Məlumat

Eukaryotik hüceyrələrdə transfeksiya olunmuş xətti DNT nə qədər sabitdir?

Eukaryotik hüceyrələrdə transfeksiya olunmuş xətti DNT nə qədər sabitdir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən ədəbiyyatdan istinadla bilmək istərdim ki, məməli hüceyrələrində transfeksiya edilmiş xətti dsDNT-nin yarı ömrü nə qədərdir. Məsələn, mən insan hüceyrələrini heç bir replikasiya və ya transkripsiya siqnalı olmayan PCR məhsulu ilə (500-2000 bp) transfeksiya etsəm, o hüceyrə tərəfindən nə qədər sürətlə pozulacaq (saatlar, günlər, həftələr... )? DNT sitozolda və ya nüvədə olarsa, yarı ömründə fərq varmı?


Biotexnologiyanın Elmi Əsasları

Mücərrəd

Transfeksiya müxtəlif kimyəvi və ya fiziki üsullardan istifadə etməklə nuklein turşusunun eukaryotik hüceyrələrə daxil edilməsi prosesidir. Viral olmayan bir çatdırılma sistemi olaraq, transfeksiya populyarlıq qazandı. Rekombinant insan terapevtik zülallarının kifayət qədər miqdarda sərfəli və sürətli istehsalı biofarmasevtika sənayesində qarşıya çıxan problemlərdən biri olmuşdur. Müvəqqəti hüceyrə transfeksiyası sabit transfektantların hazırlanmasının uzun və bahalı prosedurundan qaçan bu nəticələrə nail olmaqla problemi qarşıladı. Bu günə qədər transfeksiya texnologiyası terapevtik, gen terapiyası və peyvənd tətbiqləri üçün r-zülallar, antikorlar və viral vektorlar istehsal etmək üçün də tətbiq edilmişdir.

Bu məqalə klassik transfeksiya üsullarını təsvir edir və ən məşhur iki metodu təfərrüatlandırır: kalsium fosfat çökdürmə üsulu və polietilenimin (PEI)-DNT kondensasiyası üsulu. Hər iki üsul ankrajdan asılı, eləcə də asma böyüyən hüceyrə xətlərindən istifadə etməklə r-zülalların istehsalı üçün tətbiq olunur. Bununla belə, tədqiqatçılar arasında transfeksiya texnologiyasını daha da təkmilləşdirmək və sadələşdirilmiş geniş miqyaslı serumsuz süspansiyon mədəniyyətlərində r-zülalları istehsal etmək üçün PEI əsaslı metoda üstünlük verilmişdir. Genişmiqyaslı transfeksiya texnologiyasındakı son nailiyyətlər nəzərdən keçirilir və optimallaşdırma üsulları qeyd olunur ki, bunlara hüceyrə xəttinin seçimi, plazmid hazırlığı, mühit və transfeksiya reagentinin seçimi daxildir.


Nəzəriyyə

Transfeksiya yad molekulların və genetik materialların eukaryotik hüceyrəyə daxil edilməsi prosesidir. Transfeksiya termini ümumiyyətlə eukaryotik hüceyrələrdə genin ötürülməsinin virus olmayan üsulları üçün istifadə olunur. Transfeksiya hüceyrədə gen funksiyasını və zülal ifadəsini öyrənmək üçün mühüm tədqiqat vasitəsidir. Transfeksiya adətən bioloji laboratoriyalarda gen ifadəsinin modulyasiyası, gen funksiyası, gen tənzimlənməsi, zülal ifadəsi, biokimyəvi xəritəçəkmə, mutasiya analizi və zülal istehsalı üçün istifadə olunur.

Tətbiqdən asılı olaraq iki əsas transfeksiya növü mövcuddur: keçici transfeksiya və stabil transfeksiya. Keçici transfeksiya yad DNT-nin mitozdan əvvəl və ya mitoz zamanı hüceyrə tərəfindən xaric edildiyi transfeksiyadır. Beləliklə, yad DNT yeni hüceyrəyə keçmir və onlar təsirlənmir. Halbuki stabil transfeksiyada yad DNT-nin ya əlavə etməklə, ya da yeni DNT zəncirini yaratmaq üçün köhnə DNT-ni əvəz etməklə hüceyrənin orijinal DNT-sinin hissələrinə çevrildiyi transfeksiya formasıdır. Bu nadir bir hadisədir, həmçinin yeni material daxil olduqdan sonra, lakin hüceyrə yeni hüceyrələr əmələ gətirməzdən əvvəl onu aradan qaldırır.


Strategiyalara əsasən, tansfeksiya üsullarını üç qrupa bölmək olar
1. Daşıyıcı molekullara əsaslanan üsullar
2. Nuklein turşularını birbaşa sitoplazmaya çatdıran üsullar
3. Viral vektorlardan istifadə edən üsullar

Kalsium fosfatdan istifadə edərək transfeksiya mədəni məməli hüceyrəsinə yad molekulun daxil edilməsi üçün hazırlanmış daha əvvəlki üsullardan biri idi. Bu üsulda plazmid DNT-ni çatdırmaq üçün HEPES-tamponlu şoran məhlulu olan kalsium xlorid istifadə olunur. Nuklein turşularını bağlamaq qabiliyyətinə malik lipid və polimer əsaslı daşıyıcı molekulların inkişafı bu birləşmələrin transfeksiyada uyğunlaşmasına səbəb olmuşdur. Bu birləşmələrdən əmələ gələn lipozomlar hüceyrə membranları ilə birləşməyə qadirdirlər və bunun vasitəsilə yeni hüceyrəyə bağlı DNT və ya RNT çatdıra bilirlər. Son zamanlarda inkişaf etmiş qeyri-liposom və bəzi polimerlər DNT və ya RNT ilə kompleks əmələ gətirmək qabiliyyətinə malikdir və misellər əmələ gətirmək potensialına malikdir. Transfeksiya reaksiyası adətən sulu şəraitdə həyata keçirilir ki, bu da amfifilik birləşmənin lipofil hissəsinin içərisində ekzogen nuklein turşularının yerləşdiyi misel nüvəsini meydana gətirməsinə kömək edir. Liposomlara əsaslanan transfeksiyaya davamlı olan hüceyrə xətlərində yüksək transfeksiya effektivliyinə nail olmaq olar.


Ənənəvi transfeksiya üsulları ilə bağlı olan bəzi problemlərə kalsium fosfatla birlikdə çökdürmə, DEAE-dekstran, polibrene və elektroporasiya kimi DNT-nin çatdırılmasının aşağı effektivliyi, zəif reproduktivlik, hüceyrə toksikliyi və əlverişsizliyi daxildir. Kationik lipid reagentinin vasitəçiliyi ilə həyata keçirilən transfeksiya müxtəlif eukaryotik hüceyrələrdə yüksək və əvvəllər əlçatmaz transfeksiya effektivliyi verir. Onu yerinə yetirmək sadədir və ardıcıl olaraq təkrarlanan nəticələri təmin edir. Üstəlik, normal olaraq başqa üsullarla transfeksiyaya davamlı olan bir sıra hüceyrə xətləri kationik lipid reagentlərindən istifadə etməklə uğurla transfeksiya edir.


Beləliklə, katyonik lipid reagentlərindən istifadə edərək çatdırılma prinsipi transfeksiya üçün neytral liposomlardan istifadə etmək cəhdlərindən fərqlənir. Kationik lipid reagentləri ilə DNT məhlulu qəsdən liposomların içərisinə daxil edilmir, əksinə mənfi yüklü DNT müsbət yüklü liposomlara kortəbii olaraq bağlanaraq DNT-kationik lipid reagent komplekslərini əmələ gətirir.


Transfeksiya reagentləri tədqiqatçıların DNT-ni mədəniyyətdəki hüceyrələrə daxil etmək üçün istifadə edə biləcəyi DNT üçün daşıyıcıdır. Lipofektamin (invitrogen) kimi müxtəlif agentlərdən istifadə edərək yapışan hüceyrələrin transfeksiyası plazmid və ya reagentin miqdarının və hüceyrə sayının optimallaşdırılmasını və hüceyrə növü üçün spesifik olmasını tələb edir. Bu molekullar DNT-ni hədəf hüceyrələrə daşımaq və onu genomlarına daxil etmək üçün müxtəlif yollarla işləyə bilər. Tipik proses, istədiyiniz DNT-nin reagentlə qarışdırılmasını, mədəniyyətdəki hüceyrələrə əlavə edilməsini, inkubasiya edilməsini və sonra yeni DNT-ni ehtiva edən onları müəyyən etməyi əhatə edir.


Viral DNT vektorlarının istifadəsi, eləcə də materialın deqradasiyası riskini azaltmaq üçün istənilən DNT-nin birbaşa yeridilməsi kimi mikroinyeksiya kimi mexaniki üsullar. Gen silahları DNT transfeksiyası üçün başqa bir məşhur vasitədir.


Stabil Transfeksiya nədir

Stabil transfeksiya yad genin eukaryotik hüceyrənin genomuna ya xromosoma, ya da xromosomdan kənar epizoma inteqrasiya olunduğu transfeksiyanın başqa bir növüdür. Buna görə də stabil transfeksiyanın əsas xüsusiyyəti odur ki, o, yad genin nəsillərə keçməsinə imkan verir. Üstəlik, genomun inteqrasiyasına görə, xarici gen hüceyrə xətti daxilində daha uzun müddət davam edir və yüksək və sabit gen ifadəsini verir.

Şəkil 2: Stabil Transfeksiya

Bundan əlavə, stabil transfeksiyada inteqrasiya konstruksiyasında genomun uğurlu inteqrasiyasını və həmçinin gen ifadə səviyyəsini müəyyən etmək üçün seçilə bilən istehsalçılar var.


Eukaryotik hüceyrələrdə transfeksiya olunmuş xətti DNT nə qədər sabitdir? - Biologiya

Transfeksiya nuklein turşularının virus olmayan üsullarla hüceyrələrə yeridilməsi prosesidir. "transformasiya" termini bakteriya və qeyri-heyvan eukaryotik hüceyrələrdə virus olmayan DNT transferini təsvir etmək üçün üstünlük verilir "transduksiya" tez-tez virus vasitəçiliyi ilə DNT-ni təsvir etmək üçün istifadə olunur.
Tam məqalə >>>

Stabil Transfeksiya. Keçici və Stabil Transfeksiya . təsiri a sabit və ya keçici transfeksiya, transfeksiya edilmiş genetik material.
Tam məqalə >>>

Altogen Biosistemlər - Hüceyrə Transfeksiya Resurs. Keçici və Stabil Transfeksiya. Xərçəng Hüceyrə Xətləri və İlkin Hüceyrələr. RNT müdaxiləsi (RNAi).
Tam məqalə >>>

Ensiklopediya haqqında məlumat Stabil Transfeksiya . Yalnız a vasitəsilə sabit transfeksiya qüsurlu bir gen daimi olaraq dəyişdirilə bilər. .
Tam məqalə >>>

Hüceyrə haqqında ensiklopediya məlumatı Transfeksiya . Transfeksiya ya keçicidir, ya da sabit təbiətdə. . mitoz zamanı və adlanır sabit transfeksiya. .
Tam məqalə >>>

Nucleofector Texnologiyası və Stabil Transfeksiya . Üçün əsas tətbiqlər sabit transfeksiya gen funksiyasının təhlili və .
Tam məqalə >>>

Nucleofector Technology və Stabil Transfeksiyalar. Ev > Proqramlar > Stabil Transfeksiya > Texnologiya. RNAi. Protein istehsalı.
Tam məqalə >>>

Biotibbi tələbələr və tədqiqatçılar üçün metodlar, protokollar, texnikalar, dərs vəsaitləri və digər məlumatlar. istehsalı üçün sabit hüceyrə xətləri. .
Tam məqalə >>>

. Promega Protokolları və Tətbiqləri Bələdçisi ən aktual məlumat üçün mənbədir Transfeksiya. . Keçici İfadəyə qarşı Stabil Transfeksiya .
Tam məqalə >>>

üçün ümumiyyətlə faydalıdır sabit transfeksiya öyrənir ki. həm keçici, həm də sabit transfeksiya a. müxtəlif hüceyrə növləri. .
Tam məqalə >>>

transfeksiya n. Təmizlənmiş viral nuklein turşusu ilə hüceyrənin infeksiyası, . üçün ümumi agent sabit transfeksiya G418 kimi tanınan Geneticindir.
Tam məqalə >>>

2 Stabil və keçici transfeksiya. 3 Proqramlar. 4 Metodlar. 5 . Stabil və . üçün ümumi agent sabit transfeksiya Geneticin də tanınır.
Tam məqalə >>>

Lipofeksiya daxildir, transfeksiya problemlərin aradan qaldırılması və forum müzakirə mövzuları . üçün ümumi agent sabit transfeksiya G418 kimi tanınan Geneticindir.
Tam məqalə >>>

Bu transfeksiya reagent üstün alternativdir. Transfeksiya Reagent hər ikisində əla performans təmin edir sabit və keçici transfeksiya -nin.
Tam məqalə >>>

. Transfeksiya. 3 Stabil shRNA Transfeksiya . Stabil shRNA Transfeksiya . Stabil ifadəyə iki amil təsir edə bilər: The transfeksiya istifadə olunan üsul.
Tam məqalə >>>

Stabil,transfeksiya,bioloji,biologiya lüğəti,biologiya terminologiyası,biologiya terminləri,biologiya abbreviaturaları. Stabil transfeksiya: forması transfeksiya .
Tam məqalə >>>

Altogen Müqavilə Xidmətləri təklif edir sabit hüceyrə xətti generasiyası və RNT hüceyrəsi. Transfeksiya Resurs: RNAi proqramları, sabit və keçici transfeksiya, .
Tam məqalə >>>

Stabil transfeksiya genetik məruzəçi ilə istifadə edilə bilər. müvəqqəti və sabit transfeksiya bütün hüceyrə növlərindən. . sabit transfeksiya, xətti DNT nəticələri.
Tam məqalə >>>

Xüsusi hüceyrə xətləri ilə bağlı suallarınız var? Alimlərimizdən soruşun. Pulsuzdur! . və ya transfeksiya a ilə nəticələnəcək reagent mövcuddur sabit transfeksiya hüceyrələrimdən? .
Tam məqalə >>>


Ümumi Transfeksiya Protokolu

Hüceyrələrin Transfeksiyaya Hazırlanması

Tripsin istifadə edərək yapışan hüceyrələrin çıxarılması

Subkulturasiyadan və ya hüceyrə saymadan əvvəl hüceyrələrin tripsinizləşdirilməsi uğurlu hüceyrə mədəniyyəti üçün vacib bir texnikadır. Hüceyrələri keçərkən aşağıdakı texnika ardıcıl olaraq yaxşı işləyir.

Tələb olunan materiallar:

  • 1X tripsin-EDTA məhlulu
  • 1X PBS və ya 1X HBSS
  • subkulturasiya ediləcək yapışqan hüceyrələr
  • serum və ya böyümə faktorları və ya hər ikisi əlavə edilmiş müvafiq böyümə mühiti (məsələn, DMEM).
  • mədəniyyət qabları, kolbalar və ya çoxqulu boşqablar, lazım olduqda
  • hemositometr
  1. 1X PBS və ya 1X HBSS kimi kalsium və maqneziumsuz duz məhlulunda steril tripsin-EDTA məhlulu hazırlayın. 1X məhlulu gələcək istifadə üçün dondurulub əridilə bilər, lakin hər donma-ərimə dövrü ilə tripsin aktivliyi azalacaq. Tripsin-EDTA məhlulu 4°C temperaturda 1 aya qədər saxlanıla bilər.
  2. Toxuma mədəniyyəti qabından mühiti çıxarın. Hüceyrə monolayerini örtmək üçün kifayət qədər PBS və ya HBSS əlavə edin: 150 mm-lik kolba üçün 2 ml, 100 mm-lik boşqab üçün 1 ml. Solüsyonu bərabər paylamaq üçün plitələri silkələyin. Çıxarın və yuma təkrarlayın. Son yuma çıxarın. Hüceyrə monolayerini örtmək üçün kifayət qədər tripsin məhlulu əlavə edin.
  3. Plitələri hüceyrələr ayrılmağa başlayana qədər (adətən 1&ndash2 dəqiqə) 37°C inkubatora qoyun.
  4. Şüşəni inkubatordan çıxarın. Qalan yapışan hüceyrələri çıxarmağa kömək etmək üçün avuç içi ilə mədəni qabın dibinə və yanlarına kəskin şəkildə vurun. Bütün hüceyrələrin böyümə səthindən qopduğunu yoxlamaq üçün hüceyrələrə mikroskop altında baxın. Lazım gələrsə, hüceyrələr əlavə 1&ndash2 dəqiqə ərzində inkubatora qaytarıla bilər.
  5. Bütün hüceyrələr ayrıldıqda, tripsini təsirsiz hala gətirmək üçün hüceyrələrə serum olan mühit əlavə edin. Hüceyrə yığınlarını parçalamaq üçün hüceyrələri yumşaq bir şəkildə pipetləyin. Hüceyrələr hemositometrdən istifadə edilərək hesablana bilər, subkulturasiya üçün təzə plitələrə paylanır və ya hər ikisi.

Tipik olaraq, hüceyrələr ertəsi gün transfeksiyaya hazırlamaq üçün subkulturasiya edilir. Subkultura maraq hüceyrələrini transfeksiya üçün arzu olunan birləşməyə gətirməlidir. Ümumi təlimat olaraq, 24 quyuluq boşqabda hər quyuya 5 &x10⁴ hüceyrə və ya 60 mm mədəniyyət qabı üçün 5,5 &x10⁵ hüceyrə boşqab qoyun.

Transfeksiya günündə 80% birləşmə. Müxtəlif ölçülü lövhələr üçün hüceyrə nömrələrini mütənasib olaraq dəyişdirin (Cədvəl 3-ə baxın).

Cədvəl 3. Hüceyrə artımı üçün mədəniyyət lövhələrinin sahəsi.

Plitənin Ölçüsü Böyümə sahəsi a (sm²) Nisbi ərazi b
24 - quyu 1.88 1X
96 - quyu 0.32 0.2X
12 - quyu 3.83 2X
6 - quyu 9.4 5X
35 mm 8.0 4.2X
60 mm 21 11X
100 mm 55 29X

a Bu məlumat Corning® mədəniyyət yeməkləri üçün hesablanmışdır.
b Nisbi sahə optimallaşdırma tədqiqatları üçün tövsiyə olunan 24 quyulu lövhənin ümumi artım sahəsinin amili kimi ifadə edilir. Düzgün örtük sıxlığını müəyyən etmək üçün bu amillə 5 &x10⁴ hüceyrəni vurun.

Transfeksiya üçün DNT-nin hazırlanması

Nukleazlar, RNT və kimyəvi maddələrdən təmizlənmiş yüksək keyfiyyətli DNT uğurlu transfeksiya üçün seçilmiş transfeksiya reagenti qədər vacibdir. Transfeksiya keyfiyyətli DNT-nin təmizlənməsi haqqında məlumat üçün DNT-nin təmizlənməsi üzrə Protokollar və Tətbiqlər Bələdçisi bölməsinə baxın.

ViaFect&Trade Reagentindən istifadə edən Protokol nümunəsi

Biz hər bir hüceyrə xətti üçün transfeksiya şəraitini optimallaşdırmağı tövsiyə edirik. Optimallaşdırılmış transfeksiya parametrləriniz varsa, eksperimental transfeksiyalarınız üçün empirik olaraq müəyyən edilmiş şərtlərdən istifadə edin.

Transfeksiya parametrlərini optimallaşdırmamağı seçsəniz, aşağıda tövsiyə olunan ümumi şərtlərdən istifadə edin.

Tələb olunan materiallar:

  • transfeksiya edilən hüceyrə növünə uyğun zərdablı hüceyrə mədəniyyəti mühiti
  • kompleks formalaşması üçün zərdabsız hüceyrə mədəniyyəti mühiti (məsələn, Opti-MEM® I azaldılmış serum mühiti)
  • 96-quyu və ya digər mədəniyyət lövhələri
  • U- və ya V-dibli seyreltmə lövhələri və ya mikrosentrifuqa boruları

96 quyulu boşqabın hər quyusuna əlavə ediləcək transfeksiya kompleksinin (orta, DNT və ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti) ümumi həcmi 5&ndash10&mul təşkil edir. Aşağıdakı protokol istifadə edilən ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti:DNT qarışığının həcmindən asılı olaraq təxminən 10&ndash20 quyunun transfeksiyası üçün təlimatdır. Əlavə quyular üçün həcmləri müvafiq olaraq miqyaslayın.

  1. Steril boruya və ya U- və ya V-alt boşqaba, otaq temperaturuna qədər əvvəlcədən isidilmiş 90&ndash99&mul serumsuz mühit əlavə edin ki, DNT əlavə edildikdən sonra yekun həcm 100&mul olsun. Ortaya 1&mq plazmid DNT əlavə edin və qarışdırın. 3:1 ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti:DNT nisbəti üçün 3&ml ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti əlavə edin və dərhal qarışdırın.
  2. ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti:DNT qarışığını otaq temperaturunda 5&ndash20 dəqiqə inkubasiya edin.
    Könüllü: İnkubasiya dövrü olmayan hüceyrələrə qarışığı əlavə edin.
    Qeyd: Daha uzun inkubasiyalar transfeksiyalara mənfi təsir göstərə bilər.
  3. Böyümə mühitində 100 ml hüceyrə olan 96 quyuluq boşqaba hər quyuya 5&ndash10ml ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti:DNT qarışığı əlavə edin. Başlanğıc nöqtəsi olaraq 10 ml qarışıq təklif edirik. 10&ndash30 saniyə ərzində pipetləmə və ya boşqab çalkalayıcıdan istifadə edərək yavaş-yavaş qarışdırın. Hüceyrələri 24&ndash48 saat ərzində inkubatora qaytarın.
    Qeyd: Ümumi böyümə mühitinin həcmi quyu formatından və laboratoriyanızın ümumi təcrübələrindən asılı olaraq dəyişə bilər.
  4. Müxbir geninə uyğun bir analizdən istifadə edərək transfeksiyanın effektivliyini ölçün. Keçici transfeksiya üçün hüceyrələr adətən transfeksiyadan 24&ndash48 saat sonra təhlil edilir.

Lipid Reagentləri ilə Transfeksiyanın Optimallaşdırılması

Əvvəlki bölmələrdə biz transfeksiya müvəffəqiyyətinə təsir edən amilləri müzakirə etdik. Burada bir transfeksiya reagenti ilə müəyyən bir hüceyrə xəttinin transfeksiyasını optimallaşdırmaq üçün bir üsul təqdim edirik. ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti kimi daha müasir lipid əsaslı reagentlər üçün ilkin olaraq 96 quyu boşqabının hər quyusunda 50&ndash100 ng DNT-ni reagentdə sınaqdan keçirməyi tövsiyə edirik: Yapışqan hüceyrə xətləri üçün 3:1 və ya 4:1 DNT nisbəti və ya 2:1 asma hüceyrə xətləri üçün. Şəkil 4 tipik optimallaşdırma matrisini təsvir edir. ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti:DNT kompleksini hazırlayarkən, inkubasiya müddəti optimallaşdırma tələb edə bilər, biz tövsiyə edirik 5&ndash20 dəqiqə.

Şəkil 4. ViaFect&trade Transfeksiya Reagentindən istifadə edərək transfeksiyanın optimallaşdırılması. TF-1 hüceyrələri, ağ 96 quyulu analiz boşqabında hər quyuda 30,000 hüceyrədə antibiotiksiz böyümə mühitinə yerləşdirildi və CMV- ilə transfeksiya edildi.luc2 müxtəlif lipidlərdən istifadə edən plazmid (ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti):DNT nisbətləri. DNT konsentrasiyası Opti-MEM® I reduksiya edilmiş zərdab mühitinin 100 ml-də 1 mq-da sabit saxlanıldı və göstərilən nisbətləri əldə etmək üçün ViaFect&trade Transfeksiya Reagentinin miqdarı dəyişdirildi. Daha sonra 96 ​​quyu boşqabdakı hüceyrələrə 5 və ya 10 ml transfeksiya kompleksi əlavə edildi. Transfeksiyadan iyirmi dörd saat sonra ONE-Glo&trade + Tox Luciferase Assay həyata keçirildi. Qeyd edək ki, 0:1 DNT ilə mənfi nəzarətdir, lakin lipid yoxdur. Bu nəticələr göstərir ki, bu xüsusi hüceyrə xətti üçün 2:1 ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti:DNT nisbəti optimal nəticələr verdi.

Ənənəvi kationik lipid reagentləri üçün lipid reagentinin DNT-yə iki yük nisbətində (2:1 və 4:1 Şəkilə bax) müxtəlif miqdarda transfeksiya edilmiş DNT-ni (24 quyulu boşqabda hər quyu üçün 0,25, 0,5, 0,75 və 1 µg) sınamağı tövsiyə edirik. 5). Bu qısa optimallaşdırma serumsuz şəraitdə 1 saatlıq transfeksiya intervalından istifadə etməklə həyata keçirilə bilər. Yapışqan hüceyrələrlə qısa optimallaşdırma üçün hər reagent üçün bir 24 quyu mədəniyyət lövhəsi tələb olunur (Hər DNT miqdarına üç təkrar).

Şəkil 5. Katyonik lipidlərin transfeksiya şərtlərinin ilkin optimallaşdırılması üçün təklif olunan örtük formatı.

Əlavə yükləmə nisbətlərini, vaxt nöqtələrini və ilkin optimallaşdırma tədqiqatları zamanı optimal olan DNT miqdarında serum tərkibli mühitin təsirlərini yoxlamaq üçün daha ətraflı optimallaşdırma aparıla bilər. Transfeksiya intervalı üçün bir saat və ya iki saat bir çox hüceyrə xətti üçün optimaldır. Bununla belə, bəzi hallarda optimal gen transferinə nail olmaq üçün yük nisbətlərini və transfeksiya intervallarını bu diapazonlardan kənarda yoxlamaq lazım gələ bilər.

Bəzi transfeksiya üsulları inkubasiyadan sonra mühitin reagentlə çıxarılmasını tələb edir, digərləri isə tələb etmir. Sisteminiz üçün hansı metodun uyğun olduğunu öyrənmək üçün seçilmiş transfeksiya reagentini müşayiət edən texniki ədəbiyyatı oxuyun. Bununla belə, transfeksiya zamanı həddindən artıq hüceyrə ölümü baş verərsə, transfeksiya reagentinə məruz qalma vaxtının azaldılmasını, hüceyrələrə əlavə olunan DNT və reagentin miqdarının azaldılmasını, əlavə hüceyrələrin örtülməsini və inkubasiya dövründən sonra reagentin çıxarılmasını və tam mühitin əlavə edilməsini nəzərdən keçirin.

Son Nöqtə Təhlilləri

Bir çox keçici ifadə təhlili transfeksiyadan 24 saat sonra Dual-Luciferase® Assay System (Cat.# E1910) və Bright-Glo&trade Assay System (Cat.# E2610) kimi litik reportyor analizlərindən istifadə edir. Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Test Sistemi (Cat.# N1610) transfeksiyadan sonra cəmi bir neçə saat ərzində aşkarlamağa imkan verir. Bununla belə, əksər analizlər üçün vaxt çərçivəsi protein ifadə səviyyələrindən asılı olaraq dəyişə bilər (transfeksiyadan sonra 24&ndash72 saat). Məruzəçi-zülal analizləri hüceyrə lizatında mövcud olan ferment aktivliyini ölçmək üçün kolorimetrik, radioaktiv və ya lüminessent üsullardan istifadə edir. Bəzi analizlər (məsələn, Luciferase Assay System) mühiti çıxardıqdan sonra hüceyrələrin buferdə parçalanmasını, sonra lusiferaza aktivliyini müəyyən etmək üçün ayrıca analiz reagenti ilə qarışdırılmasını tələb edir. Digərləri eyni məhlulda lizis reagentini və analiz reagentini ehtiva edən və birbaşa mühitdəki hüceyrələrə əlavə edilə bilən homojen analizlərdir (məsələn, Bright-Glo&trade Assay System). Məruzəçi analizinin nəticələrini araşdırın və ən böyük ifadənin (ən yüksək oxunmanın) harada baş verdiyini müəyyənləşdirin. Bunlar maraq konstruksiyalarınızla istifadə etmək üçün şərtlərdir.

Alternativ aşkarlama üsullarına hüceyrələrin histokimyəvi boyanması (müxbir gen substratının iştirakı ilə boyanmış hüceyrələrin faizinin müəyyən edilməsi Şəkil 6), flüoresan mikroskopiyası (Şəkil 7) və ya Monster Green və reg Floresan Protein phMGFP kimi flüoresan məruzəçidən istifadə edildikdə hüceyrə çeşidlənməsi daxildir. Vektor (Kat. # E6421).

Şəkil 6. üçün RAW 264.7 hüceyrələrinin histokimyəvi boyanması &beta-qalaktosidaza fəaliyyəti. RAW 264,7 hüceyrə hər quyuya 0,1 mikroq DNT və FuGENE® HD-nin DNT-yə 3:1 nisbətindən istifadə etməklə transfeksiya edilmişdir. Kompleks qarışığın 5 mikrorolunu 96 quyuluq boşqabda 50,000 hüceyrə/quyuğa tətbiq etməzdən əvvəl 5 dəqiqə ərzində komplekslər əmələ gəlmişdir. Transfeksiyadan iyirmi dörd saat sonra hüceyrələr X-gal istifadə edərək &beta-qalaktosidaza aktivliyinə görə boyandı. Məlumat Fugent, LLC-nin izni ilə.

Şəkil 7. ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti ilə transfeksiya edilmiş hüceyrələrin flüoresan mikroskopiyası. 96 quyu boşqablardakı iCell® insan toxuması hüceyrələri ViaFect&trade Transfeksiya Reagenti və göstərilən reagent:DNT nisbətində GFP reportyor plazmidi ilə transfeksiya edildi və transfeksiyadan sonra GFP ifadəsi təsvir edildi. Panel A. iCell® 6:1 reagent:DNT nisbəti ilə Hepatositlər transfeksiyadan bir gün sonra təsvir edilmişdir. Panel B. iCell® 2:1 reagent:DNT nisbəti ilə kardiyomiyositlər transfeksiyadan bir gün sonra təsvir edilmişdir. Panel C. 4:1 reagent:DNT nisbəti ilə iCell® DopaNeurons transfeksiyadan üç gün sonra təsvir edilmişdir. Məlumat Cellular Dynamics International-ın izni ilə.

Real-Time Analizlər

Bəzi növ transfeksiya eksperimentləri üçün, xüsusən də patoloji mexanizmlərlə bağlı gen ifadə səviyyələrindəki dəyişiklikləri tədqiq edənlər üçün canlı hüceyrələrdə reportyor fəaliyyətinin monitorinqi arzuolunandır. Bu cür real vaxt analizləri dinamik şəkildə çoxlu genin ifadəsi haqqında qiymətli məlumat verə bilər. Nano-Glo® Canlı Hüceyrə aşkarlama variantları (Cat.# N2011) qeyri-litik protokollardan istifadə edərək canlı hüceyrələrdən NanoLuc® lüminesansını aşkar etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. Bu analizlər hüceyrə canlılığına xələl gətirmədən bir vaxt nöqtəsində və ya 72 saata qədər davamlı olaraq lüminesansı izləyir.


Stabil Transfeksiya

Stabil transfeksiya edilmiş hüceyrələrin seçilməsi

Stabil transfeksiya üçün optimallaşdırma uğurlu keçici transfeksiya ilə başlayır. Bununla belə, hüceyrələr neomisin fosfotransferaza kimi dərmanlara qarşı müqavimət genini ehtiva edən plazmidlə transfeksiya edilməlidir.neo). Mənfi nəzarət kimi, tərkibində dərman müqaviməti markerini olmayan DNT-dən istifadə edərək hüceyrələri transfektasiya edin.

  1. Transfeksiyadan əvvəl, transfeksiya edilməmiş hüceyrələri öldürmək üçün tələb olunan seçici dərman konsentrasiyasını təyin edin.
  2. Transfeksiyadan qırx səkkiz saat sonra, yapışan hüceyrələri tripsinizləşdirin və müvafiq seçmə dərmanı olan mühitdə bir neçə müxtəlif seyreltmələrdə (məsələn, 1:100, 1:500) təkrarlayın. Effektiv seçim üçün hüceyrələr subconfluent olmalıdır, çünki birləşən, böyüməyən hüceyrələr G-418 kimi antibiotiklərin təsirinə davamlıdır.
  3. Növbəti 14 gün ərzində hər 3-4 gündə dərman tərkibli mühiti dəyişdirin.
  4. İkinci həftə ərzində sağ qalan hüceyrələrin fərqli "adaları" üçün hüceyrələri izləyin. Dərmana davamlı klonlar hüceyrə tipindən asılı olaraq 2-5 həftə ərzində görünə bilər. Mənfi nəzarət plazmidi ilə transfeksiya edilmiş mədəniyyətlərdə hüceyrə ölümü 3-9 gündən sonra baş verməlidir.
  5. Ayrı-ayrı klonları standart üsullarla (məsələn, klonlama silindrlərindən istifadə etməklə) 96 quyuluq plitələrə köçürün və müvafiq dərmanı ehtiva edən mühitdə mədəniyyətləri saxlamağa davam edin.

Cədvəl 4 stabil transfektantları seçmək və saxlamaq üçün ümumi istifadə edilən antibiotiklərin icmalını təqdim edir.

Cədvəl 4. Stabil transfektantları seçmək üçün istifadə olunan antibiotiklər.

Antibiotik Müqavimət Geni İş konsentrasiyası Stok Həlli
G-418 və ya Geneticin® aminoqlikozid (məsələn, neomisin) fosfotransferaza G-418 tez-tez 50-1,000µg/ml diapazonu ilə 500μg/ml-də ilkin seçim üçün istifadə olunur. 50 mq/ml ya suda, ya da 100 mM HEPES (pH 7.3) sonuncu tampon mədəniyyət mühitinin pH-ni saxlamağa kömək edir.
Higromisin (Hygro) h/s 10-400μg/ml 100 mq/ml suda
Puromisin (Puro) pac 1-10μg/ml 10mq/ml suda və ya HEPES buferində (pH 7.0)

Stabil Transfeksiya Effektivliyinin Hesablanması

Alınan stabil transfektantların faizini müəyyən etmək üçün aşağıdakı prosedurdan istifadə oluna bilər.

Qeyd: Bu prosedurdan sonra ləkələnmiş hüceyrələr canlı olmayacaq.


Hüceyrə Transfeksiyası

Hüceyrə transfeksiyası canlı hüceyrələrə nuklein turşusunun (DNT və ya RNT) qəsdən süni daxil edilməsidir. Tipik olaraq, bu proses gen funksiyasını və protein ifadəsini öyrənmək üçün istifadə olunur. Bəzən "çevrilmə" termini ilə qarışdırılan transfeksiya demək olar ki, həmişə eukaryotik hüceyrələrdə istifadə olunur, transformasiya isə ümumiyyətlə bakteriya işində istifadə olunur.

Keçici və Sabit Transfeksiya

Həm keçici, həm də stabil transfeksiya üsullarını başa düşmək və onların son məhsuldakı rolunu nəzərə almaq vacibdir. Keçici transfeksiya adətən qısamüddətli müşahidələr üçün istifadə olunur, stabil transfeksiya isə uzunmüddətli gen tədqiqatları üçün istifadə olunur. Bundan əlavə, stabil və keçici transfeksiyalar keçici transfeksiyalarda transfeksiya prosesi baxımından əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənir, transfeksiya edilmiş nuklein turşularının nüvəyə daxil olması lazım deyil, sabit transfeksiyalarda isə DNT hüceyrənin genomuna daxil edilməlidir.

Transfeksiya üsulu tədqiqat üsulu olaraq 1970-ci illərdə Vaheri və Paqano DEAE-dekstran, Graham və Van der Eb isə hüceyrə transfeksiyası təcrübələri üçün kalsium fosfatdan istifadə etdikdə başladı. Bu kimyəvi əsaslı üsullar o dövrdə inqilabi idi, çünki hüceyrələrə genetik material təqdim etmək üçün viral vektorlara etibar etməli deyildilər. PCR kəşf edildikdən sonra bu, müxtəlif növ genetik materialların hüceyrələrə daxil edilməsi üçün tətbiqlərin inkişafını sürətləndirdi.

Hüceyrə transfeksiyasının müasir dövrü mədəni hüceyrələrə plazmid DNT, mRNT, zülallar və kiçik RNT (siRNA, microRNA, piRNA) kimi yüklərin daxil edilməsi ilə məşğul olur. in vitro və hədəflənmiş toxuma çatdırılması in vivo. Təcrübələr bu yük molekullarının hüceyrələrdəki təsirini sınaqdan keçirərək hazırlanır və həyata keçirilir. Bununla belə, çatdırılma səmərəliliyi istifadə olunan xüsusi transfeksiya reagentindən asılıdır. Transfeksiya reagentləri hər növ xərçəng hüceyrəsi, çətin transfeksiya olunan hüceyrə xətləri, həssas hüceyrələr (ilkin və kök hüceyrələr, həmçinin hormondan asılı neyron hüceyrələr, ilkin keratinositlər və aorta endotel hüceyrələri üçün xüsusi olaraq hazırlanmış, hazırlanmış və optimallaşdırılmışdır. ), yapışqan və suspenziya kulturası (məsələn, ilkin T-hüceyrələri).

Transfeksiya Təcrübəsi

İstənilən transfeksiya təcrübəsində məqsəd yüksək transfeksiya səmərəliliyidir, yəni konstruksiyanı minimal sitotoksisite ilə yaxşı ifadə etməkdir. Təcrübələr arasında hüceyrələrə minimal stress və təkrar istehsala nail olmaq istifadə olunan reagentdən və transfeksiya protokolunun optimallaşdırılmasından təsirlənir. DNT və ya RNT transfeksiyası zamanı nuklein turşusunun keyfiyyəti və saflığı da transfeksiyanın effektivliyinə təsir göstərir. Həmçinin, hüceyrə xəttinin aşağı keçid sayı hüceyrələrin yük nuklein turşusu ilə transfeksiya kompleksini qəbul etmək üçün daha uyğun olmasına imkan verir. Hüceyrə növləri və eksperimentlər arasında təkrarlana bilən vahid üsul yoxdur. Hər bir fərdi transfeksiya optimallaşdırılmalıdır. Bununla belə, optimallaşdırılmış transfeksiya protokollarına malik hüceyrə xəttinə xüsusi transfeksiya dəstləri Altogen Biosystems-dən əldə edilə bilər.

İbtidai hüceyrə mədəniyyətləri bioloji və gen terapiyası tədqiqatlarında istifadə olunur və normal hüceyrələrin biologiyasını daha dəqiq təmsil edə biləcək mühüm model sistemləri kimi xidmət edir. Müvafiq transfeksiya yanaşmalarından istifadə edildikdə, bir çox mədəni hüceyrə xətləri, eləcə də əsas hüceyrə kulturalarının əksəriyyəti ekzogen nuklein turşuları ilə transfeksiya oluna bilir. Transfeksiya üsullarının əksəriyyəti ilkin hüceyrə mədəniyyətlərində əhəmiyyətli toksikliyə səbəb olduğundan, bu prosedurun optimallaşdırılması (xüsusilə istifadə ediləcək protokol və reagentlər) verilmiş hüceyrə növü üçün effektiv transfeksiya strategiyalarının hazırlanması üçün vacibdir. Birincil hüceyrələr və həssas hüceyrə xətləri üçün altogen dəstləri digər alternativlərə nisbətən əhəmiyyətli dərəcədə aşağı sitotoksikliyə malik olmaq üçün hazırlanmışdır.

Transfeksiya üsulları

Transfeksiya ümumiyyətlə nuklein turşularının hüceyrələrə çatdırılması üçün kimyəvi vasitələrə aiddir. Digər texnikalar da mövcuddur və oxşar məqsədlərə nail ola bilər. Məsələn, viral vasitəli transduksiya, dəyişdirilmiş viruslar vasitəsilə nuklein turşularını çatdıra bilər. Texnika əhəmiyyətli effektivlik göstərdi və birincinin əsasını təşkil etdi in vivo FDA tərəfindən təsdiqlənmiş gen terapiyası. Bununla belə, transduksiya öz yan təsirlərini daşıyır. Xəstənin immun reaksiyaları nuklein turşularının daxil edilmiş ardıcıllığının nəticələrini əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirə bilər və təsirləri müşahidə edilənlərdən fərqləndirə bilər. in vitro.

Digər transfeksiya üsulları hüceyrələrin digər xüsusiyyətlərinə və hüceyrənin daxili hissəsinə daxil olmaq vasitələrinə əsaslana bilər. Balistik transfeksiya üsulları, hissəciklərin DNT-ni nüvəyə çatdırması məqsədi ilə hüceyrələrdə qızıl hissəciklərə bağlı olan DNT-ni vurur. Elektroporasiya kimi digər üsullar hüceyrə membranını yerlərdə parçalayır və hüceyrələrə yad materialların daxil olmasına imkan verir. Lakin kimyəvi transfeksiya alternativlərdən daha az invaziv olan bir üsuldur və buna görə də mənfi yan təsirlər üçün daha az potensiala malikdir.

In Vivo Altogen Biosystems-dən Transfeksiya Reagentləri

RNAi heyvan modellərindən istifadə edərək in vivo hədəfin doğrulanması tədqiqatları üçün istifadə edilmişdir. In vivo RNT tədqiqatlarının aparılmasında əsas problem funksional kiçik RNT molekullarının spesifik toxumalara effektiv, yönəldilmiş çatdırılmasıdır. Altogen® In Vivo Transfeksiya reagentləri siRNA (və ya mikroRNT) ilə birləşdirilə və qaraciyər, mədəaltı vəzi, böyrək və şişlər də daxil olmaqla, spesifik toxumalarda yönəldilmiş gen susdurulmasını təmin etmək üçün venadaxili (i.v) quyruq venasına inyeksiya yolu ilə intratumoral (i.t) və ya sistemli şəkildə tətbiq oluna bilər. Selektiv yıxılma inyeksiyadan 24 saat sonra görünə bilər.

Altogen Araşdırma Xidmətləri

Altogen Xüsusi Xidmətlər, 60-dan çox təsdiqlənmiş ksenoqraft modelləri, sabit hüceyrə xətlərinin inkişafı, RNT müdaxiləsi (RNAi) xidmətləri, analizin inkişafı, ELISA və Western Blot xidmətləri, siRNA kitabxanasının skrininqi və transfeksiya xidmətləri daxil olmaqla, hüceyrə transfeksiya xidmətləri və digər ixtisaslaşdırılmış biotexnologiya və əczaçılıq xidmətlərini təqdim edir. . Stabil ifadə edən hüceyrə xətlərinin yaradılması çox bahalı və vaxt aparan ola bilər. Altogen Labs cəmi 28 gün ərzində tamamlanan sabit mobil xətt xidmətinin yaradılmasını təklif edir (xidmət təfərrüatlarına baxın).


Transfeksiya Metodunuz üçün ibidi Məhsulunuzu Seçin:


LifeAct Adenovirus vektorları
Həssas hüceyrələrdə F-aktin analizi üçün istifadəyə hazır adenoviral vektorlar.


LifeAct Lentiviral Vektorlar
Stabil LifeAct ifadə edən hüceyrə xətlərinin asan generasiyası üçün lentiviral vektorlar.


ibidi Labware
Transfeksiya təcrübələri üçün ideal olan müxtəlif həcmlər və həndəsələr.


Transfeksiya Resursu

Transfeksiya gen funksiyasını öyrənmək üçün laboratoriya tədqiqat üsuludur. Transfeksiya həyat elmində və əczaçılıq tədqiqatlarında istifadə edilən qeyri-viral gen transferi üsuludur. Bu, gen transferi üçün viral vektorların istifadəsini nəzərdə tutan transduksiya ilə ziddiyyət təşkil edir. Transfeksiya ekzogen molekulların və DNT (sağda göstərilir) və ya RNT kimi genetik materialın mədəni məməli hüceyrələrinə keçici (müvəqqəti) və ya sabit (daimi) daxil edilməsi ilə nəticələnə bilər. Texnika adətən bioloji laboratoriyalarda gen funksiyalarının öyrənilməsi, gen ifadəsinin modulyasiyası, biokimyəvi xəritələşdirmə, mutasiya analizi və zülal istehsalı üçün istifadə olunur. Tədqiqatçılar xərçəng hüceyrə xətlərinə və ilkin hüceyrələrə plazmid DNT (pDNA), messenger RNT (mRNA), qısa müdaxilə edən RNT (siRNA) və mikroRNA (RNTİ-ni induksiya etmək üçün) qeyri-viral gen çatdırılmasını təmin etmək üçün müxtəlif daşıyıcı molekullardan istifadə edirlər. Təəssüf ki, heç bir tək çatdırılma üsulu və ya transfeksiya reagenti bütün növ hüceyrələrə tətbiq oluna bilməz. Hüceyrə sitotoksikliyi və transfeksiyanın effektivliyi istifadə olunan reagent, protokol və hüceyrə tipindən asılı olaraq kəskin şəkildə dəyişir (optimallaşdırılmış transfeksiya protokolları ilə 80-dən çox kommersiyada mövcud hüceyrə xəttinə xüsusi dəstlər mövcuddur) , bu siyahıya baxın). There are three modes of genetic transfer in bacterial cells: transformation (cellular uptake and incorporation of exogenous DNA), transduction (transfer of genetic material from one bacterium to another through bacteriophage), and conjugation (genetic material transfer between bacterial cells by direct cell-to-cell contact).

Transfection is a deliberate process that involves the opening of transient pores in eukaryotic cells to allow the uptake of exogenous molecules and genetic material. Lipids can be an important factor in this process: a type of a lipid-mediated transfection process, called lipofection (liposome transfection), has already improve the efficiency of transfection techniques. Lipofection is a lipid-mediated DNA-transfection procedure that makes use of liposomes. Due to a multitude of factors (including the size and charge of DNA along with the multitude of enzymatic and membrane barriers), the spontaneous introduction of genetic material into a cell and the expression of genetic material in the nucleus is a very inefficient process. The lipofection method is effective due to the fact that it allows the genetic material to be transfected in liposomes which are able to fuse with the cell membrane because of its nature as a phospholipid bilayer (lipids are able to conjoin with the cell membrane). If transient (temporary) expression of transfected materials is desired, DNA is transfected into the targeted cell, where it remains in the cytoplasm. On the other hand, DNA can be used for the stable expression of genes, requiring transport into a target cell’s nucleus. Once in the nucleus, the DNA can be incorporated into the genomic DNA and be passed on from cell to cell as it undergoes mitosis or meiosis.

History and Development

Cell transfection by calcium phosphate was one of the earliest chemical-based methods developed to deliver exogenous nucleic acids to cultured mammalian cells. This method is dependent upon the use of a calcium chloride-containing HEPES-buffered saline solution to deliver plasmid DNA. Advances in the development of lipid and polymer-based carrier molecules capable of binding nucleic acids led to the adaptation of these compounds for transfection. Many of these compounds create liposomes, which can fuse with the cellular membrane in order to deliver the bound RNA or DNA to the cell. This is an effective process to overcome cells’ natural resistance to the insertion of genes and maintaining the safety of the organisms being used. During this process the introduced nucleic acid may be transient (does not replicate) or it may be stable and fused into the genome of the recipient, therefore replicating when the host genome replicates. This is an important differentiation to understand when dealing with transfection, because the end result is varying and needs to be decided on depending on the goal of a particular transfection experiment.

The terms “transfection” and “transformation” have had varied meanings over time in the field of biomedical study. In more recent years, the term transfection has developed to include any artificial introduction of foreign nucleic acid into a cell. While effective delivery of genetic material (DNA and RNA) is still a challenge, recent advances in delivery technologies have allowed for the development of a new generation of transfection reagents both for in vitroin vivo tətbiqlər. These methods are a powerful tool in basic life sciences research and associated clinical studies.

Methods of Transfection

The introduction of DNA and RNA molecules into cultured mammalian cells requires the use of various transfection methods that depend, in part, on the cell lines being utilized and the types of experiments being performed. For maximum efficiency, these different methods are used in accordance with cell type and purpose. Depending on these factors, specific methods are selected to achieve minimum cell toxicity and have as minimal an effect on normal physiology as possible. Typically, these methods are categorized as viral, non-viral, chemical-based, non-chemical, and particle-based, with less common methods being gene guns and hybrid types. Making the right selection in method is vital due to the difference in their procedures. Whether you intend the process to produce DNA-carrier lipid complexes, or use packaging of viral based plasmids with specific individual properties, each varies in the way DNA or RNA is delivered. Furthermore, each method differs in efficiency and estimated longevity of experimental data gathering. The most standard methods, discussed in more detail below, include chemical (liposome-mediated, non-liposomal lipids, polyamines, polymers), physical (electroporation, microinjection, heat shock), or viral-based (retrovirus, adeno-associated virus, lentivirus) delivery systems.

Liposome-mediated transfection

Liposomes are synthetic analogues of the phospholipid bilayer of the cellular membrane. These compounds contain a number of the physical characteristics of phospholipids including the presence of hydrophobic and hydrophilic regions of each molecule, which allows for the formation of spheroid liposomes under aqueous conditions. In the presence of DNA or RNA, liposomes are capable of interacting with and encapsulating the nucleic acids, thereby creating an efficient delivery system. The liposomal charge, composition, and structure defines the affinity of the complex for the cellular membrane. Under specific conditions, the liposome complex is able to interact with the cell membrane, which enables its uptake by endocytosis and subsequent release into the cellular cytoplasm. The successful use of liposome compounds to deliver exogenous nucleic acids to specific biological system is dependent upon lipid formulation, charge ratio, particle size, and the method of liposome preparation.

Non-liposomal transfection agents (lipids and polymers)

Several non-liposomal lipids and some polymers have been developed that are capable of forming complexes with DNA or RNA and have the potential to form micelles. The transfection reaction is usually performed under aqueous conditions which enables the lipophilic portion of the amphiphilic compound to form the micelle core within which the exogenous nucleic acids are located. Superior transfection efficiencies can be achieved in cell lines that are responsive to liposome-based transfection.

Dendrimer-based transfection

Dendrimers are highly branched, globular macromolecules that are capable of interacting with and condensing DNA in small complexes. However, dendrimers are non-biodegradable and even at relatively low concentrations may cause significant cellular toxicity, thereby inadvertently affecting the outcome of the experiment. Polyamidoamine dendrimers are non-linear polycations and cascade polymers that can bind to plasmid DNA. Dendrimers are synthesized through the repeated addition reaction of methyl acrylate and the reaction of the product with ethylenamine, resulting in spherical molecules of defined size that have alternating bonds of amide and amine in the form of layers of shells. These shells which are known as generations are built up one after the other and after four generations the steric factors cause the dendrimer to become spherical. The net charge on these dendrimers is positive. Positively charged amino groups on the surface of dendrimer molecule interact with the negatively charged phosphate groups of the DNA molecule to form a DNA-dendrimer complex. This complex has an overall net positive charge and is capable to bind to negatively charged surface molecules on the membrane of eukaryotic cells, followed by cell uptake via non-specific endocytosis.

Elektroporasiya

Electroporation is a highly efficient technique, and often the only option, for delivering exogenous nucleic acids to cells grown in suspension and certain primary cells. The cell membrane is composed of lipid bilayers and when they are subjected to an electric field, a short term depolarization occurs which results in structural changes and formation of transient pores, known as electropores, which enables the delivery of charged molecules like RNA or DNA to the cytoplasm and nuclei of the targeted cells. Two types of electrical pulses have been used efficiently for cell electroporation: exponential decay and square wave. Other types may exist, but the two main ones have been extensively tested for efficiency.

Mikroinyeksiya

Direct injection of DNA into the nucleus of the cells or RNA into the cytoplasm of the target cells. This process involves the use of very thin glass capillaries which can inject nanoliters of nucleic acid solutions into the cells. Microinjection methods are utilized in cases where individual cell manipulation is possible, such as the genetic engineering of embryo cells. Certain cell types and/or experimental conditions require that specific cells within a population are targeted for gene delivery. In these instances, gene guns or manual microinjection are very efficient techniques for the direct delivery of DNA to specified target cells. However, the method is limited with regard to the number of cells to which the exogenous nucleic acids can effectively be delivered and requires certain operator skills.

Biolistic particle delivery

Delivery of nucleic acids into the cells by using high-velocity nucleic acid coated particles. This method can utilize a gun system or biolistic particle delivery system (BPDS). While the gun is more portable and involves less pressure (100-600 psi), the BPDS system has more surface area application and uses higher pressures (up to 4000 psi). Both methods use a relatively small amount of DNA, thus avoiding the waste of genetic material.

Virus-mediated gene delivery

DNA can be introduced into cultured mammalian cells by viral transduction techniques using viruses as carriers. Viral delivery is beneficial for transfection of primary cell cultures and numerous studies have developed in vivo gene delivery approaches, however the clinical and laboratory uses of these techniques also carry significant bio-hazardous risks.

Transient and Stable Transfection

Transfected genetic material can be expressed in the target cells either transiently or permanently depending on the methods utilized and the experimental questions being investigated. Transient transfections are used most commonly to analyze the short-term impacts of altered gene or protein expression. Plasmid DNA, mRNA), si/shRNA, and microRNA, are introduced and gene products are expressed in the target cells. However, the nucleic acids do not integrate into the host cell genome. Gene product expression is transient and typically results in high expression levels that persist for 24-72 hours when RNA is transfected, or 48-96 hours following DNA transfection. Conversely, in order to analyze the long-term impacts of altered gene or protein expression, investigators typically utilize stable transfection protocols to develop stable cell lines. In a subpopulation of transfected cells, whether the desired effect is a stable or transient transfection, the transfected genetic material will integrate into the genome. In order to create stable cell lines, investigators will take advantage of this natural occurrence, and introduce the gene of interest along with a selectable marker. Growth of transfected cells, in the presence of a selecting agent, will enable the subpopulation of cell where the exogenous genetic material has been incorporated into the genome to persist while the remaining cells undergo selection. Utilizing this method, investigators are able to develop cells that permanently express specific genes through their incorporation in the cellular genome. Altogen Labs offers development of stable cell lines service by transforming your cell line to stably express vector or gene of interest.

Cancer Cell Lines and Primary Cells

Primary cell cultures are used in biological and gene therapy studies and serve as important model systems that may more accurately represent the biology of normal cells. Many cultured cell lines, as well as the majority of primary cell cultures, are able to be transfected with exogenous nucleic acids when appropriate transfection approaches are employed. Since the majority of transfection methods causes significant toxicity in primary cell cultures, optimizing this procedure, specifically the protocol and reagents to be utilized, is essential for developing effective transfection strategies for a given cell type. Altogen Biosystems developed AltoFect™ Transfection Reagent – a new generation transfection reagent optimized for high transfection efficiency of primary cells and difficult-to-transfect cell lines. It has been successfully tested to deliver all types of nucleic acids into large number of primary cell types and hard-to-transfect cell lines including primary neuronal cells and suspension cell cultures.

Cancer cell lines are used for reproducible data from one lab to another and are imperative for the development of data and medicines. Cancer-derived cell lines are used to study the biology of cancer, but they also provide a valuable environment for researching drug efficiencies and testing transfection-based therapies. Cancer cell lines also have, in relation to primary cell lines, avoided the usual cellular senescence and are therefore helpful to preclinical trials because of their proliferative abilities these cells, due to their immortality, can be grown continuously in culture. This allows for a multitude of tests and transfections to be run on them, giving substantial amounts of high quality data.

RNA Interference (RNAi)

RNA interference (RNAi) is a phenomenon by which the expression of double stranded RNA (dsRNA) specifically stimulates a cellular process that reduces gene expression in a sequence-specific manner. Small synthetic RNA, termed small interfering RNAs (siRNA), which are typically 21-28 nucleotides in length, can induce RNAi and knockdown of targeted gene expression in mammalian cells without inducing an antiviral response. Biochemical studies have elucidated the mechanism of RNAi. Double stranded RNA is processed by an enzyme known as Dicer resulting in the production of siRNA molecules. These molecules are then able to form a multi-protein siRNA complex, known as the RNA-induced Silencing Complex (RISC). The RISC/siRNA complex catalyzes the cleavage and degradation of the complement mRNA molecules.

The use of RNAi applications, including siRNA and siRNA library screening (when a set of siRNAs are used that target each individual gene in a human genome), to inhibit cellular gene expression appears to have significant advantages over other approaches for targeted gene regulation and has led to the development of novel gene-targeted RNAi therapeutics. The potency of siRNA molecules, sequence-specific design, and ability of siRNAs to be re-used to guide mRNA degradation in cells bears a significant advantage over anti-sense oligonucleotides and ribozyme-stem approaches. Liposome encapsulated and functional siRNAs are capable of effectively bypassing the interferon response in order to induce post-transcriptional gene silencing in vitro, as well as inducing RNAi in vivo.

siRNA Transfection

Gene silencing by RNA Interference (RNAi) is a powerful research tool for studying gene function in mammalian cells. RNAi silencing is a biological phenomenon by which double stranded RNA (dsRNA) specifically reduces the expression of its corresponding gene. Potent inhibition of specific gene expression is experimentally achieved by the transfection of small interfering RNA (siRNA), which binds RISC complex and causes degradation of target complementary mRNA molecules in the cell. Successful, potent RNAi experimentation is dependent upon the highly efficient delivery of the siRNA into cells by transfection of stable and functional siRNA molecules.

Gene silencing or knockdown is done easily in most cell types, but the siRNA needs to be designed against the relevant gene and keep cell viability as a vital factor. siRNA transfection is referred to as “transference” and utilizes experimentation both in vivoin vitro. Reverse transfection is another option in less common experimental situations, offering comparatively stronger benefits. Determining ratios between siRNA oligos as well as siRNA concentration is essential to maximum efficiency, and is typically regulated in accordance to relevant siRNA protocols.

Most DNA transfection reagents are incompatible with siRNA, sensitive to serum, or are capable of inducing cytotoxicity, which negatively affects gene expression studies. siRNAs can be associated with off-target activity and complicate the interpretation of experiments, which is why it is important to prioritize working with specially engineered equipment and protocols. Altogen transfection kits have been developed for use with both DNA and siRNA transfection, optimized for specific cell type in vitro or targeted to a certain tissue in vivo, and are fully compatible with serum without lowering transfection efficiency or reducing cell viability. Ready-to-run transfection protocols eliminate the need for extensive siRNA optimization experiments. Altogen Biosystems kits are also compatible for transfection of other types of small RNA, including miRNA (microRNA) molecules, Piwi-interacting RNAs (piRNAs), rasiRNA, etc.

High Throughput siRNA Screens

RNAi can be used as a research tool to study the function of single or many thousands of genes in cells. siRNA libraries composed of large numbers of siRNAs have been developed and are used to identify sets of genes functionally involved in a particular biological process or disease metabolism. Phenotypic high throughput siRNA screens are a powerful approach to study structure/function relationships of genes and to identify novels parts of signaling pathways. In fact, large-scale siRNA screening is now commonly used for functional genomics and drug target validation. High throughput applications require that reliable and reproducible transfections can be performed in a 96-, 384-, or 1536-well plate format. Several transfection reagents are compatible for high throughput siRNA transfection, as well as other types of small RNA, such as microRNA, piRNA, and rasiRNA. A technique known as reverse transfection has been developed which allows for the plating of the cells and delivery of siRNA-reagent complexes on the same day, thereby eliminating a source of variability in cell culture and improving transfection efficiency.

Gene Silencing (RNAi) in Neuronal Cells

A number of studies have demonstrated the successful application of RNAi in primary cell cultures and non-neuronal cell lines. However, the use of gene silencing in neuronal cell types has been notoriously difficult because of several technical and biological limitations. Neurons have been considered the most resistant to RNAi. Methods to consider when performing nucleic acid delivery experiments with neuronal cultures include electroporation, microinjection, viral-based methods, and certain chemical transfection reagents. Although physical transfection methods appear to be efficient for siRNA-induced studies where transient modification of gene expression is sufficient, these methods do not appear to be adequate for behavioral studies where long term alteration of gene expression may be necessary. The viral-based siRNA expression systems appear to be most applicable for both Central Nervous System (CNS) gene therapy and basic neurobiological studies, while adeno-associated virus (AAV) delivery systems enable long-term stable gene expression with relatively little cytotoxicity. Lentiviral vectors have been reportedly used successfully for the delivery of short hairpin RNA (shRNA), a precursor of siRNA, into primary neurons to induce RNAi. The advantage of lentiviral system is the ability to transfect non-dividing cells. Altogen Biosystems manufactures several transfection reagents optimized for neuronal cells transfection, including Astrocyte, CLBPEC (neuroblastoma), DI-TNC1, Neuro-2a, PC-12, and AltoFect™ Reagent.

RNAi Therapeutics

The capability of siRNAs to mediate post-transcriptional gene silencing in mammalian cells and tissues, as well as its successful use to prevent expression of target mRNA, has recently led to the development of a new methodology for novel drug discovery. Several pharmaceutical and biotechnology companies are currently investigating the possible use of synthetic siRNA for inducing RNAi in vivo, its use in animal models, and in RNAi-based therapeutics. Small RNA molecules, such as siRNA and miRNA, have been regarded as potential therapeutic agents to target multiple regulated cellular processes, and it is theoretically possible that RNAi can be utilized to treat any disease associated with over expression of specific genes (e.g. oncogenes). In fact, there are many reports that address the potential therapeutic application of RNAi to specifically target genes involved in multiple diseases including various forms of cancer, Alzheimer’s, and a number of inflammatory and virally-associated diseases. However, a number of major difficulties associated with inefficient delivery of functional RNA molecules into cells and the reduced biostability of unmodified RNA must be overcome. Efficient and organ-specific delivery of synthetic oligonucleotide molecules is currently a key limiting step to enable siRNA- and microRNA-based therapeutic approaches.

In the last 9 years, Altogen Biosystems has focused on the development of efficient in vivo RNAi reagents and RNAi delivery technologies. RNAi has been used for in vivo target validation studies using animal models. The major challenge in performing RNAi studies in vivo is the effective, directed delivery of functional small RNA molecules into specific tissues. Altogen® in vivo transfection reagents can be conjugated with siRNA and administered intratumorally (i.t) or systemically via intravenous (i.v) tail vein injection in order to provide directed gene silencing in specific tissues, including liver, pancreas, kidney, and tumors. Selective knockdown can be seen as early as 12-24 hours after injection.

In Vivo Transfection Reagents (for animal research – biodistribution and tissue-targeted studies)

In vivo studies plays an important role in drug development, validation, and safety studies. Rodent in vivo studies can predict many pharm/tox parameters such as PK/PD profile of the test compound, LD50 (safety level), mechanism of action, and assess the effectiveness of drugs (often against various types of cancer in various stages by conducting xenograft studies, where novel anti-cancer drugs are tested on staged tumor growths that have been engrafted subcutaneously in mouse models). In vivo methods require live animals systems where the test molecule is delivered into the animal or locally to specific tissues. The immune response of the animal can influence the delivery efficiency. To prolong and improve test compound stability in vivo researchers often utilize nanoparticles and liposome-based technologies which allow to target certain organs. By targeting tissue types, such as the brain versus the kidney, a researcher can affect disease tissue and minimize negative effect on other organs. To enable this targeting process (in vivo transfection) researchers utilize both biodistribution and tissue-targeted in vivo transfection reagents:

In Vivo LIPID-based Transfection Reagent – Targeted tissues: Liver, Kidney, Liver Tumors, Kidney Tumors
In Vivo Nanoparticle-based Transfection Reagent – Targeted tissues: Kidney, Lung, Liver, Heart, Brain, Tumors
In Vivo PEG-Liposome Transfection Reagent – Targeted tissues: Spleen, Liver, Kidney, Pancreas, Tumors
In Vivo LIVER-targeted Transfection Kit – Targeted tissues: Liver, Liver Tumors

Tissue-targeted In Vivo Transfection Reagents:

Altogen’s transfection reagents enable efficient delivery of functional DNA and RNA molecules in vivo. The PEG-Liposome delivery system reduces innate immune responses due to PEG modification, and provides highly efficient and targeted in vivo tissue delivery.

Selected transfection product citations (Altogen® In Vivo Transfection Kits used in the following publications):

  • Təbiət. 2008 454(7203):523-7. Innate immunity induced by composition-dependent RIG-I …Saito et al [PDF]
  • Am J Pathology. 2010 177(4):1870-80. Role of ocular complement factor H in a murine model … Lyzogubov et al [PDF]
  • Nature Biotechnology. 2011 29(4):341-5. Delivery of siRNA to the mouse brain by … Alvarez-Erviti et al [PDF]
  • Cancer Research. 2011 71(15):5144-53. Inhibition of miR-193a expression by… Iliopoulos et al [PDF]
  • RNT. 2010 16(11):2108-19. RNase L releases a small RNA from HCV RNA that refolds … Malathi et al [PDF]
  • Diabetologia. 2012 55(7):2069-79. The p47phox- and NADPH oxidase organiser 1 … Youn et al [PDF]
  • British Journal of Cancer. 2012 107(3):516-26. TIGAR induces p53-mediated cell-cycle … Madan et al [PDF]
  • Hipertoniya. 2014 63(2):353-61. Tissue transglutaminase contributes to … Liu et al [PDF]
  • Circulation Research. 2010 15107(8). Kruppel-like factor-4 transcriptionally regulates … Cowan et al [PDF]
  • Hipertoniya. 2012 59(1):158-66. Role of uncoupled endothelial nitric oxide synthase … Gao et al [PDF]
  • Bioloji Kimya Jurnalı. 2012 287(4):2907. Chaperoning of mutant p53 protein … Gogna et al [PDF]
  • PLoS Pathogens. 2012 8(8) Uridine composition of the poly-U/UC tract of HCV RNA … Schnell et al [PDF]
  • J Proteome Res. 2012(11) Retinal proteome analysis in a mouse model of oxygen-induced … Kim et al [PDF]
  • J Transl Med. 2010 158:133. Prevention of hyperglycemia-induced myocardial apoptosis … Zhang et al [PDF]
  • Mol Cell Biol. 2013 33(7). SCO2 induces p53-mediated apoptosis by Thr845 phosphorylation … Madan et al [PDF]
  • Hipertoniya. 2015 65(2):430-9. Neurokinin 3 receptor and phosphocholine transferase… Parchim et al [PDF]
  • Qastroenterologiya. 2011 141(2) Differential type I interferon-mediated autophagic trafficking … Desai et al [PDF]
  • PLoS Pathog. 2014 10(10) Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV … Bukong et al [PDF]

About Altogen Biosystems:

Altogen Biosystems is a life sciences company dedicated to the development, marketing and manufacture of cell type specific transfection reagents. Efficient delivery of DNA, RNA, and siRNA enabled by advanced formulation of reagents and peculiar design of protocols. Altogen Biosystems offers a complete transfection system for a broad range of cell lines. All reagents are functionally tested to be highly reproducible, serum compatible, induce low toxicity, and can be used for co-transfection experiments, and high throughput applications. The advanced services provided by Altogen Biosystems include contract research work and preclinical studies. This outsourcing is done to receive fast, efficient results from Altogen Biosystems. Whether it be part of a regulatory process or done to secure a patent, Altogen is an advanced laboratory that delivers products at superior promptness. This cell and molecular lab specializes in top tier transfection technology fortified by years of research, expertise, and high-end lab machinery.

Transfection Services by Altogen Labs CRO:

Altogen Labs provides specialized biotechnology and pharmaceutical services, including generation of stable cell lines, RNA interference (RNAi) services, pharmacology and toxicology testing: over 60 validated xenograft models (NOD/SCID), assay development (RT-PCR, automated Western Blot, ELISA), IC-50, siRNA library screening and transfection services, liposome encapsulation, cell banking/cryopreservation, and many more biology contract research (CRO) and preclinical research services.


Videoya baxın: DNT-dən RNT sintezi və zülal əmələ gəlməsi. Azərbaycan Tibb Universiteti (Sentyabr 2022).


Şərhlər:

  1. Gardar

    Danışaq, bu mövzuda deyəcəklərim var.

  2. Faelkree

    Bilirəm necə girmək lazımdır...

  3. Son

    Həmişə bu bloqun müəlliflərinə, infa 5 ++

  4. Zioniah

    Mina üzərində mövzu olduqca maraqlıdır. I suggest all to take part in discussion more actively.



Mesaj yazmaq