Məlumat

Böyük plazmid ligasyonu: qələvi fosfataz lazımdırmı?

Böyük plazmid ligasyonu: qələvi fosfataz lazımdırmı?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Çox böyük plazmidin (təxminən 15kbp) insert ilə bağlanması üçün istifadə etdiyim protokolla bağlı şübhəm var: tək kəsilmiş fermentlə (yapışqan uclar) həzm edildikdən sonra protokol birbaşa plazmidin təmizlənməsinə keçir. heç bir qələvi fosfataz yaratmadan. Şübhə edirəm ki, bağlama zamanı plazmid əlavəni qəbul etmədən öz-özünə bağlanacaq? Mən səhv edirəm və ya protokol səhvdir?


Tək məhdudlaşdırıcı fermentdən istifadə edildikdə plazmid vektoru həmişə təkrar dövriyyəyə meylli olacaq, lakin ligasiya zamanı rekombinant plazmidlər də əmələ gələcək. Qələvi fosfataz müalicəsi təsvir etdiyiniz kimi istifadə edilə bilər; siz sadəcə olaraq daxiletmə fraqmentinin yüksək molyar artıqlıqda olduğuna əmin ola bilərsiniz və sonda rekombinant plazmidləri tapmaq üçün daha çox işləməyə hazır ola bilərsiniz. Heç bir yanaşma düzgün və ya yanlış deyil, hər ikisinin öz məhdudiyyətləri var.

Əlbəttə ki, ən yaxşı yanaşma bu tip klonlaşdırmadan tamamilə qaçmaqdır.

Sonradan əlavə edildi

Yeri gəlmişkən, sualınızın ifadəsi, plazmid vektoru adi haldan bir qədər böyük olduğu üçün daha çox probleminiz ola biləcəyini düşünürsünüz. Elə deyil! Sirkulyarizasiyaya üstünlük verilir, çünki iki ucu bir-birinə bağlıdır, buna görə hər birinin effektiv konsentrasiyası digərinə nisbətən yüksəkdir. Plazmid böyüdükcə bağ daha uzun olur və bağlama effekti daha az olacaq.


İnsan şifahi metagenomundan Lipaza kodlayan genin klonlaşdırılması, ifadəsi və xarakteristikası

pUC19 plazmidinə klonlaşdırılmış insan oral metagenomik DNT-dən DNT kitabxanasının qurulması üçün istifadə edilmişdir. Escherichia coli. 40.000 metagenomik klonun funksional skrininqi tributyrin agar boşqabında halo nümayiş etdirən LIP2 klonunun müəyyən edilməsinə səbəb oldu. LIP2 insert DNT-nin ardıcıl analizi 939 bp ORF aşkar etdi (omlip1) lipaz 1-ə homologiya göstərdi Acinetobacter junii SH205. The omlip1 ORF klonlandı və ifadə edildi E. coli PET ifadə sistemindən istifadə edərək BL21 (DE3). Rekombinant ferment homojenliyə qədər təmizlənmiş və biokimyəvi xassələri öyrənilmişdir. Təmizlənmiş OMLip1 hidrolizə edilmişdir səh-nitrofenil esterləri və orta və uzun zəncirli yağ turşularının triaçilgliserol esterləri, fermentin əsl lipaz olduğunu göstərir. Təmizlənmiş zülal müvafiq olaraq 7 və 37 °C pH və optimal temperatur nümayiş etdirdi. Lipazanın 6-7 pH diapazonunda və 40 °C-dən aşağı temperaturda sabit olduğu aşkar edilmişdir. Əhəmiyyətlisi odur ki, bir çox ikivalentli kationların olması və ya olmaması ilə fermentin fəaliyyəti dəyişməyib. OMLip1-in metal ionlarına qarşı həssaslığı onun sənaye proseslərində potensial istifadəsini təklif edir.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Videoya baxın: 7a Plasmid replication 1 (Oktyabr 2022).