Məlumat

Beta-laktamaz ifrazını absorbansa aid etmək

Beta-laktamaz ifrazını absorbansa aid etmək


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Maye kultura mühitində penisillinə davamlı bakteriyalar yetişdirildikdə, mühitə β-laktamaza ifraz olunur. Belə bir mühitin üst qatını β-laktamaz aktivliyi üçün analiz etmək olar. Penisilinə davamlı olduğuna şübhəsi olan müxtəlif orqanizmlərin kulturası əldə edildi və β-laktamaz aktivliyi üçün analiz edildi. Müvafiq absorbans dəyəri müəyyən bir dalğa uzunluğunda ölçülmüşdür.

Güman edək ki, orqanizm 1 -in mədəniyyətindən olan supernatantların absorbans dəyəri X, 2 -si isə udma qabiliyyətinə malik idi.

Sualım: X> Y olarsa, bu, 1-ci orqanizm tərəfindən daha çox β-laktamazanın istehsal olunduğu anlamına gəlirmi?


Β-laktamaz testində mədəniyyət mühitinin nümunəsinə β-laktamazanın inhibitoru əlavə olunur. İnhibitor fermentə bağlanır və onun rəngini dəyişir, bu da β-laktamazanın konsentrasiyası ilə birbaşa əlaqəlidir. Daha çox β-laktamazanın daha çox inhibitor bağlaması deməkdir və bu, daha yüksək bir absorbsiyaya səbəb olan daha çox rəng inkişafı ilə nəticələnir. Beləliklə, daha yüksək absorbsiya, süpernatanda daha çox β-laktamazanın olması deməkdir.


Beta laktamaz TEM 1

TEM-1 β-laktamaz E.. coli pBR322 plazmid 286 amin turşusu qalıqlarından ibarətdir (M.r 28,500) ( 41, 42 ). (Qeyd: A sinfi β-laktamazalar orta ölçüsü 25-30 kDa, monomerlər kimi aktivdir və karbohidrat və kofaktorlar ehtiva etmir.) İlk 23 amin turşusu bölgəsi (qalıqlar 3–25) siqnal peptididir və yetkin ferment. Yetkin fermentdə müvafiq olaraq N-terminal (ABL 3) və C-terminal (ABL 290) qalıqları kimi His və Trp var.

Yetkin TEM β-laktamazada iki Cys qalığı (C77, C123) var. A sinif fermentləri arasında bənzərsiz bir disulfid körpü meydana gətirirlər. Ferment PCMB və ya IAA tərəfindən inhibe edilmir. Disulfid bağının bir sahə-mutajenik əvəzləyici ilə (Cys-77-Ser) ləğv edilməsi, 40 ° C-dən aşağı temperaturda zülalın katalitik aktivliyinə və stabilliyinə təsir göstərmir (11). Hər iki Cys qalıqlarının Ala (Cys-Ala ikiqat mutant) ilə əvəz edilməsi qatlama prosesinə və ya fəaliyyətə təsir etmir: kinetik parametrlərin vəhşi tipli fermentin parametrlərinə oxşar olduğu aşkar edilmişdir (43). Vəhşi tipli β-laktamaz üçün optimal qatlanma çox oksidləşdirici şəraitdə baş verir, məsələn, <0,4 m.M glutatyon (GSH) və 4-8 mM GSSG (oksidləşdirilmiş GSH), optimal qatlama üçün azaldıcı bir mühit tələb edən eukaryotik zülalları (məsələn, iribuynuzlu pankreas RNazı) ziddiyyət təşkil edir, yəni.M GSH və 0,2 m GSSG ( 44 ).

Tərəfindən kodlanan TEM β-laktamazası bla pBR322 geni 39 mövqeyində Gln var. Bu ferment TEM-1 β-laktamazası olaraq adlandırılır və pMən 5.4 (28, 45). TEM-2 β-laktamazası, Lys-39 və pMən dəyəri 5.6 (46).

Hal-hazırda TEM ailəsində bir və ya daha çox amin turşusunda TEM-1 prototipindən fərqlənən 15-dən çox üzv var. β-laktamaz divergensiyasına həssas olan qalıqlara Gln-39 (Q39K), Glu-104 (E104K), Arg-164 (R164S), Gln-205 (Q205L), Ala-237 (A237T), Gly-288 (G2) daxildir. və Glu-240 (E240K) (47). Bu TEM-1 variantları olaraq adlandırılır geniş spektrli β-laktamazalar, klassik β-laktamlara (məsələn, benzilpenisilin) ​​qarşı aktivliyin azalması və α-metoksi- və oksiimino-β-laktamlara qarşı aktivliyin artması ilə xarakterizə olunan müxtəlif dərəcədə dəyişdirilmiş substrat spesifikliklərini nümayiş etdirir. Yuxarıda qeyd olunan qalıqların sahəyə xas əvəzetmələri ümumiyyətlə substrat profillərinin yeni nəsil β-laktam antibiotiklərinə doğru dəyişməsini təsdiqləyir.


Məqsəd: İnsan hüceyrələrinin radiorezistentliyinə xas olan gen ifadə profillərini müəyyən etmək.

Metodlar və materiallar: Cəmi 15 şiş və normal fibroblast hüceyrə xəttinin qlobal gen ifadə profilləri DNT mikroarrayları və statistik kümelenme üsulları ilə təhlil edildi. Başlanğıcda, hüceyrə xəttlərindən 6 -sı, sağ qalmalarını 10% -ə endirmək üçün lazım olan radiasiya dozasına görə radioresistant (RG) və ya nonradioresistant (NRG) qruplarına ayrıldı.10). Şüalanmadan 1 və ya 3 saat sonra hər bir qrupa xas olan genlər, varyans analizi və iki ölçülü iyerarxik klasterləşdirmə metodu da daxil olmaqla statistik prosedurlardan istifadə etməklə müəyyən edilmişdir. Qalan doqquz hüceyrə xətləri k-ən yaxın qonşu nümunə təsnifatına məruz qaldı.

Nəticələr: Doqquz test hüceyrə xətti D tərəfindən uğurla təsnif edildi10 transkripsiya səviyyələri, şüalanmadan 1 və 3 saat sonra əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdiyi 46 və 44 gen istifadə edən dəyər. Bu genlərdən 25 -i NRG və ya RG -də hər iki zaman nöqtəsində dəyişmiş ifadə göstərdi, lakin müstəqil olaraq test hüceyrə xətlərini təsnif edə bilmədi.

Nəticələr: Bu işdə analiz edilən radioresistant hüceyrə xətləri, daha həssas hüceyrə xətlərinin profil dəyişikliklərindən fərqli olaraq gen ifadəsi profillərində müəyyən radiasiya səbəbli dəyişikliklər göstərdi.


Xüsusi müxbir gen təhlili kateqoriyalar

Luciferase Reporter Assays və Vektorlar

Luciferase reportyor reagentləri, çoxsaylı klonlama yeri vektorları və spektral olaraq həll edilə bilənlərə əsaslanan flaş, parıltı və ikili spektral lusiferaza analiz dəstləri Cypridina, Qaussiya, Renilla və atəşböcəyi lusiferazları

Chemiluminescent Reporter Gen Assays

Kolorimetrik və ya floresan aşkarlamadan daha həssas olan müxbir gen fəaliyyətinin kimyəvi baxımdan ölçülməsini təklif edən müxbir gen testləri

Cypridina Luciferase Təhlilləri və Vektorlar

Luciferase reportyor reagentləri, çoxsaylı klonlama yeri vektorları və təbii olaraq ifraz olunanlara əsaslanan flaş, parıltı və ikili spektral lusiferaza analiz dəstləri Cypridina lusiferaza

Gaussia & Gaussia-Dura Luciferase Testləri və Vektorları

Luciferase reportyor reagentləri, çoxsaylı klonlama yeri vektorları və təbii olaraq ifraz olunanlara əsaslanan flaş və ikili spektral lusiferaza analiz dəstləri Qaussiya & amp Gaussia Dura lusiferazları

Renilla Luciferase Testləri və Vektorları

Luciferase müxbiri reaktivləri, çoxlu klonlaşdırma yeri vektorları və hüceyrədaxili olaraq ifadə edilən flaş, parıltı və ikili spektral luciferase test dəstləri Renilla lusiferaza

Firefly Luciferase Testləri və Vektorları

Luciferase müxbiri reaktivləri, çoxlu klonlaşdırma sahə vektorları və hüceyrədaxili olaraq ifadə edilən atəşböcəyi lusiferaza əsaslanan flaş, parıltı və ikili spektral lusiferaza analiz dəstləri

Turbo Luciferase Testləri və Vektorları

Lusiferaza müxbir reagentləri, çoxsaylı klonlama yeri vektorları, hüceyrədaxili olaraq ifadə edilmiş Turbo lusiferaza əsaslanan parıltı lusiferaza analiz dəsti

NovaBright Chemiluminescent β-Galactosidase Reporter Gen Testləri

Məməlilər və ya maya hüceyrələri üçün beta-qalaktosidaza məruzəçi gen analizləri, homogen analiz formatında beta-qalaktosidaza məruzəçi fermentinin sürətli ultrahəssas aşkarlanması ilə birbaşa hüceyrə lizisini birləşdirən

NovaBright Chemiluminescent Luciferase və β-Galactosidase Reporter Gen Test Sistemləri

Beta-galaktosidaz və firefly luciferase ikili ferment müxbiri geni hemiluminescent aşkarlama dəstləri, eyni nümunədə hər iki reportyor gen fermentinin sürətli və həssas ardıcıl aşkarlanmasını təmin edir.

NovaBright Chemiluminescent SEAP Reporter Gen Assays

Qələvi fosfataz substratı, parıltı artırıcı və endogen qeyri -plasental qələvi fosfatazanın fəaliyyətini xüsusi olaraq maneə törədən unikal tampon sistemi olan gizli Plasental Qələvi Fosfataz (SEAP) dəstləri, enjektor olmadan sadə luminometrlərin istifadəsinə imkan verir.


Xüsusi müxbir gen analizi məhsulları

Pirs Luciferase Testləri

NovaBright Chemiluminescent Assays

İkili İşıqlı Lusiferaza və β-Qalaktosidaza Təhlilləri

Bir genin iki funksional hissəsinə kodlaşdırma bölgəsi və promotor bölgəsi daxildir. Kodlaşdırma bölgəsi, transkripsiya və tərcümə mexanizmləri vasitəsilə istehsal ediləcək protein haqqında məlumatları ehtiva edən DNT ardıcıllığıdır. Təşviqçi bölgə, genin transkripsiyasını tənzimləyən və genin ifadəsini aktivləşdirə və ya basdıra bilən xüsusi DNT sırasıdır.

Məruzəçi gen analizləri, adətən naməlum bir DNT ardıcıllığının tənzimləmə qabiliyyətini ölçmək üçün istifadə olunur. Bu, naməlum promotor ardıcıllığını məhsulu asanlıqla aşkarlana bilən və kəmiyyətcə ölçülə bilən, asanlıqla aşkarlana bilən reportyor geni ilə əlaqələndirməklə həyata keçirilir.

Ümumi müxbir genləri arasında beta-galaktosidaz, lusiferaza, beta-laktamaz, qələvi fosfataza və GFP (yaşıl floresans zülalı) var. Lüminesans, absorbans və flüoresans aşkarlama üsulları adətən ifadə edilmiş reportyor gen zülalını ölçmək üçün istifadə olunur.

Luciferase, glycosidases, chloramphenicol asetyltransferase (CAT), green florescent protein (GFP), β-lactamase, β-gal, habelə Lumio daxil olmaqla müxtəlif məruzəçi genləri ifadə etmək və aşkar etmək üçün antikorlar, reaktivlər, vektorlar və dəstlər təqdim edirik. ™ və TC-FlAsH ™ texnologiyası.


Metodlar

Bakterial suşlar

Bu tədqiqatın diqqət mərkəzində bakteriya ştammı idi Pseudomonas aeruginosa CCBH4851. İzolat, Fundação Oswaldo Cruz (WDCM947 CGEN022/2010) ünvanında yerləşən Xəstəxanadan Alınan Bakteriyaların Mədəniyyət Kolleksiyasında (CCBH) mövcuddur. Müqayisəli genom analizini həyata keçirmək üçün istifadə edilən digər suşlar Cədvəl 4-də verilmişdir.

Genom sıralaması, yenidən yığılması və yenidən annotasiyası

CCBH4851-in bütün genom ardıcıllığı əvvəllər Illumina MiSeq platforması 6 istifadə edilərək həyata keçirilmişdi. Genom montajı, əvvəlki işdə təsvir edildiyi kimi şərh edilmiş 150 kontigdən ibarət bir genom layihəsi ilə nəticələndi. Daha sonra PacBio platformasından istifadə edərək əlavə bir bütün genom sıralaması edildi. Burada, de novo montaj MaSuRCA assemblerindən istifadə etməklə həyata keçirildi ki, bu da Illumina qısa oxunuşlarının PacBio uzun oxunuşları ilə birləşməsinə imkan verdi və nəticədə orijinal montajın təkmilləşdirilməsi 35 oldu. Tək bir contig alındı ​​və xüsusi bir boru kəməri istifadə edərək şərh edildi. Qısaca, yaxından əlaqəli gərginlikdən bir şərh P. aeruginosa PAO1, Rapid Annotation Transfer Tool 36 proqramından istifadə edərək CCBH4851 genomuna köçürüldü. Sonra CDS -lər GeneMarkS 37 tərəfindən proqnozlaşdırıldı. RRNA və tRNA-ların proqnozlaşdırılması RNAmmer və tRNAscan-SE proqramları ilə sırasıyla 38, 39 tərəfindən həyata keçirilmişdir. Proqnozlaşdırılan CDS-lər RefSeq 40 , COG 41 , KEGG 42 , UniProt 43 və InterPro 44 kimi ictimai verilənlər bazalarına qarşı homoloji axtarışlar əsasında funksional olaraq şərh edilmişdir. Nəhayət, əvvəlki addımların şərhləri müqayisə edildi, birləşdirildi və əllə seçildi. Bundan əlavə, PRIAM proqramı CDS-lərə 45 ferment komissiya nömrəsi təyin etmək üçün istifadə edilmişdir. Bütün genom vizuallaşdırması Artemis 46 proqramından istifadə etməklə edildi. CCBH4851 genomunun dairəvi planı Circos proqramı 47 tərəfindən hazırlanmışdır.

Müqayisəli genom təhlili

CCBH4851 ilə Cədvəl 4-də sadalanan hər bir ştam qrupu arasındakı oxşarlıqları və fərqləri müəyyən etmək üçün bütün genom müqayisəsi aparılmışdır. Genomlar cütlükləri müəyyən etmək üçün BLAST alqoritmindən istifadə edərək homoloji axtarışlara əsaslanan iki istiqamətli ən yaxşı vuruş (BBH) klasterləşdirmə metodu ilə təhlil edilmişdir. Müxtəlif genomlar müqayisə edildikdə bir -birlərinin ən çox vurduğu uyğun genlər 48. Hamısına qarşı BLAST hizalamaları aşağıdakı parametrlərdən istifadə edilməklə yerinə yetirilmişdir: (ge ) 90% əhatə, (ge ) 90% oxşarlıq və 1e-10 E dəyərinin kəsilməsi. BBH-ləri müəyyən etmək üçün BLAST nəticələri üzərində Python alqoritmi tətbiq edilmişdir 49 . Əsas, aksesuar və unikal genomlar əvvəlki addımlarda yaradılan məlumatlarla yaradılmış MySQL verilənlər bazasından istifadə edərək təhlil edilmişdir. CDS-lər, eggNOG-Mapper veb tətbiqi 50-dən istifadə edərək Ortoloji Qruplar Klasterləri (COG) funksional kateqoriyalarına təsnif edildi. Genomik adaların müəyyənləşdirilməsi IslandViewer 51 tərəfindən həyata keçirildi. Yerləşdirmə ardıcıllığı ISSaga veb proqramından istifadə etməklə müəyyən edilmişdir 52 . CRISPR-Cas sisteminin mövcudluğu CRISPRCasFinder veb tətbiqi 53 tərəfindən qiymətləndirilmişdir. Antimikrobiyal müqavimət mexanizmləri ilə əlaqəli genləri aşkar etmək üçün CCBH4851 genomunun zülal ardıcıllığı Resistance Gen Identifier veb tətbiqindən istifadə edərək CARD-a qarşı BLAST axtarışlarını həyata keçirmək üçün istifadə edilmişdir 54 . Həmçinin, zülal ardıcıllığı (ge ) 75% əhatə, (ge ) 50% identifikasiya və 1e-10 E dəyər kəsimi ilə BLASTP istifadə edərək Patogen Bakteriyaların 55 Virulentlik Faktorları Verilənlər Bazasına qarşı axtarıldı. Tənzimləyici zülallar Predicted Prokaryotic Regulatory Proteins veb tətbiqi 56 istifadə edərək proqnozlaşdırıldı. SNP -lərin aşkarlanması, yığılmamış oxunuşların hizalanmasına əsaslanaraq Snippy proqramı vasitəsi ilə həyata keçirilmişdir. P. aeruginosa Standart parametrlərdən istifadə edərək PAO1 genomu ardıcıllığı 9. Sinonim olmayan variantların hipotetik təsiri HOPE web tətbiqi 57 istifadə edilərək təhlil edildi.

Filogenomik analiz

CCBH4851 genomu və Cədvəl 4-də sadalanan suşlar, bütün genom filogenezi analizini aparmaq üçün istifadə edilmişdir. Təhlil standart parametrlər 58 istifadə edərək CSI Phylogeny veb proqramı tərəfindən həyata keçirilmişdir. Əsas genom filogeniya ağacı FigTree ilə nəticələndi və redaktə edildi (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ saytında mövcuddur).

Antimikrobiyal həssaslıq testi

Antimikrobiyal həssaslıq testi bulyon mikrodilüsyon metodundan istifadə etməklə EUCAST təlimatlarına uyğun olaraq aparılmışdır 11 . Dörd əsas antimikrobiyal sinif qiymətləndirildi: aminoqlikozidlər (gentamisin), kinolonlar (siprofloksasin), beta-laktamlar (imipenem) və lipopeptidlər (polimiksin E və ya kolistin). MİK, mikroorqanizmin görünən böyüməsini maneə törədən antimikrobiyal agentin ən aşağı konsentrasiyası olaraq təyin edildi. Həssas, orta və ya davamlı kimi təsnifat EUCAST meyarlarına əsaslanır 59 . Qısaca olaraq, siprofloksasin, imipenem və kolistin üçün müqavimətin kəsilmə nöqtələri müvafiq olaraq >0.5 (mu ) q/mL, >4 (mu ) q/mL və >2 (mu ) q/mL-dir. Gentamisinin "IE" statusu var, yəni orqanizmin agentlə terapiya üçün yaxşı hədəf olduğuna dair kifayət qədər sübut yoxdur, MİK bildirilə bilər, lakin S, I və ya R təyinatı olmadan. Bulyon mikrodilüsyonu metodu üçün, hər biri iki texniki təkrarlı cəmi altı bioloji təkrar üç müstəqil təcrübəyə bölünərək yerinə yetirildi. Nümunəsiz buraxılmış quyularda artım göstərən kolistinə qarşı həssaslıq testi istisna olmaqla, bütün eksperimentlərdə eyni vizual oxu müşahidə edildi.

Hərəkətlilik analizləri

Hərəkət testləri əvvəllər təsvir edildiyi kimi kiçik dəyişikliklərlə həyata keçirildi 60. İnkişaf mühiti kimi Luria-Bertani (LB) agardan istifadə edilmişdir. Üzgüçülük lövhələri (0,3% agar) steril diş çubuğu ilə aşılandı və 16 saat 37 (^) C-də inkubasiya edildi. Qaynayan plitələr (0,6% agar) steril diş çubuğu ilə aşılandı və plitələr inkubasiya edildi. 24 saat 37 (^) C. Seğirmə üçün hüceyrələr diş çubuğu ilə LB təbəqəsi (1% agar) vasitəsilə petri qabının dibinə qədər aşılandı. Plitələr 37 (^) C-də 24 saat inkubasiya edildi. İnkubasiyadan sonra agar atıldı, boşaldılmış hüceyrələri çıxarmaq üçün lövhələr yuyuldu və kristal bənövşəyi (1% [wt/vol] məhlulu ilə boyandı. ). Bütün hərəkətlər aşılama nöqtəsindən uzaqlaşan bakteriyaların miqrasiyası nəticəsində meydana gələn dairəvi zona kimi ölçülmüşdür. Bundan əlavə, seğirmə plitələrindəki ləkə etanolda (95% [həcm/həcm] məhlul) həll edildi və udma 570 nm-də etanol məhlulu ilə boş olaraq ölçüldü. Bükülmə lövhələrindəki ləkə miqdarı istisna olmaqla, hər biri üç texniki sınaqdan ibarət ən azı üç bioloji replikasiya üç müstəqil təcrübədə aparılmışdır. Qıvrım lövhələrindəki ləkələrin ölçülməsi üçün, hər biri iki texniki təcrübəyə bölünmüş beş bioloji replika iki müstəqil təcrübəyə bölünərək həyata keçirildi.

Biofilm formalaşması analizi

bacarığı P. aeruginosa biofilmlər yaratmaq üçün əvvəllər izah edildiyi kimi qiymətləndirildi 61. Qısaca olaraq, hüceyrələr LB və ya Mueller-Hinton mühitini ehtiva edən 96 quyulu lövhələrdə aşılanmışdır. Plitələr 20-24 saat 37 (^) C-də inkubasiya edildi. İnkubasiyadan sonra mühit atıldı, plitələr yapışmamış hüceyrələri çıxarmaq üçün su ilə yuyuldu və kristal bənövşəyi ilə (1% [wt/) boyandı. cild] həlli). Daha sonra, kristal bənövşəyi etanolda (95% [həcm/həcmdə) həll olundu və boşluq olaraq bir etanol məhlulu istifadə edərək 570 nm -də absorbans ölçüldü. P. aeruginosa PA01 müsbət nəzarət olaraq istifadə edildi. Hər biri ən azı üç texniki replikaya malik olan yeddi bioloji replikasiya iki müstəqil təcrübəyə bölünərək həyata keçirilmişdir.

Statistik təhlil

Statistikalar GraphPad Prism proqramında aparılmışdır. Tələbə t testi fenotipik təcrübələrin nəticələrinin əhəmiyyətli dərəcədə fərqli olub olmadığını yoxlamaq üçün istifadə edilmişdir (P dəyər & lt 0.05). Məlumatlar orta ± standart səhv olaraq ifadə edildi. Rəqəmlərdə (*) bərabərdir P dəyəri & lt 0.05, (** ) bərabərdir P dəyər & lt 0.01, (*** ) bərabərdir P dəyəri < 0,001 və (****) bərabərdir P dəyər < 0,0001.


Xüsusi müxbir gen analizi məhsulları

Pirs Luciferase Testləri

NovaBright Kimiluminesans Testləri

İkili İşıqlı Lusiferaza və β-Qalaktosidaza Təhlilləri

Bir genin iki funksional hissəsinə kodlaşdırma bölgəsi və promotor bölgəsi daxildir. Kodlaşdırma bölgəsi, transkripsiya və tərcümə mexanizmləri vasitəsilə istehsal ediləcək protein haqqında məlumatları ehtiva edən DNT ardıcıllığıdır. Promotor bölgəsi, genin transkripsiyasını tənzimləyən və genin ifadəsini aktivləşdirə və ya repressiya edə bilən xüsusi DNT ardıcıllığıdır.

Məruzəçi gen analizləri, adətən naməlum bir DNT ardıcıllığının tənzimləmə qabiliyyətini ölçmək üçün istifadə olunur. Bu, naməlum təşviqçi ardıcıllığını, məhsulu asanlıqla aşkar edilə bilən və ölçülə bilən, asanlıqla aşkar edilə bilən bir reportyor geninə bağlamaqla edilir.

Ümumi müxbir genləri arasında beta-galaktosidaz, lusiferaza, beta-laktamaz, qələvi fosfataza və GFP (yaşıl floresans zülalı) var. Luminesans, absorbans və flüoresan aşkarlama üsulları, ifadə olunan müxbir gen zülalını ölçmək üçün adətən istifadə olunur.

Biz lusiferaza, qlikozidazalar, xloramfenikol asetiltransferaza (CAT), yaşıl flüoresan zülal (GFP), β-laktamaza və β-gal, həmçinin Lumio daxil olmaqla müxtəlif reportyor genləri ifadə etmək və aşkar etmək üçün antikorlar, reagentlər, vektorlar və dəstlər təklif edirik. ™ və TC-FlAsH™ texnologiyası.


Müəllif məlumatı

Bu müəlliflər bərabər töhfə verdilər: Yunjiao He və Jinping Lei.

Əlaqələr

Hong Kong Politexnik Universiteti Shenzhen Araşdırma İnstitutu, Shenzhen, P. R. Çin

Yunjiao He, Xuehua Pan və Yanxiang Zhao

Tətbiqi Biologiya və Kimya Texnologiyası Bölməsi, Kimya Biologiyası və Dərman Kəşfi Dövlət Açar Laboratoriyası, Hong Kong Politexnik Universiteti, Hung Hom, Kowloon, Hong Kong, P. R. Çin

Yunjiao He, Xuehua Pan & amp; Yanxiang Zhao

Kimya Bölümü, Sistem Biologiyası və İnsan Sağlamlığı Mərkəzi, Hong Kong Elm və Texnologiya Universiteti, Clear Water Bay, Kowloon, Hong Kong, P. R. Çin

Əczaçılıq Elmləri Məktəbi, Sun Yat-Sen Universiteti, Guangzhou, P. R. Çin


Bölmə: BBa_J23119



Yaradıcı təşəbbüskar ailə
J23100 -dən J23119 -a qədər olan hissələr, kiçik bir kombinat kitabxanasından təcrid olunmuş qurucu təşviqçi hissələr ailəsidir. J23119, "konsensus" təşviqçisi ardıcıllığı və ailənin ən güclü üzvüdür. J23119 istisna olmaqla bütün hissələr J61002 plazmidində mövcuddur. J23119 hissəsi pSB1A2-də mövcuddur. Bu, RFP -ni promouterin aşağı axınına yerləşdirir. Promotorların bildirilmiş fəaliyyətləri LB mühitində yetişdirilmiş TG1 ştamında bu plazmidlərin doyma səviyyəsinə qədər nisbi flüoresansı kimi verilir. Onların istifadəsi haqqında ətraflı məlumat üçün BBa_J61002 hissəsinə baxın.

Bu təşviqçi hissələr, konstitusiya ilə ifadə olunan hissələrin ifadə səviyyəsini tənzimləmək üçün istifadə edilə bilər. Bu promosyon hissələrində mövcud olan NheI və AvrII məhdudlaşdırma saytları onları daha da dəyişdirmək üçün bir iskele halına gətirir. JCAraw

İstifadə və Biologiya

iGEM16-CLSB-UK:Konsensus təbliğatçısı Bölmə: BBa_J23119 AmilCP mavi-bənövşəyi xromoprotein hissəsi ilə yığılmışdır: BBa_K592025. Konstruksiya Hissəsi:BBa_K2078002 E-Coli-də ifadə və gücləndirmə üçün pSB1C3 plazmidində aparılmışdır.

Amsterdam 2020: Nisbi təşviqçi gücü Synechocystis PCC6803UTEX 2973 Vaseduvan və həmkarları (2019), təbliğatçıların güc fərqini öyrənməyi hədəflədilər Synechocystis PCC6803 (Sinekosist) və UTEX 2973. 20 əvvəllər müəyyən edilmiş ardıcıl promouterlər (o cümlədən Bölmə: BBa_J23119, Ptrc10, Ptik10 və P.tac10 Markley və s. 2015 Huang, et al. 2010 Alberts, et al. 2015) və mənşəli L-arabinoza induksiya olunan promotor Escherichia Coli (SPİS Abe və s. 2014) müqayisə edilmişdir. Bundan əlavə, onlar 8 mutant təşviqçisi qurdular Bölmə: BBa_J23119 təşviqatçı və P.trc10 promouter dizaynı (bax Şəkil 1A). Tərtibatçılar, eYFP ifadəsini idarə etmək üçün bir pPMQAK1-T-də toplandı. Promotora lak operonu (lacO) və gələcək təcrübələr üçün ribozom bağlama yeri əlavə edildi (Huang, et al. 2010). Ayrı -ayrı təşviqatçıların gücünü müqayisə etmək üçün 10.000 -dən çox hüceyrəni ölçən eYFP floresan istifadə edildi SinekosistUTEX 2973 (Şəkil 1B-ə baxın). Bundan əlavə, hər iki suşda sintetik promotorların ifadəsinin korrelyasiyası öyrənilmişdir (bax Şəkil 1C). Baxmayaraq ki, ifadə səviyyələri üçün 8 dəfə yüksəkdir UTEX 2973 üçün daha Sinekosistis, promotorların gücü hər iki ştammda oxşar nümunələrə malikdir (R 2 = 0.84, Şəkil 1C-ə baxın). Bu məlumat müxtəlif məqsədlər üçün konstruksiyalar hazırlayarkən istifadə edilə bilər.

Şəkil 1. Synechocystis və UTEX 2973 -də heterolog və sintetik promoterlərin ifadə səviyyələri. A. BioBricks -dən əldə edilən səkkiz yeni sintetik promouterin quruluşu və hizalanması Hissə:BBa_J23119 kitabxana və P.trc10 promouter dizaynı (Huang və digərləri, 2010). B. Promotorlar tərəfindən idarə olunan eYFP ifadə səviyyələri SinekosistUTEX 2973 10.000 fərdi hüceyrədən alınan ölçülərdən hesablanır. C. Test edilmiş sintetik təbliğatçıların ifadə səviyyələrinin korrelyasiya təhlili SinekosistUTEX 2973. Təyin əmsalı (R 2 ) J23119 kitabxanası (qırmızı), yeni sintetik promotorlar (çəhrayı) və trc variantlar (tünd qırmızı). Dəyərlər, 48 saatlıq böyümədən sonra ən azı dörd bioloji replikadan +- 6 SE vasitəsidir (orta OD 750 dəyərləri üçün) SinekosistUTEX 2973 mədəniyyətlər müvafiq olaraq 3.5 6 0.2 və 3.6 6 0.2 idi). (Altyazı Vaseduvan, et al. 2019 -dan alınmışdır)


GreatBay_China 2018:
GreatBay_China 2018 komandası J23119, Hissə:BBa_J23105 və Hissə:BBa_J23101-i üç vektorda Part:BBa_B0034 və sfGFPPart:BBa_I746916 ilə birləşdirərək xarakterizə etdi: pUC20 (nüsxə nömrəsi/hüceyrə nömrəsi, təxminən 50), təxminən pUC20 pSC101 (nüsxə nömrəsi təxminən 2/xana). Sonra TALE stabilləşdirilmiş promouter kitabxanası üçün istinad kimi Flow Cytometry ilə flüoresansı ölçdük.

Nəticə göstərir ki, J23119, J23105 və J23101 gücü iGEM2006_Berkeley komandası tərəfindən təsvir edilənlə təxminən eynidir və vektorun surət sayı artdıqca flüoresans artır.

GreatBay_China iki etdi təkmilləşdirilmiş hissələr J23119 əsasında.
UP119 yuxarı elementin əlavə edilməsi ilə dəyişdirilir. (Bölmə: BBa_K2753055)
TALE2 sp6 J23119 -un TALE sabitləşdirilmiş variantıdır. (Hissə:BBa_K2753023)


Təşəkkürlər

Sürfə balığı təmin edən Fremantle Dənizçilik Mərkəzindəki Su Məhsulları İnkişaf Birliyinin işçilərinə, dosent Graham Mayrhoferə, Molekulyar və Biyomedikal Elmlər Məktəbinə, Tədqiqatın bir hissəsi zamanı laboratoriya imkanlarından istifadə etdiyi üçün Adelaide Universitetinə, Dr Maree Knight və Dr Margo Ferguson, molekulyar texnikada kömək üçün və Dr Margery Barrand və Dr Joseph Lim, Corbett Life Science Rotor-Gene 3000 qPCR detektorundan istifadə etməkdə köməklik göstərdi. Bu tədqiqat Milli Sağlamlıq və Tibbi Tədqiqat Şurası (Avstraliya) tərəfindən dəstəklənmişdir, 1 nömrəli proqram qrantı. 993219, Bir UWA tədqiqat qrantı və Biotexnologiya və Biologiya Elmləri Araşdırma Şurası və Leverhulme Trust tərəfindən layihə qrantları.


Videoya baxın: بيتا-لاكتام: آلية العمل والمقاومة (Oktyabr 2022).