Məlumat

FACS ilə yağ fazasının daxilindəki damcıları çeşidləmək mümkündürmü?

FACS ilə yağ fazasının daxilindəki damcıları çeşidləmək mümkündürmü?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bir sözlə, tamponda (su əsaslı həll) deyil, yağda olan bir nümunəni FACS etmək mümkündürmü? Bu işdə hər hansı bir köməyə minnətdar olaram. Çox sağ ol


Mümkündür ki, bunu edə biləcək bəzi xüsusi modifikasiya edilmiş maşın var, lakin adi axın sitometriya maşınları bunu edə bilməz. Bu məqalə bir mümkün yanaşma təklif edir:

Təəssüf ki, FACS alətləri susuz süspansiyonlarla uyğun gəlmir, buna görə də yağda su emulsiyasını çeşidləmək üçün suda suda suda ikiqat emulsiya istehsal etmək üçün daha bir emulsifikasiya aparmaq lazımdır. İndi sulu bir mərhələdə dağılmış nümunə, FACS sıralamasına uyğundur.

-Milyonda Bir: Direksiyalı Təkamül üçün Monodispers Picolitre Cüt Emulsiya Damlalarında Tək Hüceyrə-Lisat Analizlərinin Sitometrik Sıralanması

Bunu edə biləcək mikro axıcı maşınlar da var, amma düşünürəm ki, bir həll ala bilməməkdənsə özünüz qurmalısınız (hər halda bahalı olardı).


FACS - Biologiya ilə bir yağ fazası içərisində damcıları sıralamaq mümkündürmü?

a Fiziki Kimya İnstitutu, Polşa Elmlər Akademiyası, Kasprzaka 44/52, 01-224 Varşava, Polşa
E-poçt: [email protected]

b Molekulyar və Hüceyrə Biologiyası İnstitutu, Tartu Universiteti, Riia 23, Tartu, Estoniya

Mücərrəd

Damcı mikrofluidika mikrobiologiyada yeni eksperimental imkanlar açan əsas texnologiyalardan biri kimi sürətlə ortaya çıxdı. Tək hüceyrələri və ya kiçik bakteriya populyasiyalarını daşıyan damlacıqları yüksək paralel və yüksək ötürmə qabiliyyəti ilə yaratmaq, manipulyasiya etmək və izləmək bacarığı diaqnostikada problemlərin həlli və bakterial təkamül üzrə tədqiqatlar üçün yeni yanaşmalar yaradır. Bu araşdırmada mikrobiologiyanın müxtəlif sahələrində damcı mikrofluidiklərin tətbiqləri təqdim olunur: i) patogenlərin aşkarlanması və müəyyən edilməsi, ii) antibiotiklərə həssaslıq testi, iii) mikrob fiziologiyasının tədqiqləri və iv) suşların biotexnoloji seçimi və təkmilləşdirilməsi. Dinamik olaraq inkişaf edən sahədəki problemləri və mikrobiologiyada damlacıqların yeni potensial istifadəsini də sadalayırıq.


Fon

Toxuma hər biri müxtəlif bioloji vəziyyətlərə malik ola bilən bir çox ixtisaslaşmış hüceyrə növlərindən ibarətdir. Bir toxumanın qlobal gen ifadəsini öyrənmək əvəzinə, bir hüceyrəli qətnamədə [1,2,3,4] transkripsiya profilinin bioloji funksiyasının daha tam və dəqiq bir təsvirini təqdim etdiyi qəbul edilmişdir [5, 6]. Damlacıq əsaslı mikro axıcı texnologiyalardakı son irəliləyişlər, minlərlə fərdi hüceyrənin transkripsiya profillərini yüksək paralel, çox sürətli və əlverişli bir şəkildə tutmağı, indeksləşdirməyi və ardıcıllıqla düzəltməyi mümkün etdi [7, 8].

Macosko və digərləri tərəfindən təsvir edilən 'Drop-seq' metodunda. [7], hüceyrələr ayrı-ayrılıqda mikrofluidik cihazda tək muncuqla birlikdə nanolitr ölçülü damlacıqlarda kapsullaşdırılır. Bir boncuk, hər birində bir polimeraz zəncirvari reaksiya (PCR), bir hüceyrə barkodu və bir çox fərqli bənzərsiz molekulyar identifikatorlar (UMI) saxlayan barkodlu astarlar, sonra bir polyT ardıcıllığı təqdim edir. Boncuklar bir lizis tamponunda asılır, nəticədə hüceyrə damcı meydana gəlməsi ilə parçalanır. Cellular messenger RNAs (mRNAs) sərbəst buraxılır və barkodlu boncuk astarlarının polyT ardıcıllığına hibridləşə bilir. Yığıldıqdan sonra damcılar parçalanır və mRNT əks DNT-yə (cDNA) transkripsiya edilir, PCR ilə gücləndirilir və toplu şəkildə sıralanır. Hesablama analizi, hüceyrə barkodu ilə eyni hüceyrədən hansı mRNA -nın əmələ gəldiyini aydın şəkildə təyin etməyə imkan verir. UMI-lər PCR dublikatlarını müəyyən etmək və aradan qaldırmaq və fərqli mRNT molekullarını rəqəmsal saymaq üçün istifadə olunur.

Fluidigm C1, 10XGenomics və ya 1CellBiO sistemləri kimi avtomatlaşdırılmış platformaların kommersiyalaşdırılmış versiyaları da daxil olmaqla yüksək məhsuldarlıqlı təkhüceyrəli RNT ardıcıllığı (RNT-seq) üsullarının sürətlə artmasına baxmayaraq, bu məhdudiyyətlərə nisbətən az diqqət yetirilmişdir. Hüceyrə giriş materialının hazırlanmasında və idarə olunmasında öhdəsindən gəlmək olar [9]. Mənalı məlumat əldə etməkdə əsas çətinlik, hər bir hüceyrənin təbii və ya təcrübi olaraq nəzərdə tutulan mühitdə transkripsiya vəziyyətini uyğun şəkildə əks etdirən yüksək keyfiyyətli tək hüceyrəli süspansiyonun istifadəsidir. Mədəniyyətdən hüceyrə yığımı və ya toxuma dissosiasiyasından sonra, tək hüceyrələrin təcrid edilməsi və mRNT-nin tutulması arasındakı mərhələlər xüsusilə vacibdir, çünki onlar transkriptom dəyişikliklərinə və RNT-nin deqradasiyasına meyllidirlər. Bir neçə toxumadan və ya mədəniyyət şəraitindən hüceyrələrin toplanması ehtiyacı kimi tələblər, ehtimal ki, zaman kursu təcrübələri ilə birləşərək, əlavə məhdudiyyətdir.

Prinsipcə, bu problemlərin çoxu kimyəvi fiksasiyanın köməyi ilə həll edilə bilər. Aldehidlərdən fərqli olaraq, metanol və etanol, nuklein turşularını kimyəvi cəhətdən dəyişdirməyən laxtalanıcı fiksatiflərdir [10, 11]. Spirtlər susuzlaşdırma ilə hərəkət edir: 65% -dən çox spirtdə və duzların iştirakı ilə nuklein turşuları çökmüş vəziyyətdə baş verir və sadə rehidratasiya ilə orijinal formasına qaytarıla bilər. Biz əvvəllər göstərmişdik ki, 80% metanol ilə fiksasiya həm mRNA-lar, həm də kiçik RNT-lər üçün gələcək nəsil ardıcıllığı və kitabxana hazırlığı ilə uyğun gəlir [12]. Çeşidlənmiş, bir-dörd hüceyrə mərhələsinin müvəffəqiyyətli genom geniş gen ekspresyon profili üçün fiksasiya çox tələb olunurdu. Caenorhabditis elegans embrionlar, sürətli və dinamik transkripsiya dəyişikliklərinə məruz qalan kompleks bir toxuma [12].

Burada, Stoeckius et al metanol əsaslı fiksasiya protokolunu uyğunlaşdırdıq. [12] Drop-seq ilə təkhüceyrəli transkriptomların sonrakı profili üçün hüceyrələri qorumaq. Metanol fiksasiyasının hər hüceyrədə aşkar edilən genlərin və transkriptlərin (UMİ-lərin sayı kimi müəyyən edilir) sayını dəyişdirmədiyini və ya birmənalı təyinata müdaxilə etmədiyini nümayiş etdirmək üçün əvvəlcə mədəni insan (HEK) və siçan (3T3) hüceyrələrinin həm canlı, həm də sabit qarışıqlarını təhlil etdik. bir və ya digər növə oxunur. Daha sonra metanol fiksasiyasını daha geniş miqyaslı təhlilə tətbiq etdik

Ayrılan 9000 əsas hüceyrə Drosophila embrionlar və ya sıralanmış siçan arxa beyin hüceyrələri. Metanolla sabitlənmiş hüceyrələri olan bir hüceyrəli transkriptomların Drop-seq profilinin həm mədəni, həm də birincili hüceyrələrlə yaxşı işlədiyini nümayiş etdiririk.

Əlavə olaraq, damcı əsaslı tək hüceyrəli ardıcıllıq məlumatlarının tədqiqini asanlaşdırmaq üçün hesablama resursu təqdim edirik. 'dropbead', əsas statistikanı və kəmiyyət parametrlərini görüntüləmək, fərqli nümunələri müqayisə etmək və sonrakı analizdən əvvəl nümunələri süzmək üçün asanlıqla istifadə edilə bilər.


Nəticələr

3dPCR, ümumi ddPCR-in əmisi oğludur, istisna olmaqla, yağda suda olan tək emulsiya damlalarında tək molekullu PCR analizləri yerinə yetirməkdənsə, reaksiyaları ikiqat emulsiya damlacıqlarında yerinə yetirir. Bunun faydası, ikiqat emulsiyaların, tək emulsiyalardan fərqli olaraq, ümumi axın sitometriya alətləri 23 -dən istifadə etməklə oxunmasına və sıralanmasına imkan verən sulu bir daşıyıcı fazada dayandırılmasıdır. Hər bir damcıda həyata keçirilən spesifik PCR reaksiyalarından istifadə edərək, nümunədəki hər bir molekul hədəf molekul olub olmadığını müəyyən etmək üçün müəyyən bir yerdə “oxunur”. Əgər belədirsə, PCR təhlili, FACS çeşidlənməsi ilə aşkarlanmasına və bərpasına imkan verən kapsül damlasını dolduran bir flüoresan siqnal verir. Müxtəlif rəngli zondlarla TaqMan PCR-dən istifadə edərək, iki xüsusi ardıcıllığı olan verilmiş molekul kimi kombinatorial qaydalara əsaslanaraq, qismən homologiyanı paylaşan və çeşidləyən molekulları fərqləndirmək üçün metod multipleksləşdirilə bilər.

3dPCR -in məqsədi heterojen bir nümunədə xüsusi DNT molekullarının aşkarlanmasını, miqdarını və təcridini təmin etməkdir. Bunu həyata keçirmək üçün 3dPCR nümunədən DNT-ni ikiqat emulsiya damcılarına daxil edir (Şəkil 1a) və hədəf ardıcıllığı üçün sorğu-sual edən hər damcıda spesifik PCR reaksiyası həyata keçirir (Şəkil 1b). Ardıcıllıqlar varsa, FACS (Şəkil 1c) üzərində aşkar edilə bilən və hədəf ardıcıllığını sıralamaq və bərpa etmək üçün istifadə edilə bilən bir floresan siqnal yaradan PCR gücləndirmə meydana gəlir (Şəkil 1d). Çeşidlənmiş damcılar birləşə və qarışıq kimi təhlil edilə bilər və ya tək-tək quyulara paylana bilər. SYBR və ya TaqMan floresansı ilə amplifikasiyanı aşkar etmək üçün standart PCR üsullarından istifadə edərkən, izotermik gücləndirmə (MDA, LAMP, RPA) və problar (molekulyar mayaklar, əqrəb probları) daxil olmaqla digər reaksiyalar və oxunuşlar tətbiq olunur.

DNT -nin heterojen bir nümunəsi mikrofluid şəkildə ikiqat emulsiya damlacıqlarında (a) və istilik dövrəli (b). Hədəf ardıcıllığını ehtiva edən damcılar gücləndirilməyə məruz qalır və FACS-də aşkar edilə bilən flüoresan siqnal istehsal edir (c) və kəmiyyət və çeşidləmə üçün istifadə olunur (d).

3dPCR ikiqat emulsiyalar

3dPCR, mikrofluidik cihazların tərkibində DNT molekullarının qarışığı olan nümunədən monodispers damcılar əmələ gətirmə qabiliyyəti sayəsində mümkün olur. Nümunədəki molekulların konsentrasiyasına nəzarət etməklə, hər bir damlacıqda kapsullaşdırılmış sayı tək molekullara 24 aşağı salına bilər. Hədəf molekullarının PCR aşkarlanması üçün ikiqat emulsiyalardan istifadə etmək kritik, termal dövriyyə reaksiyaları vasitəsilə damcıları sabitləşdirir. Bu işdə, PCR -nin yüksək temperaturları da daxil olmaqla, əmələ gətirdikləri emulsiyaların inanılmaz sabitliyi səbəbiylə fluorosurfactants ilə florlu yağlar istifadə edərək bunu edirik. Damlalarda aparılan PCR analizindən asılı olaraq iki səthi aktiv maddədən istifadə edirik: qeyri-ionlu polietilen glikol (PEG) Krytox sürfaktanı və ionik-Krytox sürfaktanı (Şəkil 2).

Mikrofluidik olaraq ikiqat emulsiyalar əmələ gətiririk, onlar ya qeyri-ion PEG-Krytox (a) və ya ion-Krytox səthi aktiv maddə (b). Hər ikisi də termal velosipeddən sağ çıxan son dərəcə sabit damcılar verir. Lakin damcılar velosiped sürərkən şişir, damlanın daxili nüvəsinin osmolallığını qarışıq sulu daşıyıcı ilə balanslaşdırır (c) (Pre = Pretermal Velosiped Sonrası = Termal Velosipeddən Sonra Va = ikiqat emulsiyanın sulu fazasının həcmi Vo = ikiqat emulsiyanın yağ fazasının həcmi).

İyonik olmayan səthi aktiv maddə, iki florinli blok kopolimer quyruğuna kovalent olaraq bağlanmış bir PEG baş qrupunu ehtiva edir, PEG suda həll olur, flüorlu quyruqlar isə 25 emulsiyalarımızın yağ fazasında həll olunur. Bu amfifilik molekul bir damlacığın su-yağ interfeysinə yapışdıqda, PEG baş qrupu su damlasının daxili səthini örtər. PEG, zülalların hidrofobik interfeyslərə adsorbsiyasının qarşısını almaqda təsirli olur, bu da fermentlərin PCR keçirə biləcəyi damcıların böyük hissəsində saxlanılması üçün vacibdir. Reaksiyaların gücləndirmə məhsullarını aşkar etmək üçün amplifikasiyadan sonra daşıyıcı fazaya SYBR Green boyası əlavə edirik. SYBR Green, DNT 26 -ya daxil edildikdə və ikiqat emulsiyaların nazik yağ qabığı ilə asanlıqla bölündükdə floresan olur, müsbət damcıları ləkələyir və onları FACS vasitəsilə aşkar edir. Bu səthi aktiv maddə ilə əmələ gələn ikiqat emulsiyalar monodisperdir və PCR termal dövriyyəsindən sağ çıxırlar (Şəkil 2a).

Qeyri-ion səthi aktiv maddə yaxşı sabitlik təmin etsə də və ikiqat emulsiyalarda səmərəli PCR-yə imkan versə də, qabıqlar molekulları boyamaq üçün həqiqətən sızdırır, biz bundan istifadə edərək müsbət damcıları SYBR post-termal dövriyyəsi ilə ləkələyirik. Bununla birlikdə, bu sızıntı damlalarda TaqMan PCR apararkən də bir problem yaradır: reaksiya, floresan boya ilə etiketlənmiş DNT problarından istifadə edir və amplifikasiya zamanı söndürücü boyanı flüoresana buraxır. Bununla birlikdə, bağlanmamış boya, ikiqat emulsiya qabığından asanlıqla ayrılaraq damcılardan sızaraq TaqMan siqnalının itirilməsinə səbəb ola bilər.

Siqnalı xilas etmək üçün qabığa bölünməsinə maneə qoyaraq əldə etdiyimiz boyanı ehtiva etməliyik. Biz PEG səthi aktivantından fərqli olaraq zülalları asanlıqla damcı interfeysinə 25 adsorbsiya edən ion-Krytox səthi aktiv maddəsinə keçirik. Bu normal olaraq polimerazları adsorbsiyaladığı üçün PCR üçün zərərli olardı, ancaq damlada yüksək konsentrasiyada iribuynuzlu serum albümini (BSA) də daxil edirik. BSA tez-tez reaksiyanın effektivliyini artırmaq üçün PCR-ə əlavə edilir 27 və zülal olmaqla, ion-Krytox stabilləşdirilmiş damcıların 28,29,30 interfeysinə asanlıqla adsorbsiya olunur. İnterfeysdə, zülalların daha çox adsorbsiyasının qarşısını alan və sərbəst buraxılan boya molekullarının 30 bölünməsinə mane olan bir "dəri" meydana gətirir. Bu, TaqMan müsbət damcılarını FACS-də aşkar etmək imkanı verir. Bu səthi aktiv maddə eyni zamanda termal dövrəyə davamlı olan monodisperli ikiqat emulsiya damlaları əmələ gətirir (Şəkil 2b).

İstifadə olunan səthi aktiv maddədən asılı olmayaraq ikiqat emulsiya damcıları PCR zamanı şişir (şəkil 2c). Biz bunun daxili və xarici sulu fazaların osmolyarlıqlarını tarazlaşdırmaq üçün su və tampon molekullarının qabıqlar vasitəsilə bölünməsi ilə əlaqədar olduğuna inanırıq. Beləliklə, ikiqat emulsiya damcılarında reaksiyalar aparılarkən qabıq keçiriciliyi diqqətlə nəzərdən keçirilməlidir, həm də daşıyıcı fazaya birləşmələr əlavə etməklə damcı məzmununu modulyasiya etmək üçün asan bir vasitə təmin edir.

SYBR oxunuşlu tək rəngli 3dPCR

3dPCR, ddPCR kimi, heterojen bir qarışıqda hədəf DNT molekullarını saymaq üçün istifadə edilə bilər. Bunu nümayiş etdirmək üçün biz müxtəlif konsentrasiyalarda Lambda virusunun nümunələrini təhlil edirik (Şəkil 3). Lambda DNT -ni Lambda genomunun bir hissəsini (35,515-35,664 bp) hədəf alan primerlərlə PCR qarışığına sancırıq. Nümunəni iki dəfə emulsiya edirik və termal dövrəyə keçiririk, sonra müsbət damcıları ləkələmək üçün daşıyıcı fazaya SYBR əlavə edirik (Şəkil 3a). Analizi aparmaq üçün

5 milyon ikiqat emulsiya damcıları, biz axın sitometrindən istifadə edirik. İkiqat emulsiyalar monodispersdir və hüceyrələrlə müqayisədə böyükdür (

40 μm) və beləliklə, irəli və yan səpələnmə kanallarında yüksək intensivlikdə sıx bir bulud kimi görünür (Şəkil 3b, sol). Dağıntılar aşağı yan və yüksək irəli səpilmə hadisələrinin paylanması kimi parçalanmış ikiqat emulsiya nəticəsində yaranan aşağı səpilmə hadisələri və yağ damcılarında görünür. Böyük, çox nüvəli ikiqat emulsiyalar bəzən mikrofluid damcı istehsalçısı tərəfindən istehsal olunur və nisbətən dar və çox yüksək yan və irəli səpələnmiş populyasiya kimi görünür. Yan və irəli səpələnmiş populyasiyalar üçün baş verən hadisələrin sayına əsasən, təxminən 75% -i istilik dövriyyəsi və FACS aşkarlamasından sağ çıxır. Tək nüvəli ikiqat emulsiya populyasiyasını təhlil etmək üçün səpələnmə kanallarında (qırmızı dairə) müvafiq buludu bağlayırıq və bu subpopulyasiyanın floresansını qururuq (Şəkil 3b, sağ). Floresan kanalında, hədəfdən məhrum olan mənfi damcılara uyğun gələn iki qaranlıq və hədəfi ehtiva edən damcılara uyğun olan iki populyasiyanı müşahidə edirik. Nümunədəki hədəf konsentrasiyasını ölçmək üçün, konsentrasiya vahidlərinə çevrilmək üçün həcmə görə normallaşdıraraq, qaranlıq və parlaq damcıların nisbətini hesablayırıq. Biz bu analizi Lambda virusunun konsentrasiyasına görə dəyişən altı nümunə üzərində aparırıq

5 böyüklük dərəcəsi və gözlənildiyi kimi, parlaq damlacıqların hissəsinin giriş konsentrasiyasına nisbətdə tərəzi olduğunu tapın (Şəkil 3c).

Lambda virusu DNT, virusu və PCR reaktivlərini hədəf alan primerlərlə qarışdırılır, ikiqat emulsiyalara çevrilir, termal olaraq çevrilir və SYBR yaşılı ilə boyanır (a). Damlalar FACS vasitəsilə işlənir, qalanları floresans dəyərləri üçün tərtib edilmiş bütün tək nüvəli olmayan ikiqat emulsiya hadisələrini ləğv etmək üçün səpələnmə yolu ilə bağlanır (b). Fərqli Lambda virusu konsentrasiyasına malik olan altı nümunə işlənir və kəmiyyətlənir, bu da Poisson kapsülleme statistikasına uyğun olaraq, gözlənildiyi kimi, Lambda virusunun giriş konsentrasiyasına malik olan floresan damlaların nisbətinin (c).

TaqMan oxunuşu ilə çoxşaxəli 3dPCR

TaqMan PCR flüoresan oxunu yaratmaq üçün TaqMan zondu istifadə edərək adi PCR-in spesifikliyini artırır. Yalnız gücləndirmə məhsulları TaqMan zond ardıcıllığına homologdursa, qeyri-spesifik gücləndirmə səbəbiylə yalan pozitivləri azaldan floresan siqnal yaradılacaq. TaqMan PCR, eyni zamanda nümunədə birdən çox DNT ardıcıllığını sorğu -sual etmək üçün fərqli rəngli boyalar istifadə edərək reaksiyanı çoxaltmağa imkan verir. Bu, məsələn, bir ardıcıllığı olan damlacıqları və bir neçə ardıcıllığı ehtiva edən damcıları ayırd etməyə imkan verir. Bunu göstərmək üçün biz Lambda virusunun genomlarını ΦX174 virus genomlarının nümunəsinə əlavə edirik, Lambda virusunun konsentrasiyasını daha çox dəyişirik.

OrdersX174 sabit olan 5 böyüklük əmri. Lambda (yaşıl boya) və ΦX174 (qırmızı boya) virusunu hədəf alan TaqMan analizlərindən istifadə edərək nümunəni 3dPCR ilə təhlil edirik (Şəkil 4a). Lambda və ΦX174 genomları təsadüfi olaraq damlacıqlara daxil edilir, beləliklə, biz dörd populyasiyanın, hər iki hədəfi olmayan damlacıqların (sönük), bir hədəfi (təmiz yaşıl və ya qırmızı) və hər iki hədəfi (sarı) olmasını gözləyirik.

Lambda- və 17X174 virusu DNT-si qarışdırılır və hər iki virusu hədəf alan primerlər və TaqMan probları ilə birləşdirilir. Nümunələr ikiqat emulsiyaya çevrilir və istilik dövriyyəsi (a). Damcılar FACS vasitəsilə işlənir, bütün tək nüvəli olmayan ikiqat emulsiya hadisələrini atmaq üçün səpələnmə ilə bağlanır, qalanları isə flüoresans dəyərləri üçün tərtib edilir (b). Lambda və ϕX174 virus kapsulyasiyasının dörd mümkün kombinasiyasına uyğun gələn dörd flüoresan populyasiya müşahidə edilir. Sabit ϕX174 virus şərtləri olan fərqli Lambda virusu konsentrasiyasına malik altı nümunə işlənir və kəmiyyətcə göstərilir ki, bu da nümunələr arasında expectedX174 pozitiv damlaların nisbətinin dəyişmədiyini, lakin Lambda virusunun ölçüsünün Poissona uyğun olaraq dəyişdiyini göstərir. inkapsulyasiya statistikası (kəsilmiş əyri) (c).

Damcıları FACS ilə təhlil edirik və ikiqat emulsiyaya uyğun gələn səpilmə populyasiyasını yenidən bağlayırıq (Şəkil 4b, sol). Bu populyasiyanın qırmızı və yaşıl floresansını qururuq və gözlənilən dörd qrupu müşahidə edirik (Şəkil 4b, sağ). TaqMan analizləri müsbət damcıların bir yerə toplandığı və mənfi damcılarla üst-üstə düşmədiyi “ikili” siqnallar verdiyinə görə, hər klasterdə aşkar edilmiş hadisələrin sayı keçid hədlərinin dəqiq mövqeyinə həssas deyil. Tək rəngli təcrübədə olduğu kimi, müxtəlif populyasiyalara düşən müsbət və mənfi damcıların nisbəti geniş dinamik diapazonda qarışıq nümunədə müxtəlif virus genomlarının konsentrasiyalarını qiymətləndirmək üçün istifadə edilə bilər (Şəkil 4c). Bu göstərir ki, TaqMan oxunuşu ilə 3dPCR eyni vaxtda bir nümunədə birdən çox DNT növünün kəmiyyətini təyin edə bilər. Üstəlik, eyni damcı içərisində iki fərqli hədəfin mövcud olduğu xüsusi halları müəyyən etməyə imkan verir (sarı damcılar, Şəkil 4a). Bu, adi qPCR ilə mümkün deyil və müxtəlif ardıcıllıqları birlikdə korrelyasiya etmək üçün faydalıdır, məsələn, bir-birindən müəyyən məsafələrdə ardıcıllığın mövcudluğuna əsaslanaraq DNT molekullarının uzunluqlarını xarakterizə etmək 32,33 rekombinasiya hadisələrinin mövcudluğuna əsaslanaraq xarakterizə etmək. bir molekul daxilində müxtəlif ardıcıllıq birləşmələri 34 və eyni varlıq daxilində fərqli molekulların kombinator birləşmələrini xarakterizə etmək üçün, məsələn, seqmentləşdirilmiş genomları olan virusların DNT-si 35,36 və ya müəyyən bir patogenin müəyyən bir ev sahibini yoluxdurma ehtimalı. Bu cür birləşmələr, adətən, yalnız DNT ardıcıllığı ilə ölçülə bilər, lakin 3dPCR sürətli və ucuz alternativ təmin edir.

FACS ilə tək DNT molekullarının çeşidlənməsi

3dPCR, bir FACS alətinin PCR analizindən istifadə edərək hədəf DNT ardıcıllığını "oxumasına" imkan verir. Bununla birlikdə, FACS aşkar etməkdən daha çox qabiliyyətə malikdir, ölçmə əsasında da sırala bilər.Bu, əslində, qarışıq bir DNT molekulu populyasiyasının ayrı -ayrı sorğu -sual edilməsinə, PCR analiz kriteriyasına uyğun olan bütün molekulların bərpasına imkan verir, eyni zamanda ümumi PCR və ya oligo tutmağa əsaslanan ənənəvi üsullarla müqayisədə əhəmiyyətli üstünlüklər verən DNT -ni zənginləşdirmək üçün yeni bir yol təqdim edir. Bu qabiliyyəti nümayiş etdirmək üçün biz 3dPCR istifadə edərək DNT nümunələrini çeşidləyirik. Lambda virusu DNT -ni arxa plana sancırıq S. cerevisiae genomik DNT və Lambda'yı hədəf alan TaqMan probları ilə nümunəni sıralayın (Şəkil 5a, sol). Sıralanmış ikiqat emulsiya damlaları TaqMan müsbətdir, baxmayaraq ki, bir çox yağ damlaları da var (Şəkil 5a, sağ). Yağ damlaları, FACS aşkarlanması zamanı partlayan, qabıq axını aralığının əmələ gətirdiyi kəsmə nisbətləri və çeşidləmə nəticəsində yaranan qüvvələr nəticəsində parçalanan ikiqat emulsiyaların qalıqlarıdır. Səpələnmiş əhalinin sayına və çeşidlənmiş damlacıqların görüntüsünə əsaslanaraq təxmin edirik

İkiqat emulsiyaların 40% -i PCR və FACS addımları ilə sağ qalır. FACS zamanı ikiqat emulsiya yırtılması, ikiqat emulsiya ölçüsünün azaldılması, FACS -in burun ölçüsünün artırılması və damcıların daha yavaş işlənməsi ilə azaldıla bilər.

Lambda DNT-si daxil edilir S. cerevisiae genomik DNT 1:100 konsentrasiyada və (a) 3dPCR (solda) və FACS (sağda). FACS zamanı bəzi ikili emulsiyalar əmələ gəlir və sıralanan populyasiyada kiçik yağ damlaları buraxır. Bir bölgəni hədəfləyən primerlərlə qPCR istifadə edərək zənginləşdirmənin kəmiyyətini müəyyənləşdiririk S. cerevisiae genom və 3dPCR reaksiyasında gücləndirilmiş Lambda genomunun fərqli bir bölgəsi. Eğrinin dəyişməsinə əsaslanaraq Lambda-nın nisbətininS. cerevisiae DNT çeşidlənərək 83 dəfə artır (b). Brightfield və floresan bu görüntülərdə örtülmüşdür.

İkiqat emulsiyaların çeşidlənməsi ilə əldə edilən zənginləşdirməni təsdiqləmək üçün biz Lambda genomunun fərqli bir bölgəsini və bir bölgəni hədəf alan primerlərlə çeşidlənmiş və çeşidlənməmiş nümunələri təhlil edərək qPCR-dən istifadə edirik. S. cerevisiae genom (Şəkil 5b). Lambda virusu primerləri çeşidlənməmiş nümunədən (Şəkil 5b, yuxarıda) bir qədər tez gücləndirilir, baxmayaraq ki, DNT-nin ümumi miqdarı eynidir və bu, çeşidləmənin Lambda virusu genomlarının sayını artırdığını göstərir. Əksinə, S. cerevisiae primerlər çeşidlənməmiş nümunəyə nisbətən çeşidlənmiş nümunədə çox gec güclənir və bunu göstərir S. cerevisiae DNT çeşidləmə yolu ilə güclü zənginləşdirilmişdir (Şəkil 5b, aşağıda). QPCR əyrisinin dəyişməsinə əsaslanaraq Lambda-nın nisbətini qiymətləndiririk.S. cerevisiae DNT 83 faktorla dəyişdi, bu, 1% Lambda-müsbət damcıların yüklənmə sürətimiz üçün molekulların Poisson kapsulyasiyasına əsaslanan nəzəri gözləntilərə yaxındır. Daha yüksək zənginləşdirmə nisbətlərinə nümunəni daha da seyreltməklə, miqdarını azaltmaqla nail olmaq olar S. cerevisiae Müsbət damlacıqlara daxil olan DNT, eyni zamanda müsbət damcıların tezliyini azaldır və eyni sayda müsbət hadisəni bərpa etmək üçün daha çox çeşidləmə tələb edir. Bu, 3dPCR-nin FACS ilə qarışıq nümunədən hədəf DNT-ni çeşidləmək üçün effektiv vasitə olduğunu nümayiş etdirir.

Sıralanmış DNT -nin ölçü dağılımı

3dPCR -nin digər DNT zənginləşdirmə metodlarından üstünlüyü, yalnız 100 kbp uzunluğunda molekulların bərpasına imkan verməsidir.

100 bp TaqMan identifikasiya ardıcıllığı. Bunu göstərmək üçün biz 3dPCR vasitəsilə aşkar edilmiş və bərpa edilmiş molekulların uzunluqlarını multipleksləşdirilmiş analizlə ölçürük. Biz hər bir damlacıqda qırmızı (Cy5) və yaşıl (FAM) bir-birindən müəyyən edilmiş məsafələrdə XIV maya xromosomunu hədəf alan TaqMan zondlarını daxil edirik. Əgər damcıda zondların ayrılma məsafəsindən daha qısa bir DNT molekulu varsa, damcılar ya saf qırmızı, ya da yaşıl olacaq (şəkil 6a, solda). Bununla belə, fraqment ayrılma məsafəsindən daha uzundursa, damcı ikiqat müsbət (sarı) ola bilər ki, bu da nümunədəki molekulların bir və ya ikiqat sayını hesablayaraq ayrılma uzunluğundan yuxarı olan hissəsini təxmin etməyə imkan verir. müsbət sitometriya vasitəsilə müsbət hadisələr (Şəkil 6a, sağda). Qırmızı və yaşıl zond cütləri üçün ayrılığı artırmaqla təcrübəni təkrarlayaraq (Şəkil 6b) nümunədəki molekulların uzunluq paylanmasını təxmin edə bilərik.

S. cervisiae (maya) genomik DNT, Cy5 astar/prob və FAM astar/prob dəstləri ilə ikiqat emulsiyalarda kapsullanır (a). Astar/prob dəstləri maya genomu boyunca 10 Kbp ilə 500 Kbp arasında ayrılır (b). Termal velosipeddən sonra damcılar təsvir olunur (c) və fluoressensiya intensivliyi axın sitometriyası ilə ölçülür. Zondlar arasındakı məsafə artdıqca, ikiqat müsbət damcıların payı azalır, bu DNT-nin parçalanması səbəbindən uzun molekulların qısa molekullardan daha nadir olduğunu göstərir (d). Bunu təsdiqləmək üçün DNT -ni tək bir FAM probu ilə sıralayırıq və qPCR ilə molekul uzunluğunu sorğu -suala tuturuq (esıralama zondundan artan məsafələrdə ikincil problarla (f). Termal velosipeddən sonra seyrək pozitiv damcılar görünür (g) bərpa olunan və təhlil edilən (h). QPCR ilə çeşidləmə, uzun molekulların qısa molekullardan daha nadir olduğunu, lakin nümunədə 500 Kbp -ə qədər olan molekulların olduğunu göstərən çoxşaxəli nəticələri təsdiqləyir. Bu molekulları bu bölgənin iki ekstremalını hədəfləyən multipleksləşdirilmiş TaqMan analizindən istifadə edərək çeşidləməklə bərpa etmək olar.

Termal velosipeddən sonra, damcılar, Şəkil 6c -də göstərilən təsvirlə göstərildiyi kimi, ehtiva etdikləri hədəf ardıcıllığının sayından asılı olan bir floresan əldə edir. Bunu bütün zond cütləri üçün təkrar etməklə, ikiqat müsbətlərin kəsirinin zondlar arasındakı ayrılma məsafəsi ilə tərs mütənasib olduğunu aşkar edirik (şəkil 6d). Bu, uzun molekulların mövcud olduğunu göstərir, lakin onlar qısa molekullardan daha nadirdir. 3dPCR fraksiyalarına əsaslanaraq, molekulların 3% -nin & gt100 Kbp uzunluğunda olduğunu təxmin edirik.

3dPCR ilə əldə edilən molekul uzunluqlarının əlavə təsdiqi olaraq, XIV maya xromosomunu aşkar etmək üçün tək bir prob istifadə etdiyimiz və qPCR vasitəsi ilə sorğu -sual edilən bu molekulları bərpa etmək üçün FACS istifadə etdiyimiz bir təcrübə edirik (Şəkil 6e). Algılama zondu, XIV maya xromosomunda 550 Kbp mövqedə yerləşir, belə ki, ən çox bərpa olunan molekullar 500-600 Kbp mövqeyində olmalıdır. Bunu təsdiqləmək üçün biz maya XIV xromosomunda müxtəlif mövqelərdə dörd qPCR prob dəsti yaradırıq (Şəkil 6f). Maya genomik DNT-si ikiqat emulsiyalara və termal dövrəyə çevrilərək müsbət damcıların nümunələrini verir (Şəkil 6g). Alətə bu damlaları bərpa etməyi və DNT şablonlarını çıxarmağı və qPCR ilə analiz etməyi tapşırırıq (Şəkil 6h). Biz aşkar etdik ki, aşkarlama zonduna yaxın olan zond dəstləri aşağı dövrlərdə gücləndirilir, daha uzaqda olanlar isə yüksək dövrlərdə gücləndirilir (Şəkil 6h, daxil), bu qısa fraqmentlərin çeşidlənmiş nümunədə uzun fraqmentlərdən daha çox olduğunu göstərir. QPCR məlumatlarını istifadə edərək, nümunədə mövcud olan şablon molekullarının sayını PCR izlərinin kəsişən eşik dəyərinə əsaslanaraq müəyyən edirik və yenə də uzun molekulların qısa molekullardan daha nadir olduğunu, lakin uzun molekulların əhəmiyyətli bir hissəsinin olduğunu tapırıq. mövcuddur, hətta 500 Kbp -ə qədər. Bu, bizim multipleksləşdirilmiş təcrübə nəticələrimizi təsdiqləyir. Əlavə olaraq, 3dPCR, uzunluqdan yüzlərlə kilobaz şablonların bərpasına imkan verən, bu uzunluqla ayrılmış birdən çox TaqMan zondu ilə çeşidlənərək hədəf uzunluğundan yuxarı olan molekulların bərpasına imkan verir.


2-ci hissə: Nüvənin çoxfazalı maye davranışı

00: 00: 15.09 Salam.
00:00:16.21 Mənim adım Princeton Universiteti və HHMI-dən Cliff Brangwynne,
00: 00: 19.20 və bu barədə sizə məlumat verməkdən məmnunam
00: 00: 22.24 çox fazalı maye davranışı üzərində işləyir
00: 00: 25.18 nüvənin.
00: 00: 27.09 Beləliklə, bu membransız nüvə cisimlərini müzakirə etdik
00: 00: 32.04 ilk mühazirədə,
00:00:33.21 və mən bu cür strukturlarla xüsusilə maraqlanıram,
00:00:37.13 hüceyrələrin nüvəsi kontekstində bu kondensatlar.
00: 00: 43.13 Bunu nəzərə almaq vacibdir
00:00:45.22 nüvə. hüceyrənin.
00:00:47.10 bu genomun oturacağıdır,
00: 00: 49.11 və baş verən bütün təşkilatlar
00:00:51.20 nüvənin içində tamamilə yoxluqdadır
00: 00: 54.09, membrana bağlı hər hansı bir vesikula bənzər təşkilat.
00: 00: 59.17 Deməli, bu membransız nüvə cisimləri
00: 01: 02.18 həqiqətən əsas quruluşlardır
Nüvənin tərkibini təşkil etmək üçün 00: 01: 05.26
00:01:07.19 və genomun və gen ifadəsinin təşkili.
00:01:09.18 Onlara bu söhbətin diqqət mərkəzində olacaq nüvələr kimi strukturlar daxildir
00:01:13.07 transkripsiya kimi digər şeylər.
00:01:15.29 tənzimləyən bu transkripsiya fabrikləri
00:01:18.21 fərdi genlərin ifadəsi
00:01:21.15 Bu PML orqanları da rol oynayır
00:01:23.29 genetik məlumat axınında
00: 01: 25.18 və ya Cajal cəsədləri və Snurposomları,
00: 01: 28.11 birləşmə, yenə də gen tənzimlənməsi ilə məşğul olur.
00: 01: 30.27 Beləliklə, anlamağa çalışmaq istərdik
00:01:33.26 bu strukturlar necə formalaşır və hansı rol oynayırlar
00: 01: 36.28 gen ifadəsində və genomun təşkilində.
00:01:40.26 Beləliklə, nüvələr və ya nüvələr.
00: 01: 44.24 və çoxluğu nukleolidir.
00: 01: 47.12 bunlar həqiqətən də cazibədar quruluşlardır.
00: 01: 48.26 150 ildən çoxdur tanınırlar.
00: 01: 51.26 İlk mikroskopçuların gördükləri ilk şeylərdən biridir
00: 01: 54.18 hüceyrələrə baxdıqda,
00:01:56.23 məsələn, bu HeLa hüceyrələri kimi insan hüceyrələri.
00:02:01.24 Beləliklə, nüvələr qaranlıqdır.
00: 02: 04.12 Nüvə içərisində böyük qaranlıq oklüziyalar
Bu fərdi hüceyrələrdən 00: 02: 06.21.
00:02:09.01 Onlar haqqında düşünmək həqiqətən maraqlıdır
00: 02: 12.29 DNT -dən RNT -yə zülala genetik məlumat axını
00:02:16.21 çünki onlar saytlarda otururlar
00: 02: 19.18 burada ribosomal RNT genlərinin aktiv transkripsiyası var.
00: 02: 23.19 Beləliklə, ribosomal RNT -nin transkripsiyası üçün həqiqətən vacibdirlər,
00: 02: 27.15 və ribosom əslində zülal hazırlayan maşındır,
00: 02: 30.05 nəticədə sitoplazmada,
00: 02: 32.06 buna görə də RNT -dən zülala doğru bu addım üçün də əhəmiyyətlidirlər.
00: 02: 35.17 Beləliklə, nüvə haqqında düşüncə tərzimiz
00: 02: 38.08 bu membransız kondensatdır
00:02:40.29 asanlaşdırmağa kömək edir
00: 02: 43.22 tələb olunan çoxsaylı reaksiyalar
Bu ribosomal RNT transkriptlərinin işlənməsi üçün 00: 02: 46.18
00:02:49.16 nəticədə bu yetkin preribosomal hissəcikləri meydana gətirmək
00:02:54.23 və nəticədə ribosom, bu protein tərcümə maşını.
00:02:59.13 Beləliklə, biz nüvəcik haqqında düşünməyə başladıq, bilirsiniz,
00:03:04.07 P qranullarında etdiyimiz ilk araşdırmalardan dərhal sonra
00: 03: 06.09 son danışığımda sizə dedim.
00: 03: 08.05 Nüvə.
00: 03: 11.11 bilirsiniz, bu böyük membransız kondensat,
00: 03: 13.03 olub olmadığını düşünürdük.
00:03:15.26 Əgər o, bildiyiniz kimi, maye faza ilə ayrılmış bir montaj kimi düşünülə bilərdi
00: 03: 18.25 hüceyrələrdə.
00: 03: 20.23 Beləliklə, laboratoriyamda bir postdoc, Steph Weber,
00: 03: 22.21, indi McGill Universitetində müəllim işləyir.
00: 03: 25.20 model sistem olaraq C elegans istifadə edərək bu sualı həll etməyə başladı.
00: 03: 28.21 Və bu film montaj və sökmə dövrlərini göstərir
Fərdi nüvələrin 00: 03: 32.28
00: 03: 36.04 inkişaf edən C elegans embrionu içərisində.
00: 03: 39.07 Gördüyünüz şey nüvə zülallarıdır
00:03:42.06 nukleoplazmadan kondensasiya olunur
00: 03: 44.21 bu damcıların çoxuna,
00: 03: 46.25 və sonra C elegansdakı iki saytın ətrafında həll edildi
00:03:50.15 ribosomal RNT-nin aktiv şəkildə transkripsiya edildiyi.
00: 03: 53.28 Beləliklə, Stephdən iş
00: 03: 56.19, eləcə də əməkdaşlarımız Mikko Haataja və Joel Berry,
00: 03: 59.22 bunu göstərə bildiyimiz bir xəritəyə gətirib çıxardı
00:04:05.22 nüvənin yığılmasının dinamikası.
00: 04: 08.22 istifadə edərək yaxşı təsvir edilə bilər
00: 04: 13.00 Klassik faza ayrılıq nəzəriyyələri,
00: 04: 15.09 xüsusilə bu Cahn-Hilliard formalizmi,
00:04:17.16 bir növ a. təsvir üsulu,
00:04:20.19 yuxarı diffuziya nədir.
Faza ayrılması üçün lazım olan 00: 04: 22.26
00: 04: 25.04 haqqında danışdığımız entropik təsiri aradan qaldırmaq üçün
00:04:28.12 son mühazirədə.
00:04:29.24 Beləliklə, nüvələr həqiqətən, bilirsiniz,
00:04:32.27 bir növ maye kondensat.
00: 04: 38.03 Və əslində etdiyimiz ilk iş bu qurbağa oosit sistemində idi
00: 04: 39.28 bu nukleollara baxmaq üçün
00: 04: 42.04 və bu cür suallar verməyə başlayın
00:04:44.19 biofiziki obyektlər kimi nə olduqları haqqında
00: 04: 46.24 və onların quruluşu və quruluşu haqqında düşünmək və s.
00: 04: 51.01 Xenopus laevis həqiqətən güclü bir sistemdir.
00: 04: 55.01. bu. oosit və ya yumurta əmələ gətirir,
00: 04: 58.28, gübrələməyə hazırdır. nə vaxt.
00:05:02.25 çox böyükdür. Beləliklə, təxminən bir millimetr ölçüsündədir.
00:05:06.12 O, eyni zamanda olduqca böyük olan tək böyük nüvədən ibarətdir.
00: 05: 10.15 diametri təxminən 600 mikrondur.
00: 05: 12.22 Və bu böyük nüvənin içində,
00: 05: 15.15 çoxdur
00: 05: 17.19 -əslində yüzlərlə və ya minə qədər -
00: 05: 19.15 Bu fərdi damcılarda görə biləcəyiniz nukleoli.
00:05:22.12 İçindəki damlacıq görünüşlü strukturlar.
00: 05: 25.09 Beləliklə, bu bizim üçün güclü bir sistem idi
00:05:28.03 çünki biz həqiqətən bu biofiziki xüsusiyyətləri sorğulamağa başlaya bilərdik
00: 05: 31.28 bir çox nüvədən ibarət olan bu böyük nüvənin içində.
00: 05: 36.03 Və göstərdiklərimiz bu nukleollar idi.
00:05:38.04 Biz onları bir yerə itələdiyimiz zaman, birləşirlər
00:05:40.09 onları bir-birindən ayırmağa başlasaq,
00:05:42.16 Onlar əslində bu maye körpünün qırılması hadisələrinə məruz qalacaqlar,
Bu filmdə gördüyünüz 00: 05: 44.14.
00:05:46.07 Və bu, ölçməyə başlamağa imkan verdi
00: 05: 49.03 xassələri, özlülüyü və səthi gərginliyi,
00: 05: 51.24 bu quruluşların həqiqətən maye kimi olduqlarını göstərmək üçün,
00:05:55.11 lakin bunda maraqlı bir bükülmə var,
00:05:57.14 yəni bu likvidlik, bu axıcılıq,
00: 06: 00.14 qeyri-tarazlıq bioloji proseslərdən asılıdır
00: 06: 05.19 hüceyrədə baş verir.
00: 06: 08.29 Və beləliklə, bu, bunu göstərir.
00: 06: 11.13 ATP hüceyrəsini tükəndirsək,
00:06:14.02 hüceyrənin batareyasının bir növüdür,
00:06:16.01 sonra bu strukturların görünən viskozitesi
00:06:18.25 əhəmiyyətli dərəcədə yüksəlir.
00: 06: 20.26 Beləliklə, qeyri-tarazlıq dinamikasının xüsusiyyətləri var
00: 06: 23.24, bu strukturların axıcılığını tənzimləyən
00: 06: 26.06 və biz. buna görə də onları aktiv maye adlandırırıq.
00: 06: 28.16 bir növ aktiv maye kondensatı.
00: 06: 32.03 Ən sadə sualı vermək ruhunda
00:06:35.02 tədqiqatımıza başlayarkən düşünə biləcəyimiz,
00: 06: 39.05 burada sualı verdik,
00: 06: 41.00 bunlar həqiqətən mayedirsə.
00: 06: 45.00 bunlar qurbağanın nüvəsindəki maye kondensatlardırsa.
00:06:50.08 bu qurbağa yumurtası,
00:06:53.23 onda niyə onların hamısı vahid daha böyük bir quruluşa birləşdirilmir?
00:06:57.06 Niyə onlar fərqli damcılar kimi qalırlar?
00:06:59.23 Mən bunu göstərdiyim zaman əgər. Bilirsiniz, əgər onları bir araya gətirsək,
00:07:02.12 onlar asanlıqla birləşirlər?
00: 07: 04.00 Elə isə niyə hamısı böyük bir damlada birləşmir?
00: 07: 06.08 Və budur. bu a. aydındır, çox sadə bir sual,
00:07:10.14 və mən bunun güclü olduğunu düşünürəm və bizi bəzi maraqlı yollara apardı.
00: 07: 14.15 Beləliklə, bu suala cavab verməyə çalışarkən,
00: 07: 18.09 Sizi çox fundamental fikirlərlə tanış etmək istəyirəm
00: 07: 20.24 hüceyrə biologiyasının bir çox sahələrində əhəmiyyətlidir.
00: 07: 24.08 Düşünmək vacibdir.
00: 07: 27.02 Beləliklə, əvvəlcə Brownian hərəkəti təsvir edildi
00: 07: 30.24 Robert Brown tərəfindən bu həqiqətən klassik
00: 07: 33.20 və çox maraqlı, çox tövsiyə olunan kağız
1828-ci ildən 00:07:36.09.
00: 07: 38.08 Beləliklə, bu yazıda polen hissəciklərinin təsadüfi hərəkətini təsvir edir
00: 07: 44.05 və bir hüceyrənin içindəki digər hissəciklər,
00: 07: 46.11 və təsadüfi bir gediş yolu
00:07:49.29 mikroskopda baxıldığında.
00:07:52.24 Kağız bir sıra səbəblərə görə həqiqətən maraqlıdır.
00: 07: 55.05 Onlardan biri açıq şəkildə çox məyus olmasıdır
00: 07: 57.13 gördüyü hərəkətin olduğunu kəşf etdikdə.
00:08:02.07 əslində həyatla heç bir əlaqəsi yoxdur,
00:08:04.28 o mənada ki, hətta bilirsiniz,
00: 08: 07.13 kvars və digər ölü materialların yerdən ucları
00: 08: 10.21 Brownian hərəkəti keçir.
00: 08: 12.19 Və buna görə də, bundan olduqca üzüldü.
00:08:14.11 Əlbəttə, indi gülüncdür,
00:08:17.03 çünki biz indi bunu tamamilə əsas konsepsiya kimi tanıyırıq
00: 08: 19.21 bu, yalnız cansız materiallar üçün vacibdir
00: 08: 22.02, həm də hüceyrə daxilində.
00:08:25.09 Beləliklə, bunlardır.
00:08:28.03 bu, Brownian hərəkətini keçirən hissəciklər filmidir,
00:08:32.01 bu təsadüfi termal dalğalanmalar
00:08:34.16 su məhlulu içərisində.
00: 08: 37.27 Beləliklə, burada fikir təsadüfi enerjinin olmasıdır.
00: 08: 43.00 kimi düşünmək olar.
00: 08: 45.21 kT enerji, daha əvvəl bəhs etdiyimiz istilik enerjisi miqyası,
00: 08: 48.06 bu hissəciklərin ətrafında təpiklənir
00:08:51.04 və onların təsadüfi keçməsinə səbəb olur. təsadüfi gəzinti.
00:08:53.28 İndi bəzi maraqlı riyazi xüsusiyyətlər var
Bunun necə işlədiyini 00: 08: 56.24
00:08:59.02 diqqətinizə çəkmək istəyirəm.
00:09:00.25 Birincisi, Brownian hərəkəti yönəldilmiş hərəkətdən fərqlidir.
00:09:05.01 Beləliklə, yönəldilmiş hərəkətdir. düz bir xətt ilə gedirsənsə
00: 09: 08.02 və ya maşın sürürsənsə,
00:09:10.23 Bilirsiniz, düz bir yolda
00: 09: 12.29 və yalnız maşın sürürsən.
00: 09: 15.01 Beləliklə, yönləndirilmiş hərəkətdə düşünə bilərik.
00:09:18.00 sabit bir sürətlə və ya sürətlə hərəkət ediriksə,
00:09:20.24 əgər biz. iki dəfə çox vaxta getsək,
00:09:25.29 onda biz iki dəfə məsafə qət etdik.
00: 09: 28.15 Bu cür məntiqlidir -
00: 09: 31.01 bilirsən, maşında iki dəfə uzun oturursan, eyni sürətlə hərəkət edirsən,
00: 09: 33.20 İki dəfə irəli getmisiniz.
00: 09: 35.14 Deməli, bu miqdarın kvadratını sizdən soruşsaydım
00:09:38.11 -- yerdəyişmənin kvadratı nədir? -
00:09:41.04 onda mən deyərdim ki, tamam, yaxşı mən bu tənliyin hər iki tərəfini kvadrat edirəm,
00: 09: 45.02 və v kvadratlı bir prefektorum var
00:09:47.02 və sonra mənim vaxtım kvadratdır,
00: 09: 49.00 və bu, tamamilə məntiqlidir.
00:09:50.25 Beləliklə, əgər mən bilirsənsə, iki qat daha çox gözlə,
00: 09: 53.04 sonra məsafənin kvadratı olmalıdır.
00: 09: 55.06 bilirsiniz, dörd qat böyük olmalıdır.
00:09:58.23 İndi maraqlı olan diffuziv hərəkət üçündür
00: 10: 01.07 məsafənin kvadratıdır.
00: 10: 03.04 zamanın meydanı kimi getmir,
00: 10: 05.04 ancaq zamanla xətti gedir.
00: 10: 07.23 Deməli, bu olduqca maraqlıdır.
00: 10: 10.03 İki dəfə çox gözləsəm, gözləmirəm.
00:10:12.01 bilirsiniz, bu miqdar, bu delta-x-kvadrat,
00: 10: 15.00 dörd böyük bir faktor deyil.
00: 10: 17.10 Bu, yalnız iki böyük faktordur.
00: 10: 19.22 Beləliklə, buradakı prefektora diffuziya əmsalı deyilir.
00: 10: 22.21 Bu sürət kimi bir şeydir, amma bir az fərqlidir.
00: 10: 27.04 Fərqli bölmələri var.
00: 10: 30.01 Ümumiyyətlə, bu fikir,
00: 10: 32.08 yönləndirilmiş hərəkətə malikdir. vasitələr.
00:10:35.16 orta kvadrat yerdəyişmə, delta-x-kvadrat zaman kvadratı kimi gedir,
00: 10: 38.28, zaman kimi getdiyi diffuziv hərəkətə qarşı.
00: 10: 42.14 Bəzi hallarda aranızda bir şey ola bilər.
00: 10: 44.12 Beləliklə, ümumiyyətlə yerdəyişmənin kvadratını yazardıq
00: 10: 48.08, bir gücə, alfa,
00: 10: 50.22, diffuziv göstərici adlandıracağıq.
00:10:53.07 Beləliklə, tez-tez etdiyimiz şey film çəkməkdir
00: 10: 55.23 burada muncuqlarla gördüyünüz kimidir
00: 10: 57.21 və sonra yerdəyişmə kvadratını qurun -
00:11:00.01 orta kvadrat yerdəyişmə və ya MSD --
00: 11: 02.13 bu qeyd sahəsindəki. log-log sahəsi,
00: 11: 05.19 və yamac, bu yayıcı göstəricidir.
00: 11: 08.21 Beləliklə, görə bilərsiniz. bu əslində bir filmdən alınan məlumatlardır
00:11:11.16 buradakı kimi,
00:11:13.16 və siz görə bilərsiniz ki, orta kvadrat yerdəyişmə
00: 11: 15.24, bu log-log sahəsindəki zamanın funksiyası olaraq xətti,
00: 11: 18.10 və bu, diffuziv göstəricinin 1 olduğunu söyləyir.
00:11:20.27 tam olaraq gözlədiyimiz şeydir.
00:11:22.25 Brown diffuziyasının sadə təsviri üçün bilirsiniz.
00: 11: 26.01 Beləliklə, bu fikirləri yadda saxlamaq vacibdir
00:11:28.04 bundan sonra sizə deyəcəklərimdə
00: 11: 30.25 çünki bu sistemdə nə etməyə çalışdıq
00:11:33.21 sualı cavablandırarkən
00: 11: 37.01 niyə bu damlaların hamısı bir -biri ilə birləşmir
00: 11: 40.02 soruşduqda, zond hissəcikləri təqdim edə bilərikmi?
00: 11: 43.16 Bu hüceyrənin nüvəsinə girin və soruşun:
00: 11: 46.04 sərbəst hərəkət edə bilərlərmi?
00: 11: 48.00 Beləliklə, ətraf mühitin kiçik araşdırmaları kimi,
00:11:50.08 damcılar kimi bir şey,
00:11:52.22 və onların sərbəst hərəkət edib-etmədiklərini soruşur.
00: 11: 55.26 Buna mikrorheologiya deyirik.
00: 11: 57.14 Bu bir müddətdir. reologiya materiallarda axın və deformasiya davranışının öyrənilməsidir.
00:12:03.21 Mikroreologiya yalnız mikroskopik miqyasdadır.
00:12:05.25 Beləliklə, laboratoriyamdakı həqiqətən istedadlı bir aspirant,
00:12:07.24 indi NIH-də postdok, Marina Feric,
00:12:10.13 nüvəyə kiçik zond hissəcikləri vuruldu.
00: 12: 14.14 Beləliklə, bunlar inert kiçik muncuqlardır,
00:12:17.15 mikroskopik muncuqlar,
00: 12: 19.14 nüvəyə enjekte etdi,
00: 12: 21.28 və soruşdular ki, bu muncuqlar ətrafa yayılmaqda sərbəstdir, ya yox?
00: 12: 23.24 Bir şəkildə məhdudlaşdırılırlarmı?
00: 12: 25.26 Beləliklə, Marinanın tapdığı şey budur.
00: 12: 28.07 bilirsiniz, ilk işlərdə dedi:
00: 12: 30.23 yaxşı, əslində xüsusilə məhdudlaşdırılmış görünmürlər.
00: 12: 32.19 Həqiqətən kiçik hissəciklər qoysam.
00:12:34.11 bunlar 0,2 mikron/200 nanometr muncuqlardır
00: 12: 37.11 bu nüvəyə, bu GV ya germinal vezikula enjekte edilir,
00:12:40.10 tapdığı şey, muncuqların əslində olduğu görünür
00: 12: 44.08 ətrafında rəqs edir və əslində Brownian hərəkətinə bənzəyir.
00:12:47.02 Beləliklə, onlar hərəkət etmək üçün olduqca sərbəst görünürlər.
00:12:48.28 Beləliklə, əvvəlcə təəccüblü idi.
00: 12: 51.06 Dedik, yaxşı, əgər belədirsə, niyə bunlar olmur.
00: 12: 53.25 bilirsinizmi, bu maye kondensatları da ətrafa yayılır?
00:12:57.15 Və dedik ki, gəlin müxtəlif ölçülü muncuqlara baxaq
00:13:00.08 və nə baş verdiyini soruşun.
00: 13: 02.23 Beləliklə, yenə də.
00: 13: 05.12 Bu kiçik boncukların orta kvadratik yerdəyişməsini tərtib etsəm,
00:13:07.10 əvvəl sizə göstərdiyim kimi,
00: 13: 09.16 görürsən ki, zamanla xətti asılılıq var,
00: 13: 12.05, buna görə buradakı diffuziv eksponentə 1 deyərdim.
00: 13: 14.17 Ancaq daha böyük və daha böyük boncuk ölçülərinə keçdikcə
00: 13: 18.11 gördüyünüz şey eksponentin aşağı düşməsidir.
00:13:20.07 Beləliklə, əyrinin yamacı aşağı, aşağı və aşağı enir.
00: 13: 24.22 Beləliklə, artan bir məhdudiyyət var
00:13:27.16 hissəciklərin hərəkəti haqqında
00:13:30.04 daha böyük və daha böyük hissəcik ölçülərinə çatdıqca.
00:13:31.26 Və burada muncuqların mövqe izlərini görə bilərsiniz.
00:13:35.29 Kiçik muncuqlar həqiqətən də Brownian hərəkətindən keçir,
00:13:39.00 ətrafa yayılır.
00:13:40.14 Və daha böyük hissəciklərə çatırsınız,
00: 13: 42.01 bu fasiləni görürük, sanki tullanırlar.
00: 13: 43.24 bəlkə də məsamələr arasında, istəsən,
00:13:45.14 və sonra ən böyük hissəciklər həqiqətən çox məhdudlaşmağa başlayır
00: 13: 49.19 nüvə içərisindədir.
00: 13: 51.16 Beləliklə, bu əyrilərin yamacını tərtib etsəm,
00:13:54.15 o diffuz göstərici,
00: 13: 56.27 hissəciklərin ölçüsünə görə,
00:13:58.25 Mən bu çox aydın cığır görürəm.
00: 14: 03.08 Beləliklə, 1 -ə yaxın diffuziv bir göstəricidən gedir.
00: 14: 05.06 sadə yayılmaya yaxın, kiçik hissəciklər üçün,
00: 14: 08.07 lakin daha böyük hissəciklər üçün enir.
00: 14: 11.10, hissəciklərin hərəkətində bir növ məhdudiyyətə uyğundur
00:14:16.23 müəyyən ölçüdən daha böyük olduqda,
00:14:17.16, bilirsiniz ki, bir neçə yüz nanometr/0,2 mikron kimi bir şeydir.
00: 14: 23.01 Beləliklə, bu barədə düşünməyə başladıq.
00: 14: 26.09 Beləliklə, hissəciklərin məhdudlaşdırıldığı görünür
00:14:29.00 Ölçü miqyası olan bəzi şəbəkə tərəfindən
00: 14: 32.15 bu bir neçə yüz nanometrdir.
00: 14: 34.20 Əslində burada əldə etdiyimiz məlumatlar.
00:14:37.05 bu sistemdə bəzi məlumatlar kimi görünür
00: 14: 39.17 digər insanların oxşar boncuk hərəkətinə baxarkən gördükləri
00:14:43.27 təmizlənmiş şəbəkələrdə
00: 14: 46.24, aktin zülalından bərpa olunur
00:14:50.09 və aktin meydana gətirən filamentlər.
00:14:52.01 Beləliklə, aktin bu gözəl filamentli şəbəkələri əmələ gətirir.
00: 14: 54.19 Və oraya hissəciklər qoysanız, həqiqətən eyni tipli bir şey gördünüz,
00: 14: 58.04 burada hissəciklər böyükdürsə müqayisə olunur
00:15:02.05 filamentlər arasındakı orta məsafəyə,
00: 15: 05.15 sonra hərəkət çox məhdudlaşdırılır
00: 15: 07.11 - burada bunun qara rəngdə olduğunu görə bilərsiniz.
00: 15: 09.23 altındakı bu qara əyri -
00: 15: 11.17 və əgər hissəciklər daha kiçikdirsə
00: 15: 14.03, şəbəkənin orta mesh ölçüsündən,
00: 15: 16.09 onda diffuz hərəkətə bənzəyən bir şeyiniz var,
00: 15: 18.22 bu yuxarı əyridə görə biləcəyiniz kimi.
00: 15: 23.05 Bu məlumatlarda da fasilələri görürük
00:15:25.23 müxtəlif ştatlar arasında atlama.
00:15:27.24 Beləliklə, merak etməyə başladıq, yaxşı,
00:15:30.11 bəlkə də aktin kimi bir sitoskeletal şəbəkə var
00: 15: 34.14 nüvənin içərisindədir.
00: 15: 36.04 Və bu bir az təəccüblü olardı,
00: 15: 38.29 çünki aktin sitoplazmada yaxşı tanınır
00:15:41.05 lakin adətən nüvənin daxilində struktur olaraq o qədər də vacib hesab edilmir.
00:15:45.21 Beləliklə, biz bununla maraqlanmağa başladıq.
00: 15: 47.28 Bu muncuqların hərəkəti mümkündürmü?
00: 15: 49.19 bir növ şəbəkə ilə məhdudlaşır
00:15:53.14 -- bəlkə də bu nüvə aktin şəbəkəsidir --
00:15:56.08 bunun daxilində. bu nüvə daxilində?
00: 15: 58.15 Beləliklə, şəkil,
00:16:01.02 kiçik muncuqların bir növ hərəkət edə bilməsi olardı
00: 16: 04.02 arası, lakin böyük boncuklar bir növ bu şəbəkənin içərisində tələyə düşür.
00: 16: 07.05 Beləliklə, bu fikri sınamağa çalışdıq.
00: 16: 09.24 Və əsas təcrübə o vaxt idi ki,
00: 16: 12.18 yaxşı, aktin şəbəkəsini qurmağa çalışaq
00:16:15.12 və bu muncuqların hərəkətinə baxın.
00: 16: 17.26 Beləliklə, biz bu təcrübəni etdik,
00: 16: 20.08 və bu canlı bir tamaşaçı olsaydı, tamaşaçılardan soruşa bilərəm:
00: 16: 23.14 nə gözlədiyinizi bilirsiniz.
00:16:25.28 Beləliklə, nə gözləyirsiniz? Bir anlıq düşünə bilərsiniz.
00: 16: 29.04 Son bir neçə slaydı dinləmisinizsə,
00:16:31.01 onda siz deyərdiniz ki, diffuz göstərici
Sadə bir yayılma varsa 00: 16: 33.16 1 olmalıdır.
00: 16: 35.22 Beləliklə, əgər bir aktin şəbəkəsidirsə
00: 16: 37.27 və aktin şəbəkəsini qurmalıydım.
00: 16: 40.07 sonra bu əyri əsasən hamısı 1 -ə yüksəlməlidir.
00:16:43.02 Bütün bu nöqtələr 1-in diffuziv eksponenti ətrafında olmalıdır.
00: 16: 46.06 Beləliklə, biz bu təcrübəni etdik.
00:16:49.09 Görünür, poza biləcəyimiz bir sıra yollar var
00:16:52.20 bir aktin şəbəkəsi və biz onların hamısını sınadıq.
00: 16: 55.23 Və çox ardıcıl gördüklərimiz bütün hallarda idi
00: 17: 00.03 muncuq hərəkəti indi yayıcı bir üslunu nümayiş etdirdi
00: 17: 03.16 bu sadə yayılma ilə uyğun idi
00:17:06.03 hər hansı bir elastik məhdudiyyət olmadıqda.
00: 17: 09.18 Beləliklə, bütün boncuklar, indi,
00: 17: 10.21 bu nüvə daxilində sərbəst şəkildə ətrafa yayılmağı bacardılar.
00: 17: 14.22 Beləliklə, nüvə aktin şəbəkəsi var kimi görünür
00: 17: 19.07 bu nüvədə bir iskele meydana gətirir.
00:17:22.27 İndi bunların hamısı mexanika və quruluşu öyrənmək üçün idi
00:17:27.19 bu zond hissəciklərindən istifadə etməklə.
00:17:29.15 Bu nöqtədə əsl əsas sual,
00: 17: 31.08 Bəs gömülü RNT-zülal damlaları haqqında nə demək olar?
00:17:34.09 Bəs bu nüvə kondensatları?
00: 17: 39.16 bu aktin şəbəkəsinin içində oturanlar?
00:17:41.15 Yeri gəlmişkən, bu, sizə şəbəkənin gözəl vizualını verən bir şəkildir.
00:17:43.21 Deyə bilərsiniz ki, bəli, niyə biz o şəklə baxmadıq
İlk növbədə 00: 17: 45.29?
00: 17: 47.19 Bunun səbəbi bəzi mübahisələrin olmasıdır
00:17:49.23 İnsan bunu necə təsəvvür edir,
00:17:52.03 və bu şəbəkənin həqiqətən nümayəndəsidir.
00:17:55.29 Amma bu. Şəbəkə belə görünür,
00: 17: 58.11 və bu sizə göstərdiyim bütün məlumatlara uyğundur.
00: 18: 00.21 Beləliklə, bizdə bu damlalar, bu nukleollar,
00:18:03.01 bu şəbəkədə oturan qırmızı damlalar,
00: 18: 07.06 və. Sən bilirsən.
00:18:10.29 və görünür, şəbəkə daxilində məhduddur.
00: 18: 13.21 Beləliklə, o zaman aldığımız sual,
00:18:16.07 yaxşı, bu strukturlara nə olur
00:18:18.23 aktini pozduğumuz zaman?
00:18:20.27 Beləliklə, nüvələrə nə olur?
00:18:22.28 Beləliklə, pozduğumuz bir təcrübə etdik
00: 18: 27.05 bu aktin şəbəkəsi və sonra boncuklara baxmadı,
00:18:29.27 amma indi burada yaşıl rənglə işarələnmiş nüvələrdə.
00:18:32.03 Və olduqca diqqətəlayiq hesab etdiyim bir şey oldu,
00: 18: 34.17 ki, bizik. həqiqətən heyran olduğumuzu.
00: 18: 36.12 Beləliklə, biz tez -tez bu nümunələrə baxırdıq
00:18:38.26 mikroskopda,
00:18:40.26 aşağı baxdığımız və aşağı baxan filmləri göstərdiyimiz yer.
00: 18: 44.20 Kamera belə bir təyyarədən çıxır.
00: 18: 48.05 Ancaq qərara gəldik ki, kənardan baxaq,
00: 18: 50.06 buna görə də bu görüntüləri yığa bildik
00: 18: 53.04 və yan tərəfdən baxın.
00: 18: 55.10 Budur, baxdığınız film.
00:18:57.02 baş verənlərdən yan tərəfdən
00:18:59.07 bu aktin şəbəkəsini pozduğumuzda.
00:19:01.04 Mən sizə bunun olduqca diqqətəlayiq olduğunu göstərəcəyəm.
00:19:03.15 Baş verənlər bu nüvənin içindəki nüvələrdir
00: 19: 08.03 hamısı nüvənin dibinə çökür,
00: 19: 10.13 Göründüyü kimi cazibə qüvvələri altında çöküntü.
00: 19: 15.02 Deməli, bu, həqiqətən də təəccüblüdür və maraqlıdır.
00: 19: 17.29 çünki biz ümumiyyətlə cazibə qüvvəsini laqeyd hesab edirik
00: 19: 20.18 canlı hüceyrələrdə.
00: 19: 22.23 Ancaq bu vəziyyətdə, yəqin ki, bu doğru deyil.
00: 19: 25.05 Deməli, aktin şəbəkəsi bu nukleolları yerində saxlayır,
00: 19: 30.03 və ondan qurtulduğumuzda hamısı dibə çökür.
00:19:32.19 Beləliklə, bu, bizim üçün həqiqətən təəccüblü idi.
00: 19: 34.22 Eləcə də. həm də maraqlıdır.
00: 19: 39.11. sistemin kifayət qədər uzun müddət dayanmasına icazə versəniz,
00:19:42.12 Bu nüvələr, dibinə çökdükdə,
00: 19: 44.27 hamısı mənim etdiyim şeyə birləşirlər.
00: 19: 48.00 dünyanın ən böyük nüvəsi ola bilər.
00: 19: 50.21 Bu quruluş indi bilirsiniz,
00: 19: 54.11 Çapı 100+ mikron.
00:19:57.12 Bir çox fərdi hüceyrələrdən daha böyükdür.
00: 20: 00.03 Beləliklə, bütün nüvə damlaları dibində birləşdi
00:20:03.14 aktin şəbəkəsini pozduqda.
00:20:05.27 Beləliklə, cazibə niyə vacibdir?
00: 20: 09.03 Bilirsiniz, niyə biz ümumiyyətlə hüceyrələrdəki cazibə qüvvəsinə məhəl qoymuruq,
00:20:11.21 amma bu halda vacib görünür?
00: 20: 14.22 Beləliklə, bunun fizikası ortaya çıxdı
00: 20: 18.09 həqiqətən maraqlıdır.
00:20:20.01 Beləliklə, qravitasiya uzunluğu şkalası deyilən bir şey var.
00: 20: 22.05 Fərqli adlarla gedir
00:20:25.00 Bəzi insanlar qravitasiya Peklet nömrəsi kimi istinad edirlər.
00:20:27.21 Cazibə qüvvəsi ilə təsadüfi istilik dalğalanmaları arasındakı rəqabəti əks etdirir
00: 20: 30.20 istəyənlər. bu hissəciklərin mövqelərini təsadüfi etmək istəyirlər.
00:20:35.27 Bu entropik təsirdir,
00: 20: 38.14 ilk mühazirədən xatırlayacağınız,
00: 20: 40.08 burada entropiya.
00: 20: 42.13 bilirsiniz, bu istilik enerjisi miqyası, kT,
00:20:46.08 əsasən ətrafdakı hər şeyi təpikləyir və yaxşı qarışdırılmasını istəyir.
00: 20: 48.15 Deməli, bu, havaya uçacaq hissəciklərə sahib olmağa meyllidir
00: 20: 50.15 və bərabər paylayın.
00: 20: 52.23 Ancaq cazibə qüvvəsi, bu hissəciklərin hər birinin kütləsi varsa,
00:20:54.28 hissəcikləri səthə çəkmək istəyir.
00: 20: 57.15 Deməli, bu iki effekt arasında rəqabət var,
00: 21: 01.02 və buna səbəb olur.
00: 21: 03.15 l-cazibə qüvvəsi dediyim şey,
00: 21: 06.10 qravitasiya uzunluq şkalası.
00: 21: 08.02 Beləliklə, kT bir enerji miqyasıdır
00:21:10.12 enerji vahidlərinə malikdir.
00: 21: 12.21 Və mg, çəkisi cazibə sürətindən qat qat
00: 21: 15.08 bu bir qüvvədir.
00: 21: 16.25 Beləliklə, bir qüvvəyə bölünən bir enerji uzunluq cədvəlidir.
00:21:20.07 Beləliklə, bu uzunluq şkalası əsasən uzunluq şkalasıdır
00:21:22.19 konsentrasiya profili azalır
00: 21: 26.25 yüksəldikcə yüksəlir.
00: 21: 29.06 İndi təsvir etdiyim fizikanı
00:21:33.09 atmosfer məhz buna görədir
00: 21: 36.14 yüksək yüksəklikdə incələyir.
00: 21: 38.01 Beləliklə, bilirsiniz, əgər biri aktivdirsə
00: 21: 41.27 Bir binanın 3., 4. və ya 25 -ci mərtəbəsi,
00:21:45.00 Siz adətən atmosferin daha incə olduğunu hiss etmirsiniz.
00:21:47.12 Beləliklə, niyə belədir?
00: 21: 49.20 Yaxşı, buna görədir. Bilirsən, düşünsəm,
00:21:52.03 əgər mən bir evin 2-ci mərtəbəsindəyəmsə və ya bilirsiniz, hətta hündür bir binada olsam,
00:21:55.10 bunun ölçüsü. həmin binanın hündürlüyü
00: 21: 57.29, bu cazibə uzunluğu uzunluğundan daha kiçikdir
00: 22: 00.01 oksigen kimi bir şey üçün.
00:22:02.06 Beləliklə, mən oksigen kütləsini yerləşdirə bildim
00: 22: 04.06 və digər şeylər. bilirsiniz, otaq temperaturu və s.
00: 22: 07.29 və bir mil artı kimi bir şey olan bir cazibə uzunluğu ölçüsü alacağam.
00: 22: 11.05 Beləliklə, atmosferi hiss etmirəm
00: 22: 14.10 Yüksək yüksəklikdə incəlmə.
00: 22: 16.06 Ancaq hündür bir dağa dırmaşsam fərq edərəm
00: 22: 18.25 və ya, məsələn, Boliviyanın La Paz şəhərinə uçun.
00: 22: 22.01 Atmosferin daha incə olduğunu görəcəksiniz.
00:22:25.21 və bunun səbəbi indi başlayırıq
00:22:28.19 potensial olaraq yaxınlaşmaq və ya hətta keçmək,
00: 22: 30.25 bu uzunluq şkalası.
00: 22: 32.17 Deməli, eyni fizika, diqqətəlayiq şəkildə,
00: 22: 34.29 bu hüceyrələr içərisində oynayır və aktualdır.
00: 22: 39.13 Beləliklə, düşünürük ki, ümumiyyətlə hüceyrələrdəki cazibə qüvvəsinə məhəl qoymuruq
00: 22: 42.17 çünki fikir hüceyrələrin olmasıdır.
00:22:45.01 ümumiyyətlə, bu cazibə uzunluğu şkalasından kiçikdir
00:22:47.01 nəzərdən keçirəcəyimiz hər hansı struktur üçün.
00: 22: 49.21 Bu tənlikdə edəcəyimiz tək dəyişiklik
00: 22: 51.19 kütlənin yerinə bir üzmə qoyduq.
00: 22: 53.26 qalın bir kütlədir, buna görə də bəzi həcm sıxlıq fərqindən qat qat çoxdur.
00: 22: 56.25. bu çox böyük qurbağa oositləri,
00: 23: 01.26 Baş verən kimi görünən şey hüceyrənin bu qədər böyük olmasıdır
00: 23: 05.11 indi bu cazibə uzunluğu miqyasını aşıb
Bu quruluşlar üçün 00: 23: 08.26,
00: 23: 10.18 və indi cazibə qüvvəsi həqiqətən vacib olur.
00: 23: 12.07 Bunu faktiki olaraq saya bilərik
00: 23: 15.22 və etdiyimiz bütün ölçülərlə birlikdə
00:23:17.12 cazibə uzunluğu şkalalarını təyin edə bilərik
00: 23: 21.01 və bütün bunları anlayın və bunun üçün dövlət diaqramı adlandıracağım şeyi qurun.
00: 23: 24.07 Və bunu göstərənlər böyük hüceyrələr üçündür
00:23:27.22 -- burada, biz onu müvafiq bölmənin funksiyası kimi tərtib edirik,
00: 23: 31.21 nüvədir, ancaq onu hüceyrələrin funksiyası olaraq da qoya bilərik -
00: 23: 35.17 cazibə qüvvəsi vacib olmağa başlayır
00: 23: 38.16 böyüdükcə və böyüdükcə.
00:23:40.19 Beləliklə, bu, məncə, həqiqətən maraqlı bir sistemdir,
00: 23: 43.21 və burada əyləncəli bir fizikanın olduğu bir yer,
00:23:47.14 bu gözlənilməz idi
00: 23: 50.17, bu müşahidələri etməyə başlayana qədər
00: 23: 53.17 və bu kəşf.
00:23:56.09 İndi icazə verin dişliləri bir az dəyişdirim
00: 23: 59.04 və sizə başqa maraqlı müşahidələr haqqında məlumat verərəm
00:24:02.02 Bu sistemdə hazırladığımız.
00: 24: 06.01 İndi aspirant Marina Feric,
00:24:09.02 daha əvvəl qeyd etdiyim.
00:24:10.17 Aktin şəbəkəsini pozduğu bu təcrübələr zamanı
00:24:13.01 və nüvələrin bir-biri ilə necə birləşdiyinə baxaraq,
00: 24: 17.06 bilirsiniz ki, bu cür dünya rekordu ölçüsündə bir nüvə əmələ gətirir,
00: 24: 21.12 diqqət çəkdiyi şey, nukleolların çox maraqlı bir şəkildə bir araya gəlməsidir.
00:24:27.09 etiketləməyə başlasaq. floresan etiket
00:24:30.22 nüvənin müxtəlif alt hissələri.
00: 24: 34.02 Deməli, bu sizə göstərəcəyim bir filmdir
00: 24: 37.06 burada bir zülal dəstini yaşıl rənglə etiketlədik
00: 24: 39.03 - bu protein fibrillarin,
00: 24: 41.07, nüvənin daxili nüvəsi ilə əlaqəli bir zülaldır -
00:24:43.29 və başqa bir zülal dəsti.
00:24:47.03 Mən burada nükleofosmin etiketləyirəm,
00: 24: 49.23, nukleolar zülalların bu xarici təbəqəsi ilə əlaqələndirilir.
00:24:53.29 Marinanın diqqəti odur ki, aktin şəbəkəsini pozduqda
00: 24: 58.17 və bu nukleolların hamısının bir -biri ilə birləşməsinə imkan verir,
00:25:00.17 onlar həqiqətən getdikcə böyüyən damcılar əmələ gətirirlər.
00: 25: 03.10 ancaq nüvələr də
00:25:08.23 Nükleolun içərisində fibrilyarla zəngin olan bu nüvə,
00: 25: 10.22 də bir -biri ilə birləşir.
00:25:13.27 Beləliklə, sanki bir maye içərisində maye var.
00: 25: 16.09 Və bu görüntülərdə daha yaxşı olduğunu görə bilərsiniz.
00:25:19.03 Bunlar daha yüksək keyfiyyətli şəkillərdir.
00:25:22.14 Biz onları tərk etdikdən sonra hüceyrə daxilində birləşirlər.
00:25:25.29 Həqiqətən də fibrillarinlə zəngin zülalların olduğunu hiss edirsiniz
00: 25: 30.09, bir nüvəni, nukleofosminlə zəngin xarici mayenin içərisində bir maye meydana gətirir.
00: 25: 36.10 Beləliklə, bu, həqiqətən maraqlı bir fikirdir.
00: 25: 39.23 və bunun nə demək olduğunu düşünməyə başladıq
00: 25: 41.25 və bunu necə başa düşmək olar
00:25:45.13 molekulyar biofiziki perspektivdən.
00: 25: 46.29 İndi etdiyimiz başqa işlər.
00: 25: 51.24 göstərə bildik ki, fibrillarin qəbul edərkən
00: 25: 55.09 bu əsas əlaqəli zülal və onu təmizləyin,
00: 25: 57.27 fazası bu gözəl maye damcılarına ayrılır.
00: 26: 00.21 Və bu o qədər də təəccüblü olmaya bilər
00:26:03.00 son mühazirədə sizə dediklərimə əsasən,
00:26:04.25 Çünki fibrillarin əhəmiyyətli dərəcədə uzanır.
00:26:11.03 konformasiya heterojendir. bu daxili nizamsız bölgələr,
00: 26: 15.01 həqiqətən faza ayrılığına səbəb olduğunu düşünürük.
00: 26: 17.09 Beləliklə, bu gözəl maye damcılarını meydana gətirdiyini göstərdik.
00: 26: 19.07 Bəs digər zülallar?
00:26:21.15 Beləliklə, bu iş üçün əməkdaşlıq etdik
00: 26: 23.23 Richard Kriwacki və Diana Mitrea ilə St.Jude,
00: 26: 26.23 in vitro nukleofosminlə işləyən,
00:26:30.09 təmizlənmiş sistemlə.
00:26:32.04 Onlar nukleofosmin fazasının ayrıldığını göstərdilər
00:26:34.14 in vitro bu gözəl maye damcılarına.
00:26:36.06 Beləliklə, dedik ki, hey, edək
00: 26: 39.02 sadə və aydın bir təcrübə nədir,
00: 26: 41.09 və bu iki nümunəni götürün və qarışdırın
00: 26: 44.10 və nə olduğunu soruş.
00:26:46.11 Və biz bunu etdikdə, çox diqqətəlayiq şəkildə düşünürəm ki,
00:26:48.23 Tapdıqlarımız fibrilyarla zəngin damcıların olmasıdır
00: 26: 50.26 və nukleofosminlə zəngin damlalar
00: 26: 53.04 bir -biri ilə nisbətən qarışıq deyil -
00: 26: 54.28 bir -biri ilə qarışmır.
00:26:56.23 Bunun əvəzinə biz bunu alırıq.
00:26:58.25 Üç fazalı sistem adlandırdığım şey.
00:27:00.13 Bir var. qaranlıq bölgə burada
00: 27: 02.22, aşağı konsentrasiya mərhələsi olardı.
00:27:04.15 bir az nükleofosmin və bir az fibrillarin var.
00: 27: 06.00 Buradakı yaşıl nöqtələr
00:27:08.14 fibrillarinlə zəngin maye fazadır,
00: 27: 11.08 və qırmızı və ya bir növ narıncı rəngli xarici faza
00: 27: 14.02, nukleofosminlə zəngin bir fazadır.
00: 27: 17.05 Deməli, bu, həqiqətən, məncə olduqca diqqətəlayiqdir.
00: 27: 19.27 və bir neçə səbəbdən diqqət çəkir.
00: 27: 21.14 Onlardan biri də bu təmizlənmiş protein sisteminin olmasıdır
00: 27: 25.03 mahiyyətcə tamamilə təkrarlanır
00: 27: 28.02 bu strukturların in vivo təşkilatı.
00:27:32.22 Beləliklə, in vivo olaraq xatırlayın ki, fibrillarinlə zəngin maye kimi damcılarımız var.
00:27:37.18 nukleofosminlə zəngin xarici təbəqədə,
00: 27: 41.07 və tam olaraq in vitro təmizlənmiş sistem budur
00: 27: 43.20 kimi görünür.
00: 27: 45.11 Beləliklə, bunun olduğunu düşündük. bu olduqca inanılmazdı.
00:27:47.09 Az sayda zülalın çox sadə sistemi ilə
00: 27: 51.10 və RNT komponentləri,
00: 27: 53.20 bu əsas qabıq arxitekturasını təkrarlaya bildik
00: 27: 56.07 nüvənin.
00: 27: 59.29 İndi, maye qarışmazlığı fikri
00: 28: 03.21 - bir -birinə qarışmayan çoxlu maye fazaları var
00: 28: 06.15 və ya qarışdırılmayan maye fazaları-
00: 28: 08.18 özü kimya mühəndisliyində yaxşı bilinən bir şeydir
00: 28: 12.05 və fiziki kimya və yumşaq maddə icmaları.
00: 28: 15.15 Bu, bir -birinə qarışmayan mayelərin bir nümunəsidir
00: 28: 19.00 -da yarana bilər. -dən formalaşa bilər
00:28:22.03 Cansız üzvi həlledicilər, su və yağlar,
00: 28: 24.18 bunları haradan əldə edə bilərsiniz
00:28:28.05 bir-birinə qarışmayan.
00:28:31.04 Beləliklə, faza ayrılması ola bilər, onda,
00: 28: 33.11 yalnız iki mərhələni deyil, əslində bir çox mərhələni meydana gətirmək,
00: 28: 39.15 və bu mərhələlərin qarşılıqlı əlaqəsi olduqca maraqlıdır
00: 28: 41.14 və zəngin bir fizika dəsti
00:28:43.26 bu hələ tam başa düşülməmişdir.
00: 28: 46.23 Bu təcrübələri edərkən soruşduğumuz suallardan biri də,
00: 28: 49.12 niyə fibrillarin damlaları içəridə olardı?
00:28:51.19 Yəni, başqa sözlə,
00: 28: 53.23 niyə içindəki yaşıl qırmızıdır?
00:28:55.16 Məsələn, yaşılın içərisində niyə qırmızı deyil?
00: 28: 58.12 Belə olardı. göründüyü qədər etibarlı olardı.
00:29:03.11 Qarışmazlığınız olardı
00:29:05.19 onlar bir-birinə qarışmırlar.
00: 29: 07.29 Biologiya baxımından,
00: 29: 10.14 yəqin ki, problem olardı,
00: 29: 13.19 çünki fibrillarin ilə əlaqəli olan proseslər
00: 29: 16.25 və fibrillarin sıxlığı. Qatılaşdırılmış vəziyyət əvvəlcə baş verir,
00: 29: 21.26 və fikir bu RNT transkriptlərinin olmasıdır
00: 29: 24.17 ardıcıl olaraq içəridən xaricə işlənir.
00:29:27.16 Beləliklə, əgər sifariş düzgün deyilsə, bu, yəqin ki, səbəb olacaq
00:29:31.27 biologiya üçün problemlər.
00: 29: 34.11 Bəs niyə fibrillarin bilir
00: 29: 37.06 içəridə olması lazım olduğu
00:29:39.03 və nukleofosmin və bu komponentlər
00:29:41.17 onların xaricdə olması lazım olduğunu bilirsinizmi?
00: 29: 43.25 Yaxşı olar ki, bu suala cavab verməyin açarıdır
00:29:45.28 səth gərginliyindən gəlir.
00:29:47.28 Beləliklə, adından göründüyü kimi,
00: 29: 50.23 Səth gərginliyi səthlərlə əlaqəli bir növ gərginlikdir
00: 29: 54.26 və ya iki fərqli faza növü arasındakı interfeyslər.
00:29:56.29 Xüsusilə, bu, həqiqətən.
00:29:59.10 bu, interfeysin olması ilə əlaqəli enerji xərcidir,
00: 30: 02.05 və vahid sahəyə görə enerji vahidləri var.
00: 30: 07.02 Bunu sadə bir şəkildə düşünə bilərsiniz.
00:30:09.14 faktı əks etdirən sadə sxem
00:30:14.23 Kütləvi faza daxilində molekullar bir növ yaşayırlar
00:30:17.06 ilə əhatə olunmuş homojen bir mühit.
00: 30: 20.20, bildiyiniz kimi, müəyyən bir molekul dəsti,
00:30:25.21 lakin interfeysdə belə bir şey var.
00:30:27.18 bilirsiniz, bir tərəfdən onlar homojen mərhələni görürlər
00: 30: 29.27 digər tərəfdən, bu xarici mühiti görürlər.
00:30:32.14 Və bu, enerji xərclərini təyin edir.
00: 30: 35.10 Səth gərginliyinin təzahürü
00: 30: 38.22 hamımızın tanış olduğu bir şeydir
00: 30: 41.03 suda gəzən böcəklər kimi şeylərə baxaraq
00: 30: 43.28 və ya bəzi hallarda edə biləcəyimiz fakt
00: 30: 46.06 əslində su üzərində üzmək üçün kağız klipləri alın
00: 30: 49.04 bu səth gərginliyi təsirlərindən ötəri,
00:30:51.15 və ya avtomobilinizi yuyub maşına bir az mum qoysanız,
00: 30: 55.11 məsələn, sonra baxın,
00:30:58.19 su damcıları həmin səthdə möhürlənirdi.
00: 31: 01.01 Bunlar hamısı səthi gərginlik effektləridir -
00:31:03.06 müxtəlif fazalar arasındakı interfeyslərin enerjisi.
00: 31: 06.05 Və səthin gərginliyi ortaya çıxdı
00: 31: 08.17, həqiqətən də strukturlaşdırmada açar olduğu bilinir
00: 31: 13.13 çox fazalı mayelər.
00:31:15.00 Beləliklə, xüsusilə çox fazalı sistemlər üçün
00: 31: 18.11 cansız maddədən,
00:31:20.03 biz bilirik ki, bu cür əsas qabıq təşkilatına sahib olmaq lazımdır
00:31:25.17 üç fazalı sistemin,
00: 31: 27.22 faza 3 arasındakı səth gərginliyi,
00:31:29.27 bu yaşıl faza,
00: 31: 32.05 və mərhələ 1, qara mərhələ,
00:31:34.21 böyük olmalıdır. Beləliklə, əgər bu səthi gərginlik,
00:31:36.15 bu interfeyslə əlaqəli enerji çox böyükdür,
00:31:39.21 sonra sistem enerjini minimuma endirə bilər
00: 31: 43.15 bu interfeysi uzaqlaşdıraraq -
00:31:45.15 başqa sözlə, qırmızı fazada yaşıl fazaya sahib olmaqla.
00:31:49.17 Və sonra artıq 1 və 3 arasında heç bir interfeys yoxdur.
00: 31: 53.08 Çox sadə bir təcrübə edə bilərsiniz.
00:31:56.24 Beləliklə, Marina həqiqətən bu sadə təcrübəni etdi
00:31:58.25 mətbəxinizdə edə bilərsiniz
00: 32: 01.06 su, Crisco yağı və silikon yağı alaraq
00: 32: 03.25 və su-silikon yağ interfeysi olduğu üçün bunu göstərir.
00:32:06.28 gərginlik. səth gərginliyi böyükdür,
00: 32: 09.24 su ilə Crisco yağı arasındakıdan daha böyükdür,
00:32:12.18 qırmızı şeylər,
00:32:14.25 daha sonra silikon yağı Crisco yağının içərisinə yerləşdirilir.
00: 32: 18.05 Beləliklə, əsas qabıq arxitekturasının,
00:32:21.27 nüvədə gördüyümüz əsas qabıq quruluşu,
00: 32: 24.26 bu fərqli səth gərginliklərini əks etdirir.
00:32:27.24 Bu fikri sınamağa çalışmaq üçün,
00: 32: 31.07 bu mayeləri meydana gətirən təmizlənmiş zülalları götürdük
00: 32: 33.10 və səthlərlə necə qarşılıqlı əlaqədə olduqlarını soruşdular
00:32:36.06 müxtəlif hidrofobiklik?,
00: 32: 38.00 nisbi gücü anlamağa çalışa bilərik
00:32:41.02 qarşılıqlı əlaqəsi,
00: 32: 45.22 Su ilə neftin qarşılıqlı təsirinin əlverişliliyi.
00:32:49.04 Beləliklə, biz nisbətən hidrofobik bir səth aldıq --
00: 32: 51.21 bura güclü hidrofob səth deyil, nisbətən hidrofobdur
00: 32: 52.19 - və yan tərəfdən baxdıq,
00: 32: 56.00 yenə bir tərəfdən görmə qabiliyyəti,
00: 32: 58.00, bu damlaların səthlə necə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu.
00:33:00.10 Tapdığımız şey nükleofosmin damcılarının olmasıdır
00:33:03.20 su kimi davranmağa meyllidir,
00: 33: 08.10 nisbətən hidrofob səthlərə yapışmağa meyllidirlər.
00: 33: 10.27 Fibrillarinlə zəngin olan damcılar daha yaxşı nəmlənməyə meyllidir
00: 33: 14.14 bu hidrofob səthlər,
00: 33: 16.26 və bunların hamısı fikrə uyğundur
00: 33: 18.26 ki, fibrillarin arasındakı səth gərginliyi,
00: 33: 21.02 yaşıl əşyalar,
00: 33: 23.12 və su nukleofosmin arasındakıdan daha böyükdür,
00: 33: 26.05 qırmızı şeylər və su.
00: 33: 29.01 Və buna görə də yaşıl damlalar qırmızıya daxil edilir,
00: 33: 34.00, bu sxemdə gördüyünüz kimi.
00: 33: 36.02 Beləliklə, bu səth gərginliyi və səthi gərginlik quruluşu fikri
00:33:39.08 çox fazalı mayelərin təsiri var
00:33:42.23 Mən nüvədən daha çox düşünürəm,
00: 33: 44.26 hansı sistemdir, bilirsiniz,
00: 33: 46.22 Bu fikirləri aydınlaşdırmaq üçün araşdırdıq.
00: 33: 48.25 Xüsusilə, əgər interfeys
00: 33: 52.00 və iki fərqli faz arasındakı səth gərginliyi.
00: 33: 55.01. deyək ki, 3-cü və 2-ci mərhələlər arasında,
00:33:57.23 qırmızı və yaşıl.
00: 34: 00.03 əgər bu, həqiqətən də enerji baxımından baha başa gəlirsə -
00: 34: 02.24 başqa sözlə, hər zaman qırmızı yaşılın yanında olarsa, böyük bir enerji xərci var -
00: 34: 05.05 sonra nə olur bu iki növ maye olur
00: 34: 08.05 heç vaxt qarşılıqlı olmayacaq.
00:34:11.06 Onlar heç bir-birlərinə toxunmayacaqlar.
00: 34: 12.28 Və buna görə də, ehtimal ki, hüceyrələrdəki bir çox kondensat
00: 34: 16.11 əslində heç bir əlaqəyə girmir.
00: 34: 17.16 Bir -birinə yapışmır, bir -birini islatmır.
00: 34: 19.28 bir -birini qucaqlamamaq və s.
00: 34: 21.23 Digər hallarda, qismən nəmlənmə ola bilər,
00: 34: 25.06, səth gərginliyi təxminən eyni böyüklükdədir,
00:34:30.01 və sonra damcılarınız ola bilər
00: 34: 32.08 bir -birini tam əhatə etməyən,
00: 34: 34.08, amma qarşılıqlı əlaqə qururlar,
00:34:36.25 və bu kimi görünən morfologiyalarınız ola bilər.
00: 34: 38.14 Bunun vacib olduğunu düşünürük, çünki
00: 34: 41.02 Hüceyrədə çoxlu quruluş var
00: 34: 43.13, bu kondensatlar arasında qismən qarşılıqlı əlaqə olduqda,
00:34:46.07 məsələn, Joe Gall-dan bu gözəl mikroqrafiyada
00: 34: 49.08 Cajal cəsədlərini və Snurposomları və qismən nəmləndirməni göstərir
00:34:51.29 -- bu cür yaxşı müəyyən edilmiş təmas bucaqları və s. --
00: 34: 56.00, bu damlalar arasındakı səth gərginliyini ölçmək üçün istifadə etməyə başlaya bilərsiniz.
00: 35: 01.17 və damcılar ilə ətrafdakı nukleoplazma arasında.
00:35:06.22 Beləliklə, bu söhbətdə sizə bəzi həyəcanları çatdırmağa çalışdım
00: 35: 10.14 nükleol haqqında və daha ümumilikdə
00:35:13.11 biomolekulyar maddənin bu qatılaşdırılmış hallarının olması fikri
00: 35: 17.20 nüvədə vacibdir.
00:35:20.28 Nükleolus bu strukturların yalnız bir növüdür.
00:35:24.15 Biz buna çox diqqət yetirdik
00:35:27.13 çünki o, nüvə cisimlərinin ən böyüyüdür,
00: 35: 30.00 amma nüvənin içərisində həqiqətən də onlarla fərqli növ var.
00: 35: 36.25 Və əslində nüvənin ehtimal olduğunu düşünürük
00:35:38.28 faza ayrılması növünün hipertrofik nümunəsidir
00: 35: 45.01 və meydana gələn kondensatların genoma təsir etmə üsulu,
00:35:47.10 və potensial olaraq həqiqətən mühüm rol oynayır
00:35:49.27 genetik məlumat axınında.
00:35:52.07 Bu kondensat haqqında bir şey kimi düşünə bilərik
00: 35: 55.21 bunun üzərindəki suyun yoğuşmasını sevir.
00:35:58.22 hörümçək torunu deformasiya edə bilən bu hörümçək torunda.
00: 36: 04.14 və əslində bir şəkildə yenidən qurun.
00: 36: 06.11 Və beləliklə, həll etməyə başladığımız suallar bunlardır,
00: 36: 09.00 və bu sahədə çox həyəcan var
00:36:12.00 irəliləyən bu ideyalar haqqında düşünmək.
00: 36: 14.22 Beləliklə, maye kondensatları genom memarlığına və fəaliyyətinə necə təsir edir?
00: 36: 19.00 Beləliklə, necə əsas rol oynaya bilərlər
00: 36: 21.18 genlərin ifadəsini tənzimləyir
00: 36: 23.15 hansı orqanizmin xüsusiyyətlərinə səbəb olur?
00:36:26.16 Bilirsiniz, saç rəngi və göz rəngi, boy, çəki,
00:36:30.27 qolların, ayaqların və ayaq barmaqlarının sayı,
00:36:33.21 və həqiqətən biologiya yaradan hər cür şeylər
00:36:38.28 o qədər maraqlıdır ki, genlərdən xüsusiyyətlərə keçə bilərik.
00: 36: 42.12 Necə. bu keçidləri edin.
00:36:44.26 beləliklə. Bilirsiniz, bu barədə çox danışdım.
00:36:46.29 son söhbətdə də. maye hallar arasında keçidlər haqqında
00: 36: 50.05 və bərk hallar,
00: 36: 52.01 bu mayelər, jellər və amiloidlər.
00:36:53.26 Biomolekulyar maddənin müxtəlif vəziyyətləri arasında keçidlər edin
00: 36: 56.27 gen tənzimlənməsində rol oynayır?
00:36:59.18 Beləliklə, bu, həqiqətən maraqlı bir sualdır.
00:37:01.17 Bu barədə çox az məlumatımız var,
00: 37: 03.05 və düşünürəm ki, bu əsas suallardan biri olacaq
00: 37: 05.11 bu sahədə irəliləyir,
00: 37: 09.26 yumşaq maddə fizikasının interfeysində, c
00:37:12.22 biologiya, genetika,
00: 37: 16.14 və ehtimal ki, bir sıra digər sahələr.
00:37:20.14 Beləliklə, hazırda çox həyəcan var,
00: 37: 22.22 və bu irəliləyişi görməkdən məmnun olarıq.
00:37:25.29 Diqqətinizə görə təşəkkür etmək istəyirəm.
00: 37: 28.07 Bəzi insanlarla işləmək çox xoş idi.
00: 37: 33.04 Keçmiş kurs tələbəsi Marina Fericdən bəhs etdim.
00: 37: 35.11 Laboratoriyada həqiqətən də çox gözəl insanlarımız var.
00: 37: 37.01 və mənimlə ünsiyyət qurmaq şanslıyam
00: 37: 39.27 bir çox həqiqətən gözəl əməkdaşlarla.
00: 37: 42.14 Bunun üçün və maliyyə üçün çox minnətdaram
00: 37: 45.09, laboratoriyamızda etdiyimiz işlərin bir hissəsini mümkün etdi.
00:37:48.10 Diqqətiniz üçün çox sağ olun.


4 Tək Hüceyrəli Genomika

Fərdi hüceyrələrin DNT sıralaması, nadir və ya becərilməyən mikrobların genomunun de novo yığılmasını, bir şişdəki hüceyrələrin 40, 41 heterojenliyini (DNT mutasiyaları) 42 və ya müalicə zamanı müqavimət əldə etməyi araşdırmaq üçün unikal imkanlar təqdim edir. 43, 44 Birincil şiş və metastatik şiş sahələri arasında genomik heterojenliyin geniş müqayisəsi metastazların əmələ gəlməsinin daha dərindən başa düşülməsinə, 43 və şiş mühitində dərman müqavimətinə səbəb olan genetik dəyişikliklərin başa düşülməsinə səbəb olmuşdur. 44 Damcı mikrofluidiklərindən istifadə etməyən, ancaq quyulardan istifadə edən tək hüceyrəli genomik analiz texnologiyaları: tək hüceyrəli retrotranspozon tutma ardıcıllığı (scRC-seq), 45 tək nüvəli ekzoma ardıcıllığı (nuc-seq/SNES) 46 və ya klapanlar: birbaşa deterministik mərhələləşdirmə ( DDP), 47 burada nəzərdən keçirilməyəcək.

Təkhüceyrəli genom analizində kritik addım piko- və ya nanoqram DNT miqdarının mikroqram miqdarında gücləndirilməsidir. Tək hüceyrəli genomik materialı gücləndirmək üçün iki strategiya ayırd edilə bilər: i) hədəf genom amplifikasiyası (yalnız hədəflənmiş fraqmentlər gücləndirilir) və ya ii) bütün genom gücləndirmə (WGA).

Hədəflənmiş genomun gücləndirilməsi standart PCR reaksiyasından istifadə edir. Layihələndirilmiş primerlər, yalnız növbəti mərhələdə gücləndirilən genoma olan maraq ardıcıllığını əhatə edən xüsusi ardıcıllıqla bağlanır. Bunun əksinə olaraq, WGA üçün istifadə olunan primerlər replikasiyaya başlamaq üçün genomun bir çox yerinə bağlanır, beləliklə, bütün DNT zəncirinin gücləndirilməsi. Bu bölmədə, tək hüceyrəli genom analizi üçün damcı mikrofluid texnologiyaları təqdim edilir və müqayisə edilir.

4.1 Hədəfli-Genom Analizi

Üç damlacıqlı mikrofluidik texnologiya tək hüceyrəli hədəflənmiş genom analizinə imkan verir: tək nüsxə genetik gücləndirmə (SCGA), agaroza əsaslı PCR və PCR-aktivləşdirilmiş hüceyrə çeşidlənməsi (PACS).

4.1.1 SCGA

Tək nüsxəli genetik gücləndirmə (SCGA) 48, boncuklu PCR aparmaq üçün vahid nanoliter damlacıqların yaranmasına əsaslanır. Şəkil 4a SCGA -nın ümumi iş axınını göstərir. Qısacası, tək hüceyrələr yağlı su damlaları ilə birlikdə kapsullanır: kovalent olaraq arxa astarlarla etiketlənmiş bir agaroz boncuk və boyalı etiketli ilkin primerlər və fermentlər olan PCR qarışığı. Sonradan damcılar çipdən kənarda toplanır, hüceyrələr parçalanır və emulsiya, boncuk səthində boya ilə etiketlənmiş iki telli məhsul yaradan bir sıra PCR termosikllərindən keçir. Damla PCR-dən sonra de-emulsifikasiya əmələ gəlir və floresan amplikonlarla örtülmüş boncuklar bərpa olunur. Hədəf DNT-nin aşkarlanması axın sitometriyası ilə tək muncuqlu flüoresans intensivliyini ölçməklə həyata keçirilir. 40% PCR səmərəliliyi ilə SCGA istifadə edərək 1139 bp-ə qədər DNT parçaları əldə edildi, yəni boncukla bağlanmış məhsullar toplu ardıcıllıq üçün şablon ola bilər. Bundan əlavə, SCGA sürətli və ucuz bir aşkarlama üsulu təşkil edir, yalnız üç yüksək məhsuldarlıq mərhələsindən ibarətdir: emulsifikasiya, PCR və axın sitometriyasından istifadə edərək boncukların flüoresan intensivliyinin aşkarlanması. SCGA-nın dezavantajı aşağı damcı generasiya tezliyidir (6 Hz-dən aşağı). Bu problemi həll etmək üçün Zeng et al. damlacıqların yüksək məhsuldarlığı üçün mikrofabrik emulsiya generatoru (MEGA) cihazı yaratdı. 49 96 kanallı MEGA cihazı 940 Hz-lik bir damcı istehsal sürətinə çatır. SCGA -nın ikinci bir dezavantajı, damcı PCR -nin (dPCR) toplu PCR ilə müqayisədə daha aşağı effektivliyə malik olmasıdır: toplu PCR ilə müqayisədə dPCR üçün 40%, lakin ekvivalent şablon və muncuq konsentrasiyası ilə. Nəhayət, SCGA həm muncuqları, həm də hüceyrələri Poisson statistikasına uyğun olaraq çox seyreltilmiş məhlullardan damlacıqlara daxil edir və bu, ko-enkapsulyasiyada aşağı effektivliyə səbəb olur: həm tək hüceyrə, həm də tək muncuq ehtiva edən 100 damcıdan 1-i.

4.1.2 Agaroza Damcısı Mikrofluidik ePCR

Yang qrupu agaroza əsaslı emulsiya PCR (ePCR) inkişaf etdirdi. 50 Şəkil 4b ümumi iş prosesini göstərir. Bir agaroza məhlulu hüceyrələr (hər damlacıqda 2, 1 və ya 0,5 hüceyrə) və PCR qarışığı ilə 540 Hz-də emulsiyalaşdırılır. SCGA -ya bənzər bir şəkildə, PCR qarışığı floresan etiketli irəli primerlər və fermentləri ehtiva edir. Ancaq bu vəziyyətdə tərs astarlar, bir boncuğa bağlanmaq əvəzinə, agarozaya kovalent şəkildə bağlanır. Emulsiyadan sonra, maraq doğuran hədəf DNT-ni gücləndirmək üçün damcılar əlavə PCR üçün toplanır. Sonradan, agaroz damlaları, agaroz matrisinə kovalent şəkildə bağlanmış flüoresan etiketli PCR amplikonları ilə bərk muncuqlara yapışdırılır. Nəhayət, muncuqlar PCR reaksiyası zamanı istifadə edilməmiş flüoresan etiketli irəli primerlərin artıqlığını çıxarmaq üçün yuyulur və sonra flüoresan mikroskopiya və ya axın sitometriyasından istifadə edərək təhlil edilir.

Agaroza damlacıqlı mikrofluidik ePCR SCGA ilə müqayisədə bir çox üstünlüklər təklif edir. Birincisi, primerlər agaroz maye fazasının bir hissəsidir və buna görə də bütün damlalarda mövcuddur, çünki SCGA-da primerlər bərk boncuklar üzərində aparılır (10 əmələ gələn damcıların %-i). Birgə kapsülləmə səmərəliliyinin artması, bütün hüceyrə populyasiyalarının xarakterizə olunmasını təmin edir və təcrübənin müddətini və xərclərini azaldır. Daha bir sadələşdirmə, primerlərlə etiketlənmiş muncuqlardan istifadə ehtiyacını aradan qaldıran agaroz damlacıqlarının istifadəsi ilə bağlıdır.

4.1.3 PACS

PCR-Aktivləşdirilmiş Hücre Sıralama (PACS), kiçik genomik bölgələrin (yüzlərlə əsas) sorğu-sualına əsaslanaraq bakteriyaların çeşidlənməsinə imkan verir. 51 PACS -in ümumi iş axını Şəkil 5a. Bakteriyalar və PCR reagentləri damcı şəklində birgə kapsullaşdırılır. Hüceyrələr parçalanır və əgər onların DNT-si maraq ardıcıllığını ehtiva edirsə, TaqMan zondu (bir reportyor boyası və yaxınlıqda söndürücü var) ona bağlanır. Taq polimerazanın ekzonükleaz aktivliyi ilə probun hidrolizi, müxbir boyasının probdan sərbəst buraxılmasına imkan verir və beləliklə söndürmə effektinin aradan qaldırılması səbəbindən floresans artır. PCR gücləndirildikdən sonra, hər dövrdə damlacıqda floresans siqnalının intensivliyi artır. Sonradan, floresan damlalar aşağı genom analizi üçün sıralanır.

4.1.4 Kommersiya inkişafı

Mission Bio, tək hüceyrəli hədəf genom analizi üçün bir platforma hazırladı və Tapestri texnologiyası olaraq kommersiya etdi. 52 Şəkil 5b iş axınını təqdim edir. Birincisi, tək hüceyrələr proteazları olan damlacıqlarda kapsullaşdırılır. Damlalarda hüceyrə parçalanmasından sonra proteazları təsirsiz hala gətirmək üçün temperatur artırılır. Sonradan, tək hüceyrələrin genomunu ehtiva edən damcılar, PCR reagentləri və barkodlaşdıran hidrojel boncukları (1: 1 nisbətində) olan ikinci bir damcı ilə elektro -kalsensiya ilə birləşir. Barkodlaşdıran hidrojel boncukları, hüceyrəyə xas olan bir barkod və genə xas primer ardıcıllığı olan oligonükleotidlərlə etiketlənmişdir. Hidrojel boncuklarının genom ehtiva edən damlacıqlarla birlikdə bağlanmasından sonra, hidrojel boncukunu etiketləyən primerlər UV təsirindən fotoşəkildə buraxılır və hədəf DNT ardıcıllığı PCR amplifikasiyası ilə hüceyrə barkodlanır. Nəhayət, emulsiya parçalanır və kitabxanalar toplu olaraq hazırlanır, sonra sıralanır. Pellegrino və başqaları. 52, fərdi kəskin miyeloid lösemi hüceyrələrinin genetik heterojenliyini təhlil etmək üçün 62 DNT hədəfindən istifadə edərək konsepsiyanı sübut edən bir təcrübə göstərdi.

4.2 Tam genom analizi

Tək hüceyrə səviyyəsində bütün genom analizi aşağıdakı səbəblərə görə çətindir: i) ayrı-ayrı hüceyrələrdən DNT-nin təcrid edilməsindəki çətinliklər, ii) bütün genomun gücləndirilməsinin (WGA) səmərəliliyi və etibarlılığı, iii) istifadə edilə bilən ardıcıllığın yoxlanılması. variantların müəyyən edilməsi üçün və iv) məlumatların təhlili və şərhi. 53

Bu bölmədə biz əvvəlcə son onilliklərdə bütün genom analizində əsas texniki problemlərdən biri olan müxtəlif tam genom gücləndirmə üsullarını təqdim edirik. Sonra damcı mikrofluidikasından istifadə edərək tək hüceyrəli tam genom analizi üçün iki tam boru kəmərini təsvir edirik: SiC-seq və CNV (10X Genomics).

4.2.1 Bütün Genom Gücləndirmə Texnikaları

DOP-PCR

Degenerativ oliqonukleotidlə astarlanmış polimeraza zəncirvari reaksiya və ya təmiz PCR əsaslı gücləndirmə (DOP-PCR) konsepsiyası 1992-ci ildə Telenius və digərləri tərəfindən təqdim edilmişdir. 54 DOP-PCR təsadüfi ardıcıllığı (dejenerativ ardıcıllıq) olan tək bir astarın istifadəsinə əsaslanır. DOP-PCR, təsadüfi primerlərin tavlanmasına imkan vermək üçün aşağı başlanğıc tavlama temperaturunda bir neçə pre-amplifikasiya dövrü ilə başlayır. Daha sonra, DNT amplikonları PCR ilə daha da gücləndirilir.

DOP-PCR iki əsas üstünlüyə malikdir: DNT-ni birdən çox lokusda gücləndirir və növdən asılı deyil. Bununla belə, DOP-PCR aşağı genom əhatəsini təmin edir, beləliklə, gücləndirmədəki hər hansı fərqlər eksponent olaraq genişlənir, nəticədə genom boyunca həddindən artıq gücləndirilmiş və zəif gücləndirilmiş bölgələr yaranır.

2001-ci ildə Dean və əməkdaşları tərəfindən hazırlanmış Çoxlu yerdəyişmə gücləndirilməsi (MDA) 55 izotermik gücləndirməyə əsaslanır. Təsadüfi hexamer primerləri şablona hibridləşdirilir, daha sonra yüksək sədaqətli ϕ29 polimeraza ilə telin yerdəyişmə DNT sintezi. MDA istifadə edərək DNA amplifikasiyası, DOP-PCR ilə müqayisədə daha yüksək genom əhatə dairəsi ilə nəticələnir. 56 Bununla belə, MDA, DOP-PCR-ə bənzər şəkildə, hüceyrədən hüceyrəyə təkrarlana bilməyən bütün genom boyunca ardıcıllıqdan asılı olan həddindən artıq gücləndirmə və ya zəif amplifikasiyaya səbəb olan eksponensial gücləndirməyə əsaslanır. Gücləndirmə meylini aradan qaldırmaq və ötürmə qabiliyyətini yaxşılaşdırmaq üçün MDA-nın müxtəlif variasiyaları hazırlanmışdır, yəni MIDAS, 57 IMS-MIDAS, 58 SNES, 46 ddMDA. 59 MDA, səmərəliliyini artırmaq üçün damcı mikro axıcılarda uğurla tətbiq edildi. 60-62 Damcılarda çoxlu yerdəyişmə gücləndirilməsi (sd-MDA) tək hüceyrələrdən əldə edilən genomlarda da nümayiş etdirildi. 63

Hibrid üsullar

Hibrid üsullar, yuxarıda göstərilən iki metodun bəzi çatışmazlıqlarını, bəzi güclü tərəflərini birləşdirərək aradan qaldırmaq niyyətindədir. Çoxlu tavlama və döngəyə əsaslanan gücləndirmə dövrləri (MALBAC) və yerdəyişmə DOP-PCR (PicoPLEX) izotermik gücləndirmə və ardınca yaradılmış amplikonların PCR gücləndirilməsini birləşdirən hibrid üsullara nümunədir. MALBAC, ardıcıllıqdan asılı meyli azaldan kvazi-xətti gücləndirməyə əsaslanır və əsas təkmilləşdirmə nüsxələrin surətlərini yaratmaq deyil, əksinə, artıq gücləndirilmiş məhsulları qorumaqla yalnız orijinal genom ardıcıllığını gücləndirməkdir. Bu, amplikonların döngəsini təşviq etmək və ikinci PCR -dən əvvəl daha da gücləndirilməsinin qarşısını almaq üçün ardıcıllığa (çapa) malik olan təsadüfi primerlərin istifadəsi ilə əldə edilir. Bunun əksinə olaraq, PicoPLEX, bir çapa ardıcıllığı əlavə etmək üçün ilk reaksiyada dejenerativ primerlərdən istifadə edir, sonra son PCR gücləndirilməsi üçün əlavə edilmiş ardıcıllıqla astarlanır. Yu və başqaları. surət sayı dəyişikliklərini müəyyən etmək üçün tək hüceyrəli MALBAC reaksiyaları üçün nəzərdə tutulmuş inteqrasiya edilmiş kameralı mikrofluidik cihaz nümayiş etdirdi. 64 Fərqli gücləndirmə metodlarının müqayisəsi başqa yerdə nəzərdən keçirilmişdir və bu araşdırmada daha ətraflı müzakirə edilməyəcəkdir. 65, 66

4.2.2 SiC-Seq

Lan et al. 67, reaksiyaların çoxunun damlacıqlar şəklində edildiyi tək hüceyrəli genom analizi üçün ilk platforma idi. SiC-seq fərdi hüceyrənin bütün DNT materialını bu hüceyrəyə xas olan barkodla etiketləyir. İş prosesi aşağıdakı addımlardan ibarətdir (Şəkil 6a): 1) barkodlaşdırma damlacıqlarının əmələ gəlməsi, 2) agaroz damlacıqlarında hüceyrə qapanması, lizis, genomik DNT-nin təmizlənməsi və hüceyrə boncuklarının jelasiyası, 3) təmizlənmiş hüceyrə boncuklarının etiketləmə reagentləri ilə yenidən kapsullanması, 4) birləşməsi PCR reagentləri və ştrix-kod damcıları olan damcı ilə etiketlənmiş genomu daşıyan damcılar, 5) ardıcıllıq və məlumatların təhlili.

İlk addımda SiC-seq barkodlama damcı kitabxanasının hazırlanmasını tələb edir. Daimi ardıcıllıqla əhatə olunmuş 15 əsaslı təsadüfi oligonükleotidlər PCR reaktivləri və primerləri ilə (barkodların sabit bölgələrinə tamamlayıcı və Illumina P7 axını hüceyrə adapterini ehtiva edən) birlikdə kapsullanır. Sonradan, bütün reagentləri olan damlacıqların miqdarı damcı rəqəmsal PCR vasitəsilə artırılır (bir neçə saat ərzində 10 milyon barkod damlası əmələ gəlir). Barkod kitabxanası hazırlandıqdan sonra tək hüceyrələr təcrid olunmalıdır. Hüceyrə süspansiyonu, birlikdə axan damcı istehsalçısı istifadə edərək, əridilmiş agaroz axını ilə birləşdirilir. Agaroz damlaları soyudularaq bərkidilir və yağdan sulu daşıyıcıya köçürülür. Aqaroz muncuqları fermentlərə, yuyucu vasitələrə və kiçik molekullara keçiricidir, lakin genomik DNT olaraq daha böyük strukturları sterik olaraq tutur və bu da onları örtülmüş hüceyrələrdə yuma addımlarının yerinə yetirilməsinə imkan verən ideal substrat halına gətirir. Sonradan hüceyrə divarı həzm olunur və bir sıra enzimatik və yuyucu müalicə (lipidlərin həll edilməsi və zülalların həzmi) aparılır. Genomik DNT ilə təmizlənmiş mikromuncuqlar, genomu parçalamaq və PCR tutacaqları kimi fəaliyyət göstərmək üçün universal ardıcıllıqları əlavə etmək üçün etiketləmə reagentləri olan damcılarla yenidən kapsullaşdırılır. Taqmentasiyadan sonra bu damcılar öz növbəsində digər iki damlacıqla birləşir: PZR reagentləri olan bir damcı və bir ştrixkod damcısı. Alınan damlalar, məhsulun gücləndirilməsinə və Illumina sıralaması üçün lazım olan P5 və P7 adapterinin bağlanmasına imkan vermək üçün termosikl olunur. Kitabxana hazırlandıqdan sonra damlalar sıralanmaq üçün bir yerə yığılır. Ardıcıllıq məlumatları keyfiyyətə görə süzülür və bütün hüceyrələr üçün genomik ardıcıllığı təmin edən barkodla qruplaşdırılır.

SiC-seq, yuxarıda təsvir edilən hədəf genomlu tək hüceyrəli analiz vasitələri ilə müqayisədə bir sıra üstünlüklərə malikdir. Birincisi, SiC-seq tək hüceyrəli genomun qərəzsiz təhlilinə imkan verir. Əlavə olaraq, bütün addımlar əl ilə işləmə addımlarını məhdudlaşdıraraq və təkrar istehsal qabiliyyətini artıraraq mikro axıcılardan istifadə etməklə həyata keçirilə bilər. Bununla birlikdə, mikro-maye manipulyasiyası, hədəflənmiş genom analiz üsulları ilə müqayisədə daha mürəkkəb və vaxt aparan bir işdir.

4.2.3 Kommersiya inkişafı

Tək Hüceyrəli Kopya Sayısı Variasiyası (CNV), tək hüceyrəli genomik heterojenliyi və klonal təkamülü yüksək məhsuldarlıqla (yüzlərlə-minlərlə hüceyrə) öyrənmək üçün bazara 10X Genomics tərəfindən təqdim edilmişdir, 68 CNV-nin iş axını Şəkil 6b-də göstərilmişdir. Birincisi, tək hüceyrələr, tək istifadə mikrofluid çipi içərisində paramaqnit hissəcikləri olan bir jel matrisində seyreltilmənin məhdudlaşdırılması ilə kapsullanır. Damcılar jelatlaşdıqdan sonra hüceyrələr muncuqların içərisində sıxılır və lizisə məruz qalır, sonra bütün nüvə zülalları çıxarılır, genomik DNT isə gel matrisində tələdə qalır. Daha sonra hüceyrə muncuqlarının içərisində təmizlənmiş genomik DNT barkod muncuqları (10X Barkodlu Gel Boncukları) və fermentlər ilə ikinci mikrofluidik cihazda birgə kapsullaşdırılır. Əhəmiyyətli odur ki, həm hüceyrə muncuqları, həm də ştrix kodlama muncuqları sıx şəkildə qablaşdırılıb və hər damlacıqda bir hüceyrə muncuqunun və bir ştrix kodlama muncuqunun yüksək effektiv birgə kapsulyasiyasına imkan verir (damcıların ≈80%-də bir hüceyrə muncuq və bir barkod muncuq var). Damlacıqdakı DNT, sıralanma və analiz üçün hazır olan tək hüceyrəli barkodlu kitabxanalar yaratmaq üçün gücləndirilir. Əhəmiyyətli olan, ayrı -ayrı hüceyrələrdən yaranan bütün DNT -lər ümumi 10X barkodu paylaşırlar.

Qeyd etmək yerinə düşər ki, Bio-Rad-in flüorlu olmayan kanalların istifadəsi ilə bağlı gətirdiyi patent iddiası bu yaxınlarda itirildiyindən, 10X Genomics cihaz dizaynını dəyişdirmək məcburiyyətində qaldı. Yeni "Next GEM çipi", damcı istehsalına diqqət yetirmək əvəzinə, addım emulsifikasiyasından istifadə edir, halbuki bunu hazırda təsdiqləyə bilmərik.


2 Damlalar və Veziküllər

Damlalar ən azı iki faza (qaz-maye və ya maye-maye) arasında bir-birinə qarışmazlıq dərəcəsi tələb olunan maye varlıqlardır və interfeysdəki molekullar arasında cəlbedici və itələyici qarşılıqlı təsirlər səthi gərginliyə səbəb ola bilər ki, bu da digərləri arasında müəyyən edir. şeylər damcı şəklindədir. Standart nümunələrə havadakı su damcıları [95], yağdakı su damcıları [5] və sudakı yağ damcıları [24] daxildir. Bundan əlavə, molekullar hidrofilik və ya hidrofobik xüsusiyyətlərindən asılı olaraq tercihen suya və ya yağ fazasına bölünə bilər. Məsələn, yağda həll olunan boyalar (məsələn, Oil Red O, Sudan Black) neft fazalarının daha yaxşı görsənməsi üçün istifadə olunur, qeyri-üzvi duzlar (məsələn, NaCl) tercihen sulu fazalarda həll olunur. Bununla birlikdə həm hidrofilik, həm də hidrofobik qrupları ehtiva edən amfifilik molekullar olan səthi aktiv maddələr faza sərhədində öz-özünə yığılır (Şəkil 1).Səthi aktiv maddələr, iki faza arasındakı interfasial gərginliyi azalda bilən səthi aktiv birləşmələrdir. Təbii ki, damcılar səthi aktiv maddələr olmadıqda da əmələ gələ bilər, lakin damcı sərhədində öz-özünə yığılan səthi aktiv molekullar interfeysin fazalararası gərginliyini və buna görə də damcıların xassələrini və davranışını modulyasiya etmək üçün faydalıdır. Səthi aktiv maddələrin başqa bir məqsədi, damarlar arası gərginliyi azaltmaq və damcı birləşməsini basdırmaqla damcıları sabitləşdirməkdir.

(a) Tərkibində sulu faza bölünən hidrofilik başdan və yağ fazasında üstünlüklə bölüşdürən hidrofob quyruqdan ibarət olan amfifil sürfaktant molekulunun təsviri. Fərqli şəkildə qurulmuş çoxfazalı sistemlərdə səthi aktiv maddələrin fərqli memarlıqları: (b) su fazasında yağ damlası, (c) yağ fazasında sulu damlacıq, (d) fosfolipid iki qatdan ibarət olan vesikül.

(a) Tərkibində sulu faza bölünən hidrofilik başdan və yağ fazasında üstünlüklə bölüşdürən hidrofob quyruqdan ibarət olan amfifil sürfaktant molekulunun təsviri. Fərqli şəkildə qurulmuş çoxfazalı sistemlərdə səthi aktiv maddələrin fərqli memarlıqları: (b) su fazasında yağ damlası, (c) yağ fazasında sulu damlacıq, (d) fosfolipid iki qatdan ibarət olan vesikül.

Sulu damcı kütləvi sulu fazada davamlı ikiqat lipid təbəqəsi ilə örtüldükdə, bu adlanır. vezikül [11]. Vezikül səthində öz-özünə yığılmış amfifilik molekullar vezikülü müəyyən edir. Prinsipcə bir vesikül, suda həll olunan molekulları və yağda həll olunan molekulların birləşdirilə biləcəyi iki qatlı bir lipid membranı olan sulu bir nüvəsi olan suda suda olan bir damlacıqdır. Vesiküllər davamlı su fazasında dağılır və ölçüləri onlarla nanometrdən yüzlərlə mikrometrə qədərdir. Biomembranlardan əldə edilən fosfolipidlərdən və ya lipidlərdən istifadə edərək süni şəkildə hazırlanan vesiküllər üçün bu termin lipozomlar tez -tez istifadə olunur və lipozomlar üçün tətbiqlər süni hüceyrələrdən [60] dərmanların mikrokonteynerlərə [98] çatdırılmasına qədərdir.

Damcılar müxtəlif yollarla istehsal edilə bilər. Tək damcı və ya bir neçə damcı istehsal etmək üçün sadəcə mikropipetdən və ya şprisdən maye atmaq kifayətdir. Böyük miqdarda damlacıqlar, məsələn, atomizatorlar, nebulizatorlar və müxtəlif dizaynlı homogenizatorlar da daxil olmaqla geniş çeşidli üsullarla istehsal edilə bilər. Bu üsullar emulsiya şəklində davamlı fazada dağılmış minlərlə-milyonlarla damcı istehsal edəcəkdir. Tipik memarlıqlara suda yağ (Şəkil 1b) və ya yağda su (Şəkil 1c) emulsiyaları daxildir, lakin ikiqat emulsiyalar kimi daha mürəkkəb təşkilatlar da mövcuddur [36]. Damlacıqların əmələ gəlməsi və təhlili üçün robotik platformaların və mikrofluidiklərin tətbiqi nümayiş etdirildi [43, 47, 49, 59, 74]. Ümumiyyətlə, damcılar asanlıqla istehsal edilə bilər. Bununla birlikdə uzunmüddətli sabitliyə adətən sistemin kinetik sabitliyini artıran səthi aktiv maddələrin iştirakı ilə nail olunur.


Canlı hüceyrələrin floresansla aktivləşdirilmiş hüceyrə çeşidlənməsi

Canlı hüceyrə populyasiyalarının flüoresan aktivləşdirilmiş hüceyrə sıralamasının təsviri.

Canlı hüceyrələrin floresansla aktivləşdirilmiş hüceyrə çeşidlənməsi (FACS), hüceyrə populyasiyasını floresan etiketləməyə əsaslanaraq alt populyasiyalara ayırır. Sıralama, axın sitometrində çeşidlənməmiş təhlildən daha mürəkkəb mexanizmləri əhatə edir. Flüoroforla birləşdirilmiş antikorlardan istifadə edərək boyanmış hüceyrələr hansı flüoroforla boyandığından asılı olaraq bir-birindən ayrıla bilər. Məsələn, bir hüceyrə markerini ifadə edən hüceyrə, markeri tanıyan FITC-birləşmiş antikordan istifadə etməklə, fərqli markeri ifadə edən başqa bir hüceyrə növü isə həmin marker üçün spesifik PE-birləşmiş antikordan istifadə etməklə aşkarlana bilər. Bu axın sitometriyasının əsas vəzifəsidir.

Canlı hüceyrə çeşidlənməsi bir addım daha irəli gedir:

  1. Ayrı-ayrı hüceyrələr adi bir axın sitometrində olduğu kimi lazer tərəfindən "sorğulanır".
  2. Maşın elə qurulub ki, hər bir hüceyrə daha sonra burun ucundan çıxarkən tək bir damlacığa daxil olur. Bu damla, damlanın içindəki hüceyrənin floresansına bağlı olaraq elektron yüklənir.
  3. Burulma lövhələri hüceyrələri buna uyğun olaraq toplama borularına çəkir və ya itələyir.

Tək bir FITC ləkələnmiş hüceyrə tək damcıda müsbət yük veriləcək və sağa çəkiləcək. Sağdakı toplama boruları bütün müsbət yüklü FITC ləkələnmiş hüceyrə damcılarını toplayır.

Hüceyrələr, sonrakı mədəniyyət üçün çirklənmədən və canlı olaraq qalmalıdır. Aşağıdakı məsləhətlərə baxın.


Səliqəli elm və ya təməlqoyma ideyası? Hüceyrələrin məzmunu necə təşkil etdiyinə dair nəzəriyyə bioloqları bölür

Howard Hughes Tibb İnstitutunun prezidenti olaraq 7 il Robert Tjian, biologiya və biotibbi dəyişdirə biləcək təxribatçı fikirləri araşdıran elm adamlarına yüz milyonlarla dollar yönəltməyə kömək etdi. Beləliklə, bir neçə il əvvəl onun aspirantı David McSwiggen hüceyrə biologiyasının ən qaynar konsepsiyalarından biri olan faza ayrılması adlanan proses haqqında həyəcanı artıra biləcək məlumatları aşkar etdikdə biokimyaçı çox maraqlandı.

Faza ayırma tərəfdarları, zülalların və digər molekulların suda meydana gələn yağ damlaları kimi hüceyrələr içərisində daha sıx quruluşlara çevrildiyini düşünürlər. Tərəfdarlar iddia edirlər ki, bu kortəbii çeşidləmə, hüceyrənin məzmununu təşkil etmək və əsas hüceyrə hadisələrini tetiklemek üçün lazım olan molekulları toplamaq üçün əvvəllər tanınmamış bir mexanizm kimi xidmət edir. McSwiggen, faza ayrılmasının herpesvirusların yoluxmuş hüceyrələrin içərisində çoxalmasına kömək etdiyinə dair göstərişlər tapdı və bu prosesin genləri işə salmaq, sitoskeletonları bağlamaq və zədələnmiş DNT-ni bərpa etmək kimi müxtəlif funksiyalarda rol oynadığını iddia etdi. Prinston Universitetinin biofiziki Clifford Brangwynne deyir: "Bu prosesin bütün hüceyrədə olduğu aydındır".

Əczaçılıq sənayesi, faza ayrılmasını xərçəng, amyotrofik lateral skleroz (ALS), şəkərli diabet və digər xəstəliklərlə əlaqələndirən tədqiqatlar aparıldığı üçün bəzi akademik tədqiqatçılar kimi həyəcanlıdır. Hüceyrə damlalarını hədəf alan tibbi müalicələri davam etdirən Dewpoint Therapeutics, bu yaxınlarda dərman nəhəngləri Merck və Bayer ilə 400 milyon dollardan çox dəyərində inkişaf müqavilələri imzaladı. Prosesdən istifadə etmək istəyən digər üç şirkət isə keçən ilin sonunda qapılarını açdı. Həmin həvəsi əks etdirən, Elm 2018-ci ilin sıçrayışı buraxılışında mərhələ ayrılmasını ikinci olaraq seçdi.

Tjian deyir ki, o, əvvəlcə prosesin əhəmiyyəti ilə bağlı aqnostik olub. Lakin McSwiggen-in tapıntıları onu və həmkarlarını iddialar dairəsinə daha yaxından baxmağa ruhlandırdıqdan sonra tədqiqatçılarda şübhə yaranmağa başladı. Tjian və buna bənzər şübhə ilə yanaşan bioloqların bir düşərgəsi, maye kimi kondensatların hüceyrələrdə təbii olaraq əmələ gəldiyinin sübutlarının əsasən keyfiyyətli olduğunu və birmənalı nəticələr verən üsullarla əldə edildiyini iddia edirlər - bir sözlə, tədqiqatın çoxunun qeyri -kafi olduğuna inanırlar.

2016-cı ildə Howard Hughes-un prezidenti vəzifəsindən istefa verən və hazırda Kaliforniya Universitetində laboratoriyaya rəhbərlik edən Tjian deyir ki, bu hüceyrədaxili damcıların mühüm rol oynaması ilə bağlı mübahisə “heç bir məlumat olmadan fərziyyədən qurulmuş dogmaya çevrilib”. UC), Berkeley. "Bu, mənim üçün elmi kəşf prosesi üçün çox azğın və dağıdıcıdır."

Faza ayırma tərəfdarları bu tənqidlərin bəzilərini ələ alsalar da, bir çox elm adamı tədqiqatın ciddi bir zərbə tələb etdiyinə razıdır. McGill Universitetinin biofiziki Stefani Veber deyir: "Mən bütün sahənin yıxıldığını düşünmürəm". Hüceyrələrdə faza ayrılması hallarını təyin etmək və onlara funksiyalar atamaqla "Ancaq daha diqqətli olmalıyıq".

Şimali Karolina, Chapel Hill Universitetinin kəmiyyət hüceyrə bioloqu Amy Gladfelter əlavə edir ki, proses bir çox elm adamının indi iddia etdiyindən daha az əhəmiyyətli ola bilər. O deyir ki, bəzi tədqiqatçılar bunu “hər şeyə cavab” etməyə çalışıblar.

Faza ayrılması, bioloqları 100 ildən artıqdır ki, əsəbiləşdirən əsas bir suala cavab verə bilər: Hüceyrələr, müəyyən bir işi yerinə yetirmək üçün lazım olan molekulların doğru zamanda doğru yerdə olması üçün məzmununu necə təşkil edir? Aşkar bir yol, Golgi cisimlərini və mitoxondriləri hasarlayanlar kimi daxili membranlardır. Nüvə içərisində olan bir orqanel və RNT-emal edən Cajal cisimləri də daxil olmaqla bir çox tanınmış hüceyrə quruluşunda membran yoxdur.

Faza ayrılması cəlbedici cavabdır. Bir çox zülal, eyni və ya fərqli bir növ digər zülalları cəlb edən yapışqan yamaqlara malikdir. Sınaq borusu tədqiqatları göstərdi ki, müəyyən şərtlərdə, məsələn, zülal konsentrasiyası müəyyən səviyyədən yuxarı qalxdıqda, molekullar birləşərək damcı kimi kondensatlar əmələ gətirə bilər. Tədqiqatçılar zülallar üçün mexanikanı ən yaxşı başa düşürlər, lakin RNT kimi nuklein turşuları da zülallarla birləşə bilər. Bu proses hüceyrədə baş verərsə, orqanoidləri yarada və saxlaya bilər və bənzərsiz funksiyalara icazə verə bilər. Pensilvaniya Universitetinin biofiziki Mustafa Mir, bir vaxtlar Tjian ilə postdoktur olaraq işləmiş, "Bu, hüceyrədə və nüvədə nə qədər şeyin təşkil olunduğunu izah edə bilən bir prinsipdir" deyir.

Bioloqlar hüceyrədaxili damcıların rolunu hələ 1890-cı illərdə irəli sürsələr də, onların həyati əhəmiyyətə malik olduğuna dair sübutlar 10 ildən bir qədər çox əvvəl birləşməyə başladı. Maks Plank adına Molekulyar Hüceyrə Biologiyası və Genetikası İnstitutunda hüceyrə bioloqu Anthony Hyman ilə postdoc olan Brangwynne nematod embrionlarında sperma və yumurta istehsal etməyə davam edən hüceyrələri qeyd edən P qranullarını, zülal və RNT ləkələrini izləyirdi. Qranulların hərəkətlərini müşahidə etmək üçün Brangwynne, iki mikroskop örtüyü sürüşməsi arasındakı quruluşları saxlayan qurd gonadlarını sıxdı. Brangwynne, Hyman və həmkarları, təzyiq altında P qranullarının bərk maddələr kimi deyil, nüvənin səthi boyunca axan və damlayan mayelər kimi cavab verdiyini bildirdilər. Elm Qranulların sulu davranışı “ağlını başından alırdı. Bu, hüceyrələrdəki hər şeydən çox fərqli idi,” Brangwynne-nin keçmiş postdoktu Weber deyir.

P qranulları (yaşıl), sperma və ya yumurta hüceyrələrinin harada yaranacağını göstərən erkən qurd embrionlarında zülal və RNT cibləri sitoplazmada faza ilə ayrılmış bölgələrin klassik nümunəsi olmuşdur.

2012 -ci ildə Brangwynne və həmkarları, hüceyrənin protein fabrikləri olan ribosomlar istehsal edən sıx bir zülal, RNT və DNT qarışığı olan nukleolusta bənzər maye xüsusiyyətlərini gördülər. Elə həmin il, Texas Cənub -Qərb Tibb Mərkəzindən biofizik Michael Rosen və həmkarları, sitoskeletin bir hissəsini təşkil etmək üçün əməkdaşlıq edən üç zülalın bir test borusu həllində maye damlaları meydana gətirdiyini göstərdilər. Prosesin in vitro bir növ skelet lifinin yığılmasını sürətləndirdiyini və hüceyrədə də eyni şeyi edə biləcəyini tapdılar. Elm adamları o vaxtdan bəri, yuvarlaq, əriməyə meylli və səthlərdən keçməyə meylli olan hüceyrə quruluşlarının nümunələrini - faza ayrılması nəticəsində əmələ gələn damlacıqların əlamətlərini bildirdi.

Hüceyrədə molekulyar toplanmanın maye olduğunu və daha möhkəm bir şey olmadığını təsdiqləmək üçün elm adamları tez -tez fotobleachingdən sonra (FRAP) floresan bərpası adlı bir texnikadan istifadə edirlər. Tərkibində flüoresan zülallar olan hüceyrədən istifadə edərək, tədqiqatçılar molekulları qaraltmaq üçün sözügedən bölgəni lazerlə zımparalayır və sonra flüoresansın hüceyrənin digər hissələrindən geri diffuzasiyası üçün nə qədər vaxt lazım olduğunu izləyirlər. Floresan zülalların asanlıqla nüfuz etdiyi bir maye bərkdən daha tez yanmalıdır. Başqa bir test, quruluşun əriyib-dağılmadığını müəyyən etmək üçün damcıları bir-birinə bağlayan bəzi molekulyar qarşılıqlı təsirləri pozan bir birləşmə olan 1,6-heksandiolun tətbiq edilməsini əhatə edir.

Rosen qeyd edir ki, keçən il üç məqalə dərc olunub Hüceyrə hüceyrələrdə faza ayrılmasına dair ən güclü dəlillərdən birini təqdim edir. Brangwynne laboratoriyasından biri, müəyyən bir zülalın, çətin zamanlarda ortaya çıxan və faza ayrılmasına aid olan stress qranullarının meydana gəlməsinə imkan vermək üçün hüceyrələrdə bir eşik konsentrasiyasına çatması lazım olduğunu göstərdi. Digər iki tədqiqat da faza ayrılması üçün eşik şərtlərini təyin etdi. Rosen deyir ki, hədd prosesin atributudur, tədqiqatlar "bu strukturların faza ayrılmasından keçdiyinə dair yaxşı, lakin mükəmməl olmayan məlumatlar" verir.


Kondensatlar: Hüceyrələrdə Yeni Təşkilat Prinsipi?

Mən bir neçə il əvvəl hüceyrələr daxilində “kondensatlar” – yüksək konsentrasiyada birləşən zülalların maye kimi damcıları və digər biomolekullar haqqında” yazmışdım. Bu, hamımız üçün qəribə bir fikirdir, çünki biz hüceyrə bölmələrinin membranla örtülməsi və hüceyrə anatomiyasının bir az daha çox olması haqqında düşünməyə alışmışıq. . .müəyyən edilmişdir. Kondensatlar isə tam əksinədir: onların ətrafında heç bir çanta yoxdur və onlar özlərini daha çox və ya daha çox formalaşdıra, birləşdirə və aça bilərlər. Bu cür şeylər uzun illərdir hüceyrələrin içərisində görülür və onlar haqqında çoxlu birləşdirici bir anlayış olmasa da, müxtəlif adlar verilir (nüvə benekleri, Cajal cisimləri, U və P cisimləri, paraspeckles və s.).

Sahə həqiqətən də bu yaxınlarda inkişaf edir � burada keçənilki icmalı var və bu getdikcə daha çox buna bənzəyir hüceyrə biologiyasında fundamental proses ola bilər ki (son vaxtlara qədər) biz tamamilə qaçırdı. Məsələn, transkripsiyada həqiqətən çox vacib ola bilər. Əvvəlki yazıda qeyd edildiyi kimi, bu kondensatları əmələ gətirmə xüsusiyyəti pozulmuş zülalların olduğu ehtimal olunur və transkripsiya faktoru zülalları bu xüsusiyyətlə məşhurdur.

Yeniləmə: bu yaxınlarda Təbiətdə ortaya çıxan sahəyə yaxşı bir xülasə.

Bu baxımdan düşünmək həqiqətən bir çox imkanlar açır. Canlı hüceyrədə baş verənlərin, ionlardan, kiçik molekullardan, metabolitlərdən və ionlardan ibarət şorbada üzən minlərlə-minlərlə zülaldan ibarət gelə bənzər kütlənin real zehni mənzərəsini tapmaq həmişə çətin olub. səndə nə var Əslində ola bilər ki, bu digər növlərdən bəziləri bu fazadan ayrılan kondensat damcılarının davranışında iştirak etsinlər. Hətta belə bir təklif var ki, ATP təkcə canlı hüceyrənin əsas enerji valyutası deyil, həm də onun hidrofob zülalların həllolma qabiliyyətini və onların kondensasiya davranışını tənzimləyən “hidrotrop” kimi başqa bir funksiyası var. . Bu, hüceyrələrin sırf enerjili səbəblərdən ehtiyac duyacağını düşündüyünüzdən daha yüksək konsentrasiyalarda olmasının səbəbini izah edə bilər.

Başqa bir maraqlı məqam, vaxtın miqyasıdır. İllər ərzində hüceyrələrdə inkişaf edən (amiloid, Huntingin və digərləri) geri dönməz protein birləşmələri haqqında çox şey bilirik. Bununla belə, kondensatlar geri çevrilə biləndir və bir neçə saniyədən dəqiqəyə qədər zaman miqyasında əmələ gələ, islahat edə və səpələnə bilər ki, bu da onları bir çox hüceyrə biologiyası üçün sıraya qoyur. Mütləq membranlara malik olmadan funksiyanı fərqləndirməyə başlaya bilsəniz (hüceyrədə hər şeyin ətrafında bir çantanın olması üçün hələ də açıq bir rol var) bu cür şeylərin həyatın mənşəyi nəzəriyyələri üçün də açıq təsirləri var. membran səviyyəsi). Zülal ardıcıllığında bu cür davranış üçün təkamül təzyiqi varmı?

Çox açıq suallar var. Bir dərman kimyaçısı olaraq, bu mühitlərdə dərman molekullarının çözünürlüğünün necə olduğunu merak edirəm. Mən “toplu fazaya qarşı” deyirdim, amma həqiqətən orada olub-olmadığını düşünmək lazımdır. edir bir hüceyrənin içərisində toplu faza. Biz bu interyeri təsvir etmək üçün təvazökarlıqla “sitoplazma” deyirik, lakin bu, həqiqətən müəyyən edilmiş bir şeyin olmadığı yerdə bir şeyin düzəldilməsi halı ola bilər. Əsl vəziyyətə daha çox bənzəmək, düşündüyümüzdən daha çox heterojendir və fiziklərin və polimer kimyaçıların, hüceyrə bioloqlarının etdiyi kimi, neler olduğunu bizə izah edə biləcək qədər çox şey ola biləcəyini düşünürük. Şübhəsiz ki, diqqət yetirilməli bir sahə.


Videoya baxın: BU DA HƏMİŞƏ 95 YANACAQLA SÜRDÜYÜM MAŞININ FİLTERİ (Yanvar 2023).