp ya da istehza ilə inkübe edildi (H2O) gərginliyi tətbiq etməzdən əvvəl 1 saat ərzində. Təzə çəki, böyümənin göstəricisi olaraq, Arabidopsis və tütündə müvafiq olaraq iki və dörd günlük katexin müalicəsindən sonra və 36 saat və 2 gün H.2O2 müvafiq olaraq Arabidopsis və tütündə müalicə. Tyr-Asp əlavəsi nəzarət şəraitində ümumi bitki böyüməsinə təsir etməsə də, həm Arabidopsisdə, həm də tütün fidanlarında oksidləşdirici stress rejimi altında təzə çəkinin artmasına səbəb oldu (Şəkil 2A-C və Əlavə Şəkil S5A-D). Təzə çəki artımı katexinlə müalicə olunan tütün bitkilərində yarpaq sahəsinin ölçülməsi ilə daha da təsdiqləndi (Şəkil 2C). Əhəmiyyətli olan, nə Tyr və Asp, nə də Ser-Leu və Gly-Pro test edilmiş digər dipeptidlərin birləşməsi Tyr-Aspın bioaktivliyini nümayiş etdirməmişdir (Şəkil 2A və Əlavə Şəkil S5A-D).

Şəkil 2. Tyr-Asp müalicəsi oksidləşdirici stresə məruz qalan Arabidopsis və tütün bitkilərinin böyümə performansını yaxşılaşdırır

  1. Arabidopsis və tütün şitillərinin təzə çəkisinin ölçülməsi. Fidanlar 1 saat ərzində saxta (su), Tyr-Asp (100 μM), Tyr və Asp (100 μM), Ser-Leu (100 μM) və ya Gly-Pro (100 μM) ilə əvvəlcədən müalicə edildi. əvvəl oksidləşdirici stress (kateşin və ya H2O2). Hər bir müalicə, 24 quyulu bir lövhədə (bitişik çubuqlarla təmsil olunan) yetişdirilən bitkilərə uyğun olaraq, müvafiq nəzarət ilə müqayisə edilmişdir.
  2. Katexin- (sol üst panel) və (kateşin-) Tyr-Asp ilə işlənmiş tütün bitkiləri (sağ üst panel) maye mühitdə dörd gün ərzində yetişdirilir. H2O2- (sol üst panel) və (H.2O2-) Tyr-Asp ilə işlənmiş tütün bitkiləri (sağ üst panel) iki gün ərzində maye mühitdə yetişdirilir. Stress müalicəsinə başlamazdan əvvəl bütün bitkilər 2 həftəlik idi.
  3. Tütün fidanlarından hazırlanan yarpaq seriyası, istehza və ya Tyr-Asp ilə (1 saat) əvvəlcədən işlənmiş və 4 gün ərzində kateşinə məruz qalmışdır.

Məlumat məlumatları: Məlumatlar ± SEM -in ortalamasıdır n = 10-12 (fidan). Cütləşməmiş iki quyruqlu Tələbə t- Müalicələri nəzarətlə müqayisə etmək üçün test aparıldı. Ölçü çubuğu: 10 sm.

Oksidləşdirici stres rejimlərini tamamlamaq üçün Tyr-Asp əlavəsinin duz stresi altında bitki performansına təsirini sınamaq qərarına gəldik. Yuxarıda təsvir edildiyi kimi, 12 günlük tütün fidanları ya 100 µM Tyr-Asp və ya istehza ilə inkübe edildi (H2O) duz stressini (50 mM NaCl) tətbiq etməzdən əvvəl 1 saat ərzində. Bitki performansı 6 günlük duz müalicəsindən sonra bitkilərin təzə çəkisini qiymətləndirərək ölçüldü. Yenə Tyr-Asp müalicəsi, lakin nə amin turşularının nə də digər iki sınaqdan keçirilmiş dipeptidin birləşməsi stress şəraitində bitki performansını yaxşılaşdırmadı (Əlavə Şəkil S5E və F).

Təkmilləşdirilmiş stres tolerantlığının maye mühitin istifadəsi və beləliklə dipeptidin alınması ilə məhdudlaşdığını yoxlamaq vasitəsilə həm köklər, həm də tumurcuqlar üçün qatı MS mühitinin üst-üstə düşdüyü neylon mesh üzərində yetişdirilən tütün bitkilərindən istifadə edərək katexin və duz təcrübələri apardıq (Metodlar bölməsinə baxın). İki həftəlik bitkilər əvvəlcə Tyr-Asp olan lövhələrə, sonra isə Tyr-Asp, duz və/və ya kateşin birləşməsindən ibarət olan lövhələrə köçürüldü. Bir həftəlik müalicədən sonra təzə çəki ölçüləri götürüldü (Əlavə Şəkil S6A). Tyr-Asp-in əlavə edilməsi, nəzarət şəraitində ölçülən bitki artımına heç bir təsir göstərmədi, ancaq kateşin və duz stresinə məruz qalan bitkilərdə ümumi yüksək biokütlə ilə nəticələndi (Əlavə Şəkil S6B).

Nəhayət, GAPC fəaliyyətinin Tyr-Asp inhibisyonunun Tyr-Asp müalicəsi ilə əlaqəli təkmilləşdirilmiş stres tolerantlığına verdiyi töhfəni qiymətləndirmək üçün ikiqat istifadə etdik. boşluq1 boşluq2 ikiqat nokaut mutantı (Guo və b, 2012), ümumi GAPC aktivliyinin azalmasında Tyr-Asp müalicəsində müşahidə edilənə bənzər bir təsir göstərdi (Şəkil 1B). Arabidopsis vəhşi tipli və boşluq1 boşluq2 bitkilər yuxarıda göstərildiyi kimi katexin stresinə məruz qalmışdır. Əvvəllər müşahidə edildiyi kimi, Tyr-Asp əlavəsi katexinlə müalicə olunan yabanı tipli şitillərin biokütləsini artırdı (Şəkil 3A və D Əlavəsi Şəkil S7A). Əksinə, belə bir yaxşılaşma müşahidə edilmədi boşluq1 boşluq2 mutant xətt (Şəkil 3B və E və Əlavə Şəkil S7B), Tyr-Asp ilə əlaqəli stress tolerantlığının GAPC1 və GAPC2 fəaliyyətinin inhibə edilməsindən asılı olduğunu müdafiə edir. Üstəlik, nəzarət şəraitində, boşluq1 boşluq2 mutant xətti vəhşi tiplə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə kiçik idi, katexinlə müalicə zamanı bunun əksi doğru idi (Şəkil 3C və F Əlavəsi Şəkil S7C). Nəticələrimiz, daha əvvəl bildirilən quraqlığa qarşı dözümlülüyə uyğundur boşluq1 boşluq2 mutant (Guo və b, 2012 ).

Şəkil 3. Arabidopsis stress tolerantlığının Tyr-Asp yaxşılaşması GAPC1/2 inhibisyonu ilə əlaqədardır.

  • A–C. Arabidopsis vəhşi növünün təzə çəki ölçüləri və boşluq1 boşluq2 ikiqat k.o. oksidləşdirici stresə (məsələn, kateşin) və Tyr-Asp müalicəsinə məruz qalan bitkilər. Hər bir müalicə, 24 quyulu bir lövhədə (bitişik çubuqlarla təmsil olunan) yetişdirilən bitkilərə uyğun olaraq, müvafiq nəzarət ilə müqayisə edilmişdir.
  • D–F. Nümayəndəsi Arabidopsis vəhşi tip və boşluq1 boşluq2 ikiqat k.o. müxtəlif müalicələrdən şitillər. Stressin başlanğıcında bütün bitkilər 10 günlük idi. Fidanlar 3 gün ərzində katexinə məruz qalmışdır.

Məlumat məlumatları: Məlumatlar ± SEM -in ortalamasıdır n = 10-12 (fidan). Cütləşməmiş iki quyruqlu Tələbə t- Müalicələri nəzarətlə müqayisə etmək üçün test aparıldı. Ölçü çubuğu: 10 sm. Müstəqil bir təcrübədən alınan məlumatlar (Əlavə Şəkil S7) -də göstərilmişdir.

Silikonda Tyr-Asp-in Arabidopsis GAPC1-ə bağlanmasının proqnozu, məkan baxımından yaxın iki yeri ortaya qoyur

Arabidopsis GAPC1-NAD + protein (PDB-ID 4z0h) (Zaffagnini) üçün mövcud kristal quruluşdan istifadə edərək və b, 2016), bir ifa etdik silisiumda docking təhlili. Tyr-Asp-in NAD + yaxınlığındakı iki məkana yaxınlaşacağı proqnozlaşdırılırdı: "SCT", "H", "TAT" və "R" amin turşularının qalıqları ilə əhatə olunmuş katalitik sahədə (mövqelər 148-150, 176, 179-181 və R1 zəncirinin 231) və NAD + adenozin hissəsinə yaxındır. Birinci cibdə Tyr-Asp əlaqəli K ilə birləşird 28.6 µM (Şəkil 4A – C, cib 1). "KTVDGP" (O zəncirinin ardıcıl mövqeyi 183-188) və "F", "A" və "Q" (R zəncirinin 34, 179 və 181 mövqeləri) amin turşusu qalıqları ilə örtülmüş ikinci cibdə NAD + ribonükleotid və nikotinamid hissələrinə yaxınlıq, Tyr-Asp əlaqəli K ilə bağlanırd 23.3 µM (Şəkil 4A – C, cib 2). Bundan əlavə, biz daha aşağı, lakin hələ də nəzərəçarpacaq dərəcədə bağlama effektivliyi olan alternativ bağlama cibini tapdıq (Kd 82,5 µM), əvvəlki iki cibdən nisbətən uzaqda və “VGD” (O zəncirinin ardıcıl mövqeləri 284-286) və “R”, “HGQ”, “K” və “W” amin turşusu qalıqları ilə örtülmüşdür ( mövqelər R 'zəncirinin 17, 49-51, 53 və 315) (Şəkil 4A, cib 3). Biz sonradan NAD+ molekulunu kristal strukturundan (PDB-ID 4z0h) çıxardıq, nəticədə NAD+-nın çıxarılan adenozin mövqeyində Tyr-Asp bağlandı, “I”, “SAP”, “amin turşusu qalıqlarına bağlandı. ASC "," T "," R "," NE "," Y "(mövqelər 11, 119-121, 147-149, 179, 231, 313-314 və 317, K iləd 5.1 µM Şəkil 4B). Tyr-Asp-ı S-glutatyonillenmiş GAPC1-NAD + quruluşuna bağlamaq (PDB-ID 6quq) (Berman və b, 2000 Zaffagnini və b, 2019 ) katalitik sahədə heç bir bağlama cibinin aşkar edilməməsi ilə nəticələndi və buna görə də proqnozlaşdırılan bağlanma yoxdur. GAPC1-NAD + (PDB-ID 6qun) (Zaffagnini) oksidləşmiş forması və b, 2019), K ilə katalitik cibə bağlanma üçün 13 qat azalmış yaxınlıq göstərdid 304.3 µM. Nəhayət, proqnozlaşdırılan Tyr-Asp bağlanma sahələrini Arabidopsis GAPA zülalının dərc edilmiş quruluşu ilə kiçik bir xloroplast zülalı Cp12-2 (PDB-ID 3qv1 Şəkil 4C) ilə müqayisə etdik (Marri və b, 2008 Fermani və b, 2012). Cp12-2-nin C-terminalında mövcud olan Tyr-Asp motivinin, NAD + fosfat qrupu ilə bir hidrogen bağı meydana gətirərək Tyr76 ilə GAPA/Cp12 qarşılıqlı əlaqəsinin sabitləşməsində iştirak etdiyi bildirilir. Cp12-nin C-terminal Tyr-Asp motifi, katalitik sahədə hesablanmış şəkildə bağlanmış Tyr-Asp ilə üst-üstə düşür (Şəkil 4C, cib 1). İkinci cib kimi göstərilən Tyr-Asp-in proqnozlaşdırılan bağlama mövqeyi (Şəkil 4A və C, cib 2) Cp12-2-nin qlutamik turşusu (ardıcıllıq mövqeyi 12) ilə üst-üstə düşür. Beləliklə, Tyr-Asp Cp12 bağlanmasına müdaxilə edə bilər və gələcəkdə sınaqdan keçirilməsi üçün maraqlı bir fərziyyə irəli sürə bilər.

Şəkil 4. Tyr-Asp-nin GAPC ilə bağlanmasının silisium proqnozunda

  1. GAPC1 tetramerinin (OR-dimerin dimerinin) fərqli zəncirləri və müvafiq ardıcıllıq kimliyini (O = O 'və R = R') göstərən və müəyyən edilmiş ciblərə yerləşdirilən Tyr-Asp (mavi) uyğunluqlarını vurğulayan rənglərlə səthi təqdimatı. , 1-3 etiketli, həmçinin katalitik sahə (Cys 149 və His 176 qırmızı) və NAD + (çəhrayı).
  2. NAD+ olmadan GAPC1-ə yerləşdirilmiş Tyr-Asp-in proqnozlaşdırılan bağlama uyğunluğu (lakin istinad üçün göstərilib və 4z0h, bənövşəyi rəngdən götürülüb).
  3. Steril şəkildə müdaxilə edən Cp12-2 (PDB-ID 3qv1-dən götürülmüş, karikatura boz rəngli) ardıcıl mövqedə 12-də vurgulanmış glutamik turşusu və C-terminal Tyr-Asp motivi (hər ikisi çubuq şəklində) ilə örtülmüş 1 və 2 ciblər. Tyr-Asp 1 və 2 ciblərə bağlayır.

Tyr-Asp qidalanma təcrübəsinin proteom xarakteristikası GAPC ilə müqayisədə Tyr-Asp zülalının qarşılıqlı təsirinə uyğun zülal və redoks metabolizmində dəyişiklikləri aşkar etdi.

GAPC fəaliyyətinin Tyr-Asp inhibisyonu və bununla əlaqədar NADPH/NADP + nisbətində dəyişiklik Tyr-Asp ilə əlavə edilmiş şitillərin təkmilləşdirilmiş stress müqavimətinin izahını verir. Alternativ mexanizmləri araşdırmaq üçün biz iki əlavə eksperimental strategiyaya əməl etmək qərarına gəldik. Birincisi, Tyr-Asp müalicəsi ilə əlaqəli proteom və metabolom dəyişikliklərini xarakterizə etdik. Xüsusilə, maye mədəniyyətdə yetişdirilən 10 günlük Arabidopsis şitilləri 100 µM Tyr-Asp ilə əlavə edildi və beş fərqli vaxt nöqtəsində (15, 30 dəq, 1, 6 və 24 saat) yığıldı. əvvəl hədəfsiz kütlə spektrometriyasına əsaslanan metabolomik və proteomik analizlərə. Daha əvvəl olduğu kimi, nəzarət olaraq istehza (su-) ilə işlənmiş fidanlar istifadə edilmişdir. 5257 zülalın və 201 metabolitinin statistik təhlili cəmi 212 zülal aşkar etdi, lakin yalnız üç metabolit (Tyr-Asp, Tyr və Asp-Pro) Tyr-Asp-dən əhəmiyyətli dərəcədə təsirləndi (ikitərəfli ANOVA, FDR korreksiyası ilə). P ≤ 0,05) (Şəkil 5A Dataset EV2). Müalicə olunan Arabidopsis fidanlarında ölçülən Tyr-Asp məzmunu, Tyr-Asp əlavəsindən sonra 15 dəqiqə ərzində yüksəlmiş, 1 saata çatmış, daha sonra azalma və 24 saat ərzində yığım azalmışdır (Dataset EV2). Əlavə edilən Tyr-Asp-in sürətli dövriyyəsini nəzərə alsaq, tirozin səviyyələri də Tyr-Asp qidalanması (Dataset EV2) ilə artmışdır. Ümumilikdə, Tyr-Asp müalicəsindən təsirlənən 212 zülaldan 164-ü (38-i yuxarı və 126-sı aşağı tənzimlənir) 29 funksional MapMan qutusuna (Şəkil 5B Dataset EV3) zülal və redoks metabolizmində dəyişiklikləri aşkar edir. Ribozomal alt bölmələr yuxarı tənzimlənən zülallar arasında zənginləşsə də, şaperonlar (məsələn, HSP70, HSP90.7, HSP90.1, ROF1 və CPN10) və proteazlar (məsələn, sistein proteazları RD21 və katepsin) Tyr-Asp tərəfindən aşağı tənzimlənirdi. müalicə. Bolluğun azalması redoks metabolizmində iştirak edən fermentlər üçün də ölçüldü (məsələn, tioredoksin H1 və H3, glutatyon reduktaza, ferredoksin-tioredoksin reduktaza və askorbat oksidaz). Əslində, diferensial zülalların 22-si NADP(H), o cümlədən oksidləşdirici stress reaksiyası üçün əvəzolunmaz kiçik molekul olan azaldılmış glutatyon hovuzunun doldurulmasında iştirak edən glutatyon reduktazasını bağlayır (Noctor). və b, 2018). Aşağı salınan digər zülallara amin turşusu və karbon metabolizmasının fermentləri, xüsusən plastidial G6PDH, absisik turşu reseptorları PYR1 və PYL1 və hüceyrə divarı ilə əlaqəli zülallar daxildir.

Şəkil 5. Tyr-Asp redoks və zülal mübadiləsinə təsir göstərir

  1. Tyr-Asp qidalanmasına cavab olaraq fərqli şəkildə yığılmış proteinlər və metabolitlər MeV proqramına daxil edilmiş iki tərəfli ANOVA istifadə edərək müəyyən edilmişdir (Howe və b, 2011), sonra yanlış kəşf dərəcəsi (FDR) düzəlişləri. Müvafiq olaraq 212 və üç diferensialın istilik xəritəsi təsviri (iki tərəfli ANOVA FDR düzəldilib) P ≤ 0.05) zülallar və metabolitlər beş zaman nöqtəsində. Məlumatlar jurnal kimi təqdim olunur2 nəzarət və müalicə arasında qat dəyişikliyi. Qırmızı aşağı- mavi yuxarı tənzimləməni göstərir. 1: qeyd2 qat dəyişməsi (FC) 15 dəq 2: log2 FC 30 dəq 3: qeyd2 FC 1 saat 4: qeyd2 FC 6 saat 5: qeyd2 FC 24 h M: median log2 Bütün vaxt nöqtələrinin FC.
  2. Girişin medianı2 beş vaxt nöqtəsindən hesablanmış nəzarət və müalicə arasında qat dəyişikliyi MapMan vizuallaşdırılması üçün istifadə edilmişdir (Thimm və b, 2004 ) diferensial zülalların (kvadratların) və metabolitlərin (dairələrin). Mavi yuxarı- qırmızı aşağı tənzimləməni göstərir. MapMan avtomatik təyin edilmiş binkodlar və zülallar müxtəlif hüceyrə funksiyalarına/proseslərinə təsnif edildi. Bağlama .: bağlayıcı CHO: karbohidratlar Müxtəlif .: müxtəlif Dəyişikliklər .: modifikasiya N: azot OPP: oksidləşdirici pentoz fosfat yolu Reg .: tənzimləmə S: kükürd Targ .: TCA: trikarboksilik turşu dövrü.
  3. Müxtəlif başlanğıc material mənbələrindən istifadə edərək AP təcrübələrində müəyyən edilmiş Tyr-Asp interaktorlarının Venn diaqramının müqayisəsi.
  4. AP, TPP və PROMIS təcrübələrində müəyyən edilmiş ehtimal olunan Tyr-Asp interaktorlarının Venn diaqramı ilə müqayisəsi.
  5. Sitoskop (Shannon və b, 2003) Tyr-Asp interaktomunun vizuallaşdırılması. Qovşaqlar Tyr-Asp interaktorlarını təmsil edir və kənarlar STRING verilənlər bazasından (Szklarczyk) idxal edilib və b, 2017) eksperimental, verilənlər bazası və ədəbiyyat sübutlarından istifadə edərək (0.4 olaraq təyin olunmuş bal). Funksionallıq UniProt (Apweiler və b, 2004). Bağlantısı kəsilmiş qovşaqlar şəbəkədən çıxarıldı.

Tyr-Asp qidalanma təcrübəsinin omics analizinə paralel olaraq, Tyr-Asp protein interaktomunu yenidən nəzərdən keçirdik. Əvvəllər Tyr-Asp ilə birləşdirilmiş agaroz muncuqları Arabidopsis hüceyrə mədəniyyətlərindən hazırlanmış yerli hüceyrə lizatından protein bağlayıcılarını tutmaq üçün istifadə edilmişdir (Veyel və b, 2018). Burada biz bu dəfə Arabidopsis və tütün yarpaqlarından istifadə edərək iki əlavə yaxınlıq təmizliyi (AP) təcrübəsi həyata keçirdik. Cəmi 13 və 29 zülal tütün və Arabidopsis AP təcrübələrində əvvəllər hüceyrə kulturalarından istifadə etməklə müəyyən edilmiş 108 ilə müqayisədə (Şəkil 5C Dataset EV4 və EV5) müəyyən edilmişdir. Üç siyahının Venn diaqramının üst-üstə düşməsi yalnız bir zülaldan ibarət idi, sitozolik GAPC1 (Şəkil 5C), NAD+-dan asılı GAPDH fəaliyyətinin tənzimlənməsində Tyr-Asp-nin qorunan rolunu dəstəkləyən.

AP təcrübələrini tamamlamaq üçün Tyr-Asp qarşılıqlı əlaqəsini müstəqil kiçik molekul mərkəzli bir yanaşma, yəni termal proteom profilləmə (TPP) ilə araşdırmağa qərar verdik (Savitski və b, 2014). TPP təcrübəsində, ehtimal olunan protein hədəfləri kiçik molekulların bağlanması səbəbiylə zülalın istilik sabitliyindəki dəyişiklikləri izləyərək müəyyən edilir. Arabidopsis yerli hüceyrə lizatı (işıqda yetişdirilən hüceyrə süspansiyonu mədəniyyətindən hazırlanmışdır) ya istehza ilə, ya da 10 µM Tyr-Asp ilə işlənmiş, sonra temperatur qradiyenti və proteomik analiz aparılmışdır. Tyr-Asp müalicəsi 3092 kəmiyyətləşdirilmiş zülaldan 177-nin istilik sabitliyini dəyişdirdi (Dataset EV6). Güman edilən Tyr-Asp interaktorlarının siyahısı protein metabolizması və abiotik stress reaksiyası ilə əlaqəli zülallarla zənginləşdirilmişdir: şaperonlar (məsələn, CPN10, CPN20, CPN60A), ribosom zülalları (məsələn, RPL12-C, RPL10, RPS24/35), proteazlar və peptidazalar (məsələn, CLPR3, peptidaza C15, DEG1, peptidaza M20/M25/M40) və oksidləşdirici stresdən müdafiədə iştirak edən fermentlər (qlutaredoksinlər və tioredoksinlər Əlavə Şəkil S8).

Son mərhələdə, TPP və AP təcrübələrindən ehtimal olunan Tyr-Asp interaktorlarının siyahılarını müqayisə etdik. Nəşr edilmiş PROMIS təcrübəsindən əldə edilən və ölçüyə əsaslanan fraksiya ilə Tyr-Asp ilə birlikdə ayrılan zülallardan ibarət üçüncü bir siyahını da daxil etdik (Veyel və b, 2018). Ən az iki müstəqil yanaşma ilə müəyyən edilmiş 47 zülala yüksək güvənli Tyr-Asp interaktorları kimi müraciət edirik (Şəkil 5D Dataset EV7). Bildirilən protein -protein qarşılıqlı təsirləri üçün STRING verilənlər bazasını sorğu edərək (Szklarczyk və b, 2017) və bir situasiyanı vizuallaşdırma vasitəsi olaraq istifadə etmək (Shannon və b, 2003), bir-biri ilə əlaqəli 36 zülaldan ibarət son Tyr-Asp qarşılıqlı əlaqə qurduq. Zülallar dörd funksional sinifə (i) karbon metabolizminə (GAPC1, GAPC2 və TKL1, TKL2), (ii) şaperonlara (məsələn, CPN10, CPN20), (iii) tərcümə və ATP istehsalına (məsələn, RRF, RPL12-C) qruplaşdırılmışdır. ) və (iv) protein parçalanması (məsələn, RAD23B, DSK2 Şəkil 5E).

AthPEPCK1 fəaliyyəti budaqlanmış zəncirli və qütblü amin turşusu dipeptidləri tərəfindən inhibə edilir.

Daha sonra, GAPC -nin proteogenik dipeptidlərin hədəf aldığı yeganə glikolitik/qlükoneogen ferment olub -olmadığını düşündük. PROMIS məlumat bazası (Veyel və b, 2018), Tyr-Asp-GAPDH qarşılıqlı əlaqəsinin identifikasiyasında istifadə edilir, bütün protein ayrılma aralığını əhatə edən 92 əlavə proteogenic dipeptiddən ibarətdir (Dataset EV8). Digər glikolitik/qlükoneogenik fermentlərə bağlanma ehtimalını yoxlamaq üçün PROMIS verilənlər bazasında mövcud olan bütün dipeptidlərin və bütün qlikolitik/qlükoneogen fermentlərin birgə elüsyonunu təhlil etdik. və b, 2018). Analizimiz çoxlu ehtimal olunan qarşılıqlı əlaqələri müəyyən etdi (Əlavə Şəkil S9 Dataset EV8). Diqqətimizi, fosfo qlükoneogenik fermenti ehtiva edən ortaq elusiya qruplarından birinə yönəltdikenolpiruvat karboksikinaz 1 (AthPEPCK1) və ya polar və ya dallı zəncirli amin turşularının (Ile-Gln, Ile-Ala, Phe-Gln, Leu-Thr, Ser-Tyr və Ser-Val) olması ilə xarakterizə olunan altı dipeptid qrupu. Rekombinant aktivliyi AthPEPCK1 (Rojas və b, 2019) seçilmiş dipeptidlərin artan konsentrasiyalarında təhlil edilmişdir (Şəkil 6A). Maraqlıdır ki, bütün altı sınaqdan keçirilmiş dipeptidlər inhibə edilmişdir Athilə PEPCK1 fəaliyyəti Mən0.5 ortadan yüksək mikromollara qədər dəyişən dəyərlər, Tyr-Asp üçün heç bir təsir müşahidə edilməmişdir (Şəkil 6B). Ala-Ile dipeptidi ən güclü inhibitor idi, sonra Ile-Gln, Ser-Tyr, Phe-Gln, Ser-Val və Leu-Thr. Əksinə, sınaqdan keçirilmiş amin turşularının heç biri təsir etməmişdir AthPEPCK1 fəaliyyəti (Əlavə Şəkil S10). Rekombinantın inhibisyonunu təsdiqləmək üçün AthPEPCK1, optimallaşdırılmış florometrik analizdən istifadə edərək, Arabidopsis rozetlərindən bir protein lizatında PEPCK aktivliyini ölçdük. ad hoc (Əlavə Şəkil S11). Rekombinant ferment üçün əldə edilən nəticələrə uyğun olaraq, altı dipeptidin hamısı (Ile-Gln, Ile-Ala, Phe-Gln, Leu-Thr, Ser-Tyr və Ser-Val) xam ekstraktlarda PEPCK aktivliyini Ala- Ile ən güclü inhibitor təsir göstərir, Tyr-Asp ilə heç bir təsir müşahidə edilməmişdir (Şəkil 6C).

Şəkil 6. AthPEPCK1 aktivliyi dipeptidlər tərəfindən inhibə edilir

  • A, B. Rekombinant AthPEPCK1 aktivliyi altı fərqli H-P dipeptid (A) və ya Tyr-Asp (B) artan konsentrasiyalarında ölçüldü. Mən0.5 dəyərlər hər bir qrafikdə göstərilir. Ölçmələr Metodlar bölməsində təsvir olunduğu kimi dekarboksilləşmə istiqamətində aparılmışdır. Məlumatlar dəyişdirilmiş Hill tənliyinə uyğunlaşdırılmışdır. 1 dəyəri 4,3 ± 0,2 U mg −1 aktivliyinə uyğundur. Məlumatlar 4 müstəqil ölçünün ± SEM ortalamasıdır.
  • C. PEPCK aktivliyi müxtəlif dipeptidlərin 500 µM olmaması (nəzarət, C) və ya mövcudluğu ilə 3 həftəlik Arabidopsis yarpaqlarından hazırlanmış protein lizatında ölçüldü. Ölçmələr, Metodlar bölməsində göstərildiyi kimi, karboksilasyon istiqamətində həyata keçirildi. Məlumatlar 4 müstəqil lizat preparatının ± SE orta göstəricisidir. Cütləşməmiş iki quyruqlu Tələbə t-dipeptid müalicələrini nəzarət ilə müqayisə etmək üçün testlər aparılmışdır.

Müzakirə

Bu yazıda biz zülallar, transkriptlər və metabolitlər arasında qarşılıqlı təsirlərin geniş çeşidli seçilmiş resursları ilə multi-omik məlumat dəstlərini inteqrasiya edərək sistematik şəkildə mexaniki fərziyyələr yaratmaq üçün analiz boru kəməri olan COSMOS təqdim edirik.

Əvvəlcə TF, kinaz və fosfataz aktivliklərinin ayaq izinə əsaslanan analizdən istifadə edərək transkriptomika və fosfoproteomika məlumatlarından necə ardıcıl olaraq qiymətləndirilə biləcəyini göstərdik. Bu, gələcək mexaniki kəşfiyyatdan əvvəl kritik bir addımdır. Həqiqətən də, transkript və fosfozit ümumiyyətlə uyğun funksional anlayışlar verir, çünki müvafiq protein aktivliyi ilə əlaqələri ümumiyyətlə yaxşı xarakterizə edilmir. Bununla belə, onların bolluğunu tənzimləyən yuxarı axın zülallarının fəaliyyəti haqqında məlumat verə bilirlər. Beləliklə, kinazaların, fosfatazaların və TF-lərin funksional vəziyyəti onların məlum hədəflərinin, yəni molekulyar izlərinin müşahidə olunan bolluq dəyişikliyinə əsasən qiymətləndirilir. Bu yanaşma sayəsində biz eyni zamanda şişlərdə zülalların funksional vəziyyətini siqnal yolu və transkripsiya tənzimləməsi səviyyəsində xarakterizə edə bildik. Hipoksi reaksiyasının, iltihab yolunun və onkogen genlərin əsas aktyorlarının funksional vəziyyətlərində xüsusilə güclü dəyişikliklər olduğu təsbit edildi. HIF1A, EPAS1, STAT1/2, MYC,CDK2. İtkisi VHL ccRCC-nin əlamətidir və sabitliyi ilə birbaşa bağlıdır HIF (HIF1AEPAS1) analizlərimizlə tənzimlənməmiş zülallar (Maxwell və b, 1999 İvan və b, 2001 Jaakkola və b, 2001). Təhlilimizdə tənzimlənməmiş ccRCC-nin bu müəyyən edilmiş imzalarının tapılması bu yanaşmanın etibarlılığının təsdiqidir.

Daha sonra tənzimlənməmiş protein fəaliyyətləri və metabolit konsentrasiyalarını əlaqələndirən potensial mexanizmləri sistematik şəkildə tapmaq üçün siqnalizasiya, transkripsiya və maddələr mübadiləsini əhatə edən yeni bir meta nedensel Əvvəlki Məlumat Şəbəkəsi ilə COSMOS tətbiq etdik. Bildiyimizə görə, bu üç omik təbəqəni səbəbli əsaslandırmadan istifadə edərək sistematik şəkildə birləşdirmək üçün ilk cəhddir. Multi-omics kəmiyyət məlumatları ilə siqnal yollarını öyrənən əvvəlki üsullar (Drake və b, 2016) TF-ləri kinazlarla birləşdirdi, lakin onlar TieDIE alqoritminin əvvəlcədən seçilmiş yerli əlaqəli alt şəbəkəsi ilə məhdudlaşdırıldı. Metabolik məlumatlar ilə birlikdə qlobal nedenselliyin tətbiqi, müxtəlif tənzimləyici səviyyələrdəki zülallar və metabolitlər arasındakı əlaqələrin birbaşa mexaniki şərhini əldə etməyə imkan verir. Bizim yanaşmamızın məqsədi, mümkün qədər çox tənzimlənməmiş zülal fəaliyyəti və metabolit konsentrasiyalarını birləşdirən bu cür mexanizmlərin ardıcıl dəstini tapmaqdır. COSMOS -un istifadəsi xüsusilə maraqlıdır, çünki molekul cütləri (zülallar və metabolitlər) arasında təklif olunan bütün mexanizmlər təkcə öz cüt qarşılıqlı təsirləri kontekstində deyil, həm də modelə daxil etmək istədiyimiz bütün digər molekullar baxımından inandırıcı olmalıdır. Məsələn, təklif olunan aktivləşdirmə MYC tərəfindən NFKB1MAPK1 tərəfindən daha da dəstəklənir STAT3 aktivləşdirmə, çünki MAPK1 aktivləşdirdiyi də məlumdur STAT3. Beləliklə, əhəmiyyətli dərəcədə tənzimlənməmiş protein fəaliyyətləri və metabolitləri ilə bu cür əsaslandırmanı bütün PKN -ə qədər genişləndirmək üçün COSMOS inkişaf etdirdik. Biz CARNIVAL R paketi (Liu və b, 2019b) məlumatlarımızla bu PKN -ni kontekstləşdirmək. Bu çox böyük PKN -ni idarə etmək üçün optimallaşdırma prosedurunu təkmilləşdirdik və başqalarının öz məlumatları ilə istifadə etmələrini asanlaşdırmaq üçün bir R paketi hazırladıq. Tənzimlənməmiş TF-lər, kinazlar/fosfatazlar və ya metabolitlər dəstini nəzərə alaraq, COSMOS istifadəçilərə digər omik təbəqələrdən yuxarı axın tənzimləyiciləri ilə verilmiş omiks qatında müşahidə edilən dəyişiklikləri izah etmək üçün bir sıra əlaqəli mexaniki fərziyyələr təqdim edir. Beləliklə, məqsədi yeni təcrübələrin nəticəsini açıq şəkildə proqnozlaşdırmaq deyil, ölçülmüş məlumatları əvvəlki biliklərlə ardıcıl və sistemli şəkildə birləşdirməkdir.

İnterferon qamma cavab yolu COSMOS şəbəkə həllində ən çox təmsil olunan xərçəng nişanəsi olduğundan, bu yolun üzvlərini birləşdirən mexanik hipotezin aktuallığını daha da araşdırdıq. Şəbəkə arasında çarpazlaşmalar olduğunu göstərdi MAPK1, NFKB1, MYC, HIF1A,YY1 glutaminin tənzimlənməsini və azalmış glutatyon metabolizmasını, həmçinin inosin, hipoksantin və adenin izah edə bilər. Bunlar ccRCC -də vacib qarşılıqlı təsirlər olduğu üçün xüsusilə aktual idi. MYC və glutamin metabolizması ccRCC (Shroff) üçün maraqlı bir terapevtik hədəf kimi görünür və b, 2015 ). YY1 bilinən dolayı inhibitorudur MYC xərçəng inkişafında iştirak edir (Austen və b, 1998). COSMOS şəbəkəsi göstərdi YY1 -nin aşağı tənzimlənməsində də potensial rol oynaya bilər ADAPNP metabolik ferment fəaliyyəti. Uyğun olaraq, PNP aşağı tənzimlənən metabolik fermentlərdən gözlənilən ccRCC hüceyrə xətlərində vacib olmadığı göstərilmişdir (Gatto və b, 2015). Bundan əlavə, COSMOS tərəfindən göstərilən əlaqə arasında NFKB1MYC xərçəng müalicəsində arsenitin (kimyaterapiyada istifadə olunan bir dərman) rolu səbəbiylə ccRCC müalicəsinə təsir edə bilər (Huang və b, 2014). Bundan əlavə, aktivləşdirilməsi NFKB1-MYC keçid edin FBW7-çatışmaz hüceyrələr, onları Sorafinibə (a MEK-Raf inhibitor), ilkin böyrək xərçənginin müalicəsində istifadə olunan bir dərman (Huang və b, 2014). Əlavə olaraq, NFKB1MYC hər ikisi də perspektivli ccRCC müalicə hədəfləridir (Peri və b, 2013 Bailey və b, 2017). COSMOS tərəfindən göstərilən əlaqə KMT2A və adenozin maraqlıdır, çünki KMT2A bir sıra cCRCC xəstələrində mutasiyalar bildirilmişdir (Yan və b, 2019), bu fermentin ccRCC inkişafında funksional rol oynaya biləcəyini irəli sürür. Bundan əlavə, ən azı in vitro olaraq, bazal fosfo- səviyyəsi aşağı olan ccRCC hüceyrə xətlərinin olması təklif edilmişdir.AKT adenozin analoqu ilə müalicəyə həssas idi (Kearney və b, 2015). Arasındakı əlaqə Bəli1, MAPK1,SMAD4 COSMOS şəbəkəsində bunu nəzərə alaraq xüsusilə aktualdır Bəli1 bilinən hədəflənən onkogendir (Hamanaka və b, 2019). Bu nümunələr, COSMOS -un çoxlu omics məlumatları və əvvəlki bilikləri birləşdirərək xərçəngin müalicəsini başa düşmək və potensial olaraq yaxşılaşdırmaq üçün mexaniki hipotezlər çıxarma qabiliyyətini göstərir.

Bununla belə, qeyd etmək lazımdır ki, COSMOS yalnız eksperimental olaraq daha da araşdırmaq üçün fərziyyələr təqdim etmək məqsədi daşıyır. COSMOS müəyyən bir kontekstdə baş verə biləcək bütün molekulyar qarşılıqlı təsirləri təkrarlamaq məqsədi daşımır. Hal -hazırda, COSMOS, mövcud məlumatları və əvvəlki məlumatları nəzərə alaraq, çoxlu ardıcıl mexanik hipotezlər təqdim edir. Bunun mürəkkəb bir çox omik məlumatlarının təfsirini asanlaşdırdığını və bioloji sualların araşdırılmasına rəhbərlik etdiyini iddia edirik.

Performansları və yanaşmamızın möhkəmliyini qiymətləndirdik. TF və kinaz fəaliyyətlərinin bir şişə spesifik korrelyasiya şəbəkəsini hesabladıq və COSMOS-un proqnozlaşdırdığı ortaq tənzimləmə ilə müqayisə etdik. Bu, qeyri -kamil olsa da, COSMOS -un təklif etdiyi mexanizmlərin - hər hansı bir bənzər vasitənin mexanizmləri kimi - hipotezlər olduğunu vurğulayaraq cəsarətli nəticələr verdi. İnteqrasiya etmək üçün daha çox omics məlumatının əlavə edilməsinin daha çox fərziyyələr yaratmağa və onları bir -birinə bağlamağa imkan verdiyini, lakin onların proqnozlaşdırıcı performanslarını yaxşılaşdırmadığını vurğuladı.

COSMOS -un proqnozlarında bilinən üç əsas məhdudiyyət var. Birincisi, giriş məlumatları natamamdır. Bütün potensial fosfositlərin və metabolitlərin yalnız məhdud bir hissəsi kütləvi spektrometriya ilə aşkar edilir. Bu o deməkdir ki, ölçülməmiş şəbəkənin PKN hissəsinin əhəmiyyətli bir hissəsi haqqında heç bir məlumatımız yoxdur, analizlərdə saxlanılır və dəyərlər ara "gizli dəyərlər" olaraq qiymətləndirilir. İkincisi, TF, kinaz və fosfatazlar və onların hədəfləri arasında bütün tənzimləyici hadisələr məlum deyil və fəaliyyətin qiymətləndirilməsi yalnız məlum tənzimləyici əlaqələrə əsaslanır. Beləliklə, bir çox TF, kinaz və fosfataz daxil edilməmişdir, çünki onların heç bir tənzimləyici qarşılıqlı təsiri yoxdur və ya məlumatlarda aşkar edilmiş substratlar yoxdur. Üçüncüsü, və əksinə, COSMOS, əsl mexanizm ola bilməyəcək mövcud biliklər daxilində ehtimal olunan izahlar tapacaq.

Bu problemlər əsasən bu metodda əvvəlki biliklərə verilən əhəmiyyətdən irəli gəlir. Əvvəlki biliklər əslində natamam olduğu üçün, təkmilləşdirmənin növbəti addımları, əvvəlki biliklərin qatqısı ilə müşahidə olunan məlumatlardan çəkiyə qədər daha çox məlumat əldə etməyin yollarını tapmaqdan ibarət ola bilər. Məsələn, OmniPath kimi verilənlər bazalarında mövcud olan qarşılıqlı təsirləri ölçmək üçün transkriptlər, fosfositlər və metabolitlər arasındakı korrelyasiyadan istifadə etmək olar. Əhəmiyyətli odur ki, aktiv molekullara aid olan hər hansı digər omiklər (miRNA-lar və ya metabolik ferment axını kimi) iz yanaşmaları (məsələn, DNT əlçatanlığı və ya fosforlaşmadan başqa PTM-lər) vasitəsilə zülal fəaliyyətini qiymətləndirmək üçün istifadə edilə bilər (məsələn, fosforlaşmadan başqa) döş xərçəngi məlumat dəstinin fluksomikası). Üstəlik, COSMOS toplu omics məlumat dəstləri ilə işləmək üçün hazırlanmışdır və bu yanaşmanı tək hüceyrəli məlumat toplusuna tətbiq etməyin yollarını tapmaq çox maraqlı olacaq. COSMOS-a məlumat gətirən ayaq izi üsulları, bir hüceyrəli RNT məlumatlarının, məsələn, məktəbdən çıxma kimi xüsusiyyətlərinə görə olduqca cəlbedici görünür. və b, 2020). Əvvəlki biliklərin əhəmiyyəti ilə əlaqədar olaraq, PKN molekulyar qarşılıqlı təsirlər haqqında əldə etdiyimiz məlumatları necə şərh edəcəyimizdən də asılı ola bilər. Xüsusilə, Recon3D -nin reaksiya şəbəkəsini metabolit reaktivlərinin metabolik fermentləri, metabolik fermentlərin isə metabolit məhsullarını "aktivləşdirdikləri" səbəbli bir şəbəkəyə çevirdik. Bu ilk təxmin, metabolitlərin bolluğunun yalnız onların istehsal dərəcələri ilə idarə olunduğunu güman edir. Biz metabolit bolluğunun istehlak nəticəsində də dəyişə biləcəyini nəzərə almaq üçün gələcəkdə bunu dəqiqləşdirməyi planlaşdırırıq. Nəhayət, gələcəkdə məlumat istehsal texnologiyalarının əhatə dairəsini artıracağını və əvvəlki biliklərimizin daha da dolğunlaşacağını və qeyd olunan məhdudiyyətləri azaldacağını gözləyirik. Bu arada biz inanırıq ki, COSMOS artıq multi-omika tədqiqatlarından səbəb-nəticə mexaniki anlayışları çıxarmaq üçün faydalı bir vasitədir.


ABE fermentasiyası üçün fermentasiya proseslərinin təkmilləşdirilməsi

Mikrob səviyyəsindəki dəyişikliklərdən başqa, fermentasiya prosesinin özü, butanol toksisitesini azaltmaq və butanol istehsalını artırmaq üçün başqa bir təsirli strategiyadır. Hazırda ABE fermentasiyasının səmərəliliyini daha da artırmaq üçün yuxarı və aşağı axın proseslərinə kapital qoyuluşunu, xammal istehlakını və enerji tələbatını müəyyən edən müxtəlif fermentasiya prosesləri hazırlanmışdır.

Mədəniyyət şəraitinin optimallaşdırılması

Ekzogen əlavələrin ABE fermentasiyasına təsiri

Metabolik yola və fizioloji xüsusiyyətlərə görə, müxtəlif üzvi turşular (məsələn, asetat, butirat, amin turşuları və laktik turşu) butanol istehsalı üçün alternativ substrat kimi xidmət edə bilər və sonra solventogen və solventogenez fazasında əlaqəli fermentlərin möhkəm ifadəsini qoruya bilər. [169, 170]. Maraqlıdır ki, butirat yeganə karbon mənbəyi olanda cəmi 0,2 q/l butanol istehsal olunurdu, lakin həm butir turşusu, həm də qlükoza mövcud olduqda butanolun istehsalı əhəmiyyətli dərəcədə artaraq 10 q/L-ə çatır, bu isə butir turşusunun mühüm amil ola biləcəyini göstərir. həlledici istehsalının tetiklenmesi [171]. Daha da əhəmiyyətlisi, qlükoza konsentrasiyası, butirik turşu əlavə edilməsi və C/N nisbətinin optimallaşdırılmasından sonra butanol və ABE istehsalının miqdarı daha da artırılaraq 17 g/L və 21.71 g/L səviyyəsinə çatdı. C. acetobutylicum YM1 [172, 173].Eynilə, 30 mM ammonium asetatın əlavə edilməsi ilə fermentasiya müddəti C. acetobutylicum EA təxminən 12 saat qısaldıldı və butanolun məhsuldarlığı 8,3 -dən 13 q/L -ə yüksəldi [174].

Ümumiyyətlə, kritik misel konsentrasiyasına əsaslanaraq, səthi aktiv maddələr öz-özünə birləşərək misellərə daxil ola bilər və sonra butanolu misellərə bağlayaraq mikroorqanizmlərə qarşı butanol toksisitesini aradan qaldıra bilər. Sonda, ABE fermentasiyasının performansını əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırmaq üçün səthi aktiv maddə əlavə edildi. Butanol, mikroorqanizmlərə toksikliyini azaltmaq üçün butanol istehsalını artırmaq üçün səthi aktiv maddə ilə örtülmüşdür. Məsələn, qeyri-ion səthi aktiv maddənin [3% (h/v) L62] əlavə edilməsi ilə butanolun və istehsal olunan ümumi həlledicilərin miqdarı müvafiq olaraq 15,3 q/L və 21 q/L-ə yüksəlmişdir ki, bu da müvafiq olaraq 43 % təşkil etmişdir. (w/w) və 55% (w/w), nəzarətdən daha yüksəkdir. Daha maraqlısı, səthi aktiv maddəni 9 saata əlavə etdikdə, bütanol və ümumi həlledicinin məhsuldarlığı 0,13 g/L/saat və 0,17 g/L/saatdan 0,31 q/L/saat və 0,39 g/L/saata yüksəldi, müvafiq olaraq [175]. Eyni şəkildə, sinklə əlavə edilmiş/maqnezium aclığı olan birləşdirilmiş fermentasiya mühiti də çoxsəviyyəli modulyasiya vasitəsilə mərkəzi karbon mübadiləsini effektiv şəkildə yaxşılaşdıra bilər, məsələn, qlikolitik yolun yuxarı tənzimlənməsi, tiolaza, butiraldehid dehidrogenaz və butanol dehidrogenazda yuxarı tənzimləmə və aşağı- spirt dehidrogenazda tənzimləmə və daha sonra qlükoza istifadəsini yaxşılaşdırmaq, etanol istehsalını azaltmaq və əvvəllər induksiya edilmiş solventogenez, butanolun istehsalını 11,83-dən 19,18 q/L-ə qədər artırmışdır [176].

ABE fermentasiyası üçün qarışıq becərmə

ABE fermentasiyasının iqtisadi məqsədəuyğunluğunu daha da artırmaq üçün müxtəlif mikroorqanizmləri olan qarışıq mədəniyyətlər hazırlanmışdır: (1) substratların çeşidini genişləndirmək [177] (2) aralıq məhsulların mövcudluğunu artırmaq [178, 179] və (3) ciddi anaerob şəraitin saxlanması xərcləri [180]. Məsələn, bahalı fermentativ hidroliz mərhələsini aradan qaldırmaq üçün qarışıq mədəniyyət C. termocellumC. acetobutylicum 5,8 q/l butanol istehsal etmək üçün 40 q/l sellüloza birbaşa istifadə olunduğu ABE fermentasiyası üçün istifadə edilmişdir [181]. Eyni şəkildə qarışıq bir mədəniyyət C. acetobutylicumB. subtilis bahalı azaldıcı maddələrin tətbiqini azaltmaq üçün anaerobik müalicə edilmədən, 14.9 q/L bütanol istehsal edildi ki, bu da təmiz bir mədəniyyətdən 21.1% yüksəkdir. C. acetobutylicum [182]. Bununla birlikdə, köçürmə/alt-kulturasiya addımlarının sayı artdıqda, bir bakteriyofajla yoluxma ehtimalının artması, ortaq mədəniyyət sistemlərinin sənaye tətbiqini məhdudlaşdıran əsas çatışmazlıq halına gəldi.

ABE fermentasiyası üçün oksidləşmə-reduksiya potensialının (ORP) tənzimlənməsi

Şəkil 1-də göstərildiyi kimi, yüksək səviyyəli NADH aseton əmələ gəlməsinin azalması hesabına butanol istehsalını gücləndirir və bu, hüceyrədaxili redoks balansının molekulyar səviyyədə və ya fermentasiya prosesində manipulyasiya edilməsinin daha çox karbon axını və enerjini butanol istehsalına yönəldir [183, 184].

Redoks balansı üçün hüceyrədaxili tənzimləyicilər

Klostridiya üçün elektron axını əsasən ferredoksin/hidrogenaz qovşağında tənzimlənir, belə ki, hidrogenaz fəaliyyətinin azaldılması molekulyar hidrogen əmələ gəlməsini təsirli şəkildə maneə törədə bilər və NAD (P) + hovuzunun bərpası səbəbindən elektron axını butanola doğru yönəldə bilər [185]. Buna görə də, NADH-dən çox asılılıq adhE2, redoks balansını təsirli şəkildə tənzimləyə və sonradan butanol istehsalını daha da yaxşılaşdıra bilər [80]. Eynilə, redoks hiss edən bir protein və transkripsiya tənzimləyicisi olan Rex, hüceyrədaxili NADH/NAD + dəyişməsinə qarşı butanol yollarında iştirak edən genlərin ifadəsini təsirli şəkildə tənzimləyə bilər. Nəticədə, Rex mənfi bir mutant, yan məhsul olaraq daha az hidrogen və aseton ilə daha çox miqdarda etanol və butanol istehsal etdi [186].

Bioproses mühəndisliyi

Genetik modifikasiyanın yorucu vəzifəsi ilə müqayisədə, bioproses mühəndisliyi (məsələn, NADH sintezini gücləndirmək üçün elektron daşıyıcısı əlavə etmək və ya hidrojenazları basdırmaq üçün CO ilə havalandırmaq kimi) ətraf mühitə və hüceyrədaxili ORP -yə dərhal təsir göstərərək araşdırıla bilər [187]. Bu məqsədlə, turşulardan spirtlərə karbon axını təmin etmək üçün bəzi süni elektron daşıyıcıları (metil viologen və neytral qırmızı kimi) əlavə edildi: 2 q/L Na əlavə etməklə2BELƏ Kİ4 (bir elektron reseptor) butanol istehsalını əhəmiyyətli dərəcədə artırdı, bu da 12,96 q/l-ə çatdı, bu da nəzarətdən 34,8% yüksəkdir [188]. Eyni şəkildə, 85% N qarışığı olduqda2 və ABE fermentasiyası zamanı 15% CO səpildi, hidrogenaza aktivliyi və elektron ötürülməsi effektiv şəkildə yatırıldı, lakin hüceyrə NAD(P)H hovuzu əhəmiyyətli dərəcədə artdı və butanolun istehsalını 4,8-dən 7,8 q/L-ə qədər yaxşılaşdırdı [189]. Daha maraqlıdır ki, ABE fermentasiyasının ORP - 290 mV -də tənzimləndikdə, həlledici məhsuldarlığı 35%artıraraq həlledici istehsalına daha erkən başlamaq olardı, lakin butanol məhsuldarlığı ORP nəzarəti olmadan [190] ilə müqayisədə cüzi artırıldı.

Fermentasiya prosesinin optimallaşdırılması

Yüksək hüceyrə sıxlığı fermentasiya

Aerobik fermantasyonlarla müqayisədə, clostridia ilə fermentasiyalar əla spesifik karbon axınlarına malikdir [103], lakin aşağı hüceyrə sıxlığından əziyyət çəkirlər [600 nm -də 10-11 ətrafında maksimum absorbans (A600)] məhsulun inhibisyonu, bəzi naməlum kvorum algılama mexanizmi və ya uyğun olmayan bioreaktor əməliyyatı səbəbiylə [191,192,193]. Bu məqsədlə, substratı və məhsul inhibisyonlarını yüngülləşdirərək yüksək hüceyrəli sıxlıqlı bir fermentasiya həyata keçirmək üçün müxtəlif fermentasiya prosesləri (məsələn, immobilizasiya olunmuş hüceyrə, toplu, qidalanmış və davamlı) hazırlanmışdır [Cədvəl 4].

Qidalanmış partiya və partiya fermentasiyaları ilə müqayisədə (məhsulun inhibisyonu və əhəmiyyətli işləmə müddəti ilə xarakterizə olunur) və bir neçə çatışmazlıqlara (yüksək kapital dəyəri, fag çirklənməsi və bakteriya böyüməsinin flokulyasiyası kimi) baxmayaraq, davamlı proseslər (sərbəst hüceyrələrdən, immobilizasiya edilmiş hüceyrələrdən istifadə etməklə, və hüceyrə geri çevrilməsi) ticari sənaye ABE istehsalı üçün daha cəlbedici və məhsuldar bir alternativ təklif edir. Müxtəlif üstünlüklərə sterilizasiya və təkrar peyvənd vaxtlarının azaldılması, yüksək məhsuldarlıq və daha az substrat və butanol inhibələri daxildir [194]. Məsələn, membran hüceyrə təkrar bioreaktorunun köməyi ilə yüksək hüceyrə sıxlığı davamlı ABE fermentasiyası C. acetobutylicum BKM19 optimal əməliyyat şəraitində həcm məhsuldarlığı 10,7 və 21,1 q/s, hasilatı 11,9 və 23,5 q/l, məhsuldarlığı isə 0,17 və 0,34 q/s olan butanol və ABE istehsalı üçün həyata keçirilib. vəziyyət [195]. Ümumiyyətlə, & gt 10 g/L/h, & gt 10 g/L butanol və 0.44 g/g-ə qədər məhsuldarlıq yüksək hüceyrə sıxlığı olan bir fermentasiya ilə əldə edilə bilər ki, bu da ABE fermentasiyasında böyük uğurdur. Clostridium [196, 197].

Yerində məhsulun bərpası (ISPR) üsulları

Butanolun toksikliyini daha da yüngülləşdirmək üçün daha yüksək butanol məhsuldarlığı üçün fermentasiya prosesi ilə inteqrasiya etmək üçün pervaporasiya, adsorbsiya, maye-maye ekstraktı və qazın çıxarılması daxil olmaqla bir neçə yerində məhsulun bərpası (ISPR) üsulları da hazırlanmışdır [198,199,200,201,202] (Cədvəl 5) . Məsələn, qidalı partiyalı fermentasiya və qazın çıxarılmasının birləşməsi ilə ümumi həlledicinin istehsalı, məhsuldarlığı və məhsuldarlığı müvafiq olaraq 233 q, 1,16 q/L/saat və 0,47 q/q-a qədər yüksəlmişdir [203]. Bununla birlikdə, butanol istehsalı üçün hər bir bərpa sisteminin bir çox üstünlükləri və mənfi cəhətləri var (Cədvəl 5). Ters osmos iqtisadi baxımdan ən çox seçilən bərpa üsulu kimi görünsə də, membranın tıxanmasına və ya çirklənməsinə meyllidir [204]. Bu yaxınlarda bir sıra yeni kompozit membranlar (FAS-a bağlı əlaqəli PDMS [205], PDMS əsaslı pervaporasiya membranları [206], ionlu maye ilə modifikasiya edilmiş qrafem oksidi [207] və qarışıq matris membranlar [208]) hazırlanmış və ISPR texnikasına tətbiq edildi və ABE fermentasiyasının uzun müddət davamlı işləməsi zamanı daha sabit bir performans göstərdi [24]. Daha da əhəmiyyətlisi odur ki, ideal inteqrasiya olunmuş bərpa prosesi enerji istehlakını minimuma endirməli və butanol yüksək seçiciliklə konsentrasiya etməlidir, buna görə də fərdi proseslərin müvafiq çatışmazlıqlarını kompensasiya etmək üçün hibrid inteqrasiya olunmuş bərpa prosesləri hazırlanmışdır və sənaye ABE fermentasiyası üçün yaxşı potensial nümayiş etdirmişdir [191, 209] .


Materiallar və metodlar

Qidalanma performansı

Tədqiqat 2004-cü il iyunun əvvəlindən iyulun əvvəlinə qədər Kanadanın cənubunda, Ontarioda aparılmışdır. Orta (± s.e.m) gündəlik yüksək temperatur 23,2±0,65°C olmuşdur. Bu dövrdə yem bol idi. Təcrübənin başlanğıcında müşahidə kovanına qoyduğumuz boş pətək 29 gün sonra 100% dolmuşdu. Tam çərçivə kütləsinin 4,5 kq olduğunu nəzərə alsaq (Sammataro, 1998), bu, gündəlik çəki kütləsinin ortalama 155 q artımına uyğundur. Yeni bağlanmış arıları qeyd etdik (Apis mellifera L.) ayrı-ayrılıqda nömrələnmiş etiketlərlə və təxminən 2000 arı olan iki çərçivəli bir müşahidə şanına təqdim etdi. Arıların bir neçə gün ərzində yem axtarmağa başlaması üçün 3 gün ara ilə dörd dəfə 80 arı təqdim etdik.

İlk arı kohortunu təqdim etdikdən iki həftə sonra biz artıq yem axtarmağa başlamış bir neçə arı çıxardıq və məlumatların qeydinə başladıq. Pətəkdən ayrılan və pətəyə daxil olan bütün arılar şəffaf Pleksiqlas tunelindən keçirdilər. İşarələnmiş arılar yan tunelə yönəldilmiş, qəfəsə salınmış və 0,1 mq dəqiqliklə analitik tərəzidə çəkilmişdir. Balans, arının ağırlığını və günün vaxtını kompüterə bildirdi və arı kimliyini, səyahət istiqamətini və polen daşıyıb daşımadığını əlavə etdik. Biz arı fəaliyyətinin başlanğıcından səhər saat 18:00-a qədər ardıcıl 20 gündə, heç bir yem axtarışı olmadan bir yağışlı günü atlayaraq məlumatları qeyd etdik. Təcrübənin sonunda, məlumat toplusunu yalnız 5 dəqiqədən daha uzun səfərlər daxil etmək üçün redaktə etdik. Arıların yem axtarmağa başlayacaqları üçün oriyentasiya səfərləri olduğunu düşünərək bütün qısa səfərləri buraxdıq (Capaldi və digərləri, 2000 Dukas və Visscher, 1994 Ribbands, 1953). Hər bir yem gəzintisi üçün, səyahət müddətini min ilə, yemin kütləsini mq ilə və yem müddətini hesablayırıq ki, səfər müddətində yem kütləsi olaraq təyin olunur.

Eyni zamanda, giriş və çıxışlar proteomik və enzimatik analizlər üçün istifadə edilən ayrıca işarələnmiş bal arıları dəstində monitorinq edildi. Bu arılar dörd müxtəlif həyat mərhələsində toplanmışdır: pətək arıları (11-15 günlük), gənc yem toplayanlar (2 günlük yemləmə təcrübəsi), yetkin yem toplayanlar (4-11 gün yemləmə təcrübəsi) və köhnə yemçilər (≥12 gün yem axtarma). təcrübə). Toplandıqdan sonra arılar buzun üstünə qoyuldu və yalnız döş qəfəsi saxlanması üçün parçalandı. Torakslar dərhal maye azotda donduruldu və gələcək analizlər üçün -80°C-də saxlanıldı.

Qidalanma performansı ilə ömrü arasında müsbət bir əlaqənin olub olmadığını yoxlamaq üçün eyni arıların həyatları boyunca davranışlarını müqayisə etmək çox vacib idi. Beləliklə, nəşr olunan metodlardan sonra (Dukas və Visscher, 1994), əsas statistik təhlildə ən az 7 gün ərzində ovlanan 24 arı tərəfindən ilk 7 gün ərzində ərzaq çatdırılma nisbətləri haqqında məlumatların toplanması üzrə ANOVA tədbirləri daxil edilmişdir. Bu 24 arıdan yalnız dördü yem axtarış səfərlərinin ən azı yarısında polen topladı, bu da polen toplayanların ətraflı təhlilinə mane oldu. Yaşlanmanın təsirini qiymətləndirmək üçün ən az 12 gün aralanan 14 arının fəaliyyətinin ikinci analizini apardıq. Nümunə ölçüləri 12 günlük yem təcrübəsindən sonrakı analizlər üçün kifayət etməmişdir.

İki ölçülü elektroforez və proteom analizi

Doqquz pətək arı və doqquz yetkin ovçunun oxşar ölçülü torakal bölmələri [kütləvi = 27.0 ± 0.6 mq və 26.3 ± 0.1 mq (ortalama ± sem)] 500 μl buzlu soyuq iki ölçülü gel lizis tamponunda [ətraflı şəkildə başqa yerdə(Smith et al., 2005)] motorlu hopdurucu homogenizatordan istifadə etməklə. Homojenat santrifüjlə aydınlaşdırıldı (18000 g, 5 dəqiqə ərzində 4°C-də) və supernatant kommersiyada mövcud olan protein duzsuzlaşdırma sütunlarından (Pierce, Rockford, IL, ABŞ) istifadə edərək duzsuzlaşdırıldı.

Hər homogenatdan 200 μg ümumi protein iki ölçülü (2D) gel elektroforezi ilə həll edildi. Bütün 2D elektroforez, istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Investigator ™ elektroforez sistemi (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI, ABŞ) və əvvəlcədən hazırlanmış rehidratasiya/solubilizasiya, tarazlıq və işləyən tamponlardan istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. Qısaca olaraq, birinci ölçü pHiash (pH 3-10) immobilizasiya olunmuş pH qradiyenti (IPG) zolaqlarında, pHaser izoelektrik fokuslama aparatından, cəmi 100 000 volt-saat üçün əvvəlcədən proqramlaşdırılmış rampa gərginlik rejimindən istifadə etməklə həll edilmişdir. Trycine kimyasında həll edildi/Investigator ™ (Ann Arbor, MI, ABŞ) 2D tökmə və işləyən aparatında işləyən 10% duracryl lövhə jelləri yenidən əvvəlcədən proqramlaşdırılmış gərginlik rejimindən istifadə edərək həll edildi. Elektroforezdən sonra jellər su, metanol və sirkə turşusu ilə sabitləndi (jel ləkəsi ilə verilən təlimatlara uyğun olaraq) və sonra SYPRO-yaqut ləkəsi (Genomic Solutions) ilə boyandı. Ləkələnmiş gellərin təsviri Perkin Elmer Pro-Express gel görüntüləmə sistemindən istifadə etməklə aparılmışdır. Sonra gel şəkilləri Phoretix 2D™ analitik proqram təminatının v2004 (Qeyri-xətti Dinamik) versiyasından istifadə edərək təhlil edilmişdir.

Kovan fəaliyyətindən yem yeminə keçidlə əlaqədar olduğu düşünülən protomeom dəyişikliklər Smith və digərləri tərəfindən istifadə edilənlərə bənzər meyarlara görə seçilmişdir. (Smith və digərləri, 2005). Protein nöqtəsi bütün pətək arılarında və bütün arı arı jellərində (yəni protein ardıcıl olaraq həll olunurdu) mövcud idi, lakin Sporet sahəsi və intensivliyi vermək üçün Phoretix analitik proqramı tərəfindən təklif olunan orta normallaşdırılmış ləkə həcmində əhəmiyyətli bir dəyişiklik oldu. kovan və yem jelləri arasında ümumi bir ifadə indeksi.

Seçilmiş zülal ləkələri (Nəticələrə baxın) Perkin Elmer Pro-Pick robot iş stansiyasından istifadə edərək geldən kəsildi və gel tıxacları 2% qliserolda 4°C-də jeldaxili tripsin həzminə və peptid analizinə məruz qalana qədər saxlanıldı.

Uçuş kütləsi spektroskopiyasının analizində gel-triptik həzm və nano elektrosprey quadropole vaxtı

Tərkibində maraq doğuran zülal ləkələri olan gel tıxacları (yuxarıya bax), tərkibində 50% asetonitril olan 50 mmol l-1 ammonium bikarbonatla boyandı və hava ilə quruduldu. Daha sonra zülallar, hər gel tıxacına 25 mmol l -1 ammonium bikarbonat içərisində 30 μl 10 mmol l -1 ditiotreitol (DTT) əlavə edilərək 56 ° C -də 1 saat inkübe edilərək azaldıldı. Otaq istiliyinə qədər soyuduqdan sonra, DTT məhlulu çıxarıldı və 50 mmol l -1 ammonium bikarbonat içərisində eyni həcmdə 100 mmol l -1 iyodasetamidlə işləndi. Ətraf mühitin temperaturunda 60 dəqiqə inkubasiya edildikdən sonra, qaranlıqda, gel tıxacları 30 μl 25 mmol l -1 ammonium bikarbonat ilə 15 dəqiqə yuyuldu və sonra 100% asetonitril ilə susuzlaşdırıldı. 10 dəqiqədən sonra maye faza çıxarılır və gel fişləri havada tamamilə qurudulur. Daha sonra zülallar jel daxilində həzmə məruz qaldı: 30 gel 50 mmol l -1 ammonium bikarbonat həllində 10% asetonitril olan 0.015 mq tripsin hər bir gel tıxacına əlavə edildi və bunlar 37 ° C -də bir gecədə inkübe edildi. Həzm olunan zülallar MS analizindən əvvəl Millipore C18 ZipTip istifadə edərək duzdan təmizləndi və konsentrə edildi və peptidlər nəhayət% 0.2 formik turşusu olan 8 μl% 50 sulu asetonitrildə seyreltildi. Bütün protein həzmləri bir nanoES mənbəyi ilə Q-TOF Global Ultima (Micromass Waters, Manchester, UK) tərəfindən analiz edildi. Kapilyar gərginlik adətən 1,2-1,6 kV, konus gərginliyi 50-100 V və gərginlik 100 V idi. Uçuş kütlə spektroskopiyası (TOF MS) və MSMS rejimi zamanı kütlə spektrləri 50-1800 m/e kütlə diapazonunda idi. Yarım maksimum hündürlükdə (FWHM) 8000 tam genişlik qətnaməsi. Toqquşma qazı olaraq Argon istifadə edildi.

Kovan arılarından və yetişmiş ovçulardan 2D jellərin normallaşdırılmış ləkə həcmi Student's tərəfindən müqayisə edildi t-test (Statistix analitik proqramı).

Ferment fəaliyyətləri

Hər həyat mərhələsindəki torakslar (pətək arıları, gənc ovçular, yetkin ovçular, qoca ovçular ± sem toraks kütləsi = 27.8 ± 0.8 mq, 27.1 ± 0.5 mq, 26.5 ± 0.3 mq və 26.6 ± 0.6 mq) bir maye istifadə edərək toz halına gətirildi. N2-soyudulmuş havan və havan. Sinə çəkisi həyat mərhələləri arasında fərqlənmirdi (ANOVA F3,39=1.0, P=0,41). Daha sonra 75 mmol l -1 kalium fosfat (pH 7,3) və 10 mq ml -1 Lubrol®-dan ibarət 20 həcmli ekstraksiya tamponunda 1 dəqiqə ərzində şüşə homogenizatorda bir stəkan istifadə edərək, bütün döş qəfələri buz üzərində homojenləşdirildi (Suarez et al., 1996). ). Bütün fermentlər 37-də bir Spectromax Plus 384, 96 çuxurlu mikroplaka oxuyucusunda (Molekulyar Cihazlar, Sunnyvale, Kaliforniya, ABŞ) ölçüldü. Analizlər üç dəfə həyata keçirildi və hər bir analiz üçün substrat olmadan nəzarət dərəcələri təyin edildi.

Sitokromun ferment aktivliyi c oksidaz (COx), fosfofruktokinaz (PFK) və heksokinaz (HK) təzə toraks homojenatları üzərində ölçülmüşdür. Piruvat kinazın (PK) və sitrat sintazanın (CS) ferment aktivliyi müvafiq olaraq bir və iki dəfə dondurulduqdan və əridildikdən sonra ölçüldü. Hər həyat mərhələsi üçün doqquzdan on bir toraks istifadə edilmişdir. Testlərin şərti: COx: 50 mmol l -1 kalium fosfat (pH 7.5), 50 μmol l -1 sitokrom c PFK: 10 mmol l -1 fruktoza 6 -fosfat (F6P) (nəzarətdə buraxılmış), 1 mmol l -1 ATP, 0.15 mmol l -1 NADH, 2 mmol l -1 AMP, 10 mmol l -1 MgCl2, 100 mmol l -1 KCl, 5 mmol l -1 DTT, 1 U aldolaz, 5 U trioz fosfat izomeraz və 5 U α -qliserofosfat dehidrogenaz 50 mmol l -1 imidazolda (pH 7.4) HK: 5 mmol l -1 d -qlükoza (nəzarətdə buraxılmır), 4 mmol l -1 ATP, 10 mmol l -1 MgCl2, 100 mmol l -1 KCl, 0.5 mmol l -1 NADP, 5 mmol l -1 DTT, 1 U qlükoza -6 -fosfat dehidrogenaz, 50 mmol l -1 Hepes (pH 7.4) PK: 5 mmol l -1 fosfoenol piruvat (PEP nəzarətdə buraxıldı), 50 mmol l -1 imidazol (pH 7.4), 5 mmol l -1 ADP, 2.5 mmol l -1 MgCl2, 0,15 mmol l -1 NADH, 10 mmol l -1 fruktoza 1,6-fosfat və 9,25 U laktat dehidrogenaz (LDH)CS: 0,5 mmol l -1 oksaloasetat (nəzarətdə buraxılmır), 0,09 mmol l -1 asetil- və 0,1 mmol l -1 ditiobisnitrobenzoy turşusu (DTNB) 20 mmol l -1 Trisdə (pH 8,0).

Hər bir ferment üçün, variasiya xətti kontrastının (ANOVA xətti kontrast SPSS versiyası 12.0, SPSS Inc.) təhlilini həyata keçirərək, pətək arılarından gənc yemçilərə, yetkin yemçilərə və köhnə yemçilərə qədər ferment aktivliyinin artıb-artılamadığını yoxladıq. Post hoc analiz Dunn-Sidak testindən istifadə etməklə aparılmışdır.


Müəllif məlumatı

Əlaqələr

Kompüter Elmləri Fakültəsi, Technion, Hayfa, İsrail

Shoval Lagziel və Tomer Shlomi

Biologiya Fakültəsi, Technion, Haifa, İsrail

Dong Lee və Tomer Shlomi qazandı

Lokey Həyat Elm və Mühəndislik Mərkəzi, Technion, Hayfa, İsrail

Bu müəllifi PubMed Google Scholar -da da axtara bilərsiniz

Bu müəllifi PubMed Google Scholar -da da axtara bilərsiniz

Bu müəllifi PubMed Google Scholar -da da axtara bilərsiniz

Töhfələr

SL və TS tədqiqatı hazırladı. SL hesablama təhlili aparıb. Bütün müəlliflər nəticələri şərh etdi və əlyazmanı yazdı. Bütün müəlliflər son əlyazmanı oxudular və təsdiq etdilər.


Metodlar

İfadə təhlili

Normallaşdırılmış əvvəlcədən işlənmiş məlumatlar GEO-dan (GSE59097) [49] əldə edilmişdir. GPL18893 mikroarray platformasındakı problar, 647 prob üçün gen etiketlərini düzəldən NCBI-nin müstəqil BLAST istifadə edərək şərh edildi. Xüsusi olaraq yalnız ən yaxşı hitlərdən istifadə edilib, 95%-dən çox eyniliyə malik, boşluqlar yoxdur və 100-dən çox xal istifadə edilib (Əlavə fayl 3: Cədvəl S8). R paketi limma, Kamboca və Vyetnamdan toplanan artemisinin həssas və davamlı nümunələrini müqayisə etmək üçün istifadə edilmişdir [127]. Təsbit edilə bilən gametositləri olmayan, əsasən halqa mərhələli parazitləri olan nümunələr istifadə edilmişdir. Müqavimətli parazitlər həm ən azı bir mutant Kelch13 allelinə, həm də 5 saatdan çox olan bir parazit klirensi yarı ömrüyə malik olaraq təyin edilmişdir (Şəkil 1) [49, 128]. Həssas parazitlər ən azı heç bir mutant Kelch13 allelinin olmaması və 5 saatdan az bir parazit klirensi ilə müəyyən edilmişdir. Təsadüfi Meşə təsnifatçıları, bütün ring-mərhələli nümunələrdən istifadə edərək randomForest R paketi ilə inşa edilmişdir [129]. Metadata təsnifatçısı, orijinal işdə [49] qeyd edildiyi kimi Əlavə fayl 2: Şəkil S2 -də sadalanan dəyişənlərdən istifadə etmişdir. Müqavimət statusu ilə əlaqəli nümunələrin filogeniyalarda çoxalmasını təmin etmək üçün Kamboca və Vyetnam ring-mərhələsi transkriptomları ayrıca müqayisə edildi. Bu ölkələr çoxlu sayda təcridlərə və müqavimətin yayılmasına görə seçilmişdir. Metabolik olmayan genləri çıxarmaq və hər bir genə yalnız bir prob saxlamaq üçün mikroarray zondları yoxlandı (standart praktikaya uyğundur). Çoxsaylı sınaq korreksiyası saxta kəşf dərəcəsi istifadə edərək aparılmışdır [130, 131].

Qıvrım dəyişikliklərinin hesablamaları və əlaqəli düzəlişlər ilə gen ifadəsi məlumatları səh-dəyər Diferensial İfadə üçün Metabolik Tənzimləmə (MADE) alqoritmindən istifadə edərək seçilmiş modelimizə daxil edilmişdir. MADE, hər bir metabolik genə ikili gen vəziyyətlərini ('on'/'off') təyin etmək üçün şəbəkə konteksti ilə birlikdə gen ifadəsi dəyişikliklərinin statistik əhəmiyyətindən istifadə edir. Bu, böyüməni və ya bənzər bir məqsədi qoruyarkən "off" genlərə uyğunlaşdırılmış reaksiyalar vasitəsilə axını məhdudlaşdıraraq şəbəkəni məhdudlaşdırır. Davamlı və həssas parazitlərin halqa mərhələli parazitlərin ölçüsü ilə ölçülən dəyişkən biokütlə əmələ gətirdiyinə dair heç bir məlumat verilmədiyini nəzərə alaraq 80% artım həddi istifadə edilmişdir, halbuki bu həddi dəyişmək həssas parazit biokütləsinin məhsuldarlığına təsir edir, bu, vaciblik proqnozlarına təsir etmir (məlumatlar). göstərilməyib). Yaranmış alqoritmlərlə [132] tək gen və reaksiya silinməsi aparılmaqla nəticələnən vəziyyətə xas modellər üçün əsas genlər proqnozlaşdırıldı. Kamboca və Vyetnam parazit modellərindən konsensus öldürücü gen və reaksiya silinmələri istifadə edilmişdir.

Flux analizi və metabolik vəzifələr

Flux balans analizi (FBA) silicoda metabolik fenotipləri araşdırmaq üçün bir yanaşmadır [133]. FBA, bir sıra məhdudiyyətlər nəzərə alınmaqla obyektiv funksiya vasitəsilə sonrakı axını maksimuma çatdıran şəbəkənin hər bir reaksiyası üçün sabit vəziyyət axını dəyərlərini simulyasiya edir. Əvvəlki tədqiqatlara uyğun olaraq gen əsaslılığını [50, 53, 79, 134] və bütün nəqliyyat reaksiyaları vasitəsilə icazə verilən axını soruşan obyektiv reaksiya olaraq biokütlə istehsalını seçdik. Sistemdəki məhdudiyyətlərə kütlənin qorunması, reaksiyaların geri dönməsi və reaksiyanın lokalizasiyası daxildir. Flux Variability Analizi (FVA) sistem məhdudiyyətləri ilə icazə verilən axınların diapazonunu tapmaq üçün əlaqəli yanaşmadan istifadə edir [135].

Modeli qiymətləndirmək üçün in vitro təcrübələri və in vivo məlumatları simulyasiya etdik, bunlar rekonstruksiyanın keçməli olduğu metabolik "vəzifələrimiz" dir. Media komponentlərini dəyişdirərək və ya xüsusi metabolitlərə daxil olaraq in vitro böyümə tələblərini simulyasiya edirik. Metabolitlərin idxalı və ya istehsalı yenidənqurma nəticəsində aradan qaldırıldı və sonrakı biokütlə istehsalı müşahidə edildi. Modeli qiymətləndirmək üçün ferment inhibəsinin, gen nokautlarının və metabolit istehsalının təsirlərindən də istifadə edilmişdir. Ölümcül modifikasiyalar biokütlənin artımını azaldan modifikasiyaların istehsalı ilə nəticələnməyən dəyişikliklər kimi müəyyən edilmişdi, məhdudiyyətsiz axının dəyərinin 90%-dən azını istehsal edən kimi müəyyən edilmişdir [81, 134].

COBRA Toolbox 2015, Tiger Toolbox (versiya 1.3.1) və MATLAB R2013b model istehsalı və flux simulyasiyaları üçün istifadə edilmişdir.

Kurasiya

Mövcud olanın əl ilə qurulması P. falciparum metabolik şəbəkə rekonstruksiyası [50] bir ədəbiyyat araşdırması və ümumi və Plazmodium-xüsusi verilənlər bazası (KEGG, Expasy və PlasmoDB, MPMP) [43, 136,137,138]. Bu mənbələrdən əldə edilən məlumatlar, reaksiyaların daxil edilməsini, stokiyometriyasını, geri çevrilməsini, lokalizasiyasını və gen notlarını qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir. Genetik və biokimyəvi olaraq dəstəklənən reaksiyalar saxlanıldı və yeni reaksiyalar əlavə edildi. (1) açıq şəkildə yalan olduğu və ya (2) funksional olmadığı və biokimyəvi və ya genetik olaraq dəstəklənmədiyi təqdirdə reaksiyalar aradan qaldırıldı. Kortəbii reaksiyaların (fermentlər olmadan baş verən reaksiyalar) yetim reaksiyalardan (bilinməyən ferment katalizatorları ilə reaksiyalar) fərqləndiyi qeyd olunur.

Gen mahiyyətini qiymətləndirmək üçün biz modelləşdirmə məqsədi funksiyası kimi biokütlə reaksiyasından istifadə etdik. Beləliklə, hüceyrə artımını təqlid edən bu reaksiya vasitəsilə axın, silisium eksperimental prosedurlarında hamı üçün maksimuma çatdırıldı. Biz əvvəlki tədqiqatın [50] biokütlə reaksiyasından modifikasiyalarla istifadə etdik. Biokütlə reaksiyasının kürasiyası metabolomik tədqiqatlarda aşkar edilmiş metabolitlər tərəfindən məlumatlandırıldı [28, 56,57,58], mümkünsə metabolit nisbətləri metabolomik məlumatlardan proqnozlaşdırıldı. Biz biokütlə reaksiyasını, heç bir məlum katabolizmi olmayan və ya idxal yolları biokütlə reaksiyasından xaric edilməmiş metabolomik təcrübələrdə aşkar edilmiş dərc edilmiş əsas məlumat metabolitlərini nəzərə alaraq kurasiya etdik.

Əsaslıq tədqiqatları

Təcrübəli modelimizdə və hər bir ifadə məhdudlaşdırılmış həssas və davamlı modellərdə həm genlər, həm də reaksiyalar ilə tək silmə tədqiqatları və ikiqat gen silinmə tədqiqatları həyata keçirməklə vacibliyi proqnozlaşdırdıq. Bütün simulyasiyalar silis qırmızı qan hüceyrə mühitində həyata keçirildi (Əlavə fayl 3: Cədvəl S9). Modeldən maraq geninin çıxarılması ilə gen silinməsi simulyasiya edildi. Bu dəyişiklik həmin genin işləməsini tələb edən bütün reaksiyalar vasitəsilə axının qarşısını alır. Model bu məhdudiyyətlərlə biokütlə istehsal edə bilmirsə, gen vacib sayılırdı. Böyüməni azaldan fenotiplər də müşahidə edildi və qeyd edildi. Reaksiya silmə işləri üçün reaksiyaları ardıcıl olaraq aradan qaldırdıq. Sonrakı böyümə təsirləri reaksiyanı mahiyyətcə təyin etmək üçün istifadə edilmişdir. Davamlı və ya həssas modellər üçün konsensus nəticələri müzakirə olunur.


Videoya baxın: Біорізноманіття грибів. 5. Ординації в аналізі біологічного різноманіття (Dekabr 2022).