Məlumat

Ağ qan hüceyrələrində L-selektin

Ağ qan hüceyrələrində L-selektin


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ağ qan hüceyrələrinin funksiyası əsasən xarici antigenlərlə mübarizə aparmaqdır. Bununla belə, onun digər xüsusiyyətlərindən biri də L-selektinin köməyi ilə damar endotel hüceyrələrinə bağlanma qabiliyyətidir. Bunun məqsədi nədir və bu bizə necə kömək edir?


Zərərli mikroblarla mübarizə (özlüyündə antigenlərlə deyil, spesifik antigenin tanınması vacib olsa da) WBC səthində bir neçə liqnad bağlayan molekul və liqand tələb edən çoxlu prosesləri əhatə edir. Bu zülalların bütün kompleksi və onların funksiyaları çox mürəkkəb olsa da, yerli yarada bədəni mikroblardan qorumağa çalışan bir neytrofil nümunəsini götürə bilərik. kəskin yerli iltihab reaksiyası.

1. Endotelə yapışma

Burada bir neçə seçici rol oynayır. Sadə geniş fikir ondan ibarətdir ki, yerli immun hüceyrələri (toxuma makrofaqları, damarların pozulması halında qan hüceyrələri və s.) tərəfindən hiss edilən mikroorqanizmlərin mövcudluğu ilə yerli mühitdə kemokinlərin tənzimlənməsi baş verir ki, bu da endotelin artmasına səbəb olur. müəyyən adezyon molekullarının (WBC-də reseptorları olan liqandlar və əksinə) ifadəsi, eləcə də yaranın yaxınlığında neytrofilin onlarla sıx təmasda olmasına və endotelə bağlanmasına səbəb olan digər hemodinamik dəyişikliklər. Bu, tez-tez üç prosesə bölünür, marginasiya, yuvarlananyapışma. L-selektin digər selektivlər və inteqrinlərlə birlikdə bu yapışma vasitəçilərindən biridir.

2. Endotel vasitəsilə toxumalara miqrasiya (diapedez)

3. Mikroblara qarşı kemotaksis

4. Mikroblara təsir

Xallar 2,34 öz vasitəçilərinə malikdir (bax: CD31, kemokinlər - AA, C5a, leykotrienlər).

İstinad: Robbins və Cortran: Xəstəliyin Patoloji Əsası, 9e

Digər mənbələr: Vikipediya səhifəsi


Tədqiqatçılar zülalların immunitet sistemini necə tənzimlədiyini başa düşməyə daha yaxındırlar

Kalqari Universitetinin Elmlər Fakültəsinin biologiya elmləri bölməsindəki tədqiqatçılar ağ qan hüceyrələrinin bədəndə infeksiyaya və ya iltihaba necə keçdiyini aşkar etdilər ki, bu da immunitet sistemi pozğunluqları üçün dərman müalicəsinin inkişafına kömək edə bilər.

Araşdırma bu ay nəşr olunur Bioloji Kimya Jurnalı.

İki insan zülalının - L-selektin və kalmodulinin - ağ qan hüceyrələrini bədəndəki iltihab və ya infeksiya yerinə köçürməkdə iştirak etdiyi çoxdan məlumdur. L-selektin ağ qan hüceyrələrinin hüceyrə membranına yerləşdirilir və ağ qan hüceyrəsini qan damarının divarındakı yapışqan səthə bağlayaraq Velcro kimi fəaliyyət göstərir.

Ağ qan hüceyrəsi infeksiya və ya iltihab yerinə çatdıqda, L-selektin zülalını "tökdürür" və bu, onun qan axını tərk edərək zədələnmiş toxuma daxil olmasına imkan verir. Bu tökülmə prosesi protein calmodulin tərəfindən ağ qan hüceyrəsinin içərisində idarə olunur.

Hans Vogel tərəfindən idarə olunan doktorantura tələbəsi Jessica Gifford deyir: "Hüceyrə bioloqları 1998-ci ildə kalmodulinin L-selektinin tökülməsi prosesini mənfi tənzimlədiyini anladılar". "Onlar bilirdilər ki, calmodulin bunu edir, amma necə olduğunu bilmirdilər."

Güclü maqnitlərdən və nüvə maqnit rezonansı (NMR) spektroskopiyası adlanan texnikadan istifadə edərək, Gifford və Vogel iki zülal arasındakı qarşılıqlı təsirin molekulyar strukturunu təyin edərək, molekulyar səviyyədə kalmodulinin L-selektinin tökülməsinə necə nəzarət etdiyinə dair mühüm fikir təmin etdilər.

Gifford deyir: "Bu proseslərin molekulyar təfərrüatlarını başa düşmək bədənimizin iltihaba necə reaksiya verdiyini anlamağa kömək edəcək və əgər bunu başa düşə bilsək, bu, immun sisteminizi manipulyasiya etmək və ya onu işə salmaq üçün dərman müalicəsinin istehsalının ilk addımıdır" , ya da söndürün."

Gifford deyir ki, immunitet sistemini tənzimləməyə kömək edən dərman müalicələrinə maraq artır. "İnsanların bir çox problemləri immun sistemlərinin həddindən artıq aktiv olması ilə əlaqədardır" deyir. "Ağ qan hüceyrələrinizin ətrafa necə girdiyini başa düşməklə, bəlkə də ehtiyac olmadığı zaman onların oraya çatmalarına mane ola bilərik."


Açar sözlər

  • APA
  • Standart
  • Harvard
  • Vankuver
  • Müəllif
  • BIBTEX
  • RIS

Tədqiqatın nəticəsi : Jurnalın töhfəsi › Məqalə › ekspert rəyi

T1 - Yenidən paylanmış L-selektini olan bir neytrofilin yuvarlanan dinamikası

N2 - Ən çox yayılmış ağ qan hüceyrəsi neytrofildir, kimyəvi seleksiya-karbohidrat bağlarının koordinasiyalı formalaşması və qırılması səbəbindən yavaş-yavaş qan damarlarının divarları boyunca yuvarlanır. L-selektin reseptorlarının selektivlər və ya kemotaktik stimullaşdırma vasitəsilə yuvarlanması zamanı hüceyrə membranının bir ucunda qapaq yaratmaq üçün sürətlə yenidən paylandığını göstəririk. Bu topoqrafiya, axın altında karbohidrat selektiv-liqand substratında yuvarlanan neytrofillərin kompüter simulyasiyaları ilə nümayiş etdirildiyi kimi yapışqan dinamikasını əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirir. Müəyyən edilmişdir ki, yenidən paylanmış L-selektin qapağı olan neytrofillər sialil Lewis-x üzərində kvazi-dövri hərəkətlə yuvarlanır, çünki yuvarlanma sürətində müntəzəm sıçrayışlarla kəsişən nisbətən aşağı sürət intervalları ilə xarakterizə olunur. Orta hesabla, yenidən paylanmış L-selektini olan neytrofillər bərabər orta sıxlıqda vahid L-selektin paylanmasına malik hüceyrələrlə müqayisədə daha aşağı sürətlə yuvarlanır. İltihab reaksiyası zamanı yapışma dinamikasında olan bu fərqlərin mümkün bioloji təsirləri barədə fərziyyə edirik.

AB - Ən çox yayılmış ağ qan hüceyrəsi neytrofildir, kimyəvi seleksiya-karbohidrat bağlarının koordinasiyalı formalaşması və qırılması səbəbindən yavaş-yavaş qan damarlarının divarları boyunca yuvarlanır. L-selektin reseptorlarının selektivlər və ya kemotaktik stimullaşdırma vasitəsilə yuvarlanması zamanı hüceyrə membranının bir ucunda qapaq yaratmaq üçün sürətlə yenidən paylandığını göstəririk. Bu topoqrafiya, axın altında karbohidrat selektiv-liqand substratında yuvarlanan neytrofillərin kompüter simulyasiyaları ilə nümayiş etdirildiyi kimi yapışqan dinamikasını əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirir. Müəyyən edilmişdir ki, yenidən paylanmış L-selektin qapağı olan neytrofillər sialil Lewis-x üzərində kvazi-dövri hərəkətlə yuvarlanır, çünki yuvarlanma sürətində müntəzəm sıçrayışlarla kəsişən nisbətən aşağı sürət intervalları ilə xarakterizə olunur. Orta hesabla, yenidən paylanmış L-selektini olan neytrofillər bərabər orta sıxlıqda vahid L-selektin paylanmasına malik hüceyrələrlə müqayisədə daha aşağı sürətlə yuvarlanır. İltihab reaksiyası zamanı yapışma dinamikasında olan bu fərqlərin mümkün bioloji təsirləri barədə fərziyyə edirik.


Hüceyrə biologiyası imtahan 2

daxili sərhəd membran sahəsi
- zülallarla zəngindir
- idxalında rol oynayır
mitoxondrial zülallar.

Həmçinin öz RNT və zülallarını istehsal etmək üçün ribosomlara malikdir.

DNT az sayda mitoxondrial polipeptidləri kodlayır (insanlarda 13)
- daxili mitoxondrial membrana sıx birləşmişdir
- daxilində yaşayan genlər tərəfindən kodlanan polipeptidlərlə birlikdə
nüvə.

edir
-10 NAD+
-2 FAD
-12 H2O
-34 ATP

Şərtlər arasında dəyişir
körpəlik dövründə ölümlə nəticələnən xəstəliklər
nöbet, korluq, karlıq və/və ya insult kimi epizodlara səbəb olan pozğunluqlara, məşqə dözümsüzlük və ya hərəkətsiz sperma kimi yüngül şərtlərə.
MtDNT-dəki mutasiyalar vaxtından əvvəl qocalmağa səbəb ola bilər

Trimerin tərkibinə daxildir
molekul boyunca kəsişən spiral olmayan seqmentlər və
hər ucunda qlobal domenlər.

IV tip kollagen genlərində mutasiyalar
Alport sindromu olan xəstələrdə müəyyən edilmişdir
Glomerular bazal membranın pozulması ilə irsi böyrək xəstəliyi

Plazma membranının xarici tərəfində bu, hüceyrədənkənar mühitdə mövcud olan müxtəlif liqandlar sırasına bağlanır.

Bir boşluq qovşağının plazma membranlarında 2 bitişik hüceyrənin sitoplazmasını birləşdirən kanallar var.

İnteqral membran zülalı konneksindən ibarətdir, - membranı əhatə edən çoxaltvari komplekslər, konneksonlar şəklində təşkil edilmişdir.
- Konnekson altı konneksin alt bölməsindən ibarətdir
- mərkəzi açılış və ya həlqə ətrafında halqa şəklində düzülmüşdür (təxminən 1,5 nm)

Boşluq qovşaqları hüceyrələrarası əlaqə üçün ixtisaslaşmış heyvan hüceyrələri arasında yerlərdir
- fizioloji proseslərdə mühüm rol oynayır
Məs. Ürək hüceyrələri (interkalasiya edilmiş disklər boşluq qovşaqlarından və desmosomlardan ibarətdir)

Boşluq qovşaqları bir-birinə çox yaxınlaşır, lakin birbaşa əlaqə yaratmır.

Məməlilərin boşluq qovşaqlarının kəsilməsi 1000 daltondur (bundan böyük heç nə yoxdur)
- nisbətən qeyri-seçicidirlər.

Boşluq-qovşaq kanalları qapılıdır
-connexin subunitlərinin fosforlaşması və qovşaqda gərginliyin dəyişməsi ilə tetiklenir.
Ürək əzələ hüceyrələrinin stimullaşdırılması boşluq qovşaqları vasitəsilə baş verir
- ionların cərəyanı bir ürək əzələsindən boşluq qovşaqlarından keçir
hüceyrəni qonşularına çatdıraraq, hüceyrələrin sinxron şəkildə büzülməsinə səbəb olur.

Fərqli toxuma spesifik paylanmaları olan təxminən 20 müxtəlif konneksin müəyyən edilmişdir.
- keçiricilik, keçiricilik və tənzimləmədə fərqlərə səbəb olur.

Bəzi hallarda, müxtəlif konneksinlərdən ibarət olan qonşu hüceyrələrdəki konneksonlar birləşə və funksional kanallar meydana gətirə bilir, digər hallarda isə yox.


Təşəkkürlər

Müəlliflər bu hesabatın başlanğıcı və hazırlanması zamanı düşünülmüş şərhlərinə görə Barbara Kreynə təşəkkür etmək istəyirlər. Bu tədqiqat Milli Ürək, Ağciyər və Qan İnstitutundan (NHLBI) K12-HL087169 (JFC), U54HL090515 və 5R01HL091759 (AE və JFC) və qismən Milli İnstitutlar tərəfindən maliyyələşdirilən Johns Hopkins ITCR/CTSA Biomarker İnkişaf Mərkəzi tərəfindən dəstəklənib. Səhiyyə (NIH) qrantı U54RR023561 (JVE). Məzmun yalnız müəlliflərin məsuliyyətidir və NHLBI və ya NIH-in rəsmi fikirlərini əks etdirmir.


Müzakirə

Bu işdə biz Pak1-in periferik limfa düyünlərinə T-hüceyrə ticarətinin tənzimlənməsində əhəmiyyətini müəyyən edirik. Biz göstəririk ki, bu ferment aktivləşdirilmiş T hüceyrələrinin səthində limfa düyünlərinin təyin edilməsi reseptorlarının, L-selektin və CCR7 ifadəsini tənzimləyir. WT T hüceyrələri ilə müqayisədə Pak1 çatışmazlığı olan L-selektin və CCR7 səviyyələri zülal və mRNA səviyyələri ilə ölçüldükdə aşağı idi. Bu azalmalara bir sıra amillər səbəb olub. L-selektin və CCR7-nin transkripsiyasını induksiya edən Foxo1 və Klf2 transkripsiya faktorlarının səviyyəsi aşağı idi. Pak1(T) −/− T hüceyrələri. Bundan əlavə, biz Pak1 çatışmazlığının L-selektinin sitoplazmik quyruğuna kalmodulinin cəlb edilməsi ilə əlaqəli olan Pak1 çatışmazlığı olan T hüceyrələrində L-selektinin tökülməsinin artmasına səbəb olduğunu tapdıq. Beləliklə, məlumatlarımız limfa düyünlərinin təyin edilməsi reseptorlarının ifadəsini tənzimləmək üçün birləşən T hüceyrələrində Pak1-in aşağı axınında iki müstəqil yol üçün sübut təqdim edir (Şəkil S3D).

Pak1 çatışmazlığı olan T hüceyrələrinin əhəmiyyətli qüsurlar nümayiş etdirdiyini aşkar edirik in vivo limfa düyünlərinə yönəldilir. Lakin limfa düyünlərinə çatan həmin hüceyrələrin hərəkətliliyi normal idi. Aktivləşdirilmiş, lakin Pak1 çatışmazlığı olmayan T hüceyrələrinin periferik limfa düyünlərinə daşınma qüsurunun mexanizmini müəyyən etmək üçün üç mühüm molekulun, L-selektin, CCR7 və LFA-1 ifadəsini təhlil etdik. limfosit limfa düyünlərinə daxil olur (2). Lökosit selektiv L-selektinin və kimokin reseptoru CCR7-nin səthi ifadəsinin aktivləşdirilmiş vəziyyətdə azaldığını gördük. Pak1(T) −/− T hüceyrələri, LFA-1 ifadəsi isə təsirlənməmişdir. L-selektin və CCR7 hüceyrə səthinin ifadəsinin modifikasiyası lenfositlərin təkrar dövriyyəsini dəyişdirə və immun reaksiyalara təsir göstərə bilər (37�). İmmun aktivləşmədən sonra limfa düyünlərinin homing molekullarının, L-selektin və CCR7-nin transkripsiya ilə aşağı tənzimlənməsi effektor T hüceyrələrinin periferik limfa düyünlərinə yenidən daxil olmasının qarşısını alır və onların effektor funksiyasını yerinə yetirdiyi periferik toxumalara miqrasiyasına kömək edir (4, 37). Ədəbiyyata uyğun olaraq, L-selektin və CCR7 çatışmazlığının dalağa doğru getməsinə təsir etmədiyini gördük (25�).

Pak1 çatışmazlığı, aktivləşdirilmiş T hüceyrələrində L-selektin və CCR7 ifadəsini aşağı modullaşdıran transkripsiya mexanizmlərinə təsir etdi, çünki CCR7 və L-selektinin mRNA səviyyələrində və L-selektin transkripsiya faktoru Klf2-də azalma müşahidə etdik. FOXO1 transkripsiya faktoru T hüceyrələrində (28) KLF2 promotoruna bağlanır və Foxo1 çatışmazlığı olan T hüceyrələri L-selektin ifadəsini azaldır (29). Həmçinin, FOXO1 Jurkat T hüceyrələrində (28) CCR7 mRNT ifadəsini induksiya edir, halbuki Klf2 çatışmazlıq CCR7-nin səthi ifadəsini tənzimləyir, lakin onun transkripsiyasını deyil (40). Foxo1-in ümumi miqdarının azalması ilə yanaşı, Pak1 olmadıqda sitoplazmik Foxo1-də artım müşahidə etdik. FOXO transkripsiya faktorları onların zülal səviyyələrinə, lokalizasiyasına və fəaliyyətinə təsir edən post-translational modifikasiyalarla yaxından tənzimlənir (41, 42). Onlar AKT kimi zülal kinazları tərəfindən inhibitor fosforilləşməyə məruz qalır, FOXO1-i nüvədən sitozola aparır və sitoplazmik şaperonların 14-3-3-ün FOXO1-ə bağlanmasına səbəb olur (51). Əksinə, FOXO1 JNK (30) kimi yuxarı axın tənzimləyiciləri tərəfindən aktivləşdirilir. JNK FOXO1-i fosforilləşdirir, 14-3-3 zülalların FOXO1 ilə qarşılıqlı təsirinin qarşısını alır və bununla da FOXO1 nüvə lokalizasiyasını təşviq edir. Əvvəlki tədqiqatlar göstərdi ki, PI3K siqnalı T hüceyrələrinin aktivləşdirilməsi zamanı Klf2, L-selektin və CCR7 ifadəsini maneə törədir (21, 34). Biz pAKT S473 aktivasiyasında azalma müşahidə etdik Pak1 (T) −/− T hüceyrə partlayışları, lakin biz Pak1 olmadıqda JNK fosforlaşmasında daha çox azalma müşahidə etdik. Laboratoriyamızdan əvvəlki iş Pak1 aktivləşdirilməsinin əsas və Jurkat T hüceyrələrində JNK aktivasiyasını artırdığını nümayiş etdirdi (13). Pak1 çatışmazlığı olan T hüceyrələrində AKT fosforilasiyasının azalmasının səbəbi aydın olmasa da, JNK fosforilasiyasının azalması bu şəraitdə FOXO1 lokalizasiyasının tənzimlənməsində daha vacib görünür. Birlikdə, bu məlumatlar göstərir ki, Pak1, Foxo1-ni nüvə lokalizasiyasını təşviq etmək üçün fosforilləşdirən JNK-nı aktivləşdirməklə L-selektinin və CCR7-nin gen transkripsiyasını və T hüceyrə limfa düyünlərinin homingini müsbət tənzimləyir.

Metalloproteinazların təsiri L-selektinin səthi ifadəsini tənzimləyir (43). Parçalanmadan sonra aktivləşdirilmiş T hüceyrələrinin supernatantında həll olunan L-selektin (sL-selektin) səviyyələri artır. ELISA ilə biz aktivləşdirilmiş olan supernatantda yüksək səviyyələrdə sL-selektin tapdıq Pak1(T) −/− T hüceyrələri aktivləşdirilmiş WT T hüceyrələri ilə müqayisədə. Leykosit alverinə sL-selektinin liqand bağlamaq və hüceyrə ilə əlaqəli L-selektinlə rəqabət aparmaq qabiliyyəti təsir edir. Bundan əlavə, T-hüceyrələrində L-selektinin parçalanmasının bloklanması onların miqrasiyasını pozur və antiviral T hüceyrələrinin cavablarını maneə törədir (44�). Kalmodulin konstitutiv olaraq L-selektinin sitoplazmik quyruğunu bağlayır və GPCR və ya immunoreseptorların əlaqəsi zamanı kalsium axınının artmasından sonra L-selektinin tökülməsinə gətirib çıxarır (35). Co-immunoprecipitation təcrübəsindən istifadə edərək, Pak1 çatışmazlığı olan T hüceyrələrində kalmodulinin L-selektinə bağlanmasında azalma müşahidə etdik. T hüceyrələrində Pak1 çatışmazlığı nəticəsində, CCR7 aktivləşdirildikdən sonra kalsium axınında artım tapdıq. Əvvəllər, Bam32 və ya Pak1 həddindən artıq ifadəsinin TCR ilə əlaqədən sonra kalsium axını azaldığını təsvir etdik (12). Bundan əlavə, biz müşahidə etdik ki, kalsium axını və ya ADAM17 fəaliyyətini bloklayaraq, sL-selektin səviyyələri Pak1(T) −/− T hüceyrələri azalır. Birlikdə, bu məlumatlar Pak1-in L-selektin miqdarını iki fərqli səviyyədə tənzimlədiyi modeli dəstəkləyir, həm transkripsiya, həm də membran tökülməsi, daha sonra isə kalsiumdan asılı şəkildə tənzimlənir.

Foxo1 tənzimləyici T hüceyrələrinin inkişafı və funksiyası da daxil olmaqla CD4 + T hüceyrələrinin diferensiasiyasını tənzimlədiyi üçün (47�), induksiya edilmiş T tənzimləyici hüceyrələrinin inkişafını öyrənmək maraqlı olardı. Pak1(T) −/− siçanlar. Üstəlik, bizim işimiz göstərir ki, T hüceyrələrində Pak1-in sonrakı tədqiqatları L-selektin fəaliyyətini və aktivləşdirilmiş T hüceyrə ticarətini daha seçici şəkildə modulyasiya etmək üçün terapevtik cəhətdən faydalı yolları müəyyən edə bilər. Xroniki iltihab, kəskin dermatit, romatoid artrit, diabet və astma (50) kimi bəzi xəstəliklərdə damar L-selektin liqandlarının artması səbəbindən test etmək maraqlı olardı. Pak1(T) −/− siçanlar bu müxtəlif şərtlərdə xəstəliyə həssaslıq üçün.


Bağlanmağa məcbur

L-selektin bağları güc optimal kəsilməyə qədər artdıqca daha uzun müddət saxlanılır.

Bu axınla gücləndirilmiş yapışmanın əksər izahatları onu göstərir ki, axın leykositlərdə L-selektin və damar hüceyrələrində PSGL-1 və ya digər liqandlar arasında yaranan bağların sayını artırır, ola bilsin ki, qan hüceyrəsini döndərərək və ya deformasiya edir. Lakin bəzi elm adamları hesab edirlər ki, axın nəticəsində yaranan qüvvə də mövcud bağların ömrünü artıra bilər.

Yeni nəticələr göstərir ki, L-selektin və PSGL-1 arasında leykositlərin yuvarlanmasına nəzarət edən tutma bağları - ömürləri güclə uzadılanlar. Müəlliflər fərdi bağların qalıcı gücünü hüceyrələrin yuvarlanan sabitliyi ilə əlaqələndirdilər. İstiqrazlara tətbiq olunan güc artdıqca, onların ömürləri də artdı. Beləliklə, qan hüceyrələri PSGL-1 substratlarında daha yavaş yuvarlandı. Yavaş yuvarlanma, leykositlərin kemokinlərə cavab verməyə və endoteldən keçməsinə imkan verir. Güc tələbi, ehtimal ki, damar tıxanmalarında iltihabın və leykositlərin yığılmasının qarşısını alır.

Optimal kəsilmədən yuxarı, qan hüceyrələri ən yavaş yuvarlandıqda, tutma bağları sürüşmə bağlarına çevrilir və ömürləri güclə qısalır. Beləliklə, yuvarlanma sürətləri artdı və hüceyrələr substratdan ayrıldı. Sürüşmə bağlarına keçid leykositlərin adətən qan axınının çox güclü olduğu arteriyalara yapışmamasının səbəbini izah edə bilər. ▪


Mücərrəd

Fon- Bu araşdırma gəmiricilərdə eksperimental abdominal aorta anevrizmasının (AAA) formalaşmasında L-selektinin vacib olduğu fərziyyəsini sınaqdan keçirdi.

Metodlar və Nəticələr— Siçovulların qarın aortaları şoran (nəzarət) və ya donuz pankreas elastazı ilə perfuziya edilmiş və postperfuziya 1, 2, 4, 7 və 14-cü günlərdə tədqiq edilmişdir (hər bir müalicə qrupu üçün gündə n = 5). Sabit bölmələrdə neytrofil (polimorfonükleer leykosit, PMN) və yüksək güclü sahəyə (HPF) makrofaqların sayılması aparıldı. Aorta toxumasında L-selektin ifadəsi və zülal səviyyələri müvafiq olaraq polimeraza zəncirvari reaksiya və Western blot ilə müəyyən edilmişdir. 1-ci gündən başqa bütün zaman nöqtələrində elastazla perfuziya edilmiş aorta diametrləri nəzarət aortaları ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (P<0.05). PMN sayıları 1, 2 və 4-cü günlərdə nəzarət aortaları ilə müqayisədə elastaz perfuziyalı aortalarda əhəmiyyətli dərəcədə artmış, 7-ci gündə maksimum səviyyəyə çatmışdır (40,8-ə qarşı 0,3 PMN/HPF, P=0,001). Elastaz perfuziyalı aortalarda L-selektin mRNT ifadəsi 18 (P=0.018), 17 (P<0,001) və 8 dəfə (P=0,02) müvafiq olaraq 1, 2 və 4-cü günlərdə nəzarət aortalarından dəfələrlə böyükdür. Western blot 7-ci gündə elastazda L-selektin zülalında şoran məhlulu ilə perfuziya edilmiş aortalarla müqayisədə əhəmiyyətli 69% artım nümayiş etdirdi.P=0,005). Sonrakı təcrübələr C57BL/6 vəhşi tip (WT) siçanlarının (n=21) və L-selektin-nokaut (LKO) siçanlarının (n=19) aortalarının postperfuziyadan sonrakı 4, 7 və 14-cü günlərində oxşar tədqiqatları əhatə etmişdir. LKO siçanlarının 14-cü gündə aorta diametrləri WT siçanları ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə kiçik idi (88% - 123%, P=0,02). Perfuziyadan sonra 4-cü gündə LKO siçan aortaları ilə müqayisədə elastaz-perfuziyalı WT siçan aortalarında PMN sayları əhəmiyyətli dərəcədə daha çox olmuşdur (12,8-ə qarşı 4,8 PMNs/HPF, P=0,02). Elastaz-perfuziyalı WT siçan aortalarında perfuziyadan sonra bütün zaman nöqtələrində makrofaqların sayı, elastaz-perfuziyalı LKO siçan aortaları ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə daha çox idi, maksimum fərq perfuziyadan sonra 7-ci gündə (13,3-ə qarşı 0,5 makrofaq/HPF, P<0.001).

Nəticə - L-selektin vasitəçiliyi ilə neytrofillərin toplanması AAA formalaşmasında kritik ilk addım ola bilər.

Abdominal aorta anevrizması (AAA) yüksək ölüm nisbəti ilə əhəmiyyətli bir xəstəlikdir. Ölümlər üzrə 2000-ci il Milli Həyati Statistika Hesabatı AAA-ların 65-74 yaş arası ağdərili kişilərdə 10-cu əsas ölüm səbəbi olduğunu və ABŞ-da AAA-ların 36 000 açıq təmirini sənədləşdirən Milli Xəstəxanadan Boşalma Xülasəsini göstərdi.

AAA-ların patogenezi iltihab hüceyrələrinin aorta divarına infiltrasiyasından sonra baş verən katalitik proses vasitəsilə mediada və adventisiyada elastin və kollagenin deqradasiyası ilə xarakterizə olunan kompleks hadisələr silsiləsi ilə bağlıdır. 2-9 Xüsusilə makrofaq patogenezdə kritik rol oynamışdır. 10 AAA formalaşması zamanı neytrofilin (polimorfonükleer leykosit, PMN) əhəmiyyəti 11-13 yaşlı insanlarda və daha yaxınlarda anevrizma formalaşmasının siçan modelində də müəyyən edilmişdir. 14 Anevrizmanın əmələ gəlməsi zamanı neytrofil və makrofaqların aorta divarına daxil olma mexanizmləri vacibdir. 15 Bu baxımdan yapışma molekulları, o cümlədən selektivlər aktualdır.

Seltinlər 3 yapışma molekulundan ibarətdir: aktivləşdirilmiş endotel hüceyrələrinin səthində E-selektin, aktivləşdirilmiş trombositlərin və endotel hüceyrələrinin səthində P-selektin və əksər leykositlərin səthində konstitutiv şəkildə ifadə olunan L-selektin. 16,17 Selektivlərin əsas funksiyası leykositlərin iltihab ocaqlarına tutulmasını təşviq etməkdir. Selektivlər olmadan, iltihab hüceyrələrinin cəlb edilməsi əhəmiyyətli dərəcədə azalır. 18-22 AAA formalaşması zamanı selektivlərin rolu öyrənilməmişdir. Hazırkı araşdırmada biz eksperimental AAA formalaşması zamanı selektivlərin iltihab hüceyrələrinin cəlb edilməsində rolunu qiymətləndirməyə çalışdıq.

Metodlar

Erkək Sprague-Dawley siçovulları (Charles River Laboratories, Wilmington, Mass), erkək C57BL/6 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) və L-selektin-nokaut (LKO) siçanları 18 (Dr John B. Lowe, Patologiya şöbəsi) , Michigan Universiteti Tibb Fakültəsi) tədqiq edilmişdir. Tədqiqat zamanı bütün siçovulların çəkisi 200-250 q, bütün siçanlar isə ≈20-27 q ağırlığında və 8-10 həftəlik idi. Təcrübələr Miçiqan Universitetinin Heyvanların İstifadəsi və Baxımı üzrə Universal Komitəsi (8566 siçovul, 8593 siçan) tərəfindən təsdiqlənib.

Eksperimental AAA formalaşması

Gəmiricilər 2% izofluoran inhalyasiya anesteziyası altında anesteziya edildi, orta xətt laparotomiya edildi və qarın aortası sol böyrək venasının bir az altından bifurkasiyaya qədər təcrid olundu. 10,23 Aorta diametri (AD) Image Pro Express proqram təminatından (Media Cybernetics) istifadə edərək əməliyyat mikroskopuna (Nikon) qoşulmuş Spot Insight Rəngli Optik Kamera (Diaqnostika Alətləri) ilə ölçüldü. Daha sonra aorta siçovullarda 30 dəqiqə və ya siçanlarda 5 dəqiqə donuz pankreas elastazası (xüsusi aktivlik 6,6 U/mq protein E1250 Sigma Chemical) ilə perfuziya edilmişdir. Aorta perfuziyasından sonra AD ölçüləri alındı.

Eksperimental Dizayn

Erkək Sprague-Dawley siçovul aortaları ya 1 ml izotonik salin (nəzarət) və ya 1 ml izotonik salin içində 6 U/mL ümumi donuz pankreas elastazası ilə perfuziya edilmişdir. Perfuziyadan sonra 1, 2, 4, 7 və 14-cü günlərdə duzlu perfuziyalı və elastaz perfuziyalı aortalar ölçüldü (hər bir müalicə qrupu üçün gündə n=5 və ya 6). İnfrarenal aortanın seqmentləri real vaxt rejimində polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR), Western blotting, histologiya və immunohistokimya tədqiqatları ilə gen ifadəsi və protein istehsalı üçün tədqiq edilmişdir.

C57BL/6 (n=21) və LKO (n=19) siçanları perfuziyadan əvvəl 2-ci gündə anesteziyaya məruz qaldılar və əvvəlcədən isidilmiş ventral quyruq arteriyasından yarılma yolu ilə ≈0,25 mL qan götürüldü və HEMAVET 1500FS çoxnövlü hematoloji aləti ilə analiz edildi ( CDC Texnologiyaları). Siçan aortaları 0-cı gündə elastaz (0.332 U/mL) ilə perfuziya edildi və perfuziyadan sonra 4, 7 və 14-cü günlərdə ölçüldü və yığıldı. Aorta yığımından əvvəl qan ürək ponksiyonu ilə çəkildi və əvvəllər qeyd edildiyi kimi analiz edildi. İnfrarenal aorta seqmentləri histologiya və immunohistokimya tədqiqatları üçün istifadə edilmişdir. AD artımları ilkin ölçmələrdən faiz artımı kimi bildirildi və AAA ilkin göstərici ilə müqayisədə AD-də ≥100% artım kimi müəyyən edildi.

Kəmiyyət (Real-Time) PCR

mRNT gen səviyyələri kəmiyyət PCR ilə müəyyən edilmişdir. mRNT TRIzol reagenti (Life Technologies) ilə müalicə edilərək aorta seqmentlərindən təcrid olundu və Oligo-(dT) primer və M-MLV Əks Transkriptaza (Life Technologies) ilə 3 dəqiqə 94°C, sonra 70 dəqiqə inkubasiya edilərək tərs transkripsiya edildi. 40°C. Nəticə cDNT SmartCycler kəmiyyət PCR sistemində (Cepheid) Taq Polimeraz (Promega) tərəfindən gücləndirildi. SYBR Intercalating Dye (Roche) hər bir gen üçün cDNT gücləndirmə səviyyələrini izləmək üçün istifadə edilmişdir. Primer ardıcıllıqları GenBank-dan (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) əsas siçovul mRNA ardıcıllığı əsasında Primer Premier Software (Premier Biosoft International) ilə əldə edilmişdir. Primerlər üçün ardıcıllıqlar aşağıdakı kimidir: L-selektin (hissə): 5′-AACGAGACTCTGGGAAGT-3′ (antisens): 5′-CAAAGGCTCACATTGGAT-3′ E-selektin (hissə): 5′-TGCGATGCTGCCTACTTGTG-3′ (antisense) : 5′-AGAGAGTGCCACTACCAAGGGA-3′ P-selektin (hissə): 5′-CCTGGCAAGTGGAATGAT-3′ (antisens): 5′-TAGCTCCCAATGGTCTCG-3′ β-aktin (hissə): 5′-ATGGGTCAGAAGGATTCCTATense (hissə) : 5′-CTTCATGAGGTAGTCAGTCAGGTC-3′. SmartCycler kəmiyyət məlumatları dövr həddi (Ct) kimi təqdim olunur. Bütün nəticələr β-aktin genindən istifadə edərək normallaşdırıldı. İstifadə olunan mRNT səviyyələrinin kəmiyyəti ΔCt dəyərləri ΔCt=Ct düsturu ilə hesablanmışdırhədəf gen−Ctβ-aktin. Hədəf genin β-aktin gen ifadəsinə ifadəsi hədəf gen ifadəsi/β-aktin ifadəsi=2 −(ΔCt) düsturu ilə nisbət kimi hesablanmışdır.

Western Blotting

Zülallar TRIzol Reagentindən istifadə edərək aorta seqmentlərindən təcrid olundu və 1% SDS-də həll edildi. Zülallar 7,5% -dən 12,5% -ə qədər poliakrilamid gellərində elektroforetik yolla ayrıldı və nitroselüloz membranlara ləkələndi. Qeyri-spesifik bağlanma membranı 1 saat ərzində 0,5 mol/L NaCl, 0,1% Tween 20 və 5% yağsız süd olan 20 mmol/L tris-HCl (pH 7,5) içində inkubasiya etməklə bloklandı. Elektroforez və Western blotting təchizatı BioRad-dan əldə edilmişdir. İlkin antikorlar eyni tamponda seyreltilmiş və siçan əleyhinə siçan və siçovul L-selektin monoklonal antikoru (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif) daxil etmişdir. Sonra peroksidaza ilə əlaqəli növlərə uyğun ikincili antikorlar tətbiq edildi. İmmunoreaktiv lentlər ECL kimilüminesans aşkarlama dəsti (Amersham) ilə vizuallaşdırıldı. Zülal zolaqlarının densitometrik analizi FOTO/Analyst CCD CAMERA (Fotodyne) və GEL-Pro Analyzer proqram təminatının 3.1 (Media Cybernetics) versiyasından istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. Qiymətləndirilmiş bütün zolaqlar densitometrik ölçmələrin məqbul diapazonunda idi. Bütün ölçmələr daha sonra bicinchoninic acid zülal analizi (Piers) ilə müəyyən edildiyi kimi ümumi hüceyrə zülal tərkibinə uyğunlaşdırıldı.

Histologiya və İmmunohistokimya

Yığılan aortalar təzə soyuq 4% paraformaldehiddə 16-24 saat, sonra isə 70% etanolda bərkidildi. Daha sonra seqmentlər parafinlə dolduruldu və 5 μm-lik hissələr slaydlara quraşdırıldı. İmmunohistokimyəvi tədqiqatlar üçün hazırlananlar 10 dəqiqə H2O2 otaq temperaturunda ən azı 30 dəqiqə ərzində Vectastain ABC-AP Kitindən (Vektor Laboratoriyaları) endogen peroksidaza fəaliyyətini və müvafiq seyreltilmiş serumu bloklamaq. Bölmələr sonradan 30 dəqiqə otaq temperaturunda neytrofillərin rənglənməsi üçün dovşan anti-siçovul PMN antikoru (Accurate Chemical & Scientific, Westbury, NY), siçovul makrofajı üçün siçan anti-siçovul CD68 (Serotec, Raleigh, NC) daxil olmaqla, otaq temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edildi. boyanma və siçan makrofaqlarının boyanması üçün siçovul əleyhinə Mac-3 monoklonal antikor (BD Biosciences Pharmingen, San Dieqo, Kaliforniya). Epitopun açılması, lazım olduqda, Princess model təzyiqli ocağın (Cell Marque Corporation) Trilogy istifadə edərək həyata keçirildi. Dovşan, siçan və siçovul immunoqlobulin G Vectastain ABC-AP dəstindən (Vektor Laboratoriyaları) istifadə edilən müvafiq ikincili antikorlar istifadə edildi, ardınca standart qələvi fosfataza boyanma proseduru aparıldı. Bu bölmələr hematoksilinlə yüngül şəkildə əks olundu. Ağciyər və dalaq bölmələri yuxarıda sadalanan spesifik antikorlarla neytrofillərin identifikasiyası üçün müsbət nəzarət toxuması kimi istifadə edilmişdir. Dalaq bölmələri yuxarıda sadalanan spesifik antikorlarla makrofaqların identifikasiyası üçün müsbət nəzarət toxuması kimi istifadə edilmişdir. PMNs və ya makrofaqlar nümunə təsnifatına kor olan təlim keçmiş laboratoriya texniki tərəfindən hər bir aorta bölməsinin çoxsaylı HPF-lərində sayıldı.

Məlumatların təhlili

Məlumatlar cütləşdirilməmiş tərəfindən qiymətləndirildi t kimi təyin edilmiş statistik əhəmiyyətə malik test və ya ANOVA P<0.05. ANOVA tərəfindən əhəmiyyətə çatdıqda, ayrı-ayrı qrupları müqayisə etmək üçün post hoc Tukey testindən istifadə edildi. Statistik təhlil Sigma Stat Statistical Software V2.03 (SPSS Inc) proqramından istifadə etməklə aparılmışdır.

Nəticələr

Elastaz-Perfused Aortalar 7-ci gündə anevrizmaya çevrildi

2, 4, 7 və 14-cü günlərdə salin perfuziyalı aortalarla müqayisədə siçovulların AD-ləri elastaz perfuziyalı aortalarda əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır.P<0.05 bütün vaxt nöqtələri üçün, Şəkil 1A). Elastaz-perfuziyalı siçovul aortaları 7 və 14-cü günlərdə müvafiq olaraq 263% və 434% artımla anevrizmaya çevrildi. Bundan əlavə, 7 və 14-cü günlərdə elastaz perfuziyalı AD-lər əhəmiyyətli dərəcədə fərqli idi, hər ikisi 1, 2 və 4-cü günlərdə elastaz perfuziyalı aortalardan əhəmiyyətli dərəcədə böyük idi (hamısı P<0.05 Şəkil 1A).

Şəkil 1. A, Şoran və ya elastaz perfuziyalı siçovul aortalarının baza səviyyəsindən AD-lərdə (%) artım. 2, 4, 7 və 14-cü günlərdə elastaz perfuziyalı aortalar salin perfuziyalı aortalarla müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (P<0.05). Perfuziyadan sonrakı 7 və 14-cü günlərdə müşahidə olunan ≥100% AD artımı kimi müəyyən edilən anevrizmalar. Elastaz perfuziyalı aortalar arasında hər zaman nöqtəsində ölçülərdə fərqlər əhəmiyyətli dərəcədə fərqli idi (P<0.001, ANOVA). Post hoc Tukey testi 7 və 14-cü günlər arasında əhəmiyyətli fərqləri sənədləşdirdi (P<0.05). Səhv çubuğu ±SEM-i təmsil edir. Ehtimal dəyərləri qoşalaşdırılmamış ilə müəyyən edilmişdir t-elastaz və şoran perfused aorta diametrlərini müqayisə edən test. B, β-aktin üçün korrektə edildikdən sonra elastazla perfuziya edilmiş aortalarda L-selektin mRNT-nin L-selektin mRNA-ya nisbətləri, L-selektin mRNA kimi təqdim olunur. Elastaz perfuziyalı aortalarda L-selektin mRNT səviyyələri 18 (P=0.018), 17 (P<0,001) və 8 dəfə (P=0,02) müvafiq olaraq 1, 2 və 4-cü günlərdə duzlu perfuziyalı aortalardan daha böyükdür. Azalma tendensiyası nəticədə 7 və 14-cü günlərdə hər iki qrupda L-selektin mRNT ifadəsinin aşkar olunmayan səviyyələrinə gətirib çıxardı. C, siçovul aortalarında L-selektin zülal səviyyələrinin Western blot analizi. Elastaz perfuziyalı aortaların duzlu perfuziyalı aortalarla müqayisədə L-selektin miqdarının 1,7 dəfə çox olduğu müşahidə edilmişdir.P=0,005). L-selektin protein səviyyələri ümumi protein ölçmələrinə düzəldildi. D, Şoran (S) və elastaz-perfuziyalı (E) siçovul aortalarında perfuziyadan sonra 7 gün ərzində L-selektin zülal səviyyələrinin artdığını sənədləşdirən nümayəndə Western blot.

Elastaz Perfüzyonlu Aortalar L-Selektin Səviyyələrində Əhəmiyyətli Artış nümayiş etdirdi

E- və P-selektin mRNA səviyyələrindəki fərqlər tədqiq edilən istənilən vaxtda real vaxt PCR ilə nümayiş etdirilə bilmədi (məlumatlar göstərilmir). Bunun əksinə olaraq, elastaz perfuziyalı siçovul aortalarında aorta divarı L-selektin mRNA səviyyələri 18 (P=0.018), 17 (P<0,001) və 8 dəfə (P=0,02) müvafiq olaraq 1, 2 və 4-cü günlərdə şoran perfused siçovul aortalarından dəfələrlə böyükdür (Şəkil 1B). Elastazla perfuziya edilmiş siçovul aortalarında L-selektin zülalının səviyyəsi 7-ci günə salin perfuziyalı siçovulların aortalarından 1,7 dəfə çox idi (P=0,005 Şəkil 1C, D).

L-Selektin ifadəsi və neytrofil infiltrasiyası AAA əmələ gəlməsindən əvvəldir

PMNs were significantly increased in elastase-perfused rat aortas compared with saline-perfused rat aortas at days 1, 2, 4, and 14, reaching maximum levels at day 7 (40.8 versus 0.3 PMNs/HPF, P=0.001 Table 1). PMNs peaked on day 7, coinciding with the onset of an aneurysm phenotype. Macrophage counts in the aortic wall followed a trend similar to the PMNs, with macrophages/HPF steadily rising to a peak at day 7 (17.5 macrophages/HPF in elastase-perfused rat aortas versus 1.2 macrophages/HPF in saline-perfused rat aortas, P<0.001 Table 1).

TABLE 1. PMN and Macrophage Counts in Aortic Wall of Saline- and Elastase-Perfused Rats

L-Selectin Deficiency Suppressed Experimental AAA Formation

Because increased L-selectin levels in aneurysmal aortas could be secondary to increased numbers of PMNs in the aortic wall and therefore serve only as an inflammatory marker, LKO mice were studied to more accurately characterize the role of L-selectin in AAA formation. Elastase perfusion of LKO mouse aortas resulted in significantly smaller ADs at day 14 as compared with wild-type (WT) mouse aortas (88% versus 123%, P=0.02 Figure 2). In addition, the AAA phenotype incidence was reduced in LKO mice versus WT mice (38% versus 67%). These observations appear to be associated with a reduced neutrophil infiltration into the aortic wall, with fewer PMNs at day 4 after elastase perfusion in LKO mice as compared with WT mice (4.8 PMNs/HPF versus 12.8 PMNs/HPF, P=0.02 Table 2). In addition, there were significantly fewer macrophages in LKO mouse aortas compared with WT mouse aortas at all time points (P<0.002 Table 2). PMN counts in WT mice peaked on day 4, preceding macrophages, which peaked on day 7 (Table 2, Figure 3). Of note, PMN counts were significantly greater in LKO mouse aortas as compared with WT mouse aortas at day 14 only (2.73 PMNs/HPF versus 0.96 PMNs/HPF, P=0.02 Table 2). This observation may be a secondary effect, however, because macrophage counts were elevated in WT mouse aortas and could potentially have decreased PMN counts at day 14 in the WT mouse aortas via phagocytosis. Circulating levels of neutrophils and monocytes were not different between WT and LKO mice (data not shown).

Şəkil 2. AD increases (%) at days 4, 7, and 14 in WT and LKO mice after elastase perfusion. WT mouse aortas became aneurysmal at day 14 with a mean of 123%, with LKO mouse aortas remaining below aneurysmal diameter, increasing 88%. Only 38% of LKO mice had aneurysmal aortas compared with 67% in WT mice. Error bars represent ± SEM. Probability values determined by unpaired t test comparing WT and LKO mouse ADs.

TABLE 2. PMN and Macrophage Counts in Aortic Wall in Elastase-Perfused WT and LKO Mice

Şəkil 3. Representative histological sections (original magnification ×200) of WT and LKO mouse aortas at days 4 and 7 after perfusion depicting infiltration of neutrophils and macrophages, respectively. WT mouse aorta (A) and LKO mouse aorta (B) at day 4 after perfusion stained for PMNs WT mouse aorta (C) and LKO mouse aorta (D) at day 7 after perfusion stained for macrophage antibody. Infiltrating neutrophils and macrophages (arrows). A indicates adventitia M, media.

Müzakirə

This investigation is the first to document a convincing association between L-selectin expression and AAA formation in 2 rodent models. L-selectin, by real-time PCR and protein analysis of the aortic wall, was the only member of this adhesion molecule family to be increased during rat experimental AAA formation. Furthermore, increases in L-selectin correlated with increases in neutrophil and macrophage counts in the aortic wall.

Although L-selectin is rapidly cleaved from the surface before extravasation across the vessel wall, in vitro studies have documented increased L-selectin mRNA levels and surface expression during activation. 24,25 Therefore, further studies elucidating the specific role of L-selectin after elastase perfusion of WT and LKO mouse aortas demonstrated that L-selectin deficiency results in decreased aneurysm size and incidence. In addition, peak neutrophil and macrophage counts in the aortic wall of WT mice at 4 and 7 days after perfusion, respectively, did not occur in the LKO mice.

L-selectin deficiency most likely functions to suppress AAA formation through impaired neutrophil and macrophage recruitment because neutrophils and macrophages have been documented as key participants in AAA pathogenesis and L-selectin mediates neutrophil and macrophage rolling to sites of inflammation. 5,9–14,22,26 Impaired macrophage recruitment may not be solely the result of L-selectin deficiency but could also be attributed to other mechanisms, including diminished recruitment of neutrophils, which produce proteolytic enzymes, and reactive oxygen species, which potentially stimulate the secretion of leukocyte chemotactic cytokines. 27–29 Furthermore, because the neutrophil appeared in the aortic wall before the macrophage in the WT mice, a decrease in neutrophils in the aortic wall of LKO mice most likely resulted from a lack of L-selectin. Unlike other studies, which have used WT bone marrow to rescue a phenotype in KO mice deficient in enzymes produced by bone marrow–derived cells and mesenchymal cells, bone marrow transplantation was not required in this study because L-selectin is found only on bone marrow–derived white blood cells. 8,10,17 Therefore, because the cell origin of L-selectin was known, it was not necessary to perform bone marrow transplantation. Finally, the roles of E- and P-selectin during this disease process cannot be ruled out on the basis of mRNA expression data from the initial rat experiments rather, they need to be further analyzed via the respective KO mice.

AAA pathogenesis is viewed as a multifactorial process. 30,31 Traditional concepts of this disease process implicate an initial injury to the aortic wall, followed by degradation of extracellular matrix proteins, which then serves as a catalyst for inflammation. After injury, increased cytokine production promotes further inflammatory cell recruitment and secretion of proteolytic enzymes, such as matrix metalloproteinases, and reactive oxygen species by inflammatory and mesenchymal cells. This culminates in extracellular matrix degradation, cell damage, and a proinflammatory environment that leads to aortic wall weakening and eventual AAA formation.

Most studies investigating AAA disease have focused on events taking place in the aortic wall during AAA formation. 8,10,14 A study by Ricci et al 15 was the first to focus on events initiating inflammatory cell recruitment. Antibody blockade of CD18, a subunit of the integrin adhesion molecules found on leukocytes that promote firm adhesion to the endothelial surface, decreases AAA size and macrophage recruitment after elastase perfusion. To date, the present investigation is the only one to have examined the role of selectins during AAA pathogenesis.

Limitations of the present investigation include the observation that only a partial reversal of the aneurysm phenotype occurred in the LKO mice. Clearly, other adhesion molecules, such as integrins, which were still present, also promote inflammatory cell recruitment and may play an important role. 32 In addition, it is difficult to determine the relevance of these observations to human AAA formation because many have criticized the elastase-perfusion aortic aneurysm model as an acute inflammatory aneurysm model. Furthermore, the importance of L-selectin during human AAA pathogenesis cannot be adequately assessed because L-selectin plays a functional role before AAA formation, as demonstrated by the early recruitment of inflammatory cells seen in the present study. The ability to analyze human aortic tissue before it becomes aneurysmal and to accurately predict which patients develop aneurysms is therefore not possible. Finally, the presence of L-selectin expression in human aortic aneurysm tissue would provide no direct evidence as to the mechanistic importance of L-selectin during human AAA pathogenesis because L-selectin, acting as an inflammatory marker, would be expected to be elevated.

Despite these limitations, L-selectin is required for neutrophil recruitment during the initial stages of aneurysm formation. Previous studies documenting the attenuation of ischemia-reperfusion injury during myocardial infarction 33 and thrombus resolution 34 through selectin blockade provide support for a potential L-selectin-targeted novel treatment to prevent AAA development.

This research was funded by NIH KO8 (HL67885-02), Von Liebig Award-Lifeline Foundation, the Lifeline Student Fellowship Award, the University of Michigan Summer Biomedical Research Program, and the Jobst Foundation. The authors acknowledge and thank John B. Lowe, MD, and Robert J. Kelly, PhD, for supplying the LKO mice.

Dr Wakefield and Daniel Myers have received research funding from Wyeth.

Haşiyələr


Snipping Inflammation In The Bud New Agents May Provide Relief

MADISON - Trying a new approach to controlling the process of inflammation, scientists have forged a new class of synthetic molecules that offer a new strategy for treating pain, swelling and the other hallmarks of injury or illness.

Writing this week (March 5) in the scientific journal Nature, University of Wisconsin-Madison chemist Laura L. Kiessling describes a new family of compounds that packs a novel one-two punch that effectively inhibits the cellular processes that cause us pain.

Inflammation is the body's response to irritation, infection or injury. It begins at the level of the cell when, in response to an injury or irritation, white blood cells in the bloodstream begin to stick to the cells lining the blood vessel wall. The end result of this process is inflammation and pain.

The cells stick together with the aid of a protein called L-selectin that, with many other proteins, populates the surface of cells.

"L-selectin helps mediate an inflammatory response by binding to the carbohydrate groups attached to protein molecules on the surface of an opposing cell," said Kiessling. "The many copies of L-selectin on the white blood cell surface bind with the many copies of the L-selectin-binding protein on the blood vessel, much like fingers fitting into a glove. The inflammatory response depends on the cells sticking together."

The traditional approach to controlling inflammation, through popular over-the-counter drugs such as ibuprofen, is to block events inside the cell. The synthetic molecules in Kiessling's approach act as inhibitors on the outside of the cell, attaching themselves to a L-selectin proteins and preventing the cell from linking with an opposing cell.

But synthetic molecules that only inhibit cells from linking up have to compete with the natural cell surface proteins involved in the cell-docking process, and they don't always win. The process is also reversible. The synthetic molecules, for example, can slip off their cellular targets and the L-selectin proteins can come back into play.

However, the new class of agents developed by Kiessling and colleagues Eva J. Gordon and William J. Sanders, dubbed "neoglycopolymers," also cause cells to shed the surface protein L-selectin and that prevents the cells from docking with each other.

"It's a completely different strategy," said Kiessling. "It's like doing surgery on a really small part of the cell's surface. We're removing a protein that facilitates an unwanted inflammatory response. One advantage of this strategy is that it's not reversible, so cells no longer adhere."

The neoglycopolymers work by causing the L-selectin proteins to bunch up on the cell's surface. This activates an enzyme within the cell that, like a chemical scissors, snips the L-selectin proteins from the cell surface.

When L-selectin is lost from the cell surface, the cell's docking mechanism is no longer available, and the sheared L-selectin proteins are turned loose in the bloodstream. There, the shed protein can attach themselves to the L-selectin-binding proteins on other cells, thereby acting as inhibitors to deter the inflammation response.

Does this mean an end to pain? No, said Kiessling, but the new agents suggest new ways to design far more effective tools than those now deployed in the multi-billion-dollar fight against inflammation.

Kiessling's group is now investigating whether this novel approach to removing L-selectin has potential implications for controlling other problematic proteins on the cell surface.

"We're trying to see how general the approach is and we're trying to find the enzyme that cuts L-selectin from the cell so that we can understand more about the process.

The work of Kiessling's group was funded by the National Institutes of Health and the Mizutani Glycoscience Foundation.

Hekayə Mənbəsi:

Materiallar tərəfindən təmin edilmişdir University Of Wisconsin-Madison. Qeyd: Məzmun üslub və uzunluğa görə redaktə edilə bilər.


Simon Lab illuminates a non-classical selectin signalling pathway for neutrophils

Neutrophils are a circulating “first responder” white blood cell that protects the host from infection and help to heal injured tissues. They can access any site in the body by travelling in the blood stream and use specialized adhesion receptors to capture and migrate through the wall of blood vessels at the site of the injury.

Chemical signals instruct neutrophils to “roll” through the vasculature and activate anchor molecules called integrins. Scientists have discovered some of chemical signaling pathways, but others are less well known, especially those critical for targeting white cells under different disease conditions.

One of the classical pathways involves L-selectin, a type of glycoprotein that allows neutrophils to “roll” and signals neutrophils to initiate the next step, which is formation of stable β2-integrin bonds that mediate shear resistant cell arrest. L-selectin (on the neutrophil) binding by E-selectin (on the endothelium–the surface of the cell) results in the secretion of a protein that primes the integrin on the neutrophils. This allows neutrophils to form an impermanent attachment with the endothelium.

However, L-selectin/E-selectin are also shear sensitive, meaning that at specific blood flow rates the bonds function analogous to a Chinese finger trap– the more force you apply the stronger the bond between the cell and vessel wall. To better understand the role played by E-selectin, first author Vasilios Morikis, a graduate student in the Simon Lab, used Rivipansel to block the ability of E-selectin to form these force resistant bonds with L-selectin while still allowing for binding. They found that by blocking L-selectin, the E-selectin was unable to form the strong bonds required for adhesion and transport through the lining of the blood vessel.

The paper was published and featured in the November issue of the American Society of Hematology's Blood Journal.

Further study revealed that once force was applied to receptor clusters between E- and L-selectin bonds, a chemical signal (within the neutrophil) was transmitted from the outside-in that then completed a circuit to activate β2-integrin, pushing it one step further toward the state where the neutrophil can bind strongly to the endothelium, stopping the neutrophil from rolling and committing it to migrate into the tissue.

“Our work describes a non-classical pathway through which selectin signalling activates the cell,” says Morikis. “It enhances our knowledge of selectin mediated pathways for neutrophil activation.

The paper was published in the November issue qan, which also selected an image from the article as a cover image and included it in an editorial review.


MÜZAKİRƏ

Ectodomain shedding is critical for regulating the function of membrane proteins such as TNF-α and EGFR ligands. Because dysregulation of EGFR signaling occurs in diseases such as cancer, and TNF-α is a causative factor in rheumatoid arthritis, it is important to understand the underlying proteolytic machinery. Here, we used the ectodomain shedding of TNF-α, TGF-α, and other membrane proteins such as L-Selectin to identify ADAM10 as a sheddase that can, in principle, release these proteins almost as efficiently as their primary sheddase, ADAM17, but only in Adam17−/− cells stimulated with ionomycin. Nevertheless, despite the ability of ADAM10 to efficiently shed many substrates of ADAM17 in Adam17−/− cells, ADAM17 nevertheless clearly emerged as the functionally dominant enzyme, or “principal sheddase” for these substrates when both enzymes were present.

An important criterion for identifying ADAM10 as an efficient sheddase of ADAM17-substrates in Adam17−/− cells was its “fingerprint,” defined as its characteristic response to activators and inhibitors of ectodomain shedding (Overall and Blobel, 2007). ADAM10 emerged as the relevant IM-stimulated sheddase for TGF-α and other membrane proteins in Adam17−/− cells by all criteria we could apply, including its response to an ADAM10-selective metalloprotease inhibitor (GI), ADAM10-shRNA, and dominant-negative ADAM10. In Adam10/17−/− double knockout cells, IM-stimulated shedding of TGF-α could be rescued by both ADAM10 and ADAM17, demonstrating that calcium influx activates both ADAMs. However, PMA-dependent shedding of TGF-α could only be rescued by ADAM17, corroborating that only ADAM17 responds to short-term stimulation with PMA. Interestingly, IM-stimulated ADAM10 is sensitive to low nanomolar concentrations of TIMPs 1, 2, and 3 in cell-based assays, whereas purified soluble ADAM10 is inhibited by TIMPs 1 and 3, but not TIMP2, in vitro (Amour və b., 2000) (Supplemental Figure 3). Evidently, ADAM10 has a different inhibitor profile in cell-based assays compared with biochemical assays. Because MMP7 is a known sheddase of TNF-α and other membrane proteins (Powell və b., 1999 Haro və b., 2000 Li və b., 2002 Lynch və b., 2005), we also ruled out its involvement in IM-stimulated shedding by using Mmp7−/−/Adam17−/− double-knockout cells (Supplemental Figure 4). Moreover, following up on a previous report of an aminophenylmercuric acetate (APMA)-activated TGF-α sheddase in CHO cells lacking functional ADAM17 (Merlos-Suarez və b., 2001), we showed that ADAM10-dependent TGF-α shedding can be activated by APMA in Adam17−/− cells (Supplemental Figure 5). Finally, we confirmed that TGF-α released by ADAM10 retains its biological activity (Supplemental Figure 6).

The stimuli described above, such as PMA, IM, and APMA, are pleiotropic and not physiological, so we also evaluated shedding activated by the P2X7 nucleotide receptor, which is involved in many physiological aspects of the immune response (Chen and Brosnan, 2006 Moore and MacKenzie, 2007). Təcrübələr Adəm−/− mEFs as well as ADAM17-deficient primary B cells clearly established that both ADAMs 10 and 17 can be stimulated by the P2X7R in adherent fibroblasts and nonadherent primary B cells. Moreover, ADAM10 stimulated via P2X7R was able to shed substrates such as TNF-α, ICAM, and L-Selectin. Nevertheless, selective ADAM inhibitors confirmed that ADAM17 is the major sheddase for TNF-α, TGF-α, HB-EGF, and ICAM in P2X7R-stimulated CHO cells, where both ADAMs 10 and 17 are present. So, the ability of ADAM10 to shed substrates such as TNF-α or TGF-α after activation of P2X7R is also only evident in the absence of ADAM17.

Interestingly, acute inhibition of ADAM17 with an ADAM17-selective inhibitor blocked stimulated shedding of ADAM17 substrates from wt mEFs or CHO cells, whereas chronic inhibition of ADAM17 generated conditions that mimicked those in Adam17−/− cells, i.e., ADAM10 could take over shedding of ADAM17 substrates. These observations could be relevant for chronic and specific inhibition of ADAM17 in patients. A compensatory up-regulation of ADAM10 activity during chronic treatment with SP26 is unlikely, because there was no detectably increase in shedding of the ADAM10-substrate BTC. Perhaps chronic inactivation of ADAM17 leads to an accumulation of its substrates, which then become more accessible to ADAM10, possibly by “spilling over” into a compartment where ADAM10 is most active. The results obtained in primary B cells with endogenously expressed L-Selectin are consistent with this interpretation, because higher levels of L-Selectin are seen in the absence of ADAM17. Moreover, activation of these cells with IM or ATP does not lead to complete consumption of L-Selectin in Adam17−/− cells, suggesting that a subpopulation of L-Selectin is not accessible to ADAM10, even in the absence of ADAM17.

We predict that the results obtained with TGF-α, TNF-α, and several other membrane proteins (Supplemental Figure 1) are likely representative for many, if not most or all, proteins whose constitutive and PMA-stimulated shedding depends on ADAM17. However, although ADAM10 can, in principle, process substrates of ADAM17, it nevertheless normally does not when both enzymes are present, and a role for ADAM10 as a secondary sheddase has yet to be demonstrated in vivo. For example, ADAM10 cannot efficiently compensate for the loss of ADAM17 with respect to activating the EGFR during mouse development (Peschon və b., 1998 Jackson və b., 2003 Sternlicht və b., 2005), or in terms of generating soluble TNF-α in a mouse model for endotoxin shock (Bell və b., 2007 Horiuchi və b., 2007a). Therefore, we predict that ADAM17 will also emerge as the physiologically or pathologically more relevant sheddase of other membrane proteins that can be shed by both ADAM10 and 17, such as the amyloid precursor protein (Buxbaum və b., 1990 Lammich və b., 1999) and Klotho (Chen və b., 2007). In contrast, we found no evidence that ADAM17 can substitute as a sheddase for substrates of ADAM10 in Adam10−/− cells, at least in the presence of the stimuli used here. Finally, it should be noted that other ADAMs or non-ADAM metalloproteinases may also play significant roles as sheddases in other cell types or under different conditions than those tested here.

In summary, loss of function studies with cells lacking ADAM10 or ADAM17 or both have provided new insight into the principal components of a general, yet differentially regulated cellular shedding machinery for TGF-α, HB-EGF, TNF-α, L-Selectin, and several other membrane proteins. Because ectodomain shedding is increasingly being recognized as a critical signaling switch that affects the function of a large number of membrane proteins, these results are likely to provide a framework for understanding the regulation of processing of other membrane proteins by ADAMs 10 and 17. Based on our findings, we hypothesize that the substrate repertoire of ADAM10 can, in principle, overlap with that of ADAM17 in cells activated with IM, APMA or via the P2X7R. Nevertheless, identifying ADAM10 as an alternative sheddase for ADAM17 substrates is only relevant in the case of the deletion or the chronic inhibition of ADAM17, and for stimuli that will normally activate ADAM10. Clearly, defining the individual fingerprints of these two major sheddases under various conditions is a prerequisite for probing the mechanism underlying their regulation under specific physiological and pathological conditions. Moreover, it will be important to consider the implications of these results for the use of selective ADAM inhibitors to treat human diseases.


Videoya baxın: WBCs Count physiological experiment تجربة تعيين عدد كرات الدم البيضاء الفسيولوجي (Oktyabr 2022).