Məlumat

6.3: Oksotroflar və seçici mühitlər - Biologiya

6.3: Oksotroflar və seçici mühitlər - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

The görüşdü mutantlar Met auksotroflarıdır, yəni Met ehtiva etməyən mühitlərdə böyüyə bilmirlər. Məsələn, BY4742 ştammı mutasiyaları daşıdığı üçün HIS3, LEU2, LYS2 URA3 genlər, ştam yalnız histidin, lösin, lizin və urasil olan mühitlərdə böyüyəcəkdir. Transformasiya üçün istifadə olunan plazmidlər ana ştammda qüsurlu olan genin funksional allellərini daşıyır və bu, əsas qida maddələri olmayan mühitlərdə böyümək qabiliyyətinə görə transformantları seçməyə imkan verir.

Sintetik mühitlər auksotrofların yetişdirilməsi və öyrənilməsi üçün vacib vasitədir, çünki bütün komponentlər müəyyən edilmişdir. Maya tədqiqatçıları sintetik mühitlər üçün müxtəlif formulalar hazırlamışlar. Bütün sintetik mühitlərdə karbon mənbəyi (adətən D-qlükoza), azot mənbəyi və zəruri vitamin və minerallar var. Vitaminlər və minerallar adətən satın alınır
maya azot bazası (YNB) kimi tanınan formulada. Sintetik mühitə əlavə edilən əlavələr xüsusi genotiplərin böyüməsini dəstəkləmək və ya onlara qarşı seçmək üçün uyğunlaşdırıla bilər. Bu kursda biz çoxunun böyüməsini dəstəkləyən Maya Tam (YC) mühitindən istifadə edəcəyik S. cerevisiaesuşlar. YC-də vəhşi növ ştammların böyümə sürəti YPD kimi zəngin mühitlərdəkindən bir qədər yavaşdır, lakin ştammlar uzun müddət canlıdır. Sonrakı səhifədəki cədvəl zəngin amin turşuları və nukleotid əsaslarını ehtiva edən YC-nin tərkibini göstərir. Tam YC mühitinə əlavə olaraq, bəzi komponentlərin buraxıldığı selektiv mediadan da istifadə edəcəyik. Məsələn, bu laboratoriyada metionin istisna olmaqla, aşağıdakı cədvəldəki bütün YC komponentlərini ehtiva edən YC-Met “çıxış” mediasından istifadə edəcəyik.

*YNB vitaminlər, minerallar və duzların kompleks qarışığıdır. YC-də son konsentrasiyalar: Vitaminlər (μg/litr): biotin (2), kalsium pantotenat (400), fol turşusu (2), inositol (2000), niasin (400), p-aminobenzoy turşusu (200), piridoksin hidroxlorid (400), riboflavin (200), tiamin hidroxlorid (400) ).
Minerallar (μg/litr): bor turşusu (500), mis sulfat (40), kalium yodid (100), dəmir xlorid (200), manqan sulfat (400), natrium molibdat (200), sink sulfat (400).
Duzlar (mq/litr): monobazik kalium fosfat (1000), maqnezium sulfat (500), natrium xlorid (100), kalsium xlorid (100).
(Mənbə: labs.fhcrc.org/gottschling/Ye...tocols/yc.html)


Maya mediasına giriş

Mayalar eukaryotik mikroorqanizmlərdir ki, onların genomları hərtərəfli tədqiq edilmiş və bəziləri sıralanmışdır. Laboratoriya şəraitində böyümək nisbətən asandır. Üstəlik, kiçik genom ölçüsünə baxmayaraq, əksər eukariotlar arasında yüksək dərəcədə qorunan hüceyrə xüsusiyyətləri və prosesləri nümayiş etdirirlər. Məsələn, onlar yüksək eukariotlarda olanlara bənzər membrana bağlı orqanoidlərə, sitoskeleton, nüvə DNT və transkripsiya mexanizmlərinə malikdirlər. Bundan əlavə, mayalarda çox yaxşı xarakterizə olunan ifrazat zülalları və feromonlar var. Proteazların işlənməsi və ifrazında iştirak edən bir neçə maya geni də müəyyən edilmişdir. Beləliklə, mayalar uyğun molekulyar biologiya vasitələrinin köməyi ilə bir neçə eukaryotik gen və zülal tədqiqatları üçün istifadə edilə bilər. Maya mədəniyyətləri üçün bəzi tətbiqlərə zülal ifadə sistemlərinin sintezi, xüsusi gen və ya zülal funksiyalarının öyrənilməsi və yeni protein qarşılıqlı təsirlərinin təhlili daxildir. Onlar həmçinin fermentasiya, çörəkçilik və bioremediasiya kimi bir çox sənaye tətbiqləri üçün istifadə olunur.

Maya mədəniyyəti mediası həm kiçik, həm də böyük miqyaslı məqsədlər üçün böyümənin dəstəklənməsində mühüm rol oynayır. Tipik olaraq, maya mədəniyyət mühitinə pepton, maya ekstraktı və dekstroz və ya qlükoza daxildir. Media tərkibindəki cüzi fərqlər belə, fərqli böyümə xüsusiyyətlərinə malik mayalar verə bilər.


Cas9 tərəfindən yaradılan auksotroflar Phaeodactylum tricornutum plazmid əsaslı genlərlə tamamlana bilən kiçik və böyük silinmələrlə xarakterizə olunur

Model diatom Phaeodactylum tricornutum sintetik biologiya tətbiqləri üçün cəlbedici namizəddir. auksotrof ştammlarının inkişafı P. tricornutum tez-tez istifadə olunan antibiotik müqavimət genlərinə alternativ selektiv markerlər təmin edərdi. Burada CRISPR/Cas9 istifadə edərək, biz urasil, histidin və triptofan biosintetik yollarında genlərin uğurlu redaktəsini göstəririk. Redaktə hadisələri heterozigotluğun itirilməsi və böyük silinmələrin baş verməsi ilə xarakterizə olunur.

2.7-kb redaktə saytında mərkəzləşdirilmişdir. Urasil və histidin tələb edən fenotiplər, Cas9-redaktə edən plazmidin müalicəsindən sonra bütöv genlərin plazmid əsaslı surətləri ilə tamamlana bilər. 5-FOA və urasil ilə əlavə edilmiş mühitdə urasil auksotroflarının böyüməsi tamamlayıcı plazmidin itirilməsi ilə nəticələnir, deformasiya mühəndisliyi və CRISPR redaktəsində potensial tətbiqlərlə plazmidin müalicəsi üçün asan bir üsul təmin edir. Urasil auksotroflarının metabolomik xarakteristikası, nokaut ştammlarında orotat fosforibozil transferaz fəaliyyətinin qismən və ya tam itirilməsi ilə uyğun gələn hüceyrə orotat konsentrasiyalarında dəyişiklikləri aşkar etdi. Nəticələrimiz əhatə dairəsini genişləndirir P. tricornutum auxotrophic suşları və auksotrofik tamamlama markerlərinin ənənəvi olaraq istifadə edilən antibiotik seçim markerlərinə uyğun alternativ olduğunu nümayiş etdirir. Plazmid əsaslı auksotrofik markerlər genom mühəndisliyi tətbiqlərinin spektrini genişləndirməli və mühəndislik əsasında hazırlanmış biotəxminat üçün vasitə təmin etməlidir. P. tricornutum suşlar.


Nəticələr

Biosintetik yol genlərində Cas9 hədəflərinin müəyyən edilməsi

KEGG proqnozlarını 23,24 genom ardıcıllığına əsaslanaraq araşdırdıq P. tricornutum Cas9 redaktəsi üçün urasil və histidin biosintetik yollarında genləri müəyyən etmək. Biz urasil və histidin auksotrofiyası kimi bu iki yola diqqət yetirdik və əks seçim strategiyaları digər model orqanizmlərdə çox istifadə olunur. Bu yanaşma, urasil yolunda iki mərhələni katalizləyəcəyi proqnozlaşdırılan iki funksiyalı PtUMPS genini müəyyən etdi - orotatın orotidin monofosfata (OMP) çevrilməsi və OMP-nin uridin monofosfata (UMP) çevrilməsi (Şəkil 1A, Əlavə Şəkil 1). S1) 22 . Histidin biosintezində iştirak edən xarakterik fermentlərin ortoloqları olan zülallar da müəyyən edilmişdir (Şəkil 2A, Əlavə Şəkil S2). Bundan sonra PtPRA-PH/CH adlanacaq PHATR_3140 geni, bakterial zülal HisIE və onun bitki həmkarı HISN2 25,26 ilə ardıcıl oxşarlığı paylaşan proqnozlaşdırılan ikifunksiyalı zülalı kodlayır. Bu zülallar müvafiq olaraq fosforibozil-ATP pirofosfohidrolaza (PRA-PH) və fosforibozil-AMP siklohidrolaza (PRA-CH) fermentlərinə homoloji olan iki funksional sahəyə malikdir. PRA-PH və PRA-CH, tək və ya ikifunksiyalı bir zülal olaraq, histidin biosintezi yolunun əvvəlində baş verən iki ardıcıl addımı katalizləyəcəyi proqnozlaşdırılır (Şəkil 2A, Əlavə Şəkil S2). İmidazol qliserol fosfat sintazasını (HIS3 homoloqu) kodlayan PtIGPS geninin təkrarlanan gen olduğu aşkar edilmişdir. P. tricornutum genom montajı və buna görə də Cas9 hədəfi kimi prioritet deyil.

Biz həmçinin PtI3GPS-PRAI genini potensial hədəf kimi müəyyən etdik, çünki o, indol-3-gliserol-fosfat sintaza (I3GPS) və fosforibosilantranilat izomerazanın (PRAI) birləşməsindən ibarət proqnozlaşdırılan iki funksiyalı fermenti kodlayır və iki ardıcıl addımı katalizləyir. triptofan biosintezi yolunda (Əlavə Şəkil S3).

Proqnozlaşdırılan CRISPR tərəfindən yaradılan nokautlar P. tricornutum urasil biosintezi yolu. (A) Təxmin edilənin bir hissəsi P. tricornutum mavi rənglə vurğulanmış PtUMPS fermenti ilə karbon turşusunun urasil və uridin trifosfata çevrilməsi üçün biosintez yolu. Rəqabətli inhibitor, 5-fluoroorotik turşu (5-FOA), yola girdiyi yerdə kəsikli qutuda göstərilmişdir. Molekulların və fermentlərin qısaldılmış adları mötərizədə göstərilir və proqnozlaşdırılan müvafiq P. tricornutum gen adları kvadrat mötərizədə göstərilir. (B) PtUMPS genindəki potensial redaktə hadisələri üçün ekskonjugantları ekranlaşdırmaq üçün T7EI redaktə analizinin nümunə şəkli. Substrat PCR ilə gücləndirilmiş PtUMPS gen fraqmentlərini, T7 məhsulu isə Cas9 redaktəsinin sübutu olan ekskonjuqanları göstərir. WT, vəhşi tip P. tricornutum T7EI redaktə analizində istifadə edilən genomik DNT. M, 100 bp nərdivan, ölçüləri baza cütlərində (bp) göstərilən. Bu şəkil daha böyük təsvirdən kəsilib (Əlavə Şəkil S10). (C) İlkin konsentrasiyanın göstərilən qatılmasında tək L1 və ya L1 ilə əlavə edilmiş bir PtUMPS nokaut ştammının ((Delta) UMPS2) fenotipik skrininq nümunəsi. (D) Urasil ilə əlavə edilmiş L1 və ya urasil və zeosin ilə əlavə edilmiş L1 üzərinə örtməklə (Delta) UMPS2 nokaut ştamında zeosinə davamlı Cas9 redaktə plazmidinin itirilməsi üçün skrininq nümunəsi. (E) Üç ştammın hər bir alleli üçün göstərilən mövqe (izdən aşağıda) və daxiletmə və ya silinmə növü (izdən yuxarı) ilə xarakterizə edilən PtUMPS nokautlarının Sanger ardıcıllığı izləri. (F) Vəhşi tipli UMPS geninə nisbətən üç PtUMPS nokautunun hər biri üçün indellərin yeri və ölçüsünün qrafik xəritəsi (yuxarıda göstərilmişdir). Qırmızı düzbucaqlılar nukleotidlərin silinməsini, yaşıl üçbucaqlar nukleotidlərin daxil edilməsini, WT genindəki sarı və mavi düzbucaqlılar PtUMPS aktiv sahələrinin (orotat fosforibozil transferaz və orotidin-5'-fosfat dekarboksilaza) mövqeyini, kəsikli xətləri olan ağ düzbucaqlıları göstərir. intronlar təmsil edir.

Genomik hədəf sahələrini təsdiqləmək üçün biz PtUMPS və PtPRA-PH/CH genlərini PCR ilə gücləndirdik və ardıcıllaşdırdıq. P. tricornutum Laboratoriyamızda istifadə olunan CCAP 1055/1 ştammı. Həm PtUMPS, həm də PtPRA-PH/CH genləri üçün iki fərqli allel müəyyən edilmişdir. PtUMPS allellərindəki yeddi tək nukleotid polimorfizmi (SNPs) iki alleli bir-birindən və dərc olunmuş tədqiqatlardan fərqləndirən amin turşusu əvəzlənməsi ilə nəticələnir. P. tricornutum genom (Əlavə Cədvəl S1). Bütün əvəzetmələr PtUMPS zülalının qorunmayan bölgələrində yerləşir (Əlavə Şəkil S4). Eynilə, PtPRA-PH/CH geninin 2-ci allelində 1205-ci əsas mövqedə A-dan G-yə mutasiya müəyyən edilmişdir (Əlavə Cədvəl S1). Bu transversiya yüksək dərəcədə qorunan qlutamatı PRA-PH domeninin katalitik yerində qlisinə çevirir. Bu əvəzetmələrin PtUMPS və PtPRA-PH/CH funksiyasına təsiri məlum deyil.

Proqnozlaşdırılan CRISPR tərəfindən yaradılan nokautlar P. tricornutum histidin biosintezi yolu. (A) Mavi rənglə vurğulanmış bifunksional PtPRA-PH/CH fermenti ilə riboza-5-fosfatın l-histidinə çevrilməsi üçün proqnozlaşdırılan biosintez yolunun bir hissəsi. Hər bir ferment üçün qısaldılmış adlar mötərizədə göstərilir və proqnozlaşdırılan müvafiqdir P. tricornutum gen adları kvadrat mötərizədə göstərilir. (B) PtPRA-PH/CH genində potensial redaktə hadisələri üçün ekskonjugantları ekranlaşdırmaq üçün T7EI redaktə analizinin nümunə şəkli. Substrat PCR tərəfindən gücləndirilmiş PtPRA-PH/CH gen fraqmentlərini, T7 məhsulu isə Cas9 redaktəsinin sübutu olan ekskonjuqanları göstərir. WT, vəhşi tip P. tricornutum T7EI redaktə analizində istifadə edilən genomik DNT. M, 1 kb nərdivan, ölçüləri baza cütlərində (bp) göstərilən. Bu şəkil daha böyük təsvirdən kəsilib (Əlavə Şəkil S11). (C) Təkcə L1 bərk mühitdə və ya histidinlə əlavə edilmiş L1-də tamamlayıcı PRA-PH/CH plazmidi (pPtPRAPHCH) ilə və ya onsuz transformasiya olunmuş bir PtPRA-PH/CH nokaut ştammının ((Delta) PtPRAPHCH1) fenotipik skrininq nümunəsi. ilkin konsentrasiyanın göstərilən seyreltilməsi. WT, vəhşi tip P. tricornutum gərginlik. (D) Hər allel üçün göstərilən mövqe (izin altında) və daxiletmə və ya silinmə növü (izdən yuxarı) ilə xarakterizə olunan PtPRA-PH/CH nokautlarının Sanger ardıcıllığı izləri. (E) Vəhşi tipli PtPRA-PH/CH geninə nisbətən PtPRA-PH/CH nokautu üçün indellərin yeri və dərəcəsinin qrafik xəritəsi (yuxarıda göstərilmişdir). Qırmızı düzbucaqlılar nukleotidlərin silinməsini, WT genindəki sarı və mavi düzbucaqlılar isə PRA-PH və PRA-CH aktiv sahələrinin mövqeyini göstərir.

Oksotrof genlərin Cas9 və TevCas9 redaktəsi heterozigotluğun itirilməsi ilə xarakterizə olunur.

Urasil və histidin biosintetik genlərində nokautlar yaratmaq üçün biz PtUMPS, PtPRA-PH/CH və PtI3GPS-PRAI genlərindəki müxtəlif saytlara qarşı Cas9 və TevCas9 tək bələdçi RNT (sgRNA) hazırladıq və fərdi şəkildə klonladıq (Cədvəl 1, Əlavə Şəkil S5). –S7). TevCas9 nukleazı ikili nüvədir və I-TevI ​​(Tev) və Cas9 kəsik yerləri arasında 33-38 baza cütü silinməsi yaradır 27 . TevCas9 nukleazı üçün hədəfləmə tələbləri 5-dən yuxarıda (sim) 15-18 əsas cüt yerləşdirilmiş I-TevI ​​5 (^prime) -CNNNG-3 (^prime) parçalanma motividir. (^prime) sgRNA bağlanma yerinin sonu. Cas9 və ya TevCas9 redaktə plazmidləri köçürüldü P. tricornutum zeosin tərkibli mühitlərdə seçilmiş bakterial konjuqasiya və ekskonyuqantlarla.

Biz ilk olaraq ekranlaşdırma ilə redaktəni qiymətləndirdik P. tricornutum hər bir hədəf gendən gücləndirilmiş PCR məhsulları üzrə T7 endonükleaza I (T7EI) uyğunsuzluğu parçalanma analizləri ilə ekskonjuqantlar (Şəkil 1B, 2B, Cədvəl 1). Bu analiz, ekskonjugantların skrininqinə əsaslanaraq aşkar edilə bilən redaktə dərəcələri ilə 6 sgRNA müəyyən etdi. Redaktəni göstərən koloniyalar seyreltildi, alt klonlar əldə etmək üçün örtüldü və sonra auksotrofik əlavə (urasil və ya histidin) olan və olmayan bərk mühitdə müvafiq auksotrofik fenotip üçün ekranlaşdırıldı (Şəkil 1C, 2C). Cas9-redaktə edən plazmidləri müalicə etmək üçün nokaut ştammları 1 həftə ərzində zeosin seçimi olmadan yetişdirildi və tək koloniyalar əldə etmək üçün seyreltmələr örtüldü. Koloniyalar plazmid itkisini yoxlamaq üçün zeosinli və zeosinsiz L1 plitələrinə zolaqlar çəkdilər. Cas9-redaktə edən plazmidin itirilməsi səbəbindən zeosin həssaslığını nümayiş etdirən nümayəndəli şəkil Şəkil 1D-də göstərilmişdir. PtUMPS geninin nokautu üçün, nokautların monoalel və ya bialel olduğunu müəyyən etmək üçün urasil tələb edən fenotipli 3 altklonu daha da xarakterizə etdik. Çünki iki PtUMPS alleli P. tricornutum bir-birinə nisbətən SNP-lərə sahib idik, biz allele-xüsusi redaktə hadisələrinin xəritəsini çəkə bildik (Şəkil 1E, F). Ştatlardan ikisi, (Delta) UMPS1 və (Delta) UMPS2, bialel idi və bir allel kiçik silinməyə (< 20 bps), digəri isə böyük silinməyə (>) malik olmaqla heterozigotluq itkisi nümayiş etdirdi. 610 bp). Üçüncü səciyyələndirilən alt klon, (Delta) UMPS3, monoalel idi və homozigot 1-bp daxilə malik idi. Histidin tələb edən fenotip yaradan PtPRA-PH/CH nokautları üçün (Şəkil 2B,C) bir altklonun məqsədyönlü ardıcıllığı bir alleldə 11-bp silinməsi və ikincidə 6-bp silinməsi ilə biallelik genotip aşkar etdi. allel (Şəkil 2D,E).

Redaktə edilmiş böyük silinmələr P. tricornutum Nanopore amplikon ardıcıllığı ilə tutulan metabolik genlər. hər biri üçün (AE), hədəf genin adı, eləcə də redaktə fermenti göstərilir. The ən solda süjet, PCR amplikonundakı mövqeyə nisbətən redaktə edilmiş nümunə (qara nöqtələr) və vəhşi tipli nümunə (narıncı nöqtələr) üçün 5-bp pəncərəsi üzərində orta hesablanmış normallaşdırılmış oxu əhatəsini göstərir. X oxundakı nömrələmə hər bir gen üçün ATG başlanğıc kodonuna nisbidir, yuxarıdakı ardıcıllıq mənfi (-) simvolu ilə və aşağı axın ardıcıllığı artı (+) simvolu ilə göstərilir. Yaşıl şaquli xətt Cas9 və ya TevCas9 parçalanma yerini, kölgəli düzbucaqlı isə ORF-ni göstərir. The orta süjet silinmələrin sıxlığıdır > 50-bp. The ən sağda qrafikdə x oxunun nömrələnməsi ilə PCR amplikonundakı vəziyyətinə nisbətən silinmələrin uzunluğunu və mövqeyini > 50-bp göstərir. ən solda panel. Hər bir üfüqi xətt xəritələnmiş silinmə hadisəsini göstərir. Silinmələr ən uzundan kiçiyə doğru sıralanır. Yaşıl xətt Cas9 və ya TevCas9 dekolte yerini göstərir.

Urasil- və histidin-auksotroflarda müşahidə edilən delesiya növləri heterozigotluğun itirilməsi ilə nəticələnən heterojen redaktə hadisələri ilə uyğun gəlir 28,29,30 . Bu müşahidələri genişləndirmək üçün biz Cas9-un redaktə tədqiqatlarında tez-tez nəzərdən qaçırılan böyük silinmələrin spektrini daha yaxşı qiymətləndirmək üçün Nanopore ardıcıllığından istifadə etdik. PtUMPS genində möhkəm redaktə göstərən iki sgRNA-ya əlavə olaraq, biz PtUREASE geni 6 və PtI3GPS-PRAI geninə yönəlmiş sgRNA-ları olan ekskonyuqantlarda silinmə hadisələrini araşdırdıq. Hər bir təcrübə üçün (sim) 1000 ekskonyuqant birləşdirildi və amplikonun ortasında proqnozlaşdırılan Cas9 və ya TevCas9 hədəf sahələri ilə hədəf genlərin hər biri üçün (sim) 6 kb PCR məhsulu yaradıldı. Diqqətimizi > 50 bp silinmələrə yönəltdik, çünki bu silinmələr adətən hədəflənmiş amplikon ardıcıllığında az bildirilir. Cas9 və TevCas9 redaktə təcrübələrindən (qara nöqtələr) gücləndirilmiş məhsullar üçün proqnozlaşdırılan sgRNA hədəf saytları ətrafında mərkəzləşmiş Nanopore oxunma əhatəsində, bu saytlarda redaktə ilə uyğun gələn nəzarət təcrübələri (narıncı nöqtələr) üçün oxu əhatəsi ilə müqayisədə bir azalma qeyd etdik (Şəkil 2). 3, sol panellər). Silinmə başlanğıc və son nöqtələrinin xəritələşdirilməsi aşkar etdi ki, silinmələrin əksəriyyəti Cas9 və ya TevCas9 hədəf saytında mərkəzləşib (Şəkil 3, sağ panellər), 2700 bp-ə qədər uzanan silinmələrlə (Şəkil 3, Mərkəz panel). Nanopore ardıcıllığı və > 50 bp ilə araşdırılan redaktə hadisələri üçün orta silinmə uzunluğu Cas9 üçün 1735±719 bp və TevCas9 üçün 2006±633 bp olmuşdur.

Kollektiv olaraq, bu məlumatlar göstərir ki, biosintetik genlərin Cas9 və ya TevCas9 redaktəsi asanlıqla yarada bilər. P. tricornutum fenotipik və ya genetik ekranlarla müəyyən edilə bilən auksotroflar. Üstəlik, məlumatlarımız Cas9 redaktəsinin (və burada TevCas9 redaktəsinin) heterozigotluq itkisini axtarmaq üçün skrininq strategiyaları açıq şəkildə tərtib edilmədikcə, adətən qaçırılacaq böyük silmələr yaratdığını göstərən artan sübutlar toplusu ilə razılaşır.

PtUMPS nokautlarının fenotipik və metabolomik xarakteristikası. (A) Vəhşi tip (WT), (Delta) UMPS1 və (Delta) UMPS2 ştammlarının L1 bərk mühitdə ləkəli örtük analizləri, L1 urasil ilə, L1 5-FOA ilə və ya L1 hər ikisi ilə tamamlanır urasil və 5-FOA. Göstərilən qatılmalar ilkin konsentrasiyaya nisbətəndir. (B) Vəhşi tipli (WT), (Delta) UMPS1 və (Delta) UMPS2 ştammlarının maye böyümə əyriləri tək L1 maye mühitində və ya urasil və ya 5-FOA və ya hər ikisi ilə əlavə edilmişdir. Məlumat nöqtələri ortanın standart xətasını təmsil edən xəta çubuqları ilə üç müstəqil təkrarın ortasıdır. (C) Orotat konsentrasiyaları urasil əlavəsi ilə və olmadan yetişdirilən mədəniyyətlərdən LC-MS ilə ölçüldü. Çubuqlar orta dəyərləri, səhv çubuqları isə üç bioloji təkrar üçün standart kənarlaşmanı təmsil edir. Fərdi məlumat nöqtələri rəngli nöqtələr kimi təmsil olunur. Statistik etimad səviyyəsi birtərəfli t testi ilə hesablanmışdır. p < 0,001 ulduz işarəsi ilə göstərilir. (D) 14 günlük artımdan sonra müxtəlif PtUMPS konstruksiyalarını saxlayan (Delta) UMPS1 və (Delta) UMPS2 ştammlarında plazmid tutma faizini göstərən bar qrafiki. Çubuqlar üç müstəqil replikadan seçilmiş L1 + nourseotrisinlə qeyri-selektiv L1 plitələrindəki koloniyaların orta nisbətini təmsil edir, xəta çubuqları isə ortalamanın standart xətasını təmsil edir.

PtUMPS nokautlarının fenotipik və metabolomik xarakteristikası

Urasil tələb edən iki auksotrof ((Delta) UMPS1 və (Delta) UMPS2) urasil və 5-FOA ilə və urasilsiz L1 mühitinə ilk ləkə ilə örtülməklə sonrakı xarakteristikalar üçün seçilmişdir (Şəkil 4A). PtUMPS nokaut suşları yalnız urasil əlavəsi olduqda sağ qala bildi. Bundan əlavə, nokautlar vəhşi tipli bitkilərin böyüməsini tamamilə maneə törədən 5-FOA konsentrasiyalarında sağ qaldılar. P. tricornutum (Şəkil 4A). Bu, əvvəllər müşahidə edilən fenotiplərə uyğundur P. tricornutum UMPS nokautları 7,22. Həm 5-FOA, həm də urasil ilə əlavə edilmiş mühitlərdə (Delta) UMPS1-in (Delta) UMPS2 üzərində cüzi artım üstünlüyü var idi, lakin təkcə urasil olan mediada deyil. Müşahidə olunan fenotiplərin bərk və maye mühitdə uyğun olub-olmadığını müqayisə etmək üçün biz maye mühitdə 10 gün ərzində bu suşların böyüməsini izlədik (Şəkil 4B) və artım templərinin bərk mühitdə müşahidə olunanlarla uyğun olduğunu aşkar etdik. fərq (Əlavə Şəkillər S8, S9, Əlavə Cədvəl S3). (Delta) UMPS1-in (Delta) UMPS2 üzərindəki artım üstünlüyü həm 5-FOA, həm də urasil ilə əlavə edilmiş bərk mühitdə müşahidə edilən (Delta) UMPS1 və UMPS1 üçün yaranma müddətləri kimi maye mühitdə təkrarlanmadı. (Delta) UMPS2 çox oxşar idi (müvafiq olaraq (sim) 24 və (sim) 22 saat).

PtUMPS nokautlarının urasil metabolizminə təsirini araşdırmaq üçün biz vəhşi tipli və nokaut suşlarında LC-MS istifadə edərək UMPS substrat orotatında məqsədyönlü metabolomikalar həyata keçirdik (Şəkil 4C). Biz yabanı tipə nisbətən nokaut ştammlarında orotatın artmasının olacağını proqnozlaşdıran urasil yolunda orotatın ara məhsulunu xarakterizə etməyə diqqət yetirdik (Şəkil 2A, 4C). Biz (Delta) UMPS1 ştammında urasil əlavəsi (-urasil) olmadıqda və ya (Delta) UMPS2 ştamında -urasil və ya +urasil vəziyyətində orotatı aşkar edə bilmədik. L1 mühiti minimal L1 mühiti (-urasil) ilə müqayisədə urasil (+urasil) ilə əlavə edildikdə vəhşi tipli ştammda hüceyrə orotat səviyyəsinin (sim) altı dəfə artması müşahidə edilmişdir (Şəkil 4C). Maraqlıdır ki, (Delta) UMPS1 ştammı urasil əlavəsi ilə yetişdirildikdə biz urasil ilə yetişdirilən vəhşi növ ştammda müşahidə olunanlara oxşar səviyyədə orotat aşkar etdik. Bu nəticə onu göstərir ki, (Delta) UMPS1 nokaut ştammındakı allel 1 (çərçivə daxilində 18-bp silinmə ilə) vəhşi tipli ştamla oxşar davranan UMPS fəaliyyətini saxlayır. Bunun əksinə olaraq, (Delta) UMPS2 ştamında ODC və OPRT fəaliyyətini ləğv edən iki çərçivədən kənar silinmə var. Biz güman edirik ki, (Delta) UMPS2 ştammında aşkar edilə bilməyən orotat səviyyələri onun başqa biosintetik yola yönəldilməsi ola bilər.

Urasil və histidin auksotroflarının plazmid komplementasiyası

Plazmid əsaslı komplementasiya P. tricornutum auxotrophs Cas9-redaktə hadisəsinin auksotrofik fenotipin səbəbi olduğunu təsdiqləyəcək, həmçinin epizomal vektorları saxlamaq üçün antibiotik əsaslı seçim üsullarına alternativ təmin edəcək. Biz əvvəlcə hər bir PtUMPS allelinin həm gDNA, həm də cDNA versiyalarını yerli promotor və terminatorla nourseotrisinə davamlı pPtGE31 ifadə plazmidinə klonlayaraq urasil tələb edən fenotipin tamamlamasını araşdırdıq. Bu plazmidlər pPtUMPSA1, pPtUMPSA2, pPtUMPScA1 və pPtUMPScA2 (Əlavə Cədvəl S3) təyin edildi və konyuqasiya yolu ilə (Delta) UMPS1 və (Delta) UMPS2 ştammlarına köçürüldü. Ekskonyuqantlar urasil və 5-FOA əlavəsi olan və olmayan bərk L1 mühitinə ləkələnmişdir (Şəkil 4A). Bütün tamamlanmış suşlar minimal L1 mühitində böyüdü, tamamlanmamış nokautlar isə olmadı, bu da pPtGE31 plazmidindən UMPS geninin ifadəsini təsdiqləyir. Yalnız 5-FOA-da heç bir gərginlik artmadı. Gözlənilmədən, tamamlanmış suşların bəziləri həm 5-FOA, həm də urasil ilə əlavə edilmiş lövhələrdə sağ qaldı. Məsələn, (Delta) UMPS2 allel 1 tamamlayıcı plazmidlərdən (pPtUMPSA1 və pPtUMPScA1) hər hansı biri ilə transformasiya edildikdə, urasilin iştirakı ilə 5-FOA-ya aydın müqavimət müşahidə edildi. Bərk mühitdə müşahidə olunan fenotiplər, suşlar oxşar mühit əlavəsi ilə maye mühitdə böyüdükdə müşahidə olunanlara uyğun idi (Əlavə Şəkillər S8, S9).

Urasil və 5-FOA ilə əlavə edilmiş mühitlərdə (Delta) UMPS1 və (Delta) UMPS2 ştammlarının böyümə fenotipi 5- metabolizə edən bütöv PtUMPS genini daşıyan plazmidə qarşı əks seçimlə izah edilə bilər. Zəhərli ara məhsula FOA. Beləliklə, 14 günlük böyümədən sonra nourseotrisinli və olmayan bərk L1 üzərində müxtəlif ekspressiv plazmidlər daşıyan (Delta) UMPS1 və (Delta) UMPS2 ştammlarını örtməklə tamamlanmış ştamlarda plazmid itkisini sınaqdan keçirdik. Şəkil 4D-də göstərildiyi kimi, L1 üstəgəl nourseotrisinlə L1 plitələrindəki koloniyaların nisbəti ilə ölçülən plazmid tutulması (sim) 1-dən (sim) 33%-ə qədər bütün ştammlarda ciddi şəkildə azalmışdır. . Bu müşahidə nə üçün koloniyaların 5-FOA və urasil ilə əlavə edilmiş L1 mühitində asanlıqla göründüyünü izah edə bilər və PtUMPS genini daşıyan plazmidlərin PtUMPS nokaut ştammlarından sağalmasının müvafiq mühitdə böyümənin sadə məsələsi olduğunu təklif edə bilər.

Eynilə, biz PtPRA-PH/CH geninin vəhşi tipli nüsxəsini ekspressiya vektoruna klonlaşdırmaqla və konyuqasiya yolu ilə plazmidi (Delta) PRAPHCH1 ştammına çevirməklə histidin tələb edən fenotipi tamamlaya bildik. Tamamlayıcı plazmidi olan (Delta) PRAPHCH1 ştammı histidin əlavəsi olan və olmayan bərk L1 mühitində böyüdü, halbuki tamamlayıcı plazmidsiz (Delta) PRAPHCH1 ştammı yalnız histidin əlavəsi ilə L1 mühitində böyüdü (Şəkil 2). 2C).


Protokol

1. Təhlükəsiz və Steril İş Yeri Hazırlayın

Mikroorqanizmlərlə işləyərkən görülməli olan bütün laboratoriya qaydaları və təhlükəsizlik tədbirləri ilə tanış olun. Biotəhlükə təsnifatından asılı olmayaraq, mikroorqanizmlərlə təmasda olan bütün materiallar yoluxucu tullantı hesab olunur və utilizasiyadan əvvəl zərərsizləşdirilməlidir. İnstitusional Ətraf Mühitin Sağlamlığı və Təhlükəsizliyi departamentləri tərəfindən təmin edilənlərə uyğun olaraq təhlükəsizlik qaydalarına əməl edin, potensial çirklənmiş materialların (bioloji təhlükələrin) dərhal və lazımi şəkildə atılması üçün müvafiq tullantı qabları hazırlayın.

Kaplama prosedurları üçün istifadə etməzdən əvvəl bütün alətləri, məhlulları və medianı sterilizasiya edin.

Laboratoriya skamyasında iş sahənizi darmadağın edən bütün materialları təmizləyin.

Mümkün çirklənməni minimuma endirmək üçün iş yerini dezinfeksiyaedici ilə təmizləyin.

Bunsen ocağı qurun və alovun yuxarı qalxması nəticəsində yaranan steril sahə ərazisində yavaş-yavaş, ehtiyatla və qəsdən işləyin.

BSL-2 orqanizmləri ilə işləyirsinizsə, iş yerinizi Biotəhlükəsizlik kabinetində qurun. Bunsen ocağını şkafın içərisində istifadə etmək olmaz, çünki alovdan gələn istilik onun funksionallığı üçün vacib olan hava axınını pozur.

Prosedur üçün lazım olan bütün ləvazimatları steril sahənin yaxınlığındakı laboratoriya skamyasında təşkil edin. Bütün materialların düzgün etiketləndiyinə əmin olun. İşin səmərəliliyini artırmaq və lazımsız hərəkətlərdən qaçınmaq üçün iş sahəsinin təşkili eksperimental materialların havadakı çirkləndiricilərə məruz qalma müddətini minimuma endirəcəkdir.

Bunsen burnerini skamyada sağınıza qoyun.

Aqar plitələrini və ya Petri qablarını solunuza qoyun.

Hüceyrə kulturalarını, boruları, kolbaları və şüşələri dəzgahın ortasına düzün.

Boruların, kolbaların və şüşələrin qapaqlarını gevşetin ki, sonrakı manipulyasiyalar zamanı bir əllə asanlıqla açılsın.

Mikroorqanizmlərlə işləməzdən əvvəl əlləri antiseptik sabun və ilıq su ilə yaxşıca yuyun.

2. Streak Plate Proseduru: Quadrant Metodundan istifadə edərək Bakterial Koloniyaların İzolyasiyası

Zolaqlı lövhə proseduru sadə mexaniki ayırma yolu ilə qarışıq populyasiyalardan təmiz bakteriya mədəniyyətlərini və ya koloniyalarını təcrid etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. Tək koloniyalar agar boşqabında və ya içərisində çoxluqda böyüyən milyonlarla hüceyrədən ibarətdir (Şəkil 1). Koloniya, tək bir hüceyrədən fərqli olaraq, çılpaq gözlə görünür. Nəzəri olaraq, bir koloniyadakı bütün hüceyrələr əvvəlcə boşqabda yerləşdirilən tək bir bakteriyadan əldə edilir və buna görə də klon və ya genetik olaraq eyni hüceyrələrin çoxluğu adlanır.

Bakteriyalar müxtəlif forma və ölçülərdə mövcuddur. Məsələn, fərdi Escherichia coli hüceyrələr çubuq şəklindədir, orta uzunluğu 2 milyard sm, eni isə 0,5 milyard santimetrdir. Streptokokk hüceyrələr orta diametri 1 º03 milyard sm olan sferikdir. Bəzi bakteriyalar (məsələn E. coli) tək hüceyrələr kimi mövcuddur, digərləri isə fərqli birləşmə nümunələri yaradır. Streptokokkməsələn, cüt-cüt böyüyür və ya zəncir və ya hüceyrə qrupları əmələ gətirir. Ümumiyyətlə tək koloniyanın ikili parçalanmaya məruz qalan tək bir hüceyrədən əmələ gəldiyi güman edilir, lakin bu fərziyyə təbii olaraq cütlər, zəncirlər və ya çoxluqlar şəklində mövcud olan və ya digər mexanizmlərlə bölünən bakteriyalar üçün doğru deyil. Alternativ olaraq, çox sayda bakteriya örtülürsə, hüceyrələrin üst-üstə düşməsi baş verə bilər və iki və ya daha çox bakteriyanın tək bir koloniyaya səbəb olma ehtimalını artıra bilər. Möhkəm mühitdə böyüyən bakterial kulturaları təsvir edərkən və ya sadalayarkən bu fəsadların qarşısını almaq üçün koloniyalar belə adlandırılır. koloniya əmələ gətirən vahidlər (cfu).

Zolaqlı lövhə proseduru ilə hüceyrə qarışığı Petri qabında yarı bərk, agar əsaslı qida mühitinin səthinə yayılır ki, daha az və daha az bakterial hüceyrə mühitin səthində geniş şəkildə ayrılmış nöqtələrdə yerləşdirilsin. və inkubasiyadan sonra koloniyalara çevrilir. Hüceyrələrin qarışığından tək koloniyaları təcrid etmək üçün kvadrant üsulu burada təsvir olunacaq.

Çizgilərin örtülməsi bir sıra müxtəlif alətlərlə həyata keçirilə bilər (Şəkil 2). Metal döngə bir neçə dəfə təkrar istifadə edilə bilər və adi laboratoriya ştammları üçün istifadə olunur. Birdəfəlik plastik ilmələr kommersiyada mövcuddur və biotəhlükəsizlik şkafında BSL-2 ştammları ilə işləyərkən daha çox istifadə olunur. Bir çox tədqiqatçı alim zolaqlar üçün birdəfəlik, əvvəlcədən sterilizasiya edilmiş taxta çubuqlardan və ya düz diş çubuğundan istifadə etməyi üstün tutur. Bunlar birdəfəlik plastik döngələrə ucuz alternativdir və spora əmələ gətirən bakteriyaların olduğu torpaq kimi ətraf mühit nümunəsi ilə işləyərkən xüsusilə faydalı ola bilər.

Birdəfəlik əvvəlcədən sterilizasiya olunmuş çubuqlar və diş çubuqları Bunsen burnerində yandırılmamalıdır, beləliklə, spora yaradan bakteriyaların lazımsız aerozollaşmasının və laboratoriya səthlərinin və ya agar lövhələrinin sporlarla çarpaz çirklənməsinin qarşısını alır.

Aqar boşqabının alt hissəsinin kənarına (qapağına deyil) ən azı adınız, tarix, böyümə mühitinin növü və mühitin üzərinə qoyulacaq orqanizmin növü ilə etiketləyin.

Plitələr qapaqda kondensasiya olmadan tamamilə qurudulmalı və zolaqlar qoymadan əvvəl otaq temperaturuna qədər qızdırılmalıdır. Plitələr 4 ºC-də saxlanılırsa, onları bir neçə saat və ya bir gün əvvəl çıxarın. Onları 2-3 boşqabdan çox olmayan kiçik, pilləli yığınlara yayın və qurumağa icazə verin.

Zolaq lövhəsinin aşılanacağı nümunə ya bulyondakı hüceyrələrin süspansiyonu, ya da başqa bir agar boşqabının mövcud koloniyası ola bilər. Başlamaq üçün, bir boşqabın aşılanması üçün yalnız bir nümunənin istifadə edilməsi tövsiyə olunur. Vaxta və materiallara qənaət etmək üçün bir boşqab birdən çox nümunə üçün istifadə oluna bilər, ancaq bir nümunəni boşqabda çəkməyi bacardıqdan sonra.

Birinci kvadrant üçün nümunə götürülür və sürətli, hamar, irəli-geri hərəkətlə mühitin səthinin təxminən dörddə birinə yayılır (Panel A Şəkil 3). Dəzgahdan ters çevrilmiş boşqabın alt yarısını qaldırın. Döngəni, çubuq və ya diş çubuğunu ağar səthi boyunca kənardan boşqabın mərkəzinə qədər dəfələrlə irəli-geri hərəkət etdirin.

Əgər inokulum hüceyrə süspansiyonudursa, metal ilmə ilə ilgək dolusu və ya mikropipettorla 5-10 μl alın. Kaplama üçün alikvotu çıxarmazdan əvvəl hüceyrə süspansiyonunu burulğanla və ya burulğanladığınızdan əmin olun. Bu addımı yerinə yetirərkən aseptik texnikadan istifadə edin, inokulumu götürməzdən əvvəl və sonra təkcə ilməni deyil, həm də şüşə və ya borunun kənarını yandırın. Həmçinin, borunun və ya şüşənin kənarlarına mikropipetatorun ilgəsi və ya lüləsi ilə toxunmayın. Əgər inokulum pipetlənirsə, hüceyrə süspansiyonunu boşqabın müvafiq yerinə paylayın, sonra onu lövhənin birinci kvadrantına yaymaq üçün ilgək, çubuq və ya diş çubuğundan istifadə edin.

Əgər inokulum başqa boşqabın koloniyasıdırsa, koloniyaya ilgək, çubuq və ya diş çubuğu ilə yumşaq bir şəkildə toxunun və sonra onu boşqabın birinci kvadrantına yayın. Koloniyaya toxunmadan əvvəl metal döngənin soyuduğundan əmin olun. Döngənin çox isti olmamasına əmin olmaq üçün ona heç bir zolaq əmələ gəlməyəcəyi təyin olunmuş yerdə agar boşqabına yüngülcə toxunun. Koloniyadan yalnız bir neçə hüceyrə lazımdır, bütün koloniya deyil.

Əgər metal ilmədən istifadə edirsinizsə, boşqab üçün inokulum almadan əvvəl onu Bunsen ocağı ilə yandırın (Panel B Şəkil 3). Döngədən təxminən 3-4 düymdən başlayın, tel mavi koninin ucunda, alovun ən isti hissəsidir. Metal qırmızı isti olmalıdır. Teli hərəkət etdirin ki, alov döngəyə yaxınlaşsın. Bu manipulyasiya əvvəlki istifadədən döngədə qalan bakteriyaların aerozollaşmasının qarşısını alır.

Alovlanma bakteriyaları (sporlar olmasa da) öldürür və qızdırılan havadan gələn konveksiya cərəyanları sonrakı manipulyasiyalar zamanı digər havadakı çirkləndiricilərin metal məftil üzərinə çökməsinə mane olur.

Steril yastı diş çubuğundan istifadə edirsinizsə, dar ucunu baş barmağınız və üzük barmağınız arasında orta ilə 10-20° bucaq altında yumşaq bir şəkildə tutun və geniş ucundan dörddəbirləri kəsmək üçün istifadə edin. Döngə və ya taxta çubuq istifadə edirsinizsə, onu qələm kimi eyni bucaq altında saxlayın. Döngə, çubuq və ya diş çubuğu ağarın içinə girəcək qədər bərk basmayın.

Birinci kvadrantı tamamladıqdan sonra boşqabı ters çevirin və skamyadakı qapağa geri qoyun. Çubuğu və ya diş çubuğunu atın və ya 4-cü addımda təsvir olunduğu kimi metal döngəni yenidən yandırın.

Petri qabını ikinci kvadrantı cızmaq üçün 90 ° çevirin. Dəzgahdan ters çevrilmiş boşqabın alt yarısını qaldırın, sonra son zolağın sonuna yaxın birinci kvadrant üçün ilgəyə, çubuq və ya diş çubuğuna toxunun. İrəli-geri naxışdan istifadə edərək, birinci kvadrantdakı zolaqların son yarısını keçin, sonra boş ikinci kvadrantda keçin. İkinci kvadrant doldurulduqdan sonra boşqabı ters çevirin və yenidən dəzgahın qapağına qoyun.

Döngə, çubuq və ya diş çubuğu heç vaxt orijinal əkinin çox hissəsinin yerləşdirildiyi birinci kvadrantdakı zolaqların birinci yarısına qayıtmamalıdır.

Hər kvadrant üçün yeni bir plastik döngə, taxta çubuq və ya diş çubuğu istifadə edilməlidir.

Üçüncü və dördüncü kvadrantlar üçün №6 addımı iki dəfə təkrarlayın.

Çubuğu və ya diş çubuğunu atdığınızdan və ya hər kvadrant arasındakı metal döngəni yenidən alovlandırdığınızdan əmin olun.

Dördüncü kvadrantı kəsərkən birinci kvadranta girməkdən çəkinin.

Plitəni alt-üst inkubasiya edin ki, qapaqda yığılan kondensasiya koloniyalara damlamasın.

3. Boşqabın tökülməsi proseduru: Qarışıq Nümunədə Bakterial Hüceyrələrin Sadalanması

Bu üsul tez-tez qatılaşmadan əvvəl ərimiş agar mühitinə əlavə edilən qarışıq nümunədəki mikroorqanizmlərin sayını hesablamaq üçün istifadə olunur. Proses, müvafiq nümunənin seyreltilməsi ilə örtüldükdə bərk mühitdə bərabər paylanmış koloniyalarla nəticələnir. Bu texnika, bir boşqabda agarın daxilində və səthində koloniya əmələ gətirən vahidlərin ümumi sayının sadalandığı həyat qabiliyyətli boşqab hesablamalarını həyata keçirmək üçün istifadə olunur. Canlı boşqab sayları elm adamlarına böyümə əyriləri yaratmaq, nümunənin örtüldüyü borudakı hüceyrələrin konsentrasiyasını hesablamaq və müxtəlif mühitlərin və ya böyümə şəraitinin bakteriya hüceyrələrinin sağ qalmasına və ya böyümə sürətinə təsirini araşdırmaq üçün standartlaşdırılmış vasitələr təqdim edir.

Steril, lakin boş Petri qabının dibinin kənarına (qapağına deyil) ən azı adınız, tarix, böyümə mühitinin növü və ərinmiş agar mühitinə əlavə olunacaq orqanizmin növü ilə etiketləyin.

Kaplama zamanı seyreltmə faktorunu daxil edin seriyalı seyreltmələr, və ya nümunədəki hüceyrələrin konsentrasiyasının sistematik azalması ilə nəticələnən bir sıra təkrar seyreltmələr. Nümunədəki hüceyrələrin sayı statistik əhəmiyyətli diapazonun 30-dan 300 cfu-a qədər olan agar boşqabının tutumundan artıq olarsa, seriyalı seyreltmələrin hazırlanması zəruridir. Bir boşqabda 300 cfu-dan çox varsa, o zaman koloniyalar sıx və üst-üstə düşəcək.

18 ml ərinmiş agar mühiti olan bir boru alın.

Agar mühiti sınaq borularına tökülməli və avtoklavda əvvəlcədən sterilizasiya edilməlidir. Təcrübə üçün lazım olduğu gün, agar 30 dəqiqə buxarda əridilməlidir, sonra 55 ºC su banyosuna köçürülməlidir. Yalnız təcrübə üçün lazım olan qədər agar əridilməlidir, çünki onu təkrar istifadə etmək mümkün deyil.

Plitələrin tökülməsindən on dəqiqə əvvəl ərinmiş agar boruları 55°C su banyosundan 48°C-də quraşdırılmış laboratoriya skamyasındakı istilik blokuna köçürülməlidir. Agar bu temperatura çatdıqdan sonra tökməyə hazırdır. Əgər agar çox isti olarsa, nümunədəki bakteriyalar öldürülə bilər. Əgər agar çox sərindirsə, bərkidikdən sonra mühit topaqlaşa bilər.

Nümunənizi alın, bu ya bulyon mədəniyyəti, ya da koloniyadan olan hüceyrələrin tampon və ya şoran məhlulda qarışdırılması nəticəsində əmələ gələn hüceyrələrin süspansiyonu olmalıdır.

Nümunələr tək nümunənin seyreltmə seriyasından əldə edilə bilər.

Qablaşdırılacaq nümunənin həcmi 0,1 ilə 1,0 ml arasında olmalıdır.

Boş Petri qabının qapağını açın və nümunənizi boşqabın ortasına paylayın (Panel A Şəkil 4). Qapağı bağlayın.

Bu prosedur boyunca aseptik texnikadan istifadə edin.

Nümunənizi boşqaba köçürmək üçün ya seroloji pipetkadan, ya da mikropipetdən istifadə edin. Nümunənin boşqabdan sıçramaması üçün onun axınına nəzarət edin.

Ərinmiş agarın borusundan qapağı çıxarın və açıq borunun kənarını Bunsen burnerinin alovundan keçirin.

Nümunəniz olan Petri qabının qapağını açın və ehtiyatla agarı tökün (Panel B). Şəkil 4).Qapağı bağlayın, sonra boşqabı yumşaq bir şəkildə çevirərək nümunəni agar ilə qarışdırın.

Plitəni inkubasiya üçün çevirməzdən əvvəl agarın hərtərəfli bərkiməsinə icazə verin.

4. Plitələrin yayılması proseduru: Plitələrin sayılması, zənginləşdirilməsi, seçilməsi və ya süzülməsi üçün diskret bakteriya koloniyalarının formalaşması

Bu texnika adətən kiçik bir nümunə həcmində olan mikroorqanizmləri ayırmaq üçün istifadə olunur və bu, agar boşqabının səthinə yayılır, nəticədə hüceyrələrin müvafiq konsentrasiyası örtüldükdə agar səthində bərabər paylanmış diskret koloniyalar əmələ gəlir. Tək bir boşqabda koloniya əmələ gətirən vahidlərin ümumi sayının sadalandığı və nümunənin örtüldüyü borudakı hüceyrələrin konsentrasiyasını hesablamaq üçün istifadə olunduğu həyat qabiliyyətli boşqab hesablamaları üçün bu texnikadan əlavə olaraq, yayılmış örtük müntəzəm olaraq istifadə olunur. zənginləşdirmə, seçim və seçim təcrübələrində. Bu üç təcrübə üçün arzu olunan nəticə, adətən, agarın səthində diskret koloniyaların paylanmasının meydana gəldiyi boşqabların sayılması ilə eynidir. Ancaq məqsəd təmin etmək deyil hamısı canlı hüceyrələr koloniyalar əmələ gətirir. Bunun əvəzinə, yalnız müəyyən bir genotipə malik olan populyasiyada olan hüceyrələr böyüməlidir. Əgər son məqsəd əlavə təhlil üçün koloniyaları təcrid etməkdirsə, yayma boşqab proseduru sayma təcrübəsi üçün tökmə boşqab texnikası üzərində tətbiq oluna bilər, çünki koloniyalar agarın səthində əlçatan şəkildə böyüyür, eyni zamanda tökmə boşqab proseduru ilə ağarda yerləşdirilir.

Yayılmış lövhə proseduru üçün burada təsvir olunan iki strategiya var. Birinci (Metod A) dönər masa və xokkey çubuğuna bənzər şüşə və ya metal çubuğun istifadəsini nəzərdə tutur. "Copacabana Metod" kimi istinad edilən ikinci (Metod B) əvvəlcədən sterilizasiya olunmuş şüşə muncuqların silkələnməsini nəzərdə tutur. Hər ikisi ağar səthində hüceyrələrin hətta yayılmasını asanlaşdırır.

Metod A: Dönər masa və şüşə və ya metal çubuq ilə yayılma

Aqar boşqabının alt hissəsinin kənarına (qapağına deyil) ən azı adınız, tarix, böyümə mühitinin növü və mühitin üzərinə qoyulacaq orqanizmin növü ilə etiketləyin.

Kaplama zamanı seyreltmə faktorunu daxil edin seriyalı seyreltmələr.

Plitələr qapaqda kondensasiya olmadan tamamilə qurudulmalı və yayılmadan əvvəl otaq temperaturuna qədər qızdırılmalıdır. Plitələr 4 ºC-də saxlanılırsa, onları bir neçə saat və ya bir gün əvvəl çıxarın. Onları 2-3 boşqabdan çox olmayan kiçik, pilləli yığınlara yayın və qurumağa icazə verin.

Plitəni dönər masanın ortasına qoyun (Şəkil 5).

Nümunənizi əldə edin, bu, bir bulyon mədəniyyəti və ya koloniyadan olan hüceyrələri buferə və ya şoran məhlulda qarışdırmaqla istehsal olunan hüceyrələrin süspansiyonu olmalıdır.

Nümunələr tək nümunənin seyreltmə seriyasından əldə edilə bilər.

Qablaşdırılacaq nümunənin həcmi 0,1 ilə 0,2 ml arasında olmalıdır.

Petri qabının qapağını açın və nümunənizi agarın mərkəzinə paylayın. Qapağı bağlayın.

Bu prosedur boyunca aseptik texnikadan istifadə edin.

Nümunənizi boşqaba köçürmək üçün mikropipetatordan istifadə edin. Nümunənin boşqabdan sıçramaması üçün onun axınına nəzarət edin.

Şüşə çubuğu və ya metal çubuğu (həmçinin yayıcı adlanır) 70% (h/v) etanoldan ibarət stəkana batırın.

DİQQƏT: Heç vaxt isti yayıcını spirt olan bir şüşəyə batırmayın.

Etanol yalnız yayıcının alt hissəsinə və gövdənin birinci qarışına toxunmalıdır.

Artıq etanolu Bunsen ocağının alovundan keçirərək boşaltın və yandırın.

Alov etanolla təmasda olan yayıcı və gövdə uzunluğu boyunca hərəkət etməlidir, sonra tez söndürülməlidir.

Etanol stəkanı alovlanarsa, vahimə etməyin! Mənzərənin üzərinə bir şüşə qapaq qoyun ki, bu da yanğını tez bir zamanda söndürəcək.

Ağar boşqabının qapağını açın, qapağı sol əlinizdə baş və şəhadət barmağınızla tutun. Yayıcını kənarın kənarı boyunca agara toxunduraraq sərinləyin.

Hüceyrələrin əlavə olunduğu agara toxunmayın. İsti yayıcı hüceyrələri öldürəcək.

Sol əlinizlə (aqar boşqabının qapağını hələ də tutarkən) dönər masanı yavaş-yavaş fırladın.

Bunun qarşısını almaq daha yaxşı olsa da, qapağı aşağı qoymaq lazımdırsa, Bunsen ocağının steril sahəsində dezinfeksiya edilmiş səthə üzü aşağı qoyun. Üzü yuxarı olan qapaqda, mikroorqanizmlərin və toz hissəciklərinin qapağın daxili səthinə enməsinə səbəb olan hava axınları yaradaraq, əşyaların və ya əllərin hərəkəti nəticəsində çirklənmə ehtimalı daha yüksəkdir.

Sağ əlinizlə yayıcını ağarın səthinə yumşaq bir şəkildə tutun və nümunəni tədricən bütün boşqabın üzərinə bərabər şəkildə yayın. Dönər masa fırlanan kimi yayıcını boşqab boyunca irəli və geri hərəkət etdirin.

Plitəni inkubasiya üçün çevirməzdən əvvəl nümunənin hərtərəfli udulmasına icazə verin (ən azı 5 dəqiqə).

Metod B: Şüşə muncuqlarla yayılma: "Copacabana Metod"

Aqar boşqabının alt hissəsinin kənarına (qapağına deyil) ən azı adınız, tarix, böyümə mühitinin növü və mühitin üzərinə qoyulacaq orqanizmin növü ilə etiketləyin.

Kaplama zamanı seyreltmə faktorunu daxil edin seriyalı seyreltmələr.

Ağar boşqabının qapağını açın, qapağı sol əlinizdə baş və şəhadət barmağınızla tutun. Sonra əvvəlcədən sterilizasiya edilmiş şüşə muncuqları olan şüşə borunu və ya şüşəni açın. Sağ əlinizlə borunun və ya butulkanın kənarını alovlandırın, sonra 10-12 steril şüşə muncuqları agar boşqabına tökün (Şəkil 6). Boşqabın qapağını bağlayın və qapağı dəyişdirmədən və kənara qoymadan əvvəl borunun və ya şüşənin kənarını bir daha alovlayın.

Muncuqları aqardan bir neçə santimetr yuxarı borudan və ya şüşədən yumşaq bir şəkildə tökün ki, muncuqlar Petri qabından çıxmasın.

4 mm diametrli şüşə boncuklardan istifadə edin. Onları şüşə butulkalarda və ya sınaq borularında otoklavda 121 ºC-də quru dövrədə (qravitasiya rejimi) 30 dəqiqə sterilizasiya edin.

Yayıcı əvəzinə muncuqlardan istifadə etməyin bir üstünlüyü ondan ibarətdir ki, təkrar alovlanma üçün açıq etanol qabları tələb olunmur.

Agar boşqabının qapağını açın və nümunənizi agarın mərkəzinə paylayın. Qapağı bağlayın.

Bu prosedur boyunca aseptik texnikadan istifadə edin.

Hər boşqab üçün 100-150 μl nümunə. Bu həcm hüceyrələrin hətta yayılmasını asanlaşdıracaq. Nümunənizi boşqaba köçürmək üçün mikropipettordan istifadə edin. Nümunənin boşqabdan sıçramaması üçün onun axınına nəzarət edin.

Muncuqları ağarın səthinə 6-7 dəfə yumşaq silkələməklə nümunəni yayın. Hüceyrələrin bərabər yayılmasını təmin etmək üçün üfüqi silkələmə hərəkətindən istifadə edin.

Muncuqları çevirməyin, əks halda bütün hüceyrələr boşqabın kənarında bitəcək.

İPUCU: Düzgün icra olunarsa, prosedur "marakas silkələmək" kimi səslənir.

Plitəni 60º döndərin, sonra üfüqi olaraq yenidən 6-7 dəfə silkələyin.

Plitəni ikinci dəfə 60° fırladın və yenidən üfüqi şəkildə silkələyin. İndiyə qədər, agar səthində hüceyrələrin bərabər yayılmasına nail olmalısınız.

Yayma bitdikdən sonra nümunə udulmalı və agarın səthi quru olmalıdır. Çirklənmiş muncuqları tərkibində 10% xlor ağartıcısı olan işarələnmiş bir qaba tökün.

Muncuqları zibil qutusuna atmayın! İstifadə olunmuş muncuqlar yuyulacaq və avtoklavlanacaq, təkrar istifadə üçün yenidən sterilizasiya ediləcək.

QEYD: Üç dəfə silkələməkdən sonra agar səthi hələ də yaşdırsa, mayenin agar tərəfindən udulması üçün boşqabın bir neçə dəqiqə oturmasına icazə verin, sonra boşqab səthi quru görünənə qədər №4-6 addımlarını təkrarlayın.

İnkubasiya üçün lövhəni çevirin.

5. Yumşaq Aqar Üstünlük Proseduru: Faqın İzolyasiyası və Sayımlanması üçün Lövhələrin Yaradılması (Lövhə Təhlili)

Bu texnika adətən ölçüsü 100 ilə 200 nm arasında dəyişən bakteriofaq (faj) və ya bakterial virusları aşkar etmək və kəmiyyətini müəyyən etmək üçün istifadə olunur. Fərdi faj hissəciklərini görmək üçün elektron mikroskop lazımdır. Ancaq yoluxucu faj hissəciklərinin varlığı olaraq təsbit edilə bilər lövhələr agar boşqabında (Şəkil 7A). Faqlar ev sahibi bakterial hüceyrələrindən kənarda çoxalda bilməzlər, buna görə də yayılma və aşkarlama örtükdən əvvəl fagların və ana hüceyrələrin qarışdırılmasını tələb edir. Yumşaq agar örtmə proseduru üçün kiçik həcmdə, ümumiyyətlə 50-dən 200-ə qədər faj süspansiyonu 2,5-də bərabər şəkildə səpələnmiş təxminən 108 bakteriya (ana hüceyrə) olan boruya paylanır. -3,0 ml yumşaq (0,5-0,7% [ağ/həc]), ərinmiş qidalı agar. Nəticədə qarışıq sərt (1,5-1,9% [ağırlıq/həc]) qidalı agar boşqabının səthinə tökülür. Yumşaq agarın bərk ağarın bütün səthini örtməsini təmin etmək üçün boşqab kifayət qədər yellənir. Sonra boşqab yuxarı agar təbəqəsi bərkiməyə vaxt tapana qədər düz bir səthə qoyulur və sonra inkubatora yerləşdirilə bilər.

Zamanla bakteriya hüceyrələrinin buludlu bir süspansiyonu olaraq adlandırılan a qazon, yumşaq agar mühitində görünən olur (Şəkil 7B). Bir faj bakteriya hüceyrələrindən birini yoluxdurarsa, hüceyrə daxilində çoxalırsa, sonra 100-ə qədər nəsil faqı (a.k.a.) buraxaraq hüceyrəni parçalayırsa, lövhələr əmələ gəlir. partlama ölçüsü). Yeni faj hissəcikləri yumşaq agara diffuziya edərək, lizis bakteriya hüceyrəsini əhatə edən ərazidə bakteriyaları yoluxdurur. Çoxsaylı infeksiya və lizis dövründən sonra yumşaq ağardakı buludlu bakterial hüceyrə süspansiyonu yox olur və lövhə adlanan təmizlənmə zonasını tərk edir. Hər bir lövhə 10 9-dan çox faj hissəciklərini ehtiva edir, hamısı genetik olaraq orijinal yoluxucu faq hissəcikləri ilə eynidir. Lövhə tək bir faj hissəciyindən əmələ gəldiyi üçün, nəticədə sayı lövhə əmələ gətirən vahidlər (pfu) sayıla bilər və orijinal konsentrasiyası, və ya titri, faj suspenziyası hesablana bilər. Lövhə analizi adlanan bu təcrübə növü, eyni zamanda elm adamlarına bir addımlı böyümə əyriləri yaratmaq, ev sahibi diapazonunun spesifikliyini araşdırmaq və genetik təcrübələr üçün bakteriya hüceyrələrini köçürmək üçün standart vasitələr təqdim edir.

Göstərici bakteriyaları hazırlayın: Yumşaq agar örtmə təcrübəsi üçün bakterial host ştamının eksponent olaraq artan mədəniyyəti hazırlanmalıdır. Hər ev sahibinin öz böyümə tələbləri var. Hər boşqab üçün 0,3 ml-dən 0,5 ml-ə qədər göstərici bakteriya süspansiyonu tələb olunur. Əgər indikator bakteriyalarından ibarət kolba hazırlanırsa (məsələn, 25 ml), çarpaz çirklənmə ehtimalını minimuma endirmək üçün mədəniyyət daha kiçik hissələrə bölünməlidir (məsələn, steril vida qapaqlı borulara paylanan 5 ml alikot). Təcrübədə istifadəyə hazır olana qədər borular buz üzərində (4 ºC-də) saxlanıla bilər. Steril qida bulyonu aşılamaq üçün aseptik texnikadan istifadə edin, sonra bakteriya ştammının spesifikasiyasına uyğun olaraq inkubasiya edin. Qalan mədəniyyətlər günün sonunda atılmalıdır.

Adsorbsiya borularını hazırlayın: İki steril mikrosentrifuqa borusunu rafa yerləşdirin. Birinci borunun qapağına “Faj” və ikinci borunun qapağına “Nəzarət” yazın.

Tipik olaraq seriyalı seyreltmələr faj lizatları hazırlanır və örtülür, bu halda rafa əlavə mikrosentrifuqa boruları əlavə olunacaq və seyreltmə əmsalı ilə etiketlənəcəkdir.

Faj ehtiyatları tək lövhələrdən təzə hazırlanmalı və 4 ºC-də saxlanmalıdır. Faq hissəciklərini parçalamaq üçün ehtiyatlar sınaqdan əvvəl ətraf mühitin temperaturuna qədər qızdırılmalıdır.

Faj ehtiyatları ilə yumşaq bir şəkildə işlənməlidir - güclü burulğan və ya pipetlə vurmayın.

Birinci boruya 50 μl faj nümunənizi əlavə edin, sonra ikinci boruya 50 μl faj buferi əlavə edin, bu da lövhə analizi üçün mənfi nəzarət rolunu oynayacaq.

Fag və bakteriyaların bütün manipulyasiyalarında aseptik texnikadan istifadə edin.

Sonra hər bir adsorbsiya borusuna 500 μl göstərici bakteriya əlavə edin.

Uzun müddət buz və ya skamyada oturan bakteriya hüceyrələri borunun dibinə yerləşəcək. Təcrübə üçün alikvotu çıxarmazdan əvvəl mədəniyyət qarışdırılmırsa, adsorbsiya borusuna kifayət qədər bakterial hüceyrə köçürülməyəcək. Lövhələri aşkar etmək üçün yumşaq agarda (yəni qazonda) kifayət qədər sayda bakterial koloniya əmələ gəlməlidir. Alikvotları adsorbsiya borularına köçürməzdən əvvəl indikator bakteriyaları yumşaq bir şəkildə yenidən homojen suspenziyaya salmaq üçün burulğan mikserindən istifadə edin.

Boruları yumşaq bir şəkildə silkələməklə bakteriya hüceyrələrini və faqı qarışdırın.

Faq/bakteriya qarışığını indikator ştammına uyğun temperaturda 15-20 dəqiqə (30 dəqiqədən çox olmayan) inkubasiya edin.

Qidalandırıcı yumşaq agar və sərt agar boşqablarını hazırlayın: Adsorbsiya baş verərkən, iki yumşaq agar borusunu (əvvəllər əridilmiş və 55 ºC-də saxlanmışdır) 46-48ºC-də quraşdırılmış laboratoriya skamyanızda istilik blokuna qoyun.

Ərinmiş yumşaq agar 10-15 dəqiqə ərzində istilik blokunun temperaturu ilə tarazlaşdırılmalıdır. Ərinmiş yumşaq agar 15 dəqiqədən çox oturursa, bərkiməyə başlayacaq və bərk agarın üzərinə töküldükdə yığınlar əmələ gələcək. Ərinmiş yumşaq agar 10 dəqiqədən az oturursa, faj/bakteriya qarışığına əlavə edildikdə çox isti olacaq və örtmədən əvvəl host hüceyrələri öldürəcəkdir. Nəticə etibarilə, qazon əmələ gəlməyə bilər və çox az və ya heç bir lövhə aşkar edilə bilməz.

Fag lizatının ardıcıl seyreltmələrini örtsəniz, əlavə yumşaq agar boruları hazırlayın.

Ən azı adınız, tarix, böyümə mühitinin növü və adsorbsiya borularına uyğun gələn "Faj" və ya "Nəzarət" yazısı ilə iki qidalı sərt agar boşqabının dibinin kənarına (qapağına deyil) etiketləyin.

Serial seyreltmələri örtürsə, seyreltmə əmsalı ilə etiketlənmiş əlavə lövhələri daxil edin.

Sərt agar plitələri qapaqda kondensasiya olmadan tamamilə qurudulmalı və yumşaq agar əlavə edilməzdən əvvəl otaq temperaturuna qədər qızdırılmalıdır. Plitələr 4 ºC-də saxlanılırsa, onları bir neçə saat və ya bir gün əvvəl çıxarın. Onları 2-3 boşqabdan çox olmayan kiçik, pilləli yığınlara yayın və qurumağa icazə verin. Sərt agar təbəqəsindəki həddindən artıq nəmlik yumşaq agarın seyrelməsinə səbəb olacaq, bu da lövhənin əmələ gəlməsi zamanı faqın yumşaq agar vasitəsilə daha asan yayılmasına imkan verəcəkdir. Nəticədə lövhə ölçüsü artacaq.

Plitə adsorbsiya boruları bir-bir aşağıdakı kimi: P1000 mikropipettorundan istifadə edərək faj/bakteriya qarışığını (təxminən 550 ml olmalıdır) aseptik şəkildə yumşaq agar borusuna köçürün, sonra məzmunu qarışdırmaq üçün onu ovuclarınızın arasında sürətlə çevirin. Borunu silkələməyin ki, hava qabarcıqları daxil olsun. Borunu sol əlinizdə tutaraq, sağ əlinizlə sərt agar boşqabının qapağını açın və dərhal borunun bütün məzmununu sərt agar boşqabının səthinə tökün. Qapağı bağlamazdan əvvəl ərinmiş yumşaq agarı plitənin bütün səthinə yaymaq üçün plitəni yumşaq, lakin sürətlə silkələyin ki, bərkiməyə vaxt tapmadan. Ərinmiş yumşaq agarı Petri qabının kənarlarına sıçratmaqdan çəkinin. Qapağı bağlayın.

Bütün adsorbsiya boruları üçün №9 addımı təkrarlayın, bir boru anında.

Plitələri düz bir səthə qoyun və yumşaq agar bərkiyənə qədər onlara toxunmadan dayanmasına icazə verin.

Adətən 30 dəqiqə kifayətdir.

Plitələri inkubasiya üçün çevirin.

Bir neçə boşqab yığıla və bir-birinə yapışdırıla bilər, sonra inkubasiya üçün ters çevrilə bilər.

İnkubasiyadan sonra lövhələr lövhələr üçün yoxlanıla bilər. Mənfi nəzarətdə yalnız bakteriya çəmənliyi olmalıdır (lövhələri göstərən deşiklər yoxdur). Lövhələr ölçüsü, forması və ümumi görünüşü ilə fərqlənir. Müəyyən bir faj növü, bir lövhənin mərkəzini steril diş çubuğu ilə diqqətlə vuraraq və inokulumu 100-1000 º ml bulyon və ya faj tamponu olan steril mikrosentrifuqa borusuna köçürməklə lövhələrin heterojen qarışığından təcrid oluna bilər. Bu lizat yuxarıda təsvir edilən eyni prosedurdan istifadə etməklə örtülə bilər. Saf faqın əldə edilməsini təmin etmək üçün ən azı 3-6 ardıcıl tək lövhə izolyasiyası lazımdır. Çox vaxt boşqabda üst-üstə düşməyən lövhələr yaradan titri tapmaq üçün lizat böyük diapazonda (10 -1 ilə 10 -10 arasında) seyreltilməlidir. Sayı lövhənin ölçüsündən asılı olaraq dəyişir.

6. Replika Plitəsi Proseduru: Mutantların və Oksotrofların Skrinqi üçün Hüceyrələrin Transferi

Bu texnika birincil boşqabda hüceyrə artımını ikincil lövhələrlə müqayisə etməyə imkan verir, seçilə bilən bir fenotip üçün hüceyrələrin ekranlaşdırılması üçün vasitə yaradır. Əvvəlcə ilkin və ya əsas boşqab hüceyrələrlə aşılanır və ya tək koloniyalar əmələ gətirən seyreltməni yaymaqla və ya onları şəbəkə işarələri ilə müəyyən edilmiş məkan modelində boşqaba köçürməklə aşılanır. Tərkibində böyümə inhibitorları olan media və ya müəyyən bir qida maddəsi olmayan mühitlər olan ikincil lövhələr birincil lövhədəki koloniyalardan olan hüceyrələrlə aşılanır. Koloniyaların məkan nümunəsi əvvəlcə bir məxmər parçasının əsas lövhəyə basılması ilə təkrarlanır. Bakterial hüceyrələr məxməri yapışdırırlar, çünki onlar məxmərlə ağardan daha çox yaxınlığa malikdirlər. Məxmərdəki hüceyrələrin izi daha sonra birincil lövhə ilə eyni koloniya modelini əks etdirən hüceyrə böyüməsi ilə çoxlu ikincil lövhələrə köçürülür. Başqa sözlə, bu, rezin möhürə sahib olmaq, böyümə modelini bir boşqabdan digərinə təkrarlamaq kimidir. Bu texnika əlverişlidir, çünki bir təcrübədə nisbətən çox sayda koloniyanın bir çox fenotip üçün eyni vaxtda yoxlanılmasına imkan verir.

İlkin boşqab hazırlayın: Aqar boşqabının alt hissəsinin kənarına (qapağına deyil) ən azı adınız, tarix və böyümə mühitinin növü ilə etiketləyin.

Ən azı iki bərabər aralı şaquli xətt və ən azı iki bərabər məsafəli üfüqi xətt ilə boşqabın altındakı bir şəbəkəni qeyd edin. Yaranan kvadratları nömrələyin.

Hər kvadratı hüceyrə nümunəsi ilə aşılamaq üçün əvvəlcədən sterilizasiya edilmiş diş çubuğundan istifadə edin. Hər bir nümunə üçün kvadratın mərkəzini çəkin. Bütün kvadratı hüceyrələrlə örtməyin (Şəkil 8) və ya inkubasiya edildikdə nümunə çoxalacaq və ətrafdakı meydanları çirkləndirəcək.

Hər kvadrat ya bulyon mədəniyyətlərindən və ya başqa boşqabdakı koloniyalardan əldə edilən fərqli nümunə ilə aşılanacaq.

Müxtəlif ikincili mühitləri aşılamaq üçün istifadə ediləcək əsas lövhəni çevirin və inkubasiya edin.

İkinci dərəcəli plitələri aşılayın: Birincil boşqab və bütün ikincil lövhələri yığın. Bir marker ilə plitələrin yan tərəfində bir oriyentasiya işarəsi qoyun. İşarənin hər bir boşqabın qapağında deyil, alt tərəfində olduğundan əmin olun.

Steril məxmər parça alın və onu silindrik blokun üzərinə qoyun (Şəkil 9). Məxmər parçanı tutucu ilə yerində bağlayın. Blokdakı oriyentasiya işarəsinə diqqət yetirin.

Blok Petri qabının dibi ilə eyni ölçüdə olmalıdır (diametri 10,2 sm). O, replika örtüyü zamanı məxmər parçanı bloka bağlayan kilidləmə halqası ilə gəlməlidir.

Məxmər parça (15,2 x 15,2 sm kvadrat) əvvəlcədən sterilizasiya edilməlidir. 10 və ya 12 təmiz kvadrat yığın, sonra onları alüminium folqa ilə sarın, sonra onları 121 ºC-də avtoklavda quru dövrədə (ağırlıq dərəcəsi) 30 dəqiqə qoyun. Onları replika örtük təcrübəsində istifadə etməzdən əvvəl onları bir neçə saat isti sobada yerləşdirərək tamamilə quruduqlarına əmin olun. Nəzərə alın ki, məxmər kvadratlar sterilizasiyadan əvvəl maskalama lenti ilə silinməlidir.

Məxmər kvadratlar yenidən istifadə edilə bilər. İstifadə olunmuş məxmər kvadratlar avtoklavda zərərsizləşdirildikdən sonra onlar adi suda yuyulmalı və yuxarıda göstərildiyi kimi yenidən sterilizasiya edilməlidir.

Silindrik blok və sıxac istifadələr arasında 70% (h/v) etanolda və ya 10% xlor ağartıcıda qısaca yaxalamaqla dezinfeksiya edilməlidir.

Qapağı çıxarın və əsas lövhəni çevirin. Lövhədəki oriyentasiya işarəsini blokdakı işarə ilə düzün. Plitəni aşağı salın ki, agarın səthi silindrik blokdakı məxmər parça ilə təmasda olsun. Əsas boşqabın arxasına barmaqlarınızın ucları ilə yüngül, lakin bərabər şəkildə basıb saxlayın və sonra əsas lövhəni blokdan diqqətlə qaldırın. Plitədəki qapağı dəyişdirin.

İlkin boşqabdan olan hüceyrələrin məxmər izi, yeni məxmərlə təəssürat yaratmazdan əvvəl təxminən 7-8 ikincil lövhəni aşılamaq üçün istifadə edilə bilər.

İkinci dərəcəli plitələrin hər biri ilə #7 addımı təkrarlayın.

Müsbət nəzarət olaraq, seriyanın son lövhəsi sınaqdan keçmiş bütün ştammların böyüməsi lazım olan agar mühiti olmalıdır. Beləliklə, hüceyrələrin seriyadakı bütün ikincil lövhələrə köçürüldüyünü təsdiqləyə bilərsiniz. Əks halda, müəyyən bir test mühitində böyümənin olmaması ştammın fenotipindən çox, qeyri-kafi hüceyrə transferi ilə əlaqələndirilə bilər.

Yanlış pozitivlərin qarşısını almaq üçün ikincil plitələr ən azdan ən əlverişli substrata qədər sifariş edilməlidir. Əks halda, qida maddələri hüceyrələrin əlverişsiz mühitdə böyüməsinə imkan verən lövhələr arasında ötürülə bilər.

Plitələri çevirin və inkubasiya edin.

Qeyd: Böyümə üçün ikincil lövhələri yoxlayarkən, böyümə və iz arasında fərq qoyduğunuzdan əmin olun. Sonuncu mənfi nəticədir.

7. İş yerinin təmizlənməsi

Bunsen burnerini söndürün, sonra boşqablardakı və ya borulardakı mədəniyyətlər, əlavə mühit və digər reagentlər də daxil olmaqla bütün ləvazimatları kənara qoyun.

Lövhələrdə və ya borularda köhnə mədəniyyətlərin laboratoriya skamyasında və ya saxlama yerlərində yığılmasına icazə verməyin. Kalıplar və arzuolunmaz bakterial növlər kimi məşhur çirklənmə mənbələri olan bu nümunələr ehtiyac qalmayan kimi atılmalıdır.

Çirklənmiş laboratoriya qablarını (əlcəklər, pipet ucları, kimviplər), şüşə qablar (borular, kolbalar, butulkalar) və təhlükəli tullantıları (bakterial mədəniyyətlər və ya faq məhlulları, istifadə edilmiş lövhələr) lazımi utilizasiya qabına qoyun. Patogen olmayan ilə işləyərkən E. coli ştamm (BSL-1), yalnız yoluxucu olmayan təhlükəli tullantılar əmələ gəlir. Eyni prosedurları patogen orqanizmlərlə (BSL-2 və ya daha yuxarı) həyata keçirərkən yoluxucu təhlükəli tullantılar əmələ gəlir. Biotəhlükə təsnifatından asılı olmayaraq, təhlükəli tullantılar atılmadan əvvəl avtoklavlanmalı və ya dezinfeksiya edilməlidir. Təcrübə zamanı yaranan biotəhlükələrin dərhal və lazımi qaydada utilizasiyası üçün BMBL-də (5-ci Nəşr), eləcə də sizin institusional Ətraf Mühitin Sağlamlığı və Təhlükəsizliyi departamentiniz tərəfindən verilən təlimatlara əməl edin.

İş yerini dezinfeksiyaedici ilə təmizləyin.

Laboratoriyadan çıxmazdan əvvəl əlləri antiseptik sabun və ilıq su ilə yaxşıca yuyun.

8. Nümayəndəliyin nəticələri

Streak-plate texnikası. Zolaq örtükləri üçün nümunə tətbiqi aşağıda göstərilmişdir Şəkil 1. Bu prosedur qarışıq hüceyrə mədəniyyətlərindən bakterial koloniyaları təcrid etmək üçün istifadə olunur və mikrobiologiya və molekulyar genetikada mənimsənilməsi üçün ən vacib üsullardan biridir. Hər bir koloniya genetik olaraq eyni olan hüceyrələrin populyasiyasını təmsil edir. Bir çox aşağı axın tətbiqləri üçün ya tək koloniyadan, ya da tək bir koloniyadan olan hüceyrələrlə medianın aşılanması nəticəsində yaranan təmiz bakteriya mədəniyyətindən başlamaq vacibdir. Məsələn, bir koloniyada ayrı-ayrı hüceyrələrin morfologiyası işıq mikroskopundan istifadə etməklə yoxlanıla bilər. Genetik identiklik, tək koloniya ilə başlayan hüceyrə mədəniyyətindən təcrid olunmuş genomik DNT-dən kiçik subunit ribosomal RNT geninin ardıcıllığı ilə təyin edilə bilər. Metabolik xüsusiyyətlər hüceyrələri müxtəlif biokimyəvi və fizioloji analizlərə məruz qoyaraq təsvir edilə bilər. Yalnız təmiz kulturalarla bu cür təcrübələr aparmaqla müəyyən bir mikroorqanizmə aid xüsusiyyətlərə əmin olmaq olar. Nəticələr mədəniyyətin çirklənmiş olması ehtimalı ilə örtülmür. Hüceyrələri boşqabın üzərinə sürtmək üçün istifadə edilən alətin sterilliyi bütün prosedur boyu qorunmasa, texniki xətalar baş verə bilər. Kvadrantlar arasında bir döngə yandırmağı və ya təzə diş çubuğunu götürməyi unutmaq tək koloniya əldə etməyi çətinləşdirir. Bəzi bakteriya növlərini təmiz mədəniyyətdə təcrid etmək mümkün deyil, çünki onlar müəyyən böyümə tələbləri üçün başqa bir bakteriya növü ilə əməkdaşlıqdan asılıdır. Sintroflar adlandırılan bu orqanizmlər yalnız birgə mədəniyyət şəraitində yetişdirilə bilər, buna görə də koloniyalar (əgər yaranarsa) həmişə iki və ya daha çox növdən ibarət olacaqdır. Laboratoriyada ətraf mühit nümunələrindən əldə edilən bakteriyalarla zolaq lövhəsi prosedurunu həyata keçirərkən rast gəlinən başqa bir problem, hüceyrələrin ənənəvi laboratoriya ştammlarından kənara çıxan böyümə xüsusiyyətləri nümayiş etdirməsidir. E. coli. Bu cür bakteriya ştammları ağar boşqabının böyük bir hissəsinə yayılan, kalsifikasiya olunmuş və beləliklə də zolaqlı alətlə nüfuz etməyə davamlı və ya yapışqan kapsulla əhatə olunmuş budaqları olan filamentli (hüceyrələrin sıx qruplarından fərqli olaraq) koloniyalar yarada bilər. belə ki, ayrı-ayrı koloniyaları ayırd etmək mümkün deyil. Bu xüsusiyyətlər tək-tək koloniyaları zolaqlı lövhə üsulu ilə təmizləməyi çətinləşdirir.

Boşqab texnikası. Pour-plate texnikası ilə koloniyalar agarda, eləcə də agar mühitinin səthində əmələ gəlir və beləliklə, nümunədəki canlı hüceyrələrin sayını hesablamaq üçün əlverişli vasitə təmin edir. Bu prosedur müxtəlif sənaye tətbiqlərində istifadə olunur. Məsələn, məişət, kommersiya və sənaye obyektləri, eləcə də kənd təsərrüfatı təcrübələri nəticəsində əmələ gələn maye tullantıların (məsələn, çirkab suları, fırtına drenajlarından axıdılması) təmizlənməsinə cavabdeh olan tullantı sularının təmizlənməsi qurğusu üçün suyun təhlili çox vacibdir. geniş təmizləmə prosesindən sonra nümunələr. Təmizlənmiş tullantı suları (qeyri-içməli su) müxtəlif üsullarla təkrar istifadə olunur - kənd təsərrüfatında qeyri-ərzaq bitkilərinin suvarılması üçün, yaşayış yerlərində sanitariya yuyulması üçün və sənaye soyutma qüllələrində - ona görə də kimyəvi və mikrob çirklənmədən təmizlənməlidir. İçməli su (içməli su) EPA standartlarına uyğun olaraq təmizlənməlidir və xüsusi insan patogenlərinin sadalanmasına imkan verən mikrobioloji örtük metodlarından istifadə etməklə sınaqdan keçirilir. Göstərilən Şəkil 10 ictimai içməli bulaqdan toplanmış su nümunəsində mövcud olan bakteriya hüceyrələrindən əmələ gələn bakteriya koloniyalarıdır. İçməli su üçün təmizlənmə tədbirlərini nəzərə alsaq, bakterial patogenlərin bu koloniyaları əmələ gətirməsi ehtimalı azdır, lakin mikroblar hər yerdədir və hətta patogen olmayan suşlarla çirklənməni tamamilə aradan qaldırmaq mümkün deyil, yalnız minimuma endirmək olar. Başqa bir misal olaraq, əczaçılıq şirkəti istehsal, saxlama və daşınma zamanı yeni dərman preparatının mikroblarla çirklənmə dərəcəsini və ya bioyükünü qiymətləndirməlidir. Prosesin müxtəlif mərhələlərində dərmandan nümunə götürməklə və nümunələri tökmə prosedurundan istifadə etməklə, mikrob yükünü və ya çirkləndirici bakteriyaların sayını asanlıqla müəyyən etmək olar. Bundan sonra mikrob çirklənməsini minimuma endirmək və ya aradan qaldırmaq üçün ehtiyat tədbirləri hazırlana bilər. Dökülmə texnikasını yerinə yetirərkən baş verən ən çox yayılmış texniki səhvlərdən biri, nümunənin ərinmiş agar ilə qeyri-kafi qarışdırılmasıdır ki, bu da koloniyaların bir-birinə yığılmasına səbəb olur və beləliklə, boşqabların sayının qeyri-dəqiq olmasına səbəb olur. Tez-tez rast gəlinən başqa bir səhv, ərinmiş agarı çox isti olanda tökmək və nümunədəki bir çox bakteriya hüceyrələrini öldürməkdir. Bu səhv həmçinin nümunədə koloniya əmələ gətirən vahidlərin ümumi sayını az təmsil edən nömrələr verən boşqab saymalarının düzgünlüyünə təsir edəcək.

Spread-plate texnikası. Yayılan boşqab texnikası həyat qabiliyyətli boşqab saymalarını yerinə yetirmək üçün bir vasitə kimi faydalı olan tökmə boşqab proseduruna bənzəyir. Bununla belə, yayılma lövhəsi texnikasından istifadə edərək əmələ gələn koloniyalar agar mühitinin səthində bərabər paylandığı üçün ayrı-ayrı koloniyalardan olan hüceyrələr təcrid oluna və sonrakı eksperimental manipulyasiyalarda istifadə edilə bilər (məsələn, zolaq lövhəsi üçün inokulum kimi). bulyon mədəniyyəti). Yayılmış lövhə texnikasının mühüm komponent olduğu üç ümumi tətbiq zənginləşdirmə, seçim və seçim təcrübələridir. Hər üç tətbiqdə, istənilən hüceyrə növü qarışıqdan ayrıla və daha sonra istənilən sayda biokimyəvi, fizioloji və ya genetik testlərə məruz qala bilər.

An zənginləşdirmə təcrübəsi qarışıq mədəniyyətin bir mühitə örtülməsini və ya nümunə daxilində istənilən metabolik xüsusiyyətləri, böyümə xüsusiyyətlərini və ya davranışlarını nümayiş etdirən mikroorqanizmlərin böyüməsinə kömək edən ətraf mühit şəraitində inkubasiya lövhələrini əhatə edir. Bu strategiya digər orqanizmlərin böyüməsini maneə törətmir, lakin mədəniyyətdəki digərlərinə nisbətən arzu olunan mikroorqanizmlərin sayının artması ilə nəticələnir. Beləliklə, zənginləşdirmə lövhəsində əmələ gələn koloniyalar, ehtimal ki, istənilən genotipi əks etdirən fenotipik xüsusiyyətlər nümayiş etdirirlər. Məsələn, əgər məqsədiniz 1000-dən çox müxtəlif bakteriya növünün qarışığı olan ətraf mühit nümunəsindən azot fiksasiya edən bakteriyaları yetişdirməkdirsə, o zaman nümunəni azot çatışmazlığı olan bir mühitə örtmək bu birləşməni istehsal edə bilən bakteriyalar üçün zənginləşdirəcəkdir. azotun fiksasiyası üçün tələb olunan bir sıra genlər tərəfindən təmin edilən metabolik imkanlardan istifadə edən atmosfer.

A seçim təcrübəsi qarışıq mədəniyyətin yalnız müəyyən bir gen və ya gen dəstini ehtiva edən hüceyrələrin böyüməsinə imkan verən bir mühitə örtülməsini nəzərdə tutur. Bu tip eksperiment molekulyar biologiya laboratoriyalarında bakteriya ştammlarının antibiotiklərə davamlı genləri olan plazmidlərlə transformasiyası zamanı geniş yayılmışdır. Əgər məqsədiniz yalnız rekombinant hüceyrələri və ya plazmidi uğurla qəbul etmiş hüceyrələri yetişdirməkdirsə, onda nümunənin müvafiq antibiotik konsentrasiyası ilə əlavə edilmiş mühitə qoyulması bu xüsusi dərmana müqavimət göstərən hüceyrələr üçün seçiləcək.

A skrininq təcrübəsi qarışıq mədəniyyətin bütün canlı hüceyrələrin böyüməsinə imkan verən bir mühitə örtülməsini nəzərdə tutur, lakin istənilən genotipə malik olan hüceyrələr fenotipinə görə digər hüceyrələrdən fərqlənə bilər. Yenə də bu tip təcrübə molekulyar biologiya laboratoriyalarında mutagenez analizləri və ya genlərin plazmidlərə klonlaşdırılması zamanı geniş yayılmışdır. Şəkildə göstərildiyi kimi klassik bir nümunə Şəkil 11, istifadə edir lacZ gen kodlayan β-qalaktosidaza bu ferment hüceyrələrə təbii substratı olan laktozanın substrat analoqu olan X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-qalaktopiranosid) metabolizə etməyə imkan verir. X-Gal-ın β-qalaktosidaza tərəfindən parçalanması həll olunmayan mavi məhsulla nəticələnir. Beləliklə, əgər mühitdə X-gal və ya vəhşi tip (funksional) və ya mutant (qeyri-funksional) olan hüceyrələrdən ibarət nümunə varsa lacZ gen bu mühitə yerləşdirilir, sonra inkubasiyadan sonra funksional bir funksiyanı daşıyan vəhşi tipli hüceyrələr lacZ gen mavi-piqmentli koloniyalar kimi görünəcək, funksional olmayan mutant hüceyrələr lacZ gen piqmentsiz (“ağ”) koloniyalar kimi görünəcək.

Yayılan lövhə texnikasını ilk dəfə öyrənərkən ən çox rast gəlinən texniki problem, agar səthində hüceyrələrin qeyri-bərabər yayılmasıdır. Dönər masa və şüşə çubuqdan istifadə edərkən nümunə çox tez udula bilər ki, koloniyalar yalnız boşqabın mərkəzinə yaxın əmələ gəlsin. "Kopakabana Metodunu" yerinə yetirərkən, şüşə muncuqlar agar səthində silkələnmək əvəzinə burulur. Nəticədə lövhənin xarici kənarı boyunca çoxlu koloniyalar böyüyür. Hər iki halda, koloniyaların nəticədə paylanması mövcud olan tam səth sahəsindən istifadə etmir, beləliklə, hüceyrələr bir-birinə yığılıb üst-üstə düşən koloniyalara çevrilə bilər, bu da boşqab sayını qeyri-dəqiq və ya hüceyrə növlərinin fərqləndirilməsini qeyri-mümkün edir.

Soft Agar Overlay Technique. Bakteriya koloniyalarını saymaq üçün istifadə edilən yayılmış lövhə texnikasına bənzər bir prosedur, fagların sayını hesablamaq üçün istifadə edilə bilər. 30 ilə 300 arasında bakteriya hüceyrəsi ağar səthinə boşqab sayı (cfu/ml) üçün yayıldığı halda, 100 ilə 400 arasında yoluxucu faq hissəcikləri təbəqə daxilində lövhələrin sayı (pfu/ml) üçün 108-109 host hüceyrə ilə qarışdırılır. sərt qidalı agarın səthinə yayılmış yumşaq agar. Əksi göstərilmədiyi təqdirdə, ümumiyyətlə tək bir bakteriya hüceyrəsinin bölünməsi və koloniya adlanan tək bir çoxluqda çoxlu sayda genetik eyni hüceyrə topladığı güman edilir. Daha əvvəl müzakirə edildiyi kimi, hüceyrələr dəstələr şəklində böyüdükdə (yəni, cütlər, tetradlar, zəncirlər və ya qruplar) və ya tək koloniyanın formalaşmasına mane olan kapsullar kimi böyümə xüsusiyyətlərini nümayiş etdirdikdə bu fərziyyə etibarlı deyil. Bənzər bir fərziyyə lövhənin əmələ gəlməsi üçün edilir, çünki hər bir lövhə tək bir fajın fəaliyyətini təmsil edir. Bu ifadə yalnız bir faq bir bakteriyaya yoluxduqda doğrudur. Birdən çox faj hissəcikləri bir bakteriyaya yoluxsa nə olar? Bu problem, yoluxucu faq hissəciklərinin nümunədəki ev sahibi hüceyrələrin sayına nisbətini təsvir edən faj - infeksiya çoxluğu (MOI) ilə eksperimentlər apararkən nəzərə alınmalı olan mühüm statistik parametrə aiddir. Bəzi hüceyrələr birdən çox faqı adsorbsiya etdiyi halda, digər hüceyrələr yalnız bir və ya heç bir faq adsorbsiya etmədiyinə görə, hüceyrənin birdən çox faqla yoluxma ehtimalını minimuma endirmək üçün host hüceyrələrin populyasiyası aşağı MOI-də (𢙁) yoluxmalıdır. hissəcik. Lövhə əmələ gətirən vahidin (pfu) funksional tərif kimi istifadə edilməsi, faj ehtiyatının titrini hesablamaq üçün lövhə saymalarını apararkən bu fəsadların qarşısını alır.

Göründüyü kimi Şəkil 12, lövhə morfologiyası müxtəlif faqlar üçün dəyişir. Bəzi fajlar kiçik lövhələr (panel A), digərləri isə böyük lövhələr yaradır (panel B). Bir sıra dəyişənlər lövhə ölçüsünə təsir göstərir. Bu dəyişkənliyə kömək edən texniki səbəblər var. Məsələn, tam media və qalın sərt agar daha böyük lövhələrin inkişafını dəstəkləyir, çünki ev sahibi hüceyrələr daha uzun müddət fag artımını təmin edə bilir. Ana hüceyrələrin yüksək örtük sıxlığı (hər boşqab üçün 9 cfu) lövhə ölçüsünün azalmasına səbəb olacaqdır. Yumşaq agarın aşağı konsentrasiyalarından istifadə yumşaq agarda faj hissəciklərinin diffuziya sürətini artıracaq və bununla da lövhələrin ölçüsünü artıracaq. Xatırladaq ki, bu artan diffuziya sürəti, əgər sərt agar plitələri tamamilə qurulmasa, istəmədən baş verə bilər ki, qabda kondensasiya və ya artıq nəmlik örtükdəki yumşaq agarı sulandırır. Bu texniki nəzarət müəyyən bir faq üçün lövhə ölçüsü ilə bağlı uyğun olmayan nəticələr verəcəkdir.

Lövhənin ölçüsü, həmçinin adsorbsiya səmərəliliyi, gizli dövrün müddəti (fag adsorbsiyasından ev sahibi hüceyrənin lizisinə qədər olan vaxt) və partlama ölçüsü (böyük hüceyrələr tərəfindən buraxılan nəsillərin sayı) daxil olmaqla bir sıra host hüceyrə hadisələri ilə əlaqədardır. tək infeksiya). Bakterial böyümənin müxtəlif fazalarında faj hissəcikləri ev sahibi hüceyrələri yoluxdurarsa, lövhə ölçülərinin heterojen bir qarışığı müşahidə edilə bilər. Məsələn, erkən eksponensial fazada adsorbsiya olunanlar gec eksponensial fazada adsorbsiya olunanlara nisbətən daha çox nəsil fajı olan daha böyük lövhələr əmələ gətirirlər. Bir qayda olaraq, litik faq şəffaf lövhələr əmələ gətirir, lizogen faq isə bulanıq lövhələr əmələ gətirir. Bununla belə, bəzi litik fajlar, göstərilən "öküz gözü" lövhəsi kimi maraqlı nümunələr yaradır Şəkil 12B. Bu şəffaf lövhələr bulanıq halo ilə əhatə olunmuşdur, çünki lövhənin kənarındakı hüceyrələr tam parçalanmamışdır və ya fag infeksiyasına davamlı ola bilər. Mülayim faqla müşahidə edilən "öküz gözü" nümunəsi şəffaf bir halqa ilə əhatə olunmuş bulanıq mərkəzi olan lövhədir. Bu morfologiya liziz-lizogeniya qərarı ilə bağlı MOI və ana hüceyrənin fiziologiyasını əks etdirir. Hüceyrələr ilk dəfə faqla yoluxduqda, MOI aşağı olur və hüceyrələr sürətlə böyüyür, çünki qida maddələri birlikdə boldur, bu, litik böyüməni asanlaşdırır. Getdikcə daha çox hüceyrə parçalandıqca MOI artır və şəffaf lövhə əmələ gəlir. Lövhənin mərkəzindəki lizogenlər böyüməyə davam edir, çünki onlar lizisə qarşı immunitetlidir və bulanıq mərkəzi olan şəffaf lövhə meydana gətirir.

Bindirmə texnikası eukaryotik viruslarla lövhə analizləri üçün dəyişdirilə bilər. Eyni şəkildə bakteriofaq yumşaq ağarda bakteriya hüceyrələrinin qazonunda lövhələr əmələ gətirir, eukaryotik viruslar isə gel ilə örtülmüş hüceyrələrin bir qatında lövhələr əmələ gətirir. Bir təbəqə mədəniyyət qabının səthində yan-yana böyüyən, bir-birinə toxunan, lakin bir-birinin üstündə böyüməyən birləşən hüceyrə təbəqəsidir. Bu tip lövhə analizini həyata keçirmək üçün eukaryotik hüceyrələrin həssas monolaylarına virus alikotları əlavə edilir. Sonra monolayer agaroza əsaslı qida mühiti ilə örtülür - bu gel yoluxmuş hüceyrələrdən ayrılan nəsil viruslarının monolayerdəki qonşu hüceyrələrə yayılmasını məhdudlaşdırır. Müvafiq olaraq, virionların sərbəst buraxılması ilə zədələnmiş hüceyrələri ehtiva edən sferik bir sahə və ya lövhə istehsal olunur. Lövhələrin vizuallaşdırılmasına kömək etmək üçün canlı hüceyrələri ləkələyən boyalar yoluxmuş və yoluxmamış hüceyrələr arasında kontrast təmin edərək hüceyrə mədəniyyətinə tətbiq oluna bilər.

Yumşaq-aqar örtük texnikası lövhə analizlərindən başqa təcrübələr üçün istifadə olunur. Birincisi, sərt qidalı agarın bakteriyaların böyüməsinə imkan verən bir dəstək matrisi olduğunu xatırlamaq vacibdir. İkincisi, üst-üstə düşmə üçün istifadə olunan yumşaq agar sərt agardan fərqli qida tərkibinə malik ola bilər. Bu yolla, yumşaq-aqar müxtəlif böyümə xüsusiyyətləri və ya metabolik xüsusiyyətləri üçün bakteriya ştammlarını yoxlamaq üçün bir vasitə kimi xidmət edə bilər. Məsələn, üst-üstə düşmə texnikası bakteriyaların sellülozu parçalamaq qabiliyyətini yoxlamaq üçün istifadə olunur (Teather and Wood 1982). Tək koloniyalar qeyri-selektiv sərt agar mühitində yetişdirilir, sonra 0,1% (ağırlıq/həc) karboksimetilselüloz (CMC) olan yumşaq agar sərt agarın səthinə yayılır. İnkubasiyadan sonra lövhələr yumşaq ağarda koloniyaların ətrafındakı təmizlənmə zonalarının vizuallaşdırılmasına imkan verən ləkə ilə dolur. Təmizləmə, mühitdəki sellülozu parçalayan bakteriyaların ifraz etdiyi hidrolitik fermentlər nəticəsində yaranır. Bu yaxınlarda, üst-üstə düşmə texnikası mal-qaranın rumenində tapılan metanogen arxeyanın böyüməsini maneə törədən bakteriyaları aşkar etmək üçün istifadə edilmişdir (Gilbert və b. 2010). Ətraf mühit nümunələrindən bakterial izolatlar sərt agar qidalı mühitdə yetişdirilir, sonra koloniyalar tərkibində metanogenlərin mədəniyyəti olan yumşaq agar ilə örtülür. İnkubasiyadan sonra plitələr koloniyaların ətrafındakı böyümənin qarşısını alan zonalar üçün yoxlanılır. Bu üsul yumşaq agarda metanogenlərin inhibitorlarını istehsal edən bakteriya ştammlarını müəyyən edir.

Yumşaq-aqar örtmə texnikası ilə baş verən ən çox yayılmış texniki səhvlər çox isti və ya çox sərin olduqda ərimiş yumşaq agarın tökülməsidir. Çox isti olarsa, mühitə qarışdırılmış bakteriya hüceyrələri örtükdən əvvəl öldürüləcəkdir. Əgər çox sərindirsə, yumşaq-aqar bərk ağarın üzərinə töküldükdə yığınlar əmələ gələcək. Hər iki halda, nəticələr ən yaxşı halda qeyri-müəyyən və ya oxunmaz olacaq.

Replika lövhəsi proseduru. Böyümə tələblərini yoxlamaq üçün kulturaların bir növ qida mühitindən digərinə köçürülməsi bir neçə suşdan daha çox olduqda olduqca zəhmətli olur.Replika örtük çox sayda mikroorqanizmin eyni vaxtda skrininqinə imkan verən bir üsuldur. Məsələn, yabanı tipli hüceyrələrin mədəniyyətini mutagenləşdirdikdən sonra, tək koloniyalı lövhələr əldə etmək üçün mədəniyyətin boşqab qatılmalarını yaymaq olar. Birincil lövhələr böyümə üçün lazım olan bütün birləşmələri sintez edən vəhşi tipli prototroflar və böyümə üçün vacib olan xüsusi birləşmələri sintez edə bilməyən biosintetik yolda genetik mutasiya keçirən mutant auksotroflar da daxil olmaqla, bütün hüceyrələrin böyüməsini dəstəkləyən bir mühitdən ibarətdir. Hüceyrələrin qarışığını tam bir mühitə örtməklə, itkin qidalar ətraf mühitdən götürülə bilər. Prototroflar və auksotroflar arasında fərq yaratmaq üçün koloniyalar minimal mühitə təkrarlana bilər. Yalnız prototroflar böyüyə biləcək. Birincil boşqabın məkan nümunəsi qorunduğundan, ikincil boşqabın birincil lövhə ilə müqayisəsi mutant koloniyaları müəyyən etməyə imkan verir. Mutantların hansı birləşməni artıq sintez edə bilmədiyini müəyyən etmək üçün koloniyalar xüsusi birləşmələrlə (məsələn, amin turşuları, karbon mənbələri, vitaminlər və s.) əlavə edilmiş minimal mühitə təkrarlana bilər. Bu yolla, replika lövhəsi prosedurundan istifadə etməklə eyni anda yüzlərlə koloniya yoxlanıla bilər. Baş verə biləcək texniki səhvlərdən biri, çox nəm olan agar plitələrindən istifadə etməkdir ki, bu da koloniyaların bir-birinə bulaşmasına səbəb olur və boşqabdakı bütün mədəniyyətləri çirkləndirir. Bu, tamamilə etibarsız nəticələr verir. Başqa bir texniki səhv, hüceyrələri məxmərdən ikincil plitələrə köçürərkən çox təzyiq tətbiq etməkdir. Yenə, ikincil plitələri inkubasiya etdikdən sonra, nəticədə yaranan koloniyalar auksotrofiya deyil, çirklənmə ilə əlaqəli böyümə fenotipləri yarada bilər.

Vəhşi tipli mikrob növlərinin hamısı prototrof deyil, buna görə də replika lövhəsi proseduru eyni vaxtda xarakterik böyümə tələbləri üçün müxtəlif vəhşi tipli suşların ekranlaşdırılması üçün istifadə edilə bilər. Göründüyü kimi Şəkil 13, dörd fərqli hüceyrədən "dabs" Pseudomonas bakteriya ştammları YTA (panel A) adlı tam mühiti ehtiva edən şəbəkə ilə işarələnmiş boşqabın üzərinə iki nüsxədə vurulmuşdur. Daha sonra ştamlar fərqli karbon mənbəyi (müvafiq olaraq asetamid, laktoza və qlisin) ilə əlavə edilmiş minimal mühitdən (MSA) ibarət üç ikinci dərəcəli lövhəyə (B, C və D panelləri) təkrarlandı. Nəticələr dörddən ikisinin olduğunu göstərir Pseudomonas suşlar (P. aeruginosaP. stutzeri) bu üç karbon mənbəyində böyümək iqtidarında deyillər. Nəzarət olaraq, hüceyrələrin prosedur boyu köçürüldüyünü təsdiqləmək üçün ştamlar YTA mühiti ilə dördüncü boşqaba təkrarlandı. Dörd ştamın hamısı YTA nəzarət lövhəsində böyüdüyündən, seriyanın əvvəlki üç lövhəsində göstərilən böyümə çatışmazlıqları etibarlıdır. Replika örtüklərinin nəticələri cədvəldə verilmişdir Cədvəl 1. Tez-tez edilən bir səhv, ikincil boşqabda böyümənin izini müsbət nəticə kimi şərh etməkdir. Məsələn, fenotipini müqayisə edin P. aeruginosa buna P. stutzeri MSA+asetamiddə (panel B). Sonuncu, böyümənin izini göstərir, bu mənfi nəticədir və əvvəlki boşqabdan qida maddələri ana hüceyrələrlə ötürüldükdə baş verə bilər. Yeni hüceyrə böyüməsi baş vermir, çünki çatışmayan qidalar nəsil hüceyrələri üçün mövcud deyildir. Bir izi faktiki böyümə ilə qarışdırmaq asandır. Şübhə varsa, təcrübə birincil boşqabdan ikincil mühitə zolaqlı hüceyrələr kimi alternativ üsuldan istifadə etməklə təkrar edilməlidir.

Şəkil 1. Bir boşqabdakı tək koloniyaların nümunəsi. Lövhənin mərkəzinə yaxın olan çəhrayı kürələr koloniyalardır Serratia marcescens, Enterobacteriaceae ailəsindən olan qram mənfi, çubuqşəkilli Proteobacterium. Rütubətli mühitlərə üstünlük verdiyinə görə, bu mikroorqanizm adətən vannaların künclərində, lavabo hövzələrində, kafel məhlulunda və duş pərdələrində böyüyür. S. marcescens prodigiozin adlı qırmızımtıl piqment istehsal etdiyi üçün tanımaq asandır. Bu boşqabdakı koloniyalar 30°C-də 24 saat ərzində inkubasiya edildikdən sonra dördüncü kvadrantda tək koloniyalar görünməklə, zolaqlı lövhə texnikasından istifadə edilməklə yaradılmışdır. Qalan üç kvadrant, agar səthində çökən hüceyrələrin üst-üstə düşən koloniyalara çevrildiyi birləşən böyüməyi göstərir.

Şəkil 2. Streak-plate texnikası üçün istifadə olunan alətlər. Yuxarıdan aşağıya diş çubuğu (dairəvi olmayan yastı), məftil döngəsi, birdəfəlik plastik ilmə və taxta çubuqlar göstərilir. Diş çubuqları adətən istifadə etməzdən əvvəl sterilizasiya etmək üçün avtoklavda saxlandıqda geniş ucu aşağı olan kiçik bir şüşə qaba köçürülür, sonra folqa ilə örtülür. Taxta çubuqlar 18 mm-lik sınaq borularına köçürülür, sonra istifadə etməzdən əvvəl sterilizasiya etmək üçün avtoklavlanır.

Şəkil 3. (A) Quadrant metodundan istifadə edərək zolağın plitə üsulu. Nümunəni aqar səthinin dörddə birinə sürətlə, hamar, arxa və dördüncü hərəkətlə halqadan boşqabın mərkəzinə yaymaq üçün əvvəlcədən sterilizə edilmiş ilgək, çubuq və ya diş çubuğundan istifadə olunur. Bu hərəkət boşqabın dörd kvadrantının hər biri üçün təkrarlanır. İnkubasiyadan sonra hüceyrələrin boşqabda yerləşdirilməsi üçün istifadə olunan alətin yolu boyunca hüceyrə artımı görünür. Bu texnikadan istifadə edərək qarışıq nümunədə hüceyrələrin mexaniki ayrılması dördüncü kvadrantda tək koloniyalarla nəticələnməlidir (bax. Şəkil 1 misal üçün). Tək koloniyalara koloniya əmələ gətirən vahidlər (cfu) deyilir. (B) Metal halqadan zolaqların vurulması üçün istifadə edildikdə, inokulum və ya agar mühiti ilə təmasdan əvvəl Bunsen odunun alovu ilə sterilizasiya edilməlidir. Xatırladaq ki, alovun ən isti hissəsi mavi konusun ucudur. Alətin sapını tutaraq, teli döngədən təxminən 3-4 düym məsafədə alova qoyun. Telin qızarması üçün kifayət qədər uzun müddət buraxın. Teli hərəkət etdirin ki, alov döngəyə yaxınlaşsın. İnokuluma toxunmazdan əvvəl metal halqanın soyuduğundan əmin olun.

Şəkil 4. Plitə tökmə texnikası. (A) Kiçik həcmli nümunə (0,1 ilə 1,0 ml arasında) aseptik qaydada boş, lakin steril Petri qabına 5,0 ml seroloji pipetkadan istifadə etməklə paylanır. (B) Təxminən 48 ºC temperatura tarazlaşdırılmış ərinmiş agar daha sonra nümunə ilə birlikdə Petri qabına tökülür. Qapağı bağladıqdan sonra boşqab nümunəni və ərinmiş agarı qarışdırmaq üçün yumşaq bir şəkildə burulur. Agarın təxminən 30 dəqiqə bərkiməsinə icazə verilir, sonra plitələr inkubasiya üçün ters çevrilir.

Şəkil 5. Dönər masa və şüşə yayıcı ilə yayma texnologiyası. Agar boşqab dönər masaya yerləşdirildikdən sonra kiçik həcmli nümunə (0,1-0,2 ml) mikropipetdən istifadə edərək aseptik qaydada boşqabın mərkəzinə paylanır. Yayıcı onu bir etanol şüşəsinə batıraraq, sonra artıq etanolu alovlandırmaq üçün Bunsen brülörünün alovundan keçirərək sterilizasiya edilir. Nümunə ilə təmasda olmamışdan əvvəl, yayıcı boşqabın kənarına yaxın olan agara toxunaraq soyudulmalıdır. Dönər masa yavaş-yavaş fırlanarkən, yayıcı yavaş-yavaş boşqab boyunca nümunə vasitəsilə irəli və geri hərəkət edir. Bu hərəkət nümunənin tədricən, lakin hətta agar səthinə yayılmasına imkan verir. Qapağı bağladıqdan sonra boşqab inkubasiya üçün boşqabın tərsinə çevrilməmişdən əvvəl nümunənin tam olaraq agara hopması üçün boşqab ən azı 5 dəqiqə dəzgahın üstünə qoyulmalıdır.

Şəkil 6. Şüşə muncuqlarla spread-plate texnikası (Copacabana Method). Avtoklavda əvvəlcədən sterilizasiya edilmiş şüşə muncuqlar dəzgahın üstündə oturan agar boşqabının səthinə tökülür. Kiçik həcmli nümunə (100-150 ºCl) mikropipettordan istifadə edərək aseptik qaydada agarın mərkəzinə paylanır. Lövhənin qapağı bağlı halda, muncuqları boşqab boyunca 6-7 dəfə irəli və geri hərəkət etdirmək üçün üfüqi silkələmə hərəkətindən istifadə edilir və nümunə yayılır. Bu hərəkət boşqab 60° fırlanandan sonra təkrarlanır. Sarsıntı hərəkəti başqa 60° fırlanmadan sonra üçüncü dəfə təkrarlanır. Nümunə tam olaraq agar mühitinə hopduqdan sonra muncuqlar 10% ağartıcı olan stəkana tökülür. Bundan sonra plitələr inkubasiya üçün ters çevrilir.

Şəkil 7. Lövhələrin əmələ gəlməsinə əsaslanaraq faqı təcrid etmək və saymaq üçün istifadə edilən yumşaq-aqar örtüyü texnikası (həmçinin lövhə analizi adlanır). (A) Yumşaq agarda böyüyən bakteriya koloniyalarının birləşmiş asqısında fagın olması təmizlənmə zonaları və ya lövhələr kimi aşkar edilə bilər. Phage T4, ev sahibini yoluxduran virulent, ikiqat zəncirli DNT faqıdır. Escherichia coli, ev sahibi hüceyrələrin parçalanmasına və nəsil faqının sərbəst buraxılmasına səbəb olur. İnfeksiya və lizisin çoxlu raundlarından sonra qonşu E. coli orijinal yoluxmuş ev sahibi hüceyrəni əhatə edən bilavasitə ərazidəki hüceyrələr yox olur və milyardlarla T4 faq hissəciklərini ehtiva edən lövhə buraxır. Phage T4 təxminən 1 mm diametrli lövhələr əmələ gətirir. Bu təcrübədə, Phage T4-ün 2 x 10 8 pfu/ml ehtiyatının 10-5 nisbətində seyreltilməsinin 200   təxminən 300  E. coli indikator hüceyrələri 37 ºC-də eksponent olaraq böyüyən, qazlı bir mədəniyyət kimi hazırlanmışdır. Həm faj, həm də bakteriyalar EHA yumşaq agar borusuna əlavə edildi, qarışdırıldı, sonra EHA sərt agar boşqabının səthinə töküldü. Qeyd edək ki, bu halda örtükdən əvvəl fag və bakteriyaların adsorbsiyasına icazə vermək lazım deyildi. Yumşaq agarın 20 dəqiqə ərzində toxunulmaz qatılaşmasına icazə verdikdən sonra lövhələr ters çevrildi və 24 saat ərzində 37ºC-də inkubasiya edildi. (B) İnfeksiya edən faj hissəcikləri olmadıqda, bakteriya artımı diskret koloniyaların görünmədiyi yumşaq agarda hüceyrələrin buludlu asqısına səbəb olur. Bunun əvəzinə, bu vəziyyətdə bakterial hüceyrələrin bərabər qazon E. coli, bütün yumşaq agar təbəqəsi boyunca əmələ gəlir.

Şəkil 8. Bakteriya nümunələri ilə ilkin lövhənin (master) hazırlanması. Nümunələri mütəşəkkil saxlamaq üçün boşqabın dibi tor şəklində qeyd oluna və nəticədə kvadratlar nömrələnə bilər. Hər bir nümunəyə şəbəkədə kvadrat təyin edilə bilər. Göstərilənlər düzgün və yanlış peyvənd nümunələridir. İdeal olaraq, nümunəni "dab" etmək üçün diş çubuğu kimi steril bir peyvənd alətindən istifadə edərək kvadratın mərkəzinə az sayda hüceyrə köçürülür (4 nömrəli hüceyrə). №5 xanada (“yamaq”) və xana #6 (“doldurma”) təsvir olunanlar kimi ümumi inokulyasiya səhvləri inkubasiyadan sonra bakteriya nümunələrinin həddən artıq çoxalması ilə nəticələnir və nəticədə bitişik kvadratları çirkləndirir.

Şəkil 9. Replika-plitələr texnikası, fenotip ekranları üçün hüceyrələri birincil lövhələrdən ikincil lövhələrə köçürmək üçün istifadə olunur. İlkin boşqabdakı işarə məxmər örtüklü blokdakı işarə ilə düzlənir, sonra agar səthinin parça ilə təmasda olmasına imkan vermək üçün aşağı salınır. Hüceyrələr barmaq ucları ilə əsas boşqabın üzərinə yüngül, lakin bərabər şəkildə basaraq boşqabdan məxməriyə köçürülür. Bu hərəkət məxmər üzərində hüceyrə nümunələrinin izini əsas lövhə ilə eyni məkan modelində buraxacaq. Hüceyrələri məxmərdən ikinci dərəcəli boşqaba köçürmək üçün eyni prosedurdan istifadə olunur. Məxmər üzərində eyni ilkin boşqab təəssüratından istifadə edərək 7-8 ikinci dərəcəli lövhə vurula bilər. Məxmərdən aşılanan son boşqab müsbət nəzarət kimi xidmət etməlidir. Bu, bütün sınaqdan keçirilmiş suşların böyüməsini dəstəkləyən, bütün lövhələr seriyası boyunca kifayət qədər hüceyrə köçürməsini təmin edən bir mühit olmalıdır. İnkubasiyadan sonra ikincil lövhələr yoxlanıla və böyüməyə qarşı böyüməyə görə qiymətləndirilə bilər. Beləliklə, bir təcrübədə bir neçə bakterial ştamm eyni vaxtda bir neçə böyümə mühitində yoxlanıla bilər.

Şəkil 10. Pour-plate texnikasından istifadə edərək nümunə nəticə. İctimai içməli bulaqdan toplanmış 1,0 ml su nümunəsi steril boş Petri qabına töküldü. Sonra ərinmiş, lakin soyudulmuş YTA nümunə ilə qaba töküldü. Su nümunəsində mövcud ola biləcək maya və kiflərin böyüməsinin qarşısını almaq üçün agarda 100 μg/ml sikloheksimid də var idi. Qarışdırmaq üçün yumşaq bir şəkildə çevirdikdən sonra boşqab düz bir səthə qoyuldu və agarın tamamilə bərkiməsinə icazə verildi. Plitə 37 ºC-də 48 saat inkubasiya edildi. Göstərilən bu təcrübənin nəticəsidir. Böyük və dairəvi formada olan səth koloniyaları ilə çox kiçik və qeyri-müntəzəm formada olan yeraltı koloniyalarla görünüş fərqinə diqqət yetirin, çünki bərkimiş mühit koloniyanın yeraltında yayılmasına mane olur.

Şəkil 11. Yayılmış lövhə texnikasından istifadə edərək nümunə nəticə. "Copacabana Metod" skrininq təcrübəsi üçün E. coli hüceyrələrinin qarışığını plitə etmək üçün istifadə edilmişdir. Bu halda, böyümə mühitində (LB) X-Gal var, buna görə də funksional β-qalaktosidaza fermentini ifadə edən hüceyrələr mavi koloniyalar əmələ gətirir, bu hüceyrələr isə mutasiyaya malikdirlər. lacZ gen və beləliklə funksional β-qalaktosidaza fermentini ifadə edə bilməyən ağ koloniyalar əmələ gətirir. Tez-tez "mavi/ağ ekran" olaraq adlandırılan iki növ koloniya eyni boşqabda bir-birindən asanlıqla fərqlənə bilər.

Şəkil 12. Yumşaq-aqar örtük texnikasından istifadə edərək lövhə analizinin nümunə nəticəsi. Host ştammında əmələ gələn lövhələr göstərilir Mycobacterium smegmatis mc 2 155 (ATCC 700084) iki müxtəlif faq tərəfindən: (A) Mikobakteriofaqları məhv edənlər və (B) Mikobakteriofaq MSSS. Bu faqlar 2010-cu ilin yazında UCLA MIMG 103L laboratoriya kursunda tələbələr tərəfindən təcrid edilmişdir. M. smegmatis patogen olmayan Aktinobakteriyadır və vərəm kimi ciddi xəstəliklərə səbəb olduğu bilinən bir neçə patogenləri ehtiva edən mikobakteriyalar ailəsinə aiddir.M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) və cüzam (M. leprae). Destroyers-in 10-2 seyreltilməsinin təqribən 50 μl və hər biri 10-3 MSSS seyreltməsi 500 μl ilə inkubasiya edilmişdir. M. smegmatis 20 dəqiqə 37 ºC-də, sonra MBTA (yumşaq agar) ilə qarışdırılır və MHA (bərk agar) boşqablarına tökülür. Yumşaq agarın 20 dəqiqə ərzində zədələnmədən bərkiməsinə icazə verdikdən sonra lövhələr ters çevrildi və 48 saat ərzində 37ºC-də inkubasiya edildi. Hər bir fag tərəfindən istehsal olunan fərqli lövhə morfologiyalarına diqqət yetirin. Məhv edənlər (A) kiçik (orta diametri təxminən 1 mm), litik faq üçün xarakterik olan şəffaf lövhələr əmələ gətirir, MSSS (B) isə bulanıq halo ilə əhatə olunmuş aydın mərkəzləri olan böyük "öküz gözü" lövhələr əmələ gətirir (orta diametri təxminən 3,2 mm). . Dumanlı halqa fag infeksiyasına davamlı bakteriyalardan ibarət ola bilər. Bu nümunə bulanıq lövhələr əmələ gətirən lizogen fag tərəfindən əmələ gələndən fərqlidir.

Şəkil 13. Replika lövhəsi prosedurundan istifadə etməklə nəticə nümunəsi. dörd Pseudomonas suşlar (P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens və P. stutzeri) üç müxtəlif karbon mənbəyində böyümə üçün iki nüsxədə sınaqdan keçirilmişdir: asetamid, laktoza və qlisin. (A) İlkin lövhə göstərildiyi kimi dörd ştamla aşılanmış tam mühitdir (YTA). 24 saat ərzində 30 ºC-də inkubasiya edildikdən sonra bütün dörd suş YTA-da böyüyür. Birincil boşqab tək karbon mənbəyi ilə əlavə edilmiş minimal mühitə (MSA) boşqabın təkrarlanması üçün istifadə edilmişdir: asetamid (B), laktoza (C) və qlisin (D). Seriyadakı son boşqab müsbət nəzarət YTA lövhəsi (E) idi. Göstərildiyi kimi, ştammlar ikincil plitələrdə inkubasiyadan sonra dəyişkən böyümə nümunələrini göstərir. Qeyd edək ki, böyümə və hüceyrələrin izi arasında fərq qoymaq bəzən çətindir. Məsələn, yaratdığı izi müqayisə edin P. stutzeri üç MSA plitələr tərəfindən eyni üç plitələr heç bir artım P. aeruginosa. Göstərilən böyümə nümunələri ilə müqayisədə hər ikisi mənfi nəticələrdir P. putidaP. fluorescens. Bununla belə, hüceyrələrin seriyadakı bütün ikincil plitələrə köçürüldüyünü təsdiqləyən müsbət nəzarət lövhəsində bütün suşlar böyüyür. Bu təcrübənin nəticələri cədvəldə verilmişdir Cədvəl 1.

 YTA (əsas)MSA + asetamidMSA + laktozaMSA + glisinYTA (nəzarət)
P. aeruginosa+---+
P. putida+++++
P. fluorescens+++++
P. stutzeri+---+

Cədvəl 1. Replika örtük nəticələrinin xülasəsi. Artım artı (+) işarəsi ilə, artım isə mənfi işarə (-) kimi göstərilib. YTA tam mühitdir (maya tripton agar) və MSA minimal mühitdir (minimal duzlu agar). MSA lövhələri göstərildiyi kimi tək bir karbon mənbəyi ilə tamamlandı.


Müzakirə

Metabolik mübadilə qarşılıqlı təsirləri tez-tez bir-birinə yaxın böyüyən hüceyrələr arasında baş verir, çünki metabolitlər müxtəlif səbəblərdən, məsələn, daşqın metabolizmi, metabolitlərin bərpası, ixracatdan daha yaxşı istifadə olunur. . Bakteriyalarda bu cür metabolit mübadiləsinin bir hissəsi kooperativ xarakter daşıyır, o mənada ki, bütün mübadilə tərəfdaşları bu vəziyyətdən qazanc əldə edirlər (Oliveira et al., 2014), halbuki eukaryotik orqanizmlərin əksəriyyəti üçün metabolit mübadiləsi strategiyaları qeyri-müəyyən olaraq qalır. Maya auksotroflarının əlavə və zəngin mühitlərdə canlı olmasına baxmayaraq (Mülleder et al., 2012), amin turşusu əlavəsi olmadıqda, onlar bir neçə cüt və ya daha yüksək səviyyəli birgə kultura təcrübələrində metabolik çatışmazlıqları tamamlaya bilmirlər (Şəkil 1A, B , [Müller et al., 2014 Shou et al., 2007]), oxşar təcrübələrin təsirli olduğu bakterial tədqiqatlardan aydın fərq (Foster and Bell, 2012 Freilich et al., 2011 Harcombe, 2010 Pande et al. ., 2014 Ramsey et al., 2011 Vetsigian et al., 2011). Bu, mayanın bir çox bakterial növdən fərqli olaraq, amin turşuları və nukleobazlar kimi vasitəçi metabolitlərin artımla əlaqəli mübadiləsini təmin etmək üçün tələb olunan ixrac imkanlarından məhrum ola biləcəyi ilə bağlı fərziyyələrə səbəb oldu (Shou və digərləri, 2007). Koloniyadaxili ekzometabolumu təhlil edərək, biz lazımi metabolitləri aşkar edə bildik, koloniya daxilindəki hüceyrələrin zəngin bir ekzometaboloma ilə əhatə olunduğunu gördük. Biz həmçinin aşkar etdik ki, maya mövcud olduqda qida maddələrini yalnız bu hüceyrədənkənar metabolitlərə güvəndiyi dərəcədə səmərəli şəkildə istifadə edəcək. Bu nəticə göstərirdi ki, birlikdə böyüyən maya hüceyrələri arasında metabolit mübadiləsi təbiətcə tez-tez olur, birgə kultura təcrübələrində tamamlamanın olmaması eksperimentin özünün limitini əks etdirə bilər və maya hüceyrələrinin metabolit mübadiləsi imkanlarını təmsil etmir.

İki və ya daha çox mədəniyyətin birləşməsindən yan keçmək üçün biz sintetik biologiya yanaşmasını seçdik və ilkin tək hüceyrədən təsadüfi birləşmədə metabolik çatışmazlıqları tədricən təqdim etmək üçün plazmidlərin stoxastik itkisindən istifadə etdik. Prototrofiyanın mütərəqqi itkisi hüceyrələrə metabolit mübadiləsi əsasında hüceyrə böyüməsini saxlamağa imkan verdi, nəticədə 73% auksotrofiyaya malik bir cəmiyyət yarandı ki, bu da ən məhdudlaşdırıcı metabolit olan urasil ilə əlavə edildikdə 97% -ə yüksəldi. Dominant auksotrofik tərkibinə baxmayaraq, SeMeCo icması ekzometabolom kimi vəhşi tip, metabolik effektivlik və həmçinin hüceyrə canlılığını qoruya bilər ki, bu da əməkdaşlığın bu növünün möhkəm fizioloji xüsusiyyət olduğunu göstərir. Beləliklə, mayanın təbii metabolit ixrac və idxal imkanları metabolit mübadiləsi əsasında birgə inkişafı dəstəkləmək üçün tamamilə kifayətdir.

SeMeCos-un yaradılması da auksotrofların daha yüksək nizamlı birləşmədə qarışdırılması ilə asanlaşdırılmamışdır. Bu, daha çox metabolik genlərin itirilməsinin biokimyəvi imkanları azaldır və yenilərini əlavə etməməsi anlayışına uyğundur. SeMeCo sisteminin açarı bunun əvəzinə tək hüceyrədən başlayaraq cəmiyyətin mütərəqqi özünü qurmasına imkan verməkdir (Şəkil 2). Metabolik rəy tənzimləmə sistemləri buna görə də ümumiyyətlə metabolitlərin ixracını maneə törətmir, lakin əvvəlcədən qurulmuş birgə mədəniyyətlər qarışıq olduqda kooperativ birgə böyümənin qarşısını alır (Müller et al., 2014 Shou et al., 2007). Bu mexanizmlərin mümkün rolu, bəlkə də rəqabət aparan maya koloniyasından yaranan yad, potensial aldadıcı hüceyrələrin yayılmasının qarşısını ala bilər. Biz SeMeCo-ya tez-tez rast gəlinənlərlə eyni genotipə malik olan hüceyrə mədəniyyətini yerləşdirməklə belə bir fərziyyənin lehinə olan davranışı təkrarlaya bilərik.HIS3 LEU2 ura3Δ MET15) və nadir (onun3Δ leu2Δ URA3 MET15) genotip (Şəkil 5A), biz SeMeCo-da müvafiq genotipin tezliyindən asılı olmayaraq hər iki genotipin əvvəlcədən qurulmuş SeMeCo-dan sürətlə tükəndiyini müşahidə etdik (Şəkil 5—şəkil əlavəsi 1).

SeMeCo-nun genotipik tərkibinin öyrənilməsi, müstəqil şəkildə qurulduqda səkkiz reproduktiv konsentrasiyalı metabotipi əhatə edən oxşar populyasiya tərkibini qoruyan əməkdaşlıq edən cəmiyyətin xüsusiyyətlərinin əsasında müəyyən edilmiş qarşılıqlı təsirlər toplusunun olduğunu nəzərdə tutur. Bu, kəmiyyətcə müəyyən edilmiş bu icma tərkibinin metabolik əməkdaşlıqda ən təsirli olduğunu göstərir. Bu tapıntı çoxhüceyrəliliyin təkamülünün başa düşülməsində mühüm boşluğu aradan qaldıra bilər Əgər müəyyən edilmiş tərkib kooperativ böyümədə ən təsirli olarsa, seçim üstünlüyü əməkdaşlıq tərəfdaşlarını müəyyən edilmiş tarazlıqda saxlaya bilən hər hansı fiziki əlaqə ilə təmin edilə bilər və əlavə olaraq, aldadıcı hüceyrə növlərinin işğalına qarşı əlavə qorunma təmin edir. Həqiqətən, ekzometabolom məlumatları göstərir ki, birlikdə böyüyən hüceyrələr arasında metabolit mübadiləsi qarşılıqlı təsirlərinin sayı əhəmiyyətli ola bilər. Koloniya ekzometabolomu, amin turşularının əksəriyyəti də daxil olmaqla, çoxlu biomolekullardan ibarət idi (Şəkil 1C) (Castrillo et al., 2007 Paczia et al., 2012 Silva and Northen, 2015). Maya hüceyrələrinin amin turşuları və urasil sintezindən daha çox mənimsənilməsini, hətta genetik olaraq prototrof olduqları halda belə, hüceyrə mühiti metabolitlərin kritik konsentrasiyası əldə etdikdən sonra mübadilə qarşılıqlı təsirlərinin asanlıqla qurulacağını göstərir. Bunun metagenomik tədqiqatların və fırıldaqçı/xeyirxah təcrübələrin təfsiri üçün təsirləri var, çünki bu səbəbdən, tək bir metabolik yolun genetik varlığı və ya olmamasından və ya tək bir metabolitin sintezindən, neçə başqa metabolitdən ibarət olduğuna dair nəticə çıxarmaq olmaz. də dəyişdirilir.

Seçici təzyiq olmadan belə, həm vəhşi tipli mayalar, həm də SeMeCo minimal mühitdə amin turşusu ilə zəngin ekzometabolom qurdular (Şəkil 1C) və metabolitlərin qəbulu ilə məşğul oldular (Şəkil 1). Bu, bu xüsusiyyətlərin mayanın təbii xüsusiyyəti olduğunu nəzərdə tutur və təbii maya icmalarının nə üçün birgə böyüyən, genetik, auksotroflardan ibarət olmadığı sualını doğurur. Bu suala cavab vermək üçün yadda saxlamaq lazımdır ki, genomda metabolik genlərə sahib olmaq yolun daimi aktiv olmasına bərabər deyil. Genetik olaraq prototrof olması daha yüksək səviyyədə metabolik çeviklik verir, çünki prototrof hüceyrələr tələb olunduqda sintetik yolu yenidən aktivləşdirə bilər. SeMeCo-dan fərqli olaraq, təbii icmadakı hüceyrənin genotipi mahiyyət etibarilə onun metabotipini və ya cəmiyyətdəki metabolik rolunu əks etdirmir. Bundan əlavə, mayanın təbii həyat dövrü aclığa dözmək və yaşayış yerləri arasında yayılmaq üçün vacib olan endosporların meydana gəlməsini əhatə edir. Prototrof genotip olmadan tək bir spor artıq öz başına bir koloniya yarada bilməz, çünki genetik auksotrofiya mayaların həyat dövrünü pozar. İkincisi, təbii mayanın həyat dövrünün yalnız bir hissəsi bol karbohidrat və azot tədarükü tələb edən eksponensial artımda baş verir. Həm də prototrof genotipin saxlanması S. pombe və içində S. cerevisiae vəhşi təcridlər (Jeffares et al., 2015 Liti et al., 2009) buna görə də mürəkkəb amin turşusu və nukleotid mübadiləsi mexanizmlərinin mövcudluğu ilə tam uyğundur.

Bu metabolitlər təmin edildikdən sonra bu hüceyrələrin öz-özünə sintezdən histidin, lösin, metionin və urasil üçün qəbul edilməsinə tam keçidinin tapılması genom miqyaslı tədqiqatlarda əsas eukaryotik model orqanizm olan mayadan istifadə edilən tədqiqatlara birbaşa təsir göstərir. Maya genetik təcrübələrinin əksəriyyəti amin turşusu əlavə edilmiş və ya zəngin media kompozisiyaları tələb edən auxotrofik suşlarda aparılır. Biosintetik maddələr mübadiləsinin mühüm hissələri (amin turşusu biosintezi biokütləyə gedən metabolik axının 50%-ə qədərini təşkil edə bilər) beləliklə, əhəmiyyətli miqdarda funksional genomik təcrübələrdə səssiz qalmış ola bilər. Metabolik genetik qarşılıqlı təsirlərin hüceyrə fiziologiyasına təsiri beləliklə bizim mövcud biliklərimizi əhəmiyyətli dərəcədə üstələyə bilər və minimal qida əlavələrinə keçdikdə aşkar edilə bilər. Bu kontekstdə, SeMeCos idarə etmək üçün sadədir, tez qurulur və təhlil etmək asandır və buna görə də laboratoriyada həm kooperativliyi, həm də maddələr mübadiləsinin təsirlərini öyrənmək üçün effektiv və geniş tətbiq olunan eukaryotik model sistemini təmsil edir.

Xülasə olaraq, mübadilə edilə bilən metabolitlər üçün model metabolik yollar kimi histidin, lösin, metionin və urasildən istifadə edərək aşkar etdik ki, S. cerevisiae hüceyrələr bu qida maddələrini öz-özünə sintez etməkdən üstün tuturlar və hüceyrədənkənar koloniya məkanında amin turşusu ilə zəngin ekzometabolumu saxlayırlar. Mayanın ikili və daha yüksək səviyyəli birgə kultura təcrübələrində auksotrofiyanı kompensasiya etməkdə uğursuz olduğu bilinsə də, hüceyrələr tək hüceyrəli plastik bölünməyə müvəffəqiyyətlə daxil oldular. tədricən mürəkkəb heterojen bir cəmiyyətə çevrilə bilər. Öz-özünə həyat qabiliyyəti olmayan auksotrofik hüceyrə növlərindən ibarət SeMCo icmaları metabolik çatışmazlıqları aradan qaldıra və yabanı tipli hüceyrələrə bənzər metabolit konsentrasiyalarını və möhkəmliyini qoruya bildi. Bundan əlavə, əməkdaşlıq töhfə verən hüceyrələrə müxtəlif metabolik rollar qoymuşdu. Beləliklə, mütərəqqi icma formalaşması mayaların müvafiq miqdarda böyümədə anabolik metabolitləri mübadilə etmək üçün tam imkanlara malik olduğunu və mürəkkəb, lakin müəyyən edilmiş icma strukturları daxilində hüceyrədən-atonom metabolizmi asanlıqla qurduğunu göstərir.


  • Media Resepti inqrediyentləri (Media Reseptləri səhifəsinə baxın)
  • steril, polistirol Petri qabları. 100 x 15 mm ən çox yayılmış ölçüdür, lakin 60 və 35 mm ölçüləri də işləyir
  • medianızın ən azı iki dəfə həcmini saxlayacaq şüşə qab
  • media qabınızı örtmək üçün alüminium folqa və ya mikrodalğalı soba istifadə edirsinizsə, plastik sarğı
  • medianızı sterilizasiya etmək üçün avtoklav, təzyiqli soba, mikrodalğalı soba və ya isti boşqab (Sterilizasiya Mayeləri səhifəsinə baxın)
  • isti konteynerlərlə işləmək üçün istiliyədavamlı əlcəklər, isti əllər və ya qablar
  • 70% etil və ya izopropil (sürtmə) spirti
  • iş yerinizi təmizləmək üçün məişət təmizləyicisi, 10% ağartıcı və ya dezinfeksiyaedici salfetlər
  • suyun ölçülməsi üçün pilləli silindr
  • bərk maddələrin çəkisi üçün balans
  • bərk maddələrlə işləmək üçün alətlər (məsələn, çəki qayıqları və çömçələr və ya kağız boşqablar və qaşıqlar)

Əks Mutasiyalar üzrə Biologiya Qeydləri | Genetika

Aşağıdakı məqalədə əks mutasiya haqqında qeydlər verilir.

Bir mutasiya vəhşi tipli normal genotipi mutant tipə dəyişdirdikdə, daha tez-tez olduğu kimi, bu hadisə irəli mutasiya adlanır. Bu, mutant genotipin orijinal vəhşi tipə dəyişdiyi əks mutasiyalardan fərqlidir. Mikroorqanizmlərdə prototroflara dönən auksotroflar, ilkin auksotrof ştammın hüceyrələrini minimal mühitə örtməklə asanlıqla aşkar edilir.

Bakteriofaq T4-də rll mutantları (ev sahibi hüceyrələrin sürətli lizisinə səbəb olan ştammlar) tez-tez vəhşi tip rll + ştamına qayıdırlar. Drosophila'da bir sıra resessiv mutant genlərin irəli mutasiyalardan daha az tezliklə vəhşi tipə qayıtdığı məlumdur. Mutant genlərin geri qayıtma qabiliyyəti, mutasiyanın ən azı bəzi hallarda daimi, geri dönməz bir proses olmadığını göstərir.

Əks mutasiyalar müxtəlif yollarla baş verə bilər. Əsl tərs mutasiyada vəhşi növün orijinal baza cüt ardıcıllığı bərpa oluna bilər. Beləliklə, əgər vəhşi tipli ardıcıllığın GC cütü irəli mutasiya yaratmaq üçün AT cütü ilə əvəz edilərsə, əsl əks mutasiya yenidən həmin mövqedə GC cütünü əvəz edə bilər.

Bəzən irəli mutasiya yaradan dəyişdirilmiş cütün yerinə başqa bir baza cütü daxil edilə bilər. Beləliklə, GC AT ilə əvəz edildikdə, geri dönüş GC əvəzinə CG ilə əvəz edilə bilər. Ardıcıllığı tək əsas cütdə vəhşi tipdən fərqli olsa da, bu, əks fenotip yaradır.

Bəzən görünən əks mutasiya, fenotipin vəhşi tip kimi görünməsi üçün birincil mutasiyanın təsirini yatıran ikinci supressor mutasiyasına bağlıdır. İkinci mutasiya birinci mutasiyanı daşıyan gen daxilində, lakin başqa yerdə baş verdikdə intragenik supressiya ola bilər. Və ya ikinci mutasiya fərqli bir gendə olduqda, bastırma intergenik (ekstragenik) ola bilər.

Hər iki supressiya növündə ikinci supressor mutasiyası birinci və ya əsas mutasiyanı daşıyan genin funksional məhsullarını istehsal edir. Məsələn, tutaq ki, A geni mutasiyaya görə A zülalını istehsal edə bilmir. Eyni və ya fərqli gendə supressor mutasiyası A zülalının istehsalı ilə nəticələnə bilər və bununla da A genindəki mutasiyanı geri qaytara bilər.

Genlərarası bastırma vəziyyətində, supressor gen termini başqa bir gendə əsas mutasiyanı boğan ikinci mutasiyaya malik olan geni ifadə edir. Supressor genlərin məhsulları adətən tərcümə sisteminin komponentləri, bastırıcı molekullar isə tez-tez tRNT molekullarıdır.

İntragenik supressiyada normal fenotipə qayıtma eyni gendə tək nukleotidlərin silinməsi və daxil edilməsi nəticəsində baş verə bilər. Beləliklə, əgər üçlülərin oxu çərçivəsi birinci mutasiyaya səbəb olan tək silmə səbəbindən yerdəyişsə, ikinci mutasiyanın yerində tək daxiletmə baş verərsə, çərçivə bərpa ediləcəkdir.

Yalnız silinmə və yerləşdirmə arasındakı üçlülər yanlış amin turşuları əlavə edərdi, zəncirin qalan hissəsi normal olardı. Əgər ikinci mutasiyanın yeri birinciyə yaxın olarsa, səhv amin turşularının sayı az olar və tam uzunluqda funksional zülal yaranar.

Supressor genlər tərəfindən intergenik bastırma tərcümə prosesindəki dəyişikliklərlə əlaqədardır. Supressor genlərin əksəriyyəti tRNT genlərindəki mutasiyalar nəticəsində yaranır və onların məhsulları mutant tRNT molekullarıdır. Üç zənciri bitirən kodonun hər birində mutasiya üçün supressor genlər var, yəni kəhrəba (UAG), oxra (UAA) və opal (UGA).

Normalda kəhrəba, oxra və opal mesaj daxilində yerləşmiş cəfəng mutasiyalardır və polipeptid zəncirlərinin fraqmentləri ilə nəticələnir. Hər bir cəfəng mutasiya üçün supressor gen mənasız kodonun yerinə bir amin turşusunun daxil edilməsinə imkan verir və zəncir dayandırılmır. Zənciri bitirən mutantların yatırılması mənasız kodonun sanki hiss kodonu kimi oxunması ilə həyata keçirilir.

Məsələn, bir növ kəhrəba boğucu UAG cəfəngiyat kodonuna qarşı tirozin amin turşusunu daxil edir. Supressor gen mutant tirozinə spesifik tRNT istehsal edir. Normal tirozin tRNT antikodon GUA-ya malikdir və mRNT-də UAC və UAU üçlülərini tanıyır. Mutant tRNT-dəki antikodon UAG ilə cütləşən CUA-ya çevrilir və zəncir vaxtından əvvəl sona çatmaq əvəzinə tirozin daxil edilir.

Başqa bir misal E. coli-də genlərarası təzyiqi göstərir. E. coli-də ilkin kəhrəba mutasiyası əsas üçlüyü cəfəng kodon UAG-a dəyişdi. Eyni mutasiyanı daşıyan E. coli-nin bəzi digər hüceyrələrində serin tRNT-ni kodlayan gendə intergenik kəhrəba supressor mutasiyası var idi.

Supressor gen AUG-ni tanıya bilən dəyişdirilmiş antikodonla mutant tRNT molekulları istehsal etdi. Beləliklə, supressor gen cəfəngiyat üçlüyü AUG yerinə serin daxil edə bilər və tam uzunluqda polipeptid zəncirləri yarana bilər. Həm UAG, həm də UGA supressorları spesifik tRNT-də antikodonu dəyişdirərək və mutant supressor tRNA istehsal edərək fəaliyyət göstərir. UAA-nın yatırılması mexanizmi tam məlum deyil.

Kəhrəba bastırıcı gen T4 bakteriofaqında şərti mutantların baş verməsini də izah etdi. T4-ün kəhrəba mutantlarının E. coli-nin bir ştamında (icazə verən ev sahibi adlanır), digər ştammda (məhdudlaşdırıcı host adlanır) böyümədiyi aşkar edilmişdir.

Bunun səbəbi, E. coli-nin icazə verilən ştammının kəhrəba mutasiyasının təsirini dəyişdirən kəhrəba bastırıcı geni daşıması idi. Kəhrəba boğucu genə malik olmayan E. coli hüceyrələri də kəhrəba mutasiyasını göstərir.


Replika örtük təcrübəsində auksotroflar necə müəyyən edilir?

Tam cavabı oxumaq üçün klikləyin. Bəs replika örtüklərini necə edirsiniz?

Texnika məxmər örtüklü bir diskin basılmasını və sonra orijinaldan çıxarılan koloniyalardakı hüceyrələrlə ikincil lövhələrin çap edilməsini əhatə edir. boşqab materiala görə. Ümumiyyətlə, çoxlu sayda koloniya (təxminən 30-300) olur replika örtüklü hər birini ayrı-ayrılıqda ayrı-ayrılıqda çəkməkdə çətinlik olduğu üçün boşqab.

Həmçinin bilin, auksotrofik marker nədir? An auksotrofik marker sonra biosintezdə istifadə olunan əsas monomerin istehsalı üçün əsas fermenti kodlayan genin vəhşi tipli alleli kimi müəyyən edilir. auksotrofik markerlər S. cerevisiae-də URA3, LYS2, LEU2, TRI1, HIS3, MET15 və ADE2-dir (1).

Beləliklə, Auxotroph və Prototroph nədir?

&xiά&nu&omega “artırmaq” &tau&rho&omicron&phiή “qidalanma”) orqanizmin böyüməsi üçün lazım olan xüsusi üzvi birləşməni sintez edə bilməməsidir (IUPAC tərəfindən müəyyən edildiyi kimi). An auksotrof bu xüsusiyyəti göstərən bir orqanizmdir axotrofik uyğun sifətdir.

Bakteriya populyasiyasında auksotroflarla prototrofları necə ayırd edərdiniz?

An auksotrof üzvi artım faktoru tələb edir, lakin a prototrof deyil, çünki o, ehtiyac duyduğu bütün üzvi böyümə faktorlarını sintez edə bilir.


Videoya baxın: İnsanlar ölkədən qaçmasınlar! Natiq Cəfərli Lökbatanda seçicilər qarşısında (Oktyabr 2022).