Məlumat

Kütləvi spesifikasiya ilə zülalların PTM -ləri?

Kütləvi spesifikasiya ilə zülalların PTM -ləri?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən başa düşürəm ki, kütləvi spesifikasiya zülalların qlikosilasiyası kimi PTM-ləri öyrənmək üçün geniş istifadə olunur, lakin iki qlikan strukturunun eyni kütləə malik olduğu, lakin fərqli düzülüşü (yəni izobarik) olduğu halda, kütləvi spesifikasiya qlikozilləşmənin düzgün PTM strukturunu necə təyin edə bilər? Ayrıca, kütlə spesifikliyi struktur izomerləri arasındakı fərqi necə təyin edə bilər?


Mən MassSpec mütəxəssisi deyiləm, amma spektroskopiya əsaslarımdan başa düşdüyüm budur:

Tandem MS-də (MS-MS), ionlaşdırılmış analit ümumiyyətlə parçalanmağa məruz qalır və ya daha kiçik ionlara parçalanır. Parçalanma daha incə detalları öyrənməyə imkan verir. De-novo peptid sıralaması üçün də vacibdir. Toqquşma ilə əlaqəli dissosiasiya (CID) və ya Fotofraqmentasiya kimi müxtəlif parçalanma üsulları müxtəlif növ ikinci dərəcəli ionlar verir.

Siz intuitiv olaraq başa düşə bilərsiniz ki, struktur izomerlərin Fraqmentasiyası müxtəlif növ ikinci dərəcəli ionlar verəcək (eyni parçalanma texnikasından istifadə etməklə). Parçalanma texnikasının seçimi analitin molekulyar təbiətindən asılıdır. Daha əvvəl qeyd etdiyim məqalədə, glikan-ionlarını ayırmaq üçün lazerlə induksiya edilmiş fotofragmentasiya istifadə edirlər.

MassSpec tərəfindən klassik olaraq tədqiq edilən kiçik molekullar belə, ionları sabitləşdirmək üçün ionlaşmadan sonra izomerləşməyə məruz qalırlar. Ters-Diels-Adler kimi reaksiyalar da ola bilər. Reaksiyaların nümunəsi struktur izomerlər arasında fərqli olardı. Əsaslar üçün Silversteynin Spektroskopik üsullar kitabına müraciət edə bilərsiniz


Pirinç Toxumlarının İnkişaf etdirilməsində Lisin Süksinilom və Protein Ko-modifikasiyalarının Hərtərəfli Təhlili

Lisin süksinilasiyası son illərdə post-translational modification (PTM) kimi tanınmışdır. Daha həcmli struktur dəyişiklikləri və dəyişdirilmiş lizin qalığında daha əhəmiyyətli yük fərqləri səbəbindən suksinilləşmənin asetilləşmədən daha geniş funksional təsir göstərə biləcəyi inandırıcıdır. Hal -hazırda, süksinilləşmiş zülalların miqdarı və kimliyi və taxıl bitkilərindəki uyğun funksiyaları böyük ölçüdə bilinmir. Bu araşdırmada, düyü toxumlarının inkişafında lizin üzərində yerli suksinilləşmənin 2% ilə 10% arasında olduğunu təxmin etdik. 347 zülalda səkkiz yüz əlli dörd lizin süksinasiya yeri düyü toxumlarının inkişafında hərtərəfli araşdırma ilə müəyyən edilmişdir. Süksinilasiya sahələri üçün üstünlük verilən amin turşusu ardıcıllığı kimi altı motiv aşkar edildi və fərqli bioloji proseslərlə, molekulyar funksiyalarla, yollarla və sahələrlə əlaqəli zülallarda diqqətəlayiq bir motiv tərifi müəyyən edildi. Maraqlıdır ki, əsas toxum saxlama zülallarında, mərkəzi karbon metabolizmasında iştirak edən kritik fermentlər və düyü toxumunun inkişafı üçün nişasta biosintez yolları ilə birlikdə ağır süksinilasiya aşkar edilmişdir. Bu vaxt əldə etdiyimiz nəticələr modifikasiya modelinin olduğunu göstərdi in vitro qeyri -fermentativ süksinilləşmiş zülallar Qərb ləkələrindəki hüceyrələrdən təcrid olunmuş zülallardan fərqlənirdi, bu da süksinilləşmənin hüceyrələrdə fermentativ olmayan reaksiya nəticəsində əmələ gəlmədiyini, ən azından tamamilə yox olduğunu göstərir. Eyni düyü toxumasından əldə edilən asilasiya məlumatlarından istifadə edərək, düyü toxumu zülallarında lizin süksinilləşməsi, asetilasiyası, malonilasiyası, krotonilasiyası və 2-hidroksizobutirilasiyasına malik bir çox saytın xəritəsini çəkdik. Çoxlu modifikasiyaya malik təəccüblü sayda zülalın kritik metabolik hadisələrdə iştirak etdiyi göstərildi. Bu modifikasiya hissələrinin çoxlu hüceyrəli metabolik yolların aralıq məhsulları olduğunu nəzərə alsaq, bu hədəf lizin qalıqları fərqli parçaların modifikasiyası yolu ilə fərqli metabolik yollar arasında kəsişməyə vasitəçilik edə bilər. Tədqiqatımız PTM-lər vasitəsilə taxıl toxumlarının inkişafı və metabolizmini idarə edən molekulyar şəbəkələrin geniş tədqiqi üçün bir platforma nümayiş etdirir.

Açar sözlər: asetilasyon lizin suksinilləşmə kütləvi spektrometriya bitki biologiyası post-translational modifikasiyalar protein modifikasiyası düyü toxumlarının saxlanması qidalandırıcı suksinilom.


6.3. MƏLUMAT BAZASINDA AXTAR MÜLAHƏMƏLƏR

Bir proteindən və ya tərcümə edilmiş genom məlumat bazasından peptid identifikasiyası ehtimala əsaslanır. Bu, verilənlər bazasındakı bütün zülalların proqnozlaşdırılan proteolitik peptidlərinin nəzəri spektrləri ilə MS/MS spektrini müqayisə etməklə edilir. Bir anda birdən çox dəyişiklik nəzərə alınarsa, axtarış müddəti eksponent olaraq artır və “match əldə etmək üçün daha çox modifikasiyadan istifadə olunarsa ehtimal skoru azalır. ”

ŞƏKİL 6.1

Triptik həzm olunan bir zülalın MS spektrinin sxemi.

Verilənlər bazası axtarışı üçün vacib olan başqa bir amil, modifikasiyanın yalnız müəyyən amin turşularına xas olmasıdır. Qeyri-spesifik modifikasiyalar, məsələn, reaksiya verə bilən modifikasiyalar hər hansı amin turşusu, Mascot™ (3) kimi bəzi ümumi verilənlər bazası axtarış sistemləri ilə axtarıla bilməz.


Kütləvi spektrometriyanın tətbiqinə aşağıdakılar daxildir:

Nevroloji proteomika: beyindəki protein populyasiyalarının və PTM-lərin qiymətləndirilməsi

Proteomikanın bir məqsədi, təbii stimullara və streslərə, xəstəlik vəziyyətlərinə və dərman müalicələrinə cavab olaraq zülal populyasiyalarının tərkibinin necə dəyişdiyini araşdırmaq üçün fərdi fəaliyyət göstərən protein izoformlarının reduktiv təhlilindən kənara çıxmaqdır. Beləliklə, məqsəd, ayrı -ayrı nörotransmitterlərin və reseptor növlərinin fəaliyyətlərindən kənara çıxaraq, bioloji nəticələr əldə etmək üçün qarşılıqlı əlaqədə olan yüzlərlə fərqli zülalın nisbi miqdarlarının geniş əhatəli (qlobal) ölçülməsini aparmaqdır.

Beyin və mərkəzi sinir sisteminin (CNS) sinapsları - neyronların öyrənmə və yaddaş kimi hadisələrin molekulyar dayaqları olan kimyəvi siqnalları mübadilə etdikləri dinamik qovşaqlar - şöbə tədqiqatçıları tərəfindən belə kəmiyyət və keyfiyyət (PTM) proteomik analizinin mövzusudur onların nevrolog alimləri. Misal üçün:

CNS stimullaşdırılması zamanı sinaptik proteomda koordinasiya edilmiş dəyişikliklərin izlənməsi

Peptidlərin izotopik etiketlənməsi ilə birlikdə MS geniş CNS dərman stimullaşdırılmasına cavab olaraq fərqli vaxt intervallarında siçan post-sinaptik sıxlıqlarında (PSD) təxminən 900 zülalın nisbi bolluğundakı dəyişiklikləri təhlil etmək üçün istifadə edilmişdir. Sıxlıq sinaptik yarıq boyunca neyronlararası kimyəvi əlaqənin qəbuledici ucunda (dendrite terminalı) zülalla zəngin bir quruluşdur. PSD -lərdə nörotransmitterləri bağlayan reseptorların konsentrasiyaları, eləcə də müxtəlif iskele zülalları tərəfindən yığılmış çoxsaylı əlaqəli sinaptik siqnal və tənzimləyici zülallar var.

Post-sinaptik zülalların nisbi kəmiyyətlərindəki dəyişiklikləri təhlil edərək, tədqiqat müəyyən qrupların birgə tənzimlənən aktivləşməsinin sübutunu tapdı. Beləliklə, zülalların fiziki olaraq qarşılıqlı əlaqədə olmadığı bilinməsə belə əlaqələndirilmiş fəaliyyət göstərdikləri əsas funksional kompleksləri müəyyən edə bildilər.

Beyin bölgəsinə görə sinaptik fosforiliyin və zülal ifadəsinin ölçülməsi

Beyin bölgəsinə görə post-sinaptik sıxlıqlarda protein ifadəsi və fosforiliyadakı fərqləri araşdırmaq üçün qlobal MS kəmiyyət və izotopik etiketləmə tətbiq edilmişdir. Siçan modelində 2100-dən çox zülalın və 1500 fosforlaşma sahəsinin təhlili daha çox ifadəsi məlum funksional komplekslərlə qruplaşdırılan əvvəllər qeyd olunmamış zülallar üçün rol təklif etdi.

Bu tədqiqat həmçinin NMDA-da AMPA reseptorlarına nisbətən nisbətən daha çox fosforlaşma sahələrini aşkar etdi, hər ikisi sinaptik plastisiyada iştirak edir - öyrənmə, yaddaş və digər nevroloji hadisələrin əsasını təşkil edən sinaptik ötürülmələrin effektivliyində dəyişikliklər. Həqiqətən də, araşdırma, yaddaşın formalaşması və məkan oriyentasiyası ilə əlaqəli bir bölgə olan hipokampdakı geri çevrilən fosforilləşmə (kinazlar, fosfatazalar) ilə əlaqəli daha yüksək ferment səviyyələrini tapdı, Alzheimer xəstəliyində ilk zərər çəkənlərdən biridir.

Korteks, beyin ortası, serebellum və hipokampda ən çox yayılmasını göstərən beyin bölgəsinə görə post-sinaptik sıxlıqlarda spesifik bir zülal, chapsyn-110 (membrana bağlı kinaz) nisbi bolluğunun qrafiki. (Fərdi peptidlər nöqtələrlə, orta zülallar isə üfüqi çubuqlarla təmsil olunur.) Bu tədqiqat əvvəlcə Molecular & Cellular Proteomics-də dərc edilmişdir. Trinidad və s., Sinaptik Fosforiliyin və Protein İfadəsinin Kəmiyyət Analizi. Molekulyar və zülal ifadəsi. 2008-ci cild 7:684-696

Qrafik hipokampusda geri dönən fosforlaşma ilə əlaqəli fermentlərin daha yüksək nisbi ifadəsini göstərir. Bu tədqiqat ilk olaraq Molecular & Cellular Proteomics-də dərc edilmişdir. Trinidad və digərləri, Sinaptik Fosforiliyin və Protein İfadəsinin Kəmiyyət Analizi. Molekulyar və zülal ifadəsi. 2008-ci cild 7:684-696

Sinaptik proteomda çətin karbohidrat modifikasiyalarının ilk genişmiqyaslı xəritəsi

Şöbə alimləri siçan sinaptosomlarındakı 453 zülaldan 2500-dən çox unikal N- və O ilə əlaqəli qlikopeptidin spesifik sahələrini və modifikator strukturlarını xarakterizə edən ilk genişmiqyaslı tədqiqatı aparmaq üçün maye xromatoqrafiya və elektron ötürücü dissosiasiya MS-ni tətbiq etdilər - membrana bağlı kisələr. neyron akson terminallarından vesiküllər.

Hüceyrədənkənar qlikozilləşmə, bir və ya daha çox karbohidratın (qlikanların) membrana və ya ifraz olunan zülala bağlandığı struktur cəhətdən əlaqəli PTM-lərin ümumi, mürəkkəb dəstidir. N- və ya O- işarəsi, qlikanın bağlandığı amin turşusu (qalıq) yan zəncirlərindəki azot və ya oksigenə aiddir. Bu PTM -lər digər funksiyalar arasında zülal qatlanmasına kömək edir və sabitləşdirir.

Glikosidik bağlar digər kovalent PTM-lərin peptid bağlarından daha çox toqquşma nəticəsində yaranan dissosiativ proseslərdə daha asanlıqla qırıldığı üçün bu cür təhlillər çətin olur. Ayrıca, glikan-modifikasiya spektrlərinin avtomatik identifikasiyası üçün məhdud proqram təminatı mövcuddur.

Burada tədqiqatçılar iki yaxınlıq xromatoqrafiyasından istifadə etdilər (lektin, TiO2) müəyyən etmək üçün glikopeptidlərin konsentrasiyasını çeşidləmək və zənginləşdirmək. Daha sonra minlərlə sinaptozom zülalını əvvəlcədən təyin edərək transmembran/ifraz olunan zülallara diqqət yetirmiş və potensial glikan komponentlərinə uyğun xüsusi kütlə dəyərləri ilə dəyişiklik etməyə imkan verən bu zülalları axtarmaq üçün mənbənin Protein Kəşfiyyatçısından istifadə etmişlər. Beləliklə, onlar ən çox yayılmış karbohidrat modifikasiyalarını müəyyən etdilər və kütlələrini şəkər (oliqosaxarid) strukturlarına uyğunlaşdırdılar.

Bu cür MS analizləri, 19 qlikan modifikasiyasına malik tək bir sayt da daxil olmaqla, hər bir N-bağlı glikosilasyon sahəsi üçün unikal glikanların sayını təyin etdi.

Ümumi, əhəmiyyətli bir şəkər PTM: O-GlcNAcylation saytlarının və rollarının müəyyənləşdirilməsində qabaqcıl

O-GlcNAcylation bütün heyvanlarda və bitkilərdə (metazoalarda), həm hüceyrə nüvələrində, həm də sitozolda baş verən ümumi, həyati və geri çevrilən post-translational modifikasiyadır. Nüvə və sitozolik zülalların serin və treonin qalıqlarının tək oksigenlə əlaqəli N-asetilglukozamin (GlcNAc) ilə dəyişdirilməsini nəzərdə tutur. Modulyasiyada iştirak edir:

  • gen tənzimlənməsi (transkripsiya faktorlarının dəyişdirilməsi daxil olmaqla)
  • sonuncunun hüceyrə sirkadiyan saatlarına təsiri də daxil olmaqla, hüceyrə stresinə və qida səviyyələrinə reaksiyalar
  • zülalların proteazom tərəfindən məhv edilməsi üçün hədəflənməsi
  • fosforiləşmə ilə tənzimlənən hüceyrədaxili siqnal yolları (ən çox öyrənilən PTM və ümumiyyətlə zülalların açılışı)-dəyişdirilmiş qalıqlar və ya dəyişdirmə yerləri uğrunda rəqabət vasitəsilə
  • diabet və Alzheimer kimi xəstəliklər (O-GlcNAc əlavə edən/çıxaran fermentlər beyində yüksək şəkildə ifadə olunur)

Bu PTM otuz il əvvəl kəşf edilmiş olsa da, bioloji funksiyalarının ətraflı təyin edilməsi, zülalda hansı serin və ya treonin qalıqlarının dəyişdirildiyini dəqiq müəyyən etmək çətinliyi ilə məhdudlaşmışdır. Təhlil üçün zülalları peptidlərə bölmək üçün toqquşmaya səbəb olan dissosiasiyadan istifadə, bir qayda olaraq, dəyişdirilmiş zülalın peptid onurğasından əvvəl daha zəif şəkər-oksigen qlikozid bağlarını qırdı və beləliklə, modifikasiya yeri məlumatlarını itirdi.

Bütün zülallarda, əsasən kimyəvi parçalanma (Edman degradasiyası) yolu ilə 80-dən az dəqiq O-GlcNAsilasyon qalığının məlum olduğu bir vaxtda, elm adamları, lektin (buğda toxumu aglutini) yaxınlıq xromatoqrafiyasını elektron ötürmə dissosiasiyası (ETD) ilə birləşdirərək yeni metodologiyaya rəhbərlik etdilər. ) tandem MS. Bu, yüksək O-GlcNAcylation nisbətlərinin qeyd edildiyi siçan beyin hüceyrələrinin proteomlarına tətbiq edildi. Xüsusilə, tədqiqatçılar post-sinaptik sıxlıqları - sinaptik yarıq boyunca neyronlararası kimyəvi əlaqənin qəbuledici ucunda (dendrite terminalı) zülalla zəngin strukturları təhlil etdilər.

Yeni metodu tətbiq etdikdən sonra şöbə tədqiqatçıları, tək bir təcrübədən 58 modifikasiya sahəsini təyin etdilər, bunlardan 28-i Bassoon-sinaptik aktiv zonada olan bir protein-o zülalda o vaxt məlum olan fosforiləşmə yerlərinin sayına uyğun gəlir və O-GlcNAcylation funksiyasını tənzimləməkdə bərabər rol oynayır. Həqiqətən də, araşdırma, şəkər modifikasiyasının sinapsda fosforilasyonla qarşılıqlı təsir göstərə biləcəyinə dair əlavə sübutlar da tapdı, çünki Bassoon üzərindəki bir neçə O-GlcNAc ilə dəyişdirilmiş sayt fosfatla dəyişdirilmiş olaraq əvvəllər bildirilmişdi.

Sinaptik zülal B-nin N-dən C-ə qədər olan 3940 amin turşusundan ibarət olan tərcümə sonrası dəyişikliklər. 28 O-GlcNAC modifikasiyasının (yuxarıda) mövqeləri fosforlaşma sahələrinə (aşağıda) nisbətən göstərilmişdir. Fosforlaşma yerləri qırmızı ilə göstərildiyi üçün O-GlcNAc saytları da bildirilir. Milli Elmlər Akademiyasının Materiallarından, Doğma peptidlər üzərində elektron köçürmə dissosiasiya kütlə spektrometriyasından istifadə edərək protein O-GlcNAcylation saytlarının müəyyən edilməsi, Chalkley et al., Vol 106 no. 22, 2009, 8894-8899

İki əsas modifikasiyanın ümumi qlobal xarakteristikası

O-GlcNAcylation və fosforilasyon arasında modulyasiya effektləri, qarşılıqlı tənzimləmə və digər qarşılıqlı təsir (çarpazlıq) potensialı aşağıdakı faktorlar tərəfindən irəli sürülür.

  • Hər ikisi serin və treonin qalıq yan zəncirlərini tərsinə dəyişdirir
  • Hər ikisi ümumidir (hüceyrə zülallarının çoxu fosforilləşə bilər, halbuki minlərlə O-GlcNAcylation saytı məlumdur)
  • Qlobal fosforlaşma səviyyələrinin in vitro modulyasiyası bir çox zülalın O-GlcNAcylation səviyyələrini dəyişir və əksinə.

Bu iki ümumi PTM-nin qarşılıqlı təsirini araşdırmaq üçün burada tədqiqatçılar eyni bioloji nümunədə O-GlcNAcylatoin və fosforilasyonun həm birgə aşkarlanmasına, həm də sahə təyin olunmasına imkan verən bir yanaşma hazırladılar. Bu, elektron tutma/köçürmə dissosiasiyası ilə O-GlcNAc və fosfatla dəyişdirilmiş peptidlərin zənginləşdirilməsi üçün yaxınlıq xromatoqrafiyasını (O-GlcNAc ilə lektinin hansı mikrobun aqqlütinin, həm də fosfatlarla titan dioksid arasında zəif qarşılıqlı təsiri) tətbiq edir. Bu ikili PTM xarakteristikasının nümunələrinə aşağıdakılar daxildir:

Qlobal identifikasiya, O-GlcNAcylation və eyni sinaps proteom nümunələrində fosforlaşmanın yeri

Bölmə elm adamları və onların əməkdaşları, süni sinaptozomlardan eyni bioloji nümunələrdəki zülalların həm modifikasiyalarını, həm də yerlərini aşkar etmək üçün bu metodu tətbiq etdilər-sinaptik yarıqda neyronlararası kimyəvi ünsiyyətin (akson terminalları) çatdırılma tərəfindən membranla bağlanmış kisəcik kisələri.

Tədqiqat, hər iki modifikasiyaya malik olan 6000-dən çox zülal təyin etdi və sinaptozom zülallarının 19% və 63% -nin O-GlcNAsilatlı və ya fosforilatlı təxminlərini verdi. O-GlcNAc tərəfindən geniş şəkildə dəyişdirilmiş zülalların, demək olar ki, həmişə oxşar və ya daha çox dərəcədə fosforiləşdiyi aşkar edilmişdir ki, bu da O-GlcNAc-transferazanın (PTM-ni kataliz edən OGT) müəyyən fosforlanmış zülalları hədəf aldığını göstərir. Bundan əlavə, kinazlar (zülalları fosforilləşdirənlər), O-GlcNAc tərəfindən ən geniş şəkildə modifikasiya edilmiş zülallar sinfi idi, bu da O-GlcNAcylation fermentlərin fəaliyyətini tənzimləyən bir çarpazlıq formasıdır.

Sirkadiyalı saatın tənzimlənməsində O-GlcNAcylatoin və fosforlaşmanın qarşılıqlı təsiri

Resurs bakteriyalardan insanlara qədər orqanizmlərdə bioloji prosesləri koordinasiya edən 24 saatlıq hüceyrə sirkadian saatlarının tənzimlənməsində bu dəyişikliklər arasında qarşılıqlı əlaqənin MS təhlilini təqdim etdi. Saatların ritmləri həm qida səviyyəsindən, həm də işıqdan təsirlənə bilər.

Əvvəlki tədqiqatlar sirkadiya ilə əlaqəli transkripsiya faktorlarının və zülalların O-GlcNAsilasiyasının qida sensoru kimi işlədiyini və saatı təsir etdiyini (siçanlarda və meyvə milçəklərində dövrün uzunluğunu dəyişdirərək) tapmışdı. Şöbə alimləri tərəfindən siçanların beyinlərindən və qaraciyərlərindən alınan zülalların MS analizi göstərdi ki, O-GlcNAcylation katalizatoru olan ferment olan OGT, fosforilləşir və beləliklə, bir kinaz (qlikogen sintaza Kinase 3β) tərəfindən tənzimlənir, lakin eyni yerlərdə O-GlcNAc dəyişdirilə bilər. iki fermentin rəqabət apardığını və bir -birinin təsirlərini "incə şəkildə tənzimlədiyini".

A] Sirkadiyalı saat sürətini və ya yuxunun başlama vaxtını tənzimləyən beyin zülalı PER2-nin ikiqat O-GlcNAc ilə dəyişdirilmiş bölgəsinin MS/MS spektri. B] MS/MS bir kinazın (CK1) bağlayıcı domeninin O-GlcNAc modifikasiyası yerlərini müəyyən etdi (557-771 amin turşuları). Müəyyən edilmiş serinlər (nömrələr 662, 668 və 671) eyni zamanda rəqabət aparan dəyişikliklər təklif edən CK1 fosforiləşmə sahələridir. Kimdən Hüceyrə metabolizması, Qlükoza Sensoru O-GlcNAcylation Koordinatları Fosforlaşma ilə Sirkadiyalı Saatı tənzimləyir, Kaasik et. al, fevral 2013, səh. 291-302.

Eyni tədqiqatda tandem MS analizindən istifadə edərək O-GlcNAcylation və fosforilləşmənin eyni zamanda beyin zülalının (PER2) müəyyən bir bölgəsinin saat "sürətini" tənzimləmək üçün kritik bir rəqabət modifikasiyası olduğunu aşkar etdi - bölgənin fosforlaşmasını azaldan mutasiya sindroma gətirib çıxarır. erkən axşam yuxu başlanğıcı.

Epigenetikanın deşifr edilməsi: histonların və xromatin zülallarının (DNT) dəyişikliklərinin aşkarlanması və xarakterizə edilməsi

Vücudumuzun hər bir hüceyrəsində təxminən 20.000 protein kodlayan gen vardır. Bununla belə, gen ifadəsi təkcə hüceyrə növü və inkişaf mərhələsi ilə deyil, həm də stimullara və stresslərə sağlam reaksiya zamanı, disfunksiya və xəstəliklərlə, genetik quruluşu (genotip) müşahidə edilə bilən əlamətlərə (fenotip) çevirərək fərqlənir.

Gen ifadəsinin müntəzəm olaraq dəyişdirilməsinin bir yolu, kimyəvi qrupların və karbohidratların hüceyrə nüvəsindəki DNT kompleksinə və onunla əlaqəli zülallara (xromatin) bağlanmasıdır ki, bu da genin əlçatanlığını dəyişdirən fiziki yenidən qurulmasına gətirib çıxarır.

Bu cür dəyişikliklərin necə və harada baş verdiyini müəyyən etmək, epigenetikaya nümunədir-sonrakı nəsillərə miras qala bilən gen ifadəsindəki ardıcıllıqla əlaqəli olmayan dəyişikliklərin öyrənilməsi. Epigenetik modifikasiyaların əsas alt dəsti histonlara - DNT-ni makaraya bənzər şəkildə paketləyən və sabitləşdirən bir neçə protein izoformasına (nükleosom adlanan təkrarlanan əsas vahid səkkiz histon nüvəsi ətrafında sarılmış DNT seqmentidir) edilir. Bir çox kimyəvi qruplar (məsələn, asetil, metil, ubikuitin, fosfat) tərəfindən histonların modifikasiyasından sonra, adətən strukturlaşdırılmamış N-terminallarında ("quyruq" adlandırılır), transkripsiya zülallarının bağlanma yaxınlıqlarını tənzimləyən xromatinin bir hissəsini yenidən düzəldirlər. gen ifadəsini dəyişdirir.

Qarğıdalıdan (aka qarğıdalı) bir histon (H4) peptidinin (GKGGKGLGKGGAKR) MS/MS spektri, asetil (ac) qrupları (asetilasiya) ilə tərcümə sonrası dəyişikliklərini göstərir. M/Z kütlə-yük nisbətlərini göstərir.

Şöbənin alimləri və onların əməkdaşları histon modifikasiyalarına, həmçinin DNT metilasiyası kimi epigenetik dəyişikliklərə kütləvi spektrometriya tətbiq etməkdə qabaqcıl olmuşlar. Bu cür araşdırmalar, birdən çox modifikasiyanın kompleks birləşmələrinin (qarşılıqlı söhbətlərin) endogen və ekoloji stimullara modulyasiya edilmiş reaksiyalardakı gen ifadəsindəki dəyişikliklərlə əlaqəli olduğunu və pozulduqda disfunksiyalı olduğunu irəli sürən hipotetik histonun və epigenetik kodların deşifrinə kömək edə bilər. xəstəlikdə ifadə.

Histon dəyişiklikləri, kompleks dəyişiklikləri nəzərə alınmaqla, bütöv zülalların analizində kütlə spektrometriyasının tətbiqi üçün çətin bir modeli təmsil edir. Dörd nüvəli nukleosom histonunda 60 -dan çox qalıq bir və ya daha çox dəyişikliyə məruz qalmışdır. Yuxarıdan aşağı elektron ötürmə/ələ keçirmə dissosiasiya üsulları daha böyük peptidlərin təhlilinə imkan verir, lakin müxtəlif sahələrə və müxtəlif miqdarda dəyişikliklər (məsələn, trimetilləşmə) böyüklük sıralarına görə tezliyi və bolluğu ilə fərqlənməsinə baxmayaraq, dəqiq aşkar edilməlidir.

Bölmə araşdırmalarına və MS metodologiyalarının epigenetik dəyişikliklərə tətbiqinə nümunələr bunlardır:

Kanserojen arsenik təsirinin histon modifikasiyasına təsirini ölçmək

Buradakı elm adamları, arsenik məruz qalması səbəbiylə sidik kisəsi xərçənginin inkişafı üçün bir hüceyrə mədəniyyət modelinə müqayisəli histon dəyişikliklərinin kəmiyyət MS analizini tətbiq etdilər. Xüsusilə çirklənmiş yeraltı sular vasitəsilə arsenin məruz qalmasının insanlarda bir neçə növ xərçənglə əlaqəli olduğu bilinsə də, əsas mexanizmlər qeyri-müəyyən olmuşdur. İştirakçılarla işləyən elm adamları, zaman keçdikcə arsenik dozalarına məruz qalan insan uroepiteli hüceyrələrində (sidik yollarını əhatə edən) histon dəyişikliklərini təhlil etdilər. Tədqiqat xüsusi lizin qalıqlarında H3 və H4 histon izoformlarında asetilləşmə səviyyələrində azalma aşkar etdi. Arseniklə dəyişdirilmiş histon asetilasyonu və bədxassəli transformasiya ilə əlaqədar tapıntıları qeyd edən tədqiqatçılar, bu cür epigenetik pozğunluqların böyüməni idarə edən əsas genləri susdura biləcəyini və şiş inkişafına səbəb ola biləcəyini irəli sürdülər.

Əsas nukleosom sahələrinin gen tənzimləyici demetilasiyasının qiymətləndirilməsi

Zamanla histon substratından metil qruplarının çıxarılmasını (demetilasiya) izləmək üçün maye xromatoqrafiya-tandem MS-dən istifadə edərək, buradakı tədqiqatçılar spesifik nukleosom sahələrinin demetilasyonunu qiymətləndirmək üçün geniş tətbiq olunan metod hazırlaya bildilər. Proses in vitro şəkildə yenidən qurularaq, tədqiqat, müxtəlif histon substratları arasında trimetilatlanmış H3 histonun doqquzuncu lizin qalıqlarından (H3 K9) üçüncü bir metil qrupunu çıxaran bir histon demetilaz JMJD2A katalitik sahəsinin reaksiya sürətlərinə (kinetikasına) xüsusi olaraq baxdı. Bu modifikasiya, genləri təsirsiz hala gətirmək üçün xromatin quruluşunu dəyişdirərək transkripsiyanı basdırır. Xərçəngdə susdurulmuş genlərdə bu histon sahəsinin trimetilasiyası müşahidə edilsə də, JMJD2 ferment ailəsinin həddindən artıq ekspressiyası da xəstəlikdə iştirak edir, beləliklə dəqiq demetilasiya tənzimlənməsinin vacibliyini göstərir.


Ən Tez-tez Post-translational Modifikasiyaların Kütləvi Spektrometrik Təhlili

Fosforlaşma

Fosforlaşma geniş yayılmışdır və tez-tez protein modifikasiyası öyrənilir. Serin, treonin və tirozin qalıqları bir fosfat qrupunun fermentativ əlavəsi ilə kovalent şəkildə dəyişdirilir. Fosforiləşmə, bir qayda olaraq, müxtəlif bioloji prosesləri açmaq və söndürmək üçün istifadə olunan geri çevrilə bilən bir prosesdir. Yüklü, hidrofilik qrupun olması zülalların strukturunu dəyişir, çoxsaylı biokimyəvi prosesləri, məsələn, hüceyrə dövrünü, maddələr mübadiləsini və reseptorların tənzimlənməsini tənzimləyir [41, 42].

Müəyyən bir sahənin fosforlaşması ümumiyyətlə molekulların kiçik bir hissəsində olur. Buna görə də, fosforlaşma təhlili həm struktur təyinini (fosforlaşma sahəsinin müəyyən edilməsi), həm də fosforlanmış və fosforlaşdırılmamış analoqların nisbətinin müəyyən edilməsini tələb edir. Fosfoproteinlər proteomun yalnız kiçik bir hissəsini təşkil edir, buna görə də uğurlu analiz üçün zənginləşdirmə strategiyaları vacibdir. Bu məqsədlə immunoaffinity xromatoqrafiyası, immobilizasiya edilmiş metal ion yaxınlığı xromatoqrafiyası (IMAC) və titan dioksid (TiO) kimi metal oksid yaxınlığı xromatoqrafiyası (MOAC) kimi bir neçə üsul hazırlanmışdır.2) və sirkonium dioksid (ZrO2) xromatoqrafiya [43,44,45,46]. IMAC və MOAC, fosfat qruplarının keçid metal ionları və metal oksidlərinə yaxınlığına əsaslanır. Bununla birlikdə, bu materiallar karboksil qruplarına yaxınlıq nümayiş etdirir və nəticədə fosforlanmışların yanında glutamat və aspartat tərkibli peptidlər kimi asidik qalıqların ayrılması ilə nəticələnir [47, 48]. Bu spesifikliyi aradan qaldırmaq üçün çoxsaylı strategiyalar hazırlanmışdır. Zənginləşdirmədən əvvəl karboksil qruplarının esterifikasiyası asidik peptidlərin tutulmasını azaldır. Fosfopeptid xaric edənlər kimi stasionar fazaya yaxınlığı karboksil qruplarından daha yüksək, lakin fosfat qruplarından aşağı olan üzvi turşulardan istifadə olunur. Fosfopeptidlər, peptid və fosfat qrupu arasındakı bağı aradan qaldıran beta eliminasiya vasitəsi ilə IMAC materialından da xüsusi olaraq ayrıla bilər [48]. MOAC -ın müdaxilə edən birləşmələrə (məsələn, duzlar, yuyucu vasitələr) daha çox müqavimət göstərdiyi və bir çox hallarda IMAC -dan daha seçici olduğu göstərilsə də, çoxalmış fosforlu qalıqlar metal oksidə yüksək yaxınlıq ilə bağlana bilər ki, bu da onları elut etməyi xeyli çətinləşdirir. IMAC, buna görə də, çox fosforlu peptidlərin daha yaxşı əhatə olunmasını təmin edir və eyni zamanda heç bir proteolitik həzm olmadan tam uzunluqlu fosfoproteinləri zənginləşdirə bilir [48,49,50]. İmmunoaffinlik xromatoqrafiyası əsasən tirozin qalığı üzərində fosforlanmış zülalların zənginləşdirilməsində istifadə olunur [51]. Fərqli zənginləşdirmə üsulları ilə əldə edilən məlumatların bir-birini yalnız qismən üst-üstə düşdüyünü (təxminən 30%) nəzərə alaraq, fosfoproteom örtüyünü yaxşılaşdırmaq üçün bir neçə metodun birləşməsi tövsiyə olunur [52]. Zənginləşdirilmiş nümunələr, MS analizindən əvvəl, hidrofilik qarşılıqlı təsir kromatoqrafiyası (HILIC), RP-HPLC və SCX [53,54,55] kimi bir çox üsulla parçalana bilər.

MS tərəfindən fosforlanmış peptid xarakteristikasını qeyri -əhəmiyyətsiz edən iki vacib məsələ var. Birincisi, bir fosfopeptidin həssaslığı fosforlanmamış analoqundan [56] xeyli aşağıdır. İkincisi, fosfopeptidlər adətən fosfor turşusunu itirərək CID -də parçalanır və bu səbəbdən fosforiləşmə sahəsinin identifikasiyası pozula bilər [43]. ECD, ETD və/və ya xüsusi MS/MS texnikalarından istifadə (məsələn, MS 3) bu problemi yüngülləşdirə və həm ardıcıllıq təhlilinə, həm də fosforlaşma yerini təyin etməyə imkan verə bilər [57]. Fosfopeptid analizi də derivatizasiya üsulu ilə aparıla bilər. Fosfoserin və fosfotreonin qalıqları seçici olaraq lizin analoquna çevrilir və sonrakı proteolitik parçalanma (məsələn, tripsin və ya Lys-C istifadə etməklə) yeni peptidlərlə nəticələnir [58]. Bu peptidləri MS/MS istifadə edərək təyin etmək və onu törəməsiz analoqun MS/MS ilə müqayisə etmək fosforiləşmə yerini təyin etmək üçün istifadə edilə bilər [46, 58].

Asetilasiya

Son bir neçə il ərzində zülal asetilasiyasının öyrənilməsi PTM analizində əsas məsələyə çevrilmişdir. Zülallar N son nöqtəsində və lizin qalıqlarının ε-amino qrupunda asetilləşdirilə bilər, sonuncunun bioloji əhəmiyyəti daha yüksəkdir. Asetilasiya, gen ifadəsi və DNT təmiri kimi hüceyrə dövrü proseslərində mühüm rol oynadığı qənaətinə gələrək, histonların tənzimlənməsi üçün ən geniş şəkildə xarakterizə edilmişdir [59, 60].

Asetilləşmə adətən çox aşağı stokiometriyada baş verdiyi üçün dəyişdirilmiş zülalların və peptidlərin zənginləşdirilməsi kritik əhəmiyyət kəsb edir. Asetillisinə spesifik antikorlar bu məqsədlə çox qiymətlidir və çox mürəkkəb nümunələrin ilkin təmizləmə mərhələsi olaraq istifadə olunur [61,62,63]. Bununla belə, metod yalnız peptidlər üçün düzgün işləyir, çünki asetilləşdirilmiş amin turşusu qalıqlarının əlçatanlığı bütöv zülallar vəziyyətində məhduddur. Üstəlik, N-terminal asetilasiyanın zənginləşdirilməsi üçün mövcud antikor yoxdur [64]. Ölçü istisna xromatoqrafiyası (SEC), SDS-PAGE və CE [65,66,67] daxil olmaqla, histonların prefraksiyası üçün bir sıra üsullar əlçatandır. Asetilasiya zülalların hidrofob xüsusiyyətini artırır və N-terminal amin qrupundan müsbət yükü çıxarır. Buna görə də asetillənmiş qalıqlar hidrofobiklik (RP-HPLC), elektrostatik qarşılıqlı təsirlər (SCX) və ya hər ikisinə (zvitterionik hidrofilik qarşılıqlı maye xromatoqrafiyası, ZIC-HILIC) əsaslanaraq asetil olmayan həmkarlarından ayrılır [64, 68]. HILIC, metil və asetilləşdirilmiş histonları ayıra bilmə qabiliyyətinə malikdir, bu da nümunənin mürəkkəbliyini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır [69]. Nümunə mürəkkəbliyini azaltmağın başqa bir yolu, lizin qalıqlarını və N-terminal amin qrupunu + 56 Da kütləvi yerdəyişmə və enzimatik həzmdən qoruyan propionil amidlərə çevirən propionik anhidridlə törəmədir [37, 70].

Kütlə spektrometriyası analizində lizin asetilasiyası sabit bir PTM hesab olunur, yəni funksional qrup yüksək enerjili CID istifadə edərək zülalda saxlanılır [23]. Asetilasiya dəyişdirilməmiş variantdan fərqli olaraq 42.01 Da kütlə sürüşməsi ilə müəyyən edilə bilər. Trimetilləşdirilmiş lizin adlanan başqa bir modifikasiya lizin asetilasiyasına çox oxşar çəkiyə (42,04 Da) malik olsa da, yüksək ayırdetməli kütlə spektrometrləri bu cür modifikasiyaları fərqləndirməyə qadirdir [71]. Asetilləşmə lizin qalığının müsbət yükünü neytrallaşdırdığı və triptik parçalanmasını blokladığı üçün bu xarakterik parçalanmanın olmaması asetilləşmənin başqa bir əlaməti ola bilər [72].

O/N qlikosilləşmə

Təxminən, insan zülallarının yarıdan çoxu sadə və ya mürəkkəb qlikan yan zəncirlərini daşıyır, zülalın qatlanmasına və sabitliyinə təsir göstərir [73, 74]. Qlikan yan zəncirinin iki əsas növü vardır: (1) serin, treonin, tirozinin hidroksi qrupuna bağlanmış O-bağlı glikanlar, (2) N-bağlı glikanlar asparagin yan zəncirlərin azotuna bağlanır. Nuklein turşularının və zülalların sintezindən fərqli olaraq, qlikozilləşmə prosesləri şablon yönümlü deyil, glikokonjuqatlar üçün böyük heterojenlik təmin edir. Nəticə etibarilə, qlikoprotein yaxşı müəyyən edilmiş, dəqiq kimyəvi bir varlıq olmaq əvəzinə, protein izoformlarının (qlikoformların) qarışığıdır [75].

Glikoproteinlərin və glikopeptidlərin tam xarakteristikası çoxlu analitik metodlar tələb edir. Bir yanaşmada, glikan yan zəncirlər bir ferment (məsələn, peptid) tətbiqi ilə zülaldan ayrılır. N.-qlikozidaza F, PNGase F) və ya reduktiv eliminasiya yolu ilə. Birincisi N-glikanlar vəziyyətində, ikincisi O-glikanlar üçün istifadə edilə bilər [76,77,78,79]. Şəkərlər sərbəst buraxıldıqda, adətən zülal qarışığından ayrılır və törəmələrə çevrilir. Bütün reaktiv hidrogenlərin metil qrupları ilə əvəz edilməsi (permetilləşmə) bu məqsəd üçün ən geniş yayılmış üsuldur, mürəkkəb qlikanların (məsələn, budaqlanan yerlər, interqlikozidlər arası əlaqə, konfiqurasiya izomerləri) ətraflı struktur təyininə imkan verir [82]. Prosedur sial turşusu qalıqlarını sabitləşdirdiyi üçün, permetilat törəmələri yerli analoqu ilə müqayisədə daha təsirli ionlaşma və daha çox proqnozlaşdırıla bilən parçalanma xüsusiyyətlərini göstərir [80,81,82,83,84]. Permetilatlı glikanlar ən çox MALDI-MS tərəfindən analiz edilir. Karbohidratların azaldılması üçün antranil turşusu (2-aminobenzoy turşusu, 2-AA) işarələnməsi mülayim şəraitdə aparılır, buna görə də arzuolunmaz desialilizasiyadan qaçınmaq olar [85]. 2-AA tag improves both chromatographic and mass spectrometric (in negative ion mode) detectabilities of glycans by acting as a chromophore, fluorophore and adding a negative charge to all the molecules. It also provides more informative fragments facilitating sequential analysis of saccharides [81, 85,86,87,88]. The derivatives can be subsequently separated by a number of methods, such as HILIC and CE prior to mass spectrometric analysis. CE is capable of separating positional isomers as well as differently linked glycans with high resolution and short analysis time, while HILIC tends to yield better retention time repeatability [89, 90]. It is also demonstrated that the techniques show notable complementarity in the glycoform profiling of therapeutic proteins [91].

An alternative to release glycan analysis is digestion of the protein (mixture) with proteolytic enzymes (e.g. trypsin). This yields a mixture of peptides and glycopeptides, and can be analyzed by CID- or ECD-based tandem mass spectrometry. Enzymatic digestion is often followed by enrichment techniques prior to the MS analysis. Glycopeptides may be enriched by boronate affinity chromatography, lectin affinity chromatography, HILIC, and electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography (ERLIC) [75, 92,93,94,95,96]. Boronate affinity chromatography is able to capture glycan moieties through formation of borate diesters with vicinal diols of the sugar residues. This ensures selective enrichment of glycopeptides, even in complex mixtures. In contrast to boronate affinity chromatography, lectin affinity chromatography allows the enrichment of unique glycoproteins/peptides having specific glycan structure, which may be exceptionally useful in the exploration of disease-related, abnormal glycosylation pattern [97]. As glycosylation increases hydrophilicity of proteins and peptides, glycopeptides can be easily separated from non-glycosylated ones by HILIC. ERLIC, in which positively charged functional groups are attached to the stationary phase, can be considered as a combination of hydrophilic interaction and ion-exchange chromatography. Sialylated moieties with negative charge are, therefore, highly retained, while positively charged peptides are easily eluted [98]. It is also reported that certain gradient HILIC methods can be converted into isocratic separations by ERLIC [99].

There are various mass spectrometric approaches for glycopeptide analysis, identifying the glycan structure, the glycosylation site and also the abundance ratio of various glycoforms. CID fragmentation often cleaves off the sugar residue, while ECD and ETD can yield information on the peptide sequence [75]. Ion mobility–mass spectrometry (IM-MS) is also a promising analytical tool in this field with the added value of being able to separate analytes based on their size. This technique has been successfully applied for the separation and characterization of isobaric polysaccharides and glycopeptides [100, 101].

Amidation

Approximately, half of the endocrine and neural peptides bear C-terminal amidation [102]. The presence of such modification is indispensable for signal transduction and receptor recognition [102, 103]. Furthermore, derivatization of amidated peptides with glycosylphosphatidylinositol is responsible for anchoring peptides and proteins to the cell membrane [104].

As in most cases in the field of PTMs, proteins that are presumably amidated at the C terminus can be separated or enriched by specifically engineered approaches based on the affinity of such proteins. For a long time, only radioimmunoassay (RIA) and immunoprecipitation (IP) have been applied for identification of amidated proteins [105, 106]. Separation of amidated peptides from their precursors can be carried out with RP-HPLC [105]. Weak cation-exchange chromatography (WCX) has been reported to be able to separate the α-amidated heavy chain of immunoglobulin G1 from other isoforms [107].

Amidation of a carboxyl group manifests in a 1 Da mass shift, which is very difficult to identify. The situation can be further complicated when the C-terminal amino acid is glutamine or asparagine, which cannot be distinguished from the amidated form of glutamate or aspartate, except when an auxiliary chemical or enzymatic procedure is performed. An approach has been developed for detecting C-terminal amidation by a combination of chemical derivatization and MALDI-TOF/TOF MS [86]. First step is the derivatization of the free carboxyl group at the C terminal, resulting in a methylamide structure [108, 109]. This results in a 13 Da mass increment observable in the spectrum, enabling the distinction between the amidated and the unmodified peptides. This method was shown to be able to distinguish isobaric residues at the C terminal, such as Gln-OH and Glu-NH2 or Asn-OH and Asp-NH2, suggesting a wider application to investigate modified and unmodified C terminals of proteins [104].

Hydroxylation

Although hydroxylation can take place on several amino acids including lysine, histidine, asparagine, aspartate, and aromatic residues, the most commonly hydroxylated amino acid is proline, which makes up almost one-third of collagen protein [110,111,112]. Hydroxylation generally takes place at the γ-C atom, yielding 4-hydroxyproline (4-Hyp), which has the ability to stabilize the secondary structure of the protein by the powerful electronegative effect of the hydroxy group [112]. Hyp is also associated with the decreased availability of oxygen in the cellular environment, as the alpha subunits of hypoxia-induced factor (HIF) contain hydroxylated proline residues [113].

Mass spectrometric investigation of collagenous proteins is intricate due to the large number of proline residues and the high abundance of hydroxylation. These structural features result in a vast number of isobaric but differently modified peptides in a typical proteomic workflow, which usually co-elute during chromatographic separation and provide chimeric spectra troublesome to elucidate. Moreover, the nominal mass of Hyp is 113 Da, which is the same as leucine and isoleucine. To overcome such difficulties, a mass spectrometer with high mass accuracy and abundant product ions from the tandem MS experiment are required [114, 115]. Unfortunately, MS n sequence analysis is ruined by the abnormal fragmentation of Pro- and Hyp-rich proteins and peptides. These residues promote characteristic and dominant cleavages instead of those nonselective ones, which may provide sequence information. This phenomenon is the so-called “proline-effect”, by which the identification of collagens and other proline-rich proteins are greatly hampered [114, 116, 117]. An approach has been suggested that is based on the application of five different proteolytic enzymes to increase sequence coverage of collagenous proteins. Thereafter, the analytes were separated by nano-LC and introduced into a linear ion trap–orbitrap instrument. Differently modified peptides with the same sequence were eluted and ionized together producing chimeric mass spectra. As ETD-induced fragmentation did not yield sufficient amount of data, additional dissociation techniques (CID and HCD) were also applied. In general, multistage activation made the identification of PTM-carrying residues possible, however, in some cases, the exact localization of the modification has remained unknown [114].

Table 2 summarizes the separation/enrichment techniques, fragmentation methods, and commonly used derivatization methods of modified peptides and proteins.


İstinadlar

Csizmok, V. & Forman-Kay, J. D. Complex regulatory mechanisms mediated by the interplay of multiple post-translational modifications. Current opinion in structural biology 48, 58–67 (2018).

Santos, A. L. & Lindner, A. B. Protein posttranslational modifications: Roles in aging and age-related disease. Oksidləşdirici Təbabət və Hüceyrə Uzunömürlülüyü 2017 (2017).

Ubersax, J. A. & Ferrell, J. E. Mechanisms of specificity in protein phosphorylation. Nature reviews. Molecular cell biology 8, 530–541 (2007).

Tsiatsiani, L. & Heck, A. J. R. Proteomics beyond trypsin. The FEBS journal 282, 2612–2626 (2015).

Swaney, D. L., Wenger, C. D. & Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of proteome research 9, 1323–1329 (2010).

Giansanti, P., Tsiatsiani, L., Low, T. Y. & Heck, A. J. R. Six alternative proteases for mass spectrometry-based proteomics beyond trypsin. Nature protocols 11, 993–1006 (2016).

Casanovas, A., Gallardo, O., Carrascal, M. & Abian, J. Tcellxtalk facilitates the detection of co-modified peptides for the study of protein post-translational modification cross-talk in t cells. Bioinformatics (Oxford, England) (2018).

Liu, Y., Wang, M., Xi, J., Luo, F. & Li, A. Ptm-ssmp: A web server for predicting different types of post-translational modification sites using novel site-specific modification profile. International journal of biological sciences 14, 946–956 (2018).

Li, F. və b. Quokka: a comprehensive tool for rapid and accurate prediction of kinase family-specific phosphorylation sites in the human proteome. Bioinformatics (Oxford, England) 34, 4223–4231 (2018).

Li, G. X. H., Vogel, C. & Choi, H. Ptmscape: an open source tool to predict generic post-translational modifications and map modification crosstalk in protein domains and biological processes. Molecular omics 14, 197–209 (2018).

Patrick, R., Lê Cao, K.-A., Kobe, B. & Bodén, M. Phosphopick: modelling cellular context to map kinase-substrate phosphorylation events. Bioinformatics (Oxford, England) 31, 382–389 (2015).

He, W., Wei, L. & Zou, Q. Research progress in protein posttranslational modification site prediction. Briefings in functional genomics (2018).

Chen, Z. və b. Large-scale comparative assessment of computational predictors for lysine post-translational modification sites. Briefings in bioinformatics (2018).

Xu, Y., Yang, Y., Wang, Z., Li, C. & Shao, Y. A systematic review on posttranslational modification in proteins: Feature construction, algorithm and webserver. Protein and peptide letters 25, 807–814 (2018).

Wang, D., Liang, Y. & Xu, D. Capsule network for protein post-translational modification site prediction. Bioinformatika ( Oxford, England ) (2018).

Eisenhaber, B. & Eisenhaber, F. Prediction of posttranslational modification of proteins from their amino acid sequence. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 609, 365–384 (2010).

Hui, E. və b. T cell costimulatory receptor cd28 is a primary target for pd-1-mediated inhibition. Science (New York, N.Y.) 355, 1428–1433 (2017).

Venne, A. S., Kollipara, L. & Zahedi, R. P. The next level of complexity: crosstalk of posttranslational modifications. Proteomika 14, 513–524 (2014).

Wiese, H. və b. Comparison of alternative ms/ms and bioinformatics approaches for confident phosphorylation site localization. Journal of proteome research 13, 1128–1137 (2014).

Collins, M. O., Wright, J. C., Jones, M., Rayner, J. C. & Choudhary, J. S. Confident and sensitive phosphoproteomics using combinations of collision induced dissociation and electron transfer dissociation. Journal of proteomics 103, 1–14 (2014).

Imanishi, S. Y. və b. Reference-facilitated phosphoproteomics: fast and reliable phosphopeptide validation by microlc-esi-q-tof ms/ms. Molecular & cellular proteomics: MCP 6, 1380–1391 (2007).

Consortium, T. U. Uniprot: the universal protein knowledgebase. Nuklein turşularının tədqiqi 45, D158–D169 (2017).

Hornbeck, P. V. və b. Phosphositeplus, 2014: mutations, ptms and recalibrations. Nuklein turşularının tədqiqi 43, D512–D520 (2015).

Bezanson, J., Edelman, A., Karpinski, S. & Shah, V. B. Julia: A fresh approach to numerical computing. SIAM Review 59, 65–98, http://julialang.org/publications/julia-fresh-approach-BEKS.pdf (2017).

Pont, F. & Fournié, J. J. Sorting protein lists with nwcompare: A simple and fast algorithm for n-way comparison of proteomic data files. Proteomika 10, 1091–1094 (2010).


A High Resolution Mass Spectrometry Study Reveals the Potential of Disulfide Formation in Human Mitochondrial Voltage-Dependent Anion Selective Channel Isoforms (hVDACs)

The voltage-dependent anion-selective channels (VDACs), which are also known as eukaryotic porins, are pore-forming proteins, which allow for the passage of ions and small molecules across the outer mitochondrial membrane (OMM). They are involved in complex interactions that regulate organelle and cellular metabolism. We have recently reported the post-translational modifications (PTMs) of the three VDAC isoforms purified from rat liver mitochondria (rVDACs), showing, for the first time, the over-oxidation of the cysteine residues as an exclusive feature of VDACs. Noteworthy, this peculiar PTM is not detectable in other integral membrane mitochondrial proteins, as defined by their elution at low salt concentration by a hydroxyapatite column. In this study, the association of tryptic and chymotryptic proteolysis with UHPLC/High Resolution nESI-MS/MS, allowed for us to extend the investigation to the human VDACs. The over-oxidation of the cysteine residues, essentially irreversible in cell conditions, was as also certained in VDAC isoforms from human cells. In human VDAC2 and 3 isoforms the permanently reduced state of a cluster of close cysteines indicates the possibility that disulfide bridges are formed in the proteins. Importantly, the detailed oxidative PTMs that are found in human VDACs confirm and sustain our previous findings in rat tissues, claiming for a predictable characterization that has to be conveyed in the functional role of VDAC proteins within the cell. Data are available via ProteomeXchange with identifier PXD017482.

Açar sözlər: Cysteine over-oxidation Orbitrap Fusion Tribrid hydroxyapatite mitochondria mitochondrial intermembrane space outer mitochondrial membrane post-translational modification.

Maraqların toqquşması bəyanatı

Müəlliflər maraqların toqquşmadığını bəyan edirlər.

Rəqəmlər

Sequence coverage map of hVDAC1…

Sequence coverage map of hVDAC1 obtained by tryptic and chymotryptic digestion. The gray…

MS/MS spectrum of the doubly…

MS/MS spectrum of the doubly charged molecular ion at m/z 1083.9756 (calculated 1083.9754)…

MS/MS spectrum of the triply…

MS/MS spectrum of the triply charged molecular ion at m/z 812.0634 (calculated 812.0635)…

Sequence coverage map of hVDAC2…

Sequence coverage map of hVDAC2 obtained by tryptic and chymotryptic digestion. Gray solid…

Sequence coverage map of hVDAC3…

Sequence coverage map of hVDAC3 obtained by tryptic and chymotryptic digestion. The gray…

Scheme of the cysteine localization…

Scheme of the cysteine localization in the aligned sequences of human VDAC isoforms.…


The basics of mass spectrometry

Since their inception in 1912, mass spectrometers have undergone continuous development, and these sophisticated bioanalytical instruments have now reached unrivalled detection limits, speed and diversity in applications. They detect the presence and abundance of peptides (or other biomolecules such as metabolites, lipids and proteins) using fundamental properties of molecules, such as mass, and net charge. When peptides obtain a net charge (usually through gain of protons), they are referred to as peptide ions.

All mass spectrometers have three fundamental components: an ion source, mass analyser and detector (Figure 1A). As mass spectrometers can only analyse gaseous ions, methods such as electrospray ionization (ESI) are needed to convert peptides from the liquid phase to gaseous ions. The liquid containing the peptides is pumped through a micrometre-sized orifice held at a high voltage (2–4 kV). Upon reaching this emitter, the steady stream of liquid disintegrates into extremely small, highly charged and rapidly evaporating charged droplets, leaving peptide ions in the gas phase. Even 20 years after John Fenn received the Nobel Prize for this discovery, the exact mechanisms are not completely understood. We know that the abundance of gaseous peptide ions is proportional to their original concentration, making it beneficial to use the lowest flow rates possible, thereby maximizing sensitivity. It is common in proteomics to separate peptide mixtures using high-performance liquid chromatography (HPLC) systems with flow rates of only a few hundred nanolitres per minute rather than millilitres in conventional HPLC.

Overview of sample preparation and instrumentation used in MS-based proteomics. (A) Proteins are digested into peptides using sequence-specific proteases. Optionally, post-translational modification (PTM)-containing peptides can be enriched using beads with specific surface chemistry or coupled antibodies. High-performance liquid chromatography (HPLC) separates peptides based on hydrophobicity, and they are subsequently analysed by a TOF mass spectrometer. (B) Alternatively, peptides can be analysed by an Orbitrap mass spectrometer, which is a mainstream instrument in proteomics.

The principal role of a mass analyser is to separate ions by their mass-to-charge ratios (m/z). Fundamentally, all ions are separated by modulating their trajectories in electrical fields. Mass analysers differ in the principle they use for separating ions, and this defines their preferred application areas. Quadrupoles, usually combined with time-of-flight (TOF) or Orbitrap analysers, are the most common in proteomics. Quadrupole mass analysers separate ions using an oscillating electrical field between four cylindrical rods in a parallel arrangement, where each pair of rods produces a radio frequency electrical field with a phase offset. The resulting electrical fields define a pseudo-potential surface that is configured to allow the transmission of all ions, or to selectively transmit ions of a specific m/z window.

TOF mass analysers separate ions based on the differences in velocities after acceleration to about 20 kV and subsequent different arrival times at the detector. A TOF can measure mass differences of one part per million (ppm) by detecting time differences of sub-microseconds. In contrast, the Orbitrap mass analyser distinguishes ions based on their oscillation frequencies. Ions are tangentially injected and then trapped in the Orbitrap, and they move along the length axis of a central metal spindle (Figure 1B). Although an Orbitrap is only a few centimetres long, the ions can rapidly travel up to several kilometres, enabling very high resolution (typically tens of thousands) and low ppm mass accuracy.

In proteomics, the quadrupole element is normally followed by a ‘collision cell’, which is a quadrupole where the ions can be fragmented. Either intact peptide ions or fragment ions enter the final stage that also contains the detector – the resulting spectra are called MS 1 or precursor ion spectra in the former case and MS 2 or product or MS/MS spectra in the latter. TOF instruments have microchannel plate (MCP) detectors, where each individual ion ejects electrons from a surface that are then amplified. Individual ions can be readily measured with MCPs, but this exquisite sensitivity comes with the caveat that the detector can easily saturate in case of high signals. In Orbitrap analysers, the ‘image current’ induced by the rapidly oscillating ions is measured, and it represents a quantitative readout of the strength of the individual ion packages. The current is recorded in the time domain and is converted into the frequency domain using Fourier transformation. Advances in signal processing algorithms have repeatedly doubled the achievable resolution with a given transient time of the signal, but these are still orders of magnitude slower than those of TOF analysers (tens to hundreds of milliseconds vs typically 100 microseconds for a single TOF pulse).

How do the MS instruments sequence or identify peptides? Precursor ions with a specific m/z are first isolated by the quadrupole and fragmented through collision with inert gases such as N2, He or Ar. This causes them to break apart at the lowest energy bonds – typically, some of the amide bonds (peptide bonds) connecting the amino acid residues – and leaves MS/MS spectra with incomplete ladders of peaks differing by amino acid masses. This information is incredibly specific and is used for identification of the peptide sequence. A sequence of just a few amino acids and the flanking masses – a peptide sequence tag – is sufficient for identifying a peptide from the entirety of human proteome. More usually, database identification involves generating all possible fragmentation spectra and then statistically scoring them against the experimental spectra.

The chromatographic retention time is an important level of information when matching a dataset against a previous measurement and is key to ‘targeted proteomics’ technologies. Furthermore, ion mobility analysis, an additional dimension of separation of peptide ions, has recently become mainstream. Ions are either filtered based on their cross-section (FAIMS, field asymmetric ion mobility spectrometry) or actually separated during their analysis (T-Wave or TIMS, trapped ion mobility spectrometry). TIMS is the basis of the parallel accumulation–serial fragmentation (PASEF) technology, which multiplies sequencing speed 10-fold while improving sensitivity.


Mücərrəd

Protozoan parasitic infections are health, social and economic issues impacting both humans and animals, with significant morbidity and mortality worldwide. Protozoan parasites have complicated life cycles with both intracellular and extracellular forms. As a consequence, protozoan adapt to changing environments in part through a dynamic enzyme-catalyzed process leading to reversible posttranslational modifications (PTMs). The characterization by proteomics approaches reveals the critical role of the PTMs of the proteins involved in host-pathogen interaction. The complexity of PTMs characterization is increased by the high diversity, stoichiometry, dynamic and also co-existence of several PTMs in the same moieties which crosstalk between them. Here, we review how to understand the complexity and the essential role of PTMs crosstalk in order to provide a new hallmark for vaccines developments, immunotherapies and personalized medicine. In addition, the importance of these motifs in the biology and biological cycle of kinetoplastid parasites is highlighted with key examples showing the potential to act as targets against protozoan diseases.


Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation—a 25 year update. Trendlər Biochem. Elmi. 25, 596–601 (2000).

Tyers, M. & Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr. Rəy. Genet. Dev. 10, 54–64 (2000).

Carr, S.A. et al. Protein and carbohydrate structural analysis of a recombinant soluble CD4 receptor by mass spectrometry. J. Biol. Kimya 264, 21286–21295 (1989).

Ling, V. et al. Characterization of the tryptic map of recombinant DNA-derived tissue plasminogen activator by high-performance liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Kimya 63, 2909–2915 (1991).

Roepstorff, P. Mass spectrometry in protein studies from genome to function. Curr. Rəy. Biotexnol. 8, 6–13 (1997).

Aebersold, R. & Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Təbiət, in press (2003).

Jensen, O.N. Modification-specific proteomics: strategies for systematic studies of post-translationally modified proteins. daxilində Proteomics: A Trends Guide (eds. Blackstock, W. & Mann, M.) 36–42 (Elsevier Science, London 2000).

McLachlin, D.T. & Chait, B.T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr. Rəy. Kimya Biol. 5, 591–602 (2001).

Sickmann, A. & Meyer, H.E. Phosphoamino acid analysis. Proteomika 1, 200–206 (2001).

Mann, M. et al. Analysis of protein phosphorylation using mass spectrometry: deciphering the phosphoproteome. Trendlər Biotexnologiya. 20, 261–268 (2002).

Loughrey Chen, S. et al. Mass spectrometry-based methods for phosphorylation site mapping of hyperphosphorylated proteins applied to Net1, a regulator of exit from mitosis in yeast. Mol. Cell Proteomics 1, 186–196 (2002).

Gorg, A. et al. The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Elektroforez 21, 1037–1053 (2000).

Rabilloud, T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomika 2, 3–10 (2002).

Fey, S.J. & Larsen, P.M. 2D or not 2D. Two-dimensional gel electrophoresis. Curr. Rəy. Kimya Biol. 5, 26–33 (2001).

Larsen, M.R., Larsen, P.M., Fey, S.J. & Roepstorff, P. Characterization of differently processed forms of enolase 2 from Saccharomyces cerevisiae by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Elektroforez 22, 566–575 (2001).

Knebel, A., Morrice, N. & Cohen, P. A novel method to identify protein kinase substrates: eEF2 kinase is phosphorylated and inhibited by SAPK4/p38δ. EMBO J. 20, 4360–4369 (2001).

MacDonald, J.A., Mackey, A.J., Pearson, W.R. & Haystead, T.A. A strategy for the rapid identification of phosphorylation sites in the phosphoproteome. Mol. Cell Proteomics 1, 314–322 (2002).

Covey, T.R., Shushan, B.I., Bonner, R., Schroder, W. & Hucho, F. LC/MS and LC/MS/MS screening for the sites of post-translational modifications in proteins. daxilində Methods in Protein Sequence Analysis (eds Jörnvall, H., Höög, J.O. & Gustavsson, A.M.). 249–256 (Birkhäuser Verlag, Basel, 1991).

Bateman, R.H. et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. J. Am. Soc. Kütləvi spektr. 13, 792–803 (2002).

Wilm, M., Neubauer, G. & Mann, M. Parent ion scans of unseparated peptide mixtures. Anal. Kimya 68, 527–533 (1996).

Carr, S.A., Huddleston, M.J. & Annan, R.S. Selective detection and sequencing of phosphopeptides at the femtomole level by mass spectrometry. Anal. Biokimya. 239, 180–192 (1996).

Steen, H., Kuster, B., Fernandez, M., Pandey, A. & Mann, M. Detection of tyrosine-phosphorylated peptides by precursor ion scanning quadrupole TOF mass spectrometry in positive ion mode. Anal. Kimya 73, 1440–1448 (2001).

Steen, H., Kuster, B., Fernandez, M., Pandey, A. & Mann, M. Tyrosine phosphorylation mapping of the epidermal growth factor receptor signaling pathway. J. Biol. Kimya 277, 1031–1039 (2002).

Hinsby, A.M., Olsen, J.V., Bennett, K.L. & Mann, M. Signaling initiated by overexpression of the fibroblast growth factor receptor-1 investigated by mass spectrometry. Mol. Hüceyrə. Proteomika, in press (2003).

Mann, M. & Wilm, M.S. Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags. Anal. Kimya 66, 4390–4399 (1994).

Eng, J.K., McCormack, A.L. & Yates, J.R.I. An approach to correlate MS/MS data to amino acid sequences in a protein database. J. Am. Soc. Kütləvi spektr. 5, 976–989 (1994).

Perkins, D.N., Pappin, D.J., Creasy, D.M. & Cottrell, J.S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Elektroforez 20, 3551–3567 (1999).

MacCoss, M.J., Wu, C.C. & Yates, J.R. Probability-based validation of protein identifications using a modified SEQUEST algorithm. Anal. Kimya 74, 5593–5599 (2002).

Creasy, D.M. & Cottrell, J.S. Error-tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomika 2, 1426–1434 (2002).

Marshall, A.G., Hendrickson, C.L. & Jackson, G.S. Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: a primer. Kütləvi spektr. Rev. 17, 1–35 (1998).

Martin, S.E., Shabanowitz, J., Hunt, D.F. & Marto, J.A. Subfemtomole MS and MS/MS peptide sequence analysis using nano-HPLC micro-ESI Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Kimya 72, 4266–4274 (2000).

Zubarev, R.A. və s. Electron-capture dissociation for structural characterization of multiply charged protein cations. Anal. Kimya 72, 563–573 (2000).

Stensballe, A., Jensen, O.N., Olsen, J.V., Haselmann, K.F. & Zubarev, R.A. Electron-capture dissociation of singly and multiply phosphorylated peptides. Rapid Commun. Kütləvi spektr. 14, 1793–1800 (2000).

Shi, S.D. və s. Phosphopeptide/phosphoprotein mapping by electron-capture dissociation mass spectrometry. Anal. Kimya 73, 19–22 (2001).

Kelleher, N.L. və s. Localization of labile posttranslational modifications by electron-capture dissociation: the case of γ-carboxyglutamic acid. Anal. Kimya 71, 4250–4253 (1999).

Kjeldsen, F., Haselmann, K.F., Budnik, B.A., Soerensen, E.S. & Zubarev, R.A. Complete characterization of post-translational modification sites in the bovine milk protein PP3 by tandem mass spectrometry with electron-capture dissociation as the last stage. Anal. Kimya, in press (2003).

Sze, S.K., Ge, Y., Oh, H. & McLafferty, F.W. Top-down mass spectrometry of a 29-kDa protein for characterization of any posttranslational modification to within one residue. Proc. Natl. Akad. Elmi. ABŞ 99, 1774–1779 (2002).

Soskic, V., Gorlach, M., Poznanovic, S., Boehmer, F.D. & Godovac-Zimmermann, J. Functional proteomics analysis of signal transduction pathways of the platelet-derived growth factor-β receptor. Biokimya 38, 1757–1764 (1999).

Yamagata, A. et al. Mapping of phosphorylated proteins on two-dimensional polyacrylamide gels using protein phosphatase. Proteomika 2, 1267–1276 (2002).

Stensballe, A., Andersen, S. & Jensen, O.N. Characterization of phosphoproteins from electrophoretic gels by nanoscale Fe(iii) affinity chromatography with off-line mass spectrometry analysis. Proteomika 1, 207–222 (2001).

Pandey, A. et al. Analysis of receptor signaling pathways by mass spectrometry: identification of Vav-2 as a substrate of the epidermal and platelet-derived growth factor receptors. Proc. Natl. Akad. Elmi. ABŞ 97, 179–184 (2000).

Gronborg, M. et al. A mass spectrometry-based proteomic approach for identification of serine/threonine-phosphorylated proteins by enrichment with phospho-specific antibodies: identification of a novel protein, Frigg, as a protein kinase A substrate. Mol. Hüceyrə. Proteomika 1, 517–527 (2002).

Peng, J. & Gygi, S.P. Proteomics: the move to mixtures. J. Kütlə Spektrumu. 36, 1083–1091 (2001).

MacCoss, M.J. et al. Shotgun identification of protein modifications from protein complexes and lens tissue. Proc. Natl. Akad. Elmi. ABŞ 99, 7900–7905 (2002).

Ho, Y. et al. İçindəki protein komplekslərinin sistematik şəkildə müəyyən edilməsi Saccharomyces cerevisiae kütləvi spektrometriya ilə. Təbiət 415, 180–183 (2002).

Gavin, A.C. və başqaları. Zülal komplekslərinin sistematik təhlili ilə maya proteomunun funksional təşkili. Təbiət 415, 141–147 (2002).

Andersson, L. & Porath, J. Isolation of phosphoproteins by immobilized metal (Fe 3+ ) affinity chromatography. Anal. Biokimya. 154, 250–254 (1986).

Posewitz, M.C. & Tempst, P. Immobilized gallium(iii) affinity chromatography of phosphopeptides. Anal. Kimya 71, 2883–2892 (1999).

Ficarro, S.B. və s. Phosphoproteome analysis by mass spectrometry and its application to Saccharomyces cerevisiae. Nat. Biotexnol. 20, 301–305 (2002).

Salomon, A.R. və s. Profiling of tyrosine-phosphorylation pathways in human cells using mass spectrometry. Proc. Natl. Akad. Elmi. ABŞ 100, 443–448 (2003).

Zhou, H., Watts, J.D. & Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat. Biotexnol. 19, 375–378 (2001).

Oda, Y., Nagasu, T. & Chait, B.T. Enrichment analysis of phosphorylated proteins as a tool for probing the phosphoproteome. Nat. Biotexnol. 19, 379–382 (2001).

Steen, H. & Mann, M. A new derivatization strategy for the analysis of phosphopeptides by precursor ion scanning in positive ion mode. J. Am. Soc. Kütləvi spektr. 13, 996–1003 (2002).

Medzihradszky, K.F. və s. The characteristics of peptide collision-induced dissociation using a high-performance MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometer. Anal. Kimya 72, 552–558 (2000).

Gygi, S.P. et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat. Biotexnol. 17, 994–999 (1999).

Oda, Y., Huang, K., Cross, F.R., Cowburn, D. & Chait, B.T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation. Proc. Natl Acad. Elmi. ABŞ 96, 6591–6596 (1999).

Stemmann, O., Zou, H., Gerber, S.A., Gygi, S.P. & Kirschner, M.W. Dual inhibition of sister chromatid separation at metaphase. Hüceyrə 107, 715–726 (2001).

Ong, S.E., Kratchmarova, I. & Mann, M. Properties of 13 C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J. Proteome Res., in press (2003).

Blagoev, B. et al. A proteomics strategy to elucidate functional protein–protein interactions applied to EGF signaling. Nat. Biotexnol. 21, 315–318 (2003).


Videoya baxın: Zülalların insan bədənindəki inanılmaz vəzifələri (Dekabr 2022).