Məlumat

Fenilizotiyosiyanat (PTH) ilə peptidləri müəyyən etmək üçün Edman üsulu

Fenilizotiyosiyanat (PTH) ilə peptidləri müəyyən etmək üçün Edman üsulu


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hamımız bilirik ki, bu üsulda PTH ilk amin turşusu (aa) ilə N-terminaldan peptidə qədər reaksiya verir və ondan ayrılaraq PTH-aa verir ki, peptiddəki amin turşularının ardıcıllığını bilək.

Sual olunur ki, PTH-nin eyni zamanda və fazada birinci amin turşusu ilə ayrıldıqdan sonra ikinci amin turşusu ilə reaksiyaya girməsinə nə mane olur? Çünki belə olsa, ardıcıllıqla birinci və ikinci amin turşusu qalıqlarını ayırd edə bilmərik.


Qısa cavab budur ki, Edman tənəzzülü çox mərhələli bir prosesdir. Vikipediya səhifəsində mexanizmin layiqli təsviri var. Təcrübədə, peptid sabit bir tiyoüre vermək üçün yüngül əsas şərtlərdə fenilizotiosiyanat (PTH) ilə reaksiya verilir. Həddindən artıq PTH tiyoüre aralıqdan ayrılır. Tioürea daha sonra parçalanmaq üçün turşu ilə işlənir N.-peptiddən son qalıq. PTH artıq mövcud deyil, ona görə də ikinci qalıq ilə reaksiya verməklə bağlı heç bir narahatlıq yoxdur.


Edman Deqradasiya diaqramları

Alain Doucet, Christopher M. Overall, Methods in Enzymology, 2011

Mücərrəd

Edman degradasiyası, zülalların və parçalanma parçalarının N-terminal ardıcıllığı üçün çoxdan qurulmuş bir texnikadır. Bununla birlikdə, dəqiq məlumat təhlili və amin turşularının təyin edilməsi üçün Edman sıralaması yalnız tək zülal nümunələri üzərində aparılır və buna görə də yüksək məhsuldarlıq qabiliyyətinə malik deyil. Çözümdə birdən çox protein parçasının N-terminal ardıcıllığının yüksək məhsuldarlığı üçün yeni bir üsul təsvir edirik. Proteolitik emal bioaktiv zülalların fəaliyyətini dəyişə bilər, həmçinin şifrəli bağlanma sahələrini aşkar edə və ana molekulunda tapılmayan yeni funksiyaları olan (neoproteinlər) zülallar yarada bilər. Məsələn, hüceyrədaxili matris (ECM) zülal emalı, yaxşı sənədləşdirilmiş ECM zülal emalı ilə çoxlu proteolitik fraqmentlər əmələ gətirir. Parçalanma fraqmentlərinin funksiyalarını və proteazların bioloji rollarını tam başa düşmək üçün dəqiq proteolitik parçalanma sahələri müəyyən edilməlidir. in vivo. Bununla belə, ECM-ni təşkil edənlər kimi mürəkkəb yüksək molekulyar zülallarda parçalanma yerlərinin müəyyən edilməsi əhəmiyyətsiz deyil. Proteolitik fraqmentlərin N-terminal mikrosequencing adi üsuldur, lakin natrium dodesilsülfat-poliakrilamid gel elektroforez gellərinin zəif həllindən əziyyət çəkir və analiz üçün çoxlu jel və ya membran dilimlərinin hazırlanmasını tələb edir. Biz bu yaxınlarda N-terminal ardıcıllığının tamamlayıcısı kimi bu məhdudiyyətləri aradan qaldırmaq üçün Substratların Amino-Terminal Oriented Mass spektrometriyasını (ATOMS) inkişaf etdirdik. ATOMS, parçalanma sahələrini sürətli və dəqiq bir şəkildə təyin etmək üçün izotopik etiketləmə və kəmiyyət tandem kütlə spektrometriyasından istifadə edir. ECM zülalları laminin və fibronektində təxminən 100 parçalanma yerini müəyyən etmək üçün ATOMS -dan uğurla istifadə etdik. Burada ATOMS üçün ətraflı addım-addım protokol təqdim olunur.


Prinsip

Edmanın deqradasiyası peptiddəki amin turşularının sırasını (amin turşusu ardıcıllığı) təkrar son qruplaşdırma ilə müəyyən etməyə imkan verir. Peptid zənciri tədricən parçalanır. Bu reaksiya onu müəyyən etmək üçün istifadə olunur N. -bir peptidin son amin turşusu və bir peptidin Edman reagenti olaraq da bilinən fenil izotiosiyanatla reaksiyasından ibarətdir.

Hər bir amin turşusunda fərqli bir qalıq olduğu üçün R , hər biri fərqli bir feniltiohidantoin törəməsi (PTH törəməsi) əmələ gətirir. The N- PTH törəməsi olaraq ayrılan terminal amin turşusu, bir standartla müqayisədə xromatoqrafiya ilə müəyyən edilir. Ardıcıl olaraq eyni zülalda (əvvəllər bir amin turşusu ilə qısaldılmış) daha çox parçalanma həyata keçirə bilərsiniz N. -terminal son) və beləliklə tədricən amin turşularının ardıcıllığını təyin edir. A sekvenator 50 -ə qədər degradasiya dövrünün nəzarətsiz yerinə yetirilməsinə imkan verən avtomatlaşdırılmış cihazdır. Reaksiya > 98% nisbi məhsuldarlıqla getdiyinə görə, bir tərəfdən əvvəlki dövrlərdən alınan törəmələr, digər tərəfdən isə bir və ya daha çox parçalanma dövründən keçmiş zülalların arzuolunmaz parçalanma məhsulları hər dövrə ilə artır, beləliklə, maksimum 50 dövrə siqnal - Səs nisbəti oxunmaz olur. Variantdan asılı olaraq bir dövr bir -üç saat çəkir.


Mexanizm

Fenilizotiosiyanat, yumşaq qələvi şəraitdə, yüklənməmiş bir terminal amin qrupu ilə reaksiyaya girərək, dövri olaraq əmələ gəlir. feniltiokarbamoil törəmə Sonra asidik şəraitdə terminal amin turşusunun bu törəməsi tiazolinon törəməsi kimi parçalanır. Sonra tiazolinon amin turşusu seçici olaraq üzvi həllediciyə çıxarılır və xromatoqrafiya və ya elektroforezdən istifadə etməklə müəyyən edilə bilən daha stabil feniltiohidantoin (PTH) - amin turşusu törəməsi yaratmaq üçün turşu ilə müalicə olunur. Növbəti amin turşusunu təyin etmək üçün bu prosedur təkrarlana bilər. Bu texnikanın əsas çatışmazlığı ondan ibarətdir ki, bu şəkildə ardıcıllıqla sıralanan peptidlər 50-60 qalığa malik ola bilməz (və praktikada 30-dan az). Peptidin uzunluğu, siklik törəmənin həmişə tamamlanmaması səbəbindən məhduddur. Törəmə problemi reaksiyaya davam etməzdən əvvəl böyük peptidləri daha kiçik peptidlərə parçalamaqla həll edilə bilər. Amin turşusu üçün 99% -dən çox səmərəliliyə malik olan müasir maşınlarla 30 -a qədər amin turşusunu dəqiq bir şəkildə sıralaya bilir. Edman deqradasiyasının üstünlüyü ondan ibarətdir ki, o, ardıcıllıq prosesi üçün yalnız 10 - 100 piko-mol peptiddən istifadə edir. Edman tənəzzül reaksiyası prosesi sürətləndirmək üçün avtomatlaşdırılmışdır. [ 2 ]


Edman tənəzzülü

Edmanın deqradasiyasıPehr Edman tərəfindən işlənib hazırlanmış peptiddə amin turşularının sıralanması üsuludur. Bu üsulda, amino-terminal qalığı etiketlənir və digər amin turşusu qalıqları arasındakı peptid bağlarını pozmadan peptiddən ayrılır.

Edman Degradasiyasının mexanizmi

Fenilizotiosiyanat yumşaq qələvi şəraitdə yüklənməmiş bir terminal amin qrupu ilə reaksiyaya girərək bir feniltiokarbamoil törəmə Sonra asidik şəraitdə terminal amin turşusunun bu törəməsi tiazolinon törəməsi kimi parçalanır. Sonra tiazolinon amin turşusu seçici olaraq üzvi həllediciyə çıxarılır və xromatoqrafiya və ya elektroforezdən istifadə etməklə müəyyən edilə bilən daha stabil feniltiohidantoin (PTH) - amin turşusu törəməsi yaratmaq üçün turşu ilə müalicə olunur. Sonra növbəti amin turşusunu müəyyən etmək üçün bu prosedur təkrarlana bilər. Bu texnikanın böyük bir dezavantajı, bu şəkildə sıralanan peptidlərin 50-60 qalığından çox ola bilməməsidir. Bunun səbəbi, Edman parçalanma reaksiyasının 100% təsirli olmamasıdır, yəni parçalanma addımı hər dəfə baş vermir. Ancaq bu problem, reaksiyaya davam etməzdən əvvəl böyük peptidləri kiçik peptidlərə ayıraraq həll edilə bilər. Bir amin turşusu üçün 98% səmərəliliyi olan 30 -a qədər amin turşusunu dəqiq ardıcıllıqla düzəldə bilir. Edman deqradasiyasının bir üstünlüyü, sıralama prosesi üçün yalnız 10 - 100 pikomol peptiddən istifadə etməsidir. Edman tənəzzül reaksiyası prosesi sürətləndirmək üçün avtomatlaşdırılmışdır. Ώ ]


Edman Deqradasiyası nədir?

Edmanın deqradasiyasıtez-tez N-terminal ardıcıllığı və ya Edman sıralaması olaraq adlandırılan, bir proteinin N-terminal amin turşusunu təyin etmək üçün tanınmış bir prosesdir və yeni zülal ardıcıllığı məlumatları verə biləcək bənzərsiz bir yanaşma olaraq qalır. Zülal ifadəsinin sürətli təsdiqlənməsi üçün də üstünlük verilən texnikadır.

Bu yanaşmanın kimyası ilk dəfə 1950-ci ildə İsveçin Lund Universitetindən P.Edman tərəfindən təqdim edilmiş və Avstraliyanın Melburn şəhərindəki işi zamanı ilk avtomatlaşdırılmış peptid sıralama cihazı olduğuna inanılan cihaz üçün daha da inkişaf etdirilmişdir. Fərdi hüceyrələrin içərisində istehsal olunan zülallar hormonlar, fermentlər və digər vacib tənzimləyicilər rolunu oynayır. Anormal bir proteinlə nəticələnən genetik mutasiya ciddi sağlamlıq nəticələrinə səbəb ola bilər.

N-terminal amin turşusu bir neçə reagentdən biri ilə müalicə edilərək parçalanır, sonra ayrıca amin turşusu yaratmaq üçün hidroliz edilir. İncə təbəqə xromatoqrafiyası, HPLC və ya elektroforez amin turşusunun ölçüsünü təyin edir və məlum ölçü standartı ilə müqayisə edir. Qalan zülalın yeni N-terminal ucu da eyniləşdirmə üçün yarıla bilər.

Tətbiqi Biosistemlər təmizlənmiş zülalı membrana bağlayan və onu fenilizotiyosiyanatla müalicə edən Edman deqradasiyasının avtomatlaşdırılmasının inkişafına rəhbərlik etmişdir. Pulsuz amin turşusu ’s avtomatik olaraq bir HPLC sisteminə enjekte edilir.

Fenilizotiyosiyanat, mülayim qələvi şəraitdə yüklənməmiş terminal amin qrupu ilə reaksiyaya girərək siklik feniltiokarbamoil törəməsi əmələ gətirir. Sonra asidik şəraitdə terminal amin turşusunun bu törəməsi tiazolinon törəməsi kimi parçalanır. Tiyazolinon amin turşusu daha sonra seçmə yolu ilə üzvi bir həllediciyə çıxarılır və xromatoqrafiya və ya elektroforezdən istifadə etməklə müəyyən edilə bilən daha stabil feniltiohidantoin (PTH)- amin turşusu törəməsi yaratmaq üçün turşu ilə işlənir. Növbəti amin turşusunu təyin etmək üçün bu prosedur təkrarlana bilər. Bu texnikanın böyük bir dezavantajı, bu şəkildə sıralanan peptidlərin 50-60 qalığından çox ola bilməməsidir.

Tətbiqi Biosistemlər, təmizlənmiş bir zülalı bir membrana bağlayan və onu fenilizotiosiyanatla müalicə edən Edman degradasiyasının avtomatlaşdırılmasına gətirib çıxardı. Pulsuz amin turşusu ’s avtomatik olaraq bir HPLC sisteminə enjekte edilir. N- (9-Florenilmetoksikarboniloksi) süksinimid (CAS No. 82911-69-1) bioloji cəhətdən aktiv peptidlər üzərində qismən Edman degradasiyasını həyata keçirmək üçün izotiosiyanatla birlikdə istifadə olunur. Edman deqradasiyası zülalın N-terminalından getdiyi üçün, N-terminal amin turşusu kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmişsə və ya zülalın bədənində gizlənmişsə, işləməyəcəkdir.

N-terminal amin turşusunu dəqiq müəyyən etmək üçün zülallar təmiz və çirkləndiricilərdən təmiz olmalıdır. Edman deqradasiya limitləri artıq 50 amin turşusu olmayan kiçik peptid zəncirlərinə parçalanmış böyük protein molekullarını tələb edir.


Mücərrəd

Hüceyrələrin, toxumaların və orqanizmlərin proteomları aktiv hüceyrə proseslərini əks etdirir və hüceyrədaxili və hüceyrədaxili işarələrə cavab olaraq davamlı olaraq dəyişir. Proteomun dərin, kəmiyyət profili, xüsusən də mRNA və metabolit ölçmələri ilə birlikdə, hüceyrə vəziyyətinin görünməmiş bir görünüşünü təmin etməli, hüceyrə komponentlərinin funksiyalarını və qarşılıqlı təsirlərini daha yaxşı ortaya qoymalıdır. Molekulyar diaqnostika və biomarker kəşfi xüsusilə proteomların dəqiq miqdarından faydalanmalıdır, çünki xərçəng kimi kompleks xəstəliklər zülalların miqdarını və modifikasiyasını dəyişir. Hal-hazırda, ov tüfəngi kütləvi spektrometriyası yüksək məhsuldarlıqlı zülalların müəyyən edilməsi və ölçülməsi üçün əsas texnologiyadır, lakin yüksək həssaslıq və əhatə dairəsi yoxdur. Yeni nəsil DNT sıralaması ilə paralellər qururuq və tək molekullar səviyyəsində kompleks bir protein nümunəsindəki peptidləri sıralamaq üçün fluorosequencing adlı bir strategiya təklif edirik. Təklif olunan yanaşmada, milyonlarla fərdi flüoresan etiketli peptidlər paralel olaraq vizuallaşdırılır, N-terminal amin turşuları ardıcıl olaraq çıxarıldığı üçün flüoresan intensivliyinin dəyişən nümunələri izlənilir və fərdi peptidləri unikal şəkildə müəyyən etmək üçün əldə edilən flüoresan imzalarından (flüoresans) istifadə edilir. Biz flüorosekvensiyanın nəzəri əsasını təqdim edirik və Monte Karlo kompüter simulyasiyalarından istifadə edərək, biz onun mümkünlüyünü araşdırırıq, ən çox ehtimal olunan eksperimental səhvləri təxmin edirik, onların potensial təsirini kəmiyyətləndiririk və yüksək məhsuldarlıqlı peptid ardıcıllığı texnologiyasının təklif etdiyi geniş potensial faydanı müzakirə edirik.


Nəticə

Yeni bir lipopeptid birləşməsi 5812-A/C-dən təcrid edilmişdir Streptomis sp. INA-5812 və onun ehtimal edilən struktur analoqu daptomisin də daxil olmaqla, digər kommersiya lipopeptid antibiotiklərinə oxşar struktur və funksional xüsusiyyətlərə malik olduğu aşkar edilmişdir. Daptomisinlə müqayisədə bəzi əsas funksional fərqlər aşkar edilmişdir, o cümlədən hüceyrə membranına birbaşa təsir, ardınca sürətli keçiricilik və hədəf populyasiyalara güclü bakterisid təsir göstərir. Üstəlik, 5812-A/C, çoxlu dərmana davamlı suşlar və klinik izolatlar baxımından maraqlı olan yetkin biofilmlərlə əlaqəli bakteriya hüceyrələrinin metabolizmasını bənzərsiz şəkildə maneə törədə bildi.


Materiallar və metodlar

Etiketli Proteinin Hazırlanması.

Uniforma etiketli [14 C]qlutatyon S-transferaza (GST) aşağıdakı kimi hazırlanmışdır. T. Bammler (Vaşinqton Universiteti, Seattle) tərəfindən təmin edilən siçan GST Yc (19) olan DNT plazmid BL21 (DE3) hüceyrələrinin transformasiyası üçün istifadə edilmişdir. Escherichia coli. GST vektorunu daşıyan bakteriyalar 26 saat ərzində 37 ° C -də, ampisilin (50 μg/ml) olan M9 minimal mühitdə çalxalanmaqla yetişdirildi. Bu hüceyrə mədəniyyətinin bir mikrolitri, 350 μg etiketsiz d -qlükoza olan 85 μCi (1 Ci = 37 GBq) d -[U- 14 C] qlükoza (323 mCi/mmol Amersham Pharmacia) olan 200 μl M9 mühitinə köçürüldü. Mədəniyyət OD -yə qədər sarsıntı ilə 37 ° C -də inkübe edildi600 0,5-1,0-a çatdı. Rekombinant GST istehsalı, izopropil β -d -tiogalaktopiranozidin (IPTG) 1 mM son konsentrasiyasına əlavə edilməsi ilə induksiya edildi. Bakteriyalar silkələnmə ilə 37°C-də əlavə 12 saat böyüdüldü və 4°C-də 5 dəqiqə ərzində 2000 q-da sentrifuqa ilə yığıldı. Hüceyrələr özlülüyünü azaltmaq üçün nükleaz Benzonaz (Novagen) ilə BugBuster (Novagen) reagentini pozan 100 μl hüceyrə divarında yenidən dayandırıldı. Hüceyrələr otaq temperaturunda 20 dəqiqə yumşaq bir şəkildə çalxalandı və süspansiyon 16.000 × temperaturda sentrifuqa edildi. g 4 ° C -də 20 dəqiqə. Supernatant, tampon A (50 mM Tris⋅HCl, pH 7.4/200 mM NaCl/0.5 mM DTT) ilə tarazlaşdırılmış glutatyon Sepharose 4B boncuklarına (75 μl yataq həcmi Sigma) tətbiq edildi və 35 dəqiqə inkübe edildi. 4°C-də. Süspansiyon 500 q -da 4 ° C -də 5 dəqiqə santrifüj edildi və üst qat atıldı. Qranul 4 dəfə 1 ml tampon A ilə yuyuldu. [14 C] GST, 50 μl tampon B (200 mM Tris⋅HCl, pH 9.0/50 mM azaldılmış glutatyon) ilə 4 ° C və elüentlərlə üç dəfə seyreltildi. toplanmışdılar. Tampon Microcon 10 (Millipore) istifadə edərək 0,5 mM DTT ehtiva edən PBS ilə əvəz edilmişdir. Düzgün etiketlənmiş [14 C] GST konsentrasiyası standart olaraq etiketlənməmiş GST istifadə edərək gümüş boyama ilə SDS/PAGE analizi ilə təyin edildi. Standart GST konsentrasiyası amin turşusu analizi ilə müəyyən edilmişdir. Bu kəmiyyət təhlili üçün Scion Image (Scion, Frederick, MD) istifadə edilmişdir. Xüsusi fəaliyyəti müəyyən etmək üçün Wallac 1409 LSC (Wallac, Gaithersburg, MD) istifadə edilmişdir.

Təsadüfi peptid-boncuk sintezi.

Peptid muncuqları, hər bir Edman dövrü ilə hər bir təbii amin turşusunun bərabər miqdarda sərbəst buraxılması üçün hazırlanmışdır. Fluorenilmetoksikarbonil-amin turşusu qarışıqları (Fmoc, 5 eq) TentaGel NH ilə birləşdirildi.2 qatran (0,26 mmol/q Rapp Polimer, Tübingen, Almaniya) 1,3-diizopropilkarbodiimid/1-hidroksibenzotriazol (5 ekv) metodundan istifadə etməklə (20). Fmoc qrupları 25% piperidin/dimetilformamid (DMF) məhlulu ilə çıxarıldı və 10-mer peptid muncuqları əldə edilənə qədər addım-addım birləşmə reaksiyası aparıldı. Fmoc çıxarıldıqdan sonra təsadüfi peptid muncuqları DMF, metanol və diklorometan ilə yuyuldu və vakuum altında qurudu.

Protein ardıcıllığı.

Avtomatlaşdırılmış zülal ardıcıllığı 120A HPLC sistemi (PE Applied Biosystems) ilə təchiz edilmiş 477A sequencerdə həyata keçirilib. Sekanser üçün istifadə olunan bütün reaktivlər və həlledicilər PE Applied Biosystems -dən alınmış və istifadə etməzdən əvvəl AMS tərəfindən 14 C məzmunu yoxlanılmışdır. [14 C] GST məhlulu, β-laktoglobulin (2,5 pmol/μl) olan suda 0,1% TFA ilə 10–1000 amol/μl konsentrasiyalarına qədər seyreltildi. Hər bir seyreltilmiş [14 C]GST məhlulunun konsentrasiyası AMS ilə 14 C ölçmə ilə müəyyən edilmişdir. Polibren (3.0 mq) reaksiya kamerasındakı bir şüşə süzgəcinə tətbiq edildi və üç dövrəyə məruz qaldı. [14 C] GST əlavə edilməzdən əvvəl, β-laktoglobulin (25 pmol) və peptid-boncuklar (4-7 muncuq) şüşə filtrə yüklənmiş və argon qazı altında qurudulmuşdur. Ardıcıllıq proqramı elə dəyişdirildi ki, peptid muncuqlarından və laktoqlobulindən olan amin turşularına əlavə olaraq anilinotiazolinon amin turşuları kolbaya köçürülməzdən əvvəl hər dövrədə müəyyən miqdarda standart PTH-amin turşuları konversiya kolbasına çatdırıldı. HPLC fraksiyaları hər 30 və ya 60 saniyədə bir borosilikat şüşə kultur borulara (6 × 50 mm) toplanır və qalıq karbonu çıxarmaq üçün istifadə edilməzdən əvvəl pirolizə edilir.

AMS Nümunə Hazırlanması və Ölçülməsi.

Hər bir nümunə kiçik bir şüşə boruda toplandı və 1,19 mq daşıyıcı C əldə etmək üçün vakuum sentrifuqasında qurutmadan əvvəl 50 μl karbon daşıyıcı məhlulu (metanolda 40,0 mq/ml tributirin) əlavə edildi. Hər dəstlə üç tributirin daşıyıcı blankı hazırlanmışdır. fraksiyaların. Nümunələr Vogel (21) tərəfindən təsvir edildiyi kimi AMS üçün qrafitləşdirilmişdir. Tipik AMS ölçmə vaxtları nümunə 3 dəqiqə idi, hesablama dəqiqliyi 1.4-2.0% və 1-3-7% ölçüləri arasında SD. Naməlumların 14 C/13 C nisbətləri məlum izotop konsentrasiyasının eyni şəkildə hazırlanmış dörd standartının ölçülməsinə normallaşdırıldı (Avstraliya Milli Universiteti Sukroz refer. 22).


Pehr Victor Edman, 1916-1977

Pehr Viktor Edman 1916-cı ilin aprelində İsveçin Stokholm şəhərində anadan olub və 1977-ci ilin martında Almaniyanın Münhen şəhərində vəfat edib. O, hüquqşünas ailəsində doğulub və təhsilini Stokholmda alıb. 1935 -ci ildə Karolinska İnstitutunda tibb təhsili almağa başladı və 1938 -ci ildə ilk tibbi ixtisasını bitirdi. Araşdırma ilə maraqlandı və məzun olduqdan sonra Karolinska İnstitutunda, əsasən professor Eric Jorpesin laboratoriyasında işini davam etdirdi. Görünür, bu zaman sistemli şəkildə geniş oxumaqla özünə üzvi kimyanı öyrətmişdi. Müharibə illərində onun tədqiqatları İsveç Ordusunun tibb korpusunda uzun müddət xidmət etdiyinə görə yarımçıq qaldı. O, 1946-cı ildə tibb elmləri doktoru elmi dərəcəsinə layiq görülmüşdür. Dissertasiyasının mövzusu mal-qara qanından angiotenzinin təmizlənməsi və analizi olmuşdur. Daha əvvəl nəşr olunan tədqiqatları, müəllimi Jorpesin maraqları olan heparin və sekretinə aid idi.

Bu nöqtədə Edman, karyerasının qalan hissəsi üçün demək olar ki, fasiləsiz olaraq izlədiyi müstəqil tədqiqat istiqamətini götürməyə başladı. Rockefeller Tibbi Tədqiqatlar İnstitutunun Princeton şöbəsindəki Northrop-Kunitz laboratoriyasında bir il işləmək üçün qrant aldı. İsveç tibb tədqiqatları müharibə zamanı təcrid olunmuşdu və ABŞ -da əldə edilən irəliləyişləri öyrənməkdən narahat idi. Bundan əlavə, angiotenzin üzərində apardığı işlər, sadə kompozisiya analizinin peptidlərin və ya zülalların bioloji funksiyasını başa düşmək üçün bir zəmin yaratmağa kömək etməyəcəyini anlamışdı. Xüsusilə Uppsala qrupunun işi nəticəsində zülalların kolloid olmadığını, hər birinin müəyyən bir molekulyar ağırlığa və spesifik bir quruluşa sahib olduğunu başa düşmək. Edman bilirdi ki, peptid bağları ilə əlaqəli amin turşularının sırası hər hansı bir zülalın bənzərsiz tərkibinin vacib bir hissəsidir. Prinstonda zülalların aminoasit ardıcıllığını kimyəvi yolla deşifr etmək üçün bir yol tapmağa çalışmağa başladı.

Edmanın bu sahədə cəhdlərinin ilk illərində ardıcıllıq probleminə hücum etmək üçün iki ümumi prosedurdan istifadə olunurdu. Müxtəlif reaktivlər aminoterminal (və ya birinci) amin turşusunu reaktiv amin qrupu vasitəsi ilə etiketləməkdə və bir törəmə kimi tanınmağa imkan verməkdə faydalı idi. Bu reaktivlərdən biri, aminoterminusun dinitrofenol (DNP) törəməsini verən fluorodinitrobenzen (FDNB), Sanger tərəfindən insulin quruluşu ilə bağlı epoxal işlərində istifadə edilmişdir. İnsulinin qismən parçalanmasından əldə edilən üst-üstə düşən peptid dəstləri ilə FDNB reaksiyasından istifadə edərək, Sanger 1956-cı ilə qədər insulin molekulu üçün unikal bir quruluş çıxara bildi. Bu, bir zülalın deşifr edilən ilk birincil quruluşu idi, lakin bu işin şübhəsiz əhəmiyyətinə baxmayaraq, bu metodun geniş tətbiq üçün çox çətin olduğu aydın idi.

Aminoterminal təyini üçün istifadə edilən başqa bir reagent, bu məqsədlə 1930 -cu ildə Abderhalden və Brockmann tərəfindən təqdim edilən fenilizosiyanat (PIC) idi. FDNB ilə olduğu kimi, aminoterminal aminoasit törəməsini buraxmaq üçün hidrolizi digər peptid bağlarının çoxunu məhv etdi, qalan zülal analiz üçün yararsız qaldı. Princetonda Edman, fenilizotiosiyanat (PITC) istifadə edilərsə, nukleofilik kükürdün bitişik peptid bağını zəiflədəcəyini və molekulun qalan hissəsini parçalamayan hidroliz üçün şərait tapma ehtimalını artıracağını anladı. Bu qalan peptid daha sonra PITC ilə ikinci reaksiyaya məruz qala bilər və ikinci amin turşusu təyin oluna bilər və s. nəzəri olaraq molekulun karboksiterminal ucuna qədər. Edmanın bu həlli tamamilə müstəqil şəkildə düşünüb-düşünmədiyi, geniş oxunuşunda aşkar edilən bəzi əlaqəli olmayan kağızların PITC-nin diqqətini çəkib-çəkmədiyi və ya Princeton və ya Stokholmdakı bəzi həmkarının onun istifadəsini təklif edib etmədiyi məlum deyil. Reaksiyanın son nəticədə əldə etdiyi uğuru nəzərə alsaq, bu barədə hər hansı bir iddia və ya xatırlatma olmadığı halda, sonuncunun mümkün olmadığı görünür. 1969-cu ildə yazılan aminturşuların ardıcıllığı üsullarını nəzərdən keçirərkən Edman, PITC reaksiyasının, fərqli təsir mexanizmlərinə malik olduğu üçün əvvəlki PIC reaksiyasından heç də qaynaqlanmadığını vurğulayır. Bununla belə, reagentlər və onların zülal kimyasında tətbiq olunduğu oxşar istifadələr arasındakı səthi oxşarlıqları nəzərə alsaq, bu, bir az gərgin görünür. Edman 1947-ci ildə İsveçə qayıdanda bu ideyanın həyata keçirilə biləcəyini və zülal ardıcıllığı texnikasının əsasını təşkil edə biləcəyini bilmək üçün kifayət qədər təcrübələr aparmışdı.

Edman Lundda dosent vəzifəsini aldı və demək olar ki, yalnız protein parçalanması üzərində işləməyə davam etdi. PITC-nin bir aminturşusu, 3-fenil-2-tiohidantoin (PTH) aminturşusu ilə birləşməsindən yaranan törəmə, demək olar ki, bütün hallarda sabit birləşmə olduğunu sübut etdi. Edman, zülallarda olan bütün amin turşularının PTH törəmələrini sintez etdi və PITC -nin aminoterminusa bağlanması və bütün peptid bağları üçün problemsiz işləyən PTH törəməsinin parçalanması üçün şərtləri müəyyən etmək və ölçmək üçün xromatoqrafik sistemlər hazırladı. İki il sonra Edman, zülalların birincil quruluşu problemini həll edə bilən və zülal biokimyasında daha da irəliləyişlər üçün lazım olan saysız -hesabsız zülallar haqqında əsas məlumatı təmin edə bilən bir metodun kimyəvi detallarını dərc edə bildi. PTH-amin turşularının xarakterik ultrabənövşəyi udma spektrləri onları kəmiyyət tədqiqatları üçün xüsusilə uyğunlaşdırdı. Zülalların alt quruluşunu və molekulyar çəkisini faydalı ölçməyə icazə verdi və sütun kromatoqrafiyası ilə birlikdə amin turşusu analizi üçün ninhidrin reaksiyasına alternativ oldu. Bununla belə, yüksək performanslı maye xromatoqrafiyasındakı son inkişaflara qədər bu imkanlardan tam istifadə edilə bilməzdi. Metod geniş şəkildə tanındı və ona Carlsberg Laboratories-dən Kai Linderstrom-Lanq tərəfindən "Edmanın deqradasiyası" eponimi verildi.

1950-ci illərin əvvəllərində Viktoriya dövrünün məşhur yarış atı təlimçisi cənab 'Cek' Holt vəfat etdi və onun vəsiyyətinə görə, əmlakından əldə edilən gəlirin etibarda saxlanması Melburndakı Müqəddəs Vinsent Xəstəxanasında tibbi tədqiqatlar üçün istifadə olunsun. . 1956 -cı ilə qədər xəstəxana rəhbərliyi, mövcud xəstəxana vahidlərinə tədqiqat qrantı olaraq vəsait ayırmaq əvəzinə, xəstəxanada ayrı bir tədqiqat müəssisəsi qurmaq qərarına gəldi. Klinik olmayan əsas elm sahəsini, tercihen biokimyanı inkişaf etdirmək qərarı verildi. Tibbi Araşdırma Məktəbi, əvvəlcə məlum olduğu kimi, öz idarə heyətinə malik idi və praktiki məqsədlər üçün xəstəxana rəhbərliyindən asılı olmayaraq fəaliyyət göstərirdi.

Edman Araşdırma Direktoru vəzifəsinə müraciət etdi. O, açıq-aydın görkəmli namizəd idi və üstəlik onun maraqları Məktəbin diqqət mərkəzində olan biokimyaya üstünlük verməsi ilə üst-üstə düşürdü. 1957-ci ildə Edman Melburndakı St Vinsent Tibbi Tədqiqatlar Məktəbində ilk Tədqiqat Direktoru vəzifəsi təklifini qəbul etdi. Lunddakı elmi mənbələrdən ümumi narazılığın və evliliyinin pozulmasının qarışığı olduğu söylənən bu hərəkətin səbəbləri güclü olmalı və ilk növbədə karyera yüksəlişinə yönəlməmişdir. O, indicə onu şimal yarımkürəsinin bir çox aparıcı mərkəzlərində qarşılamağa imkan verən görkəmli fərdi biokimyəvi tədqiqat işini tamamlamışdı. Avstraliyada, Melburnda, o, bu mərkəzlərdən böyük ölçüdə təcrid olunmuş olardı. Məktəb, ənənələri, qurulmuş işçiləri və ya köməkçi heyəti olmayan və Melburn Universitetinin bir tədris xəstəxanasında yerləşməsinə baxmayaraq, yeni bir qurum idi. akademik və ya universitetə ​​bağlılıq. Üstəlik, o dövrdə Avstraliya səxavətli hökumət tədqiqat maliyyəsi ilə tanınmırdı. Bu nəhəng həvəsləndirici tədbirlərə baxmayaraq, Edman işini davam etdirmək üçün əvvəlcə təlim keçmiş kömək və yaxın həmkarları olmadan Melburna tək köçmək qərarına gəldi.

Avstraliyada Edman İsveçdə başladığı protein strukturunun digər aspektləri üzrə bir neçə kiçik layihəni tamamladı, lakin əks halda o, demək olar ki, bütünlüklə fenilizotiosianatın (PITC) deqradasiyası üzərində işlədi. Bu iş üç mərhələyə bölündü: tənəzzül şəraitinin yaxşılaşdırılması, əsasən reaksiya ardıcıllığının yan reaksiyaların "avtomatlaşdırılması" nın aradan qaldırılması və deqradasiyanın müxtəlif ardıcıllıq problemlərinə tətbiqi. Sonuncu mərhələ digər ikisini üst -üstə düşür və ümumiyyətlə Edmanın laboratoriyasına onun texnikasını öyrənmək və ya istifadə etmək üçün gələn alimlərin maraqlarını əhatə edirdi.

1960-61-ci illərdə üç mərhələli tənəzzül reaksiyası mahiyyətcə mükəmməlləşdi. Universal tətbiqi və təkrarlanan təbiəti, Edmanın Avstraliyalı texniki köməkçisi G.S. Beggə, avtomatlaşdırma üçün uyğun olacağını təklif etdi. Edman, mövcud zülalların sayının (təxminən on milyon) əl ilə sıralanmasını qeyri -mümkün bir iş etdiyini və tez bir zamanda avtomatlaşdırma fikrinə çevrildiyini anladı. Avtomatlaşdırma ilə mümkün olan reaksiya şərtlərinin yaxından idarə edilməsi, əl ilə mümkün olduğundan daha yüksək və daha daimi təkrarlanan məhsuldarlıq vəd etdi. Yüksək təkrarlanan məhsullar, təkrarlanan proseslər üçün çox vacibdir, istər sintetik, istərsə deqradativ. Geoffrey Begg, Melburna gəldikdən sonra Edmanın işə götürdüyü ilk texniki heyətdən biri idi. Heç bir rəsmi ixtisası yox idi, lakin texniki kollecdə və özünütəhsil kurslarında birləşərək praktiki kimya və şüşə üfürmə, maşınqayırma və elektronika sahələrində diqqətəlayiq bir təcrübəyə sahib idi. Sequenator layihəsi Edmanın akademik və nəzəri biliklərini tamamlayan bu çoxsaylı istedadlardan istifadə etmək üçün mükəmməl bir fürsət təqdim etdi. Edman və Begg ardıcıl avtomatlaşdırma layihəsində bir komanda kimi çalışdılar, digər işçilərdən heç bir davamlı giriş olmadan. Edmanın bütün vəzifələrə hərtərəfli yanaşması üçün xarakterik idi ki, bu dövrdə özünü uyğunlaşdırmaq və özünü çevirmək üçün kifayət qədər bacarıqlı bir alət ustası oldu.

Protein sekvenatoru olmağın əsası, 1961 -ci ilin payızında bir neçə həftə ərzində bir prototip mərhələsinə qədər inkişaf etdirildi - silindrik oxunda fırlanan şüşə qab, kateter vasitəsilə reaktivlərin əlavə edilməsi, nazik bir mayedə reaksiyalar. fırlanan kubokun divarındakı film və solventlə ekstraksiyalar, filmin üstündə bir yivə doğru hərəkət edir. İki il ərzində Edman və Begg öz emalatxanalarında deqradasiya reaksiyalarını etibarlı şəkildə həyata keçirə bilən bir maşın qurdular. Onlar əyirici qabın fiziki şərtlərinə uyğun yeni şərait və reagentlər tapmışlar, məsələn, açıq stəkanda ümumiyyətlə daha az uçucu kimyəvi maddələr tələb olunurdu və dar ötürücü və çirkab borular həlledicilərin səthi gərginliyinə və reoloji xüsusiyyətlərinə xüsusi diqqət yetirməyi tələb edirdi. Edmanın klassik üzvi kimya haqqında geniş məlumatı, əllə reaksiyanı avtomatlaşdırılmış formaya çevirməkdə sürətli irəliləyişə imkan verdi. 1964-cü ildə Edman ilkin nəticələrini Şotlandiyada keçirilən görüşdə bildirdi. 1967-ci ildə jurnalın ilk sayında Avropa Biokimya Jurnalı Begg həmmüəllif kimi o, donqar balina mioqlobinin aminoterminal altmış amin turşusunun saatda bir qalıq nisbətində avtomatlaşdırılmış şəkildə pozulmamış təyinini nümayiş etdirən yekun məqaləsini dərc etdi. Bu irəliləyişin dərəcəsi, o zaman ən geniş manuel deqradasiyanın gündə bir nisbətdə təxminən on beş qalıq əhatə etdiyini bilməklə ölçülə bilər. Əks reaksiyaların aradan qaldırılmasında təmiz reagentlərin əhəmiyyətini qiymətləndirməməsi səbəbindən bir çox laboratoriyalar əl ilə deqradasiyanı ümumiyyətlə müəyyən edə bilmədi. Növbəti bir neçə il ərzində Edmanın maşından əldə edilən təkrar məhsuldarlığı artırmaq idi. 1967 -ci il kağızının 98% -dən 99% -ə qədər müəyyən edilən ardıcıllığın uzunluğunu iki dəfə artırmaq üçün hesablandı. Melburndakı zülal sekvenatoru 1969-cu ilin sonlarına qədər ABŞ-dakı Beckman Instrument Company Edmanın dizaynına əsaslanan kommersiya versiyasını bazara çıxarana qədər unikal olaraq qaldı. Edman maşınının kommersiya edilməsində heç bir rol oynamadı. Məktəbin İdarə Heyəti sekvenatorun patentləşdirilməsi imkanlarını müzakirə etdi, lakin tezliklə Edmanın patent mühafizəsi olmadan tam nəşr etməli olduğuna dair güclü fikrini qəbul etdi. Edman 1968-ci ildə Avstraliya Elmlər Akademiyasının üzvü və 1974-cü ildə London Kral Cəmiyyətinin üzvü seçildi. Edman altmışıncı illərin ortalarında Avstraliya vətəndaşı oldu.

1972 -ci ildə Edman St Vincent Tibbi Araşdırma Məktəbindən istefa etdi və Münhen yaxınlığındakı Martinsreiddəki Max Planck Biokimya İnstitutunda Protein Kimyası I direktoru oldu. 1968 -ci ildə Stokholmdan olan ikinci həyat yoldaşı Agnes Henschenlə yenidən evləndi və bu ona Avropaya qayıtmağı düşünməyə əsas verdi. 1957 -ci ildə gəlişindən bu yana on il ərzində Məktəb kiçik olaraq qaldı və sekvenator layihəsinin müvəffəqiyyətinə əsaslanaraq genişlənmə dəstəyini artırmaq cəhdləri o qədər də uğurlu olmadı. İndi, uzun illər əvvəl Lundda olduğu kimi, işinin əhəmiyyətinin düzgün şəkildə tanınmadığına və Melburnda qeyri -kafi mənbələrə sahib olmağa davam edəcəyinə inanırdı. Maks Plank İnstitutunun yeni laboratoriyalarına köçməsi onun ehtiyaclarına cavab verirdi. Edman öz laboratoriyasını Münhendə Melburndakı kimi və eyni məqsədlə deqradasiyanın səmərəliliyini artırdı. In addition, with his aid, Agnes Henschen began to make substantial progress in her studies of fibrinogen structure. Sadly, Edman developed a cerebral tumour and died after a short period of coma in 1977.

Edman played little if any role in broader scientific administration or politics in Australia. Although his School had no formal academic affiliation, there is no evidence that he would not have been accepted in these arenas. Some efforts to arrange a personal appointment at the University of Melbourne came to nothing. Thus he remained something of an enigma in the scientific community. He was slow to publish, with approximately one and a half papers per year during his Australian period, which made difficulties for those wishing to implement the method. If his impact on the Australian scene was limited, it was paradoxically the result of his single-minded pursuit of the sequence degradation. Such work, despite Edman's reputation, was not very attractive to students and he never built up a tradition of a flow of graduate students. Once the initial work on the manual or especially the automated reaction was complete, the details would easily have been completed by others in his or other laboratories. One cannot help thinking that his impact would have been so much greater had he seen himself able to move strongly into new areas of protein structure and function. Biological research often requires the appreciation of the importance of an approximate result for advancement.

Nevertheless the Fellowships of the Australian Academy of Science and the Royal Society of London indicate in how much esteem his work was held internationally, and this judgement has been supported by later events. Technical advances in related fields, especially in liquid chromatography and sensitive ultra violet detectors, have led to the development of low-level or microsequencing techniques which still employ the reactions described by Edman forty years ago and which play an indispensible role in gene isolation and molecular cloning.

Edman's reputation as a reclusive person, often difficult to deal with, did not arise from those who worked with him in the laboratory. He was reserved by Australian standards, but courteous and always helpful, often humorous, and took pleasure in organising social occasions both at his home and outdoors in the country. To those who came to know him in the laboratory two aspects probably had a lasting influence. In those days he was a rare example in the hospitals and the world of Australian medical research of someone who devoted himself full-time to nonclinical research. This served as an example, to those who came across him, of the possibility of such a career. At a time when biochemistry in Australia was largely concerned with the intricacies of metabolic pathways, an area where the great discoveries had already been made, Edman understood and stressed the importance of the information-containing macromolecules. The double helical structure of DNA had been proposed by Watson and Crick only a few years before Edman's arrival in Australia. The possibility of obtaining a corresponding understanding of the more complex structures of proteins which Edman's work opened up inspired his colleagues with the belief that they were in a position to participate directly in a new era of biological investigation. fic basis for consciousness. Cognitive Studies 5, 95-109.