Məlumat

Tək nukleotidin silinməsi və ya daxil edilməsinin primerin tavlanmasına təsiri

Tək nukleotidin silinməsi və ya daxil edilməsinin primerin tavlanmasına təsiri


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Primer tavlanması və nəticədə PCR gücləndirilməsi necədir tək nukleotidin silinməsi və ya primerin içərisinə daxil edilməsi təsir edirmi?

Belə bir primer təsəvvür edin:
GCGTCATAAAGGGGACGTG (primer)
və şablon DNT-nin müvafiq hissəsində bir G yoxdur, ona görə də belə görünür:
GCGTCATAAAGGGACGTG (şablon).

Mümkün cütləşmə ola bilər
GCGTCATAAAGGGGACGTG astar
GCGTCATAAA_GGGACGTG şablonu
və ya
GCGTCATAAAGGGGACGTG astar
GCGTCATAAAGGG_ACGTG şablonu
və ya arasında olan hər hansı bir şey.

Normal real vaxt PCR-də 60°C tavlamada belə primerlə gücləndirmənin tamamilə pozulması mümkündürmü? Bu, gücləndirməni tamamilə poza bilərmi?

Əgər uyğunsuzluq olsaydı əvəzetmə-kimi, mən olduqca əmin olardım, primer hələ də işlək olacaq və gücləndirmə baş verəcək. Həddindən artıq vəziyyətdə, Ct-nin sonunda ən azı qalıq gücləndirmə olardı. Əvəzedici uyğunsuzluqların primerlərə necə təsir etdiyinə dair çoxlu məlumat var və mənim də bununla bağlı çoxlu şəxsi təcrübəm var.

Təəssüf ki, silinmə uyğunsuzluqlar daha az öyrənilmiş və googleproof. Tapdığım yeganə göstərici bu işdir:
Lipsky RH, Mazzanti CM, Rudolph JG, Xu K, Vyas G, Bozak D, et al. Tək nukleotid polimorfizmlərinin aşkarlanması üçün DNT ərimə analizi. Clin Chem. 2001;47:635-44.
Həmin işdə tək nukleotidin silinməsi ərimə temperaturuna əvəzetmə uyğunsuzluğundan oxşar və ya daha aşağı təsir göstərmişdir. Ancaq söhbət daha uzun oliqolardan gedirdi. Nümunələr:
Silinmə effekti:
133 bp fraqment, 67 % GC, 43 mövqedə SNP silinməsi, delta Tm (homo-hetero dupleks) = 1,2°C
Əvəzetmələrin təsiri:
152 bp fraqment, 43 % GC, 68-ci mövqedə T-C-yə əvəz, delta Tm (homo-hetero dupleks) = 0,9°C
100 bp fraqment, 41 % GC, 42-ci mövqedə T-dən C-yə dəyişdirmə, delta Tm (homo-hetero dupleks) = 1,4°C
163 bp fraqment, 60 % GC, 86-cı mövqedə C-dən T-yə dəyişdirmə, delta Tm (homo-hetero dupleks) = 2.2°C
110 bp fraqment, 59 % GC, 66 mövqedə G-nin A ilə əvəzlənməsi, delta Tm (homo-hetero dupleks) = 3,8°C

Suallar:
1. İçəridə silinmə uyğunsuzluqlarının (!!! ən sonunda deyil) tavlanmaya və PCR-ə necə təsir etdiyi haqqında mənə ədəbiyyat tövsiyə edə bilərsinizmi?
2. Siz mənim nümunəmdəki primerin ən azı qismən hələ də işlək olacağını təxmin edirsiniz, yoxsa heç bir gücləndirmə gözləmirsiniz?


Daxil etdiyinizdən sonra EDIT edin:
Bu onlayn proqram " mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Two-state-melting " hesab edir ki, silinmə uyğunsuzluqları ən azı qısa primerlər üçün əvəzetmələrdən daha stabilliyi pozur. Öz nümunəm üçün o, delta Tm (homo-hetero dupleks) = 12.9°C hesabladı. Əvəzində uyğunsuzluqları sınasam, delta Tm (homo-hetero dupleks) 3,8°C ilə 5,7°C intervalında olur.

Yeni sual
Əgər mənim işimə mümkün qədər oxşar təcrübəniz varsa, 3' primer ucundan cca 6 - 9 mövqeyində tamamlayıcı şablonda tək nukleotid silinməsi ilə 19 nt uzunluğunda primer, 60°C-də istifadə edilən yumşalma temperaturu, zəhmət olmasa mənə bildirin. gücləndirmə əldə etmisinizsə, yoxsa yox. Zəhmət olmasa, mənə müvafiq arayış verin, əgər sizdə varsa, mən onu öz baxışımda sitat gətirəcəyəm :-) .

Mövzu tək nukleotidlərin silinməsi və ya primerlərə daxil edilməsi haqqında kifayət qədər dar olduğu müddətcə, mən hələ də ümumi məlumatla maraqlanıram. (Əvəzetmə uyğunsuzluğu deyil).


Bu cür primerlərdən çərçivə mutasiyalarını yaratmaq və ya əlavə əsaslar əlavə etmək üçün istifadə etdik. Təcrübəmə görə, sizin PCR işləyəcək (ehtimal ki, daha aşağı effektivlik) və siz əlavə baza ilə məhsul alacaqsınız. Biz plazmidlərin PZR əsaslı sayta yönəldilmiş mutagenezində daha böyük fərqlərə malik primerlərdən istifadə etdik, orada 10-a qədər baza uyğun gəlmirdi, lakin primerlər daha uzundur. Tək nukleotid uyğunsuzluğu üçün (ya + və ya - bir əsas) biz bu ölçüdə primerlərdən istifadə etdik.

Ədəbiyyata gəldikdə, bu nəşrlər faydalı ola bilər:

Xüsusilə ilk nəşrdə bir çox başqa maraqlı istinadlar var.


Başqa bir istinad əlavə edilir. Bu qrup müxtəlif uyğunsuzluqların təsirinə baxır (məsələn, A>T vs A>G) və həmçinin mövqe effektlərinə baxır.

Nəticələrimiz göstərir ki, tək uyğunsuzluqlar kiçik (<1,5 sikl həddi, məsələn, AC, CA, TG, GT) ilə şiddətli təsirə (>7,0 dövriyyə həddi, məsələn, AA, GA, AG, CC) qədər geniş müxtəlif effektlər yaradır. ) PCR gücləndirilməsi üzrə. Xüsusi uyğunsuzluq növləri, mövqe və təsir arasında aydın əlaqə tapıldı.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2797725/


Effektiv bir addımlı sayta yönəldilmiş silmə, daxil etmə, tək və çox yerli plazmid mutagenez protokolu

Mutagenez molekulyar biologiya və biokimyada mühüm rol oynayır. Bundan əlavə, biofiziki üsullar üçün daha uyğun olan zülallar yaratmaq üçün enzimologiya və zülal elmində istifadə edilmişdir. Zülalda qalıq(lar)ı tez və xüsusi olaraq mutasiya etmək qabiliyyəti mexaniki və funksional tədqiqatlar üçün vacibdir. Sahəyə yönəldilmiş bir çox mutagenez üsulları işlənib hazırlansa da, sadə, sürətli və çox tətbiq oluna bilən üsul hələ də arzuolunandır.

Nəticələr

Biz QuikChange™ sayta yönəldilmiş mutagenezin sadə bir addımlı prosedurunu qoruyub saxlayan, lakin onun effektivliyini artıran və çox sahəli mutagenez imkanlarını genişləndirən sahəyə istiqamətlənmiş plazmid mutagenez protokolu hazırlamışıq. Bu dəyişdirilmiş protokol, primerin dimerləşməsini aradan qaldıraraq primer-şablon tavlanmasını təşviq edən və həmçinin yeni sintez edilmiş DNT-nin sonrakı gücləndirmə dövrlərində şablon kimi istifadə edilməsinə icazə verən yeni primer dizaynından istifadə etdi. Güman etdiyimiz bu iki amil gücləndirilmiş gücləndirmə effektivliyinin və onun çox sahəli mutagenezdə tətbiqinin əsas səbəbləridir.

Nəticə

Dəyişdirilmiş protokolumuz tək mutasiyanın səmərəliliyini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı və eyni zamanda standart QuikChange™ ilə uyğun gəlməyən bir seçimdə böyük tək əlavələr, silmələr/kəsmələr və çoxsaylı mutasiyaları asanlaşdırmağa imkan verdi. Bundan əlavə, yeni protokol asanlaşdıran əhəmiyyətli dərəcədə daha az valideyn DNT tələb etdi DpnMən PCR gücləndirilməsi sonra həzm və ümumi səmərəliliyi və etibarlılığını artırmışdır. Protokolumuzdan istifadə edərək, biz tək sayt, çoxsaylı tək sayt mutasiyaları və birləşdirilmiş daxiletmə/silmə mutasiyaları yaratdıq. Nəticələr göstərdi ki, bu yeni protokol heç bir əlavə reagent xərcləri tələb etmədi (əsas QuikChange™-dən başqa), lakin ümumi müvəffəqiyyət dərəcələrini artırdı.


Mücərrəd

Kiçik nukleotidlərin daxil edilməsi/silinməsi (indel) xətaları DNT sintezində ümumi replikasiya xətalarından biridir. İndel xətasının ən tez-tez baş verməsinin DNT replikasiyası zamanı sürüşməyə meylli təkrarlanan ardıcıllıqla bağlı olduğu düşünülürdü. Düzəltmə və DNT uyğunsuzluğunun təmiri genetik məlumat əməliyyatlarının yüksək sədaqətini qorumaq üçün səhvlərin düzəldilməsində mühüm amillərdir. İndel xətalarının Klenow polimerazının (KF) yoxlanılmasının effektivliyini ölçmək üçün MALDI-TOF kütlə spektrometriyasının (MS) analizindən istifadə etdik. Burada, etiketlənməmiş və radio-izotop olmayan oliqonukleotid primeri tək nukleotid indeksi xətası meydana gətirən şablon DNT-yə qızdırılır və müxtəlif deoksiribonukleotid trifosfatların və/və ya dideoksiribonukleotid trifosfatların birləşməsinin iştirakı ilə KF tərəfindən yoxlanılır. Korrektor məhsulları astarın KF tərəfindən dəyişdirilmiş kütləvi dəyişməsi ilə müəyyən edilmişdir. Biz primer-şablon qovşağının müxtəlif mövqelərində indel xətaları olan DNT-lərin yoxlanılmasını araşdırdıq. Biz aşkar etdik ki, primer ucundan 1-5-nükleotidlər (nt) olan indel xətaları effektiv şəkildə yoxlanıla bilər, 3' ucundan 6-nt-də daxiletmə/delesiya isə qismən düzəldilir və uzadılır. Primer ucundan 7-9 nt məsafədə yerləşən indellər düzəlişdən qaçır və polimeraza ilə uzanır. Bu müşahidələrin mümkün əsas mexanizmləri struktur təhlili vasitəsilə polimeraza və primer-şablon birləşməsinin qarşılıqlı əlaqəsi kontekstində müzakirə olunur.


Effektiv bir addımlı sayta yönəldilmiş silmə, daxil etmə, tək və çox yerli plazmid mutagenez protokolu

Fon: Mutagenez molekulyar biologiya və biokimyada mühüm rol oynayır. Bundan əlavə, biofiziki üsullar üçün daha uyğun olan zülallar yaratmaq üçün enzimologiya və zülal elmində istifadə edilmişdir. Zülalda qalıq(lar)ı tez və xüsusi olaraq mutasiya etmək qabiliyyəti mexaniki və funksional tədqiqatlar üçün vacibdir. Sahəyə yönəldilmiş bir çox mutagenez üsulları işlənib hazırlansa da, sadə, sürətli və çox tətbiq oluna bilən üsul hələ də arzuolunandır.

Nəticələr: Biz QuikChange saytı yönümlü mutagenezin sadə bir addımlı prosedurunu qoruyub saxlayan, lakin onun effektivliyini artıran və çox sahəli mutagenez imkanlarını genişləndirən sahəyə yönəlmiş plazmid mutagenez protokolunu işləyib hazırlamışıq. Bu dəyişdirilmiş protokol, primerin dimerləşməsini aradan qaldıraraq primer-şablon tavlamasını təşviq edən və həmçinin yeni sintez edilmiş DNT-nin sonrakı gücləndirmə dövrlərində şablon kimi istifadə edilməsinə icazə verən yeni primer dizaynından istifadə etdi. Güman etdiyimiz bu iki amil gücləndirilmiş gücləndirmə effektivliyinin və onun çox sahəli mutagenezdə tətbiqinin əsas səbəbləridir.

Nəticə: Dəyişdirilmiş protokolumuz tək mutasiyanın səmərəliliyini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı və eyni zamanda standart QuikChange ilə uyğun olmayan bir seçimdə böyük tək əlavələr, silmələr/kəsmələr və çoxsaylı mutasiyaları asanlaşdırmağa imkan verdi. Bundan əlavə, yeni protokol PCR gücləndirilməsindən sonra DpnI həzmini asanlaşdıran və ümumi səmərəliliyi və etibarlılığı artıran əhəmiyyətli dərəcədə daha az valideyn DNT tələb etdi. Protokolumuzdan istifadə edərək, biz tək sayt, çoxsaylı tək sayt mutasiyaları və birləşdirilmiş daxiletmə/silmə mutasiyaları yaratdıq. Nəticələr göstərdi ki, bu yeni protokol heç bir əlavə reagent xərcləri tətbiq etmədi (əsas QuikChange-dən başqa), lakin ümumi müvəffəqiyyət dərəcələrini artırdı.


Nəticələr

Təhlil inkişafı

Allelik ayrı-seçkilik qabiliyyətini qiymətləndirmək üçün dideoksinukleotidlərin birləşdirilməsi üçün nəzərdə tutulmuş iki termostabil polimerazanı qiymətləndirdik: Thermo Sequenase (Termus aquaticus DNT polimeraza F667Y) və Terminator (Termokok 9°N-7 DNT polimeraza A485L). Şəkil 2 terminator konsentrasiyasının funksiyası olaraq bir sıra G/A SNP-lərində bu fermentlər tərəfindən xüsusi terminator birləşməsini təqdim edir. PCR və genomik DNT şablonlarının təmizlənməsi, təchiz edilmiş tamponların və 10 mM ddNTP terminatorlarının mövcudluğunda uzadılması ilə üsullar altında təsvir edildiyi kimi idi. Biz xüsusi birləşməni tamamlayıcı və tamamlayıcı olmayan (yanlış) terminatorların birləşmə siqnalları arasındakı fərq kimi qiymətləndirdik. Yüksək ferment konsentrasiyalarında qeyri-spesifik birləşmə müşahidə edilə bilər. Bu ilkin sınaqlarla ən böyük spesifik birləşmə Terminator üçün 0,004 vahid/μl və Thermo Sequenase üçün 0,02 vahid/μl genişləndirici ferment konsentrasiyalarında müşahidə edilmişdir.

Genişləndirici polimeraza konsentrasiyası əyriləri. (A) Terminator konsentrasiyasının funksiyası kimi xüsusi birləşmə. (B) Thermo Sequenase konsentrasiyasının funksiyası kimi xüsusi birləşmə.

Genişləndirici polimeraza konsentrasiyası əyriləri. (A) Terminator konsentrasiyasının funksiyası kimi xüsusi birləşmə. (B) Thermo Sequenase konsentrasiyasının funksiyası kimi xüsusi birləşmə.

Həm Thermo Sequenase, həm də Terminator müxtəlif SNP-lər arasında gözlənilən analiz performans dəyişikliyini göstərdi (məsələn, Əlavə Şəkil S2). Analizlərin optimallaşdırılmasına kömək olaraq, şablon və variant sayt konteksti üzərində nəzarəti təmin etmək üçün sintetik hədəf sistemi hazırladıq. Bu hədəflər PCR astarlama sahəsinin cinah ardıcıllığını, eləcə də genişləndirici primerin sonrakı hibridləşdirilməsi üçün variant mövqeyini əhatə edən kifayət qədər ardıcıllığı, variant mövqeyində terminatorun birləşməsini asanlaşdırdı. Sintetik hədəf şablonunun təhlili performansının nümunələri Şəkil 3-də göstərilmişdir.

Terminatordan istifadə edərək hazırlanmış SNP kimi sintetik hədəf şablonunun (SynFP_C və SynFP_T) nümunə təhlili (A) və ya Thermo Sequenase (B).

Terminatordan istifadə edərək hazırlanmış SNP kimi sintetik hədəf şablonunun (SynFP_C və SynFP_T) nümunə təhlili (A) və ya Thermo Sequenase (B).

Uzatma bufer tərkibinin Terminator tərəfindən terminatorun daxil edilməsinə təsirini araşdırdıq. Sintetik hədəflər SynFP_C və SynFP_T (ddG-R110 və ddA-TAMRA daxildir) və 2 mM, 10 mM KCl, 10 mM (NH) ilkin buferdən istifadə etdik.4)2BELƏ Kİ4, 0,1% Triton X-100 və 20 mM Tris-HCl pH 8,8. Bizim yanaşmamız digər dəyişənləri sabit saxlamaqla hər biri ikinci komponentin konsentrasiyaları diapazonunun mövcudluğunda bir komponentin bir sıra konsentrasiyalarını sınaqdan keçirmək idi. Biz sınaqdan keçirilmiş iki komponentin hər biri üçün optimalı seçdik, yeni şərti ilkin buferə dəyişiklik kimi qəbul etdik. Hər dəyişən üçün optimal seçilənə qədər bu yanaşmaya əməl etdik. Optimallaşdırılmış reaksiya 0,5 μM uzatma primeri və 1 × tampon A: 2 mM MgSO idi4, 5 mM (NH4)2BELƏ Kİ4, və 0,1% Triton X-100 və 20 mM Tris-HCl pH 9,3. Thermo Sequenase də bu şərtlərdə yaxşı çıxış etdi, baxmayaraq ki, biz sonradan onun üçün B tamponunu optimallaşdırdıq (aşağıda daha ətraflı təsvir edilmişdir).

Biz daha sonra ddU-TAMRA, ddG-R110, ddC-R110 və ddA-TAMRA terminatorunun həm Terminator, həm də A tamponunda Thermo Sequenase tərəfindən dörd uyğun sintetik hədəfdən istifadə etməklə birləşdirilməsinin səmərəliliyini qiymətləndirdik (şək. 4). Yalnız Thermo Sequenase bu dörd terminatorun hamısını səmərəli şəkildə birləşdirdi və bütün sonrakı təcrübələr üçün belə seçildi. Thermo Sequenase üçün bu dörd terminatorun optimal 1× terminator konsentrasiyaları 35 nM ddA-TAMRA, 4 nM ddC-R110, 4 nM ddG-R110 və 10 nM ddU-TAMRA idi (şək. 5). Biz sintetik hədəflərdən və yuxarıda göstərilən ümumi yanaşmadan istifadə edərək Termo Sequenase üçün xüsusi olaraq genişləndirmə buferini daha da optimallaşdırdıq (Şəkil 6). Nəticədə 1 × bufer B tərkibində: 6 mM MgSO4, 5 mM (NH4)2BELƏ Kİ4, 0,05% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8,9 və 5% qliserin əlavə edilməsi. Terminatorun birləşməsinin ən spesifik olduğu Thermo Sequenase konsentrasiyası 0,0175 vahid/μl olmuşdur. Termo Sequenase üçün 4 nM ddU-R110 və 20 nM ddC-TAMRA optimal konsentrasiyaları seçərək əlavə iki terminator da qiymətləndirilmişdir (şək. 7). Effektiv və spesifik terminatorun birləşdirilməsi ilə belə, etiketli uzatma primerinin yığılması xətti termal dövrlərin sayının bir funksiyasıdır. Təxminən 26 uzatma dövründə platoya malik olan təhlil edilmiş SNP-nin hər iki mümkün uzatma məhsulunun (FP cəmi) xüsusi siqnallarının cəmi (Əlavə Şəkil S3-də təsvir edilmişdir).

SynFP_A, SynFP_C, SynFP_G və SynFP_T sintetik hədəflərindən istifadə etməklə qiymətləndirilən Therminator və Thermo Sequenase tərəfindən flüoresan etiketli ddNTP terminatorunun birləşdirilməsinin spesifikliyi.

SynFP_A, SynFP_C, SynFP_G və SynFP_T sintetik hədəfləri ilə qiymətləndirilən Therminator və Thermo Sequenase tərəfindən flüoresan etiketli ddNTP terminatorunun birləşdirilməsinin spesifikliyi.

SynFPz_A, SynFPz_C, SynFPz_G və SynFPz_T sintetik hədəflərindən istifadə etməklə qiymətləndirilən ddNTP konsentrasiyasının funksiyası kimi Thermo Sequenase tərəfindən terminatorun birləşdirilməsinin spesifikliyi.

SynFPz_A, SynFPz_C, SynFPz_G və SynFPz_T sintetik hədəflərdən istifadə etməklə qiymətləndirilən ddNTP konsentrasiyasının funksiyası kimi Thermo Sequenase tərəfindən terminatorun birləşdirilməsinin spesifikliyi.

Q73mOKSlOHTtfievrDf5ztBJss6lAjRPNG" />

Tampon komponentləri və ferment konsentrasiyası funksiyası kimi Termo Sequenase tərəfindən terminatorun daxil edilməsinin spesifikliyi. Hər bir panel optimalın seçilməsi üçün qiymətləndirilmiş reaksiya komponenti əyrisini təqdim edir.

Q73mOKSlOHTtfievrDf5ztBJss6lAjRPNG" />

Tampon komponentləri və ferment konsentrasiyası funksiyası kimi Termo Sequenase tərəfindən terminatorun daxil edilməsinin spesifikliyi. Hər bir panel optimalın seçilməsi üçün qiymətləndirilmiş reaksiya komponenti əyrisini təqdim edir.

SynFPz_A, SynFPz_C, SynFPz_G və SynFPz_T sintetik hədəflərdən istifadə edilməklə qiymətləndirilən ddNTP konsentrasiyasının funksiyası kimi Thermo Sequenase tərəfindən ddC-TAMRA və ddU-R110-un birləşdirilməsinin spesifikliyi.

SynFPz_A, SynFPz_C, SynFPz_G və SynFPz_T sintetik hədəflərdən istifadə etməklə qiymətləndirilən ddNTP konsentrasiyasının funksiyası kimi Thermo Sequenase tərəfindən ddC-TAMRA və ddU-R110 birləşməsinin spesifikliyi.

Yanlış terminator birləşməsi PCR sonrası təmizləmə üçün Exo I və ya CIAP-ın azalan konsentrasiyasının istifadəsi ilə problem yaradır (şək. 8). Qalıq PCR primerləri və qalıq dNTP-lər nəzərdə tutulan, sorğulanan variant yerindən başqa bir mövqedə etiketlənmiş terminatorun daxil edilməsinə imkan verə bilər. Xüsusi terminatorun birləşdirilməsi üçün hər bir fermentin optimal konsentrasiyası hər reaksiya üçün 0,95 vahid təşkil etmişdir, 80°C-də 15 dəqiqə ərzində istilik inaktivasiyası ilə 30 dəqiqə ərzində 95°C arasında fərq yoxdur.

CIAP və Exo I konsentrasiyasının terminator birləşməsinin spesifikliyinə təsiri. Spesifik və qeyri-spesifik flüoresan etiketli ddNTP terminatorlarının birləşdirilməsi sintetik şablon hədəfləri üçün təsvir edilmişdir SynFP_G (A) və SynFP_A üçün (B).

CIAP və Exo I konsentrasiyasının terminatorun birləşməsinin spesifikliyinə təsiri. Spesifik və qeyri-spesifik flüoresan etiketli ddNTP terminatorlarının birləşdirilməsi sintetik şablon hədəfləri üçün təsvir edilmişdir SynFP_G (A) və SynFP_A üçün (B).

İstehsalın genotiplənməsi ilə analiz performansı

Biz iterativ olaraq optimallaşdırılmış SNuPE analizini 98 SNP və indel dəstinə tətbiq etdik, hər biri üçün 2202 DNT nümunəsinin genotiplənməsi üçün analizlər hazırladıq. 87-ci AmpliTaq Qızılı/betainsiz, 9-da AmpliTaq Qızıl/betain və 2-də Titan Taq/betain istifadə edilmiş Metodlarda təsvir edilən yanaşmadan istifadə edərək hər biri üçün PCR şərtlərini seçdik. İstənilən hər bir variant analizi üçün biz daha sonra irəli və tərs uzatma testinin performansının müqayisəsi üçün AA, AB (qarışıq) və BB genotiplərini təmsil etmək üçün nəzərdə tutulmuş sintetik hədəfləri gücləndirdik. Ən böyük FP məbləğinə malik versiya tam qandan alınmış tədqiqat genomik DNT nümunəsinin sonrakı sınağı üçün seçilmişdir. İki 96 quyudan ibarət bu ekran 151 subyekti (3-ü üç nüsxədə mövcuddur), 5 mənfi nəzarəti və 30 sintetik hədəfi (hər homozigotdan 10 və qarışıq/heterozigotdan 10) qiymətləndirdi. Sonuncular AA, AB və BB klaster mövqelərinin müəyyən edilməsi və nadir SNP-lərin (naməlum genotipli genomik DNT-lər üzərində qeyri-müəyyən performansın yeni bir analizinin sınaqdan keçirilməsinə qarşı) analiz performansı üçün xüsusilə faydalı olmuşdur. 98 dizayn edilmiş və sınaqdan keçirilmiş analizdən 85-i tədqiqat DNT-lərində təmiz genotiplər əldə etmişdir (87% analizin çevrilmə dərəcəsi).

Biz təxminən 170 000 ümumi genotip yaratmaq üçün 2202 DNT nümunəsində bu SNP və indel analizlərinin 77-si (işimiz üçün zəruri olan alt qrup) ilə istehsal genotiplənməsinə davam etdik. İki uyğunsuz genotip çağırışını (təxmini xəta dərəcəsi 0.0004) müşahidə edərək, 67 cüt genomik DNT cütünü nəzarət kimi daxil etdik. SNuPE analizlərindən asılı olmayaraq, biz eyni DNT nümunələrini Illumina Infinium MEGA EX massivi ilə genotip etdik. Nəzərə alın ki, bir sıra sorğusu genetik əcdadın qiymətləndirilməsi üçün spesifik, tələb olunan variantların fərdi təhlilindən daha uyğundur. Dizaynımıza görə olmasa da, SNuPE ilə yoxlanılan 77 variantdan 12-nin genotipləri də ortoqonal metoddan genotip çağırışlarının müqayisəsinə imkan verən massiv tərəfindən yaradıldı. Biri sıra ilə səhvən monomorf idi. Qalan 11 SNP 43 uyğunsuzluqla, 0,003 uyğunsuzluq dərəcəsi ilə 17 346 dublikat genotip verdi. Bu məlumatlar digər istehsal genotipləmə yanaşmalarına uyğun olaraq SNuPE analizinin dəqiqliyini dəstəkləyir.

İstehsalda genotiplənmiş SNuPE analizlərindən altısında testin inkişaf mərhələlərində FP məbləğləri var idi ki, biz tanıdığımız T uzatma primerini dəyişdirməklə yaxşılaşdırıla bilərdi.m. İstehsalın genotiplənməsi zamanı biz uzantı primer T-ni qiymətləndirdikm xüsusi birləşməni təkmilləşdirmək potensialı olan əlavə təhlil dəyişəni kimi. Daha yüksək T-ni qiymətləndirərək və seçərək altı analizi optimallaşdırdıqm uzatma astarları (şək. 9). Ümumiyyətlə, uzatma primeri TmUğurlu analizlərin göstəriciləri 52.6°C ilə 73.1°C arasında dəyişib, orta hesabla 58.1°C. Optimal uzantı primerini qiymətləndiririk Tm dizayn məqsədi 60°C ilə 65°C arasında olmalıdır.

Uzatma primerinin təsiri Tm FP məbləğində. Hər bir variant üçün ilkin və optimallaşdırılmış T-nin FP cəmim uzadılmış xətt kimi təqdim olunur.

Uzatma primerinin təsiri Tm FP məbləğində. Hər bir variant üçün ilkin və optimallaşdırılmış T-nin FP cəmim uzadılmış xətt kimi təqdim olunur.

Xüsusi tələb olunan variantların əhəmiyyətli bir hissəsi, adətən, hər hansı bir alternativ metodla təhlil üçün uğurla çevrilə bilmir. Çox vaxt birdən çox yanaşma tələb olunur. Müstəqil bir nümunə olaraq, əvvəllər TaqMan analizlərini axtardığımız 26 SNP dəsti arasında yarısı əvvəlcədən hazırlanmış, yarısı tələb olunan xüsusi dizayn idi. Xüsusi dəst arasında altı uğursuz dizayn, bir dizayn keçdi, lakin faktiki analiz uğursuz oldu və qalan altısı yaxşı performans göstərdi. Beləliklə, 26-dan 19-u (73%), təxmin edilən səhv dərəcəsi 0,004 (1,139 dublikat genotip cütü arasında dörd genotip uyğunsuzluğu) ilə TaqMan analizinə uğurla çevrildi.


Proqram təminatından istifadə edərək primer dizaynı

Həm yeni, həm də təcrübəli istifadəçilər üçün PCR primer dizaynına kömək edə biləcək bir sıra primer dizayn alətləri mövcuddur. Bu alətlər uğursuz eksperiment şansını azaldaraq, eksperimentə çəkilən xərcləri və vaxtı azalda bilər.

Primer Premier PCR primer dizaynı üçün müəyyən edilmiş bütün təlimatlara əməl edir. Primer Premier tək şablonlar, hizalamalar, degenerativ primer dizaynı, məhdudlaşdırıcı ferment analizi üçün primerlərin dizaynında istifadə edilə bilər. kontig analizi və ardıcıllıq primerlərinin dizaynı.

qPCR primer dizaynı üçün təlimatlar bir qədər dəyişir. AlleleID və Beacon Designer kimi proqram təminatı, sınaq xərclərini azaltmaq üçün multipleks analizlər, çarpaz növ primer dizaynı, növə xas primer dizaynı və primer dizaynı kimi kompleks aşkarlama analizləri üçün primerlər və oliqonukleotid zondları dizayn edə bilər.

PrimerPlex Multiplex PCR və multiplex SNP genotipləmə analizləri üçün primerlər hazırlaya bilən proqramdır.


Metodlar və materiallar

C. elegans suşlar standart üsullardan istifadə edilməklə becərilmişdir 1 . Bu tədqiqata başlamaq üçün istifadə edilən suşlar bunlardır: CB1033 che-2(e1033), CB3329 che-10(e1809), IW523 che-10(iw109) daf-3(iw108), CB3241 clr-1(e1754), CB1376 daf-3(e1376), VC20208 olmadan daf-3(gk269916), VC20379 daf-3(iw108), RB2589 daf-3(ok3610), SD378 dpy-17(e164) unc-79(e1068) / mpk-1(ga117), JN554 dyf-11 (pe554), PR813 osm-5(p813), VC40961 yarış-1(gk901813), MT7554 sqv-3(n2842) unc-69(e587)/qC1, MT9647 unc-29(e1072) sqv-5(n3039) / hT2, PR691 vergi-2(p691) che-2(iw107), RB1546 tmc-1(ok1859), VC40425 tmc-1(gk631913), CB4856 Hawaiian HA vəhşi təcrid və N2 vəhşi tipli ştam. Bu ştammlardan istifadə etməklə əlavə ştamlar hazırlanmışdır.

WormBase 37 versiyası WS256 təbii variant məlumatlarından i40-699 indelləri ayrıca tədqiqatda 39 xüsusi R 38 skriptlərindən istifadə etməklə çıxarılmışdır. WS256 məlumatlarının aktual olmasını təmin etmək üçün WormBase versiyası WS276 məlumatlarını da araşdırdıq. Əlavə xüsusi R skriptlərindən istifadə edərək, biz WormBase annotasiyalı gen məlumat dəstindən istifadə edərək, genin genetik və fiziki mövqeyi ilə yanaşı, hər i40-699 indelinə uyğun gələn ən yaxın geni müəyyən etdik. 11,556 şərhli i40-699 indelin siyahısı, indellərin fiziki vəziyyəti və ölçüsü, fiziki və genetik mövqeyi ilə ən yaxın gen, 40 yabanı təcrid arasında görünmə tezliyi və i40- ilə vəhşi təcrid ilə Əlavə Cədvəl S1-də verilmişdir. 699 indel.

Primerlərin dizaynında biz vahid PCR vəziyyətini və N2 və CB4856 HA DNT-nin asan fərqləndirilməsini hədəflədik. Məsələn, biz asan fərqləndirmək üçün CB4856-dan daha uzun N2 DNT-yə malik i40-699 indelləri seçdik. Eyni yumşalma temperaturu üçün optimal ərimə temperaturu Tm 60 ºC-ə təyin edilmişdir. Eyni uzanma müddəti üçün biz N2 və CB4856 məhsullarının ölçülərini dar diapazonda saxladıq. Son primer dəsti ilə N2 məhsul ölçüləri 500 ilə 1500 bp arasında, CB4856 məhsul ölçüləri isə 400 ilə 1300 bp arasındadır. PCR məhsullarının daha asan ayrılması üçün biz adətən  >� bp uzunluq dəyişikliyi indellərini seçdik, lakin i40-699 megabab-də təmsil olunmaq üçün bir neçə indel seçdik. ) intervallar. Əks halda, biz i40-699 indelləri özbaşına seçmişik. Genomun başqa bir hissəsindən gücləndirilmiş çaşdırıcı PCR məhsullarını minimuma endirmək üçün BLAST 40 primeri əvvəlcə altıdan istifadə edərək həyata keçirildi. C. elegans Şablon kimi xromosom ardıcıllığı ilə spesifiklik yoxlanılır C. elegans artıq olmayan (nr) nukleotid bazası. Əlavə primerlər yenidən primer-BLAST istifadə edərək və ya müvafiq kosmid, fosmid və ya YAC klon ardıcıllığı ilə primer3 41 istifadə edərək seçildi və qənaətbəxş primer cütü müəyyən edilənə qədər primerləri sınaqdan keçirdik. Cəmi 584 primer sınaqdan keçirildi və ən yaxşı primer cütləri Əlavə Cədvəl S2-də PZR məhsullarının gözlənilən ölçüləri, iki fərqli şəraitdə PCR müvəffəqiyyət dərəcələri, müvafiq hallarda 96 quyu boşqabındakı mövqenin qeydləri və vəhşi təcridlərlə verilmişdir. i40-699 indel ilə.

Əvvəlcədən qarışdırılmış primer cütlərinin işçi ehtiyatları 4 ºC-də uzunmüddətli saxlama buxarlanmaya və mümkün deqradasiyaya səbəb olduğu üçün dondurulmuş 96 quyu boşqablarda saxlanıldı. Başqa cür göstərilmədiyi halda, yetkin hermafroditlər ayrı-ayrılıqda 10 cl 1 lizis tamponunda (40 mM KCl, 10 mM Tris pH 8.3, 2.5 mM MgCl) parçalanmışdır.2, 0,45% IGEPAL, 0,45% Tween 20) 60 μg/ml son konsentrasiyada lizizdən əvvəl əlavə olunan proteinaz K ilə. Lizis 8 zolaqlı borulardan istifadə edərək 15 dəqiqə ərzində 95 ºC-də inaktivasiya ilə 1 saat ərzində 65 ºC-də həyata keçirildi. Lizis qurdlar tez-tez qarışdırılır və ya yığılırdı və birləşdirilmiş nümunələr tez-tez su və ya proteinaz K olmayan 1'lizis tamponu ilə seyreltilirdi. PCR Taq polimeraza üçün yuyucu vasitə olmadan standart şərtlərdən istifadə etməklə 25 º00b5l həcmdə aparıldı. Buxarlanmanı azaltmaq üçün 96 quyulu lövhələr üçün alüminium folqa möhürü ilə PCR üçün ya 8 zolaqlı borular, ya da 96 quyu boşqabları istifadə edilmişdir. PCR temperatur dövriyyəsinin vəziyyəti belə idi: 5º2032 95ºC, 35 dövr (30º2033 95ºC, 30º2033 60ºC, 2º2032x702º2), x000b0C. PCR məhsulları 2% agaroz geldə 120 V-də 40 dəqiqə ərzində elektroforez yolu ilə ayrıldıqdan sonra vizuallaşdırıldı.

𠂑,5 l Tris𠄺setat-EDTA işləyən bufer, başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə. Təkrarlanan zəif PCR nəticələri adətən 1-lizis tamponunun yeni hazırlanması və 1-lizis tamponunun köhnə ehtiyatlarının atılması ilə düzəldilirdi, bu isə bir çox aylardan sonra daha az təsirli ola bilər.

Xəritəçəkmə üçün F2 mutantlarını əldə etmək üçün CB4856 kişiləri maraq doğuran mutant hermafroditlərlə cütləşdirildi. Sonra F1 heterozigot hermafroditləri öz-özünə mayalanma yolu ilə F2 nəslini çoxaltmaq üçün L4 sürfələri kimi yeni lövhələrə yerləşdirildi. Nəhayət, F2 homozigot mutantları aydın (Clr) və qabarcıq bədən 42, L4 sürfə mərhələsində əzilmiş vulva (Sqv) 43 və sitokinez və ya sitokinez qabiliyyəti olmayan embrionların stereotipik morfologiyası ilə əlaqəli sterillik ola bilən mutant fenotipi ilə müəyyən edildi. temperaturdan asılı konstitutiv dauer mutant fenotipi 45 . Temperaturdan asılı olan dauer mutantlarının toplanması embrionların və L1 sürfələrinin qarışıq populyasiyasını 10 gün ərzində 28 ºC temperaturda bol miqdarda su ilə təmin etməkdən ibarət idi. E. coli mutant dauerdən sağ qalanların mutant münbit yetkinlərə çevrilməsinə imkan vermək üçün 20 ºC-ə qayıtmadan əvvəl qida kimi xidmət edən bakteriyalar.

Temperaturdan asılı konstitutiv dauer mutant fenotipindən istifadə edərək tamamlama testləri bir neçə fərqli yanaşmadan istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. üçün iw108 ya X xromosomunda yerləşir daf-3(ok3610) və ya dyf-11 (pe554) mutant hermafroditlər N2 erkəkləri ilə, F1 hemizigot mutant XO kişiləri isə hər ikisi ilə cütləşdi. daf-3(iw108) və ya dpy-17(e164) unc-79(e1068) daf-3(iw108) mutant hermafroditlər. F2 nəslinin qarışıq populyasiyaları 10 gün ərzində 28 ºC-ə köçürüldü və sonradan 20 ºC-ə köçürüldü və diri erkəklərin iştirakı ilə qeyri-Dpy qeyri-Unc məhsuldar yetkin hermafroditlər axtarıldı. Yetkin kişiyə çevrilən Dauer sağ qalanları, heç bir tamamlama olmadığını göstərən məhsuldar hermafroditlərin olmaması ilə uğurlu cütləşməni qiymətləndirmək üçün istifadə edildi. Testlərdən istifadə etməklə daf-3(iw108) olmadan hermafrodit mutantlar dpy-17 və ya unc-79 mutasiyalar, münbit yetkin hermafroditlərə çevrilmiş dauer sağ qalanları maraq mutasiyalarının varlığını və ya olmamasını təsdiqləmək üçün PCR istifadə edərək araşdırıldı. Oxşar yanaşma ilə istifadə edilmişdir iw107 həmçinin X xromosomunda yerləşir. Burada, biri che-2(e1033), daf-3(ok3610), dyf-11 (pe554), yarış-1(gk901813), osm-5(p813), və ya iw107 mutant hermafroditlər N2 erkəkləri ilə, F1 hemizigot mutant erkəkləri isə onlardan biri ilə cütləşdi. che-2(iw107), dpy-17(e164) unc-79(e1068) che-2(iw107), dpy-17(e164) unc-79(e1068) che-2(e1033), dpy-17(e164) unc-79(e1068) dyf-11(pe554), və ya dpy-17(e164) unc-79(e1068) osm-5(p813) hermafroditlər. ilə fərqli bir yanaşma istifadə edildi iw109 II xromosomda yerləşir. Burada, che-10(e1809) mutant hermafroditlər N2 erkəkləri ilə, heterozigot F1 erkəkləri isə hər ikisi ilə cütləşdi. che-10(iw109) və ya dpy-17(e164) unc-79(e1068) che-10(iw109) mutant hermafroditlər. 10 gündən sonra 28 ºC-də, kişi halına gələn dauer sağ qalanların varlığı tamamlamanın sübutu kimi istifadə edildi.

Bütün genom ardıcıllığı che-10(iw109) mutant ştamm Novogene (en.novogene.com) ilə həyata keçirildi, onların Bitki və Heyvanların Bütün Genom Sıralaması xidmətindən istifadə edərək, qoşalaşmış 150 bp ardıcıllıqla genomun 20-ni əhatə etməsi üçün 2 Gb məlumat çıxışı ilə. Sanger ardıcıllığı Genewiz (www.genewiz.com) ilə həyata keçirilmişdir.


MCAT - MOLEKULAR BİOLOGİYA

1. İki zəncirli DNT ayrılmalı və ya açılmalıdır
• DNT giraza (sinif II topoizomeraz) replikasiya çəngəlindən əvvəl DNT-nin açılmasına cavabdehdir.
• DNT helikazı replikasiya çəngəlində DNT-nin açılmasına cavabdehdir
• Tək zəncirli bağlayıcı zülal (SSB) helikazdan sonra DNT-nin açılmasına cavabdehdir. SSB-lər tək zəncirli DNT-ni ona bağlayaraq stabilləşdirir.

2. Sonra DNT yeni açılmış/ayrılmış DNT-yə tamamlayıcı olmaq üçün sintez edilir. Bütün bioloji DNT sintezi 5'-dən 3' ucuna qədər baş verir.
• Primase, açılmış DNT-yə qısa bir RNT primeri qoyaraq buna başlayır. Primer RNT-dən hazırlanır, lakin DNT ardıcıllığını tamamlayır. Daha sonra bu RNT DNT ilə əvəz olunur
• DNT polimeraza daha sonra öz üzərinə götürür və açılmamış DNT-ni tamamlayan DNT-ni yaradır
• DNT sintezi açılmamış DNT-nin hər iki zəncirində baş verir. Replikasiya çəngəlinin istiqamətində gedən sintez aparıcı zəncirdir. Replikasiya çəngəlinə əks istiqamətdə gedən sintez geridə qalan ipdir. Geridə qalan ipdə Okazaki fraqmentləri var.


Mücərrəd

Xloroplastın kodlaşdırılmayan bölgələrində əlavələr və silinmələr (indels) populyasiya strukturunu və gen axınını qiymətləndirmək üçün ümumi genetik markerlərdir, baxmayaraq ki, bitki ailələri kimi yaxınlarda ayrılmış nəsillər arasında indel təkamülü haqqında nisbətən az məlumat var. İndel hadisələri DNT ardıcıllığı boyunca təsadüfi baş vermədiyi üçün təkrarlanan mutasiyalar indel haplotipləri üçün homoplaziya yarada bilər. Bu, populyasiya tədqiqatları üçün potensial problemdir, çünki indel haplotipləri təkrarlanan mutasiyadan və həmçinin gen axınından sonra populyasiyalar arasında paylaşıla bilər. Furthermore, indel haplotypes may differ in fitness and therefore be subject to natural selection detectable as rate heterogeneity among lineages. Such selection could contribute to the spatial patterning of cpDNA haplotypes, greatly complicating the interpretation of cpDNA population structure. This study examined both nucleotide and indel cpDNA variation and divergence at six noncoding regions (psbB-psbH, atpB-rbcL, trnL-trnH, rpl20-5′rps12, trnS-trnG, and trnH-psbA) in 16 individuals from eight species in the Lecythidaceae and a Sapotaceae outgroup. We described patterns of cpDNA changes, assessed the level of indel homoplasy, and tested for rate heterogeneity among lineages and regions. Although regression analysis of branch lengths suggested some degree of indel homoplasy among the most divergent lineages, there was little evidence for indel homoplasy within the Lecythidaceae. Likelihood ratio tests applied to the entire phylogenetic tree revealed a consistent pattern rejecting a molecular clock. Tajima's 1D and 2D tests revealed two taxa with consistent rate heterogeneity, one showing relatively more and one relatively fewer changes than other taxa. In general, nucleotide changes showed more evidence of rate heterogeneity than did indel changes. The rate of evolution was highly variable among the six cpDNA regions examined, with the trnS-trnG and trnH-psbA regions showing as much as 10% and 15% divergence within the Lecythidaceae. Deviations from rate homogeneity in the two taxa were constant across cpDNA regions, consistent with lineage-specific rates of evolution rather than cpDNA region-specific natural selection. There is no evidence that indels are more likely than nucleotide changes to experience homoplasy within the Lecythidaceae. These results support a neutral interpretation of cpDNA indel and nucleotide variation in population studies within species such as Corythophora alta.


For more information about SNPs:

An audio definition of SNPs is available from the National Human Genome Research Institute’s Talking Glossary of Genetic Terms.

How scientists locate SNPs in the genome is explained by the University of Utah Genetic Science Learning Center.

For people interested in more technical data, several databases of known SNPs are available:


Videoya baxın: Biologiya. DNT və RNT Nuklein turşulari (Sentyabr 2022).


Şərhlər:

  1. Sullivan

    UUURRAAAA, FINALLY, ZABER

  2. Drem

    Mənə elə gəlir ki, bu, əla ideyadır

  3. Voliny

    Hazırda müzakirədə iştirak edə bilmirəm - çox məşğulam. Amma tezliklə düşündüklərimi mütləq yazacam.



Mesaj yazmaq