Məlumat

İstinad şablonlarından istifadə edən genom ardıcıllığının sıxılma üsullarında nəzərə çarpan hər hansı əsas məhdudiyyətlər varmı?

İstinad şablonlarından istifadə edən genom ardıcıllığının sıxılma üsullarında nəzərə çarpan hər hansı əsas məhdudiyyətlər varmı?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bu yaxınlarda mən biokimyada böyük verilənlər analitikası haqqında araşdırma apardım və genom ardıcıllığının sıxılmasının analizə necə təsir edə biləcəyi ilə maraqlanmağa başladım.

Vikipediya səhifəsində sadalanan bütün metodlar arasında istinad şablonu metodu mənim ən çox sevdiyim üsuldur, çünki o, təkcə təsirli görünmür, həm də bu mövzu ilə bağlı hər hansı araşdırma aparmazdan əvvəl ağlıma gələn fikirdir.

Ancaq bunu üzərində işlədiyim bir layihədə tətbiq etməzdən əvvəl, bioinformatika sənayesinin bu sxemdən istifadə edərkən tez-tez qarşılaşdığı ümumi və aşkar çatışmazlıqların/məhdudiyyətlərin olub olmadığını bilmək istədim.


İstinad şablonu metodunun ən bariz çatışmazlığı ondan ibarətdir ki, ondan istifadə etsəniz, artıq məlumatları təhlil etmiş olursunuz.

Adətən, siz yaş bioloqlardan məlumat alırsınız. Onlar nümunələri ardıcıllıqla sıralayır və ardıcıllığı serverə yükləyirlər. Çox vaxt yükləmə prosesi artıq avtomatlaşdırılır. Siz daxili ardıcıllıqla əgər, data artıq serverinizdədir. Əgər yoxsa - bioloqlar əlavə iş görmək istəmirlər. Üstəlik, bu böyük bir layihə deyilsə, o qədər çox məlumatınız yoxdur ki, onu köçürmək və saxlamaq problemdir. Beləliklə, məlumatları *.fastq.gz faylları kimi əldə edəcəksiniz.

Sonra siz QC edirsiniz, oxunuşları düzəldin və SNV-zəngi və ya ifadə təhlili və ya istədiyiniz hər şeyi edin. Düzəltmə və SNV çağırışı ağrılı, mürəkkəb (nüsxə sayının dəyişməsi, heterozigotluq və s.) və vaxt aparan ola bilər. Problem budur. Nəticə məlumatı adətən Variant Zəng Formatında (VCF) saxlanılır. CRAM və ondan istifadə edən 1K Genom Layihəsinin təsiri altında VCF hazırlanmışdır.


Ən böyük çatışmazlıq ondan ibarətdir ki, istinad şablonu sualını həll edə bilmir genom ardıcıllığı sıxılma. ünvanlayır variant məlumatı sıxılma.

Düzdür, genomikaya böyük maraq variantlara yönəldilmişdir, çünki onların təhlili faktiki bütün genomlardan daha asandır. Bundan əlavə, bir çox insanlar "genomika" və ya "genom ardıcıllığı" dedikdə, demək istədikləri "insan genomik variasiyası"dır, əsasən, digər genomlarla müqayisədə insan genomikası ilə əldə ediləcək daha çox pul var; və buna görə də insanların çoxu həqiqətən danışır insan genomik variantları "genomlar" haqqında danışdıqları zaman.

Variant vəziyyətində belə, genomun struktur variantları olduqda şablonlama yanaşmaları çox yaxşı işləməyi dayandırır və ya ən azı son dərəcə mürəkkəb olur. Genom qrafikləri kimi daha yeni irəliləyişlər struktur variantları kimi ən böyük problemləri həll edə bilər, lakin genomların parçalanmadan əvvəl nə qədər fərqli ola biləcəyi baxımından hələ də çox yaxşı müəyyən edilmiş (AFAIK) məhdudiyyətləri yoxdur.

Ancaq bunu bir kənara qoysaq, hər hansı iki kifayət qədər fərqli genomu istinad şablon metodu və ya qrafiklərlə sıxışdırmaq olmaz. Fərqlərin sayı o qədər böyük olur ki, genomlar arasındakı fərqləri qeyd etmək gülüncdür, çünki bu məlumat iki tam genomu qeyd etməkdən və onları müstəqil şəkildə sıxışdırmaqdan daha böyük ola bilər. Drosophila və Saccharomyces genomunu və ya insan və şimpanze kimi çox yaxından əlaqəli genom ardıcıllığını birlikdə sıxışdırmağa çalışsanız, bu aydın olur: "... təxminən otuz beş milyon tək nukleotid dəyişikliyi, beş milyon daxiletmə/delesiya hadisələr və müxtəlif xromosomal quruluşlar."

Bu fərq dərəcəsində, iki genom ardıcıllığını ayrı-ayrılıqda təmsil etmək və onları müstəqil şəkildə sıxışdırmaq daha asan və demək olar ki, daha çox yer şüurludur. Bu məkanda alətlərin nəzərdən keçirilməsi üçün buraya baxa bilərsiniz.


OMSV nanokanal əsaslı tək molekullu optik xəritələrdən böyük struktur dəyişikliklərinin dəqiq və hərtərəfli müəyyənləşdirilməsinə imkan verir.

Biz optik xəritələrdən struktur variasiyaları (SV) dəqiq və hərtərəfli müəyyən etmək üçün yeni OMSV metodunu təqdim edirik. OMSV həm homozigot, həm də heterozigot SV-ləri, müxtəlif növ və ölçülü SV-ləri və məhdudlaşdırma saytlarını yaradan və ya məhv etmədən SV-ləri aşkar edir. Biz göstəririk ki, OMSV yüksək həssaslıq və spesifikliyə malikdir və son metoddan aydın performans qazanır. OMSV-ni insan hüceyrə xəttinə tətbiq edərək, biz yüzlərlə SV >2 kbp müəyyən etdik, onların 68%-i ardıcıllığa əsaslanan zəng edənlər tərəfindən buraxılıb. Müstəqil eksperimental yoxlama bu SV-lərin yüksək dəqiqliyini təsdiqlədi. OMSV proqramı http://yiplab.cse.cuhk.edu.hk/omsv/ ünvanında mövcuddur.


GİRİŞ

Genom mühəndisliyi təkcə güclü tədqiqat vasitəsi deyil, o, həm də insan xəstəliklərinin, o cümlədən qan və immun sistemi xəstəliklərinin müalicəsi üçün inkişaf etdirilir, onların əksəriyyəti hələ də qarşılanmamış tibbi ehtiyacı olan kimi təsnif edilə bilər. Ex vivo–Hematopoetik kök və progenitor hüceyrələrdə (HSPC) HR tərəfindən mühəndisləşdirilmiş nukleaz vasitəçiliyi ilə gen redaktəsi dəqiq genetik manipulyasiyalar vasitəsilə kök hüceyrə gen funksiyasına işıq tuta bilər və hazırda sağalmaz hematoloji xəstəliklər üçün potensial olaraq müalicə strategiyasını müəyyən edə bilər. RNT ilə idarə olunan Tip II CRISPR/Cas9 genomu redaktə edən sistem Watson'sCrick baza cütləşməsi vasitəsilə DNT-ni hədəfləmək üçün kimerik tək bələdçi RNT (sgRNA) tərəfindən idarə olunan Cas9 adlı tək zülaldan istifadə edir. Sadəliyi və möhkəmliyi sayəsində məməlilərin genomlarının redaktə edilməsi üçün ən çox istifadə edilən mühəndis nüvəsinə çevrilir 5,6. Biz əvvəllər hüceyrə xətlərində plazmid əsaslı CRISPR/Cas9 sisteminin yüksək redaktə performansının insan əsas T hüceyrələri və HSPCs 7 kimi ilkin hüceyrə tiplərində yüksək redaktə fəaliyyətinə çevrilmədiyini göstərmişdik. Hər iki sgRNA termininin kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmiş nukleotidlərlə qorunması sgRNA sabitliyini artırır və 'bütün RNT' əsaslı CRISPR/Cas9 sistemini ilkin HSPC-lərdə və T hüceyrələrində yüksək effektli edir 7 . Bundan əlavə, kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmiş sgRNA-larla əvvəlcədən kompleksləşdirilmiş Cas9-un ribonukleoprotein (RNP) çatdırılması T hüceyrələri 7,8 və CD34 + HSPC-lərdə aktivliyi ardıcıl olaraq artırdı (R.O.B., D.P.D. və M.H.P., məlumatlar göstərilmir). Bir çox nəşrlər, həmçinin Cas9 RNP çatdırılması kontekstində dəyişdirilmiş sgRNA-lar olmadan T hüceyrələri 9 və HSPCs 10,11-də effektiv genom redaktəsini göstərdi. Bununla belə, bu tədqiqatlarda, modifikasiyalı sintetik sgRNA-larla birbaşa müqayisə aparılmadı və sgRNA-nın ümumiyyətlə ən aktiv formasının, hətta RNP-nin çatdırılması kontekstində belə, sintetik olaraq hazırlanmış son modifikasiyaları qoruyan bir forma olması mümkündür. endogen eksonükleaz deqradasiyasına və fitri immun stimullaşdırılmasına qarşı.

Mühəndisləşdirilmiş nükleazlarla lokus-spesifik cüt zəncirli qırılma (DSB) yaradılması genom redaktəsinin əsasını təşkil edir 12,13 . DSB-lər iki yüksək dərəcədə qorunan rəqabətli təmir mexanizmlərindən biri, qeyri-homoloji son birləşmə (NHEJ) və HR 14 ilə həll edilə bilər. NHEJ təmiri, DNT uclarının son emal edilmədən bağlanması yolu ilə qırılmaları bərpa etmək üçün hüceyrə dövrü ərzində fəaliyyət göstərən, bəzən qırılma yerində kiçik əlavələr və ya silinmələrlə (INDEL) nəticələnən standart yoldur. Əksinə, HR normal olaraq hüceyrə dövrünün S və ya G2 fazası zamanı ən aktivdir, zədələnməmiş bacı xromatidi HR təmir şablonu kimi xidmət etmək üçün mövcud olduqda. Donorun DSB-ni əhatə edən bölgə ilə eyni olan homoloji qollarına malik olduğu müddətcə, ekzogen DNT donor şablonunu təmin etməklə dəqiq DNT dəyişiklikləri yaratmaq üçün HR istifadə edilə bilər. Bu yolla, xəstəliyə səbəb olan tək nükleotid polimorfizmləri (SNPs) geri qaytarıla bilər və ya bütün açıq oxu çərçivələri xüsusi genomik saytlara 15 daxil edilə bilər (Şəkil 1). CD34 + HSPC-lərdə CRISPR və rAAV6 donorlarından istifadə edən heç bir tədqiqat homoloji qol ölçüsünün və nukleaza kəsilmiş yerə nisbətən mövqeyinin təsirini hərtərəfli araşdırmasa da, transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor nukleazlardan (TALENs) və plazmid donorlarından istifadə edilən tədqiqatlar maksimal HR- vasitəli redaktə hər iki homoloji qol ən azı 400 bp olduqda baş verir 16 .

Müxtəlif donor növləri üçün dizayn strategiyalarının sxematik icmalı. (a) Məsələn, flüoresan zülalın (FP) ifadəsini idarə edən reportyor gen ifadəsi kaseti homoloji rekombinasiya yolu ilə xüsusi olaraq sahəyə inteqrasiya oluna bilər. 400-bp homoloji qollar (boz rəngdə) CRISPR/Cas9 kəsmə yerində sgRNA hədəf sahəsinin 17 və 18 nukleotidləri arasında bölünür (hədəf yer ağ rəngdə və PAM qırmızı ilə təsvir edilmişdir) və transgen ifadə kasetinin (mavi rəngdə) yan tərəfindədir. HR-dən sonra kaset kəsilmiş sahəyə qüsursuz şəkildə inteqrasiya olunur. (b) SNP-lər (X → Y mutasiyası təsvir edilmişdir, müvafiq olaraq mavi və yaşıl rənglərlə) SNP-nin istənilən sahəsi ilə CRISPR/Cas9 kəsmə sahəsi arasında bölgəni əhatə edən 1,2 kb homoloji qolları olan vektor dizaynından istifadə etməklə təqdim edilə bilər. Donorda tam ardıcıllıq homologiyasına görə HR prosesinin erkən dayandırılmasının qarşısını almaq üçün mutasiya ilə kəsilmiş yer arasındakı bölgə mutasiya edilməlidir (nümunədə ulduzlarla işarələnmiş sinonim mutasiyalardan istifadə olunur, qeyd olunur ki, kodlanmış amin turşuları nukleotidlərin yuxarıda qeyd olunub). Bu, həmçinin HR-dən sonra Cas9 recutting və INDEL formalaşmasının qarşısını almaq üçün PAM və sgRNA hədəf sahəsinə lazımi mutasiyalar təqdim edir. (c) cDNT ardıcıllığı (yaşıl rəngdə, sinonim mutasiyalardan istifadə etməklə ayrılmış, məsələn, aşağıda göstərildiyi kimi b) endogen şəkildə tənzimlənən ifadə elementlərindən istənilən cDNT-ni ifadə etmək üçün genin başlanğıc kodonuna (ATG, bənövşəyi) birbaşa daxil edilə bilər. Ayrı bir ifadə kaseti (mavi) cDNA-dan sonra daxil edilə bilər, məsələn, hədəflənmiş hüceyrələri izləməyə və/və ya zənginləşdirməyə imkan verən flüoresan zülalı (FP) kodlayır. cDNA və reportyor kasetinin yan tərəfində başlanğıc kodonu və CRISPR/Cas9 kəsmə sahəsini əhatə edən iki 400-bp homoloji qol (boz) var. Sorunsuz HR cDNA-nın başlanğıc kodonu ilə çərçivəyə inteqrasiyasını təmin edir. Analoji şəkildə, transgenin ifadəsini endogen genin ifadəsi ilə əlaqələndirmək üçün 2A-cDNA kaseti stop kodonundan dərhal əvvəl inteqrasiya oluna bilər. FP, floresan protein LHA, sol homologiya qolu pA, poliadenilasiya siqnalı RHA, sağ homologiya qolu SNP, tək nukleotid polimorfizmi.

Rekombinant adeno ilə əlaqəli virusların (rAAVs) təbii olaraq DSB-lərin stimullaşdırılması olmadan məməli hüceyrələrində yüksək HR tezliyinə vasitəçilik etdiyi göstərilmişdir 17�. Vəhşi tipli AAV-lar zərfsiz tək zəncirli DNT viruslarıdır

4,7 kb genomu kodlayan replikasiya (rep) və kapsid (cap) genləri 145-bp ters çevrilmiş terminal təkrarları (ITRs) 19 . Diferensial tropizmə malik təbii şəkildə meydana gələn və işlənmiş serotiplər mövcuddur və serotip 6-nın HSPC və ilkin T hüceyrələrinin ötürülməsi üçün ən səmərəli serotip olduğu göstərilmişdir. AAV-lər çoxalmaq üçün adenoviruslardan (köməkçi viruslardan) asılıdır cis-də lakin, rAAV vektorlarının istifadəçi tərəfindən müəyyən edilmiş DNT yükü ilə qablaşdırılması aşağıdakı üç növ plazmidin HEK293T kimi ana hüceyrə xəttinə kotransfeksiyası ilə mümkündür: (i) iki İTR arasında maraq doğuran homologiya qolları və transgen ilə plazmidlərin ötürülməsi, (ii) rep/cap-kodlaşdıran plazmidlər (bu protokol rep2/cap6) və (iii) adenoviral köməkçi zülalları kodlayan köməkçi plazmidlər (bu Ad5 protokolunda). rAAV-lar nüvədə yüksək vektor nüsxə nömrəsi yarada bildiyindən və anadangəlmə toxunulmazlıqdan qaça bildiyinə görə, ilkin insan hüceyrələrində mühəndisləşdirilmiş nukleaz vasitəçili DSB-lərin istifadəsindən sonra HR üçün ideal şablonlardır. Müvafiq olaraq, bir neçə son hesabatlar rAAV6-dan ilkin insan HSPC-lərində HR üçün donor şablonu kimi səmərəli istifadə etmişdir 21�.

İnsan hematopoezi özünü yeniləmə qabiliyyətinə malik HSC-lərdən bütün qan və immun hüceyrələrini yaradan prosesdir 25,26 . İmmunofenotipləşdirmə 27,28 yolu ilə vicdanla təkrarlanan və özünü yeniləyən HSC-lərin müəyyən edilməsində irəliləyiş əldə olunsa da, CD34 + hüceyrə səthi markerindən HSPC-lərin heterojen populyasiyasını müəyyən etmək üçün asanlıqla istifadə edilmişdir. Bu əhali ümumiyyətlə ehtiva edir

0.1𠄱% uzunmüddətli təkrar populyasiya qabiliyyətinə malik HSC-lər (LT-HSC). Bu qabiliyyət normal olaraq immunçatışmazlığı olan siçanlarda, məsələn, qeyri-obez diabetik (NOD)-ağır birləşmiş immunçatışmazlığı (SCID)-qamma (NSG) siçanlarında, siçan sümük iliyində insan hüceyrəsinin enraftmentinə imkan vermək üçün fitri və adaptiv toxunulmazlığı olmayan siçanlarda eksperimental olaraq sınaqdan keçirilir 29 . Bu yaxınlarda bir neçə hesabat LT-HSCs 10,15,30,31 ilə müqayisədə HR-nin progenitor hüceyrələrdə daha effektiv olduğunu göstərdi. Cari araşdırmalar LT-HSC-lərdə HR dərəcələrini artırmağa cəhd etsə də, bu, qan və immun sistemi pozğunluqları üçün HR əsaslı genomun redaktəsi üçün klinik strategiyaların sürətləndirilməsində ən böyük maneədir. Buna görə də biz müxbir əsaslı zənginləşdirmə paradiqmasını hazırladıq ki, bu da uğurlu HR-dən sonra istənilən loksa (aşağı AAV6 epizomal ifadəsi ilə müqayisədə) log-qat-daha yüksək transgen ifadəsindən faydalanır və bu metodologiyada dəyişdirilmiş hüceyrələrin heyrətamiz dərəcədə yüksək tezlikləri əldə edə bilər. köçürülmüş siçanlar (97%-ə qədər) 15 . Beləliklə, zənginləşdirmə metodologiyası səmərəsiz HSC hədəflənməsinin potensial problemini həll edə bilər.

Bu protokolda biz CRISPR/Cas9 və rAAV6 homoloji donor çatdırılmasından istifadə edərək HSPC-lərdə HR-yə nail olmaq üçün təkrarlana bilən metodologiya təqdim edirik. Biz ətraflı təsvir edirik (i) sgRNA seçimi və AAV6 homolog donor dizaynı və tikintisi, (ii) elektroporasiya və transduksiya protokolları, (iii) > 90% hədəf inteqrasiyası ilə HPSC populyasiyası üçün zənginləşdirmək üçün axın sitometriyası�sed strategiya, və (iv) in vitroin vivo HSPC-lərdə HR tezliklərinin müəyyən edilməsi üçün analizlər. Biz həmçinin ilkin insan T hüceyrələrində protokolun istifadəsini təsvir edirik (Qutu 1). Bu, hematopoetik gen funksiyasını və xəstəliklərin modelləşdirilməsini, həmçinin HSC əsaslı hüceyrə və gen terapiyalarının preklinik inkişafını araşdırmaq üçün HR üçün insan HSPC-lərini hədəfləmək üçün hərtərəfli protokoldur.

Qutu 1

İbtidai insan T hüceyrələrində homoloji rekombinasiya ● TIMING 6𠄸 saat praktiki, 5𠄷 gün mədəniyyət

Biz aşkar etdik ki, aşağıda təsvir edilən eyni reagentlərdən istifadə edən eyni protokol T hüceyrələrində 60%-ə qədər HR tezliyinə nail ola bilər. CRISPR/Cas9 və AAV6-dan istifadə edərək, HR-yə məruz qalmış hüceyrələrin erkən zənginləşdirilməsinə imkan verən transgen ifadəsinin HR-yə sürüşməsi (Şəkil 2), elektroporasiya və transduksiyadan sonra 2-ci gündə kimi T hüceyrələrində də görünür.

CRISPR/Cas9, AAV6 və FACS metodologiyalarından istifadə edərək gen hədəflənmiş CD34 + HSPC-lərin zənginləşdirilməsi. (Solda) Cas9 RNP-nin elektroporasiyası və AAV6-nın ötürülməsi (yuxarıda) və yalnız AAV6-nın ötürülməsi (aşağıda) 4-cü gündən sonrakı CD34 + HSPC FACS Nümayəndələrinin qrafikləri yüksək reportyorun (GFP yüksək, qırmızı rəngdə göstərilmişdir) yaradılmasını vurğulayır. gate) Cas9 RNP əlavə edildikdən sonra əhali (həmçinin bax Əlavə Şəkil 1 CD34 ifadəsi üçün boyanma daxil olan FACS sahələri üçün). Elektroporasiyadan sonrakı 4-cü gündə GFP yüksək (qırmızı), aşağı GFP (yaşıl) və GFP neq (mavi) fraksiyalarından hədəflənmiş HSPC-lər hər 3 gündən bir axın sitometriyası ilə GFP ifadəsini izləyərkən 15 gün ərzində çeşidləndi və becərildi. Qeyd edək ki, reportyorun yüksək populyasiyası > 96% reportyor + mədəniyyətdə 15 gündən sonra, yüksək göstəricidir ki, bu populyasiya müxbir kasetinin sabit inteqrasiyası üçün zənginləşdirilmişdir. neg, mənfi SSC, yan səpələnmə. Şəkil referin icazəsi ilə uyğunlaşdırılıb. 15, Springer Təbiəti.

Yuxarıdakı rəqəm Cas9 RNP ilə və ya RNP (Mock) olmadan T hüceyrələrinin 4-cü gündən sonrakı elektroporasiyasından və sonra hədəflənmiş lokus üçün homologiya qolları ilə əhatə olunmuş bir mCherry ifadə kasetini daşıyan AAV6 vektorları ilə transduksiya edilmiş FACS sahələrini göstərir (Şəkil 1a).

Reagentlər

Ficoll-Paque PLUS (1,078 q/ml GE Healthcare, kat. № 17-1440-03)

Pan T Hüceyrə İzolyasiya Dəsti (Miltenyi Biotec, kat. № 130-096-535)

Anti-insan CD3 antikoru (BioLegend, cat. no. 317347)

Gentamisin, L-Qlutamin və Fenol Qırmızı ilə X-VIVO 15 (Lonza, kat. № 04-418Q)

İnsan serumu (Sigma-Aldrich, cat. no. H3667)

Anti-insan CD28 antikoru (Tonbo Biosciences, kat. № 70-0289-U100)

IL-2, insan (Preprotech, kat. № 200-02)

IL-7, insan (BD, kat. № 554608)

Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Fisher Scientific, cat. № 11132D)

Reagentlər

Standart Ficoll əsaslı ayırmadan istifadə edərək PBMC-ləri buffy örtüklərdən təmizləyin.

! DİQQƏT İnsan subyektlərindən toplanan toxumanın istifadəsi yerli institusional yoxlama şuraları tərəfindən təsdiq tələb edir.

Pan T Cell İzolyasiya Kitindən istifadə edərək PBMC-lərdən CD3 + T hüceyrələrini (Pan T hüceyrə izolyasiyası) təcrid edin.

T-hüceyrə təcridindən dərhal sonra antiinsan CD3 antikoru ilə örtülmüş 24 quyuluq boşqabda hər quyuya 1 milyon hüceyrədə 3 gün ərzində kulturasiya edərək hüceyrələri stimullaşdırın (37°C-də 300°C-də 2 saat əvvəlcədən örtülmüş lövhə). hər quyuya 10 μg təmizlənmiş anti-insan CD3 antikoru ilə) 5% (həcm/həc) insan serumu olan X-VIVO 15 serumsuz mühitdə, 1 μg/ml anti-insan CD28 antikoru, 100 IU/ ml insan IL-2 və 10 ng/ml insan IL-7. CD3 və CD28 antikorlarına alternativ olaraq insan CD3/CD28 Dynabeads 1:1 muncuq-hüceyrə nisbətində istifadə edilə bilər.

Stimullaşdırmadan üç gün sonra, yuxarıda təsvir olunduğu kimi T-hüceyrə mühitindən istifadə etməklə, lakin anti-insan CD28 antikoru olmadan PROSEDURUN 3-cü Addımlarında təsvir edildiyi kimi, hüceyrələri elektroporasiya edin və AAV6 donor vektorları ilə ötürün. CD34 + HSPC-lərə gəldikdə, maksimum HR tezlikləri və yüksək canlılıq verən ən aşağı MOI-ni müəyyən etmək üçün HR eksperimentlərində AAV vektorunun funksional titrlənməsinin həyata keçirilməsini şiddətlə tövsiyə edirik.

Digər texnologiyalarla müqayisə

Cas9 kimi, sink-barmaq nükleazları (ZFN), TALENlər və hibrid meqanükleaz-TALENlər (megaTALs) kimi digər mühəndis nükleazları məməlilərin genomlarında DSB-ləri stimullaşdıra bilər. Bununla belə, Cas9-un HSPC-lərdə DSB-ləri stimullaşdırmaqda bu digər dizayner nükleazları ilə müqayisədə iki fərqli üstünlüyü var. Birincisi, ZFN-lər, TALEN-lər və meqaTAL-lar qurmaq üçün daha çətin olur və geniş molekulyar biologiya bacarıq dəstini tələb edir. Bunun əksinə olaraq, CRISPR/Cas9 sistemi Streptococcus pyogenes Lokus-xüsusi DSB-ni asanlaşdırmaq üçün sadə 20-nt bələdçi ardıcıllığından istifadə edir. Bundan əlavə, kimerik sgRNA, ilkin insan HSPC-lərində onu yüksək effektiv edən uclarda dəyişikliklərlə kimyəvi olaraq sintez edilə bilər.İkincisi, rekombinant Cas9 zülalı asanlıqla istehsal oluna və sgRNA-larla əvvəlcədən kompleksləşdirilə və RNP kompleksləri kimi elektroporasiya yolu ilə çatdırıla bilər ki, bu da nukleaza məruz qalma müddətini qısaldır və potensial arzuolunmaz hədəfdən kənar DSB-ləri azaldan bir vuruş və qaçış mexanizmini təmin edir.

rAAV6 homoloji donor şablonu kimi xidmət edə bilsə də, HSPC-lərdə effektiv HR-yə vasitəçilik etdiyi nümayiş etdirilən digər donor şablon platformaları da vardır ki, bunlara bir-telli oliqonukleotidlər (ssODNs) 10,31 və inteqrasiya qüsurlu lentiviral (IDLVs) vektorları 30 daxildir. Cari ədəbiyyat rAAV6-nın IDLV 21-dən daha səmərəli donor olduğunu düşünsə də, hərtərəfli müqayisə hələ aparılmamışdır. Adətən olan ssODN-lərlə müqayisədə

Ümumi ölçüdə 50� bp və buna görə də yalnız kiçik genomik dəyişikliklərə vasitəçilik edə bilər, rAAV6 donor şablonları dəqiq SNP-lərə vasitəçilik edə bilər, həmçinin transgen kasetləri daxil edə bilər.

Tək donor vektoru istifadə edilərsə, ölçüsü 4 kb və ya iki donor vektoru ilə ardıcıl HR strategiyası istifadə edilərsə, daha böyük transgen kasetləri daxil edə bilər 32 . Əgər tək nöqtəli mutasiyalar arzu olunan genomik dəyişiklikdirsə, ssODN-lər HSPC-lərdə istifadə üçün faydalı donor şablonu ola bilər, çünki onlar asanlıqla istehsal olunur və yaxşı işləyirlər. in vitro 10. Bununla belə, ssODN-lər reportyor geni üçün ifadə kasetini əhatə etmək üçün çox kiçikdir və buna görə də bu protokolda təsvir etdiyimiz axın sitometriyası ilə dəqiq məqsədyönlü inteqrasiya ilə HSC-lər üçün zənginləşdirmə protokolu ilə uyğun gəlmir. ev sahibi sümük iliyində aşılama üçün hədəflənmiş HSC-ləri üstələyən daha çox sayda hədəflənməmiş HSC.

HSC-lərdə dəqiq genom redaktəsi adi lentiviral vektor (LV) əsaslı gen transferi üsulları ilə müqayisədə bir sıra üstünlüklərə malikdir. Birincisi, genomun redaktəsi endogen tənzimləyici elementləri saxlayır, gen ifadəsinin fizioloji məkan-zaman tənzimlənməsini qoruyur 1,3. İkincisi, LV-lər yarı təsadüfi olaraq genomda birləşdikcə, onkogenlər və/yaxud şiş supressor genlərinin yaxınlığında və ya içərisində insertional mutagenez ehtimalı həmişə qalır, eksperimental nəticələri çaşdırır və bəlkə də, xoşbəxtlikdən hələ təsvir edilməsə də, terapevtik şəraitdə leykemiyaya səbəb olur. Üçüncüsü, yarı təsadüfi lentiviral inteqrasiya hüceyrələr arasında ifadə heterojenliyinə gətirib çıxarır ki, bu da HSPCs kimi heterojen bir populyasiyada gen-hüceyrə funksiyasını başa düşməkdə əsas çaşqınlıq ola bilər. Gen terapiyası üçün bu, potensial olaraq daha yüksək hüceyrə dozaları və ya daha yüksək vektor surətlərinin sayı tələb edən diferensial potensiala malik hüceyrələrin populyasiyasını yaradır. Dördüncüsü, LV əsaslı gen əlavəsi müxbir ifadə kasetinin maraq geninə inteqrasiyası ilə hədəflənmiş gen nokautuna imkan vermir ki, bu da nokaut hüceyrələrini izləməyə və zənginləşdirməyə imkan verir. Bu səbəblər HSC gen funksiyasını aydınlaşdırmaq, həmçinin HSC əsaslı müalicələr üçün xəstəliyə səbəb olan genetik mutasiyaları düzəltmək üçün genom redaktəsini üstünlük verilən genetik manipulyasiya strategiyasına çevirir.

Protokolun məhdudiyyətləri

CRISPR/Cas9 sisteminin əsas məhdudiyyətlərindən biri maraq doğuran gen daxilində protospacer bitişik motiv (PAM) ardıcıllığına ehtiyacdır, lakin SpCas9 üçün orta hesabla hər 8-də tapıla bilər. insan genomunda x0201312 bp və buna görə də adətən tətbiqinə mane olmur 33 . Cas9 variantları bu problemi aradan qaldıra biləcək digər PAM xüsusiyyətləri ilə hazırlanmışdır, baxmayaraq ki, bu dizayn variantlarının ilkin insan hüceyrələrində yüksək səviyyəli redaktəyə vasitəçilik etdiyi hələ göstərilməyib 34,35 . Bundan əlavə, uyğun donor dizaynı (Əlavə üsullar), bu protokolda təsvir olunduğu kimi, adətən CRISPR/Cas9 nukleaza sahəsi istənilən dəyişiklikdən uzaqda olduqda problemi həll edə bilər. Zənginləşdirmə metodologiyamızın məhdudiyyəti, axın çeşidlənməsi yolu ilə istehsal prosesinin əvvəlində hədəflənmiş HSPC-lərin təmizlənməsi üçün zənginləşdirmə üçün məruzəçi transgenini idarə edən ekzogen promouterə ehtiyacdır (məsələn, GFP və ya kəsilmiş sinir böyümə faktoru reseptoru (tNGFR)). Qeyd edirik ki, HR-dən sonra gücləndirilmiş transgen ifadəsi seçilmiş promouterdən müstəqil görünür, bu, HSPC-lərdə və ya induksiya edilə bilən promotorlarda müxtəlif güclü promotorların istifadəsinə imkan verəcəkdir. Bundan əlavə, hədəflənmiş HSPC-ləri təmizləmək üçün zənginləşdirmə kasetlərindən ifadəni çıxarmaq üçün aktiv endogen promotorlardan istifadə oluna bilər. Buna baxmayaraq, zənginləşdirmə sxemi, ev sahibi sümük iliyində repopulyasiya üçün hədəflənmiş HSC-ləri geridə qoya bilən, hədəflənməmiş HSC-lərin çıxarılmasında əsasdır.

Eksperimental dizayn

SgRNA dizaynı

sgRNA-ların layihələndirilməsi və sınaqdan keçirilməsi üçün əla protokollar daha əvvəl təsvir edilmişdir 33 . Burada, HSPC-lərdə optimal HR tezliklərinə nail olmaq üçün əsas olan yüksək aktiv lokus spesifik sgRNA-nın müəyyən edilməsi və xarakterizə edilməsi üçün əsas addımları təsvir edirik (Əlavə üsullar). Qısaca olaraq, biz ölümsüzləşdirilmiş K562 hüceyrə xəttində dörd-səkkiz sgRNA-nı (hədəflənmiş bölgədəki mövcud PAM saytlarından asılı olaraq) müntəzəm olaraq yoxlayırıq. Güclü namizəd sgRNA müəyyən edildikdən sonra kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmiş sintetik sgRNA (Reagentlər bölməsi) TriLink Biotechnologies (1-cmole minimal sintez) və ya Synthego (3-nmol minimal sintez, tam uzunluqda dəyişdirilmiş sintetik üçün yeni kommersiya mənbələri kimi) sifariş edilir. sgRNA-lar əlçatan olur, bunlar da istifadə oluna bilər) və insan CD34 + HSPC-lərində funksional olaraq təsdiqlənir. Alternativ olaraq, biz müntəzəm olaraq K562 hüceyrələrində funksional ekrandan yan keçirik və CD34 + HSPC-lərdə kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmiş sintetik sgRNA-ların panelini birbaşa ekranlaşdırırıq. HSPC-lərdə bir sgRNA-nın yüksək aktivliyi (parçalanma (TIDE) analizi ilə INDEL-lərin izlənilməsindən istifadə etməklə daxiletmə və silinmə tezliyi ilə ölçülür) təsdiq edildikdən sonra, arzu olunan genomik dəyişikliyi təqdim etmək üçün homoloji donor şablonu dizayn edilir və AAV-a klonlanır. vektor plazmidi. Ümumiyyətlə, CRISPR kəsmə sahəsi (sgRNA-nın 20-nt tamamlayıcı ardıcıllığının 17 və 18-ci əsas cütləri arasında) ideal olaraq nəzərdə tutulan genomik dəyişikliyə mümkün qədər yaxın yerləşdirilməlidir 36, baxmayaraq ki, donor vektorunun düzgün dizaynı ilə biz kəsilmiş sahədən 40 bp məsafədə əhəmiyyətli aktivlik müşahidə etmişlər 15 . Təcrübəmizə görə, homoloji qollar qırılma yerindən nə qədər uzaq olsa, HR effektivliyi bir o qədər aşağı olur. Transgen ifadə kasetlərini təhlükəsiz liman lokusuna əlavə edərkən, sgRNA-nın yeri daha az məhdudlaşdırılır, lakin düzgün endogen tənzimləyici kontekst tərəfindən idarə olunacaq tam cDNA kasetləri əlavə edilərsə, məsələn, birbaşa genin başlanğıc kodonuna, sgRNA hədəfi sayt mümkün qədər nəzərdə tutulan inteqrasiya sahəsinə yaxın yerləşdirilməlidir.

Donor dizaynı

Standart HR donor dizaynı transgen ifadə kasetini və ya təqdim ediləcək mutasiyaları əhatə edən iki homoloji qoldur (uzunluğu simmetrikdir) (Şəkil 1a). Əlavə üsullar). Homolog DNT donor dizaynı burada istinad edilən əla protokollarda yaxşı təsvir edilmişdir 37,38 . Burada biz HSPC-lərdə CRISPR/Cas9 ilə stimullaşdırılmış HR üçün AAV6 homoloji DNT donoru dizayn edərkən nəzərə alınmalı olan əsas anlayışları qısaca təsvir edəcəyik. Bundan əlavə, HR donorlarının AAV plazmid onurğasına klonlaşdırılmasını və AAV vektor hissəciklərinin istehsalı və təmizlənməsini təsvir edən təfərrüatlar təqdim olunur. Əlavə üsullar. 4,7 kb-lik AAV qablaşdırma tutumu donorun ölçüsünü məhdudlaşdırır. ITR və homoloji qollar vektorun əvəzedilməz elementləridir və ITR-lər birləşir.

270 bp. Biz hər biri < 400 bp olmayan homoloji qolları tövsiyə edirik və biz uzunluğu 16 artırmağın heç bir əhəmiyyətli üstünlüyü, nə də tək telli AAV6 şablonları (ROB, DPD) ilə müqayisədə özünü tamamlayan AAV6 (ikiqat telli) istifadəsinin heç bir üstünlüyü müşahidə etməmişik. , və MHP, məlumatlar göstərilmir). Bu tərk edir

Daxiletmə üçün 3,6 kb, buna görə də böyük transgenlərin və ya multisistronik kasetlərin HR-si üçün bunu dizayn edərkən diqqətli olmaq lazımdır. SNP-lərin tətbiqi kimi kiçik genom modifikasiyaları üçün ümumi vektor ölçüsünü > 2.4 kb saxlamaq üçün 1200-bp homoloji qolları tövsiyə edirik ki, bu da AAV qablaşdırma tutumunun yarısından çoxdur və konkatemer qablaşdırmanın qarşısını alır 39 (Şəkil 1b) . HR prosesi DNT-ni tam olaraq cüt zəncirli qırılmada inteqrasiya etməkdirsə, qollar CRISPR kəsilmiş yerində bölünməlidir (şək. 1a). İstənilən modifikasiya CRISPR kəsmə yerindən ayrıdırsa, homoloji qollar kəsmə yeri ilə modifikasiya yeri arasındakı bölgəni civarında tutmalıdır (Şəkil 1b,c). Bu vəziyyətdə iki mühüm mülahizə yerinə yetirilməlidir: (i) Tətbiq edilən modifikasiya ilə hədəf sahə pozulmazsa, HR baş verdikdən sonra Cas9 INDEL təqdim edə bilər. Bunun qarşısını almaq üçün donorların PAM və ya sgRNA hədəf yerində mutasiyalar (lazım olduqda sinonim) tətbiq edilməlidir 40 (Şəkil 1b). (ii) Kəsilmiş sahə ilə daxil edilmiş dəyişikliklər arasındakı bölgədə donor və hədəf DNT arasında ardıcıllıq homologiyası varsa, HR prosesinin dayandırılması yeni yaranan DNT zəncirinin donordan ayrılaraq xromosomal DNT-yə qayıtması səbəbindən baş verə bilər. bu bölgədə. Bunun qarşısını almaq üçün kəsilmiş yer və istədiyiniz dəyişiklik sahəsi arasında bölgədə homologiyanı minimuma endirmək üçün mutasiyalar (lazım olduqda sinonim) tətbiq edilməlidir (şəkil 1b). Bir sıra tədqiqatlar göstərir ki, kodon yırğalanma mövqelərindəki mutasiyalar HR-nin vaxtından əvvəl dayandırılmasının qarşısını almaq üçün kifayətdir 15,41. Əgər cDNA kasetinin başlanğıc kodonundan sonra dəqiq mövqeyə inteqrasiyası nəzərdə tutulursa, sgRNA hədəf sahəsi başlanğıc kodonu ilə kəsilmiş yer arasındakı boşluğu minimuma endirmək üçün başlanğıc kodonuna mümkün qədər yaxın yerləşdirilməlidir. , HR dərəcələrinə mənfi təsir göstərə bilər (Şəkil 1c).

RAAV vektor istehsalı

Mükəmməl və hərtərəfli protokollar rekombinant AAV-ların (rAAVs) 38,42 istehsalı, təmizlənməsi və titrlənməsini artıq təsvir etmişdir və bunlar rAAV6 (rAAV6) yaratmaq üçün kifayət qədər resursları təmin edir.Əlavə üsullar). rAAV6 vektorunun istehsalı və təmizlənməsi üçün kritik addımları ətraflı təsvir etdik Əlavə üsullar. Qısaca olaraq, rAAV vektorları adətən HEK293T hüceyrələrində (i) ITR tərkibli transfer plazmidinin, (ii) köməkçi funksiyalar üçün tələb olunan adenoviral zülalları və RNT-ləri ifadə edən plazmidin transfeksiyasını nəzərdə tutan üçqat transfeksiya üsulu ilə istehsal olunur. iii) serotipi təyin edən AAV rep və qapaq zülallarını ifadə edən plazmid. Biz AAV2-dən (Reagentlər) İTR-ləri daşıyan transfer plazmidindən istifadə edirik və donor plazmidini, genomik DNT-dən gücləndirilmiş homoloji qolları və arzu olunan ifadə plazmidindən gücləndirilmiş əlavəni ehtiva edən terminal ITR-ləri və PCR fraqmentləri ilə xətti transfer plazmid magistralının standart Gibson montajı ilə yığırıq. . SNP donorları SNP-ləri təqdim etmək üçün standart sahəyə yönəldilmiş mutagenez üsullarından istifadə etməklə oxşar şəkildə hazırlana bilər. AAV istehsalı üçün biz əvvəllər təsvir edilmiş 38 ikili plazmid transfeksiya sistemindən istifadə edirik, burada tələb olunan adenoviral və AAV genləri daha əvvəl 43 təsvir edilmiş və Universitetdəki Russell laboratoriyasından əldə edilə bilən bir köməkçi plazmid, pDGM6 üzərində birləşdirilir. Vaşinqtondan (Reagentlər). Biz müntəzəm olaraq HSPC-lərdə HR təcrübələri üçün yodixanol gradientlərindən təmizlənmiş rAAV vektorlarından istifadə edirik, lakin qeyd edək ki, digər təmizləmə üsulları boş kapsidlərin aşağı nisbəti ilə təmiz rAAV preparatları istehsal etdiyi müddətcə işləyir. Yüksək həcmli AAV vektorundan istifadə edərkən, yüksək transduksiya sürətlərinə nail olmaq və kök hüceyrə mədəniyyət mühitinin seyreltilməsi nəticəsində yaranan toksikliyin qarşısını almaq üçün yüksək titrli preparat vacibdir. AAV-nin ümumi həcminin ümumi mədəniyyət həcminin 20%-dən çox olmamasını tövsiyə edirik (ideal olaraq, < 10%). AAV preparatlarının titrlənməsi üçün biz əvvəllər təsvir edildiyi kimi vektor genomlarının sayını ölçmək üçün İTR-lərdə kəmiyyət PCR-dən istifadə etməyi təklif edirik 44 . Alınan titrin funksional titr olmadığını qeyd etmək vacibdir. AAV6 istifadə edərək HSPC-lərdə HR həyata keçirən tədqiqatlarda müxtəlif infeksiya çoxilliklərinin geniş diapazonu (MOI-lər, yəni hüceyrə başına vektor genomları (vg)) istifadə edilmişdir. Məsələn, Wang və b. 1� × 10 3 vg/cell 21-in MOİ-lərindən istifadə edilmişdir, halbuki De Ravin və b. 1𠄳 × 10 6 vg/cell 23-ün istifadə MOİ-ləri. İnanırıq ki, bu böyük fərq titrləmə metodologiyasındakı fərqlər və/yaxud AAV təmizliyindəki fərqlərlə bağlıdır. Biz təklif edirik ki, AAV titrləri Amerika Tipli Mədəniyyət Kolleksiyasından (ATCC, kat. № VR-1616) əldə edilən AAV2 Referans Standart Materialına uyğunlaşdırılsın 45 . Bu, daha dəqiqləşdirilmiş titrlərə imkan verəcək, lakin AAV təmizliyindəki fərqləri aradan qaldırmayacaq. Minimum hüceyrə toksikliyi ilə maksimum HR tezlikləri verən ən aşağı MOI-ni müəyyən etmək üçün HSPC-lərdə HR təcrübələrində funksional AAV titrlənməsinin həyata keçirilməsini tövsiyə edirik.

Homoloji rekombinasiyaya məruz qalmış hüceyrələrin zənginləşdirilməsi (Addım 47�)

Tək zəncirli AAV-nin daxili xüsusiyyəti, ifadənin sonradan transkripsiya baxımından səlahiyyətli dsDNT istehsal edən ikinci zəncir sintezinə əsaslanmasıdır. Biz bu yaxınlarda müşahidə haqqında məlumat vermişik ki, epizomal AAV6 ifadəsi, hətta əsas hüceyrələrdə 15-də konstitutiv güclü viral təşviqatçılardan idarə olunsa da, məruzəçi gen ifadəsinin aşağı səviyyəsinə gətirib çıxarır. Bunun əksinə olaraq, eyni ifadə kasetinin HR vasitəçiliyi ilə xromosom inteqrasiyasından sonra reportyor ifadəsinin log qatından çox artdığını aşkar etdik (Şəkil 2). Əlavə Şəkil 1). Bu fenomenin hüceyrə növündən, hədəf lokusundan, ekzogen promotordan və ya istifadə edilən dizayner nüvə sistemindən asılı olmadığını gördük. Məruzəçi yerdəyişməsi elektroporasiya və transduksiyadan 24 saat sonra görünür (piklər 3 d-də) və transgen ifadə kinetikasından və hüceyrələrin proliferasiya vəziyyətindən asılıdır. Biz transgen ifadəsindəki bu dəyişikliyi məruzəçi yüksək ifadəli hüceyrələri çeşidləmək üçün istifadə etdik və 99%-ə qədər təmizlik ilə təmizlənmiş hədəf populyasiya əldə etdik. Əhəmiyyətli odur ki, biz seriyalı transplantasiyalarda göstərdik ki, bu zənginləşdirilmiş hədəf populyasiyada LT-HSC var.

Koloniya əmələ gətirən vahid analizi və klonal genotipləşdirmə (Addım 22�)

Koloniya əmələ gətirən vahid (CFU) analizi, yarı bərk metilselüloz mühitində koloniyalar əmələ gətirmək üçün əcdad hüceyrələrin potensialını qiymətləndirən bir progenitor analizdir. Bu analiz hədəf populyasiyada törədici hüceyrələrin sayına, həmçinin nəsil törədilən progenitorların (miyeloid: CFU-GM eritroid: BFU-E və CFU-E) və çoxnəsilli sələflərinin (qarışıq miyeloid və eritroid: CFU-) nisbətinə nəzarət edir. GEMM). O, həmçinin transgen ifadə kasetinin məqsədyönlü inteqrasiyası üçün koloniyaların PCR skrininqi ilə klonal genotiplərin təhlilinə imkan verir. Bunun üçün ‘In–Out’ PCR yanaşması istifadə olunur, burada bir primer homoloji qolun bölgəsindən kənarda hədəflənmiş genomik lokusda, digər primer isə transgen kasetinin içərisində yerləşir (şək. 3a). Tercihen inteqrasiyanın həm 5, həm də 3 qovşağını müəyyən edən iki PCR aparılır. Arzu edilərsə, inteqrasiya olmadan allelləri müəyyən etmək üçün üçüncü primer daxil edilə bilər. Bu primer homologiya qolundan kənarda olan primerdən sgRNA hədəf sahəsinin əks tərəfində genomik bölgədə yerləşməlidir (Şəkil 3). Bu primerin sgRNA kəsmə yerindən ən azı 50 bp məsafədə yerləşməsi vacibdir, çünki INDEL-lər primerin bağlanma yerini poza bilər. SNP-lərin inteqrasiyası üçün HR tezlikləri damlacıqlı rəqəmsal PCR və ya ardıcıllaşdırma yanaşmaları (məsələn, yeni nəsil ardıcıllıq və ya TOPO klonlama) ilə qiymətləndirilə bilər və ya genomik modifikasiyalar yeni məhdudiyyət sahəsi yaradırsa, məhdudlaşdırma fraqmentinin uzunluğu polimorfizmi (RFLP) analizi kəmiyyətini müəyyən edə bilər. HR dərəcələri 33-dən əvvəl hərtərəfli təsvir edildiyi kimi. Yuxarıda göstərilən eyni astar dizaynı homoloji qolların bölgəsindən kənarda yerləşən bir astarla istifadə edilməlidir.

‘In–Out’ Metilselülozdan əldə edilən koloniyalarda məqsədli inteqrasiya hadisələrinin genotiplənməsi üçün PCR strategiyası. (a) HSPC-lərdə məqsədli inteqrasiya hadisələrini müəyyən etmək üçün ‘In–Out’ PCR strategiyasını təsvir edən sxematik. (Üst) Sol homoloji qolun (LHA) xaricində birləşən bir primer və sağ homoloji qolun (RHA) içərisində bağlanan digər primerdən istifadə edərək, hədəflənməmiş allel üçün primer dizaynı. Primerlər qırmızı oxlar kimi təsvir edilmişdir. Təqdim olunan nümunədə PCR strategiyası vəhşi tipli (WT)/INDEL allelindən 800-bp məhsul (qırmızı) istehsal edəcək. Nəzərə alın ki, əhəmiyyətli ölçüdə INDEL varsa, bu zolağın molekulyar çəkisi daha kiçik və ya daha böyük ola bilər. (Altda) CRISPR/Cas9 və AAV6 vasitəçiliyi ilə homoloji rekombinasiyadan sonra müxbir kasetli hədəflənmiş allel. Yuxarıdakı kimi eyni xarici LHA (Out) primerindən istifadə etməklə, lakin spesifik daxili primer (In) ilə bu ‘In–Out’ PCR strategiyası 600-bp-lik hədəf inteqrasiyası üçün xüsusi PCR məhsulu yaradacaq. (bənövşəyi). Astarlar bənövşəyi oxlar kimi təsvir edilmişdir. (b) Klonal inteqrasiya hadisələrinin növlərini göstərən agaroz gel təsvirinin sxematik təsviri (hər bir xromosomda bir alleli olan autosomal geni hədəf alarkən): WT və ya INDEL (800 bp, qırmızı), bialel HR (600 bp, bənövşəyi) və monoalelik HR (800 və 600 bp). Qeyd edək ki, təqdim olunan PCR strategiyası eyni PCR-də bütün hadisələri təhlil edən üç primerli PCR-dir. Strategiyanı iki PCR reaksiyasına ayırmaq mümkündür. Bundan əlavə, inteqrasiyanın 3-cü sonunda eyni ‘In–Out’ strategiyasını yerinə yetirmək və ən əsası, hər iki ucunda qüsursuz HR-ni təsdiqləmək üçün Sanger-sequence PCR zolaqlarına tövsiyə olunur.

Transplantasiya edilmiş immun çatışmazlığı olan siçanlarda repopulyasiya analizi (Addım 53�)

Əhəmiyyətli olan odur ki, CFU analizi özünü yeniləmə və çoxillik qabiliyyəti olan HSC-lərin mövcudluğunu təhlil etmir və belə yoxlama üçün immun çatışmazlığı olan siçanlara transplantasiya lazımdır. Bir neçə siçan ştammının insan hematopoetik repopolyasiyası üçün istifadə edilməsinə baxmayaraq, biz insan enraftmenti və hematopoietik repopulasiyanı yüksək dəstəkləyən NSG ştamından istifadə etməyi tövsiyə edirik. Əgər digər suşlardan istifadə edilərsə, möhkəm enraftment üçün daha çox hüceyrə transplantasiyası tələb oluna bilər. Kütləvi, zənginləşdirilməmiş hüceyrələrin (RNP elektroporasiyası + AAV6 ötürülməsi) və ya AAV6 donor ötürülməsi olmadan RNP-elektroporasiyalı CD34 + HSPC-lərin köçürülməsi halında, transplantasiya elektroporasiyadan 2 saat sonra 2 gün ərzində həyata keçirilə bilər. Bir reportyor geni vasitəsilə hədəflənmə üçün zənginləşdirilmiş HSPC-lər, müxbir-müsbət hüceyrələrin tezliyi zirvəyə çatdıqda, zənginləşdirmədən sonra birbaşa köçürülür (17-ci addım). NSG siçanlarında kök hüceyrələrin uzunmüddətli təkrar populyasiya qabiliyyətini təsdiqləmək üçün müxtəlif standartlar müvafiq olaraq həm əsas, həm də ikincil alıcılarda 12 həftədən etibarən bildirilmişdir. Tövsiyəmiz, ilkin transplantasiyadan 16 həftə sonra aşılamanı qiymətləndirmək və isteğe bağlı olaraq ikincili transplantasiyaları yerinə yetirmək və həqiqi təkrarlanma qabiliyyətini təsdiqləmək üçün 12 həftədən sonra bunları təhlil etməkdir.

Nəzarətlər

CD34 + HSPC-lərdə Cas9/sgRNA aktivliyinə müsbət nəzarət kimi, biz yayımlanmış sgRNA-ya istinad edirik. HBB gen və uyğunluq HBB GFP 15 kodlayan donor vektoru. Bütün hədəfləmə təcrübələri üçün saxta elektroporasiyaya nəzarət (Cas9 RNP yoxdur) vacibdir. Bu iki quyuya bölünməlidir: biri AAV donorunu qəbul edən, digəri isə qəbul etmir. Sonuncu məruzəçi + hüceyrələrin axın sitometrik qapısı üçün istifadə olunur və birincisi məruzəçinin yüksək qapısını təyin etmək üçün istifadə olunur (şək. 2). Eynilə, NSG siçanlarında koloniya əmələ gətirən vahidin təhlili və aşılama tədqiqatları üçün saxta nəzarət müsbət nəzarət və koloniyanın formalaşması/paylanması və aşılanması üçün potensial istinad kimi xidmət edəcəkdir.


Effektiv DNT Sintezi üçün Yeni Alətlər

Nicholas Tang,. Jingdong Tian, ​​Sintetik Biologiya, 2013

Gen Assambleyası

Kimyəvi oliqonukleotidlərin sintezində yan reaksiyalar və mərhələli reaksiyalardakı səmərəsizliklər səbəbindən səhvlər toplanır. 43 Uzunluğu 600 bp-ə qədər olan oliqonukleotidlər sintez oluna bilsə də, məhsuldarlıq olduqca aşağıdır. 44 Daha uzun konstruksiyaların sintezi üçün gen yığılması zəruri olur. Demək olar ki, bütün mövcud montaj üsulları PCR və ya ligasiya əsaslı montajın birləşməsindən istifadə edir.Bu üsulların məhdudlaşdırıcı həzm/ligasiya üsullarından üstünlüyü onların yarasız və ardıcıllıqla müstəqil montajı həyata keçirə bilməsidir.

Liqasiya əsaslı montaj, əvvəlcədən sintez edilmiş oliqonukleotidləri birləşdirmək üçün termo-stabil DNT liqazından istifadə edir. Tədqiqat və kommersiya sintez platformalarında ligasyona əsaslanan montajın müvəffəqiyyətlə istifadəsi nümayiş etdirilmişdir. 45-47 Termosabit liqaza T4 DNT liqaza ilə müqayisədə üstünlük təşkil edir, çünki yüksək ligasiya temperaturlarında daha az ikinci dərəcəli DNT strukturları əmələ gələcək. 48-50 Liqasiya əsaslı montaj ligasiya və PCR gücləndirilməsini əhatə edir. Üst-üstə düşən oliqonukleotidlər ardıcıllığın hər iki telini tamamilə əhatə etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. Onlar ligasiya reaksiyası üçün 5′-uclarında fosforlanırlar. Oliqonukleotidlər əvvəlcə istiliklə denatürasiya olunur, sonra 50-65°C-də tavlanma və bağlama üçün soyudulur. Bağlama reaksiyası xətti olduğundan, tam konstruksiya PZR-in konstruksiyanı gücləndirə bilməsi üçün yan astar ardıcıllığı ilə tərtib edilmişdir.

PCR-əsaslı montaj, başqa bir şəkildə polimeraza velosiped montajı (PCA) olaraq bilinir, ən sərfəli gen montaj üsullarından biri olaraq qalır. 51,52 İki mərhələli prosedurda qismən üst-üstə düşən oliqonukleotidlər bütün ardıcıllığı əhatə etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. 53 Eyni zəncirdə oliqonukleotidlər arasında boşluqlara icazə verildiyi üçün başlanğıc oliqonukleotidlərin sayı bağlamaya əsaslanan montaj üçün tələb olunandan azdır. Bir PCR reaksiyası həyata keçirilir ki, üst-üstə düşən oliqonukleotidlər bağlansın və uzansın. Nəticədə ortaya çıxan iki telli konstruksiya PCR gücləndirmə reaksiyası üçün şablon kimi xidmət edə bilər. Bir addımlı prosedurda gücləndirici primerlər birləşmiş montaj və gücləndirmə reaksiyası üçün oliqonukleotidlərə daxil edilir. 54,55 Əlavə dövrə tələb oluna bilsə də, bu prosedur bir neçə addımlı montajdan daha asan şəkildə çoxaldılır. 53 PZR-əsaslı metodlar effektiv olsa da, təkrarlanan ardıcıllıqlar və ya ikincil strukturları əhatə edən konstruksiyalar PCR zamanı çətinliklərlə üzləşə bilər və beləliklə, liqaza əsaslı montajla daha yaxşı yığıla bilər. 56

Ardıcıllıqla müstəqil montaj üçün bir sıra əlaqəli üst-üstə düşən genişləndirmə üsulları var. Dairəvi iki telli konstruksiyaların və ya plazmidlərin ardıcıllıqla müstəqil yığılması üçün dairəvi polimerazın uzadılmasının klonlaşdırılması (CPEC) 57 yalnız çox gen konstruksiyalarını deyil, həm də kombinator ardıcıllıq kitabxanalarını uğurla birləşdirə bilər. 19 Tək addımlı reaksiyada üst-üstə düşən oliqonukleotidlər yığılır və dairəviləşir. Plazmid tikintisi üçün uyğun olan digər yanaşmalara Clontech-dən In-Fusion kommersiya dəsti, 58 Uracil üçün xüsusi eksizyon reagenti (USER) 59 və Sequence- and Ligation-Independent Cloning (SLIC) daxildir. 60 Böyük konstruksiyaların yığılması zamanı xətalar yarana bilər. Gibson izotermik və ya “çeynənmə və tavlama” montajı T5 DNT polimerazı ilə uzunluqdan asılı səhvlərdən qaçır, 16,3 kb mitoxondrial genom kimi 61 genom uzunluğu konstruksiyalarının yığılmasına imkan verir. 62

Oliqonukleotidləri mikroçiplərdən ayırmaq əvəzinə, Quan et al. immobilizə edilmiş mikroarray oliqonukleotidlərin izotermik nicking və strand yerdəyişmə gücləndirilməsini (nSDA) əhatə edən yanaşmadan istifadə edir. 19 Bu, eyni vaxtda oliqonukleotidləri gücləndirir və buraxır, daha sonra 1 kb konstruksiyalara yığılmış PCA. Mikrofluidik sistem sintez, gücləndirmə və montajı birləşdirməyə xidmət edir (şək. 1.3). 19,63 Çip üzərində bütün addımları yerinə yetirməklə, yüksək məhsuldarlıqlı montaj aşağı axın reaksiyaları ilə asanlıqla birləşdirilə bilər.

Şəkil 1.3. İnteqrasiya edilmiş çipdə DNT gücləndirilməsi və gen montajı. Mikroçiplər oliqonukleotidlərin izotermo nikləmə və zəncir yerdəyişməsi gücləndirilməsi ilə gücləndirildiyi fiziki cəhətdən təcrid olunmuş alt massivlərə bölünür. Buraxılmış tellər quyuların içərisində 0,5-1 kb gen fraqmentlərinə yığılır.

Yüksək sədaqətli DNT mikroçipləri bir milyona qədər unikal oliqonukleotidi saxlaya bilsə də, onların ölçüsünü artırmaq çətindir. Mikroarray oliqonukleotid hovuzları olduqca mürəkkəbdir və yığılmış fraqmentlər arasında potensial çarpaz hibridləşmə kimi ağırlaşmalarda problemli olur. Daha uğurlu miqyaslama yüksək keyfiyyətli gen sintezinin dəyərini aşağı salacaq. Bu problemi həll etmək üçün Kosuri et al. kombinə edilmiş selektiv oliqonukleotid hovuzunun gücləndirilməsi, optimallaşdırılmış gen yığılması və enzimatik xətanın korreksiyası. 12 Müəlliflər mikroçiplə sintez edilmiş oliqonukleotidləri parçaladılar. Bu oliqonukleotidlər bir neçə subpoollara uyğun gələn qanadlı gücləndirici primer tavlama yerləri ilə sintez edilmişdir. Daha sonra oliqonukleotidlərin orijinal kompleks fonundan oliqonukleotidlərin spesifik subpoollarını seçici şəkildə gücləndirmək üçün dörddə bir milyon spesifik gücləndirici primerlərdən istifadə edildi. Yan amplifikasiya primer ardıcıllığı daha sonra məhdudlaşdırıcı fermentlərlə parçalandı ki, bu da gen konstruksiyalarına problemsiz sonrakı PCR yığılmasına imkan verir. Müəlliflər sistemi zülalları və antikorları kodlayan 47 gen, o cümlədən əvvəllər yüksək GC məzmunu və təkrarlanan ardıcıllıqlar səbəbindən sintezi çətin olan 40 səhvsiz tək zəncirli antikor geni üzərində sınaqdan keçiriblər. Montajın optimallaşdırılması və enzimatik müalicə dəqiq və aşağı qiymətli sintez etməyə imkan verdi və xərcləri təxmini 0,01 ABŞ dolları/bp-ə endirdi.


Bitkilərdə Genom Redaktəsi: Alətlər və Tətbiqlərə Baxış

Genom manipulyasiya üsullarının ortaya çıxması biotexnologiya və gen mühəndisliyində əsl inqilab vəd edir. Canlı orqanizmlərin genomlarının məqsədyönlü redaktəsi təkcə bioloji sistemlərin fundamental əsaslarının dərk edilməsinə dair araşdırmalara imkan vermir, həm də məhsuldarlığın və məhsulların keyfiyyətinin yaxşılaşdırılması istiqamətində geniş məqsədlərə nail olmağa imkan verir. Buraya qiymətli kompozisiya xassələri və müxtəlif biotik və abiotik stresslərə müqavimət göstərən əlamətlərə malik bitkilərin yaradılması daxildir. Son bir neçə il ərzində, sink barmaq nükleazları (ZFNs), transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor nükleazlar (TALENs) və çoxlu müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrarlar/Cas9 (CRISPR/Cas9) daxil olmaqla bir neçə yeni genom redaktə sistemi hazırlanmışdır. Burada qısaca nəzərdən keçirilən bu maraqlı yeni üsullar bitkilərin genetik təkmilləşdirilməsi üçün effektiv və etibarlı vasitə kimi özünü sübut etdi.

1. Giriş

1972-ci ildə Paul Berqin laboratoriyasında [1] rekombinant DNT texnologiyasının meydana çıxmasından bəri, gen mühəndisliyi uzun bir yol keçmiş və böyük uğurlar qazanmışdır. Bir çox molekulyar və genetik mexanizmlər və hadisələr ətraflı şəkildə kəşf edilmiş və tədqiq edilmişdir və toplanmış biliklər indi tədqiqatçılara təcrübələri in vitroda çoxaltmağa imkan verir. Molekulyar genetika və bakteriya və virusların biokimyası sahəsində bir neçə onilliklər davam edən tədqiqatlar tədqiqatçılara müxtəlif vektor sistemləri və onların hüceyrəyə çatdırılması üçün alətlər yaratmaqla DNT ilə manipulyasiya etmək üçün yeni üsullar hazırlamağa imkan verdi. Bütün bu inkişaflar təkcə transgen mikroorqanizmlərin deyil, həm də müxtəlif bitki və bitki növləri daxil olmaqla, genetik cəhətdən dəyişdirilmiş ali orqanizmlərin uğurlu yaradılmasına imkan verir. Genetik mühəndisliyin tətbiq sahəsi olan seleksiya və biotexnologiya üçün yeni vasitələrin yaradılması faydalı vasitələrin sürətləndirilmiş inkişafı ilə nəticələnən əhəmiyyətli diqqəti cəlb etmişdir. Bununla belə, adi gen mühəndisliyi strategiyasının bir neçə problemi və məhdudiyyətləri var, bunlardan biri ali bitkilərin böyük genomlarının manipulyasiyası ilə bağlı mürəkkəblikdir [2].

Hal-hazırda, bitkilərin dəqiq genomunun redaktəsi problemlərini həll etməyə kömək edən bir neçə vasitə alimlərin ixtiyarındadır. 1996-cı ildə ilk dəfə olaraq “sink barmaqları” kimi zülal sahələrinin birləşdiyi göstərildi. FokI endonükleaz domenləri DNT-ni in vitro olaraq ciddi şəkildə müəyyən edilmiş bölgələrdə parçalayan sahəyə məxsus nükleazlar (sink barmaq nükleazları (ZFNs)) kimi fəaliyyət göstərir [3]. Belə bir kimerik zülal modul quruluşa malikdir, çünki "sink barmağı" domenlərinin hər biri bir üçlü nukleotidləri tanıyır. Bu üsul becərilmiş hüceyrələrin, o cümlədən model və model olmayan bitkilərin redaktə edilməsi üçün əsas oldu [4, 5].

Davamlı səylər və araşdırmalar TALENlər (transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor nükleazlar) və CRISPR/Cas (müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrarlar) kimi yeni genom redaktə vasitələrinin inkişafına gətirib çıxardı. TALEN-lərin layihələndirilməsi hədəflərin hər biri üçün yeni zülalın yenidən qurulmasını tələb edir. Bununla belə, dizayn prosesi, dizayn üçün tələb olunan klonlaşdırmanı əhəmiyyətli dərəcədə azaldan təkrar birləşmələrin modullarını əlçatan etməklə bu yaxınlarda sadələşdirilmişdir. Digər tərəfdən, CRISPR-nin dizaynı və istifadəsi sadədir. Həm TALEN, həm də CRISPR sistemlərinin insan hüceyrələrində, heyvanlarda və bitkilərdə işlədiyi sübut edilmişdir. Bu cür redaktə sistemləri genomların səmərəli manipulyasiyası üçün istifadə edildikdə, mutant və transgen bitkilərin yaradılması da daxil olmaqla mürəkkəb problemləri həll edə bilərdi [12, 41]. Bundan əlavə, sink barmaq domenləri və digər zülalların aktivləşdirmə domenləri və TALE DNT-ni bağlayan domen və Cas9 nukleazına əsaslanan kimerik zülallar gen transkripsiyasının tənzimlənməsi, epigenomların öyrənilməsi və hüceyrə siklində xromosom yerlərinin davranışı üçün təcrübələrdə istifadə edilmişdir. [24, 42–44].

Bu icmalda biz müxtəlif genom redaktə sistemlərinin mexanizmlərini və onların məhsulun yaxşılaşdırılması üçün istifadəsini qısaca təsvir etdik, həmçinin mühəndis nüvələrinin çoxsaylı üstünlüklərini və tətbiqlərini, eləcə də mühəndis nukleaz əsaslı texnologiyalardan istifadə etməklə yaradılan bitkilərin biotəhlükəsizliyi və tənzimləyici aspektlərini vurğuladıq.

2. Genom Redaktə Sistemlərinin Mexanizmləri

Mühəndisləşdirilmiş nukleaz (GEEN) texnologiyaları ilə genomun redaktəsi kimi də adlandırılan yeni genom redaktə vasitələri, hüceyrələrin irsi materialını uğurla dəyişdirmək üçün müəyyən yerlərdə DNT molekullarının parçalanmasına və yenidən birləşməsinə imkan verir. Bu məqsədlə, məhdudlaşdırıcı endonükleazlar və ligaza kimi xüsusi fermentlər bakterial və viral genomlar kimi kiçik genomlarda DNT molekullarının parçalanması və yenidən birləşməsi üçün istifadə edilə bilər. Bununla belə, məhdudlaşdırıcı endonükleazlar və ligazalardan istifadə edərək, bitki genomları da daxil olmaqla, ali orqanizmlərin böyük və mürəkkəb genomlarını manipulyasiya etmək olduqca çətindir. Problem ondadır ki, məhdudlaşdırıcı endonükleazlar yalnız nisbətən qısa DNT ardıcıllığını “hədəf” edə bilir. Qısa DNT virusları və bakteriyalar üçün belə spesifiklik kifayət etsə də, böyük bitki genomları ilə işləmək kifayət deyil. Mürəkkəb genomların redaktəsi üsullarının yaradılması üzrə ilk səylər hədəf DNT-nin strukturunda xüsusi ardıcıllıqla seçici şəkildə bağlana bilən və parçalana bilən kimyəvi qruplara malik olan oliqonukleotidlər (qısa nukleotid ardıcıllıqları) kimi “süni fermentlərin” dizaynı ilə bağlı olmuşdur. DNT [45].

Bu problemi həll etmək üçün məqsədyönlü yanaşma, bir və ya iki struktur vahidi olan kompleks zülallar olan, biri DNT-nin parçalanmasını kataliz edən, ikincisi isə hədəf molekulun spesifik nukleotid ardıcıllığına selektiv şəkildə bağlana bilən ximerik nukleazların dizaynı idi. bu sahəyə nukleaz hərəkəti (Cədvəl 1) [46, 47]. Bu kimerik nukleazlar birbaşa hüceyrədə “istehsal oluna” bilər: bu məqsədlə, nükleazları kodlayan müvafiq şəkildə işlənmiş vektorlar hüceyrəyə daxil edilməlidir. Bu cür vektorlar həmçinin nüvə lokalizasiyası siqnalı ilə təchiz edilir ki, bu da nukleazın hüceyrə nüvəsinə daxil olmasına və bununla da genomik DNT-yə çıxış əldə etməyə imkan verir.

2.1. Sink Barmaq Nükleazları (ZFNs)

ZFN-lər funksional Cys2-His2 sink barmaq (ZF) domeninin iş prinsiplərinin kəşfindən sonra işlənib hazırlanmış, kimerik şəkildə işlənmiş nükleazlardan istifadə edən genomu redaktə vasitələrinin ilk nəsli idi [3, 4, 46, 48]. Hər bir Cys2-His2 ZF domeni 30 amin turşusu qalığından ibarətdir və onlar qatlanmışdır. ββα konfiqurasiya [48-50]. Kristaloqrafik struktur analizi göstərdi ki, Cys2-His2 ZF zülalları DNT-yə birləşərək bağlanır. α-zülalın DNT-cüt spiralın əsas yivinə daxil olması [51]. Hər bir ZF proteini DNT-də 3 tandem nukleotidi tanımaq qabiliyyətinə malikdir. Ümumiləşdirilmiş ZFN monomeri iki fərqli funksional sahədən ibarətdir: N-terminal bölgəsində süni ZF Cys2-His2 domeni və qeyri-spesifik. FokC-terminal bölgəsində I DNT parçalanma sahəsi. FokI domeninin dimerləşməsi ZFN fermentativ fəaliyyəti üçün vacibdir [3]. Sink barmaq domenlərinin modul tanınmasının müvafiq, ardıcıl üç bp hədəfinə bir sıra kimi təqdim edilməsinin müşahidəsi, sink barmaqlarının fərdi domenlərinin hər birinin bir-birini əvəz edə biləcəyini və domenlərin sırasının manipulyasiyasının unikal nəticəyə gətirib çıxaracağını başa düşməyə imkan verdi. onları saxlayan zülallara spesifiklikləri bağlayır və bununla da genomda spesifik, unikal ardıcıllıqların hədəflənməsinə imkan verir. Məsələn, iki 3 və ya 4 ZF domenindən ibarət ZFN dimeri statistik olaraq əksər orqanizmlərin genomlarında unikal saytlar meydana gətirən 18 və ya 24 baza cütlüyünün hədəf ardıcıllığını tanıyır (Cədvəl 1).

ZFN-lərin dizaynı və tətbiqi modul dizaynı, yığılması və sink barmaqlarının spesifik hədəf DNT ardıcıllığına qarşı optimallaşdırılmasını, daha sonra fərdi ZF-lərin daha böyük ardıcıllıqların hədəflənməsi istiqamətində əlaqələndirilməsini əhatə edir. İllər ərzində çoxlu sayda triplet nukleotidi tanımaq üçün sink barmaq domenləri yaradılmışdır. Bu, maraqların hədəf ardıcıllığının tanınmasına imkan verəcək ardıcıllıqla sink barmaqlarının seçilməsini və əlaqələndirilməsini təmin etdi.

1996-cı ildə sink barmaqları haqqında ilk hesabatdan bəri, onlar bitkilər də daxil olmaqla bir neçə orqanizmdə uğurla istifadə edilmişdir [4]. Nümunələrə Arabidopsisdə endogen genlərin məqsədyönlü inaktivasiyası [15, 16], tütün genlərinin yüksək tezlikli modifikasiyası [17] və herbisidlərə dözümlülük geninin dəqiq məqsədyönlü əlavə edilməsi, həmçinin qarğıdalıda hədəf lokusun daxil edilməsinin pozulması daxildir [18]. ZFN-lər qarğıdalıda əlamət yığmaq üçün də istifadə edilmişdir [52, 53].

Sink barmaq nükleazları maraq doğuran genomik yerləri manipulyasiya etmək qabiliyyətini nümayiş etdirərək genomun redaktəsi sahəsində inqilab etdi və həm əsas, həm də tətbiqi tədqiqatlar üçün qapıları açdı. ZFN-lər səmərəlilik, yüksək spesifiklik və minimal qeyri-məqsədli təsirlər baxımından digər vasitələrə nisbətən üstünlüklər təmin edir və cari səylər dizayn və çatdırılmanın daha da təkmilləşdirilməsinə, eləcə də onların müxtəlif maraq doğuran məhsullarda tətbiqlərinin genişləndirilməsinə yönəlib.

2.2. Transkripsiya Aktivatoruna Bənzər Effektor Nükleazları (TALENs)

Hədəf genom DNT-nin effektiv və seçici manipulyasiyası axtarışı yeni genomun yaradılması üçün əsas olan tandem təkrarları dəsti vasitəsilə spesifik bitki promotorlarını tanıyan və aktivləşdirən unikal transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor (TALE) zülallarının müəyyən edilməsinə səbəb oldu. TALE nukleazları (TALENs) adlanan kimerik nukleazlardan ibarət redaktə sistemi [47]. TALE zülalları DNT-nin bağlanmasına cavabdeh olan mərkəzi domen, nüvə lokalizasiyası siqnalı və hədəf genin transkripsiyasının aktivatoru kimi xidmət edən domendən ibarətdir (Cədvəl 1) [54]. İlk dəfə bu zülalların DNT-ni bağlama qabiliyyəti 2007-ci ildə təsvir edilmişdir [55] və bir il sonra iki elmi qrup TALE zülalları ilə hədəf DNT ardıcıllığının tanınma kodunu deşifrə etmişlər [56].

Göstərilir ki, TALE monomerlərindəki DNT-ni bağlayan domen, öz növbəsində, DNT-nin bağlanmasını və ev sahibinin spesifikliyini təmin edən mərkəzi təkrar domendən (CRD) ibarətdir. CRD 34 amin turşusu qalıqlarının tandem təkrarlarından ibarətdir və CRD-də hər 34 amin turşusu uzun təkrarı hədəf nukleotid ardıcıllığında bir nukleotidə bağlanır. 12 və 13-cü mövqelərdə yerləşən təkrar amin turşularından ikisi yüksək dəyişkəndir (təkrar dəyişən direzid (RVD)) və diferensial effektivliyə malik bir neçə nukleotidin bağlanmasının degenerasiyası ilə spesifik nukleotidin tanınmasına cavabdehdir. Tanınma sahəsinin 3′ ucunda nukleotidlə bağlanan sonuncu tandem təkrarı yalnız 20 amin turşusu qalığından ibarətdir və buna görə də yarım təkrar adlanır. TALE zülalları, ümumiyyətlə, hər hansı bir maraq doğuran DNT ardıcıllığını bağlamaq üçün dizayn edilə bilsə də, tədqiqatlar göstərmişdir ki, TALE zülalı ilə bağlanmış DNT ardıcıllığının 5′-ən çox nukleotid bazası həmişə Timidin olmalıdır və bu tələbdən sapma TALE transkripsiya faktorlarının (TALE-TF), TALE rekombinazlarının (TALE-R) və TALEN-lərin [57] effektivliyinə təsir göstərə bilər.

TALE zülalları tərəfindən DNT kodunun tanınması tələbləri sındırıldıqdan sonra görülən ilk cəhd kimerik TALEN nukleazlarının yaradılması oldu [5]. Bu məqsədlə, DNT-ni bağlayan TALE domenini kodlayan ardıcıllıq əvvəllər ZFN yaratmaq üçün istifadə edilmiş plazmid vektoruna daxil edilmişdir [58]. Bu, TALE-lərin DNT bağlayan sahəsini və katalitik domenini ehtiva edən sintetik, kimerik ardıcıllığa spesifik nukleaz genetik quruluşunun yaradılması ilə nəticələndi. FokI məhdudlaşdırıcı endonükleaz. Bu konstruksiya maraq doğuran istənilən nukleotid ardıcıllığını hədəfə ala bilən DNT bağlayan domen və müxtəlif RVD-lərə malik süni nükleazların yaradılmasına kömək etdi [2, 4].

Əksər tədqiqatlarda RVD Asn və Ile (NI), Asn və Gly (NG), iki Asn (NN) və His və Asp (HD) olan monomerlər müvafiq olaraq A, T, G və C nukleotidlərinə bağlanır. G-ni təyin edən ən çox yayılmış RVD olan NN-in də A-ya bağlandığı aşkar edilmişdir. Bu suboptimal və ya spesifikliyin olmaması DNT-ni hədəfləmək üçün hazırlanmış TALE-lərin istifadəsi ilə bağlı narahatlıq doğurur. Başqa bir RVD NK guaninin spesifikliyini nümayiş etdirsə də, NN ilə müqayisədə daha az funksional effektivliyə malikdir. Bir sıra tədqiqatlar həmçinin göstərmişdir ki, guaninin spesifik bağlanması üçün NH və ya NK RVD-lərin istifadəsi məqsədsiz təsirlərin riskini azaldır [19, 59, 60]. Göstərilmişdir ki, RVD-də (NI, NG, NN və ya HD) birinci amin turşusu qalığı, istər N, istərsə də H olsun, bir nukleotidlə birbaşa bağlanmasa da, məkan konformasiyasının sabitləşməsinə cavabdehdir, halbuki ikinci amin turşusu qalığı ya azotlu əsaslarla (D və N amin turşuları halında) və ya van der Waals qüvvələri (I və G halda) ilə hidrogen əlaqəsi vasitəsilə nukleotidlə bağlanır [61].

TALEN-lərin fəaliyyət tərzinə və spesifikliyinə əsaslanaraq, genomun istənilən yerində qoşa zəncir qırılmalarını tətbiq etmək mümkün olmalıdır, o şərtlə ki, bu yer TALEN-lərin DNT-ni bağlayan domenlərinə uyğun gələn tanınma ardıcıllığını özündə saxlayır. Həmçinin yerinə yetirilməli olan başqa bir şərt var, yəni nəzərdə tutulan hədəf ardıcıllığın 5′ sonuna qədər Timidinin olması tələbi, çünki DNT-nin N-terminal hissəsindəki W232 qalığının Bağlayıcı domen Timidin ilə qarşılıqlı əlaqədə olur və bağlanma səmərəliliyinə təsir göstərir [62]. Digər nukleotidləri bağlaya bilən TALEN N-terminal domeninin mutant variantlarını inkişaf etdirməklə bu 5′ Timidin məhdudiyyətini aradan qaldırmaq da mümkündür [57]. TALEN sistemindən istifadə edərək sahəyə yönəldilmiş manipulyasiyanın asanlığını nəzərə alaraq, TALEN fəaliyyət rejiminin açılmasından sonra qısa müddət ərzində bu sistem tərəfindən dəyişdirilmiş genlər bir neçə heyvan və bitki növündə uğurla istifadə edilmişdir və bitki nümunələri arasında düyü daxildir. , buğda, Arabidopsis, kartof və pomidor (Cədvəl 2) [63].

2.3. Oliqonukleotidlərə istiqamətlənmiş mutagenez (ODM)

Məməli sistemlərində ilk uğurlu istismardan sonra oliqonukleotidlə idarə olunan mutagenez (ODM) bitkilər üçün başqa bir yeni gen redaktə vasitəsinə çevrilmişdir [7, 64]. Məqsədli mutagenez üçün alət olan ODM, ardıcıllığı genomdakı hədəf ardıcıllıqla eyni olan 20-100 əsaslı spesifik uzun oliqonukleotiddən istifadə edir ki, o, tək əsas cüt dəyişikliyini ehtiva edir. genom) gen/maraq ardıcıllığının sayta yönəldilmiş redaktəsinə nail olmaq üçün (Cədvəl 1) [65]. Bu sintetik oliqonukleotidlər və ya hədəf genin müəyyən bir bölgəsinə homoloji olan təmir şablonları müxtəlif spesifik çatdırılma üsullarından istifadə edərək bitki hüceyrələrinə müvəqqəti olaraq məruz qaldıqda, hədəflərə bağlanır və hüceyrənin təbii təmir mexanizmlərini aktivləşdirirlər. şablon və sonra təmir prosesi vasitəsilə həmin uyğunsuzluğu və ya mutasiyanı hədəf ardıcıllığına köçürür [7, 65].Bu, bitki hüceyrəsi təmir şablonu oliqonukleotidi deqradasiya edərkən, yeni funksiya və ya əlamət verən bitki genomunda arzu olunan hədəflənmiş tək nukleotid və ya baza redaktəsini yaradır. Toxuma mədəniyyəti üsullarından istifadə edərək, ardıcıllığı dəyişdirilmiş hüceyrələr sonradan regenerasiya olunur və ənənəvi yetişdirmə yolu ilə təkmilləşdirilmiş əlamətlərə/xüsusiyyətlərə malik genomu redaktə edilmiş yeni növlər hazırlanır (Cədvəl 2) [7, 64, 65].

2.4. Kümelənmiş Müntəzəm Aralıqlı Qısa Palindromik Təkrarlar (CRISPR)

Bu yaxınlarda ortaya çıxan və geniş populyarlıq qazanan başqa bir yeni genom redaktə sistemi qruplaşdırılmış müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrarlar (CRISPR)/CRISPR ilə əlaqəli (Cas) zülal sistemidir, ən görkəmlisi CRISPR/Cas9 (Cas9 zülalı əsasında). Bu, adaptiv bakterial və arxeal immun sistemindən istifadə edən bir üsuldur, onun mexanizmi bakterial genomda CRISPR lokusları adlanan xüsusi yerlərin mövcudluğuna əsaslanır. Bu lokuslar Cas9 zülalını kodlayan operonlardan və təkrar boşluq ardıcıllıqlarının təkrar massivindən ibarətdir. Təkrar massivdəki boşluqlar rekombinasiyadan sonra bakteriya genomuna inteqrasiya olunmuş xarici DNT-dən (viral və ya plazmid) əldə edilən qısa fraqmentlərdir [41, 66].

Kimerik TALEN zülallarından fərqli olaraq, CRISPR/Cas9 sistemi ilə hədəf ərazinin tanınması hədəf sahənin bələdçi (kodlaşdırılmayan) RNT və DNT ilə bələdçi RNT və Cas zülal kompleksi arasında tamamlayıcı ardıcıllığa əsaslanan qarşılıqlı əlaqə ilə həyata keçirilir. Cas9 endonükleazdan istifadə edərək ikiqat zəncirli DNT (Cədvəl 1) [9, 24, 67].

Müxtəlif bakteriyaların hüceyrələrində fəaliyyət göstərən CRISPR qoruyucu sistemlərinin bir neçə növü başqa yerdə ətraflı təsvir edilmişdir [68, 69]. Ən “məşhur” sistem bakteriyada olan CRISPR/Cas tip II-A sistemidir. Streptococcus pyogenes və CRISPR RNT (crRNA), trans-aktivləşdirici crRNA (tracrRNA) və Cas9 zülalını kodlayan üç gendən ibarətdir. Bu sistem əsasında CRISPR/Cas “genom redaktoru”nun süni elementlərini kodlayan universal genetik konstruksiyalar yaradılmışdır [70]. Həmçinin, sistemin CRISPR tracrRNA və qısa, yetkin crRNA-dan ibarət Cas9 zülalının kompleksi və tək istiqamətləndirici RNT kimi fəaliyyət göstərən sadələşdirilmiş versiyası yaradılmışdır. Bələdçi ardıcıllığı hədəf DNT yerini müəyyənləşdirir və tamamlayıcılığa əsaslanaraq ona bağlanır və Cas9 DNT-ni hədəf nöqtəsində parçalayır [71].

CRISPR sistemi mədəniyyətdə və canlı orqanizmlərdə yetişdirilən genetik cəhətdən dəyişdirilmiş hüceyrələrin yaradılması üçün istifadə edilə bilər [11]. Birinci halda hüceyrələrə CRISPR/Cas9 sistem elementlərinin yüksək və sabit sintezini təmin edən plazmidlər və ya virus vektorları daxil edilir. İkinci halda, genetik modifikasiya olunmuş bitkilərin əldə edilməsi üçün kultivasiya olunmuş protoplastlar və CRISPR/Cas elementlərini kodlayan plazmiddən istifadə edilir [32]. Bitkilər üçün tətbiq olunan başqa bir yanaşma, istifadəsidir Aqrobakteriya, CRISPR/Cas9 sistemini özündə saxlayan xüsusi plazmiddən ibarət təbii “gen mühəndisi” [41, 44].

Beləliklə, sadəliyi, səmərəliliyi və geniş imkanları sayəsində CRISPR/Cas9 sistemi qısa müddət ərzində fundamental və tətbiqi biologiyanın, biotexnologiyanın və gen mühəndisliyinin müxtəlif sahələrində istifadəsini tapmışdır.

2.5. Cleaved Genomik Saytların Təmiri

Genomun redaktə prosesində mühüm addım nükleazların yaratdığı DNT qırıqlığının təmiridir. DNT qırılması endogen hüceyrə mexanizmləri ilə bərpa olunur: qeyri-homoloji son birləşmə (NHEJ) və ya homologiyadan asılı (və ya yönəldilmiş) təmir (HDR) [14]. NHEJ, parçalanmış DNT-nin uclarının bir-birinə birləşdirildiyi ən sadə mexanizmdir, çox vaxt nukleotidlərin (indellərin) daxil edilməsi və ya silinməsi ilə nəticələnir, bununla da genin oxunma çərçivəsini dəyişir, nəticədə genin “nokautu” [72]. İndellər müşahidə olunmazsa, DNT bərpa olunur və nəzərə çarpan dəyişikliklər yoxdur. Digər tərəfdən, HDR, hədəfə homologiya olan ardıcıllığın qırılma və ya DNT lezyonunu təmir etmək üçün şablon kimi istifadə edildiyi bir mexanizmdir. Buna görə də, kəsilmə nöqtəsinin hər iki tərəfinə homolog olan ardıcıllıqla əhatə olunmuş arzu olunan maraq ardıcıllığını ehtiva edən şablon təqdim etməklə, həmin ardıcıllığın hədəf sayta daxil edilməsinə məcbur etmək olar. HDR meydana gəldikdə, genin bərpası və ya daxil edilməsi üçün yeni ardıcıllıqları təmin etmək üçün homoloji rekombinasiya istifadə olunur [72]. Bu üsul sadədir, DNT hədəfinə dəqiq təsir göstərir və demək olar ki, istənilən müasir molekulyar biologiya laboratoriyasında istifadə edilə bilər.

3. Genom Redaktə Sistemlərinin Praktik Tətbiqləri

3.1. Funksional genomika üçün “Genom redaktorlarının” tətbiqi

ZFN, TALEN, ODM və CRISPR/Cas genom redaktə sistemlərindən istifadə etməklə bir neçə müxtəlif növ genom modifikasiyasına nail olmaq olar (Cədvəl 2). Bunlara nöqtə mutasiyalarının yaradılması, xüsusi yerlərə yeni genlərin daxil edilməsi və ya nukleotid ardıcıllığının böyük hissələrinin silinməsi, fərdi genetik elementlərin və gen fraqmentlərinin korreksiyası və ya dəyişdirilməsi daxildir [4, 6, 10, 20, 23, 44, 73] .

Alimlər bitki hüceyrələrində müxtəlif genomik elementlərə modifikasiyalar tətbiq edərkən və nəticələri araşdırarkən ayrı-ayrı hüceyrələrin və bütövlükdə orqanizmin fəaliyyətində ayrı-ayrı genlərin rolunu araşdıra bildilər. Məsələn, CRISPR/Cas9 sisteminin özünəməxsus DNT sahələrinə selektiv şəkildə bağlanma qabiliyyəti gen aktivliyini tənzimləməyə kömək etmişdir [24, 41, 44]. Bu məqsədlə, gen funksiyasına nəzarət edən promotorların fəaliyyətini aktivləşdirən və ya repressiya edən zülallar katalitik cəhətdən qeyri-aktiv mutant Cas9 zülalına birləşdirilə bilər. Bir nümunədə göstərilmişdir ki, hədəf DNT-yə kompleks bağlanma hədəf genin funksiyasını inhibə edə və ya stimullaşdıra bilər [44].

Bundan əlavə, CRISPR/Cas9 sistemindən istifadə edərək, müxtəlif genom sahələrinə yönəlmiş bir neçə genetik konstruksiya eyni vaxtda hüceyrələrə daxil edilə bilər [8, 24, 43]. Bu, əgər varsa, genlərarası qarşılıqlı əlaqənin tədqiqində xoş bir xüsusiyyətdir, çünki bir neçə gen eyni vaxtda CRISPR/Cas9 sistemindən təsirlənir [44]. Məsələn, bu yanaşmadan istifadə etməklə məhsulun əhliləşdirilməsi prosesində iştirak edən genləri müəyyən etmək mümkün olmuşdur [74].

3.2. Məhsulun yaxşılaşdırılmasında genom redaktə sistemlərinin tətbiqi

Genomun redaktə texnologiyaları müasir biotexnologiyanın ən mühüm vəzifələrindən birinin həlli üçün geniş praktik tətbiqlərə malikdir - yüksək məhsuldar, abiotik və biotik stresslərə davamlı, eyni zamanda yüksək qida dəyərinə malik yeni bitki sortlarının yaradılması (Cədvəl 2) [ 31, 63, 75–80]. Bu məqsədlə bitki seleksiyasında (1) təbii SNP-lərə bənzər nöqtə mutasiyaları daxil etmək üçün genomun redaktə sistemi istifadə edilmişdir [26, 27], (2) gen funksiyasına kiçik dəyişikliklər etmək [13], (3) xarici genlər, (4) gen piramidası və nokaut üçün və (5) gen ifadəsinin repressiyası və ya aktivləşdirilməsi, həmçinin (6) epigenetik redaktə [6].

Məsələn, ZFN-nin istifadəsi Arabidopsis thaliana [15-17] və Zea mays [18] herbisidlərə davamlı genlərin genomda hədəflənmiş ərazilərə daxil edilməsi yolu ilə herbisidlərə davamlı genotiplərin uğurlu inkişafına səbəb olmuşdur [18]. ZFN, həmçinin bitkilərdə endogen malat dehidrogenaz (MDH) geninin məqsədyönlü modifikasiyası üçün istifadə edilmişdir və modifikasiya olunmuş MDH ehtiva edən bitkilər məhsuldarlığın artdığını göstərmişdir [81]. ODM texnikası Cibus Rapid Trait Development System (RTDS) [7] vasitəsilə əhəmiyyətli dərəcədə inkişaf etdirilmişdir və bu texnologiya bir neçə məhsulda uğurla tətbiq edilmişdir. Tətbiqlərə bitkilərin inkişafı üçün ənənəvi gen mühəndisliyi yanaşmasında istifadə edildiyi kimi, herbisidlərə qarşı dözümlülük, həşəratlara qarşı müqavimət, inkişaf etmiş xəstəliklərə qarşı müqavimət (bakterial və viral), təkmilləşdirilmiş qida dəyəri və yad genlərin tətbiqi olmadan artırılmış məhsul daxildir, lakin bununla məhdudlaşmır. [7, 65]. ODM RTDS texnologiyasından istifadə edərək CAC-ın TAC-a dəqiq redaktəsi nümayiş etdirildi ki, bu da GFP zülalında Histidini (H66) tirozinə (Y66) dəyişdirərək BEP-ni GFP-yə çevirir. Bu yanaşma bitkilər üçün qeyri-transgen yetişdirmə aləti təklif etmişdir [7, 64].

CRISPR/Cas9 texnologiyasından istifadə edərək, Jiang et al. [28] “biotexnologiya” neftini əldə etmişlər Camelina sativa təkmilləşdirilmiş yağ turşusu tərkibinə malik olan toxumlar onu insan sağlamlığı üçün daha faydalı edir, oksidləşməyə daha davamlıdır və bioyanacaq da daxil olmaqla müəyyən kommersiya kimyəvi maddələrinin istehsalı üçün daha uyğundur [28]. Soyk və b. [29] sürətli çiçəklənən və daha yığcam kollu bitkilər yaratmaq üçün pomidorun SP5G geninin məqsədyönlü mutagenezindən istifadə etdi, bu da öz növbəsində daha erkən məhsul əldə etdi. Başqa bir cəhddə Osakabe et al. [31], OST2 geninin CRISPR səbəb olduğu mutagenezindən istifadə edərək Ərəbidopsis, bitkilərə duz stresinə qarşı müqavimət göstərən yeni allellər əldə edə bildilər [31].

Gibberellin biosintezinin genom redaktə üsulları ilə modulyasiyası yüksək sıxlıq əkinləri və azaldılmış əmək xərcləri hesabına məhsuldarlığı artırmaq üçün böyük potensiala malik cırtdan meyvə ağaclarının [30] yaradılmasına imkan verdi. Bu, torpaq, su, pestisid və gübrə istifadəsinin azalması ilə nəticələnir [82]. Bundan əlavə, meyvələrin yetişmə prosesində [82] və ya onun siqnal yollarında çox mühüm rol oynayan etilen biosintezinin inhibə edilməsi üçün genomun redaktəsi uzun ömürlü yeni sortların yaradılmasına imkan verir [63].

Bitki seleksiyasında genomun redaktəsi yanaşmalarının tətbiqinin əsas sahəsi müxtəlif patogenlərə və/və ya zərərvericilərə davamlı sortların yaradılmasıdır. Bu üsullar bir neçə məhsulda müxtəlif səviyyələrdə əsas bitki toxunulmazlıq mərhələlərinin modifikasiyası üçün istifadə edilmişdir. Bu məqsədə (1) həssaslıq genlərini (S-genləri), (2) müqavimət genlərini (R-genlərini), (3) effektor və hədəf arasındakı qarşılıqlı əlaqəni tənzimləyən genləri və (4) bitkini tənzimləyən genləri dəyişdirməklə nail olmaq olar. hormonal balans [78]. Məsələn, toz küf xəstəliyinə davamlı buğda genotipləri kif müqavimət lokusu O (MLO) üzərində TALEN- və CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə genomun redaktəsi ilə əldə edilmişdir [34]. Genom redaktə texnologiyaları səbəb olduğu bakterial yarpaq zərərvericilərinə davamlı bitkilər istehsal etmək üçün də istifadə edilmişdir Xanthomonas oryzae pv. oryzae [21].

CRISPR/Cas9 sistemi keçici transformasiya sistemindən istifadə edərək geminiviruslara qarşı müdaxilənin təmin edilməsində effektivliyi üçün tədqiq edilmişdir. N. benthamiana tək bələdçi RNT/Cas9 (sgRNA/Cas9) ilə buruq üst virus genomunun deqradasiyası/bastırılması nümayiş etdirilmişdir [35]. Digər səylərdə, pomidor sarı yarpaq qıvrım virusu (TYLCV) və ya lobya sarı cırtdan virusu (BeYDV) ardıcıllığına xas olan sgRNA-ların tətbiq olunduğu yerlərdə. N. benthamiana Cas9 endonükleazını ifadə edən və müvafiq viruslarla mübarizə aparan bitkilərdə nümayiş etdirildi ki, CRISPR/Cas9 sistemi təkcə deqradasiya üçün virusları hədəfləmədi, həm də sərbəst replikasiya edən virusların surət sayına müdaxilə səbəbindən hədəf ardıcıllıqlarında mutasiyalar təqdim etdi [36, 37] [78].

Hormonal tarazlığı tənzimləyən metabolik yollar da bitkilərin immun sisteminin immunomodulyator komponentini gücləndirmək üçün genomun redaktə texnologiyalarından istifadə etməklə dəyişdirilə bilər. Buna etilenə cavab verən faktoru (ERF) deaktiv etməklə nail olmaq olar. Xüsusilə, düyüdə etilendən asılı yol CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə hədəf OsERF922 gen mutasiyaları ilə uğurla modifikasiya edilib və nəticədə düyüyə qarşı müqavimət artıb. Magnaporthe oryzae [38, 39].

CRISPR/Cas9 virusların tərcüməsi üçün vacib olan eukaryotik tərcümənin başlanğıc faktorunu kodlayan eIF4E genini sındırmaq üçün istifadə edilmişdir. Cucumis sativus, və bu nokaut xiyar damarlarının sararması virusu (CVYV), balqabaq sarısı mozaika virusu (ZYMV) və papaya halqası ləkəli mozaika virusu-W (PRSV-W) kimi viruslara qarşı müqavimət göstərir [83]. Bundan əlavə, CRISPR/Cas9-un sürətli və səmərəli genom redaktəsi üçün effektiv sistem olduğu nümayiş etdirildi. Phytophthora sojae, Soya paxlasının oomycete patogeni, patogenlik genini (Avr4/6) dəyişdirərək, bununla da çox ehtiyac duyulan funksional genomika işi üçün bir yol açır. Phytophthora sojae bu patogenə nəzarət etmək üçün son məqsədə doğru [83].

Eynilə, mövcud genom redaktə üsulları, xüsusən, CRISPR/Cas9 metodu, herbisidlərə davamlı bitkilərin əldə edilməsi üçün uğurla istifadə edilmişdir [33]. Məsələn, qarğıdalıda ALS2 geninin redaktəsi (asetolaktat sintaza və ya ALS bitkilərdə amin turşularının biosintezində əsas fermentdir və sulfonilüre herbisidləri tərəfindən inhibə edilmişdir) xlorsulfurona davamlı mutant qarğıdalı bitkisinin yaradılmasına imkan vermişdir [33].

CRISPR/Cas9 sisteminin əhəmiyyətli tətbiq olunduğu biotexnologiyanın digər maraqlı sahəsi şəkərli diabet xəstələri üçün zəruri olan insulin kimi insan zülallarını və ya hemorragik şokun, yanıqların, hipoproteinemiyanın müalicəsində istifadə olunan albumin sintez edə bilən bitkilərin inkişafıdır. , və siroz [84]. Hal-hazırda albumin çox məhdud tədarükdə olan insan plazmasından hazırlanır, lakin albuminə qlobal tələbat durmadan artır və hazırda ildə 500 tona bərabərdir. Artan ehtiyacları ödəmək üçün insan albumin geni artıq genomik mühəndislik üsullarından istifadə edərək düyü genomuna daxil edilmişdir [85]. Belə ifadə olunmuş zülallar sintez olunduğu bitki və heyvan toxumalarından təcrid oluna və aydınlaşdırıldıqdan sonra tibbi məqsədlər üçün istifadə oluna bilər.

Beləliklə, yuxarıda təsvir olunduğu və burada geniş istinad edildiyi kimi, bu yeni genom redaktə üsulları yeni bioenerji məhsul inkişafları da daxil olmaqla məhsulun yaxşılaşdırılması məqsədilə geniş istifadə olunur [86]. Bununla belə, bu GEEN metodları ilə toxuma mədəniyyətinin istifadəsi genomun redaktəsi prosesini ləngidə bilən mürəkkəbliklər də yarada bilər.

4. Genom Redaktə Sistemlərinin Təhlükəsizlik Qiymətləndirilməsi Aspektləri

4.1. Hədəfsiz Effektlər

Genomun redaktə üsulları mahiyyət etibarilə yerli genomik quruluşu qoruyur və buna görə də məhsulun yaxşılaşdırılması üçün təhlükəsiz texnologiya hesab olunur. Bu ümumi anlayışa baxmayaraq, bu üsullardan istifadə etməklə yaradılan məhsulların biotəhlükəsizliyi ilə bağlı bəzi narahatlıqlar var. Onun biotəhlükəsizliyi baxımından əsas narahatlıqlardan biri, genomun redaktəsi zamanı sintetik nukleazların məqsədsiz təsirlərinin mümkünlüyüdür.

Genomun redaktə üsullarının biotexnoloji tətbiqi zamanı mühəndis nüvələrinin səmərəliliyi və spesifikliyi ən vacib iki funksional tələbdir və hədəf yerinin seçimi ilə sıx bağlıdır. Hər bir endogen genomik lokus üçün DNT-nin parçalanmasının effektivliyi (həm hədəf, həm də qeyri-hədəf) təkcə nukleaz aktivliyindən (məsələn, FokI domenləri və Ruv Cas9 zülallarının domenləri), həm də hədəf sahəsinin mövcudluğu və DNT-ni bağlayan domeninin (məsələn, TAL effektor domenləri və bələdçi RNT, gRNA) hədəf ardıcıllığına yaxınlığı. Mühəndisləşdirilmiş nukleazların spesifikliyi əsasən sink barmağının DNT-yə (ZFNs), TAL effektorunun DNT-yə (TALENs) bağlanması və qRNT-nin DNT ilə hibridləşməsi (CRISPR) daxil olmaqla, nukleaza-DNT-nin bağlanma yaxınlığından asılıdır. FokI domeni (ZFNs və TALENs) və Cas9 protospacer bitişik motivə (PAM) bitişik motivlə qarşılıqlı əlaqə də mühüm rol oynaya bilər [87]. ZFN-lər vəziyyətində, ZFN-ləri ehtiva edən kanonik C2H2 bağlayıcı domeninin bağlanma effektivliyi ilə bağlı nümunələr çox olsa da, C3H1 bağlama domenini ehtiva edənlər kimi qeyri-kanonik ZFN-lərin faydalılığına dair araşdırmalar yüksək səviyyəli bağlama effektivliyini nümayiş etdirdi [88].

Genom redaktə sistemlərinin məqsədsiz təsirlərini minimuma endirmək üçün mühüm aspekt əvvəlcədən bioinformatika analizini həyata keçirməklə ikiqat telli fasilələrin tətbiqi üçün yerlərin diqqətlə seçilməsidir [89]. İstənilən yerləri seçərkən təkrar ardıcıllığın yerlərindən və genomun digər bölgələri ilə yüksək homologiyaya malik olan yerlərdən qaçınmaq lazımdır. Bununla əlaqədar olaraq, nükleazlar üçün hədəf yerlərin seçilməsini və hədəf olmayan effektlərin mövcudluğunun eksperimental yoxlanışını asanlaşdırmaq üçün nukleazların dizaynını və təsdiqini təmin edən bir neçə proqram paketi hazırlanmışdır [79, 87, 90].

4.2. Genom redaktəsi ilə yaradılmış bitkilərin tənzimlənməsi

Yeni genom redaktə sistemləri bitki genomuna sabit irsi nöqtə modifikasiyalarını daxil etməyə kömək edir və transgenik bölgə hədəf geni redaktə etdikdən sonra asanlıqla çıxarıla bilər. Bu, transgen olmayan bitkilərin və təkmilləşdirilmiş məhsul növlərinin yaradılmasına imkan verir [22, 91-93]. Bu texnologiyalar ənənəvi yetişdirmə üsulları ilə müqayisədə daha sürətlidir və transgen daxil edilməsini itirmiş boş seqreqant xətləri əldə etməyə kömək edir [94-97]. Genomun redaktəsi texnologiyası ilə hazırlanmış hədəf mutasiyaları olan bitkilər klassik seleksiya yolu ilə əldə edilən bitkilərlə demək olar ki, eynidir və onların təhlükəsizliyi onları yaratmaq üçün istifadə olunan prosesdən çox, nəticədə əldə edilən məhsul nəzərə alınmaqla qiymətləndirilməlidir [98-100]. Bu kontekstdə ODM-dən əldə edilən məhsullar bir çox hallarda ənənəvi yetişdirilmiş və ya ənənəvi mutagenez məhsullarından fərqlənmir, buna görə də belə məhsullar gen mühəndisliyi üsulları ilə yaradılan məhsullarla eyni şəkildə tənzimlənməməlidir [7, 65]. CRISPR-Cas9 sistemindən istifadə etməklə markersiz, yəni antibiotik müqavimətinin marker genləri olmadan gen-mühəndislik məhsulları əldə etmək mümkün olur [6, 100]. Belə ki, genom redaktə sistemlərindən istifadə etməklə işlənib hazırlanmış məqsədyönlü mutasiyalara malik yeni sortlarda genetik modifikasiya olunmuş bitkilərin tənzimlənməsi üçün mövcud fəaliyyət qaydaları tətbiq edilməməlidir [92, 95, 99, 100]. Hazırda genomun redaktə texnologiyaları GMO qanunvericiliyi kontekstində müxtəlif məsləhətçi və tənzimləyici orqanlar tərəfindən müzakirə olunur. Genom redaktə üsullarından istifadə etməklə əldə edilən mədəniyyətlər və bitkilər qeyri-genetik modifikasiya edilmiş hesab olunur [95, 99, 101]. Avropa Komissiyasının genomun redaktə üsullarının tənzimləyici qeyri-müəyyənliyinə dair hesabat dərc edəcəyi gözlənilir [100, 102, 103].

5. GEEN-lərin üstünlükləri və perspektivlərinin çoxluğu

Genom redaktə vasitələri bitki biologiyasında fundamental və tətbiqi tədqiqatlara əhəmiyyətli təsir göstərir [24, 43, 44, 73]. Gen/genomun redaktəsinə sadələşdirilmiş yanaşma gen(lərin) funksional analizində bitki tədqiqatçıları üçün və kənd təsərrüfatı baxımından əhəmiyyətli bitkilərin genomlarına əsas genlərin inteqrasiyasında seleksiyaçılar üçün dəyərli alətdir.Genom redaktə sistemləri sadəlik, səmərəlilik, yüksək spesifiklik, minimal qeyri-məqsədli effektlər və multipleksləşmə qabiliyyəti daxil olmaqla bir sıra cəlbedici xüsusiyyətlərə malikdir və buna görə də bitki seleksiyasında istifadə üçün çox perspektivlidir [6].

Müxtəlif genlərin sayta yönəldilmiş mutagenezi onların funksiyaları haqqında mühüm məlumat verə bilər. Multipleks strategiyaları tətbiq etməklə çoxlu genlərin/lokusların eyni vaxtda hədəflənməsi hüceyrədaxili siqnal yollarında fərdi genlərin rolunu müəyyən etmək üçün tədqiqatı təşviq edə və bitkilərdə mürəkkəb, multigenik aqronomik əlamətlərin mühəndisliyinə kömək edə bilər. CRISPR-Cas9 sisteminin üstünlük verilən istifadəsi gen funksiyasının tamamilə nokaut [6, 64], mikroRNT-nin yıxılması skrininqi [6] və cis- və transın funksional ayrılmasını təmin edə bilən genom redaktə sistemləri ilə müəyyən lokusların proqramlaşdırılmış redaktəsində misal ola bilər. -tənzimləyici elementlər/faktorlar yüksək dəqiqliklə [6]. CRISPR-Cas9 sisteminin digər perspektiv tətbiqi onun şərti allellərin formalaşmasında istifadəsi ola bilər, ölümcül genlərin funksiyasını öyrənmək üçün gen ifadəsinə məkan və zaman nəzarətini təmin edir. Cas9 və/və ya sgRNA-nın ifadəsi üçün induksiya olunan və ya toxuma-spesifik promotorların istifadəsi müəyyən bir toxumada, inkişaf mərhələsində və ya müxtəlif ətraf mühit şəraitində gen ifadəsinin tənzimlənməsi üçün vasitə ola bilər [6].

CRISPR-Cas sistemi endogen genlərin in vivo ifadəsini vizuallaşdırmaq üçün flüoresan zülallarla etiketlənməsi üçün geniş imkanlar açır. dCas9 etiketli flüoresandan istifadə edərək, bitki inkişafı zamanı genom dinamikasında dəyişikliklər/xromosom memarlıq dəyişiklikləri və onların ətraf mühitin stimullarına reaksiyası öyrənilə bilər. Bu texnologiyalar müxtəlif funksional aspektlərin öyrənilməsini xeyli asanlaşdıran xüsusi hüceyrə növlərinin seçilməsi üçün də istifadə oluna bilər [6]. dCas9-un istifadəsi endogen gen ifadəsini tənzimləmək üçün xüsusi genomik lokuslara aktivləşdirmə/repressiya effektor domenlərinin seçilməsi üçün yeni platforma təmin edə bilər.

Bundan əlavə, bu texnologiyalar bitkilərdə hüceyrə funksiyalarını tənzimləmək üçün yeni bir üsul kimi ortaya çıxan histon modifikasiyası və DNT metilasiyası üçün cavabdeh olan zülalların seçilməsi yolu ilə epigenomun redaktəsi işində uğurla istifadə edilə bilər [25]. Epigenetik tənzimləməni başa düşmək üçün CRISPR-Cas9 sistemi zənginləşdirilmiş kromatinə əlavə olunan zülalların müəyyən edilməsi üçün xromatinin hədəf sahələrinin zənginləşdirilməsi üçün də istifadə edilə bilər. Eyni şəkildə, CRISPR-Cas9 genlərin ifadəsini idarə edən xüsusi DNT ardıcıllığına bağlanan tənzimləyici zülalları müəyyən etmək üçün bir vasitə kimi istifadə edilə bilər.

6. Nəticə

Genom redaktə vasitələri funksional genomika, eləcə də məhsulun yaxşılaşdırılması üçün seçilən məşhur molekulyar vasitələrə çevrilir. Bu redaktə sistemlərinin bitki biologiyasının misli görünməmiş başa düşülməsi və sürətli və məqsədyönlü mutagenez və əlaqədar seleksiya vasitəsilə məhsul məhsuldarlığının artırılması üçün istifadə edildiyi bir çox nümunələr mövcuddur [102, 104]. Sadəlik, səmərəlilik, yüksək spesifiklik və multipleksləşmə qabiliyyəti kimi bir sıra cəlbedici xüsusiyyətlərinə görə burada təsvir edilən genomun redaktəsi texnologiyaları məhsul yetişdirmə üsulunu dəyişdirir və gələcək nəsil yetişdirilməsi üçün yol açır.

Maraqların toqquşması

Müəlliflər bildirirlər ki, bu məqalənin dərci ilə bağlı maraqların toqquşması yoxdur.

Təşəkkürlər

Müəlliflər Özbəkistan Elmlər Akademiyasına və Özbəkistanın Elm və Texnologiya Agentliyinə №-li Tədqiqat Qrantlarına görə təşəkkür edirlər. FA-F5-021 və FA-F5-025.

İstinadlar

  1. M. F. Singer, "Giriş və tarixi mənbə", in Genetika Mühəndisliyi, J. K. Setlow və A. Hollaender, Eds., cild. 1, səh. 1–13, Plenum, Nyu York, NY, ABŞ, 1979. Baxış: Google Scholar
  2. A. A. Nemudryi, K. R. Valetdinova, S. P. Medvedev və S. M. Zakian, “TALEN və CRISPR/Cas genom redaktə sistemləri: kəşf vasitələri,” Acta Naturae, cild. 6, yox. 22, səh. 19–40, 2014. Baxın: Google Scholar
  3. Y.-G. Kim, J. Cha və S. Chandrasegaran, "Hibrid məhdudlaşdırıcı fermentlər: sink barmaqlarının Fok I parçalanma domeninə birləşməsi," Amerika Birləşmiş Ştatları Milli Elmlər Akademiyasının Materialları, cild. 93, yox. 3, səh. 1156–1160, 1996. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  4. T. Gaj, C. A. Gersbach və C. F. Barbas III, “Genom mühəndisliyi üçün ZFN, TALEN və CRISPR/Cas əsaslı üsullar,” Biotexnologiyada meyllər, cild. 31, yox. 7, səh. 397–405, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  5. D. P. Weeks, M. H. Spalding və B. Yang, "Bitkilərdə hədəflənmiş gen və genomun redaktəsi üçün dizayner nüvələrinin istifadəsi" Bitki Biotexnologiyası Jurnalı, cild. 14, yox. 2, səh. 483–495, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  6. V. Kumar və M. Jain, “Bitki genomunun redaktəsi üçün CRISPR-Cas sistemi: irəliləyişlər və imkanlar,” Eksperimental Botanika Jurnalı, cild. 66, yox. 1, səh. 47–57, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  7. N. J. Sauer, J. Mozoruk, R. B. Miller və başqaları, “Dəqiq gen redaktəsi üçün oliqonukleotid yönümlü mutagenez” Bitki Biotexnologiyası Jurnalı, cild. 14, yox. 2, səh. 496–502, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  8. J. F. Li, J. E. Norville və J. Aach, “Multipleks və homolog rekombinasiya vasitəçiliyi ilə genomun redaktəsi ƏrəbidopsisNikotiana benthamiana bələdçi RNT və Cas9 istifadə edərək," Təbiət biotexnoloqu, cild. 31, yox. 8, səh. 688–691, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  9. M. Jinek, K. Chilinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna və E. Charpentier, "A adaptiv bakterial toxunulmazlıqda proqramlaşdırıla bilən ikili-RNT idarə olunan DNT endonukleaz" Elm, cild. 337, yox. 6096, səh. 816–821, 2012. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  10. B. Chen, J. Hu, R. Almeida et al., "Çoxlu genomik lokusların eyni vaxtda görüntülənməsi üçün CRISPR görüntüləmə alətlərinin Staphylococcus aureus Cas9 ilə genişləndirilməsi," Nuklein turşularının tədqiqi, cild. 44, yox. 8, səh. e75, 2016. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  11. S. W. Cho, S. Kim, J. M. Kim və J.-S. Kim, "Cas9 RNT ilə idarə olunan endonükleaz ilə insan hüceyrələrində hədəflənmiş genom mühəndisliyi" Təbiət Biotexnologiyası, cild. 31, yox. 3, səh. 230–232, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  12. A. Noman, M. Aqeel və S. He, “CRISPR-Cas9: Bitki genomunun keyfiyyət və kəmiyyət redaktəsi üçün alət,” Bitki Elmində Sərhədlər, cild. 7, yox. 2016, məqalə №. 1740, 2016. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  13. Y. Mao, H. Zhang, N. Xu, B. Zhang, F. Gou və J.-K. Zhu, "Bitkilərdə səmərəli genom mühəndisliyi üçün CRISPR-Cas sisteminin tətbiqi," Molekulyar Bitki, cild. 6, yox. 6, səh. 2008–2011, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  14. P. D. Hsu, D. A. Skott, J. A. Vaynşteyn və başqaları, “RNT ilə idarə olunan Cas9 nukleazlarının spesifikliyini hədəfləyən DNT,” Təbiət Biotexnologiyası, cild. 31, səh. 827–832, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  15. K. Osakabe, Y. Osakabe və S. Toki, “Xüsusi dizayn edilmiş sink barmaq nükleazlarından istifadə edərək Arabidopsisdə sayta yönəldilmiş mutagenez,” Amerika Birləşmiş Ştatları Milli Elmlər Akademiyasının Materialları, cild. 107, yox. 26, səh. 12034–12039, 2010. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  16. F. Zhang, M. L. Maeder, E. Unger-Wallaced et al., “Yüksək tezlikli hədəflənmiş mutagenez Arabidopsis thaliana sink barmaq nükleazlarından istifadə etməklə, Amerika Birləşmiş Ştatları Milli Elmlər Akademiyasının Materialları, cild. 107, yox. 26, səh. 12028–12033, 2010. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  17. J. A. Taunsend, D. A. Rayt, R. J. Uinfri və başqaları, “Mühəndisləşdirilmiş sink-barmaq nükleazlarından istifadə edərək bitki genlərinin yüksək tezlikli modifikasiyası,” Təbiət, cild. 459, yox. 7245, səh. 442–445, 2009. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  18. V. K. Shukla, Y. Doyon, J. C. Miller et al., "Zea mays bitki növlərində sink-barmaq nükleazlarından istifadə edərək dəqiq genom modifikasiyası," Təbiət, cild. 459, s. 437–441, 2009. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  19. M. Kristian, Y. Qi, Y. Zhang və D. F. Voytas, “Mühəndisləşdirilmiş TAL Effektor Nükleazlarından istifadə edərək Arabidopsis thaliana-nın hədəflənmiş mutagenezi,” G3: Genlər, Genomlar, Genetika, cild. 3, yox. 9, səh. 1697–1705, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  20. H. Zhang, F. Gou, J. Zhang et al., "TALEN-in vasitəçiliyi ilə hədəflənmiş mutagenez düyüdə çoxlu sayda irsi mutasiya yaradır," Bitki Biotexnologiyası Jurnalı, cild. 14, yox. 1, səh. 186–194, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  21. T. Li, B. Liu, M. H. Spalding, D. P. Weeks və B. Yang, "Yüksək effektiv TALEN əsaslı gen redaktəsi xəstəliyə davamlı düyü istehsal edir" Təbiət Biotexnologiyası, cild. 30, yox. 5, səh. 390–392, 2012. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  22. M. M. Mahfouz, L. Li, M. Piatek və başqaları, "Ximerik TALE-SRDX repressor proteinindən istifadə edərək hədəflənmiş transkripsiya repressiyası," Bitki molekulyar biologiyası, cild. 78, yox. 3, səh. 311–321, 2012. Baxın: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  23. J. Gao, G. Wang, S. Ma et al., "Nicotiana tabacumda CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə hədəflənmiş mutagenez," Bitki molekulyar biologiyası, cild. 87, yox. 1-2, səh. 99–110, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  24. L. Cong, F. A. Ran, D. Cox et al., “CRISPR/Cas sistemlərindən istifadə edərək multipleks genom mühəndisliyi,” Elm, cild. 339, yox. 6121, səh. 819–823, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  25. H. Puchta, “CRISPR/Cas-dan üç ölçüdə istifadə: sintetik bitki genomlarına, transkriptomlara və epigenomlara doğru” Bitki jurnalı, cild. 87, yox. 1, səh. 5–15, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  26. T. B. Jacobs, P. R. LaFayette, R. J. Schmitz və W. A. ​​Parrott, “CRISPR/Cas9 ilə soyada hədəflənmiş genom modifikasiyası,” BMC Biotexnologiyası, səh. 1–10, 2015. Baxın: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  27. R. Xu, R. Qin, H. Li və başqaları, “CRISPR-Cpf1 sistemindən istifadə edərək hədəflənmiş mutant düyü istehsalı,” Bitki Biotexnologiyası Jurnalı, cild. 14, səh. 1–5, 2016. Baxın: Google Scholar
  28. W. Z. Jiang, I. M. Henry, P. G. Lynagh, L. Comai, E. B. Cahoon və D. P. Weeks, "CRISPR/Cas9 gen redaktəsindən istifadə edərək, alloheksaploid, Camelina sativa toxumlarında yağ turşusu tərkibinin əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırılması," Bitki Biotexnologiyası Jurnalı, cild. 15, yox. 5, səh. 648–657, 2017. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  29. S. Soyk, N. A. Müller, S. J. Park və başqaları, “ÖZÜNDƏN budama 5G çiçəkləmə genindəki variasiya pomidorda gündüz neytrallığını və erkən məhsuldarlığı təşviq edir,” Təbiət Genetikası, cild. 49, yox. 1, səh. 162–168, 2017. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  30. J. Peng, D. E. Richards və N. M. Hartley, "Yaşıl inqilab genləri mutant gibberellin cavab modulyatorlarını kodlayır" Təbiət, cild. 400, yox. 6741, s. 256–261, 1999. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  31. Y. Osakabe, T. Vatanabe, S. S. Suqano və başqaları, “Bitkilərdə abiotik stress reaksiyalarını dəyişdirmək üçün CRISPR/Cas9 genomunun redaktəsinin optimallaşdırılması,” Elmi Hesabatlar, cild. 6, Məqalə ID 26685, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  32. Q. Shan, Y. Wang və J. Li, “CRISPR-Cas sistemindən istifadə edərək bitki bitkilərinin hədəflənmiş genom modifikasiyası,” Təbiət Biotexnologiyası, cild. 31, səh. 686–688, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  33. S. Svitashev, J. K. Young, C. Schwartz, H. Gao, S. C. Falco və A. M. Cigan, "Cas9 və bələdçi RNT-dən istifadə edərək qarğıdalıda hədəflənmiş mutagenez, dəqiq gen redaktəsi və sahəyə xüsusi gen daxil edilməsi," Bitki fiziologiyası, cild. 169, yox. 2, səh. 931–945, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  34. Y. Wang, X. Cheng və Q. Shan, "Hexaploid çörək buğdasında üç homoeoallelin eyni vaxtda redaktə edilməsi toz kifinə irsi müqavimət göstərir," Təbiət Biotexnologiyası, cild. 32, səh. 947–952, 2014. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  35. X. Ji, H. Zhang, Y. Zhang, Y. Wang və C. Gao, "Bitkilərdə DNT virusuna qarşı müqavimət göstərən CRISPR-Cas-a bənzər immun sisteminin yaradılması," Təbiət Bitkiləri, cild. 1, məqalə 15144, Maddə ID 15144, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  36. Z. Əli, A. Əbülfərəc, A. İdris, S. Əli, M. Taşkandi və M. M. Mahfouz, “Bitkilərdə CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə viral müdaxilə,” Genom Biologiyası, cild. 16, yox. 1, məqalə 238, 2015. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  37. N. J. Baltes, A. W. Hummel və E. Konecna, "CRISPR-Cas prokaryotik immun sistemi ilə geminiviruslara qarşı müqavimətin təmin edilməsi" Təbiət Bitkiləri, cild. 1, məqalə 15145, 2015. Baxın: Google Scholar
  38. D. Liu, X. Chen, J. Liu, J. Ye və Z. Guo, "Düyü ERF transkripsiya faktoru OsERF922 Magnaporthe oryzae və duz tolerantlığına qarşı müqaviməti mənfi tənzimləyir," Eksperimental Botanika Jurnalı, cild. 63, yox. 10, səh. 3899–3912, 2012. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  39. F. Wang, C. Wang, P. Liu və başqaları, "ERF transkripsiya faktoru geninin OsERF922-nin CRISPR/ Cas9-Targeted mutagenesis ilə təkmilləşdirilmiş düyü partlayış müqaviməti," PLoS BİR, cild. 11, yox. 4, Məqalə ID-si e0154027, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  40. J. Chandrasekaran, M. Brumin, D. Wolf et al., “CRISPR/Cas9 texnologiyasından istifadə edərək transgen olmayan xiyarda geniş virus müqavimətinin inkişafı,” Molekulyar bitki patologiyası, cild. 17, yox. 7, səh. 1140–1153, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  41. F. Zhang, Y. Wen və X. Guo, “Genomun redaktəsi üçün CRISPR/Cas9: Tərəqqi, təsirlər və problemlər,” İnsan molekulyar genetikası, cild. 23, yox. 1, səh. R40–R46, 2014. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  42. J. F. Petolino və J. P. Davies, "Xüsusiyyətlərin inkişafı üçün hazırlanmış transkripsiya tənzimləyiciləri" Bitki Elmi, cild. 201-202, №. 1, səh. 128–136, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  43. H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila et al., "CRISPR/Cas vasitəçiliyi ilə genom mühəndisliyi ilə çoxlu genlərdə mutasiyaları daşıyan siçanların bir addımlı nəsli" Hüceyrə, cild. 153, yox. 4, səh. 910–918, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  44. L. Lowder, A. Malzahn və Y. Qi, “Bitki genomunun redaktəsi üçün manifold CRISPR sistemlərinin sürətli təkamülü,” Bitki Elmində Sərhədlər, cild. 7, yox. 2016, məqalə №. 1683, 2016. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  45. D. G. Knorre və V. V. Vlasov, "Nuklein turşularının reaktiv törəmələri və onların komponentləri yaxınlıq reagentləri kimi" Rus Kimya Baxışları, cild. 54, yox. 9, səh. 836–851, 1985. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  46. N. J. Palpant və D. Dudzinski, “Sink barmaq nüvələri: Tərcümə istiqamətində baxırıq”. Gen terapiyası, cild. 20, yox. 2, səh. 121–127, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  47. R. Jankele və P. Svoboda, “TAL effektorları: DNATargeting üçün alətlər,” Funksional genomika üzrə brifinqlər, cild. 13, yox. 5, səh. 409–419, 2014. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  48. C. O. Pabo, E. Peisach və R. A. Grant, "Cys2His2 sink barmaq zülallarının dizaynı və seçimi," Biokimyanın İllik İcmalı, cild. 70, səh. 313–340, 2001. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  49. T. Cathomen və J. Keith Joung, "Sink-barmaq nüvələri: gələcək nəsil ortaya çıxır," Molekulyar terapiya, cild. 16, yox. 7, səh. 1200–1207, 2008. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  50. J. F. Petolino, "Təsdiqlənmiş sink barmaq nükleazları vasitəsilə bitkilərdə genomun redaktəsi," In Vitro Hüceyrə və İnkişaf Biologiyası - Bitki, cild. 51, yox. 1, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  51. N. P. Pavletich və C. O. Pabo, “Sink barmağı-DNT-nin tanınması: 2.1 -də Zif268-DNT kompleksinin kristal quruluşu”, Elm, cild. 252, yox. 5007, səh. 809–817, 1991. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  52. W. M. Ainley, L. Sastry-Dent, M. E. Welter və s., "Hədəflənmiş genomun redaktəsi ilə xüsusiyyətlərin yığılması," Bitki Biotexnologiyası Jurnalı, cild. 11, yox. 9, səh. 1126–1134, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  53. J. F. Petolino, A. Worden, K. Curlee və s., "Sink barmağının nükleaz vasitəçiliyi ilə transgenin silinməsi," Bitki molekulyar biologiyası, cild. 73, yox. 6, səh. 617–628, 2010. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  54. S. Schornack, A. Meyer, P. Römer, T. Jordan və T. Lahaye, “Nüvə hədəfli AvrBs3 kimi bakterial effektor zülallarının gen üçün vasitəçiliyi ilə tanınması,” Bitki Fiziologiyası Jurnalı, cild. 163, yox. 3, səh. 256–272, 2006. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  55. P. Römer, S. Hahn, T. Jordan, T. Strauß, U. Bonas və T. Lahaye, “Bibər Bs3 müqavimət geninin promotor aktivləşdirilməsi ilə vasitəçilik edilən bitki patogeninin tanınması,” Elm, cild. 318, yox. 5850, s. 645–648, 2007. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  56. J. Boch, H. Scholze, S.Schornack et al., "TAL-tip III effektorların DNT-yə bağlanma spesifikliyinin kodunun pozulması," Elm, cild. 326, yox. 5959, səh. 1509–1512, 2009. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  57. B. M. Lamb, A. C. Mercer və C. F. Barbas III, “Bütün 50 əsasın tanınması üçün TALE N-terminal domeninin istiqamətləndirilmiş təkamülü” Nuklein turşularının tədqiqi, cild. 41, yox. 21, səh. 9779–9785, 2013. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  58. M. Christian, T. Cermak, E. L. Doyle et al., “Targeting DNT double-strand breaks with TAL effector nucleases,” Genetika, cild. 186, yox. 2, səh. 757–761, 2010. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  59. L. Cong, R. H. Zhou, Y.-C. Kuo, M. Cunniff və F. Zhang, “Təbii TALE DNT-ni bağlayan modulların və transkripsiya repressor domenlərinin hərtərəfli sorğulanması,” Təbiət Əlaqələri, cild. 3, məqalə 968, 2012. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  60. M. L. Christian, Z. L. Demorest, C. G. Starker və başqaları, "TAL Effectors ilə G-nin hədəflənməsi: NN və NK təkrar dəyişən di-qalıqları ilə qurulmuş TALEN-lərin fəaliyyətlərinin müqayisəsi," PLoS BİR, cild. 7, yox. 9, Maddə ID-si e45383, 2012. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  61. J. Streubel, C. Bl࿌her, A. Landgraf və J. Boch, “TAL effektor RVD spesifiklikləri və səmərəliliyi,” Təbiət Biotexnologiyası, cild. 30, yox. 7, səh. 593–595, 2012. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  62. A. N.-S. Mak, P. Bradley, R. A. Cernadas, A. J. Bogdanove və B. L. Stoddard, "TAL effektoru PthXo1-in DNT hədəfinə bağlı kristal quruluşu" Elm, cild. 335, yox. 6069, səh. 716–719, 2012. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  63. J. Xiong, J. Ding və Y. Li, "Genom-redaktə texnologiyaları və onların bağçılıq bitkilərinin yetişdirilməsində potensial tətbiqi", Bağçılıq Tədqiqatı, cild. 2, məqalə 15019, 2015. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  64. İ.Y.Abduraxmonov, “Bitkilər və bitki növləri üçün genomika dövrü—Qəbul edilən və qarşıda duran vəzifələr” Bitki genomikası, I. Abdurahmonov, Ed., InTech, Xorvatiya, Balkanlar, 2016. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  65. CropLife International, “Oliqonukleotidlərə istiqamətlənmiş mutagenez (ODM),” LJournal, 2017. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  66. R. Barrangou, C. Fremaux və H. Deveau, "CRISPR prokaryotlarda viruslara qarşı qazanılmış müqavimət təmin edir" Elm, cild. 315, yox. 5819, səh. 1709–1712, 2007. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  67. E. Deltcheva, K. Chilinski, C. M. Sharma et al., "Trans-kodlaşdırılmış kiçik RNT və host faktor RNase III ilə CRISPR RNT olgunlaşması," Təbiət, cild. 471, yox. 7340, səh. 602–607, 2011. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  68. D. H. Haft, J. Selengut, E. F. Monqodin və K. E. Nelson, "Prokaryotik genomlarda 45 CRISPR ilə əlaqəli (Cas) zülal ailəsi və çoxsaylı CRISPR/cas alt tiplərindən ibarət bir gildiya mövcuddur," PLoS Hesablama Biologiyası, cild. 1, maddə e60, №. 6, s. 0474–0483, 2005. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  69. A. F. Gilles və M. Averof, “Hamı üçün funksional genetika: mühəndis nüvələri, CRISPR və gen redaktə inqilabı,” EvoDevo, cild. 5, yox. 1, maddə №. 43, 2014. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  70. J. A. Doudna və E. Charpentier, "CRISPR-Cas9 ilə genom mühəndisliyinin yeni sərhədi," Elm, cild. 346, yox. 6213, 2014. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  71. D. B. Graham və D. E. Root, "CRISPR gen redaktə təcrübələrinin dizaynı üçün resurslar", Genom Biologiyası, cild. 16, yox. 1, maddə №. 260, 2015. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  72. L. C. Perkin, S. L. Adrianos və B. Oppert, "Gen pozulma texnologiyaları saxlanılan məhsul həşərat zərərvericilərinə qarşı mübarizəni dəyişdirmək potensialına malikdir" həşəratlar, cild. 7, yox. 3, maddə №. 46, 2016. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  73. P. Perez-Pinera, D. G. Ousterout və C. A. Gersbach, "Hədəflənmiş genom redaktəsində irəliləyişlər", Kimyəvi Biologiyada Mövcud Rəy, cild. 16, yox. 3-4, səh. 268–277, 2012. Baxın: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  74. L. Chen, L. Tang, H. Xiang et al., "Genom redaktə texnologiyasında irəliləyişlər və onun təkamül və ekoloji tədqiqatlarda perspektivli tətbiqi," GigaScience, cild. 3, yox. 1, maddə №. 24, 2014. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  75. C. Kissoudis, C. van de Wiel, R. G. F. Visser və G. van der Linden, “Fizioloji və molekulyar qarşılıqlı əlaqənin parçalanması vasitəsilə birləşmiş abiotik və biotik stressə qarşı məhsulun davamlılığının artırılması,” Bitki Elmində Sərhədlər, cild. 5, yox. MAY, məqalə №. 207, 2014. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  76. L. Liu və X.-D. Fan, "CRISPR-Cas sistemi: genom mühəndisliyi üçün güclü bir alət," Bitki molekulyar biologiyası, cild. 85, yox. 3, səh. 209–218, 2014. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  77. M. Jain, “Bitkilərdə abiotik stressə dözümlülüyün funksiya genomikası: CRISPR yanaşması,” Bitki Elmində Sərhədlər, cild. 6, yox. MAY, məqalə №. 375, səh. 1–4, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  78. G. Andolfo, P. Iovieno, L. Frusciante və M. R. Ercolano, “Bitki xəstəliklərinə qarşı müqaviməti artırmaq üçün genomun redaktə texnologiyaları” Bitki Elmində Sərhədlər, cild. 7, yox. 2016, məqalə №. 1813, 2016. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  79. S. Khatodia, K. Bhatotia, N. Passricha, S. M. P. Khurana və N. Tuteja, “CRISPR/Cas genomu redaktə aləti: Bitkilərin yaxşılaşdırılmasında tətbiq”, Bitki Elmində Sərhədlər, cild. 7, yox. 2016, məqalə №. 506, 2016. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  80. R. C. Nongpiur, S. L. Singla-Pareek və A. Pareek, “Bitki bitkilərində duzluluq stresinə dözümlülüyün yaxşılaşdırılması üçün genomik yanaşmalar”, Mövcud genomika, cild. 17, yox. 4, səh. 343–357, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  81. V. Shukla, M. Gupta, F. Urnov, D. Guschin, M. Jan, and P. Bundock, "Targeted modifcation of malat dehydrogenase, 2013," WO Patent Publication Number: WO 2013166315 A1. Baxın: Google Scholar
  82. C. A. Hollender və C. Dardick, "Anjiosperm ağacının arxitekturasının molekulyar əsasları", Yeni Fitoloq, cild. 206, yox. 2, səh. 541–556, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  83. Y. Fang və B. M. Tyler, “CRISPR/Cas9 istifadə edərək oomycete Phytophthora sojae-də effektor genin effektiv pozulması və dəyişdirilməsi,” Molekulyar bitki patologiyası, cild. 17, yox. 1, səh. 127–139, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  84. G. E. Hastings və P. G. Wolf, "Albominin terapevtik istifadəsi" Ailə Təbabətinin Arxivi, cild. 1, yox. 2, səh. 281–287, 1992. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  85. Y. He, T. Ning, T. Xie və başqaları, "Transgen düyü toxumlarından funksional insan serum albuminin geniş miqyaslı istehsalı," Amerika Birləşmiş Ştatları Milli Elmlər Akademiyasının Materialları, cild. 108, yox. 47, səh. 19078–19083, 2011. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  86. M. Bosch və S. P. Hazen, "Liqnoselülozik xammallar: biokütlə keyfiyyətinin və məhsuldarlığının optimallaşdırılmasında tədqiqat tərəqqisi və problemlər," Bitki Elmində Sərhədlər, cild. 4, maddə №. 474, 2013. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  87. C. M. Lee, T. J. Cradick, E. J. Fine və G. Bao, "Hədəfdə aktivliyi maksimuma çatdırmaq və genomun redaktəsində hədəfdən kənar təsirləri minimuma endirmək üçün nüvə hədəfi saytı seçimi," Molekulyar terapiya, cild. 24, yox. 3, səh. 475–487, 2016. Baxın: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  88. Q. С. Cai, J. Miller, F. Urnov et al., "Optimallaşdırılmış qeyri-kanonik sink barmaq zülalları", ABŞ Patent nömrəsi: 9,187,758. Nəşr tarixi: 17 noyabr 2015-ci il. Baxış: Google Scholar
  89. A. Lombardo, D. Cesana, P. Genovese et al., “Dayanıqlı gen transferi üçün sayta xüsusi inteqrasiya və kaset dizaynının uyğunlaşdırılması,” Təbiət üsulları, cild. 8, yox. 10, səh. 861–869, 2011. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  90. T. Koo, J. Lee və J. Kim, “CRISPR-Cas9 daxil olmaqla, proqramlaşdırıla bilən nüvələrin hədəfdən kənar fəaliyyətlərinin ölçülməsi və azaldılması,” Molekullar və Hüceyrələr, cild. 38, yox. 6, səh. 475–481, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  91. Y. Gao və Y. Zhao, “Arabidopsisdə spesifik və irsi gen redaktəsi”, Amerika Birləşmiş Ştatları Milli Elmlər Akademiyasının Materialları, cild. 111, yox. 12, səh. 4357-4358, 2014. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  92. C. Nagamangala Kanchiswamy, D. J. Sargent, R. Velasco, M. E. Maffei və M. Malnoy, "Genetik cəhətdən dəyişdirilmiş meyvə bitkilərini gözləyirik" Biotexnologiyada meyllər, cild. 33, yox. 2, səh. 62–64, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  93. R.-F. Xu, H. Li, R.-Y. Qin və digərləri, “CRISPR/Cas9 sistemindən istifadə edərək sonrakı nəsillərdə irsi və “transgen təmiz” hədəflənmiş genom dəyişdirilmiş düyü nəsli,” Elmi Hesabatlar, cild. 5, Məqalə ID 11491, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  94. N. Podevin, Y. Devos, H. V. Davies və K. M. Nielsen, “Transgenik ya yox? Sadə cavab yoxdur! Yeni biotexnologiyaya əsaslanan bitki yetişdirmə üsulları və tənzimləyici mənzərə. EMBO Hesabatları, cild. 13, yox. 12, səh. 1057–1061, 2012. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  95. M. Araki və T. Ishii, "Genom redaktəsi ilə bitki yetişdirilməsinin sosial qəbuluna doğru" Bitki Elmində Trendlər, cild. 20, yox. 3, səh. 145–149, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  96. J. G. Schaart, C. C. M. van de Wiel, L. A. P. Lotz və M. J. M. Smulders, "Yeni bitki yetişdirmə texnikalarının məhsulları üçün imkanlar", Bitki Elmində Trendlər, cild. 21, yox. 5, səh. 438–449, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  97. J. W. Woo, J. Kim, S. I. Kwon və başqaları, "Ön yığılmış CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinləri olan bitkilərdə DNT-siz genomun redaktəsi," Təbiət Biotexnologiyası, cild. 33, yox. 11, səh. 1162–1164, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  98. F. Hartung və J. Schiemann, “Yeni genom redaktə üsullarından istifadə edərək dəqiq bitki yetişdirilməsi: AB-də imkanlar, təhlükəsizlik və tənzimləmə”, Bitki jurnalı, cild. 78, yox. 5, səh. 742–752, 2014. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  99. D. F. Voytas və C. Gao, "Dəqiq genom mühəndisliyi və kənd təsərrüfatı: imkanlar və tənzimləmə problemləri," PLoS biologiyası, cild. 12, yox. 6, səh. e1001877, 2014. Baxış: Publisher Site | Google Alim
  100. H. D. Jones, "Genomun redaktəsi ilə bağlı tənzimləyici qeyri-müəyyənlik" Təbiət Bitkiləri, cild. 1, Məqalə ID 14011, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  101. M. Lusser, C. Parisi, D. Plan, and E. Rodr'xedguez-Cerezo, "Bitki seleksiyasında yeni biotexnologiyaların tətbiqi", Təbiət Biotexnologiyası, cild. 30, yox. 3, səh. 231–239, 2012. Baxın: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  102. K. Belhaj, A. Chaparro-Garcia, S. Kamoun, N. J. Patron və V. Nekrasov, “CRISPR/Cas9 ilə bitki genomlarının redaktə edilməsi,” Biotexnologiyada Mövcud Rəy, cild. 32, səh. 76–84, 2015. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  103. J. D. Wolt, K. Wang və B. Yang, "Genomla redaktə edilmiş məhsulların tənzimləyici statusu", Bitki Biotexnologiyası Jurnalı, cild. 14, yox. 2, səh. 510–518, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  104. S. Huang, D. Weigel, R. N. Beachy və J. Li, "Genomla redaktə edilmiş məhsullar üçün təklif olunan tənzimləyici çərçivə", Təbiət Genetikası, cild. 48, yox. 2, səh. 109–111, 2016. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim

Müəllif hüququ

Müəllif hüququ © 2017 Venera S. Kamburova et al. Bu, Creative Commons Attribution License əsasında paylanmış açıq giriş məqaləsidir və orijinal əsərə düzgün istinad edildiyi təqdirdə istənilən mühitdə məhdudiyyətsiz istifadəyə, paylanmağa və çoxalmağa icazə verir.


Bitkilərdə Genom Redaktəsi: Alətlər və Tətbiqlərə Baxış.

1972-ci ildə Paul Berqin laboratoriyasında [1] rekombinant DNT texnologiyasının meydana çıxmasından sonra gen mühəndisliyi uzun bir yol keçmiş və böyük uğurlar qazanmışdır. Bir çox molekulyar və genetik mexanizmlər və hadisələr ətraflı şəkildə kəşf edilmiş və tədqiq edilmişdir və toplanmış biliklər indi tədqiqatçılara təcrübələri in vitroda çoxaltmağa imkan verir. Molekulyar genetika və bakteriya və virusların biokimyası sahəsində bir neçə onilliklər davam edən tədqiqatlar tədqiqatçılara müxtəlif vektor sistemləri və onların hüceyrəyə çatdırılması üçün alətlər yaratmaqla DNT ilə manipulyasiya etmək üçün yeni üsullar hazırlamağa imkan verdi. Bütün bu inkişaflar təkcə transgen mikroorqanizmlərin deyil, həm də müxtəlif bitki və bitki növləri daxil olmaqla, genetik cəhətdən dəyişdirilmiş ali orqanizmlərin uğurla yaradılmasına imkan verir. Genetik mühəndisliyin tətbiq sahəsi olan seleksiya və biotexnologiya üçün yeni vasitələrin yaradılması faydalı vasitələrin sürətləndirilmiş inkişafı ilə nəticələnən əhəmiyyətli diqqəti cəlb etmişdir. Bununla belə, adi gen mühəndisliyi strategiyasının bir neçə problemi və məhdudiyyətləri var, bunlardan biri ali bitkilərin böyük genomlarının manipulyasiyası ilə bağlı mürəkkəblikdir [2].

Hal-hazırda bitkilərin dəqiq genomunun redaktəsi problemlərinin həllinə kömək edən bir neçə vasitə alimlərin ixtiyarındadır. 1996-cı ildə ilk dəfə olaraq göstərildi ki, "sink barmaqları" kimi zülal domenləri, məsələn, Fokl endonükleaz domenləri ilə birləşərək, dəqiq müəyyən edilmiş bölgələrdə DNT-ni in vitro olaraq parçalayan xüsusi nükleazlar (sink barmaq nükleazları (ZFNs)) kimi fəaliyyət göstərir. [3]. Belə bir kimerik zülal modul quruluşa malikdir, çünki "sink barmağı" domenlərinin hər biri bir üçlü nukleotidləri tanıyır. Bu üsul becərilmiş hüceyrələrin, o cümlədən model və model olmayan bitkilərin redaktə edilməsi üçün əsas oldu [4, 5].

Davamlı səylər və araşdırmalar TALENlər (transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor nükleazlar) və CRISPR/Cas (müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrarlar) kimi yeni genom redaktə vasitələrinin inkişafına səbəb oldu. TALEN-lərin layihələndirilməsi hədəflərin hər biri üçün yeni zülalın yenidən qurulmasını tələb edir. Bununla belə, dizayn prosesi, dizayn üçün tələb olunan klonlaşdırmanı əhəmiyyətli dərəcədə azaldan təkrar birləşmələrin modullarını əlçatan etməklə bu yaxınlarda sadələşdirilmişdir. Digər tərəfdən, CRISPR-nin dizaynı və istifadəsi sadədir. Həm TALEN, həm də CRISPR sistemlərinin insan hüceyrələrində, heyvanlarda və bitkilərdə işlədiyi sübut edilmişdir. Bu cür redaktə sistemləri genomların səmərəli manipulyasiyası üçün istifadə edildikdə, mutant və transgen bitkilərin yaradılması da daxil olmaqla mürəkkəb problemləri həll edə bilərdi [12, 41]. Bundan əlavə, sink barmaq domenləri və digər zülalların aktivləşdirmə domenləri və TALE DNT-ni bağlayan domen və Cas9 nukleazına əsaslanan kimerik zülallar gen transkripsiyasının tənzimlənməsi, epigenomların öyrənilməsi və hüceyrə siklində xromosom yerlərinin davranışı üçün təcrübələrdə istifadə edilmişdir. [24, 42-44].

Bu icmalda biz müxtəlif genom redaktə sistemlərinin mexanizmlərini və onların məhsulun yaxşılaşdırılması üçün istifadəsini qısaca təsvir etdik, həmçinin mühəndis nüvələrinin çoxsaylı üstünlüklərini və tətbiqlərini, habelə mühəndis nüvələrinə əsaslanan texnologiyalardan istifadə etməklə yaradılan bitkilərin biotəhlükəsizliyi və tənzimləyici aspektlərini vurğuladıq.

2. Genom Redaktə Sistemlərinin Mexanizmləri

Mühəndisləşdirilmiş nukleaz (GEEN) texnologiyaları ilə genomun redaktəsi kimi də adlandırılan yeni genom redaktə vasitələri, hüceyrələrin irsi materialını uğurla dəyişdirmək üçün müəyyən yerlərdə DNT molekullarının parçalanmasına və yenidən birləşməsinə imkan verir. Bu məqsədlə, məhdudlaşdırıcı endonükleazlar və ligaza kimi xüsusi fermentlər bakterial və viral genomlar kimi kiçik genomlarda DNT molekullarının parçalanması və yenidən birləşməsi üçün istifadə edilə bilər. Bununla belə, məhdudlaşdırıcı endonükleazlar və ligazalardan istifadə edərək, bitki genomları da daxil olmaqla, ali orqanizmlərin böyük və mürəkkəb genomlarını manipulyasiya etmək olduqca çətindir. Problem ondadır ki, məhdudlaşdırıcı endonükleazlar yalnız nisbətən qısa DNT ardıcıllığını “hədəf” edə bilir. Qısa DNT virusları və bakteriyalar üçün belə spesifiklik kifayət etsə də, böyük bitki genomları ilə işləmək kifayət deyil. Mürəkkəb genomların redaktəsi üsullarının yaradılması üzrə ilk səylər hədəf DNT-nin strukturunda xüsusi ardıcıllıqla seçici şəkildə bağlana bilən və parçalana bilən kimyəvi qruplara malik olan oliqonukleotidlər (qısa nukleotid ardıcıllıqları) kimi "süni fermentlərin" dizaynı ilə bağlı olmuşdur. DNT [45].

Bu problemi həll etmək üçün məqsədyönlü yanaşma, bir və ya iki struktur vahidi olan kompleks zülallar olan, biri DNT-nin parçalanmasını kataliz edən, ikincisi isə hədəf molekulun spesifik nukleotid ardıcıllığına selektiv şəkildə bağlana bilən ximerik nukleazların dizaynı idi. bu sahəyə nukleaz hərəkəti (Cədvəl 1) [46, 47]. Bu kimerik nukleazlar birbaşa hüceyrədə "istehsal edilə bilər": bu məqsədlə, nukleazları kodlayan müvafiq şəkildə hazırlanmış vektorlar hüceyrəyə daxil edilməlidir. Bu cür vektorlar həmçinin nüvə lokalizasiyası siqnalı ilə təmin edilir ki, bu da nukleazın hüceyrə nüvəsinə daxil olmasına və bununla da genomik DNT-yə çıxış əldə etməyə imkan verir.

2.1. Sink Barmaq Nükleazları (ZFNs).ZFN-lər funksional Cys2-His2 sink barmaq (ZF) domeninin iş prinsiplərinin kəşfindən sonra işlənib hazırlanmış, kimerik şəkildə işlənmiş nükleazlardan istifadə edən genom redaktə vasitələrinin ilk nəsli idi [3, 4, 46, 48]. Hər Cys2-His2 ZF domeni [beta][beta][alfa] konfiqurasiyasına qədər qatlanmış 30 amin turşusu qalığından ibarətdir [48-50]. Kristaloqrafik struktur analizi göstərdi ki, Cys2-His2 ZF zülalları DNT-cüt spiralın əsas yivinə zülalın a-spiralını daxil etməklə DNT-yə bağlanır [51]. Hər bir ZF proteini DNT-də 3 tandem nukleotidi tanımaq qabiliyyətinə malikdir. Ümumiləşdirilmiş ZFN monomeri iki fərqli funksional sahədən ibarətdir: N-terminal bölgəsində süni ZF Cys2-His2 domeni və C-terminal bölgəsində qeyri-spesifik Fokl DNT parçalanma sahəsi. Fokl domeninin dimerləşməsi ZFN fermentativ fəaliyyəti üçün vacibdir [3]. Sink barmaq domenlərinin modul tanınmasının müvafiq, ardıcıl üç bp hədəfinə bir sıra kimi təqdim edilməsinin müşahidəsi, sink barmaqlarının fərdi domenlərinin hər birinin bir-birini əvəz edə biləcəyini və domenlərin sırasının manipulyasiyasının unikal nəticəyə gətirib çıxaracağını başa düşməyə imkan verdi. onları saxlayan zülallara spesifiklikləri bağlayır və bununla da genomda spesifik, unikal ardıcıllıqların hədəflənməsinə imkan verir. Məsələn, iki 3 və ya 4 ZF domenindən ibarət ZFN dimeri,

statistik olaraq əksər orqanizmlərin genomlarında unikal yerlər meydana gətirən 18 və ya 24 baza cütlüyünün hədəf ardıcıllığını tanıyır (Cədvəl 1).

ZFN-lərin dizaynı və tətbiqi modul dizaynı, yığılması və sink barmaqlarının spesifik hədəf DNT ardıcıllığına qarşı optimallaşdırılmasını, daha sonra fərdi ZF-lərin daha böyük ardıcıllıqların hədəflənməsi istiqamətində əlaqələndirilməsini əhatə edir. İllər ərzində çox sayda triplet nukleotidi tanımaq üçün sink barmaq domenləri yaradıldı. Bu, maraqların hədəf ardıcıllığının tanınmasına imkan verəcək ardıcıllıqla sink barmaqlarının seçilməsini və əlaqələndirilməsini təmin etdi.

1996-cı ildə sink barmaqları haqqında ilk hesabatdan bəri, onlar bitkilər də daxil olmaqla bir neçə orqanizmdə uğurla istifadə edilmişdir [4]. Nümunələrə Arabidopsisdə endogen genlərin məqsədyönlü inaktivasiyası [15, 16], tütün genlərinin yüksək tezlikli modifikasiyası [17] və herbisidlərə dözümlülük geninin dəqiq məqsədyönlü əlavə edilməsi, həmçinin qarğıdalıda hədəf lokusun daxil edilməsinin pozulması daxildir [18]. ZFN-lər qarğıdalıda əlamət yığmaq üçün də istifadə edilmişdir [52, 53].

Sink barmaq nükleazları maraq doğuran genomik yerləri manipulyasiya etmək qabiliyyətini nümayiş etdirərək genomun redaktəsi sahəsində inqilab etdi və həm əsas, həm də tətbiqi tədqiqatlar üçün qapıları açdı. ZFN-lər səmərəlilik, yüksək spesifiklik və minimal qeyri-məqsədli təsirlər baxımından digər vasitələrə nisbətən üstünlüklər təmin edir və cari səylər dizayn və çatdırılmanın daha da təkmilləşdirilməsinə, eləcə də onların müxtəlif maraq doğuran məhsullarda tətbiqlərinin genişləndirilməsinə yönəlib.

2.2. Transkripsiya Aktivatoruna Bənzər Effektor Nükleazları (TALENs). Hədəf genom DNT-nin səmərəli və seçici manipulyasiyası üçün axtarış, yeni genomun yaradılması üçün əsas olan tandem təkrarları dəsti vasitəsilə spesifik bitki promotorlarını tanıyan və aktivləşdirən unikal transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor (TALE) zülallarının müəyyən edilməsinə səbəb oldu. TALE nukleazları (TALENs) adlanan kimerik nukleazlardan ibarət redaktə sistemi [47]. TALE zülalları DNT-nin bağlanmasına cavabdeh olan mərkəzi domendən, nüvə lokalizasiya siqnalından və hədəf genin transkripsiyasının aktivatoru kimi xidmət edən domendən ibarətdir (Cədvəl 1) [54]. İlk dəfə bu zülalların DNT-ni bağlama qabiliyyəti 2007-ci ildə təsvir edilmişdir [55] və bir il sonra iki elmi qrup TALE zülalları ilə hədəf DNT ardıcıllığının tanınma kodunu deşifrə etmişlər [56].

Göstərilir ki, TALE monomerlərindəki DNT-ni bağlayan domen, öz növbəsində, DNT-nin bağlanmasını və ev sahibinin spesifikliyini təmin edən mərkəzi təkrar domendən (CRD) ibarətdir. CRD 34 amin turşusu qalıqlarının tandem təkrarlarından ibarətdir və CRD-dəki hər 34 amin turşusunun uzun təkrarı hədəf nukleotid ardıcıllığında bir nukleotidə bağlanır. 12 və 13-cü mövqelərdə yerləşən təkrar amin turşularından ikisi yüksək dəyişkəndir (təkrar dəyişən diresdue (RVD)) və diferensial effektivliklə bir neçə nukleotidin bağlanmasının degenerasiyası ilə spesifik nukleotidin tanınmasına cavabdehdir. Tanınma sahəsinin 3' ucunda nukleotidlə bağlanan sonuncu tandem təkrarı yalnız 20 amin turşusu qalığından ibarətdir və buna görə də yarım təkrar adlanır. TALE zülalları, ümumiyyətlə, hər hansı bir maraq doğuran DNT ardıcıllığını bağlamaq üçün dizayn edilə bilsə də, tədqiqatlar göstərmişdir ki, TALE zülalı ilə bağlanmış DNT ardıcıllığının 5'-ən çox nukleotid bazası həmişə Timidin olmalıdır və bu tələbdən sapma TALE transkripsiya faktorlarının (TALE-TF), TALE rekombinazlarının (TALE-R) və TALENlərin [57] effektivliyinə təsir göstərə bilər.

TALE zülalları tərəfindən DNT kodunun tanınması tələbləri sındırıldıqdan sonra görülən ilk cəhd kimerik TALEN nukleazlarının yaradılması oldu [5]. Bu məqsədlə, DNT-ni bağlayan TALE domenini kodlayan ardıcıllıq əvvəllər ZFN yaratmaq üçün istifadə edilmiş plazmid vektoruna daxil edilmişdir [58]. Bu, TALE-lərin DNT bağlayan domenini və FokI məhdudlaşdırıcı endonükleazın katalitik sahəsini ehtiva edən sintetik, kimerik ardıcıllıqla spesifik nukleaza genetik quruluşunun yaradılması ilə nəticələndi. Bu konstruksiya maraq doğuran istənilən nukleotid ardıcıllığını hədəfə ala bilən DNT bağlayan domen və müxtəlif RVD-lərə malik süni nükleazların yaradılmasına kömək etdi [2, 4].

Əksər tədqiqatlarda RVD Asn və Ile (NI), Asn və Gly (NG), iki Asn (NN) və His və Asp (HD) olan monomerlər müvafiq olaraq A, T, G və C nukleotidlərinə bağlanır. G-ni təyin edən ən çox yayılmış RVD olan NN-in də A-ya bağlandığı aşkar edilmişdir. Bu suboptimal və ya spesifikliyin olmaması DNT-ni hədəfləmək üçün hazırlanmış TALE-lərin istifadəsi ilə bağlı narahatlıq doğurur. Digər RVD NK, guaninin spesifikliyini nümayiş etdirsə də, NN ilə müqayisədə daha az funksional effektivliyə malikdir. Bir sıra tədqiqatlar həmçinin göstərmişdir ki, guaninin spesifik bağlanması üçün NH və ya NK RVD-lərin istifadəsi qeyri-məqsədli təsirlərin riskini azaldır [19, 59, 60]. Göstərilmişdir ki, RVD-də (NI, NG, NN və ya HD) birinci amin turşusu qalığı, istər N, istərsə də H olsun, bir nukleotidlə birbaşa bağlanmasa da, məkan konformasiyasının sabitləşməsinə cavabdehdir, halbuki ikinci amin turşusu qalığı ya azotlu əsaslarla (D və N amin turşuları olduqda) və ya van der Waals qüvvələri (I və G halda) ilə hidrogen əlaqəsi vasitəsilə bir nukleotidə bağlanır [61].

TALEN-lərin fəaliyyət tərzinə və spesifikliyinə əsaslanaraq, genomun istənilən yerində qoşa zəncir qırılmalarını tətbiq etmək mümkün olmalıdır, o şərtlə ki, bu yer TALEN-lərin DNT-ni bağlayan domenlərinə uyğun gələn tanınma ardıcıllığını özündə saxlayır. Həmçinin yerinə yetirilməli olan başqa bir şərt də var, yəni nəzərdə tutulan hədəf ardıcıllığın 5' sonuna qədər Timidinin olması tələbi, çünki DNT-nin N-terminal hissəsində W232 qalığının Bağlayıcı domen Timidin ilə qarşılıqlı əlaqədə olur və bağlanma səmərəliliyinə təsir göstərir [62]. Digər nukleotidləri bağlaya bilən TALEN N-terminal domeninin mutant variantlarını inkişaf etdirməklə bu 5' Timidin məhdudiyyətini aradan qaldırmaq da mümkündür [57]. TALEN sistemindən istifadə edərək sahəyə yönəldilmiş manipulyasiyanın asanlığını nəzərə alaraq, TALEN fəaliyyət rejiminin açılmasından sonra qısa müddət ərzində bu sistem tərəfindən dəyişdirilmiş genlər bir neçə heyvan və bitki növündə uğurla istifadə edilmişdir və bitki nümunələri arasında düyü daxildir. , buğda, Arabidopsis, kartof və pomidor (Cədvəl 2) [63].

2.3. Oliqonukleotidlərə istiqamətlənmiş mutagenez (ODM). Məməli sistemlərində ilk uğurlu istismardan sonra oliqonukleotidlə idarə olunan mutagenez (ODM) bitkilər üçün başqa bir yeni gen redaktə vasitəsinə çevrildi [7, 64]. Məqsədli mutagenez üçün alət olan ODM, ardıcıllığı genomdakı hədəf ardıcıllıqla eyni olan spesifik 20-100 əsaslı uzun oliqonukleotiddən istifadə edir, istisna olmaqla, o, tək əsas cüt dəyişikliyini ehtiva edir (mütəxəssislərə daxil edilməsi nəzərdə tutulan mutasiya). genom) gen/maraq ardıcıllığının sayta yönəldilmiş redaktəsinə nail olmaq üçün (Cədvəl 1) [65]. Bu sintetik oliqonukleotidlər və ya hədəf genin müəyyən bir bölgəsinə homoloji olan təmir şablonları müxtəlif spesifik çatdırılma üsullarından istifadə edərək bitki hüceyrələrinə müvəqqəti olaraq məruz qaldıqda, hədəflərə bağlanır və hüceyrənin təbii təmir mexanizmlərini aktivləşdirirlər. şablon və sonra təmir prosesi vasitəsilə həmin uyğunsuzluğu və ya mutasiyanı hədəf ardıcıllığına köçürür [7, 65]. Bu, bitki hüceyrəsi təmir şablonu oliqonukleotidi deqradasiya edərkən, yeni funksiya və ya əlamət verən bitki genomunda arzu olunan hədəflənmiş tək nukleotid və ya baza redaktəsini yaradır. Toxuma mədəniyyəti üsullarından istifadə edərək, ardıcıllığı dəyişdirilmiş hüceyrələr sonradan regenerasiya olunur və ənənəvi yetişdirmə yolu ilə təkmilləşdirilmiş əlamətlərə/xüsusiyyətlərə malik genomu redaktə edilmiş yeni növlər hazırlanır (Cədvəl 2) [7, 64, 65].

2.4. Kümelənmiş Müntəzəm Aralıqlı Qısa Palindromik Təkrarlar (CRISPR). Bu yaxınlarda ortaya çıxan və geniş populyarlıq qazanan başqa bir yeni genom redaktə sistemi qruplaşdırılmış müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrarlar (CRISPR)/CRISPR ilə əlaqəli (Cas) zülal sistemidir, ən görkəmlisi CRISPR/Cas9 (Cas9 zülalına əsaslanaraq). Bu, adaptiv bakterial və arxeal immun sistemindən istifadə edən bir üsuldur, onun mexanizmi bakterial genomda CRISPR lokusları adlanan xüsusi yerlərin mövcudluğuna əsaslanır. Bu lokuslar Cas9 zülalını kodlayan operonlardan və təkrar boşluq ardıcıllıqlarının təkrar massivindən ibarətdir. Təkrar massivdəki boşluqlar rekombinasiyadan sonra bakteriya genomuna inteqrasiya olunmuş xarici DNT-dən (viral və ya plazmid) əldə edilən qısa fraqmentlərdir [41, 66].

Kimerik TALEN zülallarından fərqli olaraq, CRISPR/Cas9 sistemi ilə hədəf ərazinin tanınması hədəf sahənin bələdçi (kodlaşdırılmayan) RNT və DNT ilə bələdçi RNT və Cas zülal kompleksi arasında tamamlayıcı ardıcıllığa əsaslanan qarşılıqlı əlaqə ilə həyata keçirilir. Cas9 endonükleazdan istifadə edərək ikiqat zəncirli DNT (Cədvəl 1) [9, 24, 67].

Müxtəlif bakteriyaların hüceyrələrində fəaliyyət göstərən CRISPR qoruyucu sistemlərinin bir neçə növü başqa yerdə ətraflı təsvir edilmişdir [68, 69]. Ən "məşhur" sistem Streptococcus pyogenes bakteriyasında tapılan və CRISPR RNT (crRNA), trans-aktivləşdirici crRNA (tracrRNA) və Cas9 zülalını kodlayan üç gendən ibarət olan CRISPR/Cas tip II-A sistemidir. Bu sistem əsasında CRISPR/Cas “genom redaktoru”nun süni elementlərini kodlayan universal genetik konstruksiyalar yaradılmışdır [70]. Həmçinin, sistemin CRISPR tracrRNA və qısa, yetkin crRNA-dan ibarət Cas9 zülalının kompleksi və tək istiqamətləndirici RNT kimi fəaliyyət göstərən sadələşdirilmiş versiyası yaradılmışdır. Bələdçi ardıcıllığı hədəf DNT yerini müəyyənləşdirir və tamamlayıcılığa əsaslanaraq ona bağlanır və Cas9 DNT-ni hədəf nöqtəsində parçalayır [71].

CRISPR sistemi mədəniyyətdə və canlı orqanizmlərdə yetişdirilən genetik cəhətdən dəyişdirilmiş hüceyrələrin yaradılması üçün istifadə edilə bilər [11]. Birinci halda hüceyrələrə CRISPR/Cas9 sistem elementlərinin yüksək və sabit sintezini təmin edən plazmidlər və ya virus vektorları daxil edilir. İkinci halda, genetik modifikasiya olunmuş bitkiləri əldə etmək üçün kultivasiya edilmiş protoplastlar və CRISPR/Cas elementlərini kodlayan plazmiddən istifadə edilir [32]. Bitkilər üçün tətbiq edilən başqa bir yanaşma CRISPR/Cas9 sistemini özündə saxlayan xüsusi plazmidi ehtiva edən təbii "gen mühəndisi" olan Agrobacterium-un istifadəsidir [41, 44].

Beləliklə, sadəliyi, səmərəliliyi və geniş imkanları sayəsində CRISPR/Cas9 sistemi qısa müddət ərzində fundamental və tətbiqi biologiyanın, biotexnologiyanın və gen mühəndisliyinin müxtəlif sahələrində istifadəsini tapmışdır.

2.5. Cleaved Genomik Saytların Təmiri. Genomun redaktə prosesində mühüm addım nükleazların yaratdığı DNT qırıqlığının təmiridir. DNT qırılması endogen hüceyrə mexanizmləri ilə bərpa olunur: qeyri-homoloji son birləşmə (NHEJ) və ya homologiyadan asılı (və ya yönəldilmiş) təmir (HDR) [14]. NHEJ, parçalanmış DNT-nin uclarının bir-birinə birləşdirildiyi ən sadə mexanizmdir, tez-tez nukleotidlərin (indellərin) daxil edilməsi və ya silinməsi ilə nəticələnir, bununla da genin oxunması çərçivəsini dəyişir, nəticədə genin “nokautu” [72]. İndellər müşahidə edilmirsə, DNT bərpa olunur və nəzərə çarpan dəyişikliklər yoxdur. Digər tərəfdən, HDR, hədəfə homologiya olan ardıcıllığın qırılma və ya DNT lezyonunu təmir etmək üçün şablon kimi istifadə edildiyi bir mexanizmdir. Buna görə də, kəsilmə nöqtəsinin hər iki tərəfinə homoloji olan ardıcıllıqla əhatə olunmuş arzu olunan maraq ardıcıllığını ehtiva edən şablon təqdim etməklə, həmin ardıcıllığın hədəf sayta daxil edilməsinə məcbur etmək olar. HDR meydana gəldikdə, genin bərpası və ya daxil edilməsi üçün yeni ardıcıllıqları təmin etmək üçün homoloji rekombinasiya istifadə olunur [72]. Bu üsul sadədir, DNT hədəfinə dəqiq təsir göstərir və demək olar ki, istənilən müasir molekulyar biologiya laboratoriyasında istifadə edilə bilər.

3. Genom Redaktə Sistemlərinin Praktik Tətbiqləri

3.1. Funksional genomika üçün "Genom redaktorlarının" tətbiqi. ZFN, TALEN, ODM və CRISPR/Cas genom redaktə sistemlərindən istifadə etməklə bir neçə müxtəlif növ genom modifikasiyasına nail olmaq olar (Cədvəl 2). Bunlara nöqtə mutasiyalarının yaradılması, xüsusi yerlərə yeni genlərin daxil edilməsi və ya nukleotid ardıcıllığının böyük hissələrinin silinməsi, fərdi genetik elementlərin və gen fraqmentlərinin korreksiyası və ya dəyişdirilməsi daxildir [4, 6,10, 20, 23, 44, 73] .

Alimlər bitki hüceyrələrində müxtəlif genomik elementlərə modifikasiyalar tətbiq edərkən və nəticələri araşdırarkən ayrı-ayrı hüceyrələrin və bütövlükdə orqanizmin fəaliyyətində ayrı-ayrı genlərin rolunu araşdıra bildilər. Məsələn, CRISPR/Cas9 sisteminin özünəməxsus DNT sahələrinə selektiv şəkildə bağlanma qabiliyyəti gen aktivliyini tənzimləməyə kömək etmişdir [24,41,44]. Bu məqsədlə, gen funksiyasını idarə edən promotorların fəaliyyətini aktivləşdirən və ya repressiya edən zülallar katalitik olaraq qeyri-aktiv mutant Cas9 zülalına birləşdirilə bilər. Bir nümunədə göstərilmişdir ki, hədəf DNT-yə kompleks bağlanma hədəf genin funksiyasını inhibə edə və ya stimullaşdıra bilər [44].

Bundan əlavə, CRISPR/Cas9 sistemindən istifadə edərək, müxtəlif genom sahələrinə yönəlmiş bir neçə genetik konstruksiya eyni vaxtda hüceyrələrə daxil edilə bilər [8, 24, 43]. Bu, əgər varsa, genlərarası qarşılıqlı əlaqənin tədqiqində xoş bir xüsusiyyətdir, çünki bir neçə gen eyni vaxtda CRISPR/Cas9 sistemindən təsirlənir [44]. Məsələn, bu yanaşmadan istifadə etməklə məhsulun əhliləşdirilməsi prosesində iştirak edən genləri müəyyən etmək mümkün olmuşdur [74].

3.2. Məhsulun yaxşılaşdırılmasında genom redaktə sistemlərinin tətbiqi. Genomun redaktəsi texnologiyaları müasir biotexnologiyanın ən vacib vəzifələrindən birinin həlli üçün geniş praktik tətbiqlərə malikdir - yüksək məhsuldar, abiotik və biotik stresslərə davamlı, həmçinin yüksək qida dəyərinə malik yeni bitki sortlarının yaradılması (Cədvəl 2). [31, 63, 75-80]. Bu məqsədlə bitki seleksiyasında (1) təbii SNP-lərə oxşar nöqtə mutasiyaları daxil etmək üçün genomun redaktə sistemi istifadə edilmişdir [26,27], (2) gen funksiyasına kiçik dəyişikliklər etmək [13], (3) xarici genlər, (4) gen piramidası və nokaut üçün və (5) gen ifadəsinin repressiyası və ya aktivləşdirilməsi, həmçinin (6) epigenetik redaktə [6].

Məsələn, Arabidopsis thaliana [1517] və Zea mays [18]-də ZFN-nin istifadəsi, herbisidlərə davamlı genlərin genomda hədəflənmiş ərazilərə daxil edilməsi yolu ilə herbisidlərə davamlı genotiplərin uğurlu inkişafına səbəb olmuşdur [18]. ZFN, həmçinin bitkilərdə endogen malat dehidrogenaz (MDH) geninin məqsədyönlü modifikasiyası üçün istifadə edilmişdir və modifikasiya olunmuş MDH ehtiva edən bitkilər artan məhsuldarlıq göstərmişdir [81]. ODM texnikası Cibus Rapid Trait Development System (RTDS) [7] vasitəsilə əhəmiyyətli dərəcədə inkişaf etdirilmişdir və bu texnologiya bir neçə məhsulda uğurla tətbiq edilmişdir. Tətbiqlər, bitki inkişafı üçün ənənəvi genetik mühəndislik yanaşmasında istifadə edildiyi kimi, herbisidlərə qarşı dözümlülük, həşəratlara qarşı müqavimət, inkişaf etmiş xəstəliklərə qarşı müqavimət (bakterial və viral), təkmilləşdirilmiş qida dəyəri və yad genlərin tətbiqi olmadan artırılmış məhsulu əhatə edir, lakin bununla məhdudlaşmır. [7, 65]. ODM RTDS texnologiyasından istifadə edərək CAC-ın TAC-a dəqiq redaktəsi nümayiş etdirildi ki, bu da GFP zülalında Histidini (H66) tirozinə (Y66) dəyişdirərək BEP-ni GFP-yə çevirir. Bu yanaşma bitkilər üçün qeyri-transgen yetişdirmə aləti təklif etmişdir [7, 64].

CRISPR/Cas9 texnologiyasından istifadə edərək, Jiang et al. [28] Camelina sativa toxumlarından təkmilləşdirilmiş yağ turşusu tərkibinə malik “biotexnologiya” yağı əldə etmişlər ki, bu da onu insan sağlamlığı üçün daha faydalı, oksidləşməyə daha davamlı və bioyanacaq da daxil olmaqla müəyyən kommersiya kimyəvi maddələrinin istehsalı üçün daha uyğun edir [28] . Soyk və b. [29] pomidorun SP5G geninin məqsədyönlü mutagenezindən istifadə edərək sürətli çiçək açan və daha yığcam kollu bitkilər yaratdılar ki, bu da öz növbəsində daha erkən məhsul əldə etdi. Başqa bir cəhddə Osakabe et al. [31], Arabidopsisdə OST2 geninin CRISPR səbəb olduğu mutagenezindən istifadə edərək, bitkilərə duz stresinə qarşı müqavimət göstərən yeni allellər əldə edə bildilər [31].

Gibberellin biosintezinin genom redaktə üsulları ilə modulyasiyası yüksək sıxlıqlı əkinlər və azaldılmış əmək xərcləri hesabına məhsuldarlığı artırmaq üçün böyük potensiala malik cırtdan meyvə ağaclarının [30] yaradılmasına imkan vermişdir. Bu, torpaq, su, pestisid və gübrə istifadəsinin azalması ilə nəticələnir [82]. Bundan əlavə, meyvələrin yetişmə prosesində [82] və ya onun siqnal yollarında çox mühüm rol oynayan etilen biosintezinin inhibə edilməsi üçün genomun redaktəsi uzun raf ömrü olan yeni sortların yaradılmasına imkan verir [63].

Bitki seleksiyasında genomun redaktəsi yanaşmalarının tətbiqinin əsas sahəsi müxtəlif patogenlərə və/və ya zərərvericilərə davamlı sortların yaradılmasıdır. Bu üsullar bir neçə məhsulda müxtəlif səviyyələrdə əsas bitki toxunulmazlıq mərhələlərinin modifikasiyası üçün istifadə edilmişdir. Bu məqsədə (1) həssaslıq genlərini (S-genləri), (2) müqavimət genlərini (R-genlərini), (3) effektor və hədəf arasındakı qarşılıqlı əlaqəni tənzimləyən genləri və (4) bitkini tənzimləyən genləri dəyişdirməklə nail olmaq olar. hormonal balans [78]. Məsələn, toz kif xəstəliyinə davamlı buğda genotipləri kif müqavimət lokusu O (MLO) üzərində TALEN və CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə genomun redaktəsi ilə əldə edilmişdir [34].Xanthomonas oryzae pv səbəb olduğu bakterial yarpaq zərərvericisinə davamlı bitkilər istehsal etmək üçün genomun redaktə texnologiyalarından da istifadə edilmişdir. oryzae [21].

CRISPR/Cas9 sistemi keçici transformasiya sistemindən istifadə etməklə geminiviruslara qarşı müdaxilənin təmin edilməsində effektivliyi üçün araşdırılmışdır ki, tək bələdçi RNT/Cas9 (sgRNA/Cas9) tərəfindən qıvrım üst virus genomunun N. benthamiana deqradasiyası/bastırılması nümayiş etdirilmişdir [ 35]. Pomidor sarısı yarpaq qıvrım virusu (TYLCV) və ya lobya sarı cırtdan virusu (BeYDV) ardıcıllığı üçün xüsusi sgRNA-ların Cas9 endonükleazını ifadə edən N. benthamiana bitkilərinə daxil edildiyi və müvafiq viruslarla sınaqdan keçirildiyi digər cəhdlərdə, CRISPR/Cas9 sistem yalnız deqradasiya üçün virusları hədəfləmədi, həm də sərbəst təkrarlanan virusların nüsxə sayına müdaxilə səbəbindən hədəf ardıcıllıqlarında mutasiyalar [36, 37] təqdim etdi [78].

Hormonal tarazlığı tənzimləyən metabolik yollar da bitkilərin immun sisteminin immunomodulyator komponentini gücləndirmək üçün genomun redaktə texnologiyalarından istifadə etməklə dəyişdirilə bilər. Buna etilenə cavab verən faktoru (ERF) deaktiv etməklə nail olmaq olar. Xüsusilə, düyüdə etilendən asılı yol CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə hədəf OsERF922 gen mutasiyaları ilə uğurla modifikasiya edilib və nəticədə Magnaporthe oryzae müqaviməti artıb [38, 39].

CRISPR/Cas9, Cucumis sativus-da virusların tərcüməsi üçün vacib olan eukaryotik tərcümənin başlanğıc faktorunu kodlayan eIF4E genini nokaut etmək üçün istifadə edilmişdir və bu nokaut xiyar damarlarının sararması virusu (CVYV), balqabaq sarısı mozaika virusu ( ZYMV) və papaya halqası ləkəli mozaika virusu-W (PRSV-W) [83]. Bundan əlavə, CRISPR/Cas9, patogenlik genini (Avr4/6) dəyişdirərək, soya paxlasının oomycete patogeni olan Phytophthora sojae-də genomun sürətli və effektiv redaktəsi üçün effektiv sistem olduğu nümayiş etdirildi və bununla da çox ehtiyac duyulan funksional imkanlar üçün yol açıb. genomika Phytophthora sojae-də bu patogenə nəzarət etmək üçün son məqsədə doğru işləyir [83].

Eynilə, mövcud genom redaktə üsulları, xüsusən, CRISPR/Cas9 metodu, herbisidlərə davamlı bitkilərin əldə edilməsi üçün uğurla istifadə edilmişdir [33]. Məsələn, qarğıdalıda ALS2 geninin redaktəsi (asetolaktat sintaza və ya ALS bitkilərdə amin turşularının biosintezində əsas fermentdir və sulfonilüre herbisidləri tərəfindən maneə törədilib) xlorsulfurona davamlı mutant qarğıdalı bitkisinin yaradılmasına imkan verdi [33].

CRISPR/Cas9 sisteminin əhəmiyyətli tətbiq olunduğu biotexnologiyanın digər maraqlı sahəsi şəkərli diabet xəstələri üçün lazım olan insulin kimi insan zülallarını və ya hemorragik şokun, yanıqların, hipoproteinemiyanın müalicəsində istifadə edilən albumin sintez edə bilən bitkilərin inkişafıdır. , və siroz [84]. Hal-hazırda albumin çox məhdud tədarükdə olan insan plazmasından hazırlanır, lakin albuminə qlobal tələbat durmadan artır və hazırda ildə 500 tona bərabərdir. Artan ehtiyacları ödəmək üçün insan albumin geni artıq genomik mühəndislik üsullarından istifadə edərək düyü genomuna daxil edilmişdir [85]. Belə ifadə olunmuş zülallar sintez olunduğu bitki və heyvan toxumalarından təcrid oluna və aydınlaşdırıldıqdan sonra tibbi məqsədlər üçün istifadə oluna bilər.

Beləliklə, yuxarıda təsvir olunduğu və burada geniş istinad edildiyi kimi, bu yeni genom redaktə üsulları yeni bioenerji məhsul inkişafları da daxil olmaqla məhsulun yaxşılaşdırılması məqsədilə geniş istifadə olunur [86]. Bununla belə, bu GEEN metodları ilə toxuma mədəniyyətinin istifadəsi genomun redaktəsi prosesini ləngidə bilən mürəkkəbliklər də yarada bilər.

4. Genom Redaktə Sistemlərinin Təhlükəsizlik Qiymətləndirilməsi Aspektləri

4.1. Hədəfsiz Effektlər. Genomun redaktə üsulları mahiyyət etibarilə yerli genomik quruluşu qoruyur və buna görə də məhsulun yaxşılaşdırılması üçün təhlükəsiz texnologiya hesab olunur. Bu ümumi anlayışa baxmayaraq, bu üsullardan istifadə etməklə yaradılan məhsulların biotəhlükəsizliyi ilə bağlı bəzi narahatlıqlar var. Onun biotəhlükəsizliyi baxımından əsas narahatlıqlardan biri, genomun redaktəsi zamanı sintetik nukleazların məqsədsiz təsirlərinin mümkünlüyüdür.

Genomun redaktə üsullarının biotexnoloji tətbiqi zamanı mühəndis nüvələrinin səmərəliliyi və spesifikliyi ən vacib iki funksional tələbdir və hədəf yerinin seçimi ilə sıx bağlıdır. Hər bir endogen genomik lokus üçün DNT parçalanmasının effektivliyi (həm hədəf, həm də qeyri-hədəf) təkcə nukleaz aktivliyindən (məsələn, Cas9 zülallarının FokI domenləri və Ruv domenləri) deyil, həm də hədəf sahəsinin mövcudluğundan və yaxınlığından asılıdır. DNT-ni bağlayan domen (məsələn, TAL effektor domenləri və bələdçi RNT, gRNA) hədəf ardıcıllığa. Mühəndisləşdirilmiş nukleazların spesifikliyi əsasən sink barmağının DNT-yə (ZFNs), TAL effektorunun DNT-yə (TALENs) bağlanması və qRNT-nin DNT ilə hibridləşməsi (CRISPR), FokI domeninin dimerləşməsi də daxil olmaqla, nukleaza-DNT-nin bağlanma yaxınlığından çox asılıdır. (ZFNs və TALENs) və Cas9-un protospacer bitişik motivinə (PAM) bitişik motivlə qarşılıqlı əlaqəsi də mühüm rol oynaya bilər [87]. ZFN-lər vəziyyətində, ZFN-ləri ehtiva edən kanonik C2H2 bağlayıcı domeninin bağlanma effektivliyi ilə bağlı nümunələr çox olsa da, C3H1 bağlama domenini ehtiva edənlər kimi qeyri-kanonik ZFN-lərin faydası ilə bağlı araşdırmalar yüksək səviyyəli bağlama effektivliyini nümayiş etdirdi [88].

Genom redaktə sistemlərinin məqsədsiz təsirlərini minimuma endirmək üçün mühüm aspekt əvvəlcədən bioinformatika analizini həyata keçirməklə ikiqat telli fasilələrin tətbiqi üçün yerlərin diqqətlə seçilməsidir [89]. İstənilən yerləri seçərkən təkrar ardıcıllığın yerlərindən və genomun digər bölgələri ilə yüksək homologiyaya malik olan yerlərdən qaçınmaq lazımdır. Bununla əlaqədar olaraq, nükleazlar üçün hədəf sahələrin seçilməsini və qeyri-hədəf effektlərin mövcudluğunun eksperimental yoxlanılmasını asanlaşdırmaq üçün nukleazların dizaynını və təsdiqini təmin edən bir neçə proqram paketi hazırlanmışdır [79, 87, 90].

4.2. Genom redaktəsi ilə yaradılmış bitkilərin tənzimlənməsi. Yeni genom redaktə sistemləri bitki genomuna sabit irsi nöqtə modifikasiyalarını daxil etməyə kömək edir və transgenik bölgə hədəf geni redaktə etdikdən sonra asanlıqla çıxarıla bilər. Bu, qeyri-transgen bitkilərin və təkmilləşdirilmiş məhsul sortlarının yaradılmasına imkan verir [22, 91-93]. Bu texnologiyalar ənənəvi yetişdirmə üsulları ilə müqayisədə daha sürətlidir və transgenin daxil edilməsini itirmiş null seqreqant xətləri əldə etməyə kömək edir [9497]. Genom redaktə texnologiyası ilə hazırlanmış hədəf mutasiyaları olan bitkilər klassik seleksiya yolu ilə əldə edilən bitkilərlə demək olar ki, eynidir və onların təhlükəsizliyi onların yaradılması üçün istifadə olunan proses deyil, nəticədə əldə edilən məhsul nəzərə alınmaqla qiymətləndirilməlidir [98-100]. Bu kontekstdə ODM-dən əldə edilən məhsullar bir çox hallarda ənənəvi yetişdirilmiş və ya ənənəvi mutagenez məhsullarından fərqlənmir, buna görə də belə məhsullar gen mühəndisliyi üsulları ilə yaradılan məhsullarla eyni şəkildə tənzimlənməməlidir [7, 65]. CRISPR-Cas9 sistemindən istifadə etməklə markersiz, yəni antibiotik müqavimətinin marker genləri olmadan gen-mühəndislik məhsulları əldə etmək mümkün olur [6, 100]. Beləliklə, genom redaktə sistemlərindən istifadə etməklə hazırlanmış, məqsədyönlü mutasiyalara malik yeni sortlar zamanı genetik modifikasiya olunmuş bitkilərin tənzimlənməsi üçün mövcud fəaliyyət qaydaları tətbiq edilməməlidir [92, 95, 99,100]. Hazırda genomun redaktə texnologiyaları GMO qanunvericiliyi kontekstində müxtəlif məsləhətçi və tənzimləyici orqanlar tərəfindən müzakirə olunur. Genom redaktə üsullarından istifadə etməklə əldə edilən mədəniyyətlər və bitkilər qeyri-genetik modifikasiya edilmiş hesab olunur [95, 99,101]. Avropa Komissiyasının genomun redaktə üsullarının tənzimləyici qeyri-müəyyənliyi haqqında hesabat dərc edəcəyi gözlənilir [100,102,103].

5. GEEN-lərin üstünlükləri və perspektivlərinin çoxluğu

Genom redaktə vasitələri bitki biologiyasında fundamental və tətbiqi tədqiqatlara əhəmiyyətli təsir göstərir [24, 43, 44, 73]. Gen/genom redaktəsinə sadələşdirilmiş yanaşma gen(lərin) funksional analizində bitki tədqiqatçıları üçün və kənd təsərrüfatı baxımından əhəmiyyətli bitkilərin genomlarına əsas genlərin inteqrasiyasında seleksiyaçılar üçün dəyərli alətdir. Genom redaktə sistemləri sadəlik, səmərəlilik, yüksək spesifiklik, minimal qeyri-məqsədli effektlər və multipleksləşmə qabiliyyəti daxil olmaqla bir sıra cəlbedici xüsusiyyətlərə malikdir və buna görə də bitki seleksiyasında istifadə üçün çox perspektivlidir [6].

Müxtəlif genlərin sayta yönəldilmiş mutagenezi onların funksiyaları haqqında mühüm məlumat verə bilər. Multipleks strategiyaları tətbiq etməklə çoxlu genlərin/lokusların eyni vaxtda hədəflənməsi hüceyrədaxili siqnal yollarında fərdi genlərin rolunu müəyyən etmək üçün tədqiqatı təşviq edə və bitkilərdə mürəkkəb, multigenik aqronomik əlamətlərin mühəndisliyinə kömək edə bilər. CRISPR-Cas9 sisteminin üstünlük verilən istifadəsi gen funksiyasının tamamilə nokaut [6, 64], mikroRNT-nin yıxılması skrininqi [6] və cis- və transın funksional ayrılmasını təmin edə bilən genom redaktə sistemləri ilə müəyyən lokusların proqramlaşdırılmış redaktəsində misal ola bilər. -tənzimləyici elementlər/faktorlar yüksək dəqiqliklə [6]. CRISPR-Cas9 sisteminin digər perspektiv tətbiqi onun şərti allellərin formalaşmasında istifadəsi ola bilər, ölümcül genlərin funksiyasını öyrənmək üçün gen ifadəsinə məkan və zaman nəzarətini təmin edir. Cas9 və/və ya sgRNA-nın ifadəsi üçün induksiya olunan və ya toxuma-spesifik promotorların istifadəsi müəyyən bir toxumada, inkişaf mərhələsində və ya müxtəlif ətraf mühit şəraitində gen ifadəsinin tənzimlənməsi üçün vasitə ola bilər [6].

CRISPR-Cas sistemi endogen genlərin in vivo ifadəsini vizuallaşdırmaq üçün flüoresan zülallarla etiketlənməsi üçün geniş imkanlar açır. dCas9 etiketli flüoresandan istifadə edərək, bitki inkişafı zamanı genom dinamikasında dəyişikliklər/xromosom memarlıq dəyişiklikləri və onların ətraf mühitin stimullarına reaksiyası öyrənilə bilər. Bu texnologiyalar müxtəlif funksional aspektlərin öyrənilməsini xeyli asanlaşdıran xüsusi hüceyrə növlərinin seçilməsi üçün də istifadə oluna bilər [6]. dCas9-un istifadəsi endogen gen ifadəsini tənzimləmək üçün xüsusi genomik lokuslara aktivləşdirmə/repressiya effektor domenlərinin seçilməsi üçün yeni platforma təmin edə bilər.

Bundan əlavə, bu texnologiyalar bitkilərdə hüceyrə funksiyalarını tənzimləmək üçün yeni bir üsul kimi ortaya çıxan histon modifikasiyası və DNT metilasiyası üçün cavabdeh olan zülalların seçilməsi yolu ilə epigenomun redaktəsi işində uğurla istifadə edilə bilər [25]. Epigenetik tənzimləməni başa düşmək üçün CRISPR-Cas9 sistemi zənginləşdirilmiş kromatinə əlavə olunan zülalların müəyyən edilməsi üçün xromatinin hədəf sahələrinin zənginləşdirilməsi üçün də istifadə edilə bilər. Eyni şəkildə, CRISPR-Cas9 genlərin ifadəsini idarə edən xüsusi DNT ardıcıllığına bağlanan tənzimləyici zülalları müəyyən etmək üçün bir vasitə kimi istifadə edilə bilər.

Genom redaktə vasitələri funksional genomika, eləcə də məhsulun yaxşılaşdırılması üçün seçilən məşhur molekulyar vasitələrə çevrilir. Bu redaktə sistemlərinin bitki biologiyasının misli görünməmiş başa düşülməsi və sürətli və məqsədyönlü mutagenez və əlaqədar seleksiya vasitəsilə məhsul məhsuldarlığının artırılması üçün istifadə edildiyi bir çox nümunələr mövcuddur [102, 104]. Sadəlik, səmərəlilik, yüksək spesifiklik və multipleksləşmə qabiliyyəti kimi bir sıra cəlbedici xüsusiyyətlərinə görə burada təsvir edilən genomun redaktəsi texnologiyaları məhsul yetişdirmə üsulunu dəyişdirir və gələcək nəsil yetişdirilməsi üçün yol açır.

Müəlliflər bildirirlər ki, bu məqalənin dərci ilə bağlı maraqların toqquşması yoxdur.

Müəlliflər Özbəkistan Elmlər Akademiyasına və Özbəkistanın Elm və Texnologiya Agentliyinə №-li Tədqiqat Qrantlarına görə təşəkkür edirlər. FA-F5-021 və FA-F5-025.

[1] M. F. Singer, "Giriş və tarixi fon", Genetika Mühəndisliyində, J. K. Setlow və A. Hollaender, Eds., cild. 1, səh. 1-13, Plenum, Nyu-York, NY, ABŞ, 1979.

[2] A. A. Nemudryi, K. R. Valetdinova, S. P. Medvedev və S. M. Zakian, "TALEN və CRISPR/Cas genom redaktə sistemləri: kəşf alətləri", Acta Naturae, cild. 6, yox. 22, səh. 19-40, 2014.

[3] Y.-G. Kim, J. Cha və S. Chandrasegaran, "Hibrid məhdudlaşdırıcı fermentlər: sink barmaqlarının Fok I parçalanma sahəsinə birləşmələri", Amerika Birləşmiş Ştatları Milli Elmlər Akademiyasının materialları, cild. 93, yox. 3, səh. 1156-1160, 1996.

[4] T. Gaj, C. A. Gersbach və C. F. Barbas III, "Genom mühəndisliyi üçün ZFN, TALEN və CRISPR/Cas əsaslı üsullar," Biotexnologiyada Trendlər, cild. 31, yox. 7, səh. 397-405, 2013.

[5] D. P. Weeks, M. H. Spalding və B. Yang, "Bitkilərdə hədəflənmiş gen və genomun redaktəsi üçün dizayner nükleazlarından istifadə", Plant Biotechnology Journal, cild. 14, yox. 2, səh. 483-495, 2016.

[6] V. Kumar və M. Jain, "The CRISPR-Cas system for plant genome editing: Advances and options", Journal of Experimental Botany, cild. 66, yox. 1, səh. 47-57, 2015.

[7] N. J. Sauer, J. Mozoruk, R. B. Miller və başqaları, "Dəqiq gen redaktəsi üçün oliqonukleotid yönümlü mutagenez", Plant Biotechnology Journal, cild. 14, yox. 2, səh. 496-502, 2016.

[8] J. F. Li, J. E. Norville və J. Aach, "Arabidopsis və Nicotiana benthamiana-da bələdçi RNT və Cas9 istifadə edərək multipleks və homolog rekombinasiya vasitəçiliyi ilə genomun redaktəsi," Nature Biotechnolog, cild. 31, yox. 8, səh. 688-691, 2013.

[9] M. Jinek, K. Chilinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna və E. Charpentier, "A programlanabilir dual-RNA-guided DNT endonuclease in adaptive bakterial immunitet", Elm, cild. 337, yox. 6096, səh. 816-821, 2012.

[10] B. Chen, J. Hu, R. Almeida et al., "Çoxlu genomik lokusların eyni vaxtda görüntülənməsi üçün Staphylococcus aureus Cas9 ilə CRISPR görüntüləmə alətlərinin genişləndirilməsi," Nucleic Acids Research, cild. 44, yox. 8, səh. e75, 2016.

[11] S. W. Cho, S. Kim, J. M. Kim və J.-S. Kim, "Cas9 RNT ilə idarə olunan endonükleaz ilə insan hüceyrələrində hədəflənmiş genom mühəndisliyi", Nature Biotechnology, cild. 31, yox. 3, səh. 230-232, 2013.

[12] A. Noman, M. Aqeel və S. He, "CRISPR-Cas9: Alət üçün keyfiyyət və kəmiyyət bitki genomunun redaktəsi," Frontiers in Plant Science, cild. 7, yox. 2016, məqalə №. 1740, 2016.

[13] Y. Mao, H. Zhang, N. Xu, B. Zhang, F. Gou və J.-K. Zhu, "Bitkilərdə səmərəli genom mühəndisliyi üçün CRISPR-Cas sisteminin tətbiqi", Molekulyar Bitki, cild. 6, yox. 6, səh. 2008-2011, 2013.

[14] P. D. Hsu, D. A. Scott, J. A. Weinstein et al., "RNT-guided Cas9 nucleases spesifikliyini hədəf alan DNT," Nature Biotechnol, cild. 31, səh. 827-832, 2013.

[15] K. Osakabe, Y. Osakabe və S. Toki, "Site-directed mutagenesis in Arabidopsis using custom-designed sinc barmaq nucleases," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States, vol. 107, yox. 26, səh. 12034-12039, 2010.

[16] F. Zhang, M. L. Maeder, E. Unger-Wallaced et al., "High tezlik targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using sinc barmaq nucleases", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States, vol. 107, yox. 26, səh. 12028-12033, 2010.

[17] J. A. Townsend, D. A. Wright, R. J. Winfrey et al., "Mühəndis edilmiş sink-barmaq nükleazlarından istifadə edərək bitki genlərinin yüksək tezlikli modifikasiyası," Nature, cild. 459, yox. 7245, səh. 442-445, 2009-cu il.

[18] V. K. Shukla, Y. Doyon, J. C. Miller et al., "Zea mays bitki növlərində sink-barmaq nukleazlarından istifadə edərək dəqiq genom modifikasiyası," Nature, cild. 459, səh. 437-441, 2009.

[19] M. Christian, Y. Qi, Y. Zhang və D. F. Voytas, "Targeted mutagenesis of Arabidopsis thaliana Use Engineered TAL Effector Nucleases", G3: Genlər, Genomlar, Genetika, cild. 3, yox. 9, səh. 1697-1705, 2013.

[20] H. Zhang, F. Gou, J. Zhang et al., "TALEN-in vasitəçiliyi ilə hədəflənmiş mutagenez düyüdə çoxlu sayda irsi mutasiya yaradır," Plant Biotechnology Journal, cild. 14, yox. 1, səh. 186-194, 2016.

[21] T. Li, B. Liu, M. H. Spalding, D. P. Weeks və B. Yang, "Yüksək effektiv TALEN əsaslı gen redaktəsi xəstəliyə davamlı düyü istehsal edir," Nature Biotechnology, cild. 30, yox. 5, səh. 390-392, 2012.

[22] M. M. Mahfouz, L. Li, M. Piatek et al., "Targeted transscriptional repression using a chimeric TALE-SRDX repressor protein," Plant Molecular Biology, cild. 78, yox. 3, səh. 311-321, 2012.

[23] J. Gao, G. Wang, S. Ma və başqaları, "Nicotiana tabacumda CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə hədəflənmiş mutagenez," Bitki Molekulyar Biologiyası, cild. 87, yox. 1-2, səh. 99-110, 2015.

[24] L. Cong, F. A. Ran, D. Cox et al., "Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas system", Science, cild. 339, yox. 6121, səh. 819-823, 2013.

[25] H. Puchta, "CRISPR/Cas-dan üç ölçüdə istifadə: sintetik bitki genomlarına, transkriptomlara və epigenomlara doğru", Plant Journal, cild. 87, yox. 1, səh. 5-15, 2016.

[26] T. B. Jacobs, P. R. LaFayette, R. J. Schmitz və W. A. ​​Parrott, "Targeted genome modifikasiyaları in soya ilə CRISPR/Cas9", BMC Biotechnology, səh. 1-10, 2015.

[27] R. Xu, R. Qin, H. Li et al., "Generation of targeted mutant rice using a CRISPR-Cpf1 system," Plant Biotechnology Journal, vol. 14, səh. 1-5, 2016.

[28] WZ Jiang, IM Henry, PG Lynagh, L. Comai, EB Cahoon, and DP Weeks, "CRISPR/Cas9 gen redaktəsindən istifadə edərək alloheksaploid, Camelina sativa toxumlarında yağ turşusu tərkibinin əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırılması," Bitki Biotexnologiyası Jurnalı , cild. 15, yox. 5, səh. 648-657, 2017.

[29] S. Soyk, N. A. Muller, S. J. Park et al., "Çiçəklənmə genindəki variasiya SELF PUNING 5G pomidorda gündüz neytrallığını və erkən məhsuldarlığı təşviq edir," Nature Genetics, cild. 49, yox. 1, səh. 162-168, 2017.

[30] J. Peng, D. E. Richards və N. M. Hartley, "Yaşıl inqilab genləri mutant gibberellin cavab modulyatorlarını kodlayır", Nature, cild. 400, yox. 6741, səh. 256-261, 1999-cu il.

[31] Y. Osakabe, T. Vatanabe, S. S. Suqano və başqaları, "Bitkilərdə abiotik stress reaksiyalarını dəyişdirmək üçün CRISPR/Cas9 genomunun redaktəsinin optimallaşdırılması," Scientific Reports, vol. 6, Maddə ID 26685, 2016.

[32] Q. Shan, Y. Wang, and J. Li, "Targeted genome modification of the crop plant using a CRISPR-Cas system," Nature Biotechnol, vol. 31, səh. 686-688, 2013.

[33] S. Svitashev, JK Young, C. Schwartz, H. Gao, SC Falco, and AM Cigan, "Targeted mutagenesis, dəqiq gen redaktoru və Cas9 və bələdçi RNT istifadə edərək qarğıdalıda sahəyə xüsusi gen daxil edilməsi," Bitki Fiziologiyası , cild. 169, yox. 2, səh. 931-945, 2015.

[34] Y. Wang, X. Cheng, and Q. Shan, "Hexaploid çörək buğdasında üç homoeoallelin eyni vaxtda redaktəsi toz kifinə qarşı irsi müqavimət göstərir," Nature Biotechnol, vol. 32, səh. 947-952, 2014.

[35] X. Ji, H. Zhang, Y. Zhang, Y. Wang və C.Gao, "Bitkilərdə DNT virusuna qarşı müqavimət göstərən CRISPR-Cas kimi immun sisteminin yaradılması," Təbiət Bitkiləri, cild. 1, maddə 15144, maddə ID 15144, 2015.

[36] Z. Əli, A. Əbülfərəc, A. İdris, S. Əli, M. Taşkandi və M. M. Mahfouz, "Bitkilərdə CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə viral müdaxilə," Genome Biology, cild. 16, yox. 1, maddə 238, 2015-ci il.

[37] N. J. Baltes, A. W. Hummel və E. Konecna, "CRISPR-Cas prokaryotik immun sistemi ilə geminiviruslara qarşı müqavimətin verilməsi," Təbiət Bitkiləri, cild. 1, maddə 15145, 2015.

[38] D. Liu, X. Chen, J. Liu, J. Ye və Z. Guo, "The düyü ERF transkripsiya faktoru OsERF922 mənfi Magnaporthe oryzae müqavimət və duz dözümlülük tənzimləyir," Eksperimental Botanika Jurnalı, cild. 63, yox. 10, səh. 3899-3912, 2012.

[39] F. Wang, C. Wang, P. Liu et al., "CRISPR/ Cas9-Targeted mutagenesis by CRISPR/ Cas9-Targeted mutagenesis by the ERF transkripsiya faktor gen OsERF922," PLoS ONE, cild. 11, yox. 4, Maddə ID-si e0154027, 2016.

[40] J. Chandrasekaran, M. Brumin, D. Wolf və başqaları, "CRISPR/Cas9 texnologiyasından istifadə edərək transgen olmayan xiyarda geniş virus müqavimətinin inkişafı," Molecular Plant Pathology, cild. 17, yox. 7, səh. 1140-1153, 2016.

[41] F. Zhang, Y. Wen, and X. Guo, "CRISPR/Cas9 for genome editing: Progress, implications and challenges", Human Molecular Genetics, vol. 23, yox. 1, səh. R40-R46, 2014.

[42] J. F. Petolino və J. P. Davies, "Xüsusiyyətlərin inkişafı üçün nəzərdə tutulmuş transkripsiya tənzimləyiciləri", Bitki Elmi, cild. 201-202, №. 1, səh. 128-136, 2013.

[43] H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila et al., "CRISPR/Cas vasitəçiliyi ilə genom mühəndisliyi ilə çoxlu genlərdə mutasiyalar daşıyan siçanların bir addımlı nəsli", Cell, cild. 153, yox. 4, səh. 910-918, 2013.

[44] L. Lowder, A. Malzahn, and Y. Qi, "Rapid evolution of manifold CRISPR system for plant genome editing", Frontiers in Plant Science, cild. 7, yox. 2016, məqalə №. 1683, 2016.

[45] D. G. Knorre və V. V Vlasov, "Nuklein turşularının reaktiv törəmələri və onların yaxınlıq reagentləri kimi komponentləri", Russian Chemical Reviews, cild. 54, yox. 9, səh. 836-851, 1985.

[46] N. J. Palpant və D. Dudzinski, "Sinc finger nucleases: Looking toward translation," Gen Therapy, vol. 20, yox. 2, səh. 121-127, 2013.

[47] R. Jankele və P. Svoboda, "TAL effectors: Tools for DNA-Targeting," Briefings in Functional Genomics, cild. 13, yox. 5, səh. 409-419, 2014.

[48] ​​C. O. Pabo, E. Peisach və R. A. Grant, "Cys2His2 sink barmaq zülallarının dizaynı və seçimi," Biochemistry İllik İcmalı, cild. 70, səh. 313-340, 2001.

[49] T. Cathomen və J. Keith Joung, "Sinc-finger nucleases: the next generation emerges", Molecular Therapy, vol. 16, yox. 7, səh. 1200-1207, 2008.

[50] J. F. Petolino, "Dizayn sink barmaq nükleazları vasitəsilə bitkilərdə genomun redaktəsi," In Vitro Hüceyrə və İnkişaf Biologiyası-Bitki, cild. 51, yox. 1, 2015.

[51] N. P. Pavletiç və C. O. Pabo, "Sink barmağı-DNT-nin tanınması: 2.1 A-da Zif268-DNT kompleksinin kristal quruluşu", Elm, cild. 252, yox. 5007, səh. 809-817, 1991.

[52] W. M. Ainley, L. Sastry-Dent, M. E. Welter et al., "Trait stacking via targeted genome editing", Plant Biotechnology Journal, cild. 11, yox. 9, səh. 1126-1134, 2013.

[53] J. F. Petolino, A. Worden, K. Curlee et al., "Sinc barmaq nükleaz vasitəçiliyi ilə transgenin silinməsi," Bitki Molekulyar Biologiyası, cild. 73, yox. 6, səh. 617-628, 2010.

[54] S. Schornack, A. Meyer, P. Romer, T. Jordan, and T. Lahaye, "Gene-for-gene-mediated recognition of nuclear-targeted AvrBs3-like bakterial effector proteins", Journal of Plant Physiology, cild 163, yox. 3, səh. 256-272, 2006.

[55] P. Romer, S. Hahn, T. Jordan, T. Straufi, U. Bonas və T. Lahaye, "Plant patogen tanınması vasitəçiliyi ilə bibər Bs3 müqavimət geninin promotor aktivləşdirilməsi", Elm, cild. 318, yox. 5850, səh. 645-648, 2007.

[56] J. Boch, H. Scholze, S. Schornack et al., "Breaking the code of DNT binding specificity of TAL-type III effectors," Science, cild. 326, yox. 5959, səh. 1509-1512, 2009.

[57] B. M. Lamb, A. C. Mercer və C. F. Barbas III, "Bütün 50 əsasın tanınması üçün TALE N-terminal sahəsinin yönləndirilmiş təkamülü", Nuklein Turşuları Tədqiqatı, cild. 41, yox. 21, səh. 9779-9785, 2013.

[58] M. Christian, T. Cermak, E. L. Doyle et al., "Targeting DNT double-strand breaks with TAL effector nucleases," Genetics, vol. 186, yox. 2, səh.757-761, 2010.

[59] L. Konq, R. H. Çjou, Y.-C. Kuo, M. Cunniff və F. Zhang, "Təbii TALE DNT bağlayan modulların və transkripsiya repressor domenlərinin hərtərəfli sorğulanması", Nature Communications, cild. 3, maddə 968, 2012.

[60] M. L. Christian, Z. L. Demorest, C. G. Starker və başqaları, "Targeting G with TAL Effectors: A Comparison of Activity of TALENs Constructed with NN and NK Repeat Variable Di-Residues," PLoS ONE, cild. 7, yox. 9, Maddə ID e45383, 2012.

[61] J. Streubel, C. Blucher, A. Landgraf, and J. Boch, "TAL effector RVD specificities and efficiities," Nature Biotechnology, cild. 30, yox. 7, səh. 593-595, 2012.

[62] A. N.-S. Mak, P. Bradley, R. A. Cernadas, A. J. Bogdanove və B. L. Stoddard, "TAL effektorunun PthXo1-in DNT hədəfinə bağlı kristal quruluşu", Elm, cild. 335, yox. 6069, səh. 716-719, 2012.

[63] J. Xiong, J. Ding, and Y. Li, "Genom-editing texnologiyaları və onların bağçılıq bitkilərinin yetişdirilməsində potensial tətbiqi", Bağçılıq Araşdırmaları, cild. 2, maddə 15019, 2015.

[64] I. Y. Abdurahmonov, "Genomics Era for Plants and Crop Species --Advances Made and Needed Tasks Ahead", Plant Genomics, I. Abdurahmonov, Ed., InTech, Xorvatia, Balkans, 2016.

[65] CropLife International, "Oliqonukleotidlərə istiqamətlənmiş mutagenez (ODM)," LJournal, 2017.

[66] R. Barrangou, C. Fremaux və H. Deveau, "CRISPR prokaryotlarda viruslara qarşı əldə edilmiş müqavimət təmin edir," Science, cild. 315, yox. 5819, səh. 1709-1712, 2007.

[67] E. Deltcheva, K. Cylinski, C. M. Sharma et al., "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNT and host factor RNase III," Nature, vol. 471, yox. 7340, səh. 602-607, 2011.

[68] D. H. Haft, J. Selengut, E. F. Monqodin və K. E. Nelson, "Prokaryotik genomlarda 45 CRISPR ilə əlaqəli (Cas) protein ailəsi və çoxsaylı CRISPR/cas alt tiplərindən ibarət gildiya," PLoS Computational Biology, cild. 1, maddə e60, №. 6, səh. 0474-0483, 2005.

[69] A. F. Gilles və M. Averof, "Funksional genetika hamı üçün: Engineered nucleases, CRISPR and the gen editing revolution", EvoDevo, cild. 5, yox. 1, maddə №. 43, 2014.

[70] J. A. Doudna və E. Charpentier, "CRISPR-Cas9 ilə genom mühəndisliyinin yeni sərhədi", Elm, cild. 346, yox. 6213, 2014.

[71] D. B. Graham və D. E. Root, "CRISPR gen redaktə təcrübələrinin dizaynı üçün resurslar," Genome Biology, cild. 16, yox. 1, maddə №. 260, 2015.

[72] L. C. Perkin, S. L. Adrianos və B. Oppert, "Gen pozulma texnologiyaları saxlanılan məhsul həşərat zərərvericilərinə qarşı mübarizəni dəyişdirmək potensialına malikdir," Insects, vol. 7, yox. 3, maddə №. 46, 2016.

[73] P. Perez-Pinera, D. G. Ousterout və C. A. Gersbach, "Advances in targeted genom editing", Current Opinion in Chemical Biology, cild. 16, yox. 3-4, səh. 268-277, 2012.

[74] L. Chen, L. Tang, H. Xiang et al., "Advances in genom editing texnologiyası və onun təkamül və ekoloji tədqiqatlarda perspektivli tətbiqi", GigaScience, cild. 3, yox. 1, maddə №. 24, 2014.

[75] C. Kissoudis, C. van de Wiel, R. G. F. Visser və G. van der Linden, "Fizioloji və molekulyar çarpışmanın parçalanması vasitəsilə birləşmiş abiotik və biotik stressə qarşı məhsulun davamlılığının artırılması," Frontiers in Plant Science, cild. 5, yox. MAY, məqalə №. 207, 2014.

[76] L. Liu və X.-D. Fan, "CRISPR-Cas sistemi: Genom mühəndisliyi üçün güclü alət", Bitki Molekulyar Biologiya, cild. 85, yox. 3, səh. 209-218, 2014.

[77] M. Jain, "Function genomics of abiotic stress tolerance in Bitkilərdə: A CRISPR yanaşması," Frontiers in Plant Science, cild. 6, yox. MAY, məqalə №. 375, səh. 1-4, 2015.

[78] G. Andolfo, P. Iovieno, L. Frusciante və M. R. Ercolano, "Bitki xəstəliklərinə qarşı müqavimətin artırılması üçün genomu redaktə edən texnologiyalar", "Frontiers in Plant Science", cild. 7, yox. 2016, məqalə №. 1813, 2016.

[79] S. Khatodia, K. Bhatotia, N. Passricha, S. M. P. Khurana, and N. Tuteja, "The CRISPR/Cas genome-editing tool: Application in improvement of crops," Frontiers in Plant Science, cild. 7, yox. 2016, məqalə №. 506, 2016.

[80] R. C. Nongpiur, S. L. Singla-Pareek və A. Pareek, "Bitki bitkilərində duzluluq stresinə dözümlülüyün yaxşılaşdırılması üçün genomik yanaşmalar", Current Genomics, cild. 17, yox. 4, səh. 343-357, 2016.

[81] V. Shukla, M. Gupta, F. Urnov, D. Guschin, M. Jan və P. Bundock, "Targeted modification of malat dehydrogenase, 2013." WO Patent Nəşr Nömrəsi: WO 2013166315 A1.

[82] C. A. Hollender və C. Dardick, "Angiosperm ağacının arxitekturasının molekulyar əsasları", Yeni Fitoloq, cild. 206, yox. 2, səh. 541-556, 2015.

[83] Y. Fang və B. M. Tyler, "CRISPR/Cas9 istifadə edərək oomycete Phytophthora sojae-də effektor genin effektiv pozulması və dəyişdirilməsi", Molekulyar Bitki Patologiyası, cild. 17, yox. 1, səh. 127-139, 2016.

[84] G. E. Hastings və P. G. Wolf, "Therapeutic Use of Albumin," Archives of Family Medicine, cild. 1, yox. 2, səh 281-287, 1992.

[85] Y. He, T. Ning, T. Xie et al., "Transgenik düyü toxumlarından funksional insan serum albumininin geniş miqyaslı istehsalı," Amerika Birləşmiş Ştatları Milli Elmlər Akademiyasının materialları, cild. 108, yox. 47, səh. 19078-19083, 2011.

[86] M. Bosch və S. P. Hazen, "Liqnoselülozik xammal ehtiyatları: Biokütlə keyfiyyətinin və məhsuldarlığın optimallaşdırılmasında tədqiqatın gedişi və çətinliklər", Bitki Elmində Sərhədlər, cild. 4, maddə №. 474, 2013.

[87] C. M. Lee, T. J. Cradick, E. J. Fine və G. Bao, "Hədəfdə aktivliyi maksimuma çatdırmaq və genomun redaktəsində hədəfdən kənar təsirləri minimuma endirmək üçün nüvə hədəfi saytı seçimi," Molecular Therapy, cild. 24, yox. 3, səh. 475-487, 2016.

[88] Q. C. Cai, J. Miller, F. Urnov et al., "Optimallaşdırılmış qeyri-kanonik sink barmaq zülalları", ABŞ Patent Nömrəsi: 9,187,758. Nəşr tarixi: 17 noyabr 2015-ci il.

[89] A. Lombardo, D. Cesana, P. Genovese et al., "Dayanıqlı gen transferi üçün sayta xüsusi inteqrasiya və kaset dizaynının uyğunlaşdırılması," Nature Methods, vol. 8, yox. 10, səh. 861-869, 2011.

[90] T. Koo, J. Lee və J. Kim, "Ölçülməsi və proqramlaşdırıla bilən nukleazların hədəfdən kənar fəaliyyətlərinin azaldılması, o cümlədən CRISPR-Cas9," Molecules and Cells, vol. 38, yox. 6, səh. 475-481, 2015.

[91] Y. Gao və Y. Zhao, "Arabidopsisdə spesifik və irsi gen redaktəsi", Amerika Birləşmiş Ştatları Milli Elmlər Akademiyasının materialları, cild. 111, yox. 12, səh. 4357-4358, 2014.

[92] C. Nagamangala Kanchiswamy, D. J. Sargent, R. Velasco, M. E. Maffei və M. Malnoy, "Looking səbirsizliklə genetik cəhətdən dəyişdirilmiş meyvə bitkiləri", Trends in Biotechnology, cild. 33, yox. 2, səh. 62-64, 2015.

[93] R.-F. Xu, H. Li, R.-Y. Qin və digərləri, "CRISPR/Cas9 sistemindən istifadə edərək sonrakı nəsillərdə irsi və "transgen təmiz" hədəflənmiş genom dəyişdirilmiş düyü nəsli," Scientific Reports, cild. 5, Maddə ID 11491, 2015.

[94] N. Podevin, Y. Devos, H. V. Davies və K. M. Nielsen, "Transgenik ya yox? Sadə cavab yoxdur! Yeni biotexnologiyaya əsaslanan bitki yetişdirmə üsulları və tənzimləyici mənzərə," EMBO Hesabatları, cild. 13, yox. 12, səh. 1057-1061, 2012.

[95] M. Araki və T. İşii, "Genom redaktəsi ilə bitki yetişdirilməsinin sosial qəbuluna doğru", Bitki Elmində Trendlər, cild. 20, yox. 3, səh. 145-149, 2015.

[96] J. G. Schaart, C. C. M. van de Wiel, L. A. P. Lotz və M. J. M. Smulders, "Opportunities for Products of New Plant Breeding Techniques", Trends in Plant Science, cild. 21, yox. 5, səh. 438-449, 2016.

[97] J. W. Woo, J. Kim, S. I. Kwon et al., "Ön yığılmış CRISPR-Cas9 ribonukleoproteinləri olan bitkilərdə DNT-siz genomun redaktəsi," Nature Biotechnology, cild. 33, yox. 11, səh. 1162-1164, 2015.

[98] F. Hartung və J. Schiemann, "Yeni genom redaktə üsullarından istifadə edərək dəqiq bitki yetişdirilməsi: AB-də imkanlar, təhlükəsizlik və tənzimləmə", Plant Journal, cild. 78, yox. 5, səh.742-752, 2014.

[99] D. F. Voytas və C. Gao, "Dəqiq genom mühəndisliyi və kənd təsərrüfatı: imkanlar və tənzimləyici problemlər," PLoS biology, cild. 12, yox. 6, səh. e1001877, 2014.

[100] H. D. Jones, "Genomun redaktəsi üzərində tənzimləyici qeyri-müəyyənlik", Nature Plants, cild. 1, Maddə ID 14011, 2015.

[101] M. Lusser, C. Parisi, D. Plan, and E. Rodriguez-Cerezo, "Deployment of new biotechnologies in bitki seleksiyası", Nature Biotechnology, cild. 30, yox. 3, səh. 231-239, 2012.

[102] K. Belhaj, A. Chaparro-Garcia, S. Kamoun, N. J. Patron və V Nekrasov, "Editing plant genoms with CRISPR/Cas9," Current Opinion in Biotechnology, cild. 32, səh. 76-84, 2015.

[103] J. D. Wolt, K. Wang və B. Yang, "The regulatory status of genomed edited crops," Plant Biotechnology Journal, cild. 14, yox. 2, səh. 510-518, 2016.

[104] S. Huang, D. Weigel, R. N. Beachy, and J. Li, "A proposed regulatory framework for genom-edited crops," Nature Genetics, vol. 48, yox. 2, səh. 109-111, 2016.

Venera S. Kamburova, (1) Elena V. Nikitina, (1) Şuxrat E. Şermatov, (1) Zabardast T. Buriev, (1) Siva P. Kumpatla, (2) Çandrakanth Emani, (3) İbroxim Y. Abduraxmonov (1)

(1) Genomika və Bioinformatika Mərkəzi, Özbəkistan Respublikası Elmlər Akademiyası, Universitet küçəsi-2, Qibray rayonu, 111215 Daşkənd, Özbəkistan


Metodlar

Bioloji material

Altı giriş İerasium altcins Pilosella bu tədqiqatda istifadə edilmişdir: Hieracium piloselloides (D36), Hieracium praealtum (R35), Hieracium pilosella (S36), m115m134, bunlar R35-dən [16] və D18-dən D36-dan nadir meiotik olaraq azalmış yumurtanın partenogenezi ilə əldə edilmişdir [15, 18, 30]. Növlərin əsas xromosom sayı var n = 9. Genom ölçüsünün orta 2C dəyərləri diploidlərdə 7,03 pg ilə tetraploid birləşmələrdə 16,67 arasında dəyişir [67]. apomiktik növləri İerasium D36 və R35 daxilində süni intellekt hüceyrələrini əmələ gətirən və mayalanmadan müstəqil toxum əmələ gəlməsinə məruz qalan yumurtalıqların nisbəti fakultativdir.

müvafiq olaraq 99 % [15, 20]. Bitkilərin klonal bütövlüyünü qorumaq üçün vegetativ yolla mikroçoğaldılar. Bitki böyümə şərtləri və AI fenotipləmə üsulları daha əvvəl təsvir edilmişdir [18, 24]. Peyvənd daha əvvəl təsvir edildiyi kimi həyata keçirildi [44, 68]. Çiçəkləndikdən sonra peyvənd edilmiş qönçədə əmələ gələn yumurtalıqlar fiksasiya edilmiş, təmizlənmiş və ovüldə genişlənmiş AI-yə bənzər hüceyrələrin olub-olmaması üçün kapitulumun 4 və 10-cu mərhələlərində vurulmuş və apomiksisi başlatma qabiliyyəti müəyyən edilmişdir. Embrion kisəsinin abort dərəcəsi də qeydə alınıb. LOA267.14 BAC zondu ilə xromosomların yayılması və flüoresan in situ hibridləşməsi (FISH) əvvəllər təsvir edildiyi kimi həyata keçirilmişdir [19].

D18 genomik DNT ardıcıllığı və yığılması

FISH təcrübələri D18-in 18 xromosomdan ibarət olduğunu təsdiqlədi LOA-konservləşdirilmiş xromosomla birlikdə daşıyıcı LOA-əlaqəli markerlər [17]. D18 genomik DNT [69]-da təsvir edilən nüvə DNT zənginləşdirmə metodunun (Protokol C) uyğunlaşdırılmasından istifadə etməklə yarpaqlardan çıxarılmışdır. D18 genom DNT-nin işıqlandırma ardıcıllığı Avstraliya Genom Tədqiqat Mexanizmi tərəfindən HiSeq 2000 sistemindən istifadə edərək 2 × 100 bp qısa əlavə (SI) qoşalanmış uc və 2 × 100 bp standart daxiletmə qoşalaşmış uc ardıcıllığının birləşməsindən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir.

SI dəsti 180 bp ətrafında paylanmış fraqment uzunluqları yaratdı, buna görə də fraqmentin hər iki ucundan 100 bp cütləşmiş ardıcıllığın oxunmasına imkan verdi. Montajdan əvvəl, adapter və/və ya vektorla çirklənmiş ardıcıllıqları, N-dən ibarət ardıcıllıqları, artıq dəqiq dublikat oxunan cütləri və verilənlər bazasındakı digər ardıcıllıqla əsaslı şəkildə üst-üstə düşməyən təcrid olunmuş ardıcıllıqları çıxarmaq üçün genomik oxunuşlar əvvəlcədən işlənmişdir. SI oxunuşları üst-üstə düşən SI oxunuşlarını birləşdirmək üçün əlavə addımda işlənmişdir. DNT ardıcıllığından emal edilmiş oxunuşlar BioKanga montaj alqoritmi (https://sourceforge.net/projects/biokanga/) istifadə edərək yığılmışdır.

Yaranan genomik kontiglər AUGUSTUS gen modeli proqnozlaşdırma alqoritmi ilə ehtimal olunan gen bölgələri üçün şərh edildi, pomidor təlim növü kimi qismən proqnozlar və UTR proqnozlarına imkan verir [70]. Həm bütövlükdə genomik resurs, həm də tərcümə edilmiş proqnozlaşdırılan gen ardıcıllığı, məlum protein ardıcıllığı dəstlərinə uyğunlaşdırmalarla əlavə olaraq şərh edilmişdir. Ərəbidopsis (TAIR10), pomidor (ITAG2.4), düyü (MSU7), sorqo (Phytozome10 Sbicolor2.1), Physcomitrella patens (Phytozome10 PPatens3.0), Zea mays (Phytozome10 Zmays6a) və kahı ESTs (Milli Biotexnologiya Məlumat Mərkəzi, NCBI). Zülal ardıcıllıqlarına uyğunlaşdırmalar tələb olunduqda blastp və ya tblastn istifadə edilməklə tamamlandı, genomik EST-yə uyğunlaşmalar isə xüsusi Blat kimi alqoritmdən, Blitzdən (https://sourceforge.net/projects/biokanga/) istifadə edildi. Proqnozlaşdırılan D18 zülal ardıcıllıqlarının və ya CDS-lərin digər növlərin zülal ardıcıllıqlarına Blastp və tblastn uyğunlaşdırılması, 1e-50 e-dəyər həddinə cavab verən və uyğunlaşma ilə əhatə olunan D18 zülal uzunluğunun ≥50%-nə malik olan hər bir D18 zülalı üçün 10-a qədər düzülmə haqqında məlumat verdi. . Cinsi yolun təhlili məqsədləri üçün ən yaxşı hit seçildi. EST ardıcıllığının D18 genomik ardıcıllığına blits düzülmələri, EST ardıcıllığının uzunluğunun ≥60%-i uyğunlaşmaya daxil olmaqla, hər EST ardıcıllığı üçün 10-a qədər düzülmə barədə məlumat verdi. Yeni yığılıb İerasium transkriptom kontigləri də yuxarıdakı kimi parametrlərlə Blitzdən istifadə edərək D18 genomik kontiglərə uyğunlaşdırıldı. Genomik kontig dəsti üzrə ardıcıllığın artıqlığı, montaj daxilində bütün mümkün 100-bp kmerlər arasında redaktə (Hamming) məsafəsini hesablamaq üçün xüsusi proqramdan istifadə etməklə qiymətləndirilmişdir.

Transkriptom və kiçik RNT ardıcıllığı

Transkriptomik resurs yaratmaq üçün bütün yumurtalıqlar parçalandı və maye azotda toplandı. Ümumi RNT yumurtalıq və yarpaq toxumasından təcrid olunub və mRNT (polyA) və kiçik RNT-yə (mirVana miRNA İzolyasiya Kiti, Life Technologies) fraksiyalaşdırılıb. Poliakrilamid gel elektroforezi ilə kiçik RNT-lərin (<35 nt) seçilməsi kitabxananın hazırlanması zamanı aparılmışdır. 50-bp tək uçlu ardıcıllıqla və 100-bp ardıcıllıqla istifadə edərək mRNT kitabxanalarının ardıcıllığından istifadə edərək kiçik RNT kitabxanalarının işıqlandırma ardıcıllığı HiSeq 2000 sistemindən istifadə edərək Avstraliya Genom Tədqiqat Qurumu tərəfindən həyata keçirilmişdir. mRNT-nin iki bioloji replikası və kiçik RNT-nin bir replikası ardıcıllaşdırıldı. Hər ikisindən xam oxunuşlar adapter və aşağı keyfiyyətli ardıcıllıq üçün kəsildi və kiçik RNT ardıcıllıq dəstləri 18-25 nukleotidin uzunluğunu saxlamaq üçün süzüldü.Yalnız hər hansı bir nümunədə minimum beş dəfə (oxumaq) müşahidə edilən ardıcıllıqlar əlavə təhlil edilmişdir. Ardıcıllıq kəsmə alqoritmindən (mcf) istifadə edərək adapter ardıcıllıqlarını və aşağı keyfiyyətli ucları çıxarmaq üçün RNT ardıcıllıq kitabxanaları əvvəlcədən işlənmiş və Trinity transkriptom montaj boru kəmərindən istifadə edərək birtərəfli oxunuşlar kimi yığılmışdır [71].

M115 və m134 SNP kəşfi

Həm MMC, həm də FM mərhələlərindəki R35 ovul transkriptom kontigləri R35-dən RNT ardıcıllığı oxunuşlarını yenidən tənzimləmək üçün istinad kimi istifadə edilmişdir, m115m134 transkriptomlar. Düzəlişlər BioKanga hizalayıcısından istifadə edilərək yerinə yetirildi ki, bu da oxunmaların çoxsaylı lokuslara uyğunlaşmasına və oxunma uzunluğunun 10%-ə qədərini əvəzləmə kimi əldə etməyə imkan verir. SNP kəşfi iki mümkün ssenariyə əsaslanırdı. Birinci ssenari, genlərin silindiyini güman edir m134m115 R35 genomunda homoeoloji və ya paraloq gen nüsxəsini ehtiva edir. R35-də heterozigot (AB) və hər ikisində homozigot (AA) kimi müəyyən edilən SNP-lər m115m134 bu kateqoriya üçün seçilmişlər. İkinci ssenari, silinmiş genlərin hemizigotluğunu nəzərdə tutur və buna görə də SNP-lər R35-də homozigot genotip (A-) və hər ikisindən uyğunlaşdırılmış oxuların olmaması (−−) əsasında seçilmişdir. m115m134 mutantlar. SNP kəşfi BioKanga istifadə edərək həyata keçirildi və istənilən SNP lokusunda ən azı 0,25 kiçik allel tezliyi tələb olundu. Ardıcıllıqları LOA- bağlı kontiglər A və B [19] kahının genetik xəritəsində sintenik bölgələri müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir [22]. Bu sintenik bölgədə kahı EST-lərinə bənzərliklə SNP kəşfi prosesindən müəyyən edilmiş R35 transkriptom kontigləri əlavə təhlil üçün nəzərdən keçirilmişdir. Əlaqəni müəyyən etmək üçün LOA, SCAR markerləri 9-dan hazırlanmış və gücləndirilmişdir LOA silmə mutantları, 10 LOP silmə mutantları və əvvəllər təsvir edilmiş R35 xəritəçəkmə populyasiyasından 42 nəslin alt çoxluğu [20]. Primer ardıcıllığı və PCR şərtləri Əlavə fayl 1-də göstərilmişdir: Cədvəl S8. Təsdiqlənmiş markerlər əvvəllər təsvir edildiyi kimi JoinMap 4.0-dan istifadə edərək R35 əlaqə xəritəsinə çəkildi [20].

Diferensial ifadə və gen ontologiyası təhlili

Hər proqnozlaşdırılan üçün oxunma sayları yaratmaq İerasium gen modeli, RNT ardıcıllığı oxunuşları BioKanga alignerindən istifadə edərək D18 genomik kontig dəstinə uyğunlaşdırıldı, oxunuş uzunluğunun 10%-i maksimum uyğunsuzluq sayı ilə yalnız unikal uyğunlaşdırılmış oxunuşları qəbul etdi. AUGUSTUS gen modeli proqnozları daxilində uyğunlaşdırılmış oxunmaların cəmi hər bir proqnozlaşdırılan gen üçün oxunma sayları kimi istifadə edilmişdir. Bütün təkrarlara ayrıca baxıldı və oxunma sayının normallaşdırılması və diferensial ifadənin təhlili R statistik proqram paketi [72] (https://cran.r-project.org/) daxilində edgeR paketindən istifadə etməklə qiymətləndirildi. Gen modelləri statistik həddi qarşıladıqları halda diferensial şəkildə ifadə edilmiş hesab olunurdu P ≤ 0.01, çoxsaylı sınaq və minimum ikiqat dəyişiklik üçün düzəldilib.

Diferensial şəkildə ifadə olunan gen namizədlərinin siyahılarında funksional mövzuların zənginləşdirilməsini yoxlamaq üçün annotasiyadan istifadə etdik. Ərəbidopsis genlər və onlarla əlaqəli GO annotasiyaları. Ərəbidopsis mövcud olandan daha az GO annotasiyasının qaldığı pomidor əvəzinə istifadə edilmişdir Ərəbidopsis. -nin annotasiyalarını müşahidə etdik İerasium gen modelləri Ərəbidopsis və pomidor genləri əhəmiyyətli nisbətdə birə çox uyğunluq yaratdı. Bir neçə fərqli D18 gen modelinin birinə uyğun olduğu aşkar edildi Ərəbidopsis gen, biz əlaqəli GO şərtlərinin sayını əlaqəli D18 gen modellərinin sayına vurduq. Zənginləşdirilmiş GO şərtlərini nəzərdən keçirdik P ≤ jurnal10-5. Zənginləşdirmə bütün genotiplər üzrə maksimum oxunma saylarından əmələ gələn yumurtalıqda ifadə edilmiş bütün gen modellərinin fonunda qiymətləndirilmişdir.

Kiçik RNT analizi

Kiçik RNT ardıcıllıqları, iki uyğunsuzluğa və 1-2 nt mikroindelə imkan verən həm 5', həm də 3' sərhədləri 500 bp genişləndirilmiş D18 daxilində proqnozlaşdırılan gen modellərinə uyğunlaşdırılmaqla təhlil edildi. Kiçik RNT ardıcıllıqları 18-25 nt uzunluğa qədər süzüldü və yalnız hər hansı bir nümunədə beş dəfədən çox müşahidə edilən ardıcıllıqlar sonrakı analiz üçün saxlanıldı. Hər bir gen modeli üçün ümumi oxunma sayları (+/−500 bp) R statistik proqram dəsti [72] (https://cran.r-project.org/) daxilində edgeR paketindən istifadə etməklə normallaşdırıldı. MİRNA gen proqnozu əvvəllər düyüdə istifadə edilən [73] potensial miRNA-miRNA* cütlərinin aşkarlanmasına əsaslanan üsullardan istifadə etməklə tamamlandı: fərqli kiçik RNT-lər bir-birindən 400 bp daxilində genomik ardıcıllıqla mükəmməl şəkildə uyğunlaşdırıldı, onların arasında transkripsiya edilmiş ardıcıllıq potensial olaraq ikincil saç sancağı yarada bilər. strukturu.

QRT-PCR analizi

Bütün yumurtalıqlar maye azota bölündü və RNeasy Mini Kit (Qiagen) istifadə edərək RNT çıxarıldı. RNT RQ1 DNase (Promega) ilə müalicə olundu və reaksiya RNeasy Mini sütunundan (Qiagen) istifadə edilərək təmizləndi. cDNT sintezi SuperScript III birinci zəncirli sintez reaksiyasında (Invitrogen) 1 μg RNT istifadə edilərək həyata keçirilmişdir. qRT-PCR, Əlavə fayl 1: Cədvəl S8-də sadalanan oliqonukleotidlərlə LightCycler 480 SYBER Green I Master Mix (Roche) istifadə edərək RG-3000 (Corbett Research) üzərində həyata keçirilib. İki bioloji və iki texniki təkrarın orta göstəricisi ΔΔCt metodundan istifadə etməklə verilir HpUBC21 istinad gen kimi. Genlərin >1,5 qat dəyişməsi və qoşalaşmış olması diferensial şəkildə ifadə edilmiş hesab olunurdu ttest P dəyər <0.05. qRT-PCR istifadə edərək transkriptom analizimizdə diferensial şəkildə ifadə olunan gen modellərinin doğrulama dərəcəsi idi

45 %. Aşağı olsa da, bu, ehtimal ki, tetraploid bitkilər daxilində D18 proqnozlaşdırılan gen modellərinə allele-spesifik primerlərin dizaynındakı çətinliyi təmsil edir. Transkriptom analizinin təsdiqi üçün istifadə edilən oliqoslar proqnozlaşdırılan D18 gen modellərinə ən yaxşı uyğunluğu göstərən transkriptom kontiglərindən hazırlanmışdır. Bütün qRT-PCR amplikonları düzgün gücləndirməni yoxlamaq üçün ardıcıllıqla sıralandı.

ARQONAUTE klonlaşdırma və filogenetik analiz

Gizli Markov modeli (HMM) NCBI PLN03202 zavodunun AGO uyğunlaşdırılmasından HMMER v. 2.1 (http://hmmer.org/) istifadə edilməklə yaradılmışdır. HMM daha sonra daxilində AGO ilə əlaqəli domenləri ehtiva edən yığılmış kontigləri axtarmaq üçün istifadə edilmişdir İerasium R35 və P36 genotiplərindən bütün yumurtalıq transkriptomları. Müəyyən edilmiş AGO transkriptləri həm R35, həm də P36 fonlarında FM mərhələsində bütün yumurtalıqlardan əldə edilən cDNT kitabxanalarından gücləndirilmişdir. Gücləndirmə üçün istifadə olunan primerlər Əlavə fayl 1-də verilmişdir: Cədvəl S8. PCR məhsulları pCR4-TOPO vektoruna (Invitrogen) klonlaşdırıldı. Sonrakı filogenetik analiz üçün istifadə olunan konsensus ardıcıllığı yaratmaq üçün çoxsaylı klonlar ardıcıllıqla sıralanıb və uyğunlaşdırılıb. Tam uzunluqlu AGO konsensus protein ardıcıllığı H. praealtum (R35) istinada uyğunlaşdırılmışdır AGO cDNA-lar ƏrəbidopsisS. lycopersicum Clustal Omega [74] istifadə edərək. 1000 bootstrap replikasiyasına əsaslanan maksimum ehtimal metodundan istifadə etməklə MEGA6 daxilində köksüz ağac qurulmuşdur [75]. Ən yüksək log ehtimalı olan ağac göstərilir. Saytın əhatə dairəsi 95%-dən az olan bütün vəzifələr ləğv edildi. Son məlumat dəsti cəmi 715 mövqedən ibarət idi.

Yerində hibridləşmə

Prob üçün şablonlar HpAGO1a, HpAGO2bHpAGO5 müvafiq olaraq amplikonun 5' və 3' ucunda T7 və SP6 promotorlarını təqdim edən oliqolardan istifadə edərək pCR4-TOPO cDNA klonlarından (yuxarıda təsvir edilmişdir) gücləndirilmişdir (Əlavə fayl 1: Cədvəl S8). Daha sonra gel ilə təmizlənmiş amplikonlardan DIG RNT Labeling Kit SP6/T7 (Roche) ilə prob sintezi üçün şablon kimi istifadə edilmişdir. Hibridləşdirmə və vizuallaşdırma daha əvvəl təsvir edildiyi kimi həyata keçirildi [76].

ARGONAUTE zülalının modelləşdirilməsi

Modelləri İerasium HpAGO4cP36 və HpAGO4cR35 zülalları insan Argonaute2 zülalının məkan məhdudiyyətlərinə əsaslanan müqayisəli (homologiya) modelləşdirmə yolu ilə qurulmuşdur (qoşulma [PDB:4OLB])[43, 77]. HpAGO4c zülalları və 4OLB zülal ardıcıllığı AA-Annotator [78] istifadə edərək uyğunlaşdırıldı, ardınca əl ilə düzəlişlər edildi və ikinci dərəcəli struktur elementlərin yerləşdirilməsi üçün təhlil edildi [79]. Düzəlişlər Modeller 9v8 [77] daxilində üçölçülü (3D) modellərin qurulması üçün giriş parametrləri kimi istifadə edilmişdir. Hər iki zülalın son 3D molekulyar modeli “Modelçinin Məqsəd Funksiyasının” ən aşağı dəyərlərini və ən əlverişli Diskret Optimize Edilmiş Zülal Enerjisi (DOPE) qiymətləndirmə parametrlərini göstərən 40 model arasından seçilmişdir [77, 80]. Stereokimyəvi keyfiyyət və ümumi G faktorları PROCHECK [81] ilə hesablanmışdır. Birləşdirilmiş enerji profilləri üçün Z-hesab dəyərləri Prosa2003 [82] tərəfindən qiymətləndirilmişdir. Struktur super mövqelər DeepView 'iterativ sehrli uyğunlaşma' alqoritmi [83] istifadə edilərək yerinə yetirildi, burada 760 və 751 qalıq (HpAGO4cP36, HpAGO4cR35 və COLα-da müvafiq olaraq 866, 857 və 838 qalıqdan) uyğunlaşdırıldı. İndellər istisna olmaqla, HpAGO4cP36 və HpAGO4cR35 üçün müvafiq olaraq 0,68 Å və 0,72 Å orta kvadrat sapma dəyərləri. Molekulyar qrafika PyMOL proqram paketi (http://www.pymol.org/) ilə yaradılıb.


Abiotik Stress Yaddaşında DNT Metilasyonunun Rolu

Somatik Stress Yaddaş

Abiotik stresslər bitkilərdə müxtəlif xromatin dəyişikliklərinə səbəb olsa da, epigenetik dəyişikliklərin əksəriyyəti keçici xarakter daşıyır və abiotik stresslər aradan qaldırıldıqda tez bir zamanda əvvəlki gərginlik səviyyəsinə qayıdır. Bununla belə, abiotik stresslər nəticəsində yaranan bəzi xromatin dəyişiklikləri mitotik irsi ola bilər və eyni nəsildə bir neçə gün və ya hətta bitki həyatının istirahət vaxtı davam edə bilər. In Ərəbidopsis, təkrarlanan susuzlaşdırma stressləri, transkripsiya sürətinin artması və bəzi stresə cavab verən genlərin yüksək transkript səviyyələri ilə xarakterizə olunan transkripsiya stress yaddaşı ilə nəticələnir (Ding və digərləri, 2012). Soyuq, quraqlıq və istilik stressi müalicəsi 3 gün davam edən somatik abiotik stress yaddaşına səbəb ola bilər ki, bu da əsasən H3K4me2/me3, H3K27me3 və H3K14ac daxil olmaqla histon modifikasiyasındakı dəyişiklikləri əhatə edir (Lamke və Bäurle, 2017Eurle və Trindade, 2020). Vernalizasiya ilə bağlı yaddaş FLC susdurma H3K27me3-ün qurulması və saxlanması ilə əlaqəli olan isti temperaturda sonrakı böyümə və inkişafda saxlanıla bilər. Pro-embrionda toxuma xas transkripsiya faktoru LEAFY COTYLEDON1 (LEC1) H3K27me3 demetilasiyasına və aktivləşməsinə kömək edir. FLC, bununla da vernalizasiya yaddaşını silir (Tao et al., 2017 He and Li, 2018). Görünür ki, DNT metilasiyası yuxarıda göstərilən stressin yaratdığı somatik yaddaş üçün cavabdeh deyil. Bununla belə, düyüdə duzun səbəb olduğu DNT metilasiyası və ya demetilasiya dəyişikliklərinin əsas hissəsi bərpa olunduqdan sonra qalır, bu, duzluluğun səbəb olduğu DNT metilasiya dəyişikliklərinin ətraf mühitdəki duz stressini xatırlaya biləcəyini və stresin səbəb olduğu epigenetik vəziyyəti mitotik hüceyrə vasitəsilə qız hüceyrələrinə ötürə biləcəyini göstərir. indiki nəsildə bölünmələr (Wang et al., 2015). Bəzi genom-lokuslara xas 5mC və ya 6mA dəyişikliklərin bitkilərin abiotik stresslərə reaksiyalarının somatik yaddaşında işləyə biləcəyi formal bir ehtimal olaraq qalır.

Stress Yaddaşının Transgenerativ İrsi

Bəzi abiotik stress xromatin dəyişiklikləri ilə birlikdə transgenerasiyalı fenotipik dəyişikliklərə səbəb ola bilər ki, bu da ən azı bir qeyri-stresssiz nəsilə qədər aşkar edilə bilər (Cədvəl 1). In Ərəbidopsis, qısa dalğa uzunluğunda radiasiya (ultrabənövşəyi-C, UV-C) və ya flagellin müalicəsi transgen məruzəçinin somatik homoloji rekombinasiya tezliyini artırır və bu, sonrakı dörd müalicə olunmamış nəsildə də davam edir (Molinier et al., 2006). Bu, bitkilərdə transgenerativ epigenetik irsiyyətin ilk hesabatıdır. 2006-cı ildən bitkilərin stres reaksiyalarının nəsillərarası yaddaşının deşifr edilməsi maraqlı tədqiqat sahəsinə çevrilib. Bəzi stress reaksiyaları yalnız nəsillərarası stress yaddaşı adlanan birbaşa nəsillərə ötürülə bilər, bəzi stress reaksiyaları isə ən azı iki sonrakı stressdən azad nəsillər üçün yadda saxlanıla bilər ki, bu da nəsillərarası stress yaddaşı kimi tanınır (Lamke və Bäurle , 2017).

Cədvəl 1. Bitkilərdə nəsillərarası və nəsillərarası stress yaddaşının nümunələri.

Nəsillərarası stress yaddaşı flagellin (bitki müdafiəsinin elisitoru), ultrabənövşəyi-C, duz, soyuq, istilik və quraqlıq stressi, β03B2-aminobutirik turşu (BABA), metil jasmonat kimi çoxsaylı biotik və abiotik stresslərlə tətiklənə bilər. və bakteriyalar Pseudomonas syringae pv pomidor (PstavrRpt2) (Cədvəl 1 Johnsen et al., 2005 Kvaalen and Johnsen, 2008 Sultan et al., 2009 Boyko et al., 2010 Ito et al., 2011 Scoville et al., 2011 Slaughter et al., 2012 Iwasaki, Pask201ow Migicovsky et al., 2014 Bilichak et al., 2015 Wibowo et al., 2016 Ganguly et al., 2017 Bose et al., 2020). Maraqlıdır ki, çoxillik şotland şamlarında (Pinus sylvestris L.), valideyn ağaclarında təbii quru şəraitin ekoloji yaddaşı isti quraqlıq şəraitində nəslin sağ qalmasına və böyüməsinə səbəb olur (Bose et al., 2020). Stress yaddaşı dərhal nəslini təkrarlanan stresdən qoruya bilər və ya onlara dəyişən mühitlərə yerli uyğunlaşma potensialı təklif edə bilər, eyni zamanda növbəti nəsildə sıfırlama əlverişli şəraitdə böyüməni maksimum dərəcədə artıra bilər (Crisp et al., 2016). Nəsillərarası stress yaddaşı, ətraf mühit faktorlarının gametogenez, mayalanma və embrionun inkişafına və ya nəsil ana bitkilərdə inkişaf etdikdə toxumlara daşınan və saxlanılan ana siqnallarına birbaşa təsiri ilə vasitəçilik edilə bilər. Nəsillərarası stress yaddaşının nə qədərinin ətraf mühitin yaratdığı epigenetik dəyişikliklərə bağlı olduğu aydın deyil. Nəsillərarası stress yaddaşında iştirak edən epigenetik tənzimləyicilər, kiçik RNT-lərin və DNT metilasiyasının mümkün rollarına dair bir neçə hesabat istisna olmaqla, böyük ölçüdə naməlum olaraq qalır (Cədvəl 1 Boyko və digərləri, 2010 Ito et al., 2011 Migicovsky et al., 2014 Bilichak et al. ., 2015 Wibowo et al., 2016). Hiperosmotik stressin səbəb olduğu reaksiyalar, kişi cücərti xəttində geniş yayılmış DNT qlikosilaz aktivliyinə görə qadın nəsli vasitəsilə ilk növbədə gələcək nəsildə saxlanılır və stress olmadıqda geniş şəkildə yenidən qurulur (Wibowo et al., 2016). Stressə məruz qalan valideyn bitkilərində meioz zamanı keçici stress yaddaşının necə saxlanıldığı və sonrakı nəslin çoxalma mərhələsində necə çıxarıldığı və ya yenidən qurulduğu hələ araşdırılmalı olaraq qalır.

Artan dəlillər göstərir ki, bir çox abiotik stress reaksiyaları transgenerativ epigenetik irsiyyət nümayiş etdirə bilər (Cədvəl 1). Uzun müddət davam edən istilik stressi PTGS-nin buraxılması və zəifləmiş toxunulmazlığın transgenerasiya yaddaşına səbəb ola bilər. Ərəbidopsishiston demetilazları, istilik şokunun transkripsiya faktorlarını və trans-fəaliyyət göstərən siRNA-lar (tasiRNAs) (Zhong et al., 2013 Liu et al., 2019). Soyuq stress və sərt UV-B müalicəsi ilə səbəb olan TGS-nin sərbəst buraxılması iki qeyri-stressli nəsil üçün məhdud olaraq aşkar edilə bilər (Lang-Mladek və digərləri, 2010). Bəzi transpozonların UV-C vasitəçiliyi ilə aktivləşdirilməsi, DCL zülallarının rolunu tələb edən stress olmadan da iki nəsil üçün saxlanıla bilər (Migicovsky və Kovalchuk, 2014). Ağır metal stresinə məruz qaldıqda, bir Tos17 retrotranspozonunun 5 mC vəziyyəti dəyişdirilir və düyüdə transgenerativ irsiyyət göstərir (Cong et al., 2019). Üstəlik, ağır metal daşıyan P-tipli ATPaz genləri (HMAs) stresssiz nəsildə nəsillər arası yaddaşda saxlanılan ağır metal stressi altında yuxarı tənzimlənir (Cong et al., 2019). Əkinçilikdən taxıl doldurma mərhələlərinə qədər bir-birinin ardınca gələn quraqlıq stressi qeyri-təsadüfi epimutasiyalara səbəb olur və quraqlığın səbəb olduğu epimutasiyaların 44,8%-dən çoxu dəyişdirilmiş DNT metilasiya statusunu stresssiz nəsillərə ötürür. Epimutasiya ilə əlaqəli genlər, düyü bitkisinin quraqlıq stresinə uyğunlaşmasına vasitəçilik edə bilən stressə cavab verən yollarda birbaşa iştirak edir (Zheng et al., 2017). Bu nəsillərarası xatirələr nəsillərə müxtəlif abiotik stresslər altında daha yaxşı uyğunlaşma üçün uyğunlaşma üstünlüyü və ya genomik elastiklik təklif edə bilər.

Bəzi aseksual çoxillik bitkilərdə stressin yaratdığı transgenerasiya yaddaşı da bildirilmişdir. Genetik cəhətdən eyni olan apomiktik dandelionda (Taraxacum officinale) bitkilər, müxtəlif stresslər genom boyunca əhəmiyyətli metilasiya dəyişikliyinə səbəb oldu və bir çox modifikasiya stresssiz nəsillərə ötürüldü (Verhoeven et al., 2010). İki fərqli apomiktik dandelion nəsillərində Taraxacum officinale qrup (Taraxacum alatumT. hemicyclum) quraqlıq stresi altında və ya salisilik turşusu (SA) müalicəsindən sonra ilkin stress müalicəsindən asılı olmayaraq üç nəsildə irsi DNT metilasiya dəyişiklikləri müşahidə olunur (Preite et al., 2018). Qeyd etmək lazımdır ki, dandelionlarda stressin yaratdığı bu transgenerasiyalı DNT metilasiya variasiyaları genotip və kontekstə xasdır və spesifik lokuslara yönəldilmir (Preite et al., 2018). Əksər birillik bitkilərdən fərqli olaraq, aseksual çoxillik bitkilər klonal yayılmadan istifadə edirlər. Stressin səbəb olduğu DNT metilasiya dəyişiklikləri mitoz zamanı böyük ölçüdə miras qala bilər ki, bu da gələcək nəsil bitkilərin bəzi yaşayış yerlərində mənfi ətraf mühit faktorlarına dəqiq və səmərəli reaksiya verməsini təmin edə bilər (Latzel et al., 2016). Metilasiya variasiyalarının aseksual çoxillik bitkilərdə fenotipik dəyişikliklərə necə töhfə verdiyi hələ də araşdırılmalıdır.

Cücərmə xətti və erkən embrion mərhələsində həm ata, həm də ana genomları məməlilərdə həm aktiv, həm də passiv demetilasiya yolları vasitəsilə geniş DNT demetilasiyasına məruz qalır ki, bu da metilomada stressin səbəb olduğu dəyişikliklərin miras qalması üçün çox az imkan yaradır (Smith et al., 2012) ). Stressin səbəb olduğu transgenerativ epigenetik irsiliyin bəzi nümunələri, məsələn, bəzi heyvanlarda bildirilmişdir. Caenorhabditis elegans, əsas epigenetik işarələr əsasən histon modifikasiyaları və ya kiçik RNT-lərdir (Skvortsova et al., 2018). Bununla belə, bitkilərdəki DNT metilasiyası silinmir, əksinə bitki çoxalması zamanı epigenetik olaraq miras alınır (Feng et al., 2010 Calarco et al., 2012 Heard and Martienssen, 2014), transgenerasiya yaddaşında DNT metilasiyasının potensial rolunu təklif edir. Ardıcıl nəsillərdə met1-3 CG metilasiyasını saxlamaqda çatışmayan mutantlar, mCG itkisinin RdDM, DNT demetilazlarının ifadəsinin azalması və H3K9 metilasiyasının yenidən hədəflənməsi kimi stoxastik şəkildə yeni və anormal genom boyu epigenetik nümunələri tədricən tetiklediyi aşkar edilmişdir (Mathieu et al. ). Tütündə kartof mil yumru viroidi (PSTVd) infeksiyası zamanı PSTVd ​​transgeninin bədəni sıxdır. de novo hər üç kontekstdə metilləşdirilmişdir.Ancaq viroidsiz nəsil bitkilərində, yalnız m CG RdDM tetikleyicilərindən asılı olmayaraq ən azı iki nəsil üçün sabit saxlanıla bilər (Dalakouras et al., 2012). Beləliklə, CG metilasiyası sabit abiotik transgenerasiya yaddaşını təmin etmək üçün mərkəzi koordinator kimi fəaliyyət göstərə bilər. Epigenetik rekombinant inbred xətlərin (epiRIL) populyasiyasında vəhşi tipli və vəhşi tipli vəhşi növlərdən ibarət epigenetik mozaik xromosomlar met1-3Təxminən izogen, lakin DNT metilasiyası səviyyəsində çox dəyişkən olan səkkiz nəsil qohumluğa baxmayaraq, gözlənilmədən yüksək tezlikli qeyri-valideyn metilasiya polimorfizmləri genomda səpələnmişdir (Reinders et al., 2009). F5 fərdi bitkilərində ddm1 epiRIL-lərdə, vəhşi tipli metilasiyanın bərpası RNT müdaxiləsi (RNAi) maşınları tərəfindən hədəflənən ağır metilləşdirilmiş təkrarların bir hissəsinə xasdır (Teixeira və digərləri, 2009). Buna uyğun olaraq, NRPD1 tamamlamasında Ərəbidopsis xətləri, RdDM hədəf lokuslarının bir alt çoxluğunun DNT metilasiyası hətta 20-ci nəsillərdə də bərpa edilə bilməz. Bu tamamlanmayan DMR-lərin çoxu inbreeding təcrübələrində və ya bitki müdafiə reaksiyalarında funksional olan təbii birləşmələrdə müəyyən edilmiş epi-alellərlə üst-üstə düşür (Li və digərləri, 2020). Duz, quraqlıq və artan qidalanma şəraitində Arabidopsis thaliana, ddm1 epiRIL-lər kök yerləşdirmə, qida plastikliyi, quraqlıq və duz stresinə dözümlülükdə fenotipik dəyişikliklər nümayiş etdirir (Zhang et al., 2013 Kooke et al., 2015). Bu hesabatlar epiRIL-lərdə 5 mC-də irsi dəyişkənliyin potensial adaptiv və təkamül dəyərlərinə malik olan epi-allelik variasiyanın yaranmasına imkan verə biləcəyi fikrini gücləndirir. Ancaq nəsillər quraqlıq yaşayarkən vurğuladı Ərəbidopsis soylar artan toxum dormansiyasının transgenerasiya yaddaşını nümayiş etdirir, yaddaş DNT metilomunda səbəbli dəyişikliklərlə əlaqəli deyil (Ganguly et al., 2017).

Hər şeydən əvvəl, transgenerasiya yaddaşında epigenetik tənzimləmələrin potensial rolları şübhəsiz olsa da, transgenerativ mirasın davamlılığında stressin səbəb olduğu DNT metilasiya dəyişmələrinin rolları daha da aydınlaşdırılmalıdır. Lokus-spesifik metilasiya dəyişikliklərinin stress yaddaşının saxlanmasına nə dərəcədə kömək edə biləcəyi də qeyri-müəyyən olaraq qalır. The de novo Müəyyən bir bölgənin metilasiyası RdDM tərəfindən qurula bilər və DNT metilasiyasının saxlanması RdDM-ni nəsillər boyu birləşdirir. Arabidopsis thaliana, bununla da epigenetik yaddaş qurur (Kuhlmann et al., 2014). In ddm1 epiRIL-lərdə bir neçə DMR, çiçəkləmə vaxtı və ilkin kök uzunluğu üçün irsiyyətin 60% -ni təşkil edən vicdanlı epigenetik kəmiyyət əlamət lokusları (QTL epi) kimi müəyyən edilir (Cortijo et al., 2014). Abiotik stress nəticəsində yaranan DMR-lərin irsi nəsillərarası mirasa töhfə verib-verməməsi əlavə araşdırma tələb edir. Bundan əlavə, abiotik stresslərdən qaynaqlanan 6mA dəyişikliklərinin miras alına bilməyəcəyi və onların stress yaddaşındakı rolları hələ də çətin olaraq qalır.


Mücərrəd

Biz növbəti nəsil hədəflənmiş amplikon ardıcıllığı ilə istehsal olunan nukleotid ardıcıllığındakı səhvlərin düzəldilməsini nəzərdən keçiririk. Növbəti nəsil sıralama (NGS) platformaları yüksək ötürmə qabiliyyəti sayəsində çoxlu ardıcıllıq məlumatı təmin edə bilər, lakin bununla bağlı səhv dərəcələri çox vaxt yüksək olur. Beləliklə, yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığında denoising aşağı axın təhlillərinin etibarlılığını artırmaq üçün vacib bir prosesə çevrildi. DUDE-Seq adlı metodologiyamız diskret yaddaşsız kanal tərəfindən pozulmuş son qiymətli mənbə məlumatlarının yenidən qurulmasının ümumi parametrindən irəli gəlir və əvəzetmə və homopolimer indeksi xətalarını effektiv şəkildə düzəldir, ən yüksək məhsuldarlıqlı hədəf amplikonda ardıcıllıq xətalarının iki əsas növü ardıcıllıq platformaları. Həqiqi və simulyasiya edilmiş verilənlər bazası ilə apardığımız eksperimental tədqiqatlar göstərir ki, təklif olunan DUDE-Seq yalnız səhvləri düzəltmə qabiliyyəti və vaxt səmərəliliyi baxımından mövcud alternativləri üstələmir, həm də aşağı axın təhlillərinin etibarlılığını artırır. Bundan əlavə, DUDE-Seq-in çevikliyi onun səs-küy modelinin sadə yeniləmələri ilə müxtəlif ardıcıllıq platformalarına və analiz boru kəmərlərinə möhkəm tətbiqinə imkan verir. DUDE-Seq http://data.snu.ac.kr/pub/dude-seq ünvanında mövcuddur.

Sitat: Lee B, Moon T, Yoon S, Weissman T (2017) DUDE-Seq: Hədəflənmiş amplikon ardıcıllığı üçün sürətli, çevik və möhkəm denoising. PLoS ONE 12(7): e0181463. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181463

Redaktor: Junwen Wang, Mayo Clinic Arizona, Amerika Birləşmiş Ştatları

Qəbul edildi: 20 mart 2017-ci il Qəbul edildi: 30 iyun 2017-ci il Nəşr olundu: 27 iyul 2017-ci il

Müəlliflik hüququ: © 2017 Lee et al. Bu, Creative Commons Attribution Lisenziyasının şərtlərinə uyğun olaraq paylanmış açıq giriş məqaləsidir və orijinal müəllif və mənbənin qeyd edilməsi şərti ilə istənilən mühitdə məhdudiyyətsiz istifadə, paylama və reproduksiyaya icazə verir.

Məlumatın mövcudluğu: Bütün müvafiq məlumatlar kağızda, onun Dəstəkləyici Məlumat fayllarında və onun dəstəkləyici veb-saytındadır (http://data.snu.ac.kr/pub/dude-seq). İstifadə olunan bütün məlumat dəstləri həmçinin https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRP000570 və Avropa Nukleotid Arxivində (ENA) SRP000570 (SRS002051–SRS002053) qoşulma nömrəsi ilə Ardıcıllıq Oxuma Arxivində (SRA) mövcuddur. ) http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB6244 ünvanında PRJEB6244 (ERS671332–ERS671344) qoşulma nömrəsi altında.

Maliyyələşdirmə: Bu iş qismən Koreya hökuməti (Elm, İKT və Gələcək Planlaşdırma Nazirliyi) [2014M3A9E2064434 və 2016M3A7B4911115] tərəfindən maliyyələşdirilən Koreya Milli Tədqiqat Fondu (NRF) qrantı, qismən də Koreya Səhiyyə Texnologiyası Tədqiqat və İnkişaf Layihəsinin qrantı ilə dəstəkləndi. Səhiyyə və Rifah Nazirliyi [HI14C3405030014] tərəfindən maliyyələşdirilən Koreya Səhiyyə Sənayesinin İnkişafı İnstitutu (KHIDI), qismən Koreya Milli Tədqiqat Fondu [NRF-2016R1C1B2012170] vasitəsilə Əsas Elm Tədqiqat Proqramı, qismən də İKT Tədqiqat və İnkişafı tərəfindən MSIP/IITP proqramı [2016-0-00563, Intelligent Autonomous Digital Companion üçün Adaptiv Maşın Öyrənmə Texnologiyasının İnkişafı üzrə Tədqiqat] və qismən NIH Grant 5U01CA198943-03. Tədqiqatın dizaynında, məlumatların toplanmasında və təhlilində, nəşr etmək qərarında və ya əlyazmanın hazırlanmasında maliyyə verənlərin heç bir rolu olmayıb.

Rəqabətli maraqlar: Müəlliflər heç bir rəqabət aparan maraqların olmadığını bəyan ediblər.


İstinadlar

1. Ottley C. İrsiyyət və varikoz damarları. Br Med J 19341:528.

2. Wagner FB, Herbut PA. Birincili varikoz damarlarının etiologiyası. J Surg 194978:876-80.

3. Vanhoutte PM, Corcaud S, de Montrion C. Venöz xəstəlik: patofiziologiyadan həyat keyfiyyətinə qədər. Angiologiya 199748:559-67.

4. Meissner MH, Gloviczki P, Bergan J, et al. İlkin xroniki venoz pozğunluqlar. J Vasc Surg 200746 Təchizat S:54S-67S.

5. Hauge M, Gundersen J. Alt ekstremitələrin varikoz damarlarının genetikası. Hum Hered 196919:573-80.

6. Matousek V, Prerovský I. Birincili varikoz damarlarının irsi probleminə töhfə. Hum Hered 197424:225-35.

7. Cornu-Thenard A, Boivin P, Baud JM, De Vincenzi I, Carpentier PH. Varikoz xəstəliyində ailə faktorunun əhəmiyyəti. 134 ailənin klinik tədqiqi. J Dermatol Surg Oncol 199420:318-26.

8. Quo Q, Quo C. Alt ekstremitələrin varikoz damarlarının genetik analizi. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 199815:221-3. (Çin dilində)

9. Serra R, Buffone G, de Franciscis A və s. Xroniki venoz çatışmazlığın genetik tədqiqi. Ann Vasc Surg 201226:636-42.

10. Pistorius MA. Xroniki venoz çatışmazlıq: genetik təsir. Angiologiya 200354 Təchizat 1:S5-12.

11. Krysa J, Jones GT, van Rij AM. Varikoz damarlarında və xroniki venoz çatışmazlıqda genetik rolun sübutu. Flebologiya 201227:329-35.

12. Smetanina MA, Shadrina AS, Zolotuxin IA, Filipenko MI. Xroniki venoz xəstəliyin genetik bazası: müasir konsepsiyaların nəzərdən keçirilməsi. Flebol 201610:199. (rusca).

13. Shadrina AS, Smetanina MA, Sevost'ianova KS, et al. AGGF1 genində polimorfik variantlar rs13155212 (T/C) və rs7704267 (G/C) və etnik rusların populyasiyasında aşağı ətrafların varikoz damarlarının riski. Bull Exp Biol Med 2016161:698-702.

14. Shadrina AS, Sevost'ianova KS, Shevela AI, et al. MTHFR və MTR genlərindəki polimorfizmlər və etnik ruslarda varikoz damarları riski. Biomarkerlər 201621:619-24.

15. Shadrina AS, Smetanina MA, Sevost'yanova KS, et al. MMP1, MMP2, MMP3 və MMP7 matris metalloproteinaz genlərinin polimorfizmi və alt ekstremitələrin varikoz genişlənməsi riski. Bull Exp Biol Med 2017163:650-4.

16. Sokolova EA, Shadrina AS, Sevost'ianova KS, et al. HFE p.C282Y gen variantı Rusiya əhalisinin varikoz damarları ilə əlaqələndirilir. Clin Exp Med 201616:463-70.

17. Shadrina AS, Smetanina MA, Sokolova EA, et al. Etnik ruslarda varikoz damarları riski ilə FOXC2 geninə yaxın polimorfizmlərin birləşməsi. Flebologiya 201631:640-8.

18. Shadrina AS, Smetanina MA, Sokolova EA, et al. VEGFA geninin alleli rs2010963 C etnik ruslarda ilkin varikoz genişlənmə riskinin azalması ilə əlaqələndirilir. Flebologiya 201833:27-35.

19. Shadrina AS, Smetanina MA, Sevost'ianova KS, et al. MCP1 genindəki rs1024611 funksional polimorfizmi aşağı ətrafların varikoz damarları riski ilə əlaqələndirilir. J Vasc Surg venoz limfa pozğunluğu 20175:561-6.

20. Shadrina A, Voronina E, Smetanina M və s. İltihabla əlaqəli genlərdə polimorfizmlər və etnik ruslarda ilkin varikoz damarları riski. Immunol Res 201866:141-50.

21. Bell RK, Durand EY, McLean CY, Eriksson N, Tung JY, et al. 23andMe kohortunda varikoz damarlarının geniş miqyaslı genom geniş birliyi tədqiqi. In: Amerika İnsan Genetika Cəmiyyətinin 64-cü İllik Toplantısı 2014 18-22 Oktyabr San Dieqo, ABŞ: ASHG. Kağız nömrəsi. 2082M səh. 487.

22. Ellinghaus E, Ellinghaus D, Krusche P, et al. Xroniki venoz xəstəlik üçün genom miqyaslı assosiasiya təhlili EFEMP1 və KCNH8-i həssaslıq lokusları kimi müəyyən edir. Sci Rep 20177:45652.

23. Shevela AI, Gavrilov KA, Plotnikova EY, Sevostianova KS, Filipenko ML, Smetanina MA. Varikoz damarlarında hüceyrədənkənar matrislə əlaqəli genlərin COL15A1, CHRDL2, EFEMP1 və TIMP1 ifadəsinin dəyişdirilməsi. Eur J Vasc Endovasc Surg 202060: e75-6.

24. Şadrina A, Tsepilov Y, Sokolova E və başqaları. Etnik ruslarda genom miqyaslı assosiasiya tədqiqatı MHC sinif III genomik bölgəsinin birincili varikoz damarları riski ilə əlaqəsini təklif edir. Gen 2018659:93-9.

25. Shadrina A, Tsepilov Y, Smetanina M, et al. İltihab və qan damarlarının inkişafında iştirak edən genlərin polimorfizmləri varikoz damarlarının riskinə təsir göstərir. Clin Genet 201894:191-9.

26. Fukaya E, Flores AM, Lindholm D, et al. Varikoz damarlarının klinik və genetik determinantları. Dövriyyə 2018138:2869-80.

27. Şadrina A.S., Şarapov S.Z., Şaşkova T.İ., Tsepilov YA. Alt ekstremitələrin varikoz damarları: İlk geniş miqyaslı genetik araşdırmadan fikirlər. PLoS Genet 201915: e1008110.

28. Smetanina MA, Shadrina AS, Zolotukhin IA, Seliverstov EI, Filipenko ML. Varikoz damarlarında diferensial şəkildə ifadə olunan genlər: problemin cari vəziyyəti, dərc edilmiş məlumatların təhlili. Flebol 201711:190. (rusca).

29. Smetanina M, Sipin F, Seliverstov E, Zolotuxin I, Filipenko M. Alt ekstremitələrin varikoz damarlarında diferensial şəkildə ifadə olunan genlər. Flebol 202014:122. (rusca).

30. Smetanina MA, Kel AE, Sevost'ianova KS, et al. DNT metilasiyası və gen ifadəsi profili MFAP5-ni varikoz damarlarında hüceyrədənkənar matrisin yenidən qurulmasının tənzimləyici sürücüsü kimi ortaya qoyur. Epigenomika 201810:1103-19.

31. Smetanina MA, Sipin FA, Sevostyanova KS, Xrapov EA, Zolotuxin IA, Filipenko ML. . MFAP5 geninin tənzimləyici bölgələrindəki iki CpG lokusu varikoz damarlarında hipometilizasiya olunur. 25-27 Avqust 2019-cu il tarixlərində, Polşa, Krakov, Beynəlxalq Flebologiya Birliyinin Yığıncağının ABTRACTLARI. Fleboloji İcmal 20191:23-4.

32. Smetanina MA, Shevela AI, Gavrilov KA, Filipenko ML. . Varikoz damarlarında HRC, DPEP2 və CCN5 genləri ilə əlaqəli DNT lokuslarının dəyişdirilmiş metilasiyası. In: 13-cü Sankt-Peterburq Venoz Forumunun (Milad görüşləri) 2020-ci il, 4-5 dekabr Sankt-Peterburq, Rusiya. FLEBOLOGİYADA TƏKKİL PROBLEMLƏR 2020. səh. 11-12.

33. Lim JP, Brunet A. Epigenetik yaddaşla nəsillərarası boşluğun aradan qaldırılması. Trendlər Genet 201329:176-86.

34. Legoff L, D'Cruz SC, Tevosian S, Primig M, Smagulova F. Məməlilərin inkişafı zamanı ətraf mühitin səbəb olduğu epigenetik dəyişikliklərin nəsillərə ötürülməsi. Hüceyrələr 20198:1559.

35. Bradbury J. İnsan epigenomu layihəsi - hazır və işləyir. PLoS Biol 20031: E82.

36. Ashar FN, Zhang Y, Longchamps RJ, et al. Mitoxondrial DNT nüsxə nömrəsinin ürək-damar xəstəliyi ilə birləşməsi. JAMA Kardiol 20172:1247-55.

37. Smetanina MA, Sevost’ianova KS, Shirshova AN, et al. . Varikoz damarlarında mitoxondrial DNT-nin kəmiyyət və struktur xüsusiyyətləri. In: 27-29 İyun Sürix, İsveçrə, 2019-cu il Avropa Venöz Forumunun 20-ci İllik Yığıncağının ELMİ PROQRAMI VƏ TƏKLİF KİTABI. Edizioni Minerva Medica24.

38. Castellani CA, Longchamps RJ, Sumpter JA, et al. Mitokondrial DNT nüsxə nömrəsi nüvə DNT CpG-lərinin metilasiyası vasitəsilə ölüm və ürək-damar xəstəliklərinə təsir göstərə bilər. Genom Med 202012:84.

39. Xarkeviç D.A. . Venotropik (flebotrop) maddələr. Eksp Klin Farmakol 200467:69-77. (rus dilində) [PMID: 15079914]

40. Felixsson E, Persson IA, Eriksson AC, Persson K. At şabalıdı ekstraktı iribuynuzlu heyvanların damarlarını daraldır və 5-HT(2A) reseptorları vasitəsilə insan trombositlərinin yığılmasına təsir göstərir: in vitro tədqiqat. Phytother Res 201024:1297-301.

41. Feldo M, Wójciak-Kosior M, Sowa I, et al. Xroniki venoz pozğunluqları olan xəstələrdə diosmin administrasiyasının angiogenezə təsir edən seçilmiş amillərə təsiri. Molekullar 201924:3316.

42. İvanov V, Roomi MW, Kalinovski T, Niedzwiecki A, Rath M. Bioflavonoidlər angiotensin II tərəfindən induksiya edilən kollagen matrisinin hamar əzələ hüceyrəsi vasitəçiliyi ilə daralmasını effektiv şəkildə maneə törədir. J Cardiovasc Pharmacol 200546:570-6.

43. Zheng Y, Zhang R, Shi W, et al. Sağlamlığa faydalı təbii birləşmə diosminin metabolizmi və farmakoloji fəaliyyəti. Qida funksiyası 202011:8472-92.

44. Coccheri S, Mannello F. Damar xəstəliklərində sulodexidin inkişafı və istifadəsi: müalicə üçün təsirlər. Drug Des Devel Ther 20138:49-65.

45. Zolotuxin IA, Porembskaya OY, Smetanina MA, Sazhin AV, Filipenko ML, Kirienko AI. Varikoz damarları: səbəbi tapmaq ərəfəsində? Annals RAMS 202075:36-45. (rusca).

46. ​​Maggioli A. Xroniki venoz pozğunluqlar: mikronize təmizlənmiş flavonoid fraksiyasının farmakoloji və klinik aspektləri. Flebolimfologiya 201623:82-91.

47. Ramelet AA. . Venoaktiv dərmanlar. In: Goldman MP, Weiss RA, redaktorlar. Skleroterapiya 6-cı nəşr. Varikoz və Telangiektatik Ayaq Damarlarının Müalicəsi. Elsevier 2017. səh. 426-34.

48. Mansilha A, Sousa J. Xroniki Venöz Xəstəliyin Patofizyoloji Mexanizmləri və Venoaktiv Dərman Müalicəsi üçün Təsirləri. Int J Mol Sci 201819:1669.

49. Paysant J, Sansilvestri-Morel P, Bouskela E, Verbeuren TJ. Mikronlaşdırılmış təmizlənmiş flavonoid fraksiyasında (Daflon 500 mq) mövcud olan müxtəlif flavonoidlər onun hamster yanaq kisəsinin mikrosirkulyasiyasında hiperkeçiriciliyə qarşı təsirinə kömək edir. Int Angiol 200827:81-5. [PMID: 18277344].

50. Yanuşko VA, Bayeshko AA, Sushkov SA, Nebylitsyn YS, Nazaruk AM. MPFF-nin ilkin xroniki venoz xəstəliklərlə əlaqəli simptomlar və həyat keyfiyyətinə faydaları: DELTA tədqiqatı. Flebolimfologiya 201421:146-51.

51. Graças C de Souza M, Cyrino FZ, de Carvalho JJ, Blanc-Guillemaud V, Bouskela E. Mikronize təmizlənmiş flavonoid fraksiyasının (MPFF) Xroniki Venöz Hipertansiyonun Yeni Eksperimental Modelinə Qoruyucu Təsirləri. Eur J Vasc Endovasc Surg 201855:694-702.

52. Kakkos SK, Nicolaides AN. Mikronize təmizlənmiş flavonoid fraksiyasının (Daflon®) xroniki venoz xəstəliyi olan xəstələrdə fərdi simptomların, əlamətlərin və həyat keyfiyyətinin yaxşılaşdırılmasında effektivliyi: randomizə edilmiş ikiqat kor plasebo-nəzarətli sınaqların sistematik icmalı və meta-analizi. Int Angiol 201837:143-54.

53. Rodnyansky DV, Fokin AA. [Varikoz ekzemasında diosmin tərkibli flebotrop dərmanlar]. Angiol Sosud Khir 201925:88-92.

54. Kurqinyan H.M., Raskin V.V. Mikronize təmizlənmiş flavonoid fraksiya ilə xroniki venoz çatışmazlığın müalicəsinə müasir baxış. Cardiovasc Ther Prev 202019:2592.

55. Ponomarev ÉA, Strepetov NN, Sotnikov IE, et al. [Aşağı ətrafların xroniki venoz çatışmazlığının müalicəsində Detravenolun istifadəsi]. Angiol Sosud Khir 202026:95-102.

56. Raffetto JD, Eberhardt RT, Dean SM, Ligi D, Mannello F. Venöz ayaq xorasının sağalmasını yaxşılaşdırmaq üçün farmakoloji müalicə. J Vasc Surg venoz limfa pozğunluğu 20164:371-4.

57. Bush R, Comerota A, Meissner M, Raffetto JD, Hahn SR, Freeman K. Xroniki venoz xəstəliyin tibbi idarə olunması üçün tövsiyələr: Mikronlaşdırılmış Təmizlənmiş Flavanoid Fraksiyasının (MPFF) rolu. Flebologiya 201732:3-19.

58. Melin MM, Dekan SM. RE: venoz ayaq xorasının sağalmasını yaxşılaşdırmaq üçün farmakoloji vasitələrin ədəbiyyat icmalı. Redaktora məktub. Yaralar 202032:A10.

59. ABŞ Səhiyyə və İnsan Xidmətləri Departamenti, Milli Səhiyyə İnstitutu, NCATS. İnksight: Narkotiklər. Vasculera. Buradan əldə etmək olar: https://drugs.ncats.io/drug/Z7R65IFU98. [Sonuncu dəfə 12 mart 2021-ci ildə daxil olub].

60. Casili G, Lanza M, Campolo M, et al. Xroniki venoz çatışmazlığın müalicəsində flavonoidlərin terapevtik potensialı. Vascul Pharmacol 2021137:106825.

61. ABŞ Səhiyyə və İnsan Xidmətləri Departamenti, Milli Səhiyyə İnstitutu, NCATS. İnksight: Narkotiklər. Diosmin. Buradan əldə etmək olar: https://drugs.ncats.io/drug/7QM776WJ5N. [Sonuncu dəfə 12 mart 2021-ci ildə daxil olub].

62. Sirtori CR. Aescin: farmakologiya, farmakokinetikası və terapevtik profili. Pharmacol Res 200144:183-93.

63. Stücker M, Debus ES, Hoffmann J, et al. Xroniki venoz xəstəliklərin simptomatik müalicəsinə dair konsensus bəyanatı. J Dtsch Dermatol Ges 201614:575-83.

64. Peralta GR, Arévalo Gardoqui J, Llamas Macías FJ, Navarro Ceja VH, Mendoza Cisneros SA, Martínez Macías CG. Ambulator xəstələrin venoz çatışmazlığının müalicəsində Ruscus aculeatus, hesperidin metilxalkon və askorbin turşusu ilə xroniki venoz çatışmazlığın müalicəsində klinik və kapilyaroskopik qiymətləndirmə. Int Angiol 200726:378-84.

65. Almeida Cyrino FZG, Balthazar DS, Sicuro FL, Bouskela E. Mikrosirkulyasiyaya venotonik dərmanların təsiri: Ruscus ekstraktı və mikronlaşdırılmış diosmin1 arasında müqayisə. Clin Hemorheol Microcirc 201868:371-82.

66. Kiesewetter H, Koscielny J, Kalus U, et al. Qırmızı üzüm yarpağının AS 195 (folia vitis viniferae) şifahi olaraq qəbul edilən ekstraktının xroniki venoz çatışmazlığında (I-II mərhələ) effektivliyi. Randomize, ikiqat kor, plasebo ilə idarə olunan sınaq. Arzneimittelforschung 200050:109-17.

67. Rabe E, Stücker M, Esperester A, Schäfer E, Ottillinger B. Xroniki venoz çatışmazlıqdan əziyyət çəkən xəstələrdə qırmızı üzüm yarpağı ekstraktının effektivliyi və tolerantlığı - ikiqat kor plasebo-nəzarətli tədqiqatın nəticələri. Eur J Vasc Endovasc Surg 201141:540-7.

68.Elleuch N, Zidi H, Bellamine Z, Hamdane A, Guerchi M, Jellazi N. CVD tədqiqatçıları. Alt ekstremitələrin xroniki venoz xəstəliyi olan xəstələrdə sulodeksid: Klinik effektivlik və həyat keyfiyyətinə təsiri. Adv Ther 201633:1536-49.

69. Chupin AV, Katorkin SE, Katel'nitskiĭ II, et al. Sulodexide xroniki venoz çatışmazlığın müalicəsində. Ümumrusiya çoxmərkəzli ACVEDUCT proqramının nəticələri. Angiol Sosud Khir 201824:47-55. (rusca).

70. Carroll BJ, Piazza G, Goldhaber SZ. Sulodexide venoz xəstəliklərdə. J Thromb Haemost 201917:31-8.

71. Qohil KJ, Patel JA, Qacar ​​AK. Centella asiatica üzrə Farmakoloji İcmal: Potensial Bitki mənşəli Müalicə. Hindistan J Pharm Sci 201072:546-56.

72. Martinez-Zapata MJ, Vernooij RW, Simancas-Racines D, et al. Venöz çatışmazlıq üçün phlebotonics. Cochrane Database System Rev 202011: CD003229.

73. Karetová D, Suchopár J, Bultas J. Diosmin/hesperidin: əməkdaşlıq edən tandem, yoxsa diosmin həlledicidir və hesperidin yalnız qeyri-aktiv tərkibdir? Vnitr Lek 202066:97-103.

74. Lust L, Kuk H, Kohlhaas J, Sticht C, Korff T. Diklofenak tərəfindən siklooksigenaz fəaliyyətinin inhibə edilməsi siçan damarlarının varikoz yenidən qurulmasını zəiflədir. Gəmi Plus 20215:7.