Məlumat

Transgenik çevrilmələr hədəfdən kənar fenotiplərə necə səbəb olur?

Transgenik çevrilmələr hədəfdən kənar fenotiplərə necə səbəb olur?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Oxudum ki, transgen əlavələri hədəfdən kənar mutasiyalara səbəb ola bilər ki, bu da fenotipin transgenə həddən artıq aid edilməsi ilə nəticələnir, məsələn. ömür uzunluğunun artması Sir2 həddindən artıq ifadəsi ilə əlaqələndirilir (Burnett et al, 2011, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21938067). Bu xüsusi tədqiqatda, bu hədəfdən kənar təsirləri aradan qaldırmaq üçün transgen ştamını bir neçə dəfə vəhşi tiplə keçdilər, Dyf2-də bir mutasiya xüsusilə adlandırılır.

Genetika sahəsində zəif biliklərim var, ona görə də transgen daxiletmələrinin hədəfdən kənar mutasiyalara necə səbəb ola biləcəyini və ya aşınmanın nəzərdə tutulan mutasiyanı necə təcrid edə biləcəyini həqiqətən anlamıram.


The C.elegans Əlaqələndirdiyiniz tədqiqatda istifadə edilən ilk olaraq Tissenbaum & Guarente tərəfindən qamma şüalanma protokolundan istifadə edərək hazırlanmışdır.

Qısacası, protokol qurdların cinsiyyət orqanına arzu olunan DNT konstruksiyasının yeridilməsi və sonra qurdların qamma şüalanması ilə təmin edilir.

Radiasiya ekspozisiyasından sonra qurdun genomik DNT-si təsadüfi yerlərdə qırılacaq və müvafiq hüceyrə fermentləri tərəfindən təmirə məruz qalacaq, sonuncu mərhələdə ekzogen DNT genomla birləşə (bağlana bilər). Bununla birlikdə, genomik DNT radiasiya səbəbindən təsadüfi mutasiyalar da əldə edə bilər. Budur transgen əlavələri hədəfdən kənar mutasiyalara necə səbəb ola bilər bu halda.

Digər orqanizmlər və ya hüceyrələr ilə protokollar fərqlidir. Məsələn, məməlilərin hüceyrələrini yaratmaq üçün radiasiya heç vaxt istifadə olunmur, lakin yenə də onu redaktə etmək üçün genomda fasilələr yaratmalısınız. Metoddan asılı olaraq, müəyyən bir təcrübənin "hədəfdənkənar nisbəti" dəyişə bilər, lakin heç vaxt sıfır deyil (hələ deyil).


Bir mutant orqanizmi vəhşi tiplə (backcrossing) keçdiyiniz zaman hər bir nəsildə allellərin yarısı mutant valideyndən, yarısı isə vəhşi tipdən əmələ gəlir. Buna baxmağın başqa bir yolu, mutant orqanizmdə heterozigot olduğunu və fitnes diferensialına səbəb olmadığını fərz etsək, nəslin təxminən yarısı hər hansı bir mutasiyadan ibarət olacağını söyləməkdir.

Buna görə, orta hesabla, hər dəfə vəhşi tipə keçdiyiniz zaman mutasiyaların yarısını itirirsiniz. Bir neçə raunddan sonra mutasiyanın qalma ehtimalı çox tez azalır (bir nəsildən sonra 0,5, 2-dən sonra 0,25, 3-dən sonra 0,125, 4-dən sonra 0,0625, 5-dən sonra 0,03125 və s.).

Hər geri krossinq raundunda siz nəsli sınayırsınız və nəzərdə tutulan mutasiyaya malik olanları seçirsiniz və onlardan növbəti raund üçün istifadə edirsiniz, beləliklə, nəzərdə tutulan mutasiyanı saxlamaq ehtimalı yüksək (~1.0) qaldıqda, gözlənilməz mutasiyaların saxlanılma ehtimalı çox sürətlə azalır. Bütün bunlar, hədəfdənkənar mutasiyaların müxtəlif xromosomlarda olduğunu və ya nəzərdə tutulan mutasiyadan kifayət qədər uzaqda (əlaqəsiz) olduğunu nəzərdə tutur ki, onlar ayrıca ayrılırlar və “bağlantı sürükləməsi” ilə geriyə çarpaz nəsillərə ötürülmürlər.


Genetik manipulyasiya Soc1-bənzər genlər çiçəklərdə və yarpaqlarda fotosintezi təşviq edir və bitkilərin yüksək temperatura dözümlülüyünü artırır

Qlobal istiləşmə nəticəsində orta qlobal temperaturun sürətlə artması bitkilərin məhsuldarlığını təhdid edir (Li və b., 2015). Xloroplastlar və xloroplast zülalları ətraf mühitin stresləri ilə əlaqələndirilir (Alexia və başqaları, 2019 Hong və b., 2020). Bir çox istilik şoku zülalları (HSP) xloroplastın inkişafı ilə əlaqələndirilir və bitkilərin yüksək temperaturda istilik stresinə dözümlülüyünü artırır (Shen). və b., 2015 Zhong və b., 2013), halbuki xloroplastın inkişafını təşviq edən və sinxron olaraq yüksək temperatura dözümlülüyü artıran heç bir gen bildirilmir. Yüksək temperaturun xloroplasta təsiri xüsusi əhəmiyyət kəsb edir, çünki digər hüceyrə funksiyaları pozulmazdan əvvəl fotosintez tez-tez inhibə olunur (Zhang və b., 2010). Beləliklə, xloroplastların biogenezinin və fotosintezinin təşviqi bitkilərin istiliyə dözümlülüyünü artırmaq üçün potensial bir üsuldur. Əvvəllər həddindən artıq ifadə tapdıq SOC1 və ya SOC1 kimi İstilik gərginliyinə məruz qalan bitkilərdə genlər ləçəklərdə xloroplastların biogenezinə səbəb olur (Vanq). və b., 2019). Bununla belə, fotosintez aparatının pozulduğu və transgen bitkilərdə bitki termotolerantlığının artıb-artırılmadığı məlum deyil. Hazırkı tədqiqatımızda transplastomik (harbouring GFP tərəfindən idarə olunan müxbir geni psbA xloroplastın promotoru), multigen transgen tütün (Fbp21 geninin saf xəttinin genomuna təqdim edildi GFP transplastomik tütün etiketli nFbp21*pGFP) və transgenik petuniyanı həddindən artıq ifadə edən FBP21 gen xloroplast və nüvə çevrilməsi nəticəsində əmələ gəlmişdir. Bundan əlavə, transgen bitkilər (bu sənəddə Fbp21 etiketli F21 və Fbp21*22 ​​etiketli F21_22) SOC1 kimi genlər və ləçəklərin RNT-Seq məlumatları, əvvəllər bildirildi (Wang və b., 2019) da inteqrasiya olunub. Nəhayət, yarpaqlarda RNT ardıcıllığı, bioloji və fizioloji, anatomik və fenotipik təyini ilə bağlı bir sıra təcrübələr aparılmışdır.

Bitkilər yüksək temperaturda (40°C gün/28°C gecə) yetişdirildikdə, nəzarət tütün bitkilərinin çəhrayı ləçəklərində yalnız plastoqlobulları olan qeyri-fotosintetik plastidlərin göründüyünü göstərdi. Yaşıl ləçəklərdə morfoloji cəhətdən normal xloroplastları müşahidə etdik SOC1 kimi gen transgen tütün bitkiləri (Şəkil 1a). Yaşıl ləçəklərdə xloroplastlar nFbp21*pGFP transplastomik tütünün yüksək temperaturda eyni vaxtda qırmızı və yaşıl flüoresans buraxdığı müşahidə edilmişdir (Şəkil 1b). Bu, xloroplast genlərinin ləçəklərdəki bu istilik stressinin yaratdığı plastidlərdə ifadə edildiyini göstərir. Maksimum fotokimyəvi səmərəlilik dəyərləri (Fv/Fm) təyini də fotosintezin xloroplast tərkibli ləçəklərdə baş verdiyini göstərdi (Şəkil 1c və d). Fotosintez genlərinin əksəriyyəti xloroplast tərkibli yaşıl ləçəklərdə kəskin şəkildə tənzimlənirdi (Şəkil 1e). İmmunoblot analizi həmçinin yaşıl ləçəklərdə fotosintezlə əlaqəli bir çox zülalın sintez edildiyini göstərdi (Şəkil 1f).

İstiliyə davamlı analiz göstərdi ki SOC1 kimi gen transgen tütünü (F21 və F21_22) uzun müddət davam edən həddindən artıq istilik stresinə dözümlülüyünə görə nəzarət tütünündən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənirdi. 2 həftəlik tütün bitkiləri üçün yabanı tipli tütündə, istilik stressindən sonra transgen xətlərə nisbətən daha çox açıq sarı rəngli fidanlar görüldü (Şəkil 1g). Fv/Fm transgen xətlərdəki qiymətlər də yabanı tipdən əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olmuşdur (Şəkil 1g və h). Aşağı elektrolit sızması (EL) (Şəkil 1i) və daha yüksək sağ qalma nisbəti (Şəkil 1j) bu 2 həftəlik transgen tütünün istiliyə dözümlülüyünü artırdığını göstərir. Bitkilər normal temperaturda yetişdirildikdə, transgen tütünün (o cümlədən F21 və ya F21_22 tütünün) yarpaqlarının hüceyrələrində də daha çox xloroplastlar müşahidə edilmişdir. nFbp21*pGFP transplastomic tütünə görə qırmızı və yaşıl floresan ilə müqayisədə GFP transplastomik tütün (Şəkil 1k). Bu nəticələr həddindən artıq ifadə edildiyini göstərir Soc1 kimi genlər transgen yarpaqlarda xloroplast biogenezini təşviq edir. Yüksək temperaturda yetişdirildikdə, transgen tütünün yarpaq xloroplastları (həmçinin nFbp21*pGFP) normal görünüşü və nizamlı paylanmasını qorudu və daha çox yaşıl flüoresan buraxdı (Şəkil 1k). Bu müşahidələr göstərir ki, xloroplast genləri normal olaraq yüksək temperaturda ifadə edə bilir, halbuki nəzarət tütünün yarpaqlarında xloroplastlar şişmiş, kürəşəkilli və qeyri-müntəzəm olmuşdur. Bu, Kwon və həmkarlarının bildirdikləri ilə uyğun gəlirdi GFP transplastomik tütün (Kwon və b., 2013). Xloroplastların struktur dəyişiklikləri və onların nəzarət tütünündə səpələnmiş paylanması (Şəkil 1k) müxtəlif hüceyrə membranlarının daha yüksək qeyri-sabitliyini və yüksək temperaturda istilik nəticəsində hüceyrə zədələnməsini göstərir.

6 həftəlik tütün bitkilərinin yüksək temperatura reaksiyası da nəzarət və transgen tütün arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqli idi (Şəkil 1l). Bir çox fotosintez genləri yüksək temperaturda böyüyən transgen bitkilərin yarpaqlarında kəskin şəkildə tənzimlənirdi (Şəkil 1m). İmmunoblot analizi göstərdi ki, fotosintezi birləşdirən zülallar transgen bitkilərdə toplanıb (Şəkil 1n). Davamlı istilik gərginliyi altında (9 saat ərzində 45°C), Fv/Fm dəyərlər transgen tütün bitkilərinin yarpaqlarında da əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olmuşdur (Şəkil 1o). Xalis fotosintetik sürətin (Pn) müəyyənləşdirilməsinin zaman seriyası transgen tütün bitkilərinin yarpaq Pn nisbətinin yabanı tipdən daha yüksək olduğunu göstərdi (Şəkil 1p). Maqnezium xlorofilin bir hissəsidir və fotosintez üçün vacibdir (Leonard, 1954) və daha yüksək maqnezium tərkibi F21 transgen tütün bitkilərinin yarpaqlarında da aşkar edilmişdir (Şəkil 1q). Birlikdə götürdükdə bu nəticələr ortaya çıxdı SOC1 kimi gen transgenik tütün bitkiləri istilik stressi şəraitində gücləndirilmiş fotosintetik qabiliyyətə malikdir.

6 həftəlik transgen tütünün yarpaq EL dəyəri istilik stressindən sonra yabanı növdən aşağı olmuşdur (Şəkil 1r). RNT-seq analizi göstərdi ki, istilik şoku zülallarını kodlayan genlər də istilik stresi altında transgen tütün bitkilərinin yarpaqlarında böyük dərəcədə tənzimlənir (Şəkil 1s). GC-MS analizi prolin tərkibinin əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olduğunu göstərdi SOC1 kimi gen transgen tütün bitkiləri (Şəkil 1t). Qeyd etmək lazımdır ki, qönçələnmə fazasında transgen tütün bitkiləri istilik stressi altında zədələnməmiş və normal çiçək açmışdır (15 gün ərzində 12 saat işıq dövrü). Bunun əksinə olaraq, yabanı tipli tütün bitkiləri eyni istilik stressi şəraitində çiçəkləməmiş və ya zəif çiçək açmışdır (Şəkil 1u).

Bundan əlavə, transgen petuniya həddindən artıq ifadəlidir Fbp21 gen müxtəlif inkişaf fazalarında yabanı tipli petuniya bitkilərinə nisbətən daha çox istiliyə dözümlü idi (Şəkil 1v və w). Ən yüksək sağ qalma dərəcəsi (96,60%) istilik stressindən sonra 2 həftəlik transgen petuniya üçün qeydə alınıb (Şəkil 1v). 6 həftəlik petuniya fidanları üçün yabanı tipli petuniya fidanlarının heç biri yüksək temperaturda 3 gündən sonra sağ qalmamışdır (Şəkil 1w). Tütünün həddindən artıq ifadəsinə bənzəyir SOC1 kimi genlər, transgenik petuniya həddindən artıq ifadəlidir Fbp21 gen də istilik stressi altında açıq yaşıl ləçəklər əmələ gətirdi (Şəkil 1x).

Əvvəlki bir araşdırmada ilk dəfə bunu bildirdik SOC1 kimi genlər istilik gərginliyinə məruz qalan ləçəklərdə xloroplastların biogenezini təşviq edir (Wang və b., 2019). Bu tədqiqatda göstəririk ki, tərkibində artan sayda xloroplastlar olan hüceyrə daha çox yarpaqlarda müşahidə olunur. Soc1 kimi yabanı tipli bitkilərə nisbətən gen transgen bitkilər və o SOC1 kimi genlər fotosintezi və istilik şoku ilə əlaqəli genləri tənzimləyir, bitki fotosintezini yaxşılaşdırır və xloroplastın istilik stressinin zədələnməsini azaldır. Nəticələrimiz göstərdi ki, xloroplast tərkibli ləçəklərə, daha yüksək xlorofil tərkibinə, artan fotosintezə və istilik dözümlülüyünə malik super bitkilərin genetik mühəndisliyi ilə sinxron şəkildə əldə edilə bilər. Bitki çiçəklərinin istilik stressi və həddindən artıq ifrazat şəraitində karbondan istifadənin səmərəliliyini daha da artırmaq üçün fotosintez edə biləcəyini göstərdik. SOC1 kimi genlər istilik stressinin xloroplasta zərərli təsirini azaldır və bitkilərdə fotosintezi gücləndirir. Müşahidəmiz yüksək temperatur, bitki funksional xloroplast biogenezi, bitki fotosintezi və bitki istiliyinə dözümlülük arasında qarşılıqlı əlaqə mexanizmi haqqında yeni bir fikir verir. Qlobal istiləşmənin artan təhlükəsi şəraitində istiliyə davamlı bitkilərin istehsalı böyük ekoloji və iqtisadi əhəmiyyət kəsb edəcəkdir.


Giriş seçimləri

1 il ərzində jurnala tam giriş əldə edin

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.
ƏDV daha sonra ödəniş zamanı əlavə olunacaq.
Vergi hesablanması yoxlama zamanı yekunlaşacaq.

ReadCube-da vaxt məhdud və ya tam məqaləyə giriş əldə edin.

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.


Nəticələr

PNP sistemi soma və rüşeym xəttində səmərəli işləyir

Şərti transgen RNT sistemləri Drosophila binar Gal4/UAS sistemi ilə hədəf genləri müvəqqəti və məkan olaraq sıradan çıxara bilir. Gal4 olmasaydı, UAS-ın aşağı axınında DNT ardıcıllığı ilə kodlanmış saç sancağı ifadə olunmazdı ki, bu da bizə pVALIUM vektorları 2,4 əsasında minlərlə transgen RNT xətlərini yaratmağa və saxlamağa imkan verirdi. Bununla belə, Tsinghua Fly mərkəzində (THFC) pVALIUM20 sisteminə əsaslanan transgen RNT xətlərinin 15,8%-nin homozigotluğu saxlaya bilməyəcəyini gördük (Əlavə Məlumat 1). Bu arada, Vyana Drosophila Resurs Mərkəzində (VDRC) ɸC31 və uzun ikiqat zəncirli RNT (dsRNA) saç sancağı əsaslı transgenik RNT kitabxanasının (KK kolleksiyası) 8,5%-i heterozigotdur və pVALIUM20 sisteminə əsaslanan transgen RNT-nin 17,9%-i VDRC heterozigotdur (Əlavə məlumat 1). Əvvəllər hazırlanmış transgen RNT sistemlərində istifadə edilən bütün bu vektorlar pUAST vektoruna əsaslanır, onun promotoru tandem UAS təkrarlarından və ardınca TATA qutusundan ibarətdir. Drosophila hsp70 gen 1,4. Nəzərə alsaq ki, hsp70 bazal promotor müəyyən toxumalarda Gal4 induksiyası olmadan transkripsiyanı standart 25℃ 9-da yönəldə bilər, biz bu homozigot transgen RNT xətlərinin ölümcüllüyünün sızan aktivləşməsi ilə bağlı ola biləcəyini fərz etdik. hsp70 bazal promotor.

Bu ehtimalı yoxlamaq üçün onu əvəz etdik hsp70 a ilə pVALIUM20 vektorunda bazal promotor Drosophila sintez edilmiş nüvə promotoru (DSCP) 13 . ildən hsp70 bazal promotor DSCP-dən uzundur, biz promotor və qaraçı izolyatorları arasında müvafiq iş məsafəsini təmin etmək üçün UAS-ın yuxarı axınına 100 bp boşluq ardıcıllığı əlavə etdik. Çoxsaylı shRNA-ların 14 dəqiq işlənməsi və ifadəsinə nail olmaq üçün miR-2a-1 və miR-2b-2 arasında intergenik bağlayıcı gücləndirdik və onu miR1 iskelesinin aşağı axınında klonladıq. Bu optimallaşdırmalarla nəticədə yaranan konstruksiyanı pNP vektoru kimi təyin etdik (Əlavə Şəkil 1).

Biz qanadda, gözdə, neyronlarda, bağırsaqda, testisdə və yumurtalıqların kök hüceyrə sistemində məlum funksiya itkisi fenotipləri ilə zülal kodlaşdıran genlər toplusunu hədəf alan shRNA-ları ifadə etmək üçün bu sistemdən istifadə edərək sabit transgenik xətlər hazırladıq və yaratdıq. Birincisi, yıxılma egfr, Hp1a, kis, Notch qanad xüsusi Gal4s tərəfindən idarə qanadda ciddi qanad qüsur (Şəkil. 1a) əmələ əvvəlki təsviri 4,15,16,17,18 uyğundur. Bundan əlavə, hədəfləmə ağ, yüngül, kirpi (H h) ey-Gal4-dən istifadə edərək əvvəlki hesabatlarla eyni göz fenotipini istehsal etdi (Şəkil 1b) 19,20,21, pNP transgenik RNT sisteminin somadakı genləri səmərəli şəkildə tükədə biləcəyini göstərir. Biz həmçinin neyronlarda pNP sisteminin effektivliyini təhlil etmək üçün məlum funksiya itkisi fenotipləri olan bir neçə gen seçdik. Əvvəlki hesabatlara uyğun olaraq 1,22,23, onların hamısı elav-Gal4 tərəfindən idarə edildikdə ölümcül nəticələrə səbəb oldu, bu da pNP-nin neyronlarda səmərəli işlədiyini göstərir (Əlavə Şəkil 2a). Sonra, bağırsaq, testis və yumurtalıq kök hüceyrə sistemində pNP sisteminin effektivliyini sınaqdan keçirdik. Biz yıxmaq üçün germ hüceyrə spesifik nos-Gal4 istifadə etdik piwi və ya bam, bu nəzarətlə müqayisədə yumurtalıq ölçüsünü ciddi şəkildə azaltdı (Şəkil 1c) və yumurta qoymayan milçəklərlə nəticələndi (Şəkil 1d). Bundan əlavə, RNAi bam əvvəlki hesabatlarda olduğu kimi cücərmə xətti kök hüceyrələrinin (GSC) sayını 24 artırdı. punt Nos-Gal4 tərəfindən testislərdə GSC və daha az mikrob hüceyrələri 25 və tükənmə göstərdi. çentik esg-Gal4 ilə bağırsaqda bağırsaq kök hüceyrələrinin və enteroendokrin hüceyrələrinin sayını artırdı (Əlavə Şəkil 2) 26 . Birlikdə götürdükdə, bu nəticələr göstərir ki, pNP transgenik RNT sistemi təkcə somada deyil, həm də neyronlarda, bağırsaqda, testisdə və yumurtalıqların kök hüceyrə sistemində hədəf genləri effektiv və spesifik şəkildə məhv edə bilir.

pNP sistemi soma və rüşeym xəttində səmərəli işləyir. a MS1096-Gal4 və ya C96-Gal4 istifadə edərək pNP-induksiya etdiyi qanad fenotiplərinin nümunələri. Tərəzi çubuqları, 500 μm. b yıxmaq ağ, yüngül və ya H h ey-Gal4 tərəfindən idarə olunan gözdə. Tərəzi çubuqları, 200 μm. c Yumurtalıq fenotipinin qaranlıq sahə şəkilləri, yıxılma ilə piwibam nos-Gal4 tərəfindən idarə olunur. Tərəzi çubuqları, 300 μm. d Nəzarət məhsuldarlıq dərəcələri, pNP-piwi və pNP-bam nos-Gal4 sürücüsündən istifadə edən dişi milçəklər (n = 10, orta ± s.d.). Məlumatlar tək quyruqlu Tələbə ilə qiymətləndirilir t-test (*səh < 0,05, **səh < 0.01, ***səh < 0,001)

Bazal promouterdən sızan ifadəni əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb

pNP və pVALIUM20 vektorlarında promotorların bazal fəaliyyətlərini müqayisə etmək üçün miR1 iskelesini lusiferaza müxbir kimi gen. Birincisi, biz Gal4 sürücüsü olmadan müxtəlif inkişaf mərhələlərində bu transgen milçəklərdə lusiferazanın sızan ifadəsini sınaqdan keçirdik. Şəkil 2a-da göstərildiyi kimi, pNP-dən lusiferaza intensivliyilusiferaza transgen milçəklər təhlil edilən bütün inkişaf mərhələlərində vəhşi tipli heyvanlara bənzəyir, lakin onların səviyyəsi pVALIUM20-də kəskin şəkildə artır.lusiferaza embrion mərhələsindən sonra heyvanlar. Potensial toxuma spesifik fərqləri yoxlamaq üçün biz üçüncü instar sürfələrdən fərqli toxumaları parçaladıq və lusiferaza analizlərini həyata keçirdik. Oxşar lusiferaza intensivliyi hər iki vektor ilə əzələ və mərkəzi sinir sistemində (beyin və sinir kordonu) müşahidə edilmişdir (Şəkil 2b). Bununla belə, biz pVALIUM20 sistemindən tüpürcək vəzində, kişi cinsiyyət bezində, qadın cinsiyyət bezində, yağlı bədəndə və qanad diskində müvafiq toxumalardan 685, 41, 42, 167 və 4 dəfə yüksək olan lusiferazanın əhəmiyyətli dərəcədə yüksəlmiş bazal ifadəsini müşahidə etdik. pNP sistemindən (Şəkil 2b).

Bazal promouterdən sızan ifadəni əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb. a pVALIUM20-nin müxtəlif inkişaf mərhələlərində nisbi lusiferaza ifadə səviyyələrilusiferaza və pNP-lusiferaza Gal4 sürücüsü olmadan uçur (n = 5, orta ± s.d.). b pVALIUM20-nin müxtəlif toxumalarında nisbi lusiferaza ifadə səviyyələrilusiferaza və pNP-lusiferaza sürfə mərhələsində Gal4 sürücüsü olmadan uçur (n = 3, orta ± s.d.). c pVALIUM20-dən politen xromosomunun immuno-boyanmasıHp1a və pNP-Hp1a Gal4 induksiyası olmadan. DNT DAPI ilə vizuallaşdırıldı və HP1a siçan monoklonal anti-HP1a (HP1a C1A9) ilə boyandı. Nöqtəli dairələr xromosentri göstərir. Tərəzi çubuqları, 20 μm. d pVALIUM20-də politen xromosomunun xromosom mərkəzində nisbi HP1a intensivliyinin kəmiyyətiHp1a və ya pNP-Hp1a Gal4 sürücüsü olmadan (n = 10, orta ± s.d.). Məlumatlar tək quyruqlu Tələbə ilə qiymətləndirilir t-test. e Nəzarətdə HP1a-nın nisbi ifadəsi, pVALIUM20-Hp1a və ya pNP-Hp1a Gal4 idarə etmədən tüpürcək vəzi (n = 3, orta ± s.d.). Məlumatlar birtərəfli Tələbədən istifadə edərək qiymətləndirilir t-test. f pVALIUM20 sisteminə əsaslanan transgen xətlərin və pNP sisteminə əsaslanan transgen xətlərin heterozigot faizi

Lusiferaza məruzəçisinə əsaslanan bu müşahidələri təsdiqləmək üçün biz pVALIUM20-dən politen xromosomlarından istifadə edərək immuno-boyanma yolu ilə heterokromatin zülal 1 (HP1) səviyyələrini müqayisə etdik.Hp1a və pNP-Hp1a Gal4 olmayan sürfələr. Nəzarət və pNP- ilə müqayisədəHp1a, pVALIUM20-dən politen xromosomlarında HP1a səviyyələriHp1a sürfələr əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır (Şəkil. 2c) və xromosentrdə nisbi HP1a intensivliyi 20% -ə qədər aşağı idi (Şəkil 2d), pVALIUM20-də shRNA-nın sızan ifadəsini göstərir.Hp1a. Bu müşahidəyə uyğun olaraq, biz qRT-PCR analizindən istifadə etdik və müşahidə etdik Hp1a pVALIUM20- tüpürcək vəzində mRNT səviyyələriHp1a sürfələr də nəzarətlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır, lakin fərqlər yoxdur Hp1a pNP- arasında mRNT səviyyələri müşahidə edilmişdir.Hp1a sürfələr və nəzarət sürfələri eyni inkişaf mərhələsindədir (Şəkil 2e). Birlikdə götürüldükdə, bu məlumatlar pVALIUM20 vektoru ilə müqayisədə pNP sisteminin sızan ifadəni əhəmiyyətli dərəcədə azaltdığını təsdiqləyir.

pVALIUM20 vektorundan sızan ifadənin uçmanın inkişafı üçün zərərli olub-olmadığını yoxlamaq və bununla da transgen heyvanların heterozigot dərəcəsini artırmaq üçün biz müvafiq olaraq 300-dən çox genə qarşı pVALIUM20 və pNP əsaslı transgen xətləri qurduq (Əlavə Məlumat 2). Hər bir hədəf gen üçün eyni shRNA müvafiq olaraq pVALIUM20 və ya pNP vektoruna klonlaşdırıldı və onlar eyni xromosom lokusuna daxil edildi. Bu transgen xətlərin heterozigot dərəcəsini müqayisə edərkən, pVALIUM20 sisteminə əsaslanan transgen xətlərin demək olar ki, 15%-nin heterozigot olduğunu müşahidə etdik ki, bu da mövcud ehtiyat mərkəzlərindəki nisbətə uyğundur, pNP sisteminə əsaslanan transgen xətlər isə yalnız 0,6% heterozigotluq nümayiş etdirdi ( Şəkil 2f). Bu nəticələr pNP sistemində sızan ifadənin əhəmiyyətli dərəcədə azaldığını, həmçinin pVALIUM20 sisteminin göstərdiyi yan təsirin azaldığını nümayiş etdirir.

PNP sistemi pVALIUM20 sistemindən daha səmərəlidir

pVALIUM20 sistemi bir çox gen üçün somatik hüceyrələrdə və qadın cücərmə xəttində yaxşı işləyir, lakin inkişafda olan bəzi funksional genləri hədəf alan shRNA-lar heç bir aşkar və ya zəif fenotiplər yaratmadı. pNP sisteminin pVALIUM20 sistemindən daha səmərəli olub olmadığını yoxlamaq üçün əvvəlcə pNP-nin müxtəlif toxumalarında lusiferazanın ifadəsini sınaqdan keçirdik.lusiferaza və pVALIUM20-lusiferaza elav-Gal4, MS1096-Gal4, Nub-Gal4, MTD-Gal4, nos-Gal4, GMR-Gal4 və esg-Gal4 daxil olmaqla müxtəlif Gal4 sürücülərindən istifadə edən transgenik milçəklər. Əlavə Şəkil 3-də göstərildiyi kimi, hər iki pNP-lusiferaza və pVALIUM20-lusiferaza transgen milçəklər nəzarətlə müqayisədə yüksək ifadəli lusiferaz nümayiş etdirdi. Bundan əlavə, pNP-nin lusiferaza intensivliyilusiferaza transgen milçəklərin hamısı pVALIUM20-dən əhəmiyyətli dərəcədə yüksəkdir.lusiferaza heyvanların bu sürücüləri istifadə etməsi, pNP sisteminin daha səmərəli olduğunu göstərir. Sonra göz, qanad və ya yumurtalıqların inkişafı zamanı kritik funksiyaları ilə tanınan zülalları kodlayan genləri hədəf alan eyni shRNA-ları seçdik və pNP sistemindən istifadə edərək transgen xətləri yaratdıq. Hədəflənən genlər idi E2F1, Upf1, aTub67C, və yumurta.

İlk nümunəmizdə hüceyrə dövrünün G1-S faza keçidinin tənzimlənməsində iştirak edən əsas transkripsiya faktoru olan E2F1-i sınaqdan keçirdik 27,28. tükənməsi E2F1 pVALIUM20-də ey-Gal4 istifadə edərək gözdə-E2F1 sistem göz ölçüsünü bir qədər azaldır, pNP-E2F1 ey-Gal4 ilə birləşən sistem daha kiçik bir göz əmələ gətirdi (şək. 3a). İkinci nümunə araşdırmamızda, yıxılandan bəri cəfəngiyat mRNA vasitəçiliyi ilə tənəzzüldə iştirak edən mühüm protein olan Upf1 29-u təhlil etdik. Upf1 MS1096-Gal4 və pVALIUM20 istifadə edərək-Upf1 sistem aşkar fenotiplər yaratmadı. Ancaq bunun tükəndiyini gördük Upf1 pNP-dən istifadə etməkləUpf1 MS1096-Gal4 tərəfindən idarə olunan ön çarpaz damar (a-cv) pozulmuş kiçik qanadlara gətirib çıxardı (Şəkil 3b). Eynilə, tükənmə aTub67C pVALIUM20 istifadə edərək qanadda-aTub67C sistem və Nub-Gal4, ehtimal ki, hüceyrələrdə bu transkriptin çoxluğuna görə heç bir fenotip yarada bilmədi. Buna baxmayaraq, pNP-dən istifadə edərək oxşar təcrübəaTub67C sistem son dərəcə kiçik qanadlara gətirib çıxardı (Şəkil 3c). Bu nəticələr pNP sisteminin somatik toxumalarda pVALIUM20-dən daha güclü fenotiplər istehsal etdiyini göstərir.

pNP sistemi pVALIUM20 sistemindən üstündür. a yıxmaq E2F1 pVALIUM20 sistemindən və ya ey-Gal4 tərəfindən idarə olunan eyni shRNA ilə pNP sistemindən istifadə edərək gözdə. Tərəzi çubuqları, 200 μm. b RNAi Upf1 MS1096-Gal4 istifadə edərək qanadda. Tərəzi çubuqları, 500 μm. c hədəflənməsi aTub67C pVALIUM20 sistemi və ya Nub-Gal4 tərəfindən idarə olunan pNP sistemi ilə. Tərəzi çubuqları, 500 μm. d yıxmaq yumurta nos-Gal4 tərəfindən idarə olunan rüşeym xəttində. Tərəzi çubuqları, 300 μm. e Nəzarət məhsuldarlıq dərəcələri, pVALIUM20-yumurta və pNP-yumurta nos-Gal4 sürücüsündən istifadə edən dişi milçəklər (n = 10, orta ± s.d.). Məlumatlar tək quyruqlu Tələbə ilə qiymətləndirilir t-test. f RNT-nin effektivliyinin qRT-PCR təhlili E2F1, Upf1, aTub67C,yumurta, müvafiq olaraq (n = 3, orta ± s.d.). Məlumatlar birtərəfli Tələbədən istifadə edərək qiymətləndirilir t-test (*səh < 0,05, **səh < 0.01, ***səh < 0,001)

Qadın rüşeym xəttində bu iki sistemin yıxılma səmərəliliyini müqayisə etmək üçün biz pNP- ilə nos-Gal4 xəttini keçdik.yumurta və pVALIUM20-yumurta. Şəkil 3d-də göstərildiyi kimi, pVALIUM20-dən olan yumurtalıqlaryumurta dişilər nəzarətdən daha kiçik idi, lakin pNP-dən olan yumurtalıqlaryumurta dişilərin ölçüsü daha da kiçildildi (şəkil 3d). Nəticədə, pVALIUM20-dən istehsal edilən bir neçə yumurta ilə müqayisədəyumurta dişilər, biz pNP-dən heç bir yumurta almadıq.yumurta dişilər (Şəkil 3e). Bu nəticələr göstərir ki, pNP sistemi də qadın rüşeym xəttindəki pVALIUM20 sistemindən daha səmərəli işləyir. Üstəlik, hədəfdən kənar təsir ehtimalını istisna etmək və Şəkil 3-də yaradılan fenotipi xilas etmək üçün xüsusi Gal4 xətləri ilə idarə olunan RNAi milçəklərindəki saç sancaqlarına həssas olmayan hədəf genləri həddindən artıq ifadə etdik. Əlavə Şəkil 4-də göstərildiyi kimi, həm pVALIUM20 ilə induksiya olunan fenotip, həm də pNP-induksiya etdiyi fenotiplərin hamısı müvafiq olaraq, RNTİ fenotipləri ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə xilas edildi və bu RNTİ-lərin spesifikliyini göstərir. Birlikdə götürdükdə, bu nəticələr bu pNP sisteminin səmərəliliyini və spesifikliyini dəstəkləyir.

pNP sisteminin pVALIUM20 sisteminə nisbətən maraq doğuran genləri tükəndirməkdə daha səmərəli olduğu anlayışını daha da təsdiqləmək üçün biz qRT-PCR analizindən istifadə edərək mRNT səviyyələrini kəmiyyətləndirdik. Baxmayaraq ki, pVALIUM20 sistemi transkriptləri əhəmiyyətli dərəcədə azaldır E2F1, Upf1, və yumurta nəzarət ilə müqayisədə, bu mRNAs daha tükənməsi pNP sistemi (Şəkil. 3f) oxumaq əldə edilmişdir. Üçün aTub67C gen, pVALIUM20 sistemi mRNA səviyyəsinə təsir etmədi, lakin pNP sistemindən istifadə edən qanad disklərində əhəmiyyətli azalma müşahidə edildi (Şəkil 3f). Bu müşahidələr yuxarıda qeyd olunan fenotipik analizlərə uyğundur. Maraqlıdır ki, tubulin ailəsinin bir üzvü olaraq, aTub67C pVALIUM20 sisteminin yıxıla bilmədiyi hüceyrələrdə yüksək şəkildə ifadə edilir. aTub67C transkriptlər (Şəkil 3f), pVALIUM20 sisteminin yüksək dərəcədə ifadə olunan genlərin tükənməsində zəifliyini ifadə edir. Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr pNP sisteminin həm soma, həm də qadın cücərmə xəttində pVALIUM20 sistemindən daha səmərəli olduğunu göstərir.

PNP sistemi yüksək ifadəli genləri səmərəli şəkildə modullaşdırır

Hüceyrələrdə yüksək şəkildə ifadə olunan genləri səmərəli şəkildə tükəndirmək bu sahədə problem olmuşdur. ilə apardığımız müşahidələr aTub67C gen bizi pNP sistemini pVALIUM20 sistemi ilə müqayisə etmək üçün əlavə halları sınaqdan keçirməyə sövq etdi. Bunun üçün çox nüsxəli genlər toplusunu seçdik, histon H1, H2A, H2B, H3, və H4, hamısı hüceyrələrdə yüksək şəkildə ifadə edilir. Hər bir histon geni üçün eyni saç sancaqlarından istifadə edərək, pNP sistemi və ya pVALIUM20 sistemi əsasında transgen RNTi milçəkləri qurduq. MS1096-Gal4 tərəfindən idarə edildikdə, pNP sistemindən istifadə edərək bütün histonları yıxın, hüceyrə canlılığında histonların kritik roluna uyğun olaraq ciddi qanad qüsurları əmələ gətirdi (Əlavə Şəkil 5). Təəccüblüdür, tükənir H1 və ya H3 pVALIUM20 sistemindən istifadə edərək, yıxılarkən zəif və ya heç bir anormal fenotip yaratmadı. H2A, H2B, və ya H4 bu sistemdə pupa mərhələsindən əvvəl ölümcülliyə səbəb oldu (Əlavə Şəkil 5). pNP sisteminin pVALIUM20 sistemindən daha səmərəli, lakin daha az sızma olduğunu nəzərə alsaq, pVALIUM20-nin sızan ifadəsinin olduğundan şübhələnirdik.H2A, H2B, və H4 üstəlik erkən inkişaf mərhələlərində MS1096-Gal4 induksiya edilmiş RNTİ bu pVALIUM20 transgen xətlərinin ölümcül olmasına səbəb ola bilər.

Bu fikri sınamaq üçün pNP və pVALIUM20 istifadə edərək qanad fenotiplərini müqayisə etmək üçün Nub-Gal4 küvet-Gal80 ts sistemini seçdik. Gal80 ts, nəzarəti altında olan Gal4-ün temperatura həssas repressorudur tubulin promouter 30,31. Keçidilmiş milçəklər əvvəlcə Gal80-in Gal4 fəaliyyətlərini sıxışdırmağa imkan verən icazə verilən temperatur 18 ℃ altında saxlanıldı. Üçüncü instar sürfələr daha sonra 29 ℃-ə köçürüldü, bu da Gal80-ni təsirsiz hala gətirir və bununla da Gal4-dən asılı ifadənin normal şəkildə baş verməsinə və histon genlərinin tükənməsinə imkan verir. Şəkil 4a-da göstərildiyi kimi, MS1096-Gal4 tərəfindən idarə olunan RNAi fenotiplərinə bənzər pNP sistemindən istifadə edərək tükənmiş bütün histonlar üçün ciddi şəkildə pozulmuş qanad fenotipini müşahidə etdik (Əlavə Şəkil 5). Bunun əksinə olaraq, pVALIUM20 sistemi tükənmiş histonların heç biri üçün aşkar fenotip göstərmədi (Şəkil 4a). qRT-PCR nəticəsi, həmçinin pNP sisteminin pVALIUM20 sistemindən daha səmərəli olduğunu təsdiqlədi (Şəkil 4b), pNP sistemini dəstəkləmək, aşağı yanlış müsbət nəticələrlə yüksək ifadə genlərini səmərəli şəkildə modullaşdıra bilər.

pNP sistemi yüksək ifadəli genləri səmərəli şəkildə modulyasiya edə bilər. a Nub-Gal4 küvet-Gal80 ts sistemi pNP və pVALIUM20 sistemlərində histonların şərti olaraq yıxılması üçün istifadə edilmişdir, milçəklər əvvəlcə 18 °C-də inkubasiya edilmiş və sonra üçüncü sürfə mərhələsində 29 °C-yə köçürülmüşdür. Tərəzi çubuqları, 500 μm. b Act-Gal4 küvet-Gal80 ts sistemi RNT-nin effektivliyinin qRT-PCR analizi üçün istifadə edilmişdir. H1, H2A, H2B, H3,H4 (n = 3, orta ± s.d.). Məlumatlar birtərəfli Tələbədən istifadə edərək qiymətləndirilir t-test (*səh < 0,05, **səh < 0.01, ***səh < 0,001)

pVALIUM20-də yanlış müsbət nəticələrH2A, H2BH4 milçəklər çox güman ki, erkən inkişaf mərhələsində sızan ifadənin və MS1096-Gal4-ə səbəb olan RNTİ-nin birləşməsindən idi. Bizim təhlilimizdə pVALIUM20-H2A, H2BH4 MS1096-Gal4 tərəfindən idarə olunanların hamısı ölümcül idi (Əlavə Şəkil 5), lakin erkən inkişaf mərhələsində RNT-nin qarşısını alan Nub-Gal4 çəllək-Gal80 ts istifadə edərək canlı idi və zəif qanad fenotipləri yaratdı (Şəkil 4a). Bununla birlikdə, MS1096-Gal4 tərəfindən daha səmərəli pNP sistemində (həmçinin aşağı sızan ifadə ilə) idarə olunan bu saç sancaqları canlı idi (Əlavə Şəkil 5) və Nub-Gal4 küvet-Gal80 ts ilə eyni ağır fenotipləri verdi (Şəkil 4a) . Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr göstərir ki, pVALIUM20 sisteminin və MS1096-Gal4 induksiya edilmiş RNTi-nin erkən inkişaf mərhələsində sızan ifadəsi yanlış müsbət nəticələrə səbəb ola bilər.

Bu müşahidələr göstərdi ki, pVALIUM20 sistemi sızan və qeyri-spesifik ifadə səbəbindən ölümcül nəticələrə səbəb ola bilər ki, bu da xüsusilə bu sistemi geniş miqyaslı genetik ekranlar üçün tətbiq edərkən problem yarada bilər. Məsələn, pNP-dəki shRNA-ların qanadlara xas olan Gal4 ilə kəsişdikdə qanad qüsuru fenotipləri verdiyi 20 geni təsadüfi seçdik, onlardan üçü pVALIUM20-də eyni saç sancaqları istifadə olunarsa ölümcül idi, pNP sisteminin yüksək toxuma spesifikliyini daha da dəstəkləyir (Əlavə). Məlumat 3). Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr göstərir ki, pNP sistemi pVALIUM20 sistemindən daha effektivdir ki, maraq doğuran genləri, o cümlədən yüksək ifadə səviyyəsinə malikdir və pVALIUM20-də tez-tez müşahidə olunan açıq-aydın sızan ifadə olmadan gözlənilən güclü fenotipləri yaradır. sistemi.

PNP sistemi eyni vaxtda birdən çox geni hədəf ala bilir

İki və ya daha çox gen tərəfindən kodlanan zülallar Drosophila qismən üst-üstə düşən və ya artıq funksiyalara malik ola bilər və beləliklə, onlardan birinin tükənməsi funksional və ya fenotipik analizlərə az təsir göstərə və ya heç bir təsir göstərə bilməz. Bundan əlavə, zülal kompleksinin tək alt bölməsinin tükənməsi in vivo olaraq dominant-mənfi və ya neomorfik təsir göstərə bilən qismən protein komplekslərinin əmələ gəlməsi ilə nəticələnə bilər. Beləliklə, birdən çox genin eyni vaxtda tükənməsi sərfəlidir. Bununla belə, mövcud transgen RNT vektorları yalnız bir shRNA-nı qəbul edə bilər, buna görə də iki və ya daha çox geni eyni vaxtda hədəfləmək üçün çətin genetik xaçlar tələb olunur. Başqa bir problem, genetik rekombinasiyanın Gal4-ün seyreltilməsi səbəbindən RNT-nin effektivliyini azalda bilməsi, həmçinin qeyri-sağlam rekombinantların tez-tez baş verməsidir.

miR-2a-1 və miR-2b-2 arasındakı intergenik bağlayıcı bölgə, çoxlu shRNA-ları ifadə edə bilən miR1 iskelesindən sonra pNP vektoruna daxil edildi (Əlavə Şəkil 1). Eyni vektorda bu hədəf gen dəstlərini ayrı-ayrılıqda və ya eyni vaxtda tükəndirmək üçün səmərəliliyi müqayisə edərək, paralel olaraq üç təcrübə dəsti həyata keçirdik. Birincisi, bir saç sancağını hədəfləyən subklonlaşdırdıq çentik gen və bir saç sancağı hədəflənir gen pNP vektoruna daxil olur, pNP- olaraq təyin olunur.N-W vektor və yaradılan transgen xətləri. Fərdi olaraq pNP vektoruna subklonlaşdırılmış eyni saç sancaqları müsbət nəzarət kimi istifadə edilmişdir. Gözə xas GMR-Gal4 xətti ilə idarə edildikdə, RNT-nin tükənməsi ya yıxarkən, gözlərdə qırmızı piqmentləri tamamilə aradan qaldırdı çentik tək və ya çentik birlikdə (çentik-) sürfə mərhələsində ölümcülliyə səbəb olmuşdur (şək. 5a). Əgər RNTİ qanada xüsusi C96-Gal4 xətti ilə induksiya edilibsə, tükənən qanadda gözlənildiyi kimi heç bir anormal fenotip yaratmadı, halbuki hər ikisinin tükənməsi çentik tək və ya Çəngəl-ağ azaldılmış ölçü ilə eyni qanad fenotipini yaratdı. Göz üzərindəki təsirlərinin tükənməsi müşahidə edilir gen və yıxılma nəticəsində yaranan qanad təsirləri çentik pNP- daxilində müstəqil olaraq baş verir.N-W xətt göstərir ki, pNP vektoru eyni vaxtda bir RNAi vektoru ilə çoxlu geni hədəf ala bilir (Şəkil 5b). RNTi-induksiya etdiyi fenotiplərin pNP vektorunda saç sancaqlarının sırası ilə təsirlənməsi ehtimalını yoxlamaq üçün biz transgenik xətt yaratdıq. qarşısında saç tokası çentik saç sancısı (pNP-W-N) və sonra RNAi səmərəliliyini pNP-nin effektivliyi ilə müqayisə etdi.N-W xətt. Şəkil 5a, b-də göstərildiyi kimi, həm pNP-W-N və pNP-N-W xətlər GMR-Gal4 və ya C96-Gal4 xətləri ilə idarə olunduqda eyni fenotiplər yaratdı, bu, pNP vektorunda olan saç sancaqlarının ardıcıl təsir etmədən müstəqil olaraq fəaliyyət göstərdiyini göstərir.

pNP sistemi eyni vaxtda birdən çox geni hədəf ala bilir. a RNAi qarşı Gözdə qırmızı piqmentin tam itkisinə səbəb olduğunu da qeyd edin çentik GMR-Gal4 istifadə edərək gözdə ölümcül nəticələrə səbəb oldu. Tərəzi çubuqları, 200 μm. b Nəzarətlə müqayisədə pNP-N, pNP-W-N və pNP-N-W C96-Gal4 tərəfindən idarə olunan hamısı oxşar göstərdi çentik qanad qüsuru fenotipləri. Tərəzi çubuqları, 500 μm. c pozulması Ci Nub-Gal4 tərəfindən idarə olunan qanadın L3 və L4 damarlarının ön birləşməsini əmələ gətirdi, qanadları yıxdı. E2F1 L2 və L3 damarlarının anterior füzyonu ilə kiçik qanad meydana gətirdi. L2, L3, L4 damarlarının və kiçik qanadın ön birləşməsinin birləşmiş fenotipi pNP-də göstərilmişdir.Ci-E2F1 və pNP-E2F1-Ci uçur. Tərəzi çubuqları, 500 μm. d, e pNP-nin ənənəvi genetik birləşməsiCi və pNP-E2F1 daha zəif bir fenotip nümayiş etdirdi. pNP-nin yalnız kiçik bir hissəsiCi pNP-E2F1 milçəklər hər ikisini göstərdi Ci KD və E2F1 KD fenotipi onların əksəriyyətini də yaradır Ci KD və ya E2F1 KD, vəhşi tipli fenotiplərlə belə oxşarlar var idi. Tərəzi çubuqları, 500 μm

Bundan əlavə, başqa bir protein kodlaşdıran gen dəsti seçdik, CiE2F1, Nub-Gal4 istifadə edərək hər ikisini tükəndirmək qanadda fərqli fenotiplər yaratdı. Şəkil 5c-də göstərildiyi kimi, tükənir Ci pNP-dən istifadə etməkləCi yıxılarkən qanadın ölçüsünə təsir etmədən L3 və L4 arasında ön birləşmə yaratdı E2F1 pNP-dən istifadə etməkləE2F1 L2 və L3 arasında damar füzyonu ilə daha kiçik bir qanad əldə etdi. Hər iki gen pNP-dən istifadə edərək tükəndikdəCi-E2F1 xətt və ya pNP-E2F1-Ci xəttində pNP- üçün olduğu kimi eyni kiçik ölçülü qanadı müşahidə etdik.E2F1, bir də damar füzyonları daşıyan L2 və L3 arasında idi E2F1 KD, digəri L3 ilə L4 arasında idi Ci KD (Şəkil 5c). Bu fenotiplər ya tükənmə nəticəsində yarananların əlavə təsirindən qaynaqlanır E2F1 və ya Ci tək, pNP sisteminin çoxlu geni hədəfləməsində yüksək səmərəliliyini daha da dəstəkləyir. Yenə də pNP-ni müqayisə etməklə ardıcıl təsir müşahidə edilməmişdir.Ci-E2F1 xətt və pNP-E2F1-Ci xətt (Şəkil 5c). Çoxsaylı shRNA-nın effektivliyini pNP sistemindən ənənəvi genetik rekombinasiya ilə müqayisə etmək üçün pNP-Ci və pNP-E2F1 Əvvəlcə genetik olaraq rekombinasiya edildi və sonra Nub-Gal4 xətti ilə keçdi. Maraqlıdır ki, pNP-nin yalnız 2,47%-iCi pNP-E2F1 milçəklər hər ikisini göstərdi Ci KD və E2F1 KD fenotipləri onların əksəriyyətini ya da əmələ gətirir Ci KD və ya E2F1 6.81% faktiki olaraq heç bir aşkar fenotip (Şəkil. 5d, e) istehsal isə, tək KD fenotipi. Bu dəyişən nəticə, çox güman ki, iki UAS kasetinin Gal4 bağlaması üçün rəqabətə görə çoxlu geni yıxmaq üçün ənənəvi genetik rekombinasiyadan istifadənin başqa bir çatışmazlığını göstərir. Bundan əlavə, pNP-nin inteqrasiya edilmiş xətti ilə milçəklərCi pNP-E2F1 homozigotluq yetkinlik yaşına çatmazdan əvvəl öldürücü olduğu üçün çox güman ki, çoxlu ekzogen genetik komponentlər səbəbindən zəif görünürdü. Bu müşahidələr pNP sisteminin çoxsaylı geni hədəfləmək üçün ənənəvi rekombinasiyadan daha möhkəm və çox yönlü olması fikrini daha da dəstəkləyir.

pNP-nin eyni vaxtda birdən çox geni tükəndirmək qabiliyyətini daha da təsdiqləmək üçün bu sistemi normal inkişaf 32 üçün vacib olan transkripsiya repressor kompleksləri kimi fəaliyyət göstərən Polycomb repressiv kompleks 1 (PRC1) üçün tətbiq etdik. PRC1-in dörd əsas zülalının eyni vaxtda yıxılması ciddi göz qüsurları yaratdı, onların ayrı-ayrılıqda tükənməsi gözdə heç bir qüsura səbəb olmadı (Əlavə Şəkil 6a).Tetradik-gen-KD-nin RNT-nin effektivliyi qRT-PCR analizi ilə sınaqdan keçirilmiş tək genli -KD ilə də müqayisə edilə bilər (Əlavə Şəkil 6b). Birlikdə götürdükdə, bu nəticələr pNP sisteminin eyni vaxtda birdən çox geni sıradan çıxarmaq üçün əla effektivliyini nümayiş etdirir.

HAT-lar Wnt siqnal yolları vasitəsilə gözün inkişafını tənzimləyir

Qismən lazımsız funksiyaları olan zülalların tədqiqi üçün bu transgen RNT sistemini sınaqdan keçirmək məqsədilə biz histon asetiltransferazaların (HAT) ailəsini, əsasən histonlarda lizin qalıqlarını asetilatlayan fermentləri öyrənməyi seçdik. HAT fermentlər ailəsinin transkripsiya aktivləşdirilməsini, DNT təmirini və hüceyrə siklini tənzimlədiyini nəzərə alsaq, onların fəaliyyətlərinin tənzimlənməməsi çox vaxt bir çox inkişaf pozğunluqlarında və xərçəng kimi xəstəliklərdə epigenetik dəyişikliklərlə əlaqələndirilir 33 . Transkripsiya aktivləşdirilməsi çoxlu HAT tələb edir və bəzi HAT-ların funksiyaları ümumiyyətlə lazımsızdır, buna görə də bir HAT-ın tükənməsi fenotiplər yaratmaq üçün kifayət deyil. Biz təhlillərimizi, o cümlədən MYST və ya GNAT ailələrinə aid bir sıra HAT-lara yönəltdik chm, Tip60, və Gcn5. Qarşı transgenik RNT xətləri meydana gətirdikdən sonra chm, Tip60, Gcn5, və birləşmələri chm-Tip60chm-Tip60-Gcn5, biz bu xətləri gözə xas GMR-Gal4 xətti ilə keçdik. Biz müşahidə etdik ki, pNP-chm, pNP-Tip60, pNP-Gcn5, və pNP-chm-Tip60 gözdə heç bir qüsur yaratmadı (şək. 6a). Bununla birlikdə, pNP-dən istifadə edərək gözdəki hər üç HAT-ın eyni vaxtda tükənməsichm-Tip60-Gcn5 xətt göz piqmentinin həddindən artıq istehsalı, nekrotik hüceyrə ölümü və göz ölçüsünün bir qədər azalması ilə xarakterizə olunan ciddi qüsurlu göz fenotipinə gətirib çıxardı (Şəkil 6a) Bunun hədəfdən kənar təsirlərdən qaynaqlanması ehtimalı azdır, çünki onlardan hər hansı birinin tükənməsi. aşkar qüsurlar yaratmadı.

Histon asetiltransferazları Wnt siqnal yolları vasitəsilə gözün inkişafını tənzimləyir. a chm, Tip60, Gcn5 tək yıxmaq və ya chm-Tip60 ikiqat yıxma GMR-Gal4 tərəfindən idarə olunan vəhşi tipli fenotip nümayiş etdirdi, eyni zamanda yıxıldı chm-Tip60-Gcn5 pNP sistemindən istifadə edərək ciddi göz qüsurları meydana gəldi. Tərəzi çubuqları, 200 μm. b qRT-PCR nəticələri bunu göstərir chm, Tip60, Gcn5 tək genin yıxılması və ya üç gen yıxılması milçəklərində hamısı müqayisə edilə bilən səviyyəyə endirilir. (n = 3, orta ± s.d.). c Wnt siqnal yolu qRT-PCR analizi ilə Wg ilə təmsil olunduğu kimi əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimləndi (n = 3, orta ± s.d.). Məlumatlar birtərəfli Tələbədən istifadə edərək qiymətləndirilir t-test. d İmmun boyama nəticəsi GFP ilə işarələnmiş yuxarı tənzimlənmiş Wg göstərdi chm-Tip60-Gcn5 KD klonları. Nöqtəli xətlər GFP ilə işarələnmiş klonu göstərirdi. İdarəetmə ilə müqayisədə (uzun quyruq oxları ilə göstərilir) Wg siqnalları əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır chm-Tip60-Gcn5 KD klonu (qısa quyruq oxları ilə göstərilir). Tərəzi çubuqları, 50 μm. e Transkripsiya aktivləşdirilməsi wg kimi oxşar göz fenotipi istehsal etdi chm-Tip60-Gcn5 KD uçur. Knockdown of wg və ya qol fonunda chm-Tip60-Gcn5 üçlü RNT göz fenotipini aydın şəkildə xilas etdi. Tərəzi çubuqları, 200 μm

Bu fenotipin həqiqətən tükənməsindən qaynaqlandığını təsdiqləmək üçün chm, Tip60, və Gcn5, GMR-Gal4 tərəfindən tetiklenen RNAi-dən sonra bu genlərin transkriptlərini göz disklərində ölçmək üçün qRT-PCR analizi etdik. Nəzarətlə müqayisədə, fərdi RNAi xətlərindən və üçlü RNAi xəttindən olan transkriptlərin hamısı əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır (Şəkil 6b). Qeyd etmək lazımdır ki, üçlü RNAi xəttində RNT-nin tükənməsinin səmərəliliyi fərdi RNAi xətləri ilə müqayisə edilə bilərdi, bu da pNP sisteminin eyni vaxtda birdən çox geni hədəfləmək gücünü nümayiş etdirdi. Hədəfdən kənar təsirlərin mümkünlüyünü daha da istisna etmək üçün həddindən artıq ifadə etdik chm-T2A-Tip60-T2A-Gcn5 T2A öz-özünə parçalanan peptiddən istifadə edərək saç sancaqlarına qarşı həssas olmayan chm-Tip60-Gcn5 üçqat KD uçur və KD fenotipi bu RNAi təcrübəsinin spesifikliyini dəstəkləyərək tamamilə xilas edildi (Əlavə Şəkil 7b). Bundan əlavə, biz bu yaxınlarda inkişaf etdirdiyimiz flySAM sistemindən istifadə edərək eyni vaxtda bu üç geni hədəfləyən transgen aktivləşdirmə xətti yaratdıq 34. Əlavə Şəkil 7c-də göstərildiyi kimi, bu üç genin aktivləşdirilməsi də əhəmiyyətli dərəcədə xilas oldu. chm-Tip60-Gcn5 üçlü KD şişə bənzər fenotip, bu üçlü KD nəticəsinin spesifikliyini daha da dəstəkləyir.

Bundan əlavə, ferment fəaliyyətini təsdiqləmək üçün chm, Tip60, Gcn5 histon asetilasiyası ilə əlaqədar olaraq, tüpürcək vəzinə məxsus 1824-Gal4 tərəfindən induksiya edilən RNT-dən sonra politen xromosomlarında qlobal H4 asetilasiya səviyyəsini aşkar etmək üçün immun boyama apardıq. pNP-dən politen xromosomlarında H4 asetilləşməsinə qarşı immun boyama intensivliyichm, pNP-Tip60, pNP-Gcn5 xətlər nəzarətlə müqayisədə bir qədər aşağı idi, halbuki pNP-dən politen xromosomlarında H4 asetilasiya səviyyəsichm-Tip60-Gcn5 xətt demək olar ki, aşkar edilmirdi (Əlavə Şəkil 8). Birlikdə götürüldükdə, bu müşahidələr bu HAT-ların epigenomdakı lazımsız rollarını nümayiş etdirir və pNP sisteminin çoxsaylı geni uğurla modulyasiya etmək qabiliyyətini daha da dəstəkləyir.

Qarşı üçlü RNTİ tərəfindən istehsal olunan ağır göz qüsuru fenotipinin molekulyar mexanizmini araşdırmaq chm-Tip60-Gcn5, göz inkişafını tənzimləməkdəki rollarına görə JAK-STAT, EGFR, Hippo, JNK, dpp, Notch və Wnt siqnal yolları kimi bir neçə əsas siqnal yollarının aşağı axınında genlərin transkripsiya səviyyəsini aşkar etdik. Konkret olaraq ifadəsini təhlil etdik SOCS36E, aos, Yki, puc, ata, Su(H)wg Bu HAT-ların tükəndiyi göz disklərində yuxarıda qeyd olunan siqnal yollarının fəaliyyəti üçün oxunuşlar 35 . Şəkil 6c-də göstərildiyi kimi, wg, Wnt siqnalının hədəfi, nəzarətin beş qatından çoxu ilə əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimləndi, sınaqdan keçirilmiş digər siqnal yollarının təmsilçi hədəf genləri isə HAT tükənmiş göz disklərində əhəmiyyətli dərəcədə təsirlənmədi. Bu müşahidələr göstərir ki, Wnt göz disklərində bu HAT-lardan təsirlənən əsas siqnal yolu ola bilər.

HAT-ların tükənməsinin Wnt siqnalına təsirini yoxlamaq üçün biz yaratdıq chm-Tip60-Gcn5 KD klonları qanad disklərində GFP ilə işarələnmiş və sonra immun boyama istifadə edərək Wg ifadə səviyyələrini təhlil etmişdir. Şəkil 6d-də göstərildiyi kimi, chm-Tip60-Gcn5 KD klonları Wg zülallarının açıq şəkildə yüksəldiyini göstərdi. Bu arada biz inşa etdik wg transkripsiya aktivləşdirilməsi CRISPRa sistemindən 34 istifadə edərək uçur, bu da göz fenotipinə tam oxşardır. chm-Tip60-Gcn5 GMR-Gal4 tərəfindən idarə edildikdə KD (Şəkil 6e). Qüsurlu göz fenotipinin həqiqətən yüksək Wg siqnalından qaynaqlandığını daha da təsdiqləmək üçün biz tükənmişik wg üçlü yıxılması ilə yanaşı chm, Tip60Gcn5. ilə müqayisədə chm-Tip60-Gcn5-GFP-RNAi nəzarəti ilə eyni idi chm-Tip60-Gcn5 KD fenotipinin yıxıldığını müşahidə etdik wg HAT-ların tükənməsi nəticəsində yaranan göz fenotipini əhəmiyyətli dərəcədə xilas etdi. Eynilə, üç HAT-ın eyni vaxtda tükənməsi və qol, Wg siqnal yolunun əsas komponentini kodlayan, bu HAT-ların tükənməsi nəticəsində yaranan qüsurlu göz fenotipini dramatik şəkildə xilas etdi (Şəkil 6e). Bütün bu təhlillər bunu deməyə əsas verir chm, Tip60Gcn5 Əsasən Wnt siqnal yolunu modulyasiya etməklə, göz inkişafının tənzimlənməsində sinergik olaraq mühüm rol oynayır.


Transgenin fenotipik xarakteristikası Miscanthus sinensis Həddindən artıq ifadə edən bitkilər Ərəbidopsis Fitoxrom B

Fitoxromlar qırmızı və uzaq qırmızı işığı udma formaları arasında geri dönən fotoxromizmə malik dimerik piqment zülallarıdır. Onlar bitki böyüməsinin və inkişafının müxtəlif aspektlərini tənzimləyən fotoreseptorlardır və bitkilərin kənd təsərrüfatı məhsuldarlığını yaxşılaşdırmaq üçün biotexnoloji tətbiqlər üçün istifadə edilmişdir. Miscanthus növlər ən perspektivli enerji bitkilərindən biri kimi təklif edilmişdir. Bu vərəqdə, Ərəbidopsis fitoxrom B (PHYB) gen daxil edilmişdir Miscanthus sinensis istifadə edərək Aqrobakteriya-Herbisid müqavimət geni ilə bu yaxınlarda inkişaf etdirdiyimiz vasitəli transformasiya üsulu (BAR) seçim markeri kimi. Güman edilən transgen bitkilər herbisid müqaviməti təhlili ilə seçildikdən sonra transgenin genomik inteqrasiyası genomik PCR və Southern blot analizi ilə təsdiqləndi və transgen ifadəsi Northern blot analizi ilə təsdiq edildi. Transformasiya edilməmiş nəzarət bitkiləri ilə müqayisədə, transgen bitkilər həddindən artıq ifadə edir PHYB artan xlorofil məzmunu, azalmış bitki hündürlüyü və gecikmiş çiçəklənməni ehtiva edən artan fitoxrom B funksiyası ilə fenotipləri göstərdi. Ona görə də bu nəticələr onu deməyə əsas verir Ərəbidopsis fitoxrom B funksionaldır M. sinensis və inkişaf etdirmək üçün bir üsul təqdim edir Miscanthus fitoxromlardan istifadə edərək inkişaf etmiş kənd təsərrüfatı məhsuldarlığı olan sortlar.

1. Giriş

Fitoxromlar ətraf mühitdən gələn qırmızı və uzaq qırmızı işıq siqnallarına cavab olaraq bitki böyüməsinin və inkişafının müxtəlif aspektlərini tənzimləyən fotoreseptorlardır [1, 2]. Onlar hər bir monomeri (120-130 kDa) olan dimerik xromopeptidlərdir, sistein qalığı ilə tioeter əlaqəsi vasitəsilə fitoxromobilin adlı kovalent bağlı açıq tetrapirol xromofora malikdir [3]. Fitoxromların ən vacib xüsusiyyəti onun geri dönən fotoxromizmidir: fotonun udulması ilə rəngin dəyişməsi və başqa bir fotonun udulması ilə orijinal formasına qayıtma xüsusiyyəti. Fitoxromlar qırmızı işığı udan Pr şəklində sintez olunur (

nm) uzaq qırmızı işığı udan Pfr formasına fototransformasiya edilə bilər (

nm) qırmızı işığa məruz qaldıqda. Fitoxromların funksional fəaliyyəti bu iki forma arasında fotoxrom transformasiyası ilə modullaşdırılır [4, 5]. Ümumiyyətlə, fitoxromun Pr-to-Pfr fototransformasiyasının bitkilərdə fotomorfogenez üçün yüksək tənzimlənən siqnal şəbəkəsini induksiya etdiyi məlumdur [6-8].

Fitoxrom vasitəsilə həyata keçirilən fotomorfogen reaksiyalara cücərmə, gövdə və yarpaq böyüməsi, xloroplastın inkişafı, xlorofillərin və digər piqmentlərin biosintezi, kölgədən yayınma, sirkadiyalı ritm və çiçəklənmə daxildir [9]. Fitoxromların biotexnoloji tətbiqləri aspektində, fitoxrom transgenlərini həddindən artıq ifadə edən bitkilərin fizioloji təhlili əvvəllər bitki bitkilərinin arxitekturasını dəyişdirmək üçün transgenik yanaşmaların potensialını aşkar etmişdir [10]. Nümunə olaraq, yulafın fitoxrom A transgenini ifadə edən tütün bitkiləri (PHYA) məhsul indeksinin 20%-ə qədər yaxşılaşmasına səbəb olan yaxınlıq-şərti cırtdanlıq nümayiş etdirir [11]. Prinsipcə, fitoxromlar bitkilərin qonşulardan əks olunan uzaq-qırmızı radiasiyaya reaksiya verdiyi və yan-yana böyüyən rəqiblərin üst-üstə düşməsinin qarşısını almaq üçün uzanma artımına səbəb olduğu bitki kölgəsindən yayınma reaksiyalarına vasitəçilik edir [12]. Kölgədən yayınma reaksiyalarına səbəb olarsa, resursların uzanma artımına yenidən bölüşdürülməsi məhsul məhsuldarlığının azalması ilə yarpaq və saxlama orqanının istehsalının azalması ilə nəticələnə bilər [13]. Beləliklə, kölgədən yayınma reaksiyaları əkin sıxlığını məhdudlaşdırdığı üçün kənd təsərrüfatında zərərli ola bilər. Buna görə də, bitki məhsuldarlığının fitoxrom qırmızı/uzaq-qırmızı işıq qavrayışının manipulyasiyası yolu ilə qonşuların qavrayışını azaltmaqla (yəni kölgədən yayınma reaksiyalarının qarşısını almaqla) artırıla biləcəyi təklif edilmişdir [14].

Miscanthus növlər C4 fotosintezli hündür çoxillik rizomatoz otlardır və geniş iqlim diapazonlarında hər il yüksək biokütlə məhsulu verməyə meyllidirlər [15, 16]. Beləliklə, onlar biokütlə istehsalı üçün ən perspektivli enerji bitkilərindən biri kimi təklif edilir [17]. İndiyə qədər triploid hibrid Miscanthus × giganteus diploid arasında M. sinensis və tetraploid M. sacchariflorus hal-hazırda cinsdə ticari olaraq yetişdirilən növdür [18, 19]. Bununla belə, bu hibrid sterildir və genetik variasiyadan məhrumdur, buna görə də genetik cəhətdən sabit və münbit növlərdə toxumla yayılan sortlara ehtiyac var, məsələn M. sinensis, qaldırılmışdır [20].

Adi yetişdirmə ilə genetik təkmilləşdirmə bir çox növlərin xüsusiyyətlərini yaxşılaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir, lakin onun müvəffəqiyyəti cinsi çoxalma və yetişdirmə proqramları üçün tələb olunan nisbətən uzun müddətlər kimi maneələrlə məhdudlaşdı. Bu yaxınlarda bitki transformasiya texnologiyalarının köməyi ilə genetik mühəndislik üsulları bir çox növlərin daha səmərəli təkmilləşdirilməsi üçün istifadə edilmişdir, bununla da iqtisadi cəhətdən sərfəli vaxt çərçivəsində daha geniş mənbələrdən faydalı xüsusiyyətlər təqdim edilmişdir [21]. halda Miscanthus növlər, genetik transformasiya sistemləri çox yaxınlarda hissəcik bombardmanı vasitəçiliyi ilə qurulmuşdur və Aqrobakteriya-vasitəçi üsullar [22, 23]. Bununla belə, selektiv marker genlərindən başqa faydalı genə malik transgen Miscanthus bitkiləri haqqında indiyə qədər heç bir hesabat yoxdur. Buna görə də, genetik cəhətdən dəyişdirilmiş Miscanthus bitkiləri müəyyən edilmiş transformasiya üsulundan istifadə edərək faydalı bir gen təqdim edilərək daha da inkişaf etdirilməlidir.

Bu tədqiqatın məqsədi transgenik inkişaf etdirmək idi M. sinensis bitkilərin həddindən artıq ifadəsi Ərəbidopsis fitoxrom B geni (PHYB) istifadə edərək Aqrobakteriya-bu yaxınlarda inkişaf etdirdiyimiz vasitəli genetik transformasiya üsulu. Bundan əlavə, transgen bitkilərin fenotipləri fitoxrom funksiyası baxımından tədqiq edilmişdir ki, bu da xlorofilin tərkibini, bitki boyu və çiçəkləmə müddətini əhatə edir. Bu araşdırmada biz uğurla transgen əldə etdik M. sinensis vektoru olan bitkilər PHYB eləcə də herbisid müqavimət geni (BAR) seçmə işarəsi kimi və həddən artıq ifadə olunduğunu aşkar etdi PHYB artan xlorofil tərkibi, azaldılmış bitki boyu və gecikmiş çiçəkləmə M. sinensis bitkilər. Buna görə də, bu iş genetik mühəndisliyin inkişafı üçün bir üsul təqdim edir Miscanthus fitoxromlardan istifadə edərək inkişaf etmiş kənd təsərrüfatı məhsuldarlığı olan sortlar.

2. Materiallar və Metodlar

2.1. Rekombinantın hazırlanması Ərəbidopsis Fitoxrom B zülalları

Xromoforla yığılmış holoproteinlər Ərəbidopsis fitoxrom B (phyB) əvvəllər təsvir edildiyi kimi ifadə edildi, yenidən quruldu və təmizləndi [24, 25]. Tam uzunluqlu Arabidopsis PHYB gen a-ya subklonlaşdırıldı Pichia ifadə vektoru pPIC3.5K (Invitrogen). pASK75 vektorundan (Biometra) on amin turşusu streptavidin yaxınlıq etiketi 3′ ucuna yapışdırıldı. PHYB gen. Primerlər 5′-CTCCCCGGGTACGTAACCATGGTTTCCGGAGTCGGGG-3′ (irəli, Smamən/SnaBI) və 5′-TCGCAGCGCTATATGGCATCATCAGCATCATG-3′ (əks, Eko47III) subklonlaşdırma üçün istifadə edilmişdir. pPIC3.5K konstruksiya rulmanı PHYB sonra çevrildi Pichia mikropulser elektroporasiya aparatı (Bio-Rad) vasitəsilə hüceyrələr. Rekombinant fitoxrom zülalları ifadə edildi Pichia ifadə sistemi (Invitrogen) və istehsalçı tərəfindən təsvir edilən prosedura uyğun olaraq streptavidin yaxınlıq xromatoqrafiyası (IBA) ilə təmizlənir. Phycocyanobilin (PCB) dən hazırlanmışdır Spirulina platensis təsvir edildiyi kimi metanoliz yolu ilə ekstraktlar [25] və holo-fitoxrom yığılması üçün xromoforlar kimi istifadə olunur. Xam ekstraktlar sındırılaraq hazırlanmışdır Pichia homojenizatordan (Nihonseiki Kaisha) istifadə edərək maye azotdakı hüceyrələr. Fitoxrom nümunələri daha sonra 0,23 q/l ammonium sulfat əlavə edilərək çökdürüldü və buferdə (100 mM Tris, pH 7,8, 1 mM EDTA) yenidən dayandırıldı, DMSO-da PCB xromoforları 10 son konsentrasiyada nümunələrə əlavə edildi. μM və qarışıq üçün inkubasiya edilmişdir in vitro buz üzərində 1 saat sulandırmaq. Sərbəst xromoforların çıxarılması üçün dializdən sonra nümunələr yaxınlıq xromatoqrafiya sütunlarına yükləndi və holo-phyB zülalları təmizləndi.

2.2. Zn 2+ Floresans və Spektroskopik Analiz

Xromofor bağlamasını qiymətləndirmək üçün Zn 2+ flüoresan analizi üçün zülal nümunələri 10% SDS-PAGE gelində təhlil edildi və gel 5-30 dəqiqə ərzində 20 mM sink asetat/150 mM Tris-HCl (pH 7.0) ilə isladıldı. otaq temperaturunda yumşaq silkələməklə. Holo-fitoxromların sink flüoresansı UV işığı (312 nm) altında görüntülənmişdir. Rekombinant phyB-nin spektroskopik təhlili üçün udulma spektrləri qırmızı və ya uzaq qırmızı işıq şüalanmasından sonra diod massivi UV/VIS spektrofotometri (Cary) ilə qeydə alınmışdır. Bütün spektroskopik təcrübələr 500 nm-də maksimal keçiriciliyə malik plastik filtr (Rosco) ilə təchiz edilmiş ağ flüoresan lampadan və işıqlandırma ilə təchiz olunmuş fiber optik işıqlandırma sistemindən (Cole-Parmer) ibarət yaşıl təhlükəsizlik işığı şəraitində aparılmışdır. İşıq mənbəyi kimi 656 və 730 nm müdaxilə filtrlərindən (Oriel) istifadə edilmişdir. İşıq intensivliyi qırmızı işıq üçün 8 Vt/m2, uzaq qırmızı işıq üçün isə 6 Vt/m2 idi. Nümunələr 15 dəqiqə qırmızı və ya 10 dəqiqə uzaq qırmızı işıqla işıqlandırıldı. Pfr spektrini Pr spektrindən çıxarmaqla fərq spektri əldə edildi və Pr və Pfr udma dalğa uzunluğunun maksimumları arasındakı interpik məsafəni təyin etmək üçün istifadə edildi (

maksimal) və Pr və Pfr absorbsiya zirvələrinin nisbəti (APfr/APr).

2.3. Genetik transformasiya üçün istifadə olunan plazmid və aqrobakterium ştammı

Arabidopsis PHYB gen (AT2G18790) pCAMBIA3301 ikili vektoruna subklonlaşdırıldı. Bamsalam/SmaMən qarğıdalı ubiquitin promotorunun (Pubi) və Agrobacterium tumefaciens NOS gen terminatoru. pCAMBIA3301 daşıyır BAR seçilə bilən marker kimi herbisid müqaviməti üçün gen və BAR gen, herbisid olan fosfinotrisinə (PPT) müqavimət göstərən bir fosfinotrisin asetiltransferazanı kodlayır. İkili vektor DNT daha sonra daxil etmək üçün istifadə edilmişdir A. tumefaciens EHA105-i dondurma-ərimə üsulu ilə süzün [26].

2.4. Güman edilən transgenin yaranması M. sinensis Bitkilər

SNU-M-045 germplazma toxumları M. sinensis Seul Milli Universitetində saxlanılan, transformasiya və toxuma mədəniyyəti və genetik transformasiya üçün istifadə edilmişdir. M. sinensis təsvir edildiyi kimi yerinə yetirilmişdir [23]. Yetkin toxumlardan alınan embriogenik kalluslar və A. tumefaciens EHA105 ilə pCAMBIA3301-i saxlayır PHYB genetik çevrilmə üçün istifadə edilmişdir. Embriogen kalluslar kallusun induksiya mühitində (MS duzları və vitaminləri, 3% saxaroza, 3 mq/L 2,4-D, 750 mq/L MgCl) induksiya edilmiş və becərilmişdir.2·6H2O, 25 mM L-prolin, 0.2 q/L Gelrit, pH5.7) 8-10 həftə. Daha sonra embriogenik kallilər batırıldı Aqrobakteriya süspansiyonlar əlavə edilir və 15 dəqiqə inkubasiya edilir, zərif silkələnir, sonra artıq bakteriyalar çıxarılır və filtr kağızı üzərində havada qurudulur. Sonra yoluxmuş kalluslar kokultivasiya mühitinə köçürüldü (MS duzları və vitaminləri, 2% saxaroza, 1% qlükoza, 3 mq/L 2,4-D, 400 μM acetosyringone, 3 g/L Gelrite, pH 5.7) və qaranlıqda 25°C-də 5 gün inkubasiya edildi.Transformasiya prosesi zamanı embriogenik kallisin transformasiya olunub-olunmadığını yoxlamaq üçün GUS boyanma analizləri aparıldı. Transformasiyadan sonra 5 mq/L PPT olan seçmə mühitdə transgenik kallilər seçildi və 3 mq/L PPT ilə regenerasiya mühitində transgen tumurcuqlar induksiya edildi. Yaxşı inkişaf etmiş kökləri olan bitkilər torpaqda əkilmiş və herbisidlə müalicədən əvvəl 2 həftə yetişdirilmişdir. Daha sonra 0,4% (h/v) BASTA (tərkibində 18% qlufosinat ammonium ehtiva edir) çiləyərək herbisidlərə davamlılıq təhlili aparıldı və ehtimal olunan transgen bitkilərin herbisidlərə davamlılığı 14 gündən sonra müəyyən edildi.

2.5. Transgeniklərin Molekulyar Analizləri M. sinensis Bitkilər

Transgen bitkilərin genomik PCR, Southern blot və Northern blot analizləri əvvəllər təsvir edildiyi kimi aparılmışdır [27, 28]. Genomik PCR analizi üçün istixana şəraitində yetişdirilən bitkilərin yarpaqlarından ümumi genomik DNT və kodlaşdırma bölgəsi təcrid edilmişdir. PHYB və ya BAR transgen aşağıdakı oliqonukleotid primerləri dəstindən istifadə etməklə genomik DNT və ya müsbət nəzarət vektorundan PCR ilə gücləndirilmişdir: 5′-TCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAG-3′ (irəli) və 5′-GCAGCGCTCAGTGTCTGCGTTCTCAAAACG-3′ (geri) PHYB, 5′-CTACCATGAGCCCAGAACGACG-3′ (irəli) və 5′-CTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTC-3′ (geri) üçün BAR. aktin geni (ACT) of M. sinensis eyni şablondan və 5′-AACTGGGGATGATATGGAGAA-3′ (irəli) və 5′-CCTCCAATCCAGACACTGTA-3′ (geri) primerlərindən istifadə edərək gücləndirilmiş və sonra genomik DNT-nin yük nəzarəti kimi işlədilmişdir. PCR məhsulları PHYB, BAR,ACT müvafiq olaraq 1106, 421 və 1046 bp olacağı gözlənilirdi.

Southern blot analizi üçün genomik DNT hər ikisi ilə həzm olundu HindIII və ya EkoRI və hibridizasiyalar ilə həyata keçirilmişdir BAR ilə etiketlənmiş gen zonduα 32 P] Radiprime II Random Prime Labeling System (Amersham Biosciences) istifadə edərək dCTP. Northern blot analizi üçün Trizol reagentindən (Invitrogen) istifadə edərək yarpaqlardan ümumi RNT çıxarıldı və hibridləşmələr [α 32 P] dCTP etiketli PHYB prob.

2.6. Xlorofil tərkibinin ölçülməsi

Xlorofilin (chl) tərkibi DOY (ilin günü) 273-də yığılmış əkinçilərin üçüncü yarpağı ilə ölçüldü. Yarpaqlar 80% asetonla ekstraksiya edildi və məhlulun udulması 645 nm-də ölçüldü (

). Ümumi xlorofil tərkibi tənlikdən hesablanmışdır: ümumi xlorofil (μq/ml)

. Daha sonra qeyri-transgen nəzarət bitkisinin xlorofil tərkibini 100%-ə təyin etməklə nisbi xlorofil tərkibi hesablanmışdır.

2.7. Transgenlərin Fenotipik Təhlilləri M. sinensis Bitkilər

M. sinensis torpaqdakı bitkilər mədəniyyət otağında (24-26°C, 16 saatlıq fotoperioda) yetişdirilmiş və vegetativ şəkildə çoxaldılmışdır. Fenotiplərin araşdırılması üçün bitkilər daha sonra mədəniyyət otağından Koreyanın Suvon şəhərindəki Seul Milli Universitetinin təcrid olunmuş LMO istixanasına köçürüldü və əkildi (N 37° 16′ 15.08′′, E 126° 59′ 22.02′′). Bitki hündürlüyü yerdən hər bir bitkinin yuxarı hissəsinə qədər olan uzunluqlar kimi ölçülür. Başlıq və çiçəkləmə tarixləri müvafiq olaraq bayraq yarpağı qabığından panikula ucunun çıxması və ilk çiçəyin açılması kimi müəyyən edilmişdir.

2.8. Statistik təhlil

Fizioloji parametrlərin nəticələri IBM SPSS statistics 20 proqramı ilə ANOVA istifadə edərək təhlil edilmişdir. Nəzarət qiymət(lər)indən əhəmiyyətli fərq müəyyən edilmişdir

səviyyə. Bütün məlumatlar ən azı üç müstəqil eksperimentin orta ± SD və ya SE-ni təmsil edirdi.

3. Nəticələr və müzakirə

3.1. Fotokimyəvi xassələri Ərəbidopsis phyB

Dikot model bitkidə bitki fitoxromlarının (phyA-phyE) beş izoforması var. Arabidopsis thaliana, bunların arasında phyA və phyB bitkilərdə böyük rol oynadığı bilinir [29, 30]. Məsələn, phyA uzaq qırmızı işığa (FR) cavab olaraq toxumun cücərməsini və şitil böyüməsini tənzimləyir, phyB isə qırmızı işığa (R) cavab olaraq toxumun cücərməsini, R/FR nisbətinə və çiçəklənməyə cavab olaraq bitki böyüməsini və kölgədən yayınmağı tənzimləyir. vaxt [4]. Xüsusilə məlumdur ki, phyB çatışmazlığı olan mutant (hy3) konstitutiv kölgədən yayınma və erkən çiçəklənmənin fenotiplərini göstərir [31], phyB-nin bitki məhsuldarlığını artırmaq üçün zəruri olan bitkilərdə kölgədən yayınma reaksiyalarını və çiçəklənməni yatırtmaq üçün zəruri olduğunu göstərir. Ona görə də təqdim etməyi planlaşdırdıq Ərəbidopsis phyB daxil M. sinensis və dikot phyB-ni həddindən artıq ifadə edən monokot məhsulunun fenotiplərini araşdırmaq.

Genetik çevrilmədən əvvəl ilk olaraq fotokimyəvi analizini etdik Ərəbidopsis phyB təmizlənmiş rekombinant zülallardan istifadə edir, çünki phyB yerli toxumada az bolluğuna görə yaxşı xarakterizə edilməmişdir [32]. Bunun əksinə olaraq, phyA-nın spektral xassələri bu fotoreseptorun tündləşmiş toxumada nisbətən çox olması səbəbindən yaxşı xarakterizə edilmişdir.

phyB-dən 100 dəfə çoxdur). Bu işdə biz uğurla istifadə edərək rekombinant phyB zülallarını ifadə etdik və təmizlədik Pichia protein ifadə sistemi və streptavidin yaxınlıq xromatoqrafiyası (Şəkil 1(a)). Təmizlənmiş Ərəbidopsis phyB xromofor phycocyanobilin (PCB) ilə bağlanma və normal absorbans və fərq spektrləri nümunələri göstərdi (Şəkil 1). Təmizlənmiş phyB zülallarının spektroskopik təhlili göstərdi ki, Pr-nin udma dalğa uzunluğu maksimumu (

) formaları müvafiq olaraq 650 nm və 714 nm-dir. Əvvəlki hesabatda [25] yulaf phyA-nın fotokimyəvi xassələri ilə müqayisədə, Ərəbidopsis phyB, maksimum (64 m) və A daxil olmaqla, phyA ilə oxşar xüsusiyyətlər göstərdiPfr/APr (1.09) fərq spektrindən alınır. Müşahidə olunan yeganə fərq o idi ki, phyB-nin absorbsiya dalğa uzunluqları yulaf phyA-nın absorbsiya zirvələri (Pr üçün 654 nm və Pfr üçün 720 nm) ilə müqayisədə bir qədər maviyə dəyişdi (4-6 nm). Kollektiv olaraq, nəticələr PCB ilə yığılmış rekombinant olduğunu göstərir Ərəbidopsis phyB bitki fitoxromlarının tipik fotoxromizminə malikdir.


(a)
(b)
(a)
(b)

MÜZAKİRƏ

MiRNA-nın in vivo funksiya qazanması ilə induksiya edilən çoxlu spesifik fenotiplər

Hüceyrə əsaslı tədqiqatlardan heyvan miRNA-larının hətta ektopik fəaliyyət kontekstində ölçüldükdə belə, yüzlərlə hədəfi birbaşa, lakin yumşaq şəkildə repressiya etdiyinə dair çoxlu sübutlar var (Lim və digərləri, 2005 Hendrickson et al., 2009 Guo et al., 2010). Bunu nəzərə alaraq, miRNA deregulyasiyasının in vivo nəticələrinin çox vaxt incə olması (bir neçə hədəfin funksiya itkisi fenotiplərini aşkar etmək üçün kifayət qədər sıxışdırıla biləcəyi baxımından) ağlabatan ola bilərdi və ya çox vaxt hüceyrənin ümumi həyat qabiliyyətini poza bilərdi. yüzlərlə hədəfin koordinasiyasının aşağı salınması hüceyrələrin sadəcə olaraq qeyri-sağlam olmasına səbəb ola bilər).

Biz bütöv heyvanda hədəflənmiş miRNA səhv ifadəsinin nəticələrinin sistematik in vivo müayinəsini təsvir edirik. Yuxarıda qeyd olunan imkanlardan fərqli olaraq, biz tapırıq ki, sınaqdan keçirilmiş miRNA-ların əksəriyyəti müxtəlif və nisbətən fərqli mutant fenotiplər əmələ gətirir, onların əksəriyyətini hədəf proqnozlarından və ya miRNT funksiyasının ümumi incə tənzimləmə modelindən gözləmək mümkün deyildi. Bir sıra miRNA-ların hüceyrə toksikliyinə görə ciddi mənfi nəticələri olmasına baxmayaraq, bir çox miRNA-induksiya etdiyi fenotiplər, toxumaların inkişafı və formalaşdırılması üçün vacib olan siqnal/çoxalma/apoptoz yollarında gen mutantları tərəfindən nümayiş etdirilənlərə yaxından bənzəyir. Hazırkı tədqiqatlar miR-315-i Wnt yolunun aktivləşdirilməsi ilə əlaqələndirən mədəni hüceyrələrdəki əvvəlki funksional ekranlarımızı genişləndirir (Silver et al., 2007) və indi heyvanda müxtəlif funksional skrininqlərə imkan verir. Həqiqətən, bir-biri ilə əlaqəsi olmayan ardıcıllığın bir çox miRNA-ları in vivo oxşar fenotiplər əmələ gətirdi və bu, eyni yollarda müxtəlif düyün nöqtələrinə toxunduqları təqdirdə izah edilə bilər.

Əksəriyyəti olmasa da, bir çox genlər çoxlu miRNA üçün qorunmuş bağlanma yerlərini ehtiva edir. Ancaq aydındır ki, qorunmuş miRNA-məcburi yerlərin sadə mövcudluğu istiqamətləndirilmiş sensor analizlərində cavab reaksiyasına zəmanət vermir. Daha da belədir ki, qohum bağlayıcı yerlərin olması, hətta yanlış ifadə olunduğu halda belə, heyvanda müvafiq funksiya itkisi fenotipini induksiya edə biləcək bir miRNT göstərmir (Silver et al., 2007). Maksimal effekt əldə etmək üçün mükəmməl tamamlayıcılıq üçün nəzərdə tutulmuş süni shRNA konstruksiyalarından istifadə edərkən belə, onların yalnız qismən yıxılması və ya bəzən ümumiyyətlə işləməməsi xarakterikdir. Əsas hüceyrə siqnal yollarının və modelləşdirmə genlərinin məlum doza həssaslığı, onların açıq mutant fenotiplərə çevrilən şəkildə miRNA-lardan təsirlənməyə niyə xüsusilə meylli ola biləcəyinə dair genetik əsaslandırma təmin edir (Hagen və Lai, 2008 Smibert və Lai, 2010) . Bu cür genetik əlaqələr funksional tədqiqatlara rəhbərlik edə bilər və hətta müvafiq hesablama üsulu ilə proqnozlaşdırılan hədəflər haqqında biliklər olmadıqda belə, ehtimal olunan hədəf yollarına işarə edə bilər.

Həşəratların əsas genetik dövrəsini başa düşməkdən başqa, tədqiqatlarımız vurğulayır ki, ektopik miRNA-lar çox vaxt toxuma modelinin dəyişdirilməsi, apoptozun yayılması nəticəsində spesifik inkişaf fenotipləri yarada bilər. Bu, xəstəliyin və xərçəngin etiologiyasını şərh etmək üçün əhəmiyyətli nəticələrə malikdir. Məsələn, artan sayda məməli miRNA-nın həddən artıq ifadəsi hüceyrə spesifikasiyası və ya metabolik qüsurlar və məsələn, miRNA-lar yarada bilər. mir-21 (Medina et al., 2010) və mir-17-92 (He et al., 2005) aşkar onkogenlərdir. Sistemli müayinəmiz Drosophila çoxlu sayda onurğalı miRNA-nın heyvanda nisbətən spesifik fenotiplərə səbəb ola biləcəyini sübut edə biləcəyini, lakin bunların yalnız nadir hallarda hesablama yolu ilə əldə edilmiş hədəf birləşmələri əsasında proqnozlaşdırıla biləcəyini güclü şəkildə göstərir.

In vivo miRNA skrininqi üçün genetik resurs

Şərti olaraq aktivləşdirilmiş transgen əlavələrinin kolleksiyalarının genişləndirilməsinə böyük səy sərf edilmişdir. Drosophila (Brand və Perrimon, 1993 Rorth et al., 1998). Son 15 il ərzində bunlar zülal kodlayan genlərin bioloji aktivliyini və funksiyasını aşkar etmək üçün çox böyük istifadə edilmişdir. Burada miRNA transgenlərinin genom boyu kolleksiyalarını təsvir edirik və qanad inkişafı zamanı onların kollektiv şəkildə müxtəlif fəaliyyətlərini nümayiş etdiririk. Bu kolleksiyalara həm P daxiletmə, həm də attP daxiletmə xətləri daxildir ki, bu da onların sonrakı yoxlanılması üçün böyük çeviklik təmin edir. Sonuncu, müxtəlif miRNA-ların fəaliyyətini birbaşa müqayisə etməyə imkan verir, halbuki birincisi bir çox hallarda transgen güclərinin allel seriyasını təmin edir. Bu xətlərin mövcudluğu, miRNT deregulyasiyasının inkişafdakı nəticələrini, həmçinin fiziologiya və ya davranışda böyüklərin rollarını qiymətləndirmək üçün toxuma və ya hüceyrəyə xas sürücülərdən istifadə edən geniş çeşidli ekranlara imkan verir. Onların funksional imkanları haqqında bilik daha sonra endogen ifadə sahələrində müxtəlif miRNA-ların öyrənilməsinə məlumat verə bilər (Aboobaker et al., 2005 Berezikov et al., 2011).

Bu iş nəzərdən keçirilərkən, Cohen və həmkarları UAS-miRNA transgenlərinin daha kiçik dəstini və onların hüceyrə dövrü tənzimləyicisinin tüklü fenotipinin modifikatorlarının axtarışında tətbiqini təsvir etdilər. mənfi (Szuplewski və başqaları, 2012). Məhdud tük dəyişdiricilərindən başqa, onların təhlili ilk növbədə miRNA ifadəsinin nəticəsi kimi ölümcül olduğunu ortaya qoydu (Szuplewski et al., 2012). 100-dən çox miRNA transgenimizlə geniş şəkildə ifadə edildikdə ölümcül təsirə səbəb olur. da-Qal4. Bununla birlikdə, qanad sürücülərindən ibarət bir paneldən istifadə edərək ətraflı təhlilimiz, bir çoxu əsas siqnal yollarının və modelləşdirmə amillərinin modulyasiyasını fenokopiya edən fərqli fenotiplərin kornukopiyasını aşkar etdi (Şəkil 2, 3, 4, 5 və 6). Bizim UAS-miRNA kolleksiyalarımız öz transgenlərini tamamlayır və əhəmiyyətli dərəcədə genişləndirir və birlikdə miRNT fəaliyyətinin in vivo analizi üçün nəhəng mənbə təşkil edir. Bir çox miRNA-nın aşkar edilə bilməyən funksiya itkisi fenotipləri var (Miska et al., 2007 Alvarez-Saavedra və Horvitz, 2010), lakin bir çox miRNA mutantlarının digər genetik təhqirlərlə birlikdə sintetik fenotiplər əmələ gətirdiyi də belədir (Brenner). və başqaları, 2010). Bizimki kimi məlumatlar 100-dən çox nümayiş etdirilə bilən miRNA fəaliyyətini və onlarla məcburi miRNA-hədəf/yol əlaqələrini izləmək üçün genetik əsas təmin edir və miRNA süngərləri ilə daha mürəkkəb qarşılıqlı əlaqə araşdırmaları haqqında məlumat verə bilər (Loya və digərləri, 2009). Həqiqətən, biz Notch siqnalını maneə törədən K qutusu miRNA-nın funksiya qazanmasının, qanadın inkişafı zamanı Notch siqnalını məhdudlaşdırmaqda çox güman ki, çox lazımsız olan endogen K qutusu miRNA dəstinin endogen fəaliyyətini aşkar edən həssaslaşdırılmış genetik analizlər haqqında məlumat verdiyinə dair prinsipin sübutunu təqdim edirik. Geniş təhlillərimiz şərti olaraq aktivləşdirilə bilən miRNT transgenlərinin bu geniş genom kolleksiyalarının faydalılığına dair inandırıcı sübutlar təqdim edir və onların miRNA süngər transgenlərinin oxşar kolleksiyaları ilə yaxşı tamamlana biləcəyini göstərir.


Nəticələr

CRISPR-cas9 texnologiyası bir neçə bitki növündə bir neçə protein kodlaşdıran genləri sıradan çıxarmaq üçün uğurla istifadə edilmişdir. Kodlanmayan RNT-lərin uğurlu redaktəsi heyvanlarda nümayiş etdirilsə də [Başak və Nithin (2015)-də nəzərdən keçirilmişdir], kodlaşdırmayan RNT-nin redaktəsi ilə bağlı yeganə hesabat pomidordadır (Li et al. 2018). Biz kodlaşdırmayan tənzimləyici RNT-nin uğurlu gen redaktəsini nümayiş etdiririk TAS4a/b üzüm sortunda 101-14, antosiyanin istehsal edən anaç. Biz daha sonra TAS4b bələdçi RNT-nin təsadüfi hədəfdən kənar təsirlərini nümayiş etdiririk TAS4a hədəfdən kənar redaktə ilə əlaqəli homoloji rekombinasiya hadisələrinə məruz qalan kimerik TAS4a-b lokusu ilə nəticələnən lokus. Gələcək işlərin rollarını sınamaq artıq mümkündür Vvi-MYBA7Vvi-TAS4a/b/c toxuma spesifik antosiyanin ifadəsində və genlərin mikrob və virus xəstəliklərinin etiologiyalarında rolları və bəlkə də artropod vektorlarının qidalanma üstünlükləri (Zeilinger et al. 2018).


Giriş seçimləri

1 il ərzində jurnala tam giriş əldə edin

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.
ƏDV daha sonra ödəniş zamanı əlavə olunacaq.
Vergi hesablanması yoxlama zamanı yekunlaşacaq.

ReadCube-da vaxt məhdud və ya tam məqaləyə giriş əldə edin.

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.


Müzakirə

CRISPR/Cas9 spesifikliyinə müxtəlif amillər, o cümlədən hədəfdən kənar ərazilərin xüsusiyyətləri və Cas9/sgRNA komplekslərinin effektiv konsentrasiyası təsir göstərir. CRISPR/Cas9 spesifikliyinin müəyyən edilməsi həm qərəzli, həm də qərəzsiz və siliko hədəfdən kənar proqnozlaşdırma alqoritmlərində olan analiz metodlarından asılıdır. Bu mürəkkəblik hədəfdənkənar mutasiya analizləri üçün çaşdırıcı amil kimi qəbul edilir və hədəfdənkənar fəaliyyətin ölçülməsi və bildirilməsi üçün müxtəlif standartların istifadəsi nəticələrin dəqiqliyinə təsir göstərir (Tsai and Joung 2016 Tycko et al. 2016 Wu et al. 2014).

CRISPR/Cas9-un bitki hüceyrələrində insan hüceyrələrindən əhəmiyyətli dərəcədə daha spesifik olduğu bilinir (Feng et al. 2014 Peterson et al. 2016 Wolt et al. 2016 Zhang et al. 2014). Bütün genom ardıcıllığına (WGS) və ya dərin ardıcıllığa əsaslanan iki hesabat CRISPR/Cas9 sisteminin redaktə səmərəliliyinin yüksək spesifik olduğunu sübut edir. Ərəbidopsis (Feng et al. 2014 Peterson et al. 2016). Bu hesabatlardan birində hədəfdən kənar cəmi 178 saytın dərin ardıcıllığı göstərdi ki, CRISPR/Cas9-un yüksək spesifikliyi Ərəbidopsis və UBQ10 promouteri tərəfindən idarə olunan Cas9-un aşağı ifadə səviyyələrinin aşkar edilməyən hədəfdən kənar hadisələrin səbəbi olduğu fərz edilirdi (Peterson et al. 2016). Əslində, 14 sgRNA variantının Cas9-a rəqabətli bağlanması mütləq hər bir Cas9/sgRNA kompleks variantının effektiv konsentrasiyalarının əhəmiyyətli dərəcədə aşağı düşməsinə səbəb oldu. 14 sgRNA-dan ikisi (CLE18_2 və GLV8_1) məqsədli redaktə ilə bağlı heç bir sübut göstərmədiyinə görə, bu iki sgRNA-dan olan 26 hədəfdənkənar sayt hədəfdən kənar saytlar siyahısından xaric edilə bilər. Beləliklə, 12 sgRNA-dan qalan 152 hədəfdən kənar saytdan 83% (126/152) və 17% (26/152) müvafiq olaraq 4 və 3 uyğunsuzluğu ehtiva edir ki, bu da 12 sgRNA-nın proqnozlaşdırıldığını göstərir. tərəfindən xüsusi silisiumda təhlili (Peterson et al. 2016). Buna görə də, hər bir Cas9/sgRNA kompleks variantının aşağı effektiv konsentrasiyaları və nisbətən spesifik sgRNA-lar CRISPR/Cas9-un yüksək spesifikliyinin bildirilməsinin səbəbləri ola bilər. Ərəbidopsis.

Digər hesabatda, GAI-sgRNA1-i saxlayan iki T1 zavodunun (#T1-46 və #T1-55) və bir T2 zavodunun (#T2-46) dərin WGS potensialında hədəfdən kənar hər hansı hadisənin göstəricisi göstərilməyib. 1-4 uyğunsuzluğu ehtiva edən hədəfdən kənar saytlar (Feng et al. 2014). Bununla belə, WGS ayrı-ayrı bitkilərin hədəfdən kənar mutasiya analizləri üçün ideal olsa da, yüksək qiymətə görə, Cas9 spesifikliyini müəyyən etmək üçün çoxlu sayda bitki və sgRNA variantlarını sistemli şəkildə qiymətləndirmək praktiki deyil (Wu et al. 2014). Beləliklə, aşağı tezlikli hədəfdən kənar hadisələrin əksəriyyəti hesaba alınmaz (Wu et al. 2014). GAI-sgRNA1-i saxlayan təxminən 60 T1 bitkisi PCR və ardınca sekvensiya ilə hədəfdənkənar mutasiyalar üçün tədqiq edilsə də, çox sayda T2 bitkisi araşdırılmadı. Məhdud nəsillərdən yalnız bir sgRNA və məhdud sayda bitki hədəfdənkənar mutasiyalar üçün tədqiq edildiyi üçün məlumatlar eyni sgRNA tərəfindən induksiya edilən aşağı tezlikli hədəfdənkənar hadisələrin və induksiya edilən yüksək tezlikli hədəfdənkənar hadisələrin mümkünlüyünü istisna edə bilməz. digər sgRNA variantları ilə (Feng et al. 2014).

İki hesabatdakı nəticələrin yuxarıdakı təhlilinə əsaslanaraq, biz yüksək tezlikli hədəfdən kənar mutasiyaları müşahidə etməyimiz anormal deyil. Ərəbidopsis tədqiqatımızda (Şəkil 1, 2), sgRNA-nın yüksək spesifiklik balı olacağı proqnozlaşdırılsa da (Haeussler et al. 2016, Hsu et al. 2013). Əslində, bu işdəki müşahidələr, eyni sgRNA-nın spesifik olduğunu təklif etdiyimiz əvvəlki hesabatlarımızdakılarla da uyğunsuz idi (Wang et al. 2015 Xing et al. 2014). Nəticələrdəki bu uyğunsuzluğun əsas səbəbi ondan ibarətdir ki, bizim əvvəlki nəticələrimiz yalnız bir və ya iki T1 zavoduna əsaslanmışdı və Cas9-u idarə etmək üçün müxtəlif promouterlərdən istifadə edilmişdir. Bu anlayışa uyğun olaraq, sgRNA-nı hədəf alan əvvəlki hesabatımızda ABI1 gen, səkkiz T1-in tədqiqi abi1 mutantlar və hədəfdən kənar mutasiyalar üçün iki T2 populyasiyası bu işdə müşahidə edilənə oxşar nəticələr yaratdı (Zhang et al. 2017b). 8 T1-dən abi1 mutantlar, 1 (1/8 və ya 13%) T1 bitkisində heterozigot və ya kimerik hədəfdən kənar mutasiyalar AT5G02760 2 uyğunsuzluq və bütün 8 sətirdə hədəfdən kənar mutasiyalar yox idi ABI2 yalnız 1 uyğunsuzluq və digər 2 gen 3 uyğunsuzluqla. Məqsəddən kənar mutasiyaları saxlayan T1 xəttindən 52 T2 bitkisinin təhlili AT5G02760 T2 (44/52) bitkilərin 85%-nin hədəfdən kənar mutasiyalara malik olduğunu göstərdi. AT5G02760, və 17% (9/52) hədəfdən kənar mutasiyalara sahib idi ABI2 və hər iki gen. Hədəfdən kənar mutasiyalara malik olmayan digər T1 xəttindən 41 T2 bitkisinin təhlili göstərdi ki, T2 (4/41) bitkilərinin 10%-i hədəfdən kənar mutasiyalara malik olub. AT5G02760, 4,9% (2/41) hədəfdən kənar mutasiyalara sahib idi ABI2, və 2,4% (1/41) hər iki gendə hədəfdən kənar mutasiyalara sahib idi (Zhang et al. 2017b). Hazırkı tədqiqatın nəticələrinə uyğun olaraq (Şəkil 2), bu tapıntılar hədəfdən kənar təsirlərin növbəti nəsildə ağırlaşdığını göstərir. GAI-sgRNA1-in spesifikliyini müəyyən etmək üçün yumurta hüceyrəsi üçün spesifik promotorla idarə olunan (EPC) CRISPR/Cas9 sistemimizdən istifadə etmək maraqlı olacaq, çünki onun spesifiklik balı 0-100 diapazonuna nisbətən 64 idi (94). ) sgR-ETC2 (Haeussler et al. 2016, Hsu et al. 2013).

Yüksək tezlikli hədəfdən kənar mutasiyalar CPC gen uyğunsuzluqların mövqeyi, paylanması və şəxsiyyəti kimi bəzi ardıcıllıq xüsusiyyətlərinə aid edilə bilər (Tsai and Joung 2016 Wu et al. 2014). Baxmayaraq ki, hədəfdən kənar sayt CPC genin sgRNA-ETC2 ilə üç uyğunsuzluğu var, PAM-dan distal olan birinci bazada yerləşən ilk uyğunsuzluq adətən CRISPR/Cas9 sistemi tərəfindən tolere edilir (Şəkil 1). İkinci uyğunsuzluq da PAM-dan çox uzaqdır və/yaxud iki uyğunsuzluq bir-birindən uzaqda yerləşir ki, bu da yüksək tezlikli hədəfdən kənar mutasiyalara səbəb ola bilər. CPC gen deyil KEÇİN gen və ya AT5G50230 (şək. 1). PAM-proksimal

11-nt, Cas9 kəsmə fəaliyyəti üçün toxum bölgəsi kimi müəyyən edilmişdir və bölgədəki uyğunsuzluqlar daha az tolere edilir (Wu et al. 2014). Bəzi digər analizlərdə toxum bölgəsi PAM-proksimal 5-nt-yə qədər daraldı (Wu et al. 2014). CRISPR/Cas9 kompleksinin müxtəlif konsentrasiyaları və Cas9 bağlanma və parçalanma müddəti müxtəlif analizlərlə aşkar edilən toxum uzunluğunda müşahidə edilən dəyişikliklərə görə cavabdeh ola bilər. Buna görə də, yüksək tezlikli hədəfdən kənar mutasiyalar üçün qəribə deyil CPC PAM-proksimal mövqedə 8-ci nt-də uyğunsuzluğu saxlayan hədəfdən kənar sayt (Şəkil 1). Bu araşdırmaya bənzər olaraq, sgRNA-ABI1 ilə bağlı əvvəlki araşdırmamız göstərdi ki, hədəfdən kənar saytlar da PAM-proksimal mövqeyində 9-cu nt-də uyğunsuzluq saxlayır (Zhang et al. 2017b). Hədəfdən kənar hadisələrin tezliyi də uyğunsuzluq şəxsiyyətindən təsirlənmişdir və əsasən aşağıdakı kimi göstərilə bilər: rN:dT ≥ rU:dG >> rC:dC >> rA/rG:dA/dG (Doench et al. 2016 Tsai and Joungycko 2016) və başqaları 2016). Daha əvvəl qeyd olunan 8-ci və 9-cu uyğunsuzluqların hamısı rC:dT uyğunsuzluğu idi və bu, bu uyğunsuzluğun tez-tez tolere edildiyini və bitkilərdə hədəfdən kənar təsirlərə səbəb olduğunu göstərir. İki uyğunsuzluğu özündə cəmləşdirən hədəfdən kənar saytın hədəfləmə sgRNA ilə müşahidəsi. ABI1 bir uyğunsuzluğu özündə cəmləşdirəndən daha yüksək tezlikli hədəfdənkənar təsirlər göstərdi (Zhang et al. 2017b) göstərir ki, yüksək məhsuldarlıqlı təcrübələrdən əldə edilən böyük təlim məlumat dəstlərinə əsaslanan daha dəqiq hədəfdənkənar proqnozlaşdırma alqoritmlərinin hazırlanmasında daha çox amil nəzərə alınmalıdır. .

EPC sistemimiz nisbətən qısa müddətli ifadə sistemi olduğundan (Wang et al. 2015), belə görünürdü ki, o, 2 × 35S, UBQ1, UBQ10 və PCUbi4-2 (Fauser et al. 2014 Feng et al. 2014 Peterson et al. 2016). Bu ehtimalın əksinə olaraq, yüksək tezlikli hədəfdən kənar mutasiyalar müşahidə etdik CPC gen, EPC sistemində yumurta hüceyrələrində və bir hüceyrə mərhələsindəki embrionlarda CRISRP/Cas9 kompleksinin yüksək dozasının hədəfdən kənar mutasiyalar üçün qısa müddəti kompensasiya etdiyini göstərir. Bu anlayışa uyğun olaraq, tRNA-sgRNA(m) və tRNA-sgRNA(o) ilə əldə edilən nəticələrin müqayisəsi, kompleksin artan dozasının hədəfdən kənar mutasiyaların tezliyini əhəmiyyətli dərəcədə artırdığını göstərdi: 66,7 və 20,0% (Şəkil S1) ).

tRNA-sgRNA(m) ümumiyyətlə tRNA-sgRNA(o) (Xie et al. 2015) və sgRNA(m) (Dang et al. 2015) ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yüksək redaktə effektivliyinə malik olduğu başa düşüləndir. Bununla belə, bu tədqiqat göstərdi ki, tRNA-sgRNA(o) bizim gözlədiyimizin əksinə olaraq sgRNA(o) ilə müqayisədə xeyli aşağı redaktə effektivliyinə malikdir (Şəkil 3, 4, S1 və S2). Bu tapıntı üç aspektə aid edilə bilər. Birincisi, EPC sistemi CRISPR/Cas9 kompleksinin effektiv konsentrasiyalarındakı və ya fəaliyyətlərindəki dalğalanmalara konstitutiv promotorlar tərəfindən idarə olunan sistemlərə nisbətən daha həssas ola bilər. Bu anlayışa uyğun olaraq, müxtəlif terminatorlar (Wang et al. 2015) və hətta terminatorun arxasındakı mCherry kaseti (Şəkil 3) EPC sisteminin redaktə səmərəliliyinə əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərmişdir. Bundan əlavə, yüksək spesifik SpCas9 variantları T1 bitkilərində yabanı tipli həmkarına nisbətən daha aşağı effektiv mutasiyalara səbəb oldu ki, bu da EPC sisteminin CRISPR/Cas9 variantlarının fəaliyyətindəki dalğalanmalara daha həssas olduğunu göstərir. Konstruktiv şəkildə ifadə olunmuş CRISPR/Cas9 sistemləri üçün tRNA-sgRNA(o)-dan sgRNA-nın aşağı səviyyələri, əgər varsa, kompleksin ifadəsinin və ya fəaliyyətinin uzadılmış müddəti ilə kompensasiya edilə bilər, beləliklə, ümumi yüksək redaktə səmərəliliyinə səbəb olur (Xie et al. 2015). İkincisi, istifadə etdiyimiz U6 promotorları OsU3 promotorundan daha orijinal sgRNA skafoldunda Pol-III promotorlarının potensial terminatoru olan 4 × T-yə daha həssas ola bilər. Üçüncüsü, transkripsiyadan sonra əmələ gələn tRNT ikincil strukturu (yonca yarpağı strukturu) 4 × T sahələrində sonlanmanı gücləndirə bilər. Səbəbi nə olursa olsun, bu tədqiqat tRNA-sgRNA(m)-nin Cas9-suz bitkilərin əks-seçimində təkcə mCherry kasetinin deyil (Gao et al. 2016), həm də uğurlu tətbiqini asanlaşdıran optimal forma olduğunu müşahidə etdi. yüksək spesifik Cas9 variantları (Chen et al. 2017 Kleinstiver et al. 2016 Slaymaker et al. 2016) hədəfdən kənar təsirlərin baş verməsinin qarşısını alır.

Nəticələrimiz həmçinin göstərir ki, yüksək spesifiklikli SpCas9 mutant variantları vəhşi tipli həmkarına nisbətən yüksək redaktə effektivliyini qorumaq üçün daha yüksək konsentrasiyalar tələb edir (Şəkil 5), baxmayaraq ki, mutant sgRNA iskelesinin onların redaktə səmərəliliyinə təsir edib-etmədiyini müəyyən etmək qalır. tRNA-sgRNA(m) füzyon strategiyası ilə birlikdə konstitutiv və güclü promotorlar tərəfindən idarə olunan bu SpCas9 variantları məhsullarda yüksək spesifiklik və yüksək effektivlikli genomun redaktəsi üçün istifadə edilə bilər. Xüsusilə geminivirusun vasitəçi olduğu CRISPR/Cas9 sistemlərində, Cas9 və sgRNA kasetlərini özündə saxlayan DNT replikonları bitki hüceyrəsində yüzlərlə nüsxəni müvəqqəti olaraq gücləndirdiyindən, yüksək spesifiklikli SpCas9-un redaktə effektivliyi xeyli güclənəcək və beləliklə, CRISPR-nin çox yüksək konsentrasiyasına gətirib çıxarır/ Hüceyrədəki Cas9 kompleksi (Cermak et al. 2017). Beləliklə, geminivirus əsaslı replikon sistemlərinin və CRISPR/Cas9 sistemlərinin inteqrasiya olunmuş tətbiqlərinin sürətli təkamülü ilə birlikdə, yüksək spesifiklikli SpCas9 hüceyrədə yüksək dozalı CRISPR/Cas9 komplekslərinin yaratdığı hədəfdən kənar mutasiyaların qarşısını almaqda xüsusilə faydalı olacaqdır (Gil). -Humanes et al. 2017 Wang et al. 2017).

Bu hesabatda gözlənilməz, lakin maraqlı tapıntılarımızdan biri, parçalanma yerlərinə yüksək tezlikli T-DNT daxil edilməsi idi (Şəkil 6, S3-S5). Bu tapıntı transgenlərin məqsədyönlü inteqrasiyası üçün eksperimental dizaynı asanlaşdıra bilər (Li et al. 2016 Salomon and Puchta 1998 Tzfira et al. 2003) və mutasiya təhlili üçün əlavə narahatlıqlara səbəb ola bilər. Birincisi, hədəf bölgənin PCR gücləndirilməsində uğursuzluqla qarşılaşdıqda, T-DNT daxiletmələri bir ehtimal kimi nəzərə alınmalıdır. İkincisi, əvvəlki hesabatlarda naməlum böyük fraqmentlərin daxil edilməsi kimi müəyyən edilmiş mutasiya növləri T-DNT daxiletmə hadisələri kimi yenidən nəzərdən keçirilə bilər. Üçüncüsü, T1 üçün Ərəbidopsis EPC sistemindən istifadə etməklə yaradılan mutantlar və ya embriogen kallusdan yaranan T0 mutantları, homozigot və ya biallelik mutantların nisbətləri müvafiq olaraq həddən artıq və aşağı qiymətləndirilməyə məruz qalır. T-DNT-nin iki nüsxəsinin iki allelinə məqsədyönlü inteqrasiyası CPC bu hesabatda gen və ya HAB1 Əvvəlki tədqiqatda olan gen, Agrobacterium vasitəçiliyi ilə T-DNT-nin bitki genomuna daxil edilməsinə dair yeni bilikləri də təmsil edə bilər. Birincisi, T-DNT-lər hədəf hüceyrələrin genomuna inteqrasiya olunmazdan əvvəl CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə DNT-nin parçalanması tamamlana bilər. İkincisi, üçün Ərəbidopsis floral dip transformasiyası (Desfeux et al. 2000), T-DNT-nin təsadüfi inteqrasiyası adətən mayalanmadan əvvəl baş verir, halbuki CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə T-DNT-lərin məqsədyönlü inteqrasiyası mayalanmadan sonra baş verir.

sgR-ETC2 hədəfdən kənar mutasiyalara səbəb olduğundan CPC yüksək tezlikli, in KEÇİN orta tezlikli ve in AT5G50230 aşkar edilə bilən səviyyədə aşağı tezlik ilə, nəticələrimiz diqqətlə seçilmiş hədəf saytlarının yüksək spesifikliyə zəmanət verdiyini göstərir. Bu müşahidə əvvəlki hesabatımızla dəstəkləndi, burada sgR-ABI1-in səbəb olduğu hədəfdən kənar mutasiyaları aşkar etdik. ABI2AT5G02760, lakin hədəfdən kənar mutasiyalar aşkar etmədi AT2G25070AT3G17090. Hədəfdə olan saytlarda üçdən az uyğunsuzluq və asanlıqla yol verilən uyğunsuzluq xüsusiyyətləri olan potensial hədəfdənkənar saytlar olmamalıdır. Bundan əlavə, çoxlu yüksək homoloji genləri hədəfə alarkən məlumatlılıq tövsiyə olunur, çünki hədəfdən kənar saytlar, ehtimal ki, hədəfdə olan saytlara bitişikdir və bu, bu tədqiqatda bildirilən vəziyyətə bənzər, hədəfdən kənar təsirlərin güclənməsinə səbəb ola bilər. Ümumiyyətlə, bitkilərdə hədəfdən kənar təsirlərin qarşısını almaq üçün aşağıdakı altı strategiyanın kombinativ formalarından istifadə etməyi tövsiyə edirik (Tycko et al. 2016). Birincisi, yüksək spesifiklik hədəfləri silisium proqnozlarında istifadə edilməklə diqqətlə seçilməlidir (Haeussler et al. 2016). İkincisi, Cas9-suz mutantlar mümkün qədər təcrid olunmalıdır (Gao et al. 2016 Lu et al. 2017). Üçüncüsü, zəruri hallarda tRNA-sgRNA(m) füzyon metodu ilə birlikdə yüksək spesifik SpCas9 variantlarından istifadə edilə bilər (Chen et al. 2017 Kleinstiver et al. 2016 Kulcsar et al. 2017 Slaymaker et al. 2016 Xie et al. 2015 Zhang və başqaları 2017a). Dördüncüsü, zərurət yarandıqda, SaCas9 və ya daha yüksək spesifikliyə malik digər ortoloqlardan istifadə edilə bilər (Steinert et al. 2015). Beşincisi, zərurət yarandıqda, qoşalaşmış nikaslardan istifadə etmək olar (Fauser et al. 2014). Nəhayət, lazım gəldikdə, DNT-siz üsullardan istifadə edilə bilər (Liang et al. 2017 Svitashev et al. 2016 Woo et al. 2015).

Kollektiv olaraq, bu, bitkilərdə CRISPR/Cas9 tərəfindən törədilən yüksək tezlikli hədəfdənkənar mutagenezin müşahidələrinə dair ilk hesabatdır, bizim nəticələrimiz göstərir ki, CRISPR/Cas9 komponentləri olan bitkilərdə CRISPR tərəfindən törədilən hədəfdənkənar təsirlərə davamlı diqqət yetirilməlidir. /Cas9 cari və sonrakı nəsillərdə və bu hesabatda optimallaşdırılan alətlərin bitkilərdə və digər orqanizmlərdə genomun redaktəsinin səmərəliliyini və spesifikliyini yaxşılaşdırmaq üçün faydalı olacağını bildirir.


Dinitroanilin herbisid müqaviməti üçün yeni süni düyü rüşeyminin hazırlanması. OsTubA2

Tarlada alaq otlarını məhv etmək üçün geniş istifadə olunan kimyəvi herbisidlər səmərəliliyi, istifadəsi asanlığı və nisbətən aşağı qiymətə görə müasir kənd təsərrüfatında alaq otlarının idarə olunması üsulunu geniş şəkildə tətbiq etmiş və dəyişdirmişdir. Son onilliklərdə çoxlu sayda transgenik herbisidlərə dözümlü bitkilər (məsələn, qarğıdalı, soya, pambıq, düyü) hazırlanıb və kommersiyalaşdırılaraq qlobal toxum bazarını yenidən formalaşdırıb (Schutte). və b., 2017). Bununla belə, kimyəvi herbisidlərin (yəni, ALS inhibitorları, EPSPS inhibitorları, ACCase inhibitorları) istifadəsi də kəskin şəkildə artmışdır ki, bu da bu herbisidlərə davamlı alaq otlarının növlərinin yaranması ilə nəticələnmişdir. Beləliklə, alaq otlarının idarə edilməsini diversifikasiya etmək üçün yeni herbisidlərə davamlı bitkilərin inkişaf etdirilməsi, herbisidlərə qarşı alaq otlarına davamlılığın təkamülünü yavaşlatmaq və gələcəkdə davamlı məhsul istehsalını saxlamaq üçün böyük əhəmiyyət kəsb edir. Son zamanlar ortaya çıxan qabaqcıl CRISPR vasitəçiliyi ilə əsas redaktə texnologiyaları sayəsində (Ren və b., 2019 Wang və b., 2020 Yan və b., 2018 ) hər hansı herbisid müqaviməti ilə bağlı mühüm genetik variasiyalar müvafiq baza redaktorları tərəfindən birbaşa və sürətlə idarə oluna bilər. Tubulin genlərinin bir sıra bitkilərdə trifluralinə və digər dinitroanilin herbisidlərinə müqavimət göstərdiyi bildirilmişdir (Çu). və b., 2018 Lyons-Abbott və b., 2010). Digər əsas herbisidlərlə müqayisədə alaq otlarında dinitroanilin müqavimətinin tezliyi olduqca aşağıdır (Heap, 2014). Bu, çox güman ki, tubulin genlərindəki mutasiyalar hüceyrə bölünməsində və uzanmasında mühüm proses olan mikrotubulun polimerləşməsinə təsir edə bilər və nəticədə bitki ölümünə səbəb ola bilər. Buna görə də, tubulin genləri gələcək məhsul yetişdirilməsi üçün herbisidlərə davamlı mikrobların inkişaf etdirilməsi üçün perspektivli hədəf genlərdir. Bu tədqiqatda biz endogeni dəqiq şəkildə redaktə edərək, fitnes cəzası olmadan trifluralin və pendimetalin müqavimətinə malik yeni süni düyü rüşeymini uğurla yaratdıq. OsTubA2 düyü genomunda olan gen. Nəzəri olaraq, bu mühüm xüsusiyyət CRIPSR vasitəçiliyi ilə adenin bazası redaktorlarından istifadə edərək digər əsas məhsullara da sürətlə daxil edilə bilər.

Əvvəllər Met-268-Thr mutasiyasının olduğu göstərilmişdir α-tubulin gen EiTUA1 bir sıra qaz otu bitkilərində dinitroanilin müqaviməti ilə əlaqələndirilir (Eleusine göstəricisi) biotiplər (Yamamoto və b., 1998). aid olan zülallar α-tubulinβ-tubulin ailəsi yüksək dərəcədə qorunub saxlanılır, 88%-ə qədər amin turşusu oxşarlığı göstərir (Rao və b., 2016). Buna görə də biz fərz etdik ki, bu nöqtə mutasiyasının düyü genomuna daxil edilməsi adi düyünü herbisidlərə davamlı çeşidə çevirə bilər. Bu məqsədlə, α-tubulin homoloq geninin dəqiq əsas redaktəsi OsTubA2 (LOC_Os11g14220) əvvəllər təsvir edilmiş düyü adenin əsas redaktoru rBE14 (Yan və b., 2018). NGG PAM-a uyğun gələn sgRNA, tamamlayıcı genomik DNT zəncirini hədəf almaq üçün nəzərdə tutulmuşdur. OsTubA2 T1981 sahəsində (Şəkil 1a). Oliqoslar sintez edilmiş, qurulmuş və daha əvvəl təsvir edildiyi kimi Gateway rekombinasiyası vasitəsilə rBE14 ikili vektoruna göndərilmişdir (Yan). və b., 2018). Daha sonra rBE14/sgRNA sistemi Kitaake düyü sortuna daxil edildi.Oryza sativa spp. yapon) vasitəsilə Aqrobakteriya- vasitəçi çevrilmə.

Düyü bitkiləri müstəqil kallidən regenerasiya edilmiş və hədəf bölgənin Sanger ardıcıllığı ilə birbaşa genotiplənmişdir. Əldə edilmiş 63 müstəqil düyü xəttindən 8 xətt (12,7% səmərəlilik) Met268 qalığını treonin qalığı ilə əvəz edərək T1981-də baş verən A > G çevrilməsi ilə müəyyən edildi (Şəkil 1b). Səkkiz mutant xəttin hamısı heterozigot idi və təsadüfi indellər aşkar edilmədi. Potensial kənar hədəflər OsTubA2-düyü genomunda rBE14/sgRNA-nın hədəflənməsi proqnozlaşdırıldı. Səkkiz müsbət transgen xəttdə potensial hədəfdən kənar yerlərdə heç bir nukleotid dəyişikliyi aşkar edilmədi (Şəkil 1c).

Sonra, hər birinin T1 nəsli OsTubA2-redaktə edilmiş T0 xətləri T-DNT-nin ayrıldığı xətləri müəyyən etmək üçün genotiplənmişdir. Uyğun olan xüsusi primerlərlə PCR gücləndirilməsi Cas9, sgRNAHyg transgenlər aparılmışdır. Şəkil 1d ande-də göstərildiyi kimi, bəzi T1 fərdlərində genetik seqreqasiya səbəbindən transgenlər yox idi. Bundan əlavə, Sanger ardıcıllığı bəzi bitkilərin (məsələn, #2-5, #2-10) olduğunu ortaya qoydu. və s.) homozigot idi. Yabanı tipli Kitaake toxumlarının cücərməsinin dinitroanilin herbisid müalicəsinə həssas olduğunu nəzərə alaraq (Şəkil 1f), daha sonra fenotipik və genotipik analiz aparılmışdır. Heterozigot T0 xətlərinin №2 və №5 T1 populyasiyasının düyü toxumları yabanı tipli düyüdə hipokotil və kök böyüməsini maneə törətmək üçün kifayət olan 6,6 mq/L pendimetalin olan silindrlərdə cücərmişdir. M268T mutasiyasını daşıyan bütün homozigot toxumlar pendimetalinlə müalicəyə müqavimət göstərmiş, yabanı tipli toxumun cücərməsi isə dayandırılmışdır. Digər tərəfdən, heterozigot bitkilər sınaqdan keçirilmiş şəraitdə köklərin və hipokotillərin böyüməsinə görə fərqli müqavimət fenotipləri nümayiş etdirmişlər, bu, ehtimal ki, M268T mutasiyasının doza təsirindən irəli gəlir (Şəkil 1g andh). Biz həmçinin 4,0 mq/L trifluralinə (dinitroanilin herbisidlərinin başqa bir növü) qarşı müqaviməti təhlil etdik ki, bu da yabanı tipli düyünün kök və hipokotil inkişafını maneə törədə bilər. Trifluralin T1 nəslinə tətbiq edildikdə, oxşar fenotiplər müşahidə edildi (Şəkil 1h). Beləliklə, M268T mutasiyası OsTubA2 həqiqətən düyüdə həm trifluralinə, həm də pendimetalin herbisidlərinə qarşı müqavimət göstərir və sonrakı nəsillərdə stabil olaraq miras qalır.

Hamısı OsTubA2-T-DNT transgenləri olmayan redaktə edilmiş bitkilər istixanada təbii işıq şəraitində yetişdirilmişdir. Bitkilər yabanı tipli bitkilərdən morfoloji cəhətdən fərqlənmirdi (Şəkil 1i). Bundan əlavə, T2 toxumlarının min dənə çəkisi və cücərmə sürəti araşdırılmış, M268T və yabanı tipli bitkilər arasında əhəmiyyətli fərq müşahidə edilməmişdir (Şəkil 1j). Nəticələrimiz birlikdə Met-268-Thr mutasiyasının daxil olduğunu göstərir OsTubA2 əsas redaktə düyü artım cəza səbəb deyil.

Genetik müxtəliflik OsTubA2 RiceVarMap v2.0 (Zhao) istifadə edərək, 4726 təkrar ardıcıllaşdırılmış düyü birləşməsindəki gen araşdırılıb. və b., 2015). Məlumatlar göstərir ki, M268 in OsTubA2 düyü əhliləşdirmə zamanı təbii və ya insan seçilməsi ilə hədəf alınmamışdır (Şəkil 1k). Beləliklə, M268T bitkiləri gələcək düyü yaxşılaşdırılması üçün böyük potensiala malik yeni süni germplazmadır. Bir sıra α-tubulin buğda, qarğıdalı, arpa, sorqo, yağlı toxum, pambıq və soya daxil olmaqla digər əsas iqtisadi bitkilərin genləri əlavə olaraq təhlil edilmişdir. Ardıcıllıqla düzülmələr M268 lokusu ardıcıllığının müxtəlif növlər arasında yüksək səviyyədə qorunduğunu aşkar etdi (Şəkil 1l), M268T-vasitəçiliyi ilə dinitroanilin müqavimətinin dəqiq əsas redaktəsi vasitəsilə sürətlə digər məhsullara daxil edilməsi imkanını açır.

Xülasə, araşdırmamız göstərir ki, M268T mutasiyası endogen OsTubA2 adenin bazası redaktoru tərəfindən yaradılan gen, fitnes xərclərinə səbəb olmadan düyüdə dinitroanilin herbisid müqavimətini təmin edir. Gələcəkdə bu strategiyadan istifadə edərək, hər hansı digər düyü sortları və ya nağd məhsullar herbisidlərə qarşı müqavimət xüsusiyyəti ilə gücləndirilə bilər.


Videoya baxın: BIOTEKNOLOGI KELAS 9 Part 2 Bioteknologi Modern #bioteknologi (Sentyabr 2022).


Şərhlər:

  1. Adalwin

    əlamətdar, çox yaxşı məlumat

  2. Mura

    Nə olursa olsun.

  3. Vernon

    Bu çox yaxşı ifadə lazımlı olacaq.

  4. Gilmat

    Üzr istəyirəm, amma məncə yanılırsınız. Mən bunu sübut edə bilərəm.



Mesaj yazmaq