Məlumat

Prokaryotlar haploiddirlərsə, homoloji rekombinasiya yolu ilə qoşa zəncir qırılmalarını necə düzəldə bilərlər?

Prokaryotlar haploiddirlərsə, homoloji rekombinasiya yolu ilə qoşa zəncir qırılmalarını necə düzəldə bilərlər?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Başlıq hər şeyi deyir, mən dəli olmalıyam.


Bu suala bir neçə cavab:

  1. DSB-ləri təmir etmək üçün bakteriyaların etdikləri çox vaxt, ciddi homologiya tələb etməyən qeyri-homoloji son birləşmədir. Bu, nüsxə sayının ~1 olması ehtimalı daha çox olduqda, hüceyrə dövrünün əvvəlində daha çox ehtimal olunan mexanizmdir.

  2. Hüceyrələr DNT replikasiyasını tamamlamışsa (hüceyrə siklinin sonrakı mərhələsində), hüceyrədə bütün DNT-lərin ən azı 2 nüsxəsi mövcuddur. Bunlar homoloji rekombinasiya üçün istifadə edilə bilər.

  3. Bakterial xromosomun nüsxə sayı bəzi hallarda çoxaldıla bilər, belə ki, DNT replikasiyası hüceyrə dövrü ilə sinxronlaşdırılmır və hüceyrə üçün normaldan çox olur. Bu hallarda nüsxə sayı >2 ola bilər.


Prokaryotlar haploiddirlərsə, homoloji rekombinasiya yolu ilə qoşa zəncir qırılmalarını necə düzəldə bilərlər? - Biologiya

Hədəflənmiş genomun redaktəsi, maraq doğuran genomik ardıcıllığı xüsusi olaraq dəyişdirmək, daxil etmək və ya silmək üçün proqramlaşdırıla bilən nukleazlardan istifadə edən davamlı inkişaf edən texnologiyadır. Bu qabaqcıl molekulyar vasitələrə meqanükleazlar, sink barmaq nükleazları, transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor nukleazlar və genomun xüsusi hədəf yerlərində ikiqat zəncirli qırılmalar yaradan və ya homolog rekombinasiya yolu ilə DNT-ni təmir edən RNT-yə rəhbərlik edən mühəndis nükleazlar (RGENs) daxildir. donor DNT-nin olması və ya vasitəsilə xətaya meylli qeyri-homoloji son birləşmə mexanizmi. Bu yaxınlarda kəşf edilmiş CRISPR/Cas9 gen redaktə sistemləri kimi tanınan RGEN qrupu, müxtəlif ardıcıllıqları hədəf alarkən xüsusi fermentin yenidən qurulmasına ehtiyac olmadan xəstəliyin genotipi və fenotipi arasında səbəb əlaqəsini aşkar edən dəqiq genom manipulyasiyasına imkan verdi. CRISPR/Cas9 uğurla istifadə edilmişdir ex vivo pankreas beta-hüceyrəsinin inkişafı və funksiyasını anlamaq üçün embrion kök hüceyrələrində və xəstədən əldə edilən kök hüceyrələrdə gen redaktə vasitəsi. RNT ilə idarə olunan nukleazlar həmçinin diabet üçün yeni heyvan modellərinin yaradılmasına yol açır və bu əlyazmada ümumiləşdirilmiş və nümunə göstərildiyi kimi diabetdə müxtəlif terapevtik yanaşmaların effektivliyini sınamağa imkan verir.

Əsas İpucu: Bu icmalda CRISPR/Cas9 nukleazı yeni insulin gen terapiyası yanaşmalarının müalicə effektivliyinin sınaqdan keçirilməsi üçün uyğun olan şəkərli diabetin hüceyrə və heyvan modellərinin yaradılmasında tətbiq edilir.

  • Sitat: Eksi YE, Şanlıoğlu AD, Akkaya B, Öztürk BE, Şanlıoğlu S. Genom mühəndisliyi və xəstəlik modelləşdirilməsi vasitəsilə insulin gen terapiyası üçün proqramlaşdırıla bilən nükleazlar CRISPR/Cas9 texnologiyasını vəd edir. Dünya J Kök Hüceyrələri 2021 13(6): 485-502
  • URL:https://www.wjgnet.com/1948-0210/full/v13/i6/485.htm
  • DOI:https://dx.doi.org/10.4252/wjsc.v13.i6.485

İnsan genomunda təxminən 25000 zülal kodlayan və 25000 kodlaşdırmayan RNT geninin cəmi 50000 genin olduğu təxmin edilir[1]. Son illərdə fərdi genlərin funksiyasının dekodlanması insan genomu tədqiqatının əsas məqsədinə çevrildi. Genetik variantlar və insan xəstəlikləri arasındakı əlaqəni aşkar etmək üçün hərtərəfli genetik analiz tələb olunurdu. İnsanın genetik xəstəliklərinə qarşı effektiv terapevtik dərmanların hazırlanması genlərin funksiyasını başa düşməkdən asılıdır. Genetik dəyişikliklərlə insan xəstəlikləri arasında əlaqə illərdir məlum olsa da, bəzi xəstəlik fenotiplərinin yaranmasına səbəb olan mutasiyaları ancaq genetik modifikasiya yolu ilə müalicə etmək olar[2,3]. İnsan genomunun mürəkkəbliyinə görə, genetik məlumatın modifikasiyası texnoloji cəhətdən təkmil molekulyar alətlər tələb edən bir problem idi[4,5]. Bundan əlavə, bu genom mühəndisliyi vasitələrinin maraq doğuran hədəf toxumalara səmərəli və təhlükəsiz çatdırılması bu texnologiyaların klinik tətbiqi üçün narahatlıq doğurur[6].

Genom modifikasiyası ideyası ilk dəfə 1988-ci ildə Rudin və Haber[7] tərəfindən irəli sürüldü, burada onlar homotallik keçid endonükleaz fermenti ilə tetiklenen xromosom qırılmalarının effektiv təmiri haqqında məlumat verdilər. Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) homoloji rekombinasiya (HR). Onlar gen hədəflənməsinin effektivliyinin artdığını nümayiş etdirdilər vasitəsilə mayalarda cüt zəncirli DNT qırılmalarının (DSB) yaradılması[7]. Bundan əlavə, DSB-lərin təmirində HR-nin əhəmiyyəti ilk dəfə Jasinin tədqiqat qrupu tərəfindən məməli hüceyrələrində nümayiş etdirilmişdir[8]. Əvvəllər hesab olunurdu ki, məməlilər hüceyrələrində öldürücü xromosom DSB-ləri qırılma sahəsinə homologiya tələb etməyən bir mexanizmlə təmir edilir. Bu ilə kifayət qədər ziddiyyət təşkil edirdi S. cerevisiae burada əsas DSB təmir yolu HR-dir. Məməli hüceyrələrinin nəzərəçarpacaq səviyyədə rekombinasiya təmirindən istifadə edib-etmədiyini müəyyən etmək üçün nadir kəsici endonükleaz I-SceI üçün DNT parçalanma yerləri S. cerevisiae məməli (siçan) genomuna inteqrasiya edilmişdir. Beləliklə, xüsusi DSB-lər fermentin parçalanma yerlərində siçan genomuna daxil edilə bilər. vasitəsilə I-SceI üçün ifadə sistemi. Homoloji DNT-nin istifadəsi əsasən HR və ya daha az dərəcədə məməlilərin hüceyrələrinin məqsədyönlü genetik modifikasiyası ilə nəticələndi. vasitəsilə xətaya meylli qeyri-homoloji son birləşmə (NHEJ) mexanizmi. Bu iki tədqiqat yalnız məməli hüceyrələrində DSB-lərin təmirində HR-nin əhəmiyyətini nümayiş etdirmədi, həm də hədəflənmiş genom modifikasiyası üçün əsas yaratdı. Bununla belə, genomik modifikasiya üçün meqanükleazların uzun DNT-yə bağlanan tanınma bölgələrini yenidən proqramlaşdırmaq həqiqətən bir problemdir. Bu nöqtədə genom tənzimləmə vasitəsilə proqramlaşdırıla bilən nukleazlar genomda istənilən bölgəni dəyişdirmək üçün çox səmərəli alternativ yanaşmadır.

Gen hədəflənməsi vasitəsilə HR yüksək eukaryotik hüceyrələrdə aşağı effektivliyə görə praktik deyil və onların gündəlik istifadəsinə mane olur. Digər tərəfdən, sahəyə xüsusi DSB-lər yaradan proqramlaşdırıla bilən nukleazların HR səmərəliliyini ən azı 100 dəfə artırdığı və/yaxud səhvə meylli NHEJ mexanizmini aktivləşdirdiyi aşkar edilmişdir[9]. Genom redaktə yanaşmalarından sonra vasitəsilə bir müddət tədqiqatçılar üçün əsas modifikasiya variantı olaraq qalan sink barmaq nükleazları (ZFNs), transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor nükleazlar (TALENs) genomun redaktəsi üçün yeni alətlər kimi işlənib hazırlanmış, ardınca genomu redaktə edən nükleazların yeni bir sinfi inkişaf etdirilmişdir. RNT-yə rəhbərlik edən mühəndislik nükleazları (RGENs) adlanır. Öz xüsusiyyətlərini göstərən RGEN-lər vasitəsilə kiçik bələdçi RNT-lər, hədəflənmiş nüvə sistemlərini dəyişdirmək üçün daha asan sahəyə həyəcan gətirdi. Hər bir proqramlaşdırıla bilən nukleazın özünəməxsus xassələri olsa da, onların hamısı oxşar fəaliyyət mexanizmi kimi xüsusi hədəf bölgələrində nüvə DNT-ni parçalayaraq, hədəflənmiş genom modifikasiyasına aparan endogen DNT təmir sistemlərini aktivləşdirir. Bu araşdırmada əvvəlcə proqramlaşdırıla bilən nukleazların ümumi xüsusiyyətlərini təsvir etmək, sonra genom modifikasiyası üçün RGEN-lərə xüsusi diqqət yetirmək istərdik.

1990-cı illərin əvvəllərində Cons Hopkins Universitetindən Srinivasan Chandrasegaran adlı biokimyaçı fərziyyələr irəli sürdü və göstərdi ki, tip IIS məhdudlaşdırıcı ferment Fok1 iki ayrı zülal sahəsinə, yəni DNT-ni bağlayan domenə və ayrıla bilən endonükleaza fəaliyyəti göstərən domenə malikdir. bir-birindən proteazın köməyi ilə funksiyasını itirmədən[10]. Bu, Fok1 endonükleazını sink barmaq zülallarına bağlamaq yolu ilə ZFN-lərin generasiyasında olduğu kimi ardıcıllıqla spesifik nukleazlar yaratmaq üçün Fok1 nukleaza sahəsini digər zülalların DNT bağlayan domenləri ilə birləşdirmək ideyasına yol açdı[11]. Çandra seqaranın Bibikova əsərindən ilhamlanıb və b[12] Yuta Universitetində müvəffəqiyyət qazandı in vivo Canlı bir orqanizmdə ilk dəfə genom tənzimləməsi meydana gətirərək xüsusi olaraq hazırlanmışdır Drosophila ZFN-lərdən istifadə edərək hədəflənmiş parçalanma ilə mutantlar. ZFN-lər II tip məhdudlaşdırıcı endonükleaz FokI-dən qeyri-spesifik parçalanma domenindən parçalanma sahəsi kimi istifadə etsələr də, palindromik olmayan DNT sahələrini hədəf alan bir cüt ZFN-ni tələb edən parçalanma üçün FokI domenlərinin dimerizasiyası tələb olunur (Şəkil 1)[13]. Bundan əlavə, yönəldilmiş təkamül, gücləndirilmiş parçalanma fəaliyyəti ilə bir FokI ştammı istehsal etmək üçün istifadə edilmişdir[14]. FokI-nin parçalanma spesifikliyi struktur əsaslı dizayndan istifadə edərək dimerizasiya interfeysini dəyişdirməklə də gücləndirilmişdir[15].

ZFN-lər bitkilərin, heyvanların və insanların genomlarını manipulyasiya etmək üçün çox faydalıdır. Onlar Huntington xəstəliyi, miotonik distrofiya və bir sıra spinoserebellar ataksiyaları da daxil olmaqla, lakin bununla məhdudlaşmayan ondan çox irsi nevroloji pozğunluqlarda mövcud olan üçlü təkrar pozğunluqlarda xəstəliyə səbəb olan allelləri düzəltmək üçün uğurla istifadə edilmişdir[16]. Terapevtik genlərin əvvəlcədən seçilmiş xromosom lokusuna məqsədyönlü çatdırılması ZFN-ləri kodlayan plazmidlərdən istifadə etməklə əldə edilə bilər. vasitəsilə insan hüceyrələrində müəyyən bir gendə DSB-lərin yaranması. Bu, terapevtik genlərin viral ötürülməsi ilə bağlı bütün fəsadların qarşısını alacaqdır[17]. Bundan əlavə, xəstələrin kök hüceyrələri ZFN-lərdən istifadə etməklə dəyişdirilə bilər ex vivo onları mədəniyyətdə genişləndirdikdən sonra, korreksiya edilmiş funksiyaları olan fərqli hüceyrələr yaratmaq üçün genetik cəhətdən dəyişdirilmiş kök hüceyrələr yenidən xəstəyə yerləşdirilə bilər[18].

Təəssüf ki, bir çox ZFN-nin hədəfdən kənar DSB-lərə görə sitotoksik təsirlərə malik olduğu göstərilmişdir[19]. ZFN-lərin hədəfdənkənar parçalanma fəaliyyəti, sink barmaqlarının domenləri hədəf sahəsi üçün kifayət qədər spesifik olmadıqda və ya digər nəzərdə tutulmayan saytlara homologiya daşıdıqda bildirilir. Həddindən artıq miqdarda DSB-lərin yaradılması donor DNT-nin təsadüfi inteqrasiyasına və nəticədə hüceyrə ölümünə səbəb olan təmir mexanizmlərini alt-üst edə bilər. İki bitişik 9 baza cüt sahəsini hədəf alan 3 barmaqlı ZFN-lərin hədəfdən kənar parçalanmasını azaltmaq üçün daha uzun və nadir yerləri hədəf alan 4, 5 və ya 6 sink barmağı olan ZFN-lərin istifadəsi təklif olunur[20,21]. Maraqlıdır ki, HR və NHEJ təmir yolları arasındakı rəqabət ZFN vasitəçiliyi ilə gen modifikasiyası üçün bir maneədir. ZFN dimerində bir ZFN monomerinin katalitik fəaliyyətinin inaktivasiyası, HR-vasitəçiliyi ilə gen modifikasiyası üçün qərəzliliyi təmin edən sink-barmaq nikazalarının (ZFNickases) əmələ gəlməsi ilə nəticələnir[22]. ZFNickases, NHEJ təmirlərinin azalması səbəbindən hədəfdən kənar dəyişikliklərin azaldılmış spektrinə malikdir. Təəssüf ki, endogen genləri manipulyasiya etmək üçün ZFN-lərin tətbiqi kifayət qədər ardıcıllıq spesifikliyi ilə seçilmiş ardıcıllığı hədəf alan sink barmaq sahələrini yaratmaqda çətinlik çəkdiyinə görə çətin bir iş olmuşdur.

ZFN-lərin sitotoksiklik probleminin həlli 2009-cu ildə qram-mənfi bakterial bitki patogeninin təbii olaraq meydana gələn transkripsiya faktorlarından əldə edilmişdir. Ksantomonas. İki tədqiqat qrupu, biri Bogdanove tərəfindən idarə olunur və b[23] Ayova Dövlət Universitetində, digəri isə Martin Lüter Universitetində Boch və Bonas[24] arasında qarşılıqlı əlaqə mexanizmlərini ortaya qoydular. Ksantomonas-mənşəli transkripsiya aktivatoruna bənzər effektorlar (TALEs) və DNT və bu, bu zülalların sadə DNT bağlayan kodu və nisbi mühəndislik asanlığı ilə genomun redaktəsi üçün də istifadə edilə biləcəyini kəşf etdi. TALE-lər ifraz olunan zülallardır Ksantomonas bitkilərin yoluxmasından sonra III tip ifrazat sistemi vasitəsilə bakteriyalar. TALE-nin DNT-ni bağlayan sahəsi təkrar dəyişən Di-qalıq[25] kimi istinad edilən divergent 12-ci və 13-cü amin turşuları ilə təkrarlanan yüksək dərəcədə qorunan 33-34 amin turşusu ardıcıllığını daşıyır. Bu qalıqlar olduqca çevikdir və xüsusi nukleotidlərin tanınmasında istifadə olunur. TALEN-lər, DNT-nin spesifik ardıcıllığını parçalamaq üçün hazırlana bilən Fok1 DNT-nin parçalanma domeni ilə TAL effektorunun DNT-ni bağlayan domenini birləşdirməklə əmələ gəlir (Şəkil 1)[26]. ZFN və TALEN-lərin C-terminal uclarında eyni Fok1 nukleaz domenini ehtiva etmələrinə baxmayaraq, onların DNT-yə bağlanma yerləri bir-birindən fərqlidir (Şəkil 1). Sink barmaq zülallarından fərqli olaraq, TALE-lərin hər təkrarı tək bir baza tanıyır.

TALEN-lər insan embrion kök hüceyrəsini (hESC) və induksiya edilmiş pluripotent kök hüceyrə (iPSC) klonlarını və insan eritroid hüceyrə xətlərini [27,28], nokaut siçanları və siçovulları [29,30] yaratmaq üçün səmərəli şəkildə dəyişdirmək üçün istifadə edilmişdir. TALENlər həmçinin xəstəliklərin altında yatan genetik səhvləri düzəltmək üçün eksperimental olaraq tətbiq edilmişdir[31]. Oraq hüceyrə xəstəliyi[28,32], kseroderma piqmentozum və epidermoliz büllozası[33] kimi pozğunluqlara səbəb olan genetik qüsurların hamısı düzəldilə bilərdi. in vitro TALEN-lərdən istifadə edir. Üstəlik, T-hüceyrələri TALEN-lər tərəfindən genetik olaraq dəyişdirilə bilər ki, kemoterapevtik dərmanlara davamlı olsunlar və antitümör fəaliyyət göstərsinlər[34,35].

Təəssüf ki, effektiv çatdırılma mexanizminin olmaması, immunogenlik və qeyri-spesifik TALEN-in nəzərdə tutulmayan yerlərə bağlanması yerində TALEN-lərin insan xəstəliklərinin müalicəsi üçün tətbiqi[31]. Bundan əlavə, TALE təkrar ardıcıllıqlarını ehtiva edən DNT seqmentinin yaradılması çox çətin və vaxt aparır. Bu ardıcıllıqları yaratmaq texniki cəhətdən çox çətindir, çünki onlar hüceyrələrdə bir-biri ilə rekombinasiya oluna bilər. TALEN-lərin insan hüceyrələrində minimal toksiklik və hədəfdən kənar fəaliyyət göstərməsi olduqca diqqətəlayiq olsa da, CRISPR/Cas9 sisteminin ortaya çıxması cəmiyyətin diqqətini bu yeni nüvə sinfinə yönəltdi.

Kümelenmiş DNT təkrarlarının kəşfinə səbəb olan tədqiqatlar dünyanın üç fərqli yerindən müstəqil olaraq həyata keçirilmişdir. İşino və b[36] və onun Osaka Universitetindən olan həmkarları 1987-ci ildə kəsilmiş klasterin funksiyasını bilmədən klasterləşdirilmiş müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrarlar (CRISPR) ardıcıllığının bir hissəsini öz maraqları olan qələvi fosfataz geninin izozimə çevrilməsi ilə birlikdə təsadüfən klonladılar. . 1993-cü ildə Groenen və b[37] DR çoxluqda DNT polimorfizmi üzərində işləyərkən kəsilmiş birbaşa təkrarların (DR) çoxluğunu aşkar etdilər. Mycobacterium tuberculosis Hollandiyada. Daha sonra Mojica və b[38] İspaniyanın Alikante Universitetində təkrar ardıcıllıqları və onların arxeyadakı müvafiq funksiyasını öyrənirdi. HaloferaksHaloarkula 2000-ci ildə ilk dəfə kəsilmiş təkrarların transkripsiyasını müşahidə etdikdə növlər. 2001-ci ildə mümkün əlavə fasiləli təkrarlar üzərində işləyərkən, Mojica və Montoliu[39] istifadə olunan çoxsaylı abbreviaturalardan anlaşılmazlığın qarşısını almaq üçün CRISPR qısaltmadan istifadə etməyi təklif etdilər. müvafiq ədəbiyyatda ardıcıllıqları müəyyən etmək. Bəzi CRISPR ayırıcılarının faj DNT-sindən və plazmidlər kimi ekstraxromosomal DNT-dən əldə edildiyini göstərən sübutlar 2005-ci ildə üç ayrı tədqiqat qrupundan əldə edilmişdir[40 - 42]. Bakteriya və arxeya kimi prokaryotik orqanizmlərin genomlarında aşkar edilən CRISPR, əvvəllər prokariotu yoluxdurmuş müəyyən bakteriofaqların DNT seqmentlərindən əldə edilən DNT ardıcıllığı ailəsidir[43]. CRISPR ilə əlaqəli zülal 9 (Cas9) CRISPR ardıcıllığını tamamlayan spesifik DNT zəncirlərini müəyyən etmək və kəsmək üçün bələdçi kimi CRISPR ardıcıllığından istifadə edən helikaz və nukleaz motivlərini göstərən fermentdir. CRISPR ardıcıllığı Cas9 fermentləri ilə birlikdə orqanizmlər daxilində genləri dəyişdirmək üçün istifadə edilən CRISPR/Cas9 kimi tanınan yeni texnologiyanın əsasını qoydu[44].

Bir çox bakteriya və arxe növlərindən müəyyən edilən fərqli xüsusiyyətlərə malik CRISPR/Cas sistemləri müxtəlif qruplara təsnif edilə bilər. 1-ci sinif sistemləri hədəf nuklein turşularını pozmaq üçün çoxlu Cas zülalları kompleksindən istifadə edir, 2-ci sinif isə eyni funksiyanı yerinə yetirir. vasitəsilə tək böyük Cas proteini. Bunlar arasında II tip CRISPR/Cas9 sisteminə aid olan Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) bu gün ən çox tanınan və ən çox istifadə edilən texnologiyadır. Bu sistem bakteriyalarda viruslara və ya xarici nuklein turşularına qarşı immun sistemi kimi fəaliyyət göstərir[45]. Bakteriyalar fajla yoluxmuşsa, bakteriyaya daxil olan faj DNT bakteriyanın müdafiə mexanizmlərinin işə salınmasına səbəb olur. Bir çox Cas zülalları bakterial CRISPR lokusundan sintez edilir və naməlum mexanizmdə fag DNT-dən bir parça (protospacer) götürür və onu təkrar ardıcıllıqla birlikdə palindromik təkrar ardıcıllıqla ayrılmış bölgəyə əlavə edir. Daha sonra, CRISPR-dən əvvəlki RNT (crRNA), transaktivator crRNA (tracrRNA) və Cas9 fermentlərini ehtiva edən CRISPR lokusunun transkripsiyası baş verir[46]. Pre-crRNA, viral DNT-ni tamamlayan 20 nukleotid uzunluğunda crRNA yaratmaq üçün işlənir. Bu prosesdə bir çox Cas zülalları iştirak edir. crRNA-tracrRNA və Cas9 zülalı kompleks əmələ gətirərək viral DNT-yə bağlanır. Viral DNT-yə bağlanmaq üçün Cas fermentləri hədəf DNT-də mövcud olmalı olan protospacer bitişik motiv (PAM) ardıcıllığını xüsusi olaraq tanıyır. CRISPR lokuslarındakı boşluq ardıcıllığına uyğun gələn protospacerlərin yaxınlığında yerləşən bu növə xas qorunan ardıcıllıqlar aşkar edilmişdir. vasitəsilə hesablama analizləri. Üçün S. pyogenes Cas9 fermenti, bu ardıcıllıq ya "NAG" və ya "NGG"dir, sonuncusu fərdiləşdirilmiş parçalanma sistemlərində ən çox istifadə edilən PAM ardıcıllığıdır.

Cas9 fermenti iki nukleaz aktivlik sahəsini ehtiva edir. Bunlar HNH domeni (tamamlayıcı zəncirdə fasilə yaradır) və RuvC domeni (tamamlayıcı olmayan zəncirdə fasilə yaradır). PAM ardıcıllığının mövcudluğunda crRNA-tracrRNA-Cas9 kompleksi viral DNT-yə bağlanır və cüt zəncirli qırılmalar yaradır, beləliklə viral infeksiyanın qarşısını alır[47].

Bu kəşfdən sonra crRNA və tracrRNA-lar Cas9 aktivliyinin azalmasına səbəb olmadan birləşdirildi və beləliklə, 2020-ci ildə Kimya üzrə Nobel Mükafatı tərəfindən çox əhəmiyyətli tapıntı kimi tanınan kimerik-hibrid bələdçi RNT (sgRNA) əmələ gəldi[48]. CRISPR/Cas9 istifadə edərək insan hüceyrə mədəniyyətlərində genomun redaktəsi ilk dəfə Hsu tərəfindən eyni vaxtda bildirildi. və b[49], Konq və b[50] və Mali və b[51]. Daha sonra müxtəlif CRISPR/Cas9 və sgRNA ifadə plazmidləri bildirildi. Bu yeni sistemdə arzu olunan hədəf gen, uzunluğu 20 nukleotiddən ibarət hədəfə xüsusi oliqonukleotidin layihələndirilməsi və onu sgRNA ifadə plazmidinə köçürməklə Cas9 ifadə vektoru ilə dəyişdirilə bilər.

Spesifikliyi 20 nt bələdçi ardıcıllığının və bölünəcək hədəf ardıcıllığına bitişik PAM bölgəsinin ciddi nəzarəti altında olmasına baxmayaraq, Cas fermentlərinin potensial hədəfdənkənar təsirləri xüsusilə terapevtik tətbiqlər üçün böyük narahatlıq doğurur. Bu çatışmazlığı aradan qaldırmaq üçün strategiyalara məsələn, sgRNA ardıcıllığının dəyişdirilməsi daxildir. vasitəsilə 3' ardıcıllığının kəsilməsi, transfeksiya edilmiş DNT-nin miqdarının azaldılması və ya Cas9 fermentində dəyişikliklər. Bu kontekstdə aspartik turşusunu Alaninə (D10A) çevirən Cas9 fermentinin 10-cu amin turşusuna bir mutasiya tətbiq edildi. Bu mutasiya Cas9 fermentinin RuvC nukleaz aktivliyinin itirilməsinə səbəb oldu və Cas9 (Cas9_D10A) nikaza mutantının yaradılmasına imkan verdi (Şəkil 2)[52].Nikaz fəaliyyəti yalnız DNT ardıcıllığında mutasiyalara səbəb olmayan bir "əsas eksizyon" təmir mexanizmi ilə təmir olunan tək zəncirli DNT qırılmalarını təqdim edir. Bundan əlavə, Cas9 nikaza ilə cüt zəncirli DNT qırılmaları yaratmaq üçün iki fərqli gRNA lazımdır[53]. 20 nukleotidin iki fərqli ardıcıllığının genomda eyni şəkildə mövcud olması ehtimalı çox az olduğundan, bu Cas9_D10A vasitəçiliyi ilə DNT modifikasiyalarını daha təhlükəsiz edir[51].

Nikaz Cas9 zülalından sonra "qüsurlu və ya ölü Cas9" (dCas9) zülalı fermentin həm HNH, həm də RuvC domenlərində (müvafiq olaraq D10A və H840A) mutasiyaları susdurmaqla, inaktivləşdirilmiş endonükleaza fəaliyyəti ilə əmələ gəlmişdir. -sgRNA[52] tərəfindən idarə edildikdə hədəfləmə funksiyası. dCas9 zülalı çoxlu müxtəlif zülallarla birləşir və transkripsiya nəzarəti, həmçinin DNT modifikasiyası kimi müxtəlif məqsədlər üçün istifadə olunur (Şəkil 2). Fok1 nukleaz domeninin dCas9 zülalına birləşməsi hədəfdən kənar təsirləri azaldıb. Tədqiqatçılar dCas9-u Herpes simplex virus zülalının 16 (VP16) trans-aktivasiya domeninin bir sıra tandem təkrarları (VP48, VP64, VP160 kimi) və transkripsiyanın başlanğıc sahəsinin yuxarı hissəsini hədəfləmək üçün nəzərdə tutulmuş sgRNA-larla birləşdirdilər və beləliklə, aktivləşdirdilər. hədəf gendə transkripsiya (Şəkil 2)[54,55]. Eynilə, transkripsiyanı maneə törədən zülalın birləşməsi hədəf geni bloklayır. Bu repressorlar arasında ən yaxşı müəyyən edilmiş və tez-tez istifadə edilən Krüppel ilə əlaqəli qutu domeni, repressiv xromatin dəyişdirici domenidir və minimal hədəfdən kənar təsirlərlə heterokromatin yayılması vasitəsilə hədəf genin 90-99% yıxılmasını təmin edir[56,57] . Bundan əlavə, dCas9-un epigenetik enzimatik domenlərə (məsələn, p300, SID4x, PRDM9, DOT1L, Tet1) birləşdirilməsi spesifik epigenetik dəyişikliklərə imkan verir, eyni zamanda spesifik DNT ardıcıllığında baza redaktəsi başlana bilər. vasitəsilə dCas9-un əsas redaktə fermentləri ilə birləşməsi (Şəkil 2)[56 - 59]. CRISPR-genom təşkilatı adlı başqa bir CRISPR/Cas9 texnologiyası nüvə quruluşu ilə gen tənzimlənməsi və funksiyası arasındakı əlaqəni öyrənmək üçün proqramlaşdırıla bilən 3D platforma təklif edir (Şəkil 2)[60].

Müxtəlif məqsədlər üçün istifadə edilən unikal xüsusiyyətlərə malik bütün proqramlaşdırıla bilən nukleazlar arasında bu gün CRISPR/Cas9 sistemi tətbiqi asan, sərfəli və çox yönlü sistem kimi genomun redaktəsi üçün ən yaxşı seçim hesab olunur. Üstəlik, CRISPR/Cas9 sistemindən istifadə edən insan üçnüvəli ziqotlarında effektiv gen redaktələri ilk dəfə Çin alimləri Lianq tərəfindən təsvir edilmişdir. və b[61] 2015-ci ildə. CRISPR/Cas9 sistemindən istifadə etməklə 54 embriondan 28-də mutant Beta-Hemoqlobinin uğurlu parçalanmasına nail olunub.

2015-ci ildə bakteriyadan başqa bir növ nukleaz, Cas12a (əvvəllər Cpf1 kimi tanınırdı) kəşf edildi. Francisella novicida[62]. Cas12a-da Cas9-dan bir neçə əsas fərq müşahidə edildi, məsələn, uğurlu hədəfləmə üçün yalnız crRNA tələb olunur, T-zəngin PAM-a güvənilir və ikiqat zəncirli DNT-də pilləli kəsilməyə səbəb olur. Bu xüsusiyyətlər Cas12a-nı multipleksləşdirilmiş genomun redaktəsi üçün ideal etdi. Həmçinin, Cas12a təmirdən sonra tanınma ardıcıllığını pozmadan DNT 18-23 baza cütünü PAM yerindən aşağıya doğru ayırır.

2016-cı ildə yeni RNT-i idarə edən RNT endonükleazı, Cas13a nukleazı bakteriyadan səciyyələndirildi. Leptotrichia shahii[63]. Cas13a öz crRNA tərəfindən ssRNA hədəfinə yönəldilir və sonra digər ssRNA molekullarını ayrı-seçkilik etmədən parçalayır. Cas13a-nın girov bölünməsi adlanan bu parçalanma nümunəsi müxtəlif diaqnostik texnologiyaların inkişafı üçün istifadə edilmişdir[64 - 66].

Buna baxmayaraq, təbiətdə bakterial müdafiə sistemi kimi fəaliyyət göstərən CRISPR/Cas9 sistemi bu gün ən müasir gen modifikasiya üsullarından biri kimi biotexnologiyanın bir çox sahələrində tətbiq edilmişdir[67].

Sağlamlıq və xəstəlik şəraitində beta hüceyrə funksiyasının mexanizmləri CRISPR/Cas9 texnologiyasından istifadə etməklə eksperimental olaraq parçalana bilər. vasitəsilə pankreas beta hüceyrələrində genomun manipulyasiyası [68,69]. Bundan əlavə, beta-hüceyrə funksiyasının sınaqdan keçirilməsi üçün yeni genetik modifikasiya edilmiş heyvan modellərinin yaradılması indi CRISPR/Cas9 texnologiyasından istifadə etməklə mümkündür. Pankreas adacıqlarının hüceyrə itkisi diabetin əsas səbəblərindən biridir[70]. Bu problemin həlli olaraq, illər ərzində mədəaltı vəzi beta hüceyrələrinin bərpası üçün üç fərqli strategiya istifadə edilmişdir. Bu üç yanaşma mövcud beta hüceyrələrinin çoxalmasının stimullaşdırılması, müxtəlif növ hüceyrələrin beta hüceyrələrinə yenidən proqramlaşdırılması və beta hüceyrələrinin PSC-lərdən fərqləndirilməsidir. Pankreas adacıq hüceyrələrinin proliferasiyası da induksiya edilə bilər in vivo daha əvvəl göstərildiyi kimi gen terapiyası yanaşmalarından istifadə [71 - 73]. Pluripotent kök hüceyrələrdən istifadə kontekstində ilk dəfə 1989-cu ildə insan embrionlarından təcrid olunmuş ESC-lərdən fərqləndirilmiş pankreasın beta hüceyrəsinə bənzər insulin istehsal edən hüceyrələr (IPC) və ilk dəfə fərqli hüceyrələrin yenidən proqramlaşdırılması ilə əldə edilən iPSC-lər həyəcan yaratmışdır. beta hüceyrələrinin yeni potensial mənbələri kimi[74 - 76]. Etik narahatlıqlar, eləcə də immun supressiya zərurəti, ESC ilə bağlı tədqiqatlar/potensial müalicə yanaşmalarında ortaya çıxdı, bu sahədə aparılan tədqiqatlar əsasən iPSC vasitəçiliyi ilə aparılan yanaşmalara diqqət yetirir. Etik narahatlıqları aradan qaldırmaqla yanaşı, bu yanaşma həm də xəstəliyin modelləşdirilməsini, dərmanların hazırlanmasını və diabetin patogenezini dərk etməyi asanlaşdırır, yeni nəsil müalicə strategiyalarının inkişafına zəmin yaradır. Proqramlaşdırıla bilən nukleazlar (ZFNs, TALENs, CRISPR/Cas9) bizə pankreas beta hüceyrələrinin inkişafını, bərpasını, insulin istehsalını və ifrazat nümunələrini bütün aspektlərdə anlamağa kömək etdi.

CRISPR/Cas9 sistemi gen funksiyasında növə xas fərqləri aşkar etdi. Məsələn, McGrath və b[77] siçanlarda endokrin mədəaltı vəzinin formalaşması üçün vacib olan əsas spiral-loop-heliks transkripsiya faktoru olan Neurogenin3 (NEUROG3) çatışmazlığının insan endokrin mədəaltı vəzinin böyüməsinə mane olmadığını nümayiş etdirdi. NEUROG3 nokaut mutasiyalarını daşıyan hESC xətləri endokrin hüceyrələri deyil, endoderma və mədəaltı vəzi sələflərini səmərəli şəkildə formalaşdırdı. in vitro. Bundan əlavə, NEUROG3 ifadəsinin 75%-90% yıxılması vasitəsilə lentivirusun vasitəçiliyi ilə həyata keçirilən qısa saç tıxacının RNT yanaşması pankreas endokrin hüceyrəsinin inkişafını yalnız azaldıb, lakin onun qarşısını almayıb, beləliklə deməyə əsas verir ki, NEUROG3 insan endokrin pankreasın inkişafı üçün əsas olsa da, mədəaltı vəzi endokrin hüceyrələrinin formalaşması üçün çox az miqdarda kifayətdir.

STAT3-ün diabetik siçan modellərində [78] onları beta hüceyrələrinə yenidən proqramlaşdıraraq acinar hüceyrələrdə Neurog3-ün aktivləşdirilməsinə vasitəçilik etdiyi göstərilmişdir. Bundan əlavə, STAT3-də aktivləşdirici germline mutasiyaları bu yaxınlarda beta-hüceyrə autoimmuniteti ilə əlaqəli neonatal diabetes mellitusun səbəbi kimi bildirildi[79]. Yenidoğulmuşlarda şəkərli diabet və pankreas hipoplaziyası olan bir xəstədən əldə edilən iPSC-lərdən istifadə edərək pankreas inkişafı üzrə aktivləşdirici mutasiya, STAT3 K392R tədqiqi, STAT3 K392R mutasiyasının NEUROG3 ifadəsinin birbaşa induksiyası vasitəsilə vaxtından əvvəl endokrin differensasiyaya səbəb olduğunu göstərdi. Xoşbəxtlikdən, STAT3 mutasiyasını düzəltmək üçün CRISPR/Cas9 texnologiyasından istifadə edərək xəstəliyin fenotipi tamamilə dəyişdirildi.

TALEN-lərin və CRISPR/Cas sisteminin[80] istifadəsi ilə bu yaxınlarda insan PSC-lərində (hPSCs) (iCRISPR) səmərəli genom redaktə platforması yaradılmışdır. Bu yanaşma, pankreas inkişafının transkripsiya nəzarətini və daimi neonatal diabet mellitus ilə əlaqəli inkişaf qüsurlarını metodik manipulyasiya etmək üçün genom redaktəsinin və kök hüceyrə biologiyasının gücünü birləşdirdi[81]. Bu araşdırmada Zhu və b[82] CRISPR/Cas9 və TALEN-lərdən istifadə edərək hESC-lərdə beta hüceyrə inkişafında təsirli olan səkkiz transkripsiya faktorunu (PDX1, RFX6, PTF1A, GLIS3, MNX1, NGN3, HES1 və ARX) susdurdu. Bu mutasiyaların təsir etdiyi spesifik inkişaf mərhələlərini müəyyən etməklə yanaşı, bu yanaşma, pankreas sələflərinin sayına nəzarətdə RFX6-nın rolu, pankreas endokrin inkişafında PDX1-in əsas şərti və potensial olaraq fərqli rolu ilə bağlı xəstəlik mexanizmlərinə dair yeni anlayışları üzə çıxardı. İnsanlarda və siçanlarda NGN3. Proqramlaşdırıla bilən nükleazların tətbiqi diabetin müalicəsi üçün hPSC əsaslı beta hüceyrə əvəzedici müalicələrini inkişaf etdirərək pankreasın inkişafını tənzimləyən transkripsiya faktorlarının müəyyən edilməsinə imkan verdi. İnsan xəstəliklərinin çoxalması üçün eksperimental heyvan modellərinə ehtiyac olsa da, növlər arasındakı genetik və metabolik fərqlər bəzən insan xəstəliklərini düzgün şəkildə təqlid edə bilməməsinə səbəb ola bilər ki, bu da effektiv müalicənin inkişafına mane olur.

CRISPR/Cas9 sistemi həmçinin genom boyu assosiasiya tədqiqatlarından (GWAS) toplanan nəticələrin qiymətləndirilməsinə əhəmiyyətli dərəcədə töhfə verdi. GWAS tədqiqatlarında tək nukleotid polimorfizmləri, əlavələr, silinmələr və nüsxə sayı varyasyonlarını ehtiva edən 2-ci tip diabet (T2D) ilə əlaqəli çox sayda gen müəyyən edilsə də, xəstəliyin patofiziologiyası ilə məlumatın hər hansı mümkün istifadəsi arasında əlaqə yaradır. narkotik kəşf etmək çətin məsələdir[83 - 86]. CRISPR/Cas9, Zeng-dən istifadə etməklə və b[87] GWAS tədqiqatları ilə T2D üçün həssaslıq genləri kimi müəyyən edilmiş hESC-dən əldə edilən qlükozaya cavab verən hüceyrələrdə üç geni (CDKAL1, KCN111, KCNQ1) susdurdu və müşahidə etdi ki, bu genlərin susdurulması insulin+ əmələ gəlməsinə təsir göstərmir. hüceyrələri, beta-hüceyrə diferensiasiya potensialında heç bir dəyişiklik aşkar edilməmişdir. Bununla belə, insulin+ beta-hüceyrələri CDKAL1 gen ifadəsi olmadıqda qlükolipotoksikliyə qarşı yüksək həssas idi. Bu ilkin tədqiqatlar göstərdi ki, GWAS tərəfindən xəstəliklərin patogenezində mümkün rolları olan gen lokuslarının funksional xüsusiyyətləri CRISPR/Cas9 texnologiyasından istifadə etməklə daha yaxşı qiymətləndirilə bilər.

Təcrid olunmuş insan adacıqları diabet tədqiqatı üçün nadir və qiymətli materiallar olduğundan, hPSC-lər pankreas adacıq hüceyrə donorlarına yaxşı alternativdir. iPSCs yetkin somatik hüceyrələrdən yaradıla bilər vasitəsilə birbaşa yenidən proqramlaşdırma və beta-hüceyrə kimi insulin istehsal edən hüceyrələrə diferensiasiya olunur[88]. Baxmayaraq ki, bu hüceyrələrin qanda qlükoza konsentrasiyasındakı dəyişikliklərə cavab olaraq insulin ifraz edən IPC-lərə tam yetişməsi asanlıqla əldə edilə bilməz, bu yanaşma diabet kimi genetik xəstəliklərin inkişaf qüsurlarını modelləşdirmək üçün istifadə edilə bilər[68]. CRISPR/Cas9 texnologiyasının vasitəçiliyi ilə həyata keçirilən genomun redaktəsi spesifik genotiplərin təsirlərini araşdırmaq və diabetik sindromlara səbəb olan genetik dəyişiklikləri olan xəstəlik modellərini inkişaf etdirmək üçün güclü imkanlar təqdim edir və ehtimal ki, beta hüceyrə fiziologiyasının öyrənilməsi imkanlarını sürətlə artıra bilər[89].

Tip 1 diabet (T1D) çoxlu immun dözümlülük mexanizmlərinin pozulması səbəbindən pankreasın beta hüceyrələrinin otoimmün sistem tərəfindən məhv edilməsi nəticəsində yaranır[90]. İnsanlarda T1D, mövcudluğu diabet riskini iki-dörd dəfə artıran 22-ci tip protein tirozin fosfataz qeyri-reseptor tip 22 (PTPN22), PTPN22 R620W-nin allel variantı ilə güclü şəkildə əlaqələndirilir[91]. NOD siçanı insanlarla diabetlə əlaqəli bir çox genetik yolları paylaşan kortəbii T1D modeli olduğundan, NOD genomuna fare ortoloji PTPN R619W mutasiyasının tətbiqinin T1D-nin kortəbii inkişafını gücləndirəcəyi gözlənilirdi. CRISPR/Cas9-un mikroinyeksiyası və NOD təkhüceyrəli ziqotlara homoloji yönümlü təmir şablonu PTPN R619W mutasiyası olan siçanlarda insulin otoantikorlarının artması və T1D-nin daha erkən başlanğıcı və daha yüksək penetranlığı nümayiş etdirməsi ilə nəticələndi[92].

Leptin reseptoru (Lepr) enerji homeostazını, qida qəbulu və enerji sərfi arasında tarazlığı tənzimləyən yağ hüceyrəsinə xas hormon leptin (ob) üçün reseptor kimi fəaliyyət göstərir[93]. Lepr-qüsurlu siçanlar (db/db) hal-hazırda ağır piylənmə, hiperfagiya, polidipsiya və poliuriya nümayiş etdirən T2D-nin ən çox istifadə edilən siçan modelidir[94]. db/db siçanın siçovul ekvivalenti Lepr genində spontan autosomal mutasiyaya malik olan və qlükoza dözümsüzlüyünə, insulin müqavimətinə və xəstə piylənməyə gətirib çıxaran müqayisə edilə bilən hiperfagiyanın fenotipini nümayiş etdirən Zuker siçovuludur (fa/fa)[95] . Maraqlıdır ki, Zucker siçovulunda hiperqlikemiya yoxdur. Bunu həll etmək üçün CRISPR/Cas9 sistemindən istifadə edərək Lepr nokaut siçovulları yaradıldı[96]. Bu Lepr CRISPR/Cas9 nokaut siçovulları piylənmə və T2D üzrə biotibbi və farmakoloji tədqiqatlar üçün heyvan modellərini genişləndirən diabetlə əlaqəli bütün fenotipləri nümayiş etdirdi. Bundan əlavə, leptin reseptoru çatışmazlığı olan db/db siçan və Zucker siçovullarının heyvan modellərində davamlı hiperqlikemiya və qlükoza dözümsüzlüyünün gec görünüşü ilə bağlı müşahidə olunan bəzi problemlər CRISPR/Cas9 tərəfindən yaradılan Lepr nokaut siçovullarından istifadə etməklə aradan qaldırıldı.

Gəmirici modelləri diabetin öyrənilməsi üçün faydalı olsa da, metabolik cəhətdən insanlara daha yaxın olan heyvan modellərinin istifadəsi CRISPR/Cas9 sistemindən istifadə edərək insan xəstəliklərinin inkişafı və patogenezini anlamaq üçün daha effektiv üsuldur. Şəkərli diabet tədqiqatlarının insanlarla oxşar fiziologiya və metabolik yolları paylaşması səbəbindən donuzlardan model kimi istifadə edilməsinə baxmayaraq, diabet əlamətləri göstərən donuz modellərinin azlığı açıq bir maneədir. Bu məqsədlə Ço və b[97] ilk olaraq CRISPR/Cas9 sistemindən istifadə edərək somatik hüceyrələrdə insulin genini dəyişdirdi. Daha sonra dəyişdirilmiş insulin genini daşıyan somatik hüceyrə nüvəsinin ötürülməsi insulin (INS) nokaut fenotipi ilə donuz embrionlarının yaranması ilə nəticələndi. INS nokautlu donuz balaları hiperglisemiya və qlükozuriya ilə özünü göstərmiş, CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə yeni donuz modellərinin effektivliyini nümayiş etdirmişdir ki, bu da gəmiricilərlə müqayisədə dərman inkişafı və adacık transplantasiyası tədqiqatları üçün daha uyğun ola bilər.

Həmçinin, CRISPR/Cas9 sistemi insulin istehsalını kəsən mutasiyaların səbəb olduğu diabetes mellitusun bir neçə irsi formalarından hər hansı birinə istinad edərək, gəncliyin Yetkinlik Başlamış Diabeti (MODY) kimi monogen diabetin xəstəlik modellərini inkişaf etdirmək üçün effektiv bir yol ola bilər[98] . MODY-nin otosomal dominant xəstəlik olmasına baxmayaraq, xəstəliyin simptomlarını göstərmək üçün yalnız bir anormal gen tələb olunur, xəstəliyin şiddəti ikinci allelin olması ilə tənzimlənir. MODY 2 və MODY 3 ən çox yayılmış formalar olsa da, insulin genindəki mutasiyalar MODY10-a səbəb olur ki, bu da klinik simptomlardakı oxşarlıqlara görə tez-tez T2D ilə qarışdırılır[99]. Xəstəliyin gedişi yüngül olsa da, bu genetik pozğunluğu olan insanlar sonrakı illərdə insulin istifadəsinə ehtiyac duyurlar. Mövcud müalicə üsulları ilə müalicəsi mümkün olmayan bu cür tək gen pozğunluqları gen terapiyası ilə effektiv şəkildə müalicə edilə bilər. Burada lentivirus vasitəçiliyi ilə insulin gen terapiyası daha əvvəl T1D[72,100] üçün göstərildiyi kimi MODY10 müalicəsi üçün daimi həll ola bilər.

Streptozotosinin (STZ) səbəb olduğu eksperimental diabetik heyvan modellərində pankreas beta hüceyrə kütləsində müəyyən azalma əldə edilsə də, sağ qalan və insulini sintez etmək və ifraz etmək qabiliyyətinə malik olan beta hüceyrələri insulin gen terapiyası strategiyalarının sınaqdan keçirilməsinə mane ola bilər. İnsulin gen terapiya vektorlarının effektivliyini tam yoxlamaq üçün insulini sintez etməyən pankreasın beta hüceyrələrinə ehtiyac var. Bu hüceyrələr kommersiya baxımından mövcud olmadığı üçün CRISPR/Cas9 sistemi insulin sintezi olmadan mədəaltı vəzi beta hüceyrələrini yaratmaq üçün uyğun bir üsul təqdim edir. İnsulin geni, insulin genini hədəf alan xüsusi bələdçi RNT-lərdən istifadə etməklə CRISPR/Cas9 köməyi ilə DNT səviyyəsində susdurula bilər. Bu hüceyrələr insulin sintezi istisna olmaqla, bütün beta-hüceyrə xüsusiyyətlərinə sahib olacağı üçün hər ikisi üçün uyğun bir model olacaq ex vivoin vivo insulin gen transfer vektorlarının effektivliyinin sınaqdan keçirilməsi. Bu modeli yaratmaq üçün pankreas beta hüceyrələri CRISPR Cas9 zülalını, xüsusi bələdçi RNT-ni və insulin geninə homoloji bölgələri ehtiva edən HR plazmidini kodlayan susdurucu plazmidlə transfeksiya edilir (Şəkil 3). Bu strategiyada susdurucu plazmid insulin genində iki zəncirli qırılma yaradır, HR plazmidi isə uğurlu transformantları selektiv şəkildə təmizləmək üçün antibiotik müqaviməti geni və flüoresan zülal kodlayan gen verir.məs. RFP) DSB-nin baş verdiyi bölgədə uğurlu rekombinasiyanı təsdiqləmək üçün. Beləliklə, transfeksiyadan sonra flüoresan mikroskop altında vizual olaraq yoxlanıla bilən stabil floresan protein ifadəsi ilə pankreas beta-hüceyrə xətti yaradılır. Bu hüceyrələr, tərkibindəki stabil floresan zülal ifadəsinə görə axın sitometriyası ilə və ya köçürülmüş antibiotik müqavimət geni ilə antibiotik seçimi ilə təmizlənə bilər (Şəkil 3). Sonra məhdud seyreltmə üsulu ilə hüceyrələr klonlanır. Nəhayət, təkhüceyrəli koloniyaların insulin ifraz statusu insulin ELISA, western blot və ya immunositokimya üsulları ilə təsdiqlənə bilər. Təsdiq edildikdən sonra insulin geni çatdırıla bilər yerində gen terapiya vektorları ilə insulin ifrazının pankreas beta hüceyrələrinin INS nokautunun transduksiyasından sonra bərpa edilib-edilmədiyini müəyyən etmək üçün. Daha sonra insulin geninin çatdırılması ilə və ya olmayan CRISPR/Cas9 texnologiyası ilə yaradılan INS nokaut beta hüceyrələri STZ ilə induksiya olunmuş diabetik heyvanların böyrək kapsulunun altına köçürülə bilər (Şəkil 4). Bununla, insulin gen sintezində çatışmazlıq olan pankreas beta-hüceyrə xətti yaradıla bilər və bunun üçün istifadə edilə bilər. in vivo insulin gen terapiya vektorlarının effektivliyinin sınaqdan keçirilməsi.

Xülasə, CRISPR/Cas9 sistemi dizayn və tətbiq asanlığı, yüksək effektivlik və aşağı qiymətə malik genomun redaktəsi üçün çox güclü və çox yönlü platforma təmin edən unikal texnologiyadır[67]. Genetik mühəndislikdə oyun dəyişdirici kimi təsvir edilən CRISPR/Cas9 texnologiyasından istifadənin əsas məqsədlərindən biri dərman testi üçün uyğun modellər hazırlamaq və insan xəstəliklərinin inkişafının altında yatan molekulyar və fizioloji mexanizmləri anlamaqdır[18]. Uğurlu hüceyrə əsaslı CRISPR/Cas9-vasitəçili xəstəlik modellərinin yaradıldığı xəstəliklər arasında kistik fibroz, Bart sindromu, β-talassemiya, Duchenne əzələ distrofiyası və hemofiliya A [101 - 106] var. Tirozinemiya və ağciyər xərçəngi üçün siçan modelləri, əzələ distrofiyası üçün siçovul və primat modelləri də CRISPR/Cas9 texnologiyası ilə uğurla yaradılmışdır, daha çoxu üzərində işlənmiş və hazırlanacaq[107 - 110]. Əlavə bir yanaşma olaraq, bu nəşrdə təsvir olunduğu kimi, yeni in vivo diabet xəstəliyi modeli STZ ilə induksiya edilmiş diabetik heyvanların böyrək kapsulu altında CRISPR/Cas9 texnologiyası ilə yaradılmış INS nokautlu pankreas beta-hüceyrə xəttinin allogen ötürülməsi yolu ilə hazırlana bilər. İnsulin gen terapiyasının terapevtik effektivliyini müəyyən etmək üçün insulin çatışmazlığı olan pankreas beta hüceyrələri ilə eyni proseduru yalnız insulin geninin çatdırılmasından sonra təkrarlamaq lazımdır. Güclü CRISPR/Cas9 texnologiyasındakı mövcud irəliləyişlərlə, insan xəstəliklərinin daha yaxşı başa düşülməsini və müalicəsini təmin etmək üçün ən dəqiq, spesifik və proqnozlaşdırıcı xəstəlik modellərinin yaradılması və tətbiqi probleminin öhdəsindən gəlmək üçün daha yaxşı şans var.

Əlyazma mənbəyi: Dəvət olunmuş əlyazma

Peşəkar Cəmiyyətlərdə Müəllif Üzvlüyü: Amerika Gen və Hüceyrə Müalicəsi Cəmiyyəti və Avropa Gen və Hüceyrə Terapiyası Cəmiyyəti

İxtisas növü: Tibb, tədqiqat və eksperimental

Mənşə ölkə/bölgəsi: Türkiyə

Peer-review hesabatının elmi keyfiyyət təsnifatı

Rəyçi: Duan W, Kurniawan A S-Redaktor: Liu M L-Redaktor: A P-Redaktor: Xing YX


Xülasə

Sintetik biologiya sahəsi sürətlə inkişaf edir. O, tək hostlarda tək gen dəyişikliklərindən kənarda mürəkkəb sxemlərin məntiqi dizaynına və inteqrasiya olunmuş sintetik genomların inkişafına doğru irəliləyir. Getdikcə daha çox istifadə olunan dərin öyrənmədə son nailiyyətlər de novo proqnozlaşdırıla bilən təsirləri olan DNT komponentlərinin montajı da nizam-intizamda kömək edir. Hesablama sahəsindəki irəliləyişlərə baxmayaraq, bu sahə hələ də bakteriyalarda gen ifadəsini tənzimləmək və qiymətli birləşmələr yaratmaq üçün təbii və ya sintetik olsun, əvvəlcədən xarakterizə edilmiş DNT hissələrinin mövcudluğundan asılıdır. Bu icmalda biz 5′ tənzimləyici bölgələrin yaradılmasında istifadə olunan müxtəlif bakterial sintetik biologiya metodologiyalarını müzakirə edirik – promotorlar, tərcümə olunmamış bölgələr və kodlaşdırma ardıcıllığının 5′ sonu. Biz metodologiyaları ümumiləşdirir və onların hər bir funksional DNT komponenti üçün əhəmiyyətini müzakirə edirik və onların qüsurlarına və güclü tərəflərinə diqqət yetirməklə bakterial mühəndislikdə əldə edilmiş əsas nailiyyətləri vurğulayırıq. İntizamın yaxın gələcəkdə qarşılaşa biləcəyi məsələləri qeyd etməklə nəzərdən keçirməyi bitiririk.


Ən son REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. Patentləri:

Bu ərizə ABŞ patent ərizəsinin davamıdır. 19 sentyabr 2019-cu il tarixində təqdim edilmiş № 16/575,506, ABŞ patent ərizəsinin Ser. 13 oktyabr 2017-ci il tarixində təqdim edilmiş № 15/783,525, hazırda tərk edilmişdir və bu, ABŞ patent ərizəsinin Ser. № 14/919,300, 21 oktyabr 2015-ci il tarixdə verilmişdir, indi ABŞ Patenti. 23 oktyabr 2014-cü il tarixində təqdim edilmiş 62/067,774 nömrəli ABŞ Müvəqqəti Ərizəsinin prioritet üstünlüklərini tələb edən 9,816,110 nömrəli, bütün məzmunu buraya istinadla daxil edilmişdir.

ARDILIQ SİYAHISINA ARAYIŞ İLƏ BİRLİK

20 oktyabr 2015-ci ildə yaradılmış və EFS-Web vasitəsilə Birləşmiş Ştatlar Patent və Ticarət Nişanları İdarəsinə təqdim edilmiş 28 KB-lıq 32353_T0045US01_SequenceListing.txt adlı ASCII mətn faylındakı Ardıcıllıq Siyahısı buraya istinadla daxil edilmişdir.

FON İxtira sahəsi

İxtira eukaryotik hüceyrələrdə rekombinant zülalların sabit inteqrasiyasını və/yaxud ifadəsini təmin edir. Xüsusilə, ixtira eukaryotik hüceyrələrdə, xüsusən də Çin hamsterində zülalların ifadəsini yaxşılaşdırmaq üçün üsullar və kompozisiyalar daxildir (Cricetulus griseus) ifadəni gücləndirən nukleotid ardıcıllığından istifadə etməklə hüceyrə xətləri. İxtira rekombinasiya vasitəçiliyi ilə kaset mübadiləsini (RMCE) asanlaşdıran polinükleotidləri və dəyişdirilmiş hüceyrələri əhatə edir. İxtiranın üsulları dəyişdirilmiş hüceyrələr tərəfindən rekombinant zülalların gücləndirilmiş və sabit ifadəsini asanlaşdırmaq üçün Çin hamsterinin hüceyrə genomunda xüsusi xromosom lokuslarında ekzogen nuklein turşularını birləşdirir.

Əlaqədar Sənətin təsviri

Hüceyrə ifadə sistemləri tədqiqat və ya terapevtik istifadə üçün müəyyən bir zülalın istehsalı üçün etibarlı və səmərəli mənbə təmin etməyi hədəfləyir. Məməli hüceyrələrində rekombinant zülal ifadəsi, məsələn, məməlilərin ekspressiya sistemlərinin rekombinant zülalları müvafiq şəkildə post-translational modifikasiya etmək qabiliyyətinə görə terapevtik zülalların istehsalı üçün üstünlük verilən üsuldur.

Qısa inkubasiya müddətləri ilə yüksək səviyyəli rekombinant zülal əldə etmək üçün hər birində cis- və bəzi hallarda trans-tənzimləyici elementlərin müxtəlif kombinasiyalarını ehtiva edən zülalların ifadəsi üçün bir neçə hüceyrə sistemi mövcuddur. Çoxsaylı sistemlərin mövcudluğuna baxmayaraq, effektiv gen transferi və rekombinant zülalın ifadəsi üçün inteqrasiya olunmuş genin sabitliyi problemi hələ də mövcuddur. Çoxlu yerli genetik faktorlar təkcə maraq doğuran hədəf genin nə vaxt ifadə olunacağını deyil, həm də hüceyrənin funksional olaraq genin transkripsiyasını məhsuldar bir nəticəyə yönəldə biləcəyini və ya ifadənin hətta uzun müddət davam edib-etməyəcəyini müəyyən edəcək. Xromosom inteqrasiya yerləri, məs. Çin hamster yumurtalıq hüceyrəsinin (CHO) inteqrasiya yerləri və spesifik genlər daxilində və ya onlara bitişik olan lokusu idarə edən bölgələr texnikada xarakterizə edilmişdir (WO2012/138887A1 U, Q. et al., 2002). qan. 100:3077-3086). Beləliklə, hədəf tənzimləyici bölgələr adətən endogen zülalları kodlayan bölgədə müəyyən edilir. Bununla belə, hədəf transgenin uzunmüddətli ifadəsi üçün əsas məsələ hüceyrə xəttinin fenotipində dəyişikliklərin qarşısını almaq üçün hüceyrə genlərinin minimal pozulmasıdır.

Multispesifik antikorlarda olduğu kimi əlavə antikor zəncirləri kimi ifadə üçün əlavə genləri yerləşdirmək üçün sabit hüceyrə xətlərinin mühəndisliyi xüsusilə çətindir. İnteqrasiya edilmiş genlərin ifadə səviyyələrində geniş dəyişikliklər baş verə bilər. Əlavə genlərin inteqrasiyası yerli genetik mühit (yəni, mövqe effektləri) səbəbindən ifadədə daha çox dəyişkənliyə və qeyri-sabitliyə səbəb ola bilər. Müvafiq olaraq, sənətdə məməlilərin ifadə sistemlərinin təkmilləşdirilməsinə ehtiyac var.

QISA XÜLASƏ

Bir aspektdə ixtira lokusu daxilində xüsusi bir yerə inteqrasiya olunmuş ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığından ibarət hüceyrə təmin edir, burada lokusu SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO: 4 ilə ən azı 90% eyni olan nukleotid ardıcıllığından ibarətdir. Bəzi təcəssümlərdə lokus SEQ İD NO:1 ilə ən azı 90% eyni olan nukleotid ardıcıllığından ibarətdir. Bəzi təcəssümlərdə lokus SEQ ID NO:4 ilə ən azı 90% eyni olan nukleotid ardıcıllığından ibarətdir.

Digər aspektdə ixtira ikinci nuklein turşusu ardıcıllığı (məsələn, ixtira yeri) daxilində xüsusi bir yerə inteqrasiya olunmuş birinci nuklein turşusu ardıcıllığından ibarət polinükleotidi təmin edir. Bir təcəssümdə ikinci nuklein turşusu ardıcıllığı SEQ İD NO:1-in nukleotid ardıcıllığını ehtiva edir. Başqa bir təcəssümdə ikinci nuklein turşusu ardıcıllığı SEQ İD NO:4-ün nukleotid ardıcıllığını ehtiva edir.

Bir təcəssümdə ikinci nuklein turşusu ardıcıllığı SEQ İD NO:1-ə ən azı 90% nuklein turşusu eyniliyinə malik olan nukleotid ardıcıllığından seçilmiş ifadə gücləndirici ardıcıllıq və ya onun ifadə gücləndirici fraqmentidir. Bir təcəssümdə ikinci nuklein turşusu ardıcıllığı SEQ İD NO:4-ə ən azı 90% nuklein turşusu eyniliyinə malik olan nukleotid ardıcıllığından seçilmiş ifadə gücləndirici ardıcıllıq və ya onun ifadə gücləndirici fraqmentidir. Başqa bir təcəssümdə ifadə gücləndirici ardıcıllıq ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı ilə kodlanmış zülalın ifadəsini gücləndirməyə qadirdir. Başqa bir təcəssümdə ifadə gücləndirici ardıcıllıq ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı ilə kodlanmış zülalın ifadəsini, adətən, təsadüfi inteqrasiya ilə müşahidə edilən ifadə ilə müqayisədə ifadədə ən azı təxminən 1,5-ən azı 3 dəfə artırmağa qadirdir. genom.

Başqa bir təcəssümdə, ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO:4 daxilində istənilən mövqedə xüsusi bir yerə inteqrasiya olunur.

Bəzi təcəssümlərdə SEQ ID NO:1 daxilindəki mövqedə və ya SEQ ID NO:1 daxilindəki mövqeyə bitişik olan xüsusi sahə 10-4,000 100-3,900 200-3,800 300-3,700 nömrəli mövqeləri əhatə edən nukleotidlərdən ibarət qrupdan seçilir. 400-3,600 500-3,500 600-3,400 700-3,300 800-3,200 900-3,100 1,000-3,000 1,100-2,900 1,200-2,800 1,300-2,700 1,200-2,600 1,300-2,500 1,400-2,400 1,500-2,300 1,600-2,200 1,700-2100 1,800- 2050 1850-2050, 1,900-2040 1950-2,025, 1990-2021, 2002-2021 və SEQ ID NO:1-in 2,010-2,015. Müəyyən təcəssümlərdə SEQ ID NO:1 daxilindəki mövqedə və ya SEQ ID NO:1 daxilindəki mövqeyə bitişik olan xüsusi sahə 1990-1991, 1991-1992, 1992-1993-cü illəri əhatə edən mövqeləri əhatə edən nükleotidlərdən ibarət qrupdan seçilir, 1993-1994, 1995-1996, 1996-1997, 1997-1998, 1999-2000, 2001-2002, 2002-2003, 2003-2004, 2004-2002, 2004-2002, 2002, 2002, 2002- 2009, 2009-2010, 2010-2011, 2011-2012, 2012-2013, 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016, 2016-2017, 20102, 2012, 20102 və 20102- SEQ ID NO:1.

Başqa bir təcəssümdə SEQ ID NO:1 daxilindəki mövqedə və ya SEQ ID NO: daxilində mövqeyə bitişik olan xüsusi sahə 10-500 500-1.000 500-2.100 1.000-1.5001 nömrəli mövqeləri əhatə edən nukleotidlərdən ibarət qrupdan seçilir. -2,100 1,500-2,000 1,500-2,500 2,000-2,500 2,500-3,000 2,500-3,500 3,000-3,500 3,000-4,000 və 3,5000-dən ID:SEQ1. Müəyyən təcəssümlərdə, ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı yuxarıda təsvir edilən hər hansı bir və ya bir neçə xüsusi sahənin daxilində və ya yaxınlığında inteqrasiya olunur.

Başqa bir təcəssümdə, ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı yuxarıda təsvir edildiyi kimi ifadə gücləndirici ardıcıllıqla yerləşdirilmiş tanınma yerindən ibarətdir, bu şərtlə ki, ifadə gücləndirici ardıcıllıq ən azı təxminən 90% eyni, ən azı təxminən 91% eyni olan ardıcıllıqdan ibarətdir, ən azı təxminən 92% eyni, ən azı təxminən 93% eyni, ən azı təxminən 94% eyni, ən azı təxminən 95% eyni, ən azı təxminən 96% eyni, ən azı təxminən 97% eyni, ən azı təxminən 98% eyni və ya SEQ İD NO:1 və ya SEQ İD NO:4-ün ifadə gücləndirici ardıcıllığı ilə ən azı təxminən 99% eynidir, onun ifadə gücləndirici fraqmenti.

Bir təcəssümdə, ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı rekombinazın tanınması sahəsini ehtiva edir. Bəzi təcəssümlərdə ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı LoxP sahəsi, Lox511 sahəsi, Lox2272 sahəsi, Lox2372, Lox5171, Loxm2, Lox71, LoxFx66 a, və f-a-dan müstəqil olaraq seçilmiş ardıcıllığı özündə əks etdirən ən azı bir rekombinaz tanınma sahəsini əhatə edir. . Bir təcəssümdə rekombinazın tanınması sahəsi ifadə gücləndirici ardıcıllıqla inteqrasiya olunur. Başqa bir təcəssümdə rekombinazın tanınması sahəsi dərhal gen kasetinin 5′ ucunun terminal nukleotidinə 5′ istiqamətdə bitişik və ya genin 3′ ucunun terminal nukleotidinə 3′ istiqamətdə dərhal bitişikdir. kaset. Bəzi təcəssümlərdə ən azı bir rekombinazın tanınması sahəsi və gen kaseti ifadəni gücləndirən ardıcıllıqla inteqrasiya olunur.

Bir təcəssümdə ifadəni gücləndirən ardıcıllıq daxilində ən azı iki rekombinaz tanınma yeri mövcuddur. Başqa bir təcəssümdə əks oriyentasiyalı iki rekombinaz tanınma yeri ifadə gücləndirici ardıcıllıqla inteqrasiya edilmişdir. Başqa bir təcəssümdə, üç rekombinaz tanıma sahəsi ifadə gücləndirici ardıcıllıqla inteqrasiya edilmişdir.

Bir aspektdə, SEQ ID NO:1-in dizayn edilmiş ifadə gücləndirici ardıcıllığından və ya onun ifadə gücləndirici fraqmentindən ibarət təcrid olunmuş Çin hamster yumurtalığı (CHO) hüceyrəsi təmin edilir. Bir təcəssümdə SEQ İD NO:1 və ya SEQ İD NO:4-ün nukleotid ardıcıllığından və ya onun stabil variantından ibarət ifadə gücləndirici ardıcıllıq yuxarıda təsvir olunduğu kimi ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığını inteqrasiya etmək üçün hazırlanmışdır. Digər təcəssümlərdə ixtira SEQ İD NO: 1 və ya SEQ İD NO: 4 və ya onun stabil variantının ifadə gücləndirici ardıcıllığından ibarət lokusa daxil edilmiş ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığından ibarət təcrid olunmuş CHO hüceyrəsini təmin edir.

Bir təcəssümdə, CHO hüceyrəsi əlavə olaraq ifadə gücləndirici ardıcıllıqla ən azı bir rekombinazın tanınması ardıcıllığını ehtiva edir. Başqa bir təcəssümdə ən azı bir rekombinaz tanınma ardıcıllığı LoxP, Lox511, Lox2272, Lox2372, Lox5171, Loxm2, Lox71, Lox66 LoxFas və frt sahəsindən müstəqil olaraq seçilir. Başqa bir təcəssümdə, rekombinazın tanınma sahəsi dərhal gen kasetinin 5′ ucunun terminal nukleotidinə 5′ istiqamətdə bitişik və ya genin 3′ ucunun terminal nukleotidinə 3′ istiqamətdə dərhal bitişikdir. kaset. Bəzi təcəssümlərdə ən azı bir rekombinaz tanınma sahəsi və gen kaseti burada təsvir edilən CHO hüceyrə genomunun ifadə gücləndirici ardıcıllığı daxilində inteqrasiya olunur.

Başqa bir təcəssümdə, ən azı bir rekombinasiya tanınma yeri yuxarıda təsvir edildiyi kimi yerləşdirilir, gen kasetinin ən azı 90% eynilik, ən azı təxminən 91% eynilik, ən azı təxminən 92% eynilikdən ibarət ifadə gücləndirici ardıcıllığı ehtiva etdiyinə dair xəbərdarlıq edilir. , ən azı təxminən 93% şəxsiyyət, ən azı təxminən 94% şəxsiyyət, ən azı təxminən 95% şəxsiyyət, ən azı təxminən 96% şəxsiyyət, ən azı təxminən 97% şəxsiyyət, ən azı təxminən 98% şəxsiyyət və ya ən azı təxminən 99% şəxsiyyət SEQ İD NO:1-in (SEQ İD NO:2) 1001-2001 nukleotidlərinə və ya onun ifadə gücləndirici fraqmentinə. Başqa bir təcəssümdə, ən azı bir rekombinasiya tanınma sahəsi yuxarıda təsvir edildiyi kimi yerləşdirilir, gen kasetinin ən azı 90% eynilik, ən azı təxminən 91% eynilik, ən azı təxminən 92% eynilikdən ibarət ifadə gücləndirici ardıcıllığı ehtiva etdiyinə dair xəbərdarlıq edilir. , ən azı təxminən 93% şəxsiyyət, ən azı təxminən 94% şəxsiyyət, ən azı təxminən 95% şəxsiyyət, ən azı təxminən 96% şəxsiyyət, ən azı təxminən 97% şəxsiyyət, ən azı təxminən 98% şəxsiyyət və ya ən azı təxminən 99% şəxsiyyət SEQ İD NO:1-in (SEQ İD NO:3) 2022-3022 nukleotidlərinə və ya onun ifadə gücləndirici fraqmentinə.

Başqa bir təcəssümdə, ən azı bir rekombinaz tanınma sahəsi 1990-1991, 1991-1992, 1992-1993, 1993-1994, 1995-1991, 1995-1991, 1991-1991-ci illərdə və ya nukleotidlərdə CHO hüceyrə genomuna daxil edilmişdir. , 1999-2000, 2001-2002, 2002-2003, 2003-2004, 2004-2005, 2005-2006, 2006-2007, 2007-2008, 2008-20102, 2008-20102, 2001-2012, -2013, 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016, 2016-2017, 2017-2018, 2018-2019, 2019-2020, 2020-2021 və ya IDNO202: 2013-2014.

Başqa bir təcəssümdə ekzogen nuklein turşusu CHO genomuna 1990-1991, 1991-1992, 1992-1993, 1993-1994, 1995-1996, 1971-1919, 1971-19, 1992-19-19-cu illərdə və ya nukleotidlər daxilində daxil edilir. 2001-2002, 2002-2003, 2003-2004, 2004-2005, 2005-2006, 2006-2007, 2007-2008, 2008-2009, 2009-2009, 2009-2012, 2012, 2012, 2012, 2012 2014, 2014-2015, 2015-2016, 2016-2017, 2017-2018, 2018-2019, 2019-2020, 2020-2021 və ya 2021-2022 SEQ: NO1.

Başqa bir təcəssümdə ekzogen nuklein turşusu SEQ ID NO:1-in 2001-2022 nukleotidlərində və ya daxilində CHO genomuna daxil edilir. Bəzi təcəssümlərdə ekzogen nuklein turşusu SEQ ID NO:1-in 2001-2002 nukleotidlərinə və ya 2021-2022 nukleotidlərinə və ya onların içərisinə daxil edilir və daxiletmə nəticəsində SEQ ID NO:1-in 2002-2021 nukleotidləri silinir. Eynilə, ekzogen nuklein turşusu CHO genomuna SEQ ID NO:4-ün 9302-9321 nukleotidlərində və ya daxilində daxil edilir. Bəzi təcəssümlərdə ekzogen nuklein turşusu SEQ ID NO:4-ün 9301-9302 nukleotidlərinə və ya 9321-9322 nukleotidlərinə və ya onların içərisinə daxil edilir və daxiletmə nəticəsində SEQ ID NO:4-ün 9302-9321 nukleotidləri silinir.

Bəzi təcəssümlərdə, SEQ İD NO:1 və ya SEQ İD NO:4-ün nukleotid ardıcıllığı kimi lokus daxilində xüsusi bir yerə inteqrasiya olunmuş ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı maraq doğuran geni (GOI) (məsələn, nukleotid ardıcıllığı) ehtiva edir. maraq doğuran zülalın və ya “P”nin kodlanması). Müəyyən təcəssümlərdə, ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı maraq doğuran bir və ya bir neçə geni ehtiva edir. Bəzi təcəssümlərdə maraq doğuran bir və ya bir neçə gen birinci GOI, ikinci GOI və üçüncü GOI-dən ibarət qrupdan seçilir.

Bəzi təcəssümlərdə, SEQ İD NO:1 və ya SEQ İD NO:4-ün nukleotid ardıcıllığı kimi lokus daxilində xüsusi bir yerə inteqrasiya olunmuş ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı bir GOI və ən azı bir rekombinaz tanınma yerindən ibarətdir. Bir təcəssümdə birinci GOI SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO:4-ün ifadə gücləndirici ardıcıllığına və ya SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID-yə ən azı 90% nukleotid eyniliyinə malik ifadə gücləndirici ardıcıllığa daxil edilir. NO:4 və ya onun ifadə gücləndirici fraqmenti, yuxarıda təsvir edildiyi kimi və birinci GOI isteğe bağlı olaraq promotorla operativ şəkildə əlaqələndirilir, burada promotorla əlaqəli GOI (və ya GOI) birinci rekombinaz tanıma sahəsi və 3′ ikinci rekombinaz tanıma sahəsi ilə. Başqa bir təcəssümdə, ikinci GOI ikinci rekombinazın tanınması sahəsinin 3′-ə daxil edilir və ikinci GOI üçüncü rekombinazın tanınması sahəsi ilə 3′ civarındadır.

Başqa bir təcəssümdə GOI GOI ifadəsini hərəkətə gətirə bilən promotorla operativ şəkildə əlaqələndirilir, burada promotor aktivator və ya inhibitor tərəfindən tənzimlənə bilən eukaryotik promotordan ibarətdir. Digər təcəssümlərdə eukaryotik promotor prokaryotik operatorla operativ şəkildə əlaqələndirilir və eukaryotik hüceyrə əlavə olaraq prokaryotik repressor zülalını ehtiva edir.

Başqa bir təcəssümdə, bir və ya bir neçə seçilə bilən marker birinci və ikinci və/yaxud ikinci və üçüncü rekombinaz tanınma sahələri arasında daxil edilir. Bəzi təcəssümlərdə maraq doğuran birinci və/yaxud ikinci genlər və/yaxud bir və ya daha çox seçilə bilən markerlər promotorla operativ şəkildə əlaqələndirilir, burada promotor eyni və ya fərqli ola bilər. Başqa bir təcəssümdə promotor isteğe bağlı olaraq prokaryotik operator (məsələn, tet operatoru) tərəfindən idarə olunan eukaryotik promotordan (məsələn, CMV promotoru və ya SV40 gec promotorundan) ibarətdir. Digər təcəssümlərdə hüceyrə əlavə olaraq prokaryotik repressoru (məsələn, tet repressoru) kodlayan bir geni ehtiva edir.

Başqa bir təcəssümdə hüceyrə əlavə olaraq rekombinazı ifadə edə bilən bir gen ehtiva edir. Bəzi təcəssümlərdə rekombinaz Cre rekombinazdır.

Bir aspektdə, SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO:4-dən seçilmiş ifadə gücləndirici ardıcıllıqdan və ya SEQ ID NO:1-ə ən azı 90% nukleotid eyniliyinə malik ifadə gücləndirici ardıcıllıqdan ibarət CHO host hüceyrəsi təmin edilir. və ya SEQ İD NO:4 və ya onun ifadə gücləndirici fraqmenti, birinci rekombinazın tanınması yerindən, ardınca birinci eukaryotik promotordan, birinci seçilə bilən marker genindən, ikinci eukaryotik promotordan, ikinci seçilə bilən marker genindən və ikinci rekombinazın tanınmasından ibarət Sayt. Daha çox təcəssümdə CHO host hüceyrəsi əlavə olaraq üçüncü eukaryotik promotor, üçüncü marker geni və üçüncü rekombinaz tanıma sahəsi təmin edir. Bir təcəssümdə ifadə gücləndirici ardıcıllıq yuxarıda təsvir olunduğu kimi SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO:4 daxilindədir.

Bir təcəssümdə birinci, ikinci və üçüncü rekombinaz tanıma sahələri bir-birindən fərqlidir. Bəzi təcəssümlərdə rekombinaz tanınma sahələri LoxP saytı, Lox511 saytı, Lox2272 saytı, Lox2372, Lox5171, Loxm2, Lox71, Lox66, LoxFas və frt saytından seçilir.

Bir təcəssümdə ilk seçilə bilən marker geni dərmana qarşı müqavimət genidir. Başqa bir təcəssümdə, dərman müqaviməti geni neomisin müqavimət geni və ya bir higromisinə müqavimət genidir. Başqa bir təcəssümdə, ikinci və üçüncü seçilə bilən marker genləri iki müxtəlif flüoresan zülalları kodlayır.Bir təcəssümdə iki fərqli flüoresan zülal Discosoma mercan (DsRed), yaşıl flüoresan zülal (GFP), gücləndirilmiş yaşıl flüoresan zülal (eGFP), siyano flüoresan protein (CFP), gücləndirilmiş siyano flüoresan protein (eCFP) ibarət qrupdan seçilir. ), sarı flüoresan protein (YFP), gücləndirilmiş sarı flüoresan zülal (eYFP) və uzaq qırmızı flüoresan zülal (məsələn, mKate, mKate2, mPlum, mRaspberry və ya E2-crimson).

Bir təcəssümdə birinci, ikinci və üçüncü promouterlər eynidir. Başqa bir təcəssümdə birinci, ikinci və üçüncü promouterlər bir-birindən fərqlidir. Başqa bir təcəssümdə birinci promotor ikinci və üçüncü promotorlardan fərqlidir, ikinci və üçüncü promotorlar isə eynidir. Daha çox təcəssümlərdə birinci promotor SV40 gec promouterdir, ikinci və üçüncü promotorların hər biri insan CMV promouteridir. Digər təcəssümlərdə birinci və ikinci promotorlar prokaryotik operatorla operativ şəkildə əlaqələndirilir.

Bir təcəssümdə, ev sahibi hüceyrə xətti onun genomuna inteqrasiya olunmuş rekombinazanı kodlayan, promotorla operativ şəkildə əlaqəli ekzogen olaraq əlavə edilmiş genə malikdir. Başqa bir təcəssümdə rekombinaz Cre rekombinazdır. Başqa bir təcəssümdə, host hüceyrəsi onun genomuna inteqrasiya olunmuş, promotorla operativ şəkildə əlaqəli olan tənzimləyici zülalı kodlayan bir genə malikdir. Daha çox təcəssümlərdə tənzimləyici zülal tet repressor zülaldır.

Bir təcəssümdə, birinci GOI və ikinci GOI bir antikorun yüngül zəncirini və ya onun fraqmentini və ya ağır zəncirini və ya onun fraqmentini kodlaşdırır. Başqa bir təcəssümdə, birinci GOI antikorun yüngül zəncirini, ikinci GOI isə antikorun ağır zəncirini kodlayır.

Müəyyən təcəssümlərdə birinci, ikinci və üçüncü GOI birinci yüngül zəncirdən və ya onun fraqmentindən, ikinci yüngül zəncirdən və ya onun fraqmentindən və ağır zəncirdən və ya fraqmentindən ibarət qrupdan seçilmiş polipeptidi kodlayır. Başqa bir təcəssümdə birinci, ikinci və üçüncü GOI yüngül zəncirdən və ya onun fraqmentindən, birinci ağır zəncirdən və ya onun fraqmentindən və ikinci ağır zəncirdən və ya fraqmentindən ibarət qrupdan seçilmiş polipeptidi kodlayır.

Bir aspektdə maraq doğuran zülal hazırlamaq üçün metod təmin edilir, o cümlədən (a) CHO host hüceyrəsinə maraq geninin (GOI) daxil edilməsi, burada GOI ən azı 90 olan nukleotid ardıcıllığından ibarət spesifik lokusa inteqrasiya olunur. SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO:4 ilə eyni olan % (b) (a) hüceyrəsinin GOI ifadəsinə imkan verən şəraitdə kulturasiyası və (c) maraq doğuran zülalın bərpası. Bir təcəssümdə maraq doğuran zülal immunoqlobulinin alt bölməsindən və ya onun fraqmentindən və onun reseptorundan və ya liqand bağlayan fraqmentindən ibarət qrupdan seçilir. Müəyyən təcəssümlərdə maraq doğuran zülal antikor yüngül zəncirindən və ya onun antigen bağlayan fraqmentindən və antikor ağır zəncirindən və ya antigen bağlayan fraqmentindən ibarət qrupdan seçilir.

Bəzi təcəssümlərdə GOI rekombinaz vasitəçiliyi ilə kaset mübadiləsi (RMCE) üçün hədəf vektordan istifadə edərək hüceyrəyə daxil edilir və CHO host hüceyrə genomu xüsusi lokus daxilində ən azı bir ekzogen tanınma ardıcıllığından ibarətdir. Digər təcəssümlərdə CHO host hüceyrə genomu ən azı bir ekzogen tanınma ardıcıllığından və xüsusi lokus daxilində promotor, IRES və/və ya poliadenilləşmə (poliA) ardıcıllığı ilə isteğe bağlı olaraq bağlı seçilə bilən markerdən ibarətdir.

Müəyyən təcəssümlərdə CHO host hüceyrə genomu yuxarıda təsvir olunduğu kimi bir və ya daha çox rekombinaz tanınma yerindən ibarətdir və GOI rekombinazın tanınma sahəsini tanıyan rekombinazın hərəkəti ilə xüsusi lokusa daxil edilir.

Başqa bir təcəssümdə GOI homoloji rekombinasiya üçün hədəfləmə vektorundan istifadə edərək hüceyrəyə daxil edilir və burada hədəfləmə vektoru spesifik lokusda mövcud olan ardıcıllıqla homoloq olan 5′ homoloji qoldan, GOI və homolog 3′ homoloji qoldan ibarətdir. xüsusi lokusda mövcud olan ardıcıllığa. Başqa bir təcəssümdə hədəf vektor daha çox maraq doğuran iki, üç, dörd və ya beş və ya daha çox gendən ibarətdir. Başqa bir təcəssümdə maraq doğuran genlərdən biri və ya bir neçəsi promotorla operativ şəkildə əlaqələndirilir.

Başqa bir aspektdə, hədəf vektorunun SEQ İD NO:1 və ya SEQ İD NO:4 ilə ən azı 90% eyni olan nukleotid ardıcıllığından ibarət lokusda mövcud olan ardıcıllıqla homolog olan 5′ homoloji qoldan ibarət olduğu hədəfləmə vektoru təmin edilir. , GOI və SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO:4 ilə ən azı 90% eyni olan nukleotid ardıcıllığından ibarət lokusda mövcud olan ardıcıllıqla homoloq olan 3′ homologiya qolu. Başqa bir təcəssümdə hədəf vektor əlavə olaraq iki, üç, dörd və ya beş və ya daha çox maraq doğuran geni ehtiva edir.

Başqa bir aspektdə, ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığını inteqrasiya etmək üçün CHO hüceyrə genomunun modifikasiyası üçün bir üsul təmin edilir, bu, vektoru ehtiva edən bir vasitənin hüceyrəyə daxil edilməsi addımından ibarətdir, burada vektor ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığından ibarətdir. turşu SEQ İD NO: 1 və ya SEQ İD NO: 4 ilə ən azı 90% eyni olan nukleotid ardıcıllığından ibarət genomun lokusu daxilində inteqrasiya edir.

Bəzi təcəssümlərdə vektor SEQ İD NO: 1 və ya SEQ İD NO: 4, ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı ilə ən azı 90% eyni olan nukleotid ardıcıllığından ibarət genomun lokusunda mövcud olan ardıcıllıqla homolog olan 5′ homologiya qolundan ibarətdir. , və SEQ ID NO: 1 və ya SEQ ID NO: 4 ilə ən azı 90% eyni olan nukleotid ardıcıllığından ibarət genomun lokusunda mövcud olan ardıcıllıqla homoloji olan 3' homoloji qolu.

Bəzi təcəssümlərdə vektordakı ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı bir və ya bir neçə tanınma ardıcıllığından ibarətdir. Digər təcəssümlərdə ekzogen nuklein turşusu bir və ya bir neçə GOİ-dən ibarətdir, məsələn, seçilə bilən marker və ya POI-ni kodlayan nuklein turşusu. Digər təcəssümlərdə ekzogen nuklein turşusu bir və ya daha çox GOI və bir və ya bir neçə tanınma ardıcıllığını ehtiva edir.

Bir təcəssümdə nəqliyyat vasitəsi ən azı bir əlavə vektor və ya mRNT-dən ibarətdir. Başqa bir təcəssümdə əlavə vektor adenovirus, lentivirus, retrovirus, adeno ilə əlaqəli virus, inteqrasiya edən faq vektoru, qeyri-viral vektor, transpozon və/və ya transpozaza, inteqrasiya substratından ibarət qrupdan seçilir. , və plazmid. Bəzi təcəssümlərdə əlavə vektor ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığını inteqrasiya etmək üçün sahəyə məxsus nukleazanı kodlayan nukleotid ardıcıllığından ibarətdir.

Müəyyən təcəssümlərdə sahəyə xas nukleaza sink barmaq nükleazından (ZFN), ZFN dimerindən, transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor nukleazdan (TALEN), TAL effektor domeninin füzyon zülalından və ya RNT ilə idarə olunan DNT endonükleazından ibarətdir.

Başqa bir aspektdə, ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığını inteqrasiya etmək üçün CHO hüceyrə genomunun modifikasiyası üçün vasitə təmin edilir, burada nəqliyyat vasitəsi vektoru ehtiva edir, burada vektor genomun lokusunda mövcud olan ardıcıllıqla homolog olan 5' homoloji qoldan ibarətdir. SEQ ID NO: 1 və ya SEQ ID NO: 4 ilə ən azı 90% eyni olan nukleotid ardıcıllığı, ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı və ən azı bir nukleotid ardıcıllığından ibarət genomun lokusunda mövcud olan ardıcıllıqla homoloq olan 3′ homoloji qolu SEQ ID NO: 1 və ya SEQ ID NO: 4 ilə 90% eynidir.

Bəzi təcəssümlərdə ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı bir və ya bir neçə tanınma ardıcıllığını ehtiva edir. Digər təcəssümlərdə ekzogen nuklein turşusu bir və ya bir neçə GOİ-dən ibarətdir, məsələn, seçilə bilən marker və ya POI-ni kodlayan nuklein turşusu. Digər təcəssümlərdə ekzogen nuklein turşusu bir və ya daha çox GOI və bir və ya bir neçə tanınma ardıcıllığını ehtiva edir.

Başqa bir aspektdə, terapevtik agentin ifadəsi üçün ardıcıllığı ehtiva edən ekzogen nuklein turşusunun genomuna daxil edilməsi üçün vasitədən ibarət terapevtik agenti ifadə etmək üçün CHO hüceyrə genomunun modifikasiyası üçün bir üsul təmin edilir, burada vasitə 5-dən ibarətdir. SEQ İD NO:1-in nukleotid ardıcıllığında mövcud olan ardıcıllıqla homoloji homologiya qolu, terapevtik agenti kodlayan nuklein turşusu və SEQ İD NO:1 və ya SEQ-in nukleotid ardıcıllığında mövcud olan ardıcıllıqla homoloq olan 3′ homoloji qolu ID NO:4.

Daha bir aspektdə ixtira dəyişdirilmiş CHO genomundan ibarət dəyişdirilmiş CHO host hüceyrəsini təmin edir, burada CHO genomu SEQ ID NO ilə ən azı 90% eyni olan nukleotid ardıcıllığına malik genomun lokusu daxilində ekzogen tanınma ardıcıllığının daxil edilməsi ilə dəyişdirilir. : 1.

Digər aspektdə ixtira dəyişdirilmiş eukaryotik genomdan ibarət dəyişdirilmiş eukaryotik ana hüceyrə təmin edir ki, burada eukaryotik genom ekzogen nuklein turşusu daxil etmək üçün genomun kodlaşdırılmayan bölgəsindəki hədəf inteqrasiya yerində modifikasiya edilir. Bəzi təcəssümlərdə ekzogen nuklein turşusu tanınma ardıcıllığıdır. Digər təcəssümlərdə ev sahibi hüceyrə CHO hüceyrəsi kimi məməlilərin ana hüceyrəsidir. Digər təcəssümlərdə hədəf inteqrasiya sahəsi SEQ ID NO:1 kimi ifadə gücləndirici ardıcıllığı ehtiva edir, bir şərtlə ki, ardıcıllıq hər hansı endogen zülalları kodlamasın. İxtira həmçinin belə dəyişdirilmiş eukaryotik ana hüceyrənin hazırlanması üsullarını təqdim edir.

Yuxarıda təsvir edilən aspekt və təcəssümlərin hər hansı birində ifadə gücləndirici ardıcıllıq SEQ İD NO:1-də olduğu kimi göstərilən oriyentasiyada və ya SEQ ID NO:1 oriyentasiyasının tərsinə yerləşdirilə bilər.

İxtiranın hər hansı aspektləri və təcəssümü, kontekstdən başqa cür göstərilmədiyi və ya aydın olmadığı halda, ixtiranın hər hansı digər aspekti və ya təcəssümü ilə birlikdə istifadə edilə bilər.

Digər obyektlər və üstünlüklər sonrakı ətraflı təsvirin nəzərdən keçirilməsindən aydın olacaq.

ŞƏKİLLƏRİN QISA TƏSVİRİ

ŞEK. 1A və 1B. ŞEK. 1A: GOI ifadə edən nuklein turşusu molekulunun (məsələn, çox zəncirli antikor) və seçim markerinin çoxsaylı nüsxələrinin hüceyrə genomuna, məsələn, hədəfi müəyyən etmək üçün CHO genomuna təsadüfi daxil edilməsindən istifadə edən işlək quruluşun sxematik diaqramı yer. Nümunəvi konstruksiyaya daxildir: Ağır zəncir (HC) Birinci nüsxə seçim markeri, məsələn: hiqromisinə müqavimət geni (Hyg) Birinci nüsxə Yüngül Zəncir (LC) İkinci nüsxə seçim markeri (məsələn, Hyg), İkinci nüsxə Yüngül Zəncir (LC) Üçüncü nüsxə seçimi marker (məsələn, Hyg). ŞEK. 1B: SEQ ID NO:1 kimi müəyyən edilmiş yerli lokusda homoloji rekombinasiya yolu ilə inteqrasiya üçün nümunə donor vektoru. 5′ və 3′ homoloji qolları SEQ ID NO:1-dən götürülüb.

ŞEK. 2A-dan 2C-yə qədər olan SEQ ID NO: (LOCUS 1), maraq geninə (GOI) operativ şəkildə bağlı olan lokusun LOCUS 1 ilə operativ əlaqəsi olmayan eyni GOI ilə müqayisədə GOI-nin inkişaf etmiş mRNT ifadəsini nümayiş etdirdiyini göstərir. Nəzarət Lokusuna bağlıdır. ŞEK. 2A: Maraqlanan antikor genini kodlayan hüceyrələr üçün nümayiş etdirilən ekvivalent sayda gen nüsxələri, məsələn, İdarəetmə Lokusuna qarşı LOCUS 1 ilə operativ şəkildə əlaqəli bir ağır zəncir (HC) və iki yüngül zəncir (LC). 2B: LOCUS 1-də ifadə edilən GOI üçün mRNT səviyyələri Control Locus mRNA ilə müqayisədə daha yüksəkdir. ŞEK. 2C: LOCUS 1-də GOI ifadə edən hüceyrələr üçün zülal titri Nəzarət Lokusunda eyni GOI ifadə edən hüceyrələrdən istehsal olunan protein titri ilə müqayisədə 3 dəfə yüksəkdir.

ŞEK. 3A və 3B LOCUS 1-də inteqrasiya olunmuş flüoresan marker və GOI-dən (məsələn, eYFP və GOI ilə dəyişdiriləcək lox saytları ilə əhatə olunmuş mKate) ibarət kaset nümunəsini göstərir. marker, məsələn, dsRed2, lox saytları ilə əhatə olunmuşdur), burada belə inteqrasiya Cre rekombinaz və rekombinaz vasitəçiliyi ilə kaset mübadiləsini (RMCE) istifadə edir. Belə kasetlər GOI-nin rekombinasiya effektivliyini və transkripsiyasını ölçmək üçün təcrübələrdə istifadə edilmişdir.

ŞEK. Şəkil 4, LOCUS 1-də (SEQ ID NO:1) GOI ifadə edən CHO hüceyrə hovuzunda ölçülən maraq doğuran genin (GOI) daha yüksək mRNT səviyyəsini göstərir, eyni altında eyni GOI ifadə edən CHO hüceyrə hovuzundan olan mRNT ilə müqayisədə tənzimləmə şərtləri, lakin nəzarət lokusu daxilində inteqrasiya olunmuş, yəni EESYR.

ƏTRAFLI TƏSVİRİ

Mövcud metodlar təsvir edilməzdən əvvəl başa düşülməlidir ki, bu ixtira xüsusi metodlarla və təsvir edilən eksperimental şərtlərlə məhdudlaşmır, belə üsullar və şərtlər fərqli ola bilər. Həmçinin başa düşülməlidir ki, burada istifadə olunan terminologiya yalnız xüsusi təcəssümləri təsvir etmək məqsədi daşıyır və məhdudlaşdırıcı olmaq üçün nəzərdə tutulmur, çünki hazırkı ixtiranın əhatə dairəsi yalnız əlavə edilmiş tələblərlə məhdudlaşdırılacaqdır.

Bu spesifikasiyada və əlavə edilmiş iddialarda istifadə edildiyi kimi, “a”, “an” və “the” tək formaları, kontekst aydın şəkildə əksini diktə etmədiyi halda, cəm istinadları ehtiva edir. Beləliklə, məsələn, “metod”a istinad burada təsvir edilən və/yaxud bu açıqlamanı oxuduqdan sonra bu sahədə təcrübəli şəxslərə aydın olacaq bir və ya bir neçə metodu və/yaxud tipli addımları ehtiva edir.

Başqa cür müəyyən edilmədikdə və ya başqa cür qeyd edilmədikdə, burada istifadə edilən bütün texniki və elmi terminlər bu ixtiranın aid olduğu sənətdə adi bacarıqlara malik olan birinin ümumi başa düşdüyü eyni məna daşıyır.

Baxmayaraq ki, burada təsvir edilənlərə oxşar və ya ekvivalent olan hər hansı üsul və materiallar hazırkı ixtiranın təcrübəsində və ya sınaqlarında istifadə oluna bilər, indi xüsusi üsullar və materiallar təsvir edilmişdir. Burada qeyd olunan bütün nəşrlər bütövlükdə istinadla buraya daxil edilmişdir.

Təriflər

DNT bölgələri funksional olaraq bir-biri ilə əlaqəli olduqda operativ şəkildə əlaqələndirilir. Məsələn, promotor ardıcıllığın transkripsiyasında iştirak edə bilirsə, promotor kodlaşdırma ardıcıllığı ilə operativ şəkildə əlaqələndirilir, əgər o, tərcüməyə icazə vermək üçün yerləşdirilibsə, ribosom bağlayan yer kodlaşdırma ardıcıllığı ilə operativ şəkildə əlaqələndirilir. Ümumiyyətlə, operativ şəkildə əlaqəli olan bitişiklik daxil ola bilər, lakin tələb etmir. Sekretor liderlər kimi ardıcıllıq vəziyyətində, bitişiklik və oxu çərçivəsinə düzgün yerləşdirmə tipik xüsusiyyətlərdir. Maraq lokusunun ifadə gücləndirici ardıcıllığı funksional olaraq GOI ilə əlaqəli olduğu maraq geninə (GOI) operativ şəkildə bağlıdır, məsələn, onun mövcudluğu GOI-nin təkmilləşdirilmiş ifadəsi və/və ya sabit inteqrasiyası ilə nəticələnir.

Təkmilləşdirilmiş ifadəni təsvir etmək üçün istifadə edildikdə, "inkişaf etmiş" termini, adətən ekzogen ardıcıllığın genomda təsadüfi inteqrasiyası və ya inteqrasiya ilə müşahidə ediləndən daha çox ifadənin ən azı 1,5-dən ən azı 3 qat artırılmasını əhatə edir. məsələn, eyni ifadə konstruksiyasının tək nüsxəsinin təsadüfi inteqrantlar hovuzu ilə müqayisədə fərqli bir yer. İxtiranın ardıcıllığından istifadə etməklə müşahidə edilən bükülmə ifadəsinin gücləndirilməsi eyni genin ifadə səviyyəsi ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə eyni şəraitdə, ixtiranın ardıcıllığı olmadıqda, məsələn, başqa lokusda inteqrasiya ilə müqayisədə eyni növ genom. Təkmilləşdirilmiş rekombinasiya səmərəliliyinə lokusun rekombinasiya qabiliyyətinin artırılması daxildir (məsələn, rekombinaz tanıma sahələrinin istifadəsi). Təkmilləşdirmə, məsələn, rekombinazın tanınması sahələrini və ya oxşarlarını istifadə etmədən, adətən 0,1% olan təsadüfi rekombinasiya üzərində rekombinasiyanın səmərəliliyinə aiddir. Tercih edilən gücləndirilmiş rekombinasiya səmərəliliyi təsadüfidən təxminən 10 qat və ya təxminən 1% təşkil edir. Müəyyən edilmədikdə, iddia edilən ixtira xüsusi rekombinasiya səmərəliliyi ilə məhdudlaşmır.

“Ekzogen əlavə edilmiş gen” və ya “ekzogen əlavə edilmiş nuklein turşusu” ifadəsi maraq dairəsinə istinadla işlədildikdə, bu ifadə maraq ocağında mövcud olmayan hər hansı DNT ardıcıllığına və ya genə aiddir, çünki lokus təbiətdə yerləşir. Məsələn, CHO lokusu daxilində "ekzogen əlavə edilmiş gen" (məsələn, SEQ ID NO:1 ardıcıllığından ibarət olan lokus) təbiətdə xüsusi CHO lokusunda tapılmayan hamster geni ola bilər (yəni, hamster geni hamster genomunda başqa bir lokus), hər hansı digər növdən olan bir gen (məsələn, insan geni), kimerik gen (məsələn, insan/siçan) və ya təbiətdə CHO maraq dairəsində mövcud olmayan hər hansı digər gen.

SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO:4 və ya onun fraqmenti kimi maraq dairəsini təsvir edərkən faiz eyniliyi, bitişik homologiyanın bölgələri boyunca oxunan eyniliyi göstərən homoloji ardıcıllıqları ehtiva edir, lakin Müqayisə edilmiş ardıcıllıqda homoloqu olmayan boşluqlar, silinmələr və ya əlavələr faiz eyniliyinin hesablanması zamanı nəzərə alınmır.

Burada istifadə edildiyi kimi, məsələn, SEQ İD NO:1 və ya onun fraqmenti ilə növ homoloqu arasında “faiz eynilik” təyini, növ homoloqunun uyğunlaşmada müqayisə etmək üçün heç bir homoloji ardıcıllığa malik olmadığı ardıcıllıqların müqayisəsini daxil etməyəcəkdir (yəni , SEQ ID NO:1 və ya onun fraqmentində həmin nöqtədə daxiletmə var və ya növ homoloqunda vəziyyətə uyğun olaraq boşluq və ya silinmə var). Beləliklə, “faiz şəxsiyyəti” boşluqlar, silinmələr və əlavələr üçün cəzaları əhatə etmir.

Nuklein turşusu ardıcıllığı kontekstində "homoloji ardıcıllıq" istinad nuklein turşusu ardıcıllığına əhəmiyyətli dərəcədə homolog olan ardıcıllığa istinad edir. Bəzi təcəssümlərdə, ən azı 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% olduqda iki ardıcıllıq əhəmiyyətli dərəcədə homoloji hesab olunur. , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% və ya daha çox onların müvafiq nukleotidləri qalıqların müvafiq hissəsi üzərində eynidir. Bəzi təcəssümlərdə müvafiq uzanma tam (yəni tam) ardıcıllıqdır.

“Məqsədli daxiletmə” genin və ya nuklein turşusu ardıcıllığının genomda müəyyən bir yerə daxil edilməsi və ya inteqrasiyası, yəni DNT-ni bitişik polinükleotid zəncirindəki iki nukleotid arasında xüsusi bir yerə yönəltmək üçün istifadə olunan gen hədəfləmə üsullarına aiddir. Məqsədli daxiletmə çoxlu genləri, tənzimləyici elementləri və/və ya nuklein turşusu ardıcıllığını ehtiva edən xüsusi bir gen kaseti üçün də edilə bilər. "Daxiletmə" və "inteqrasiya" bir-birini əvəz edən mənada istifadə olunur. Anlaşılır ki, bir gen və ya nuklein turşusu ardıcıllığının daxil edilməsi (məsələn, ifadə kasetindən ibarət olan nuklein turşusu ardıcıllığı) gen redaktə texnikasından asılı olaraq bir və ya bir neçə nuklein turşusunun dəyişdirilməsi və ya silinməsi ilə nəticələnə bilər (və ya bunun üçün hazırlana bilər) istifadə olunur.

"Tanınma yeri" və ya "tanınma ardıcıllığı" DNT onurğasının sahəyə xas parçalanmasını bağlamaq və istiqamətləndirmək üçün nükleaz və ya digər ferment tərəfindən tanınan xüsusi DNT ardıcıllığıdır. Endonukleazlar DNT molekulunda DNT-ni parçalayır. Tanınma saytları sənətdə tanınma hədəf saytları kimi də xatırlanır.

“Rekombinazın tanınması sahəsi” Cre rekombinaz (Cre) və ya flippaz (flp) kimi rekombinaz tərəfindən tanınan xüsusi DNT ardıcıllığıdır. Sahəyə spesifik rekombinazlar, bir və ya bir neçə hədəf tanınma ardıcıllığı strateji olaraq orqanizmin genomuna yerləşdirildikdə, silmələr, inversiyalar və translokasiyalar daxil olmaqla, DNT-nin yenidən qurulmasını həyata keçirə bilər.Bir misalda Cre, 8-bp-lik boşluqla ayrılmış iki 13-bp ters çevrilmiş təkrardan ibarət olan loxP DNT hədəfinin tanınması sahəsində rekombinasiya hadisələrinə xüsusi vasitəçilik edir. Məsələn, DNT-nin rekombinasiya vasitəçiliyi ilə mübadiləsini asanlaşdırmaq üçün birdən çox rekombinaz tanıma sahəsi istifadə edilə bilər. Rekombinaz tanıma sahələrinin variantları və ya mutantları, məsələn, lox saytları da istifadə edilə bilər (Araki, N. et al, 2002)., Nuklein turşularının tədqiqatı, 30:19, e103).

“Rekombinaz vasitəçiliyi ilə kaset mübadiləsi” genomik hədəf kasetinin donor kasetlə dəqiq dəyişdirilməsi prosesinə aiddir. Bu prosesi yerinə yetirmək üçün adətən təmin edilən molekulyar kompozisiyalar daxildir: 1) xüsusi rekombinaza xas olan tanınma hədəf sahələri ilə həm 5′, həm də 3′ yan tərəfdə yerləşən genomik hədəf kaset, 2) tanınma hədəf sahələrinə uyğun gələn donor kaset və 3) sahəyə xas rekombinaz. Rekombinaz zülalları bu sahədə yaxşı tanınır (Turan, S. və Bode J., 2011. FASEB J., 25, s. 4088-4107) və DNT-nin müəyyən bir tanınma hədəfi (DNT ardıcıllığı) daxilində dəqiq parçalanmasına imkan verir. nukleotidlərin qazanılması və ya itirilməsi. Ümumi rekombinaz/sayt birləşmələrinə Cre/ox və Flp/frt daxildir, lakin bunlarla məhdudlaşmır.

“Nəqliyyat vasitəsi” hüceyrəyə daxil olmaq üçün ekzogen nuklein turşusu daşıyan hər hansı polinükleotiddən və ya polinükleotidlər dəstindən ibarət tərkibdir. Nəqliyyat vasitəsinə tanınmış transfeksiya üsulları ilə hüceyrəyə çatdırılan vektorlar, plazmidlər və mRNT molekulları daxildir. Bir misalda hüceyrələrə daxil edilən mRNT keçici ola bilər və genomla inteqrasiya olunmur, lakin mRNT inteqrasiya prosesinin baş verməsi üçün zəruri olan ekzogen nuklein turşusunu daşıya bilər.

ÜMUMİ TƏSVİRİ

İxtira ən azı qismən genomdakı digər bölgələrə və ya ardıcıllıqlara nisbətən daha səmərəli rekombinasiya, insert sabitliyi və daha yüksək səviyyəli ifadə nümayiş etdirən genomda unikal ardıcıllıqların, yəni lokusların kəşfinə əsaslanır. İxtira həm də ən azı qismən belə ifadə gücləndirici ardıcıllıqlar müəyyən edildikdə müvafiq gen və ya konstruktun ekzogen olaraq ardıcıllıqlara və ya onların yanına əlavə oluna biləcəyi və ekzogen yolla əlavə olunan genin daha da faydalı şəkildə ifadə oluna və ya istifadə oluna biləcəyi tapıntısına əsaslanır. genomik dəyişikliklər. İfadə gücləndirici ardıcıllıqlar adlanan belə ardıcıllıqlar sabit hesab olunur və genomun kodlaşdırma bölgəsində yerləşmir. Bu ifadə gücləndirici və sabitlik bölgələri gələcək klonlaşdırma və ya genomun redaktəsi hadisələri üçün hazırlana bilər. Beləliklə, hüceyrənin genomik onurğasına etibarlı bir ifadə sistemi qurulur.

İxtira həmçinin ekzogen genin inteqrasiya sahəsinə xüsusi hədəflənməsinə əsaslanır. İxtiranın üsulları, məsələn, rekombinaz vasitəçiliyi ilə kaset mübadiləsindən (RMCE) istifadə etməklə hüceyrə genomunun faydalı klonlama kasetinə səmərəli “çevrilməsinə” imkan verir. Bu məqsədlə, ixtiranın üsulları rekombinant zülal istehsalı üçün yüksək məhsuldar hüceyrə xətləri yaratmaq üçün maraq doğuran genlərin yerləşdirilməsi üçün hüceyrə genomunun rekombinaz tanınması yerlərindən istifadə edir.

İxtiranın kompozisiyaları həmçinin ifadə konstruksiyalarına, məsələn, yeni hüceyrə xətlərinin klonlanması və mühəndisliyi üçün ifadə vektorlarına daxil edilə bilər. İxtiranın polinükleotidlərindən ibarət ekspressiya vektorları zülalları keçici olaraq ifadə etmək üçün istifadə oluna bilər və ya təsadüfi və ya hədəflənmiş rekombinasiya yolu ilə genomlara inteqrasiya oluna bilər, məsələn, homoloji rekombinasiya və ya xüsusi rekombinasiya sahələrini tanıyan rekombinazların vasitəçiliyi ilə rekombinasiya (məsələn, Cre). -lox vasitəçiliyi ilə rekombinasiya). İxtiranın polinükleotidlərindən ibarət ifadə vektorları digər DNT ardıcıllıqlarının, məsələn, cis-təsirli tənzimləyici ardıcıllıqların effektivliyini qiymətləndirmək üçün də istifadə edilə bilər.

İnteqrasiya sahələri adətən ya təsadüfi inteqrasiya, ya da retrovirus inteqrasiya hadisələrinin təhlili ilə müəyyən edilir. Burada ətraflı təsvir edilən CHO inteqrasiya sahəsi çox zəncirli antikoru kodlayan DNT-nin təsadüfi inteqrasiyası ilə müəyyən edildi və ifadə edilmiş zülalın gücləndirilmiş ifadə nümayiş etdirdiyi aşkar edildi.

Bir ağır zəncirdən (HC) və yüngül zəncirin iki nüsxəsindən (LC) ibarət olan nümunə çox zəncirli antikor, alternativ hiqromisin müqavimət genlərini ehtiva edən ekspressiya kasetində təsadüfi olaraq genoma inteqrasiya edildi (bax, məsələn, ŞEKİL-də təsvir olunduğu kimi üç eyni Hyg geni 1A). Bir sabit və yüksək ifadəli klonu SEQ ID NO:1 kimi müəyyən edilmiş lokuslar daxilində ifadə kasetinin inteqrasiyası nəticəsində əldə edilmişdir.

CHO genomunun başqa bir bölgəsinə (nəzarət inteqrasiya sahəsi) inteqrasiya ilə müqayisədə çox zəncirli antikor nümunəsi SEQ ID NO:1 lokusuna inteqrasiya edildikdə daha yüksək ifadə səviyyələri nümayiş etdirir. Maraqlıdır ki, gen nüsxə nömrəsi SEQ ID NO: daxilində inteqrasiya olunmuş antikor ifadə edən polinükleotidlər üçün nəzarət inteqrasiya sahəsi ilə müqayisə edilə bilər, lakin SEQ ID NO:1 daxilində birləşdirilmiş antikor ifadə edən polinükleotidlər üçün protein titrləri 3 dəfə yüksəkdir.

Məqsədli rekombinasiya üsulları CHO hüceyrə genomunu rekombinaz tanınma yerlərini ehtiva edən klonlama konstruksiyasına çevirmək üçün istifadə edilmişdir (bax, məsələn, ŞEKİL 3A-B).

Əsasən, SEQ ID NO:1-in inteqrasiya sahəsinin müəyyən edilməsindən sonra rekombinaz tanınma sahələri (məsələn, lox saytları) seçilə bilən marker kimi ifadəli GOI-ni təşkil edən ifadə kasetlərinin tətbiqi üçün lokusda istifadə edilmişdir (bax, məsələn, ŞEKİL. 3A-B), məsələn, promotorlar, gücləndiricilər, markerlər, operatorlar, ribosomların bağlanma yerləri (məsələn, daxili ribosoma giriş yerləri) və s. kimi istənilən digər arzu olunan elementlərlə birlikdə.

SEQ ID NO:1 daxilində lox saytlarının məqsədyönlü inteqrasiyası üçün istifadə edilən donor konstruksiyasının nümunəsi ŞEKİL-də göstərilmişdir. 1B. Donor konstruksiya neomisin (neo) müqavimət geni və daxili ribosoma giriş yeri (IRES) tərəfindən idarə olunan ifadə kasetindən ibarətdir ki, burada kaset flüoresan markerdən (mKate) ibarətdir və rekombinazın tanınması ilə 5′ və 3′ uclarında yan tərəfdədir. saytlar və 5′ və 3′ homoloji qolları (SEQ ID NO:1 ilə homolog). SEQ ID NO: lokusuna daxiletmə göstərilir, burada daxiletmə donor neo/mKate konstruksiyasının hiqromisin müqavimət markerindən ibarət ifadə kasetini əvəz etməsi ilə nəticələnir, burada SEQ İD NO:1 lokusu daxilindəki ifadə kasetinin 5-də yan tərəfində yerləşir. ′ və 3′, 5′ və 3′ homoloji qollarına (SEQ ID NO:1-ə homolog) bağlı rekombinaz tanınma sahələri ilə bitir (bax. ŞEK. 1B).

Tərkiblər və üsullar nuklein turşusu ardıcıllığının eukaryotik hüceyrəyə stabil şəkildə inteqrasiyası üçün nəzərdə tutulmuşdur, burada nuklein turşusu ardıcıllığı SEQ İD NO:1 və ya onun ifadə gücləndirici fraqmentinə inteqrasiya olunduğu üçün ifadəni gücləndirmək qabiliyyətinə malikdir. GOI-dən maraq doğuran zülalın ifadəsinə nail olmaq üçün GOI daxil etmək üçün əlverişli olan SEQ ID NO:1 daxilində rekombinaz tanınma ardıcıllığını ehtiva edən hüceyrələr təmin edilir. Tərkiblər və üsullar həmçinin ifadə konstruksiyaları ilə, məsələn, ifadə vektorları ilə əlaqədar inteqrasiya sahələrini hədəfləmək və maraq doğuran CHO hüceyrəsinə ekzogen nuklein turşu(lar)ı əlavə etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur.

CHO İnteqrasiya Sahəsinin Fiziki və Funksional Xarakteristikası

SEQ İD NO:1-in nuklein turşusu ardıcıllığı (və SEQ İD NO:4-ün daha geniş nuklein turşusu ardıcıllığı) hüceyrə xəttinin nuklein turşusu konstruksiyasının (ifadə kasetindən ibarət) inteqrasiya sahəsinin yuxarı və aşağı axınındakı ardıcıllıqla empirik olaraq müəyyən edilmişdir. yüksək səviyyədə bir protein ifadə edir. İxtiranın nuklein turşusu ardıcıllığı nuklein turşusunun (məsələn, GOI-dən ibarət olan ekzogen nuklein turşusu) gücləndirilmiş ifadəsi və sabitliyi ilə əlaqəli yeni funksionallığı olan ardıcıllıqları təmin edir və heç bir nəzəriyyə ilə bağlı olmadan eyni və ya fərqli fəaliyyət göstərə bilər. Promotorlar, gücləndiricilər, lokusu idarə edən bölgələr, iskele əlavə bölgələri və ya matris əlavə bölgələri kimi cis-təsirli elementlər üçün əvvəllər təsvir edilənlərdən. SEQ ID NO:1-də heç bir açıq oxu çərçivəsi (ORF) olmadığı görünür, bu da lokusun yeni trans-aktivləşdirici zülalları kodlamasını çətinləşdirir. SEQ ID NO:4-ün genomik lokusu 3′ (aşağı axını) ilə ehtimal olunan sink barmaq zülalı müəyyən edilmişdir.

Birinci hiqromisin (Hyg) geni, birinci GOI, ikinci Hyg geni, ikinci GOI, üçüncü Hyg geni və üçüncü GOI kodlaşdırma ardıcıllığından ibarət ifadə kasetinin unikal sayt daxilində inteqrasiyası ilə bağlı ifadə gücləndirici fəaliyyət müəyyən edilmişdir. CHO genomik DNT-nin kodlaşdırılmayan bölgəsi. Məsələn, GOI ifadə edən ifadə kasetinə münasibətdə CHO genomik DNT-nin kodlaşdırılmayan bölgəsindən müəyyən edilmiş 5′ təcrid olunmuş 1 kb bölgə və 3′ təcrid olunmuş 1 kb bölgədən ibarət ifadə vektorları transfeksiya edilmiş CHO hüceyrələrinə təsir göstərə bilmişdir. onlarla rekombinant zülalların yüksək ifadə səviyyəsi.

İxtira əks yönümlü SEQ ID NO:1 fraqmentlərindən və ya SEQ ID NO:4 fraqmentlərindən ibarət ifadə vektorlarını əhatə edir. Burada təsvir edilən fraqmentlərin digər kombinasiyaları da hazırlana bilər. Burada təsvir edilmiş fraqmentlərin işlənib hazırlana bilən digər kombinasiyalarına misal olaraq burada açıqlanan ifadə gücləndirici ardıcıllıqların çoxsaylı nüsxələrini və ya açıqlanmış SEQ ID NO:1 fraqmentlərini və ya SEQ ID NO:4 fraqmentlərini birləşdirməklə əldə edilən ardıcıllıqları əhatə edir. tənzimləyici elementlərin optimal birləşməsinə nail olmaq üçün digər nukleotid ardıcıllığı. Bu cür kombinasiyalar SEQ İD NO:1 və ya SEQ İD NO:4 fraqmentləri arasında optimal məsafəni təmin etmək üçün (məsələn, fraqmentlər arasında spacer nukleotidlərin daxil edilməsi yolu ilə) bir-birinə bağlı ola və ya təşkil edilə bilər. Tənzimləyici elementlər, həmçinin SEQ ID NO:1 fraqmentinin tənzimləyici elementlərə nisbətən optimal məsafəni təmin etmək üçün təşkil edilə bilər.

Burada açıqlanan SEQ İD NO:1 və SEQ İD NO: 4 CHO hüceyrələrindən təcrid edilmişdir. Digər məməli növlərinin (məsələn, insanlar və ya siçanlar) müəyyən edilmiş ifadəni gücləndirən bölgə ilə məhdud homologiyası olduğu aşkar edilmişdir, lakin homoloji ardıcıllıqlar digər toxuma növlərindən əldə edilən hüceyrə xəttlərində tapıla bilər. Cricetulus griseus, və ya digər homoloji növlər və sənətdə yaxşı tanınan üsullarla təcrid oluna bilər. Məsələn, növlər arası hibridləşdirmə və ya PCR əsaslı üsullarla digər homoloji ardıcıllıqları müəyyən etmək olar. Bundan əlavə, SEQ İD NO: 1, SEQ İD NO: 4 və ya onun fraqmentlərində göstərilən nukleotid ardıcıllığında, sahəyə istiqamətlənmiş və ya təsadüfi mutagenez üsulları ilə texnikada yaxşı məlum olan dəyişikliklər edilə bilər. Nəticədə ardıcıllıq variantları daha sonra burada təsvir olunduğu kimi ifadəni gücləndirən fəaliyyət üçün sınaqdan keçirilə bilər. Nuklein turşusu eyniliyinə görə SEQ İD NO:1, SEQ İD NO: 4 və ya onların fraqmentləri ilə ən azı təxminən 90% eyni olan, ifadəni gücləndirən aktivliyə malik olan DNT-lər adi təcrübə ilə təcrid edilə bilər və ifadəni gücləndirən fəaliyyət göstərməsi gözlənilir. . SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO: 4 fraqmentləri üçün faiz eyniliyi SEQ ID NO:1 fraqmentində və ya SEQ ID NO: 4 fraqmentində olan istinad yerli ardıcıllığının həmin hissəsinə aiddir. Müvafiq olaraq, SEQ İD NO:1, SEQ İD NO: 4-ün homoloqları və ya onların fraqmentləri və onların variantları da ixtiranın təcəssümü ilə əhatə olunur.

Müəyyən təcəssümlərdə SEQ ID NO:1 fraqmenti 10-4,000 100-3,900 200-3,800 300-3,700 400-3,600 500-3,600, 500-60003,350 nömrəli mövqeləri əhatə edən nukleotidlərdən ibarət qrupdan seçilir. 1,400-2,400 1,500-2,300 1,600-2,200 1,700-2100 1,800-2050 1850-2050 900-3,100 1,000-3,000 1,100-2,900 1,200-2,800 1,300-2,700 1,200-2,600 1,300-2,500, 1,900-2040 1950-2,025, 1990-2021 , 2002-2021 və SEQ ID NO:1-in 2,010-2,015. Başqa bir təcəssümdə SEQ ID NO:1 fraqmenti 10-500 500-1,000 500-2,100 1,000-1,500 1,000-2,100 1,5000002,2,5000-2,500-2,5000-2,5000-2,5000-2,5000-2,5000-2,5000-2,5000-2,5000-2,5000-2,5000-2,5000-2,500-1,000 nömrəli mövqeləri əhatə edən nukleotidlərdən ibarət qrupdan seçilir. 2,500-3,500 3,000-3,500 3,000-4,000 və 3,500-4,000 SEQ ID NO:1. Müəyyən təcəssümlərdə, ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı yuxarıda təsvir edilən fraqment daxilində xüsusi yerlərdə və ya yaxınlığında birləşir.

Başqa bir təcəssümdə ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığı yuxarıda təsvir edildiyi kimi SEQ İD NO:1 və ya onun fraqmentləri daxilində və ya ən azı təxminən 90% eyni, ən azı təxminən 91% eyni, ən azı təxminən 92% eyni olan ardıcıllıqla yerləşdirilir. , ən azı təxminən 93% eyni, ən azı təxminən 94% eyni, ən azı təxminən 95% eyni, ən azı təxminən 96% eyni, ən azı təxminən 97% eyni, ən azı təxminən 98% eyni və ya ən azı təxminən 99% eynidir SEQ ID NO:1-in ifadə gücləndirici ardıcıllığına və ya onun ifadə gücləndirici fraqmentinə.

Maraqlanan zülalın yüksək səviyyələrini ifadə edən hüceyrə populyasiyaları burada göstərilən üsullardan istifadə etməklə inkişaf etdirilə bilər. Mütləq ifadə səviyyəsi, zülalın hüceyrə tərəfindən nə qədər səmərəli işlənməsindən asılı olaraq, xüsusi zülal ilə dəyişəcəkdir. İxtiranın ifadə gücləndirici ardıcıllığı daxilində birləşdirilmiş ekzogen ardıcıllıqla (lər) inkişaf etdirilmiş hüceyrə hovuzları zamanla sabitdir və əksər məqsədlər üçün sabit hüceyrə xətləri kimi qəbul edilə bilər. Rekombinasiya mərhələləri də ixtiranın hüceyrə xətlərinin inkişafı prosesində sonraya qədər gecikdirilə bilər.

CHO İfadəsini Artıran Lokus və Onun Fraqmentləri

İxtira ən azı təxminən 90% eyni, ən azı təxminən 91% eyni, ən azı təxminən 92% eyni, ən azı təxminən 93% eyni, ən azı təxminən 94% eyni olan nukleotid ardıcıllığının ifadə gücləndirici fraqmentini əhatə edir. ən azı təxminən 95% eyni, ən azı təxminən 96% eyni, ən azı təxminən 97% eyni, ən azı təxminən 98% eyni və ya SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO: 4-ün nukleotid ardıcıllığı ilə ən azı təxminən 99% eynidir 10-4,000 100-3,900 200-3,800 300-3,700 400-3,600 500-3,50090,300,30,30,30,30-30,30-30-30-30-30-30-30-30-30-3000-3000-300-300-30-30-30-30-30-30-3000-3000-300-300-300-30-30-30-30-30-30-3000-3000-300-300-30-30-30-30-30-30-30-3000-3000-300-300-300-30-3000-30-30-30-3900 nömrəli mövqeləri əhatə edən ixtiraya fraqmentdən ibarət vektorlar, o cümlədən keçici və ya stabil transfeksiya üçün daxildir. 1,400-2.400 1,500-2.300 1,600-2,200 1,700-2100 1,800-2050 1850-2050 -3.000 1,100-2,900 1,200-2,800 1,300-2,700 1,200-2.600 1,300-2.500, 1,900-2040 1950-2,025, 1990-2021, 2002-2021 və SEQ İD NO:1-in 2,010-2,015. İxtira, həmçinin, fraqmentin hüceyrə üçün ekzogen olduğu və hüceyrə genomuna inteqrasiya olunduğu belə bir fraqmentdən ibarət olan eukaryotik hüceyrəni və dərhal 5′ və ya dərhal daxilində olan ən azı bir rekombinaz tanınma sahəsinə malik belə bir fraqmentdən ibarət hüceyrələr daxildir. 3′ fraqmentə.

Bir təcəssümdə, SEQ ID NO:1-in ifadə gücləndirici fraqmenti SEQ ID NO:1 daxilində 10-500 500-1.000 500-2.100 1.000-1.500 1.000-2.1000-1.500-1000-2.100-2 nömrəli mövqeləri əhatə edən mövqedə yerləşir. 2,000-2,500 2,500-3,000 2,500-3,500 3,000-3,500 3,000-4,000 və ya 3,500-4,000 SEQ ID NO:1.

İnteqrasiya edilmiş polinükleotidin sabit inteqrasiyası və/yaxud təkmil transkripsiyası dəstəkləndikdə, nümunəvi yerlərə nisbətən yerləşdirmə yerinin (yəni inteqrasiya) dəqiq yeri vacib deyil. Əksinə, inteqrasiya sahəsi burada təsvir edildiyi kimi SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO:1 fraqmenti və ya SEQ ID NO: 4 və ya SEQ ID NO: 4 fraqmenti daxilində və ya ona bitişik olan istənilən mövqedə ola bilər. . Maraq lokusu daxilində və ya ona bitişik olan xüsusi xromosom yerinin sabit inteqrasiyanı və inteqrasiya olunmuş ekzogen genin səmərəli transkripsiyasını dəstəkləyib-dəstəkləməməsi sənətdə yaxşı məlum olan standart prosedurlara və ya burada nümunə verilmiş üsullara uyğun olaraq müəyyən edilə bilər.

Burada nəzərdən keçirilən inteqrasiya sahələri SEQ İD NO:1 və ya SEQ İD NO:4-ün nukleotid ardıcıllığından ibarət lokus daxilində və ya maraq dairəsinə yaxın ərazidə yerləşir, məsələn, təxminən 1 kb-dən az, 500 baza cütü (bp) ), 250 bp, 100 bp, 50 bp, 25 bp, 10 bp və ya SEQ ID NO:1-in xromosomal DNT-də yerləşməsinə görə yuxarı (5′) və ya aşağı axın (3′) ilə təxminən 5 bp-dən az. Hələ bəzi digər təcəssümlərdə, istifadə olunan inteqrasiya sahəsi SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO-nun yeri ilə bağlı təxminən 1000, 2500, 5000 və ya daha çox baza cütlərində yuxarıda (5′) və ya aşağı axında (3′) yerləşir: Xromosom DNT-də 4.

Sənətdə başa düşülür ki, xromosom DNT-nin səmərəli replikasiyası və transkripsiyası üçün iskele/matris əlavə bölgələri kimi böyük genomik bölgələrdən istifadə olunur. İskele/matris əlavə bölgəsi (S/MAR), həmçinin iskele-bağlama bölgəsi (SAR) və ya matrislə əlaqəli və ya matris əlavə bölgəsi (MAR) olaraq da bilinir, nüvə matrisinin bağlandığı eukaryotik genomik DNT bölgəsidir. Heç bir nəzəriyyə ilə bağlı olmadan, S/MAR-lar adətən kodlaşdırılmayan bölgələrə xəritə verir, verilmiş transkripsiya bölgəsini (məsələn, xromatin domeni) qonşularından ayırır, həmçinin transkripsiyaya imkan verən mexanizmlər və/yaxud amillərin bağlanması üçün platformalar təmin edir, DNT-lər və ya polimerazlar üçün tanınma yerləri kimi. Bəzi S/MAR-lar təxminən 14-20 kb uzunluğunda xarakterizə edilmişdir (Klar, et al. 2005)., Gen 364:79-89). Beləliklə, LOCUS 1-də (SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO:4 daxilində və ya yaxınlığında) genlərin inteqrasiyasının gücləndirilmiş ifadə təmin edəcəyi gözlənilir.

Sənətdə olanlar başa düşəcəklər ki, bir neçə element mövzu yerində yüksək transkripsiya fəaliyyəti üçün optimallaşdırıla bilər ki, bu da maraq zülalını kodlayan daxil edilmiş genin yüksək ifadəsi ilə nəticələnir. Nəzərə alınacaq elementlərə transkripsiyanı idarə etmək üçün güclü promotor, adekvat transkripsiya mexanizmləri və açıq və əlçatan konfiqurasiyaya malik DNT daxildir. Mövzu sahəsinə daxiletmə SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO:4 daxilində seçilmiş inteqrasiya sahəsini hədəf alaraq, sənətdə olan şəxsin bacarığı daxilində optimallaşdırıla bilər.

Bir təcəssümdə SEQ ID NO:1-in ifadə gücləndirici ardıcıllığı GOI ifadəsini gücləndirmək üçün istifadə olunur. ŞEK. Şəkil 2A, CHO hüceyrə genomunda (İdarəetmə Lokusunda) fərqli bir lokusda inteqrasiya olunmuş eyni GOI ilə müqayisədə SEQ ID NO:1 (LOCUS 1) ilə işlək şəkildə əlaqələndirilmiş GOI-nin nəticələrini göstərir (Control Locus), Hər bir hüceyrə xətti üçün ölçülən gen nüsxə nömrəsi ekvivalentdir, lakin təcrübələr göstərir ki, mRNT səviyyəsi və GOI ifadə edən hüceyrələrin zülal titri LOCUS 1 ilə operativ şəkildə əlaqəli GOI üçün 3 dəfə yüksəkdir.

Müxtəlif təcəssümlərdə GOI-nin ifadəsi GOI-ni SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO: 4 daxilində yerləşdirməklə gücləndirilə bilər. Müxtəlif təcəssümlərdə ifadənin təkmilləşdirilməsi ən azı təxminən 1,5-3 dəfə və ya daha çox olur.

Hədəf Lokusunun Genetik Modifikasiyası

Müəyyən bir yerdə (yəni hədəf lokusda) bir hüceyrə genomunun genetik mühəndisliyi üsulları bir neçə yolla əldə edilə bilər. Nuklein turşusu ardıcıllığını eukaryotik hüceyrəyə sabit şəkildə inteqrasiya etmək üçün genetik redaktə üsullarından istifadə edilmişdir, burada nuklein turşusu ardıcıllığı normal olaraq belə hüceyrələrdə tapılmayan ekzogen ardıcıllıqdır. Hüceyrə nəslinin mühəndis hüceyrə xəttinin eyni genotipik və fenotipik xüsusiyyətlərini paylaşmasını təmin etmək üçün klonal genişlənmə lazımdır.Bəzi nümunələrdə yerli hüceyrələr SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO: 4 daxilində ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığını inteqrasiya etmək üçün homoloji rekombinasiya texnikası ilə dəyişdirilir. Digər nümunələrdə SEQ daxilində ən azı bir rekombinaz tanınma ardıcıllığını ehtiva edən hüceyrələr təmin edilir. İD NO:1 və ya SEQ İD NO: 4 ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığını və ya maraq doğuran geni inteqrasiya etmək üçün əlverişlidir.

Bəzi nümunələrdə birinci rekombinaz tanınma ardıcıllığını və ikinci rekombinaz tanınma ardıcıllığını ehtiva edən hüceyrələr verilir ki, burada birinci və ikinci rekombinaz tanınma ardıcıllığının hər biri LoxP, Lox511, Lox5171, Lox2272, Lox27, Lox27, -FAS, Lox71, Lox66 və onların mutantları. Bu halda, rekombinaz vasitəçiliyi ilə kaset mübadiləsi (RMCE) istənildikdə, sahəyə xas rekombinaz Cre rekombinaz və ya onun törəməsidir. Digər nümunələrdə, birinci və ikinci rekombinaz tanınma ardıcıllığının hər biri FRT, F3, F5, FRT mutant-10, FRT mutant+10 və onların mutantlarından ibarət qrupdan seçilir və bu ssenaridə RCME istənildikdə, sahəyə məxsus rekombinaz Flp rekombinaz və ya onun törəməsidir. Başqa bir misalda sözügedən birinci və ikinci rekombinaz tanınma ardıcıllığının hər biri attB, attP və onların mutantlarından ibarət qrupdan seçilir və bu halda RMCE istənildikdə, sahəyə məxsus rekombinaz phiC31 inteqraza və ya onun törəməsidir. .

Bir aspektdə SEQ İD NO: 1 və ya SEQ İD NO: 4 daxilində nuklein turşusu ardıcıllığının və ya onun ifadəsini gücləndirən fraqmentinin stabil inteqrasiyası üçün üsullar və kompozisiyalar homoloji rekombinasiya yolu ilə həyata keçirilir. Nuklein turşusu molekulu, yəni. maraq doğuran gen və ya polinükleotid, homoloji rekombinasiya yolu ilə və ya inteqrasiya yerlərində ardıcıllığı xüsusi olaraq hədəf alan sahəyə xas nukleaza metodlarından istifadə etməklə hədəflənmiş lokusa (yəni SEQ ID NO:1) daxil edilə bilər. Homoloji rekombinasiya üçün homolog polinükleotid molekulları (yəni homolog qollar) düzülür və ardıcıllıqlarının bir hissəsini mübadilə edirlər. Bu mübadilə zamanı transgen homoloji genomik ardıcıllıqla əhatə olunarsa, transgen daxil edilə bilər. Bir misalda, inteqrasiya yerlərində rekombinaz tanınma sahəsi ana hüceyrə genomuna daxil edilə bilər.

Eukaryotik hüceyrələrdə homoloji rekombinasiya inteqrasiya yerində xromosom DNT-də fasilə yaratmaqla asanlaşdırıla bilər. Model sistemlər göstərmişdir ki, xromosom hədəf ardıcıllığı daxilində cüt zəncirli qırılma baş verərsə, gen hədəfləmə zamanı homoloji rekombinasiya tezliyi artır. Bu, müəyyən nükleazları xüsusi inteqrasiya sahəsinə yönəltməklə həyata keçirilə bilər. Hədəf lokusunda DNT ardıcıllığını tanıyan DNT-ni bağlayan zülallar sənətdə məlumdur. Homoloji rekombinasiyanı asanlaşdırmaq üçün gen hədəfləmə vektorları da istifadə olunur. Homoloji yönümlü təmir üçün gen hədəfləyən vektor olmadıqda, hüceyrələr tez-tez homoloji olmayan son birləşmə (NHEJ) ilə cüt zəncirli qırılmanı bağlayır, bu da parçalanma yerində çoxsaylı nukleotidin silinməsinə və ya daxil olmasına səbəb ola bilər. Daxiletmələr və ya silinmələr (InDels) baş verərsə, beləliklə, az sayda nukleotid qırılma yerində təsadüfi olaraq daxil edilir və ya silinir və bu InDels hədəf daxilində genin hər hansı açıq oxu çərçivəsini (ORF) dəyişdirə və ya poza bilər. yer. SEQ İD NO:1 (yaxud SEQ İD NO:4) kimi müəyyən edilən lokusun gen kodlaşdırma bölgəsi olmadığı başa düşülür. Beləliklə, bu lokusun daxil edilməsi və/və ya silinməsi ilə endogen gen transkripsiyasının heç bir pozulması nəzərdə tutulmur.

Homologiyaya yönəldilmiş təmir (və ya homoloji yönümlü rekombinasiya) (HDR) mövzu yerində genlərin daxil edilməsi və ya inteqrasiyası üçün xüsusilə faydalıdır. Donor konstruksiya burada təsvir olunduğu kimi SEQ İD NO:1 və ya SEQ İD NO:4-dən alınan homoloji qollardan ibarətdir.

Gen hədəfləyən vektor konstruksiyası və nukleaz seçimi bu ixtiranın aid olduğu sənətkarın bacarığı daxilindədir.

Bəzi nümunələrdə modul quruluşa malik olan və sink barmaqlarının fərdi domenlərini ehtiva edən sink barmaq nükleazları (ZFN) hədəf ardıcıllıqda xüsusi 3-nukleotid ardıcıllığını tanıyır (məsələn, məqsədli inteqrasiya yeri). Bəzi təcəssümlər bir çox hədəf ardıcıllığını hədəfləyən fərdi sink barmaq domenlərinin kombinasiyası ilə ZFN-lərdən istifadə edə bilər.

Transkripsiya aktivatoruna bənzər (TAL) effektor nukleazları (TALENs) həmçinin sayta məxsus genomun redaktəsi üçün istifadə edilə bilər. TAL effektor zülalının DNT-ni bağlayan sahəsi adətən FokI kimi məhdudlaşdırıcı nukleazın qeyri-spesifik parçalanma sahəsi ilə birlikdə istifadə olunur. Bəzi təcəssümlərdə TAL effektor zülalının DNT-ni bağlayan domenindən və məhdudlaşdırıcı nükleaz parçalanma domenindən ibarət füzyon zülalı ixtiranın lokusu daxilində hədəf ardıcıllıqla DNT-ni tanımaq və parçalamaq üçün istifadə olunur (Boch J et al., 2009). Elm 326:1509-1512).

RNT ilə idarə olunan endonükleazlar (RGENs) bakterial adaptiv immun mexanizmindən hazırlanmış proqramlaşdırıla bilən genom mühəndisliyi alətləridir. Bu sistemdə - çoxluqlu müntəzəm aralıqlı qısa palindromik təkrarlar (CRISPR)/CRISPR ilə əlaqəli (Cas) immun cavabı - Cas9 zülalı iki RNT ilə kompleksləşdikdə, biri hədəf seçimini istiqamətləndirən ardıcıllıqla spesifik endonükleaza əmələ gətirir. RGEN-lər komponentlərdən (Cas9 və tracrRNA) və hədəfə məxsus CRISPR RNT-dən (crRNA) ibarətdir. Həm DNT hədəfinin parçalanmasının effektivliyi, həm də parçalanma yerlərinin yeri hədəfin tanınması üçün əlavə tələb olan protospacer bitişik motivin (PAM) mövqeyinə görə dəyişir (Chen, H. et al, J. Biol. Kimya. Əlyazma M113.539726 kimi 14 mart 2014-cü ildə onlayn nəşr olundu).

SEQ ID NO:1-in xüsusi hədəfləmə lokusu üçün unikal ardıcıllıqların müəyyən edilməsi strategiyaları texnikada məlumdur, lakin bu ardıcıllığın bir çoxunun CHO genomuna uyğunlaşdırılması 16-17 baza cütü uyğunluğu ilə potensial hədəfdənkənar saytları aşkar edir. SEQ ID NO:5-də (SEQ ID NO: 1-in 1990-2001 nukleotidlərinə uyğundur) göstərilən ardıcıllıqla kodlanmış 20 bp Bələdçi RNT nümunəsi SEQ ID NO:1 və ya RNT-in idarəolunan CRISPR/Cas geninin redaktəsi üçün faydalıdır. SEQ ID NO:4. Kiçik idarə olunan RNT və trakrRNA (məs. SEQ ID NO:6) ifadəsini idarə edən promotordan ibarət plazmid, eləcə də promotorun nəzarəti altında uyğun Cas9 fermenti daşıyan plazmid donor vektoru ilə birgə transfeksiya edilə bilər ( Bu metodla məqsədyönlü inteqrasiyadan istifadə etmək üçün 5′ və 3′ homoloji qolları ilə əhatə olunmuş maraq genini daşıyan. Yuxarıda təsvir edilənlərə əlavə olaraq RNT molekullarının müxtəlif modifikasiyaları və variantları bu sahədə təcrübəli olanlar üçün aydındır və ixtiranın əhatə dairəsinə daxil olmaq nəzərdə tutulur.

Bəzi təcəssümlərdə, maraq doğuran geni və ya tanınma ardıcıllığını və ya gen kasetini kodlayan ardıcıllıqdan ibarət olan ekzogen nuklein turşusunun genomun daxil edilməsi üçün vasitə, vəziyyətə uyğun olaraq, ekzogen nuklein turşusunu daşıyan vektordan və bir və ya daha çox əlavə vektor və ya mRNT. Bir təcəssümdə, bir və ya daha çox əlavə vektor və ya mRNT sink barmaq nükleazı (ZFN), ZFN dimeri, transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor nukleazı (TALEN) daxil olmaqla, lakin bununla məhdudlaşmayaraq, sahəyə məxsus nukleazanı kodlayan nukleotid ardıcıllığından ibarətdir. , TAL effektor domeninin füzyon zülalı və RNT ilə idarə olunan DNT endonükleazı. Müəyyən təcəssümlərdə bir və ya bir neçə vektor və ya mRNT istiqamətləndirici RNT, trakrRNA və Cas fermentini kodlayan nukleotid ardıcıllığından ibarət birinci vektor və donor (ekzogen) nukleotid ardıcıllığından ibarət ikinci vektordan ibarətdir. Bu cür donor ardıcıllığı maraq doğuran geni kodlaşdıran nukleotid ardıcıllığını və ya tanınma ardıcıllığını və ya hədəf daxil edilməsi üçün nəzərdə tutulmuş bu ekzogen elementlərdən hər hansı birini özündə cəmləşdirən gen kasetini ehtiva edir. mRNT istifadə edildikdə, mRNT təcrübəli şəxsə məlum olan ümumi transfeksiya üsulları vasitəsilə hüceyrəyə transfeksiya edilə bilər və bir fermenti, məsələn, transpozaza və ya endonükleazı kodlaya bilər. Hüceyrələrə daxil edilən mRNT keçici ola bilər və genomla inteqrasiya etməsə də, mRNT inteqrasiyanın baş verməsi üçün zəruri və ya faydalı olan ekzogen nuklein turşusu daşıya bilər. Bəzi hallarda əlavə polinükleotidin uzunmüddətli yan təsirləri riskini aradan qaldırmaq üçün mRNT seçilir, burada GOI-nin istənilən inteqrasiyasına nail olmaq üçün yalnız qısamüddətli ifadə tələb olunur.

Təcrübəli sənətkarlar üçün homoloji rekombinasiyanın başqa üsulları da mövcuddur, məsələn, dəqiq DNT-ni bağlayan spesifikliklərə malik BuD-dən əldə edilən nukleazlar (BuDNs) (Stella, S. et al. Akta Krist. 2014, D70, 2042-2052). Dəqiq genom modifikasiyası üsulları hüceyrə fenotipinin pozulmasının qarşısını almaq üçün SEQ ID NO:1 daxilində unikal hədəf ardıcıllığı ilə uyğun gələn alətlər əsasında seçilir.

Gen Hedefleme Konstruksiyaları

Ev sahibinin genomuna inteqrasiya ediləcək polinükleotid ardıcıllığı, hüceyrə ifadə sistemlərinin yaradılması üçün tanınma ardıcıllığı kimi hər hansı sənaye baxımından faydalı DNT ardıcıllığı ola bilər. Ev sahibi genomuna inteqrasiya ediləcək polinükleotid ardıcıllığı burada təsvir olunduğu kimi hər hansı terapevtik və ya sənaye baxımından faydalı zülal və ya zülalları kodlaya bilər. Ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığını inteqrasiya etmək üçün hədəf lokusu daxilində hədəf ardıcıllığının müəyyən edilməsi bir sıra amillərdən asılıdır. İstifadə olunan homoloji rekombinasiya metodundan asılı olaraq, SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO: 4-ə homoloji olan ardıcıllıqları seçmək ustanın bacarığına uyğundur. İstifadə olunan sahəyə məxsus nukleaz vektorları əlavə komponentlər (ardıcıllıq kompozisiyaları) tələb edir. ) DNT parçalanması üçün nəzərdə tutulmuş xüsusi yeri tanıyan.

Beləliklə, bir gen hədəfləyən konstruksiya adətən ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığının maraq mərkəzinə məqsədyönlü inteqrasiyasını asanlaşdıran belə nukleotid ardıcıllıqlarını özündə birləşdirir. Bəzi təcəssümlərdə konstruksiya birinci homoloji qoldan və ikinci homolog qoldan ibarətdir. Digər təcəssümlərdə konstruksiya (məsələn, gen kaseti) SEQ İD NO:1 və ya SEQ İD NO:4-dən əldə edilən homoloji qollardan ibarətdir. Bəzi təcəssümlərdə homoloji qollar SEQ İD NO: 1 və ya SEQ İD NO: 4-də mövcud olan nukleotid ardıcıllığına homolog olan nukleotid ardıcıllığından ibarətdir. Xüsusi təcəssümlərdə konstruksiya SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 1-in 1001-2001 nukleotidlərinə uyğundur) nukleotid ardıcıllığına malik olan 5′ homologiya qolundan və SEQ ID-nin nukleotid ardıcıllığına malik 3′ homologiya qolundan ibarətdir. NO:3 (SEQ ID NO: 1-in 2022-2001 nukleotidlərinə uyğundur). Homoloji qollar, məsələn, birinci homoloji qol (həmçinin 5′ homoloji qolu adlanır) və ikinci homoloji qol (həmçinin 3′ homoloji qolu adlanır) lokus daxilində hədəflənmiş ardıcıllıqla homologdur. 5′-dən 3′-ə qədər olan homoloji qollar lokus daxilində ən azı 1 kb və ya ən azı təxminən 2 kb və ya ən azı təxminən 3 kb və ya ən azı təxminən 4 kb və ya ən azı bir bölgəni və ya hədəf ardıcıllığı genişləndirə bilər. 5 kb və ya ən azı 10 kb. Digər təcəssümlərdə, birinci və ikinci homoloji qol üçün seçilmiş hədəflənmiş ardıcıllığın nukleotidlərinin ümumi sayı ən azı 1 kb və ya ən azı təxminən 2 kb və ya ən azı təxminən 3 kb və ya ən azı təxminən 4 kb və ya ən azı 5 kb və ya ən azı 10 kb. Bəzi hallarda, 5′ homoloji qolu ilə 3′ homoloji qolu (hədəflənmiş ardıcıllıqla homolog) arasındakı məsafə ən azı 5 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 təşkil edir. bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp və ya ən azı 1 kb və ya ən azı 2 kb, və ya ən azı təxminən 3 kb və ya ən azı təxminən 4 kb və ya ən azı 5 kb və ya ən azı təxminən 10 kb. SEQ ID NO: 2 və SEQ ID NO: 3-ün 5′ və 3′ homoloji qolları kimi seçildiyi hallarda, iki homoloji qol arasındakı məsafə 20 nukleotid ola bilər (SEQ ID NO: 1-in 2002-2021 nukleotidlərinə uyğundur) və bu cür homoloji qollar SEQ ID NO: 1-dən ibarət lokus daxilində ekzogen nuklein turşusu ardıcıllığının inteqrasiyasına vasitəçilik edə bilər, məsələn, SEQ ID NO: 1-in 1990-2021 və ya 2002-2021 nukleotidləri daxilində və eyni vaxtda nukleot202020-in silinməsi SEQ ID NO: 1.

Digər təcəssümlərdə konstruksiya birinci homoloji qoldan və ikinci homolog qoldan ibarətdir ki, burada birləşmiş birinci və ikinci homolog qollar lokus daxilində endogen ardıcıllığı əvəz edən hədəflənmiş ardıcıllıqdan ibarətdir. Digər təcəssümlərdə, birinci və ikinci homoloji qollar lokus daxilində endogen ardıcıllıqla inteqrasiya edən və ya daxil olan hədəflənmiş ardıcıllıqdan ibarətdir.

Dəyişdirilmiş hüceyrə xətləri SEQ ID NO:1 daxilində bir yerdə bir və ya daha çox rekombinaz tanınma yerini birləşdirərək yaradılmışdır. Bu dəyişdirilmiş hüceyrə xətləri həmçinin maraq doğuran ifadə olunan genin mənfi və ya müsbət seçilməsi üçün əlavə ekzogen genləri də əhatə edə bilər.

İxtira hüceyrəyə bir və ya bir neçə nəqliyyat vasitəsinin daxil edilməsini əhatə edən CHO hüceyrə genomunun modifikasiyası üsullarını təmin edir, burada bir və ya bir neçə vasitə inteqrasiya üçün ardıcıllıqla, nukleotiddə mövcud olan ardıcıllıqla homoloq olan 5' homoloji qoldan ibarət ekzogen nuklein turşusundan ibarətdir. SEQ ID NO:1 ardıcıllığı və SEQ ID NO:1-in nukleotid ardıcıllığında mövcud olan ardıcıllıqla homoloq olan 3′ homoloji qolu. Bəzi təcəssümlərdə üsullar əlavə olaraq inteqrasiya yerində bir sahəyə xüsusi DNT parçalanması üçün nükleaz və kompozisiyalardan ibarət bir və ya bir neçə vasitə təmin edir.

Dəyişdirilmiş hüceyrə xətləri rekombinaz vasitəçiliyi ilə kaset mübadiləsi (RMCE) üçün rahat və sabit ifadə sistemləri kimi istifadə edilə bilər. Maraqlanan zülalı kodlayan nuklein turşusu ardıcıllığı, məsələn, RMCE prosesi vasitəsilə, ən azı bir rekombinaz tanıma sahəsinə malik olan, SEQ İD NO:1 və ya onun ifadə gücləndirici fraqmentindən ibarət dəyişdirilmiş hüceyrəyə rahat şəkildə inteqrasiya oluna bilər.

Rekombinant ifadə vektorları məməli, viral və ya həşərat genlərindən əldə edilən uyğun transkripsiya və/yaxud tərcümə tənzimləyici elementlə operativ şəkildə əlaqələndirilmiş, zülalı kodlayan sintetik və ya cDNA-dan əldə edilmiş DNT fraqmentlərindən ibarət ola bilər. Bu cür tənzimləyici elementlərə transkripsiya promotorları, gücləndiricilər, uyğun mRNT ribosomal bağlanma yerlərini kodlayan ardıcıllıqlar və aşağıda ətraflı təsvir olunduğu kimi transkripsiyanın və tərcümənin dayandırılmasına nəzarət edən ardıcıllıqlar daxildir. Məməlilərin ifadə vektorları həmçinin replikasiyanın mənşəyi kimi transkripsiya olunmamış elementləri, digər 5′ və ya 3′ yan transkripsiya edilməmiş ardıcıllıqları və 5′ və ya 3′ transkripsiya edilməmiş ardıcıllıqları, məsələn, birləşmə donoru və akseptor sahələrini əhatə edə bilər. Transfektantların tanınmasını asanlaşdırmaq üçün seçilə bilən marker geni də daxil edilə bilər.

Floresan markerlər, vəziyyətə uyğun olaraq uğurla daxil edilmiş və/və ya dəyişdirilmiş gen kasetlərinin tanınması üçün uyğun seçilə bilən marker genləridir. Discosoma mercan (DsRed), yaşıl flüoresan zülal (GFP), gücləndirilmiş yaşıl flüoresan zülalı (eGFP), siyano flüoresan protein (CFP), gücləndirilmiş siyano flüoresan zülalı da daxil olmaqla, lakin bununla məhdudlaşmayaraq, flüoresan markerlərin nümunələri sənətdə yaxşı tanınır. (eCFP), sarı floresan protein (YFP), gücləndirilmiş sarı flüoresan zülal (eYFP) və uzaq qırmızı flüoresan zülal (məsələn, mKate, mKate2, mPlum, mRaspberry və ya E2-crimson. Həmçinin baxın, məsələn, Nagai, T., et al. 2002 Təbiət Biotexnologiyası 20:87-90 Heim, R. et al. 23 fevral 1995-ci il Təbiət 373:663-664 və Strack, R. L. et al. 2009 Biokimya 48:8279-81.

Onurğalıların hüceyrələrini transfeksiya etmək üçün faydalı olan ifadə vektorlarında transkripsiya və tərcümə nəzarət ardıcıllığı viral mənbələr tərəfindən təmin edilə bilər. Məsələn, tez-tez istifadə olunan promotorlar və gücləndiricilər polioma, adenovirus 2, simian virus 40 (SV40) və insan sitomeqalovirusu (CMV) kimi viruslardan əldə edilir. Viral genomik promotorlar, nəzarət və/yaxud siqnal ardıcıllıqları, bu cür nəzarət ardıcıllıqları seçilmiş ana hüceyrə ilə uyğun gələrsə, ifadəni idarə etmək üçün istifadə edilə bilər. Rekombinant zülalın ifadə olunacağı hüceyrə növündən asılı olaraq qeyri-viral hüceyrə promotorları da istifadə edilə bilər (məsələn, β-qlobin və EF-1α promotorları).

SV40 viral genomundan əldə edilən DNT ardıcıllıqları, məsələn, SV40 mənşəyi, erkən və gec promotor, gücləndirici, splays və poliadenilləşmə yerləri heteroloji DNT ardıcıllığının ifadəsi üçün faydalı olan digər genetik elementləri təmin etmək üçün istifadə edilə bilər. Erkən və gec promotorlar xüsusilə faydalıdır, çünki hər ikisi SV40 virusundan, həmçinin replikasiyanın SV40 virus mənşəyini də özündə birləşdirən bir fraqment kimi asanlıqla əldə edilir (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Daha kiçik və ya daha böyük SV40 fraqmentləri də istifadə edilə bilər. Tipik olaraq, Hind III yerindən replikasiyanın SV40 mənşəyində yerləşən BglI sahəsinə doğru uzanan təxminən 250 bp ardıcıllığı daxil edilir.

Çoxsaylı transkriptlərin ifadəsi üçün istifadə edilən bisistronik ifadə vektorları əvvəllər təsvir edilmişdir (Kim S. K. və Wold B. J., Cell 42:129, 1985) və ixtiranın ifadəni gücləndirən ardıcıllığı ilə birlikdə istifadə edilə bilər, məsələn. SEQ İD NO:1 və ya onun fraqmenti. İfadə vektorlarının digər növləri də faydalı olacaq, məsələn, ABŞ Pat. 4,634,665 (Axel et al.) və ABŞ Patenti. № 4,656,134 (Ringold və başqaları).

Maraq zülalları

Eukaryotik hüceyrələrdə ifadə üçün uyğun olan hər hansı bir protein istifadə edilə bilər. Məsələn, maraq doğuran zülala, lakin bununla məhdudlaşmayaraq, antikor və ya onun antigen bağlayan fraqmenti, ximerik antikor və ya onun antigen bağlayan fraqmenti, ScFv və ya onun fraqmenti, Fc-füzyon zülalı və ya onun fraqmenti, böyümə faktoru və ya onun fraqmenti, sitokin və ya onun fraqmenti və ya hüceyrə səthi reseptorunun hüceyrədənkənar sahəsi və ya onun fraqmenti. Maraqlanan zülallar bir alt vahiddən ibarət sadə polipeptidlər və ya iki və ya daha çox alt bölmədən ibarət mürəkkəb multibunit zülalları ola bilər.

Host Hüceyrələr və Transfeksiya

İxtiranın üsullarında istifadə edilən ana hüceyrələr, məsələn, Çin hamsterinin yumurtalıq (CHO) hüceyrələri və siçan hüceyrələri də daxil olmaqla məməlilərin sahib hüceyrələridir. Üstünlük verilən təcəssümdə ixtira CHO hüceyrəsində ifadə gücləndirici ardıcıllığı kodlayan SEQ ID NO:1-in nuklein turşusu ardıcıllığı fraqmentini təqdim edir. İnteqrasiya saytı SEQ ID NO:1 və ya SEQ ID NO:1-in istənilən fraqmentində tapıla bilər. İnteqrasiya sahəsi, məsələn, SEQ ID NO:1 daxilində yerləşdirilmiş rekombinazın tanınması sahəsi və ya SEQ ID NO:1-in hər hansı fraqmenti ola bilər. Uyğun inteqrasiya saytının bir nümunəsi LoxP saytıdır. Uyğun inteqrasiya saytının başqa bir nümunəsi iki rekombinaz tanınma sahəsidir, məsələn, LoxP saytı, Lox511 saytı, Lox2272 saytı, Lox2372 saytı, Loxm2 saytı, Lox71 saytı, Lox66 saytı və Lox5171 saytı. Digər təcəssümlərdə inteqrasiya sahəsi 10-4000 100-3.900 200-3.800 300-3.700 400-6005 nömrəli mövqeləri əhatə edən nukleotidlərdən ibarət qrupdan seçilən ardıcıllıq daxilindəki mövqedə və ya ardıcıllıqla bir mövqedə yerləşir. 3.500 600-3,400 700-3,300 800-3,200 900-3,100 1,000-3,000 1,100-2,900 1,200-2,800 1,300-2,700 1,200-2,600 1,300-2,500 1,400-2,400 1,500-2,300 1,600-2,200 1,700-2100 1,800-2050 1850-2050, SEQ ID NO:1-in 1,900-2040 1950-2,025, 1990-2021, 2002-2021 və 2,010-2,015.Müəyyən təcəssümlərdə, SEQ ID NO:1 daxilindəki mövqedə və ya SEQ ID NO:1 daxilindəki mövqeyə bitişik olan inteqrasiya sahəsi 1990-1991, 1991-1992, 1992-1993-cü illəri əhatə edən mövqeləri əhatə edən nükleotidlərdən ibarət qrupdan seçilir, 1993-1994, 1995-1996, 1996-1997, 1997-1998, 1999-2000, 2001-2002, 2002-2003, 2003-2004, 2004-2002, 2004-2002, 2002, 2002, 2002- 2009, 2009-2010, 2010-2011, 2011-2012, 2012-2013, 2013-2014, 2014-2015, 2015-2016, 2016-2017, 20102, 2012, 20102 və 20102- SEQ ID NO:1.

İxtira ekspressiya vektoru və ya ixtiranın mRNT-si ilə transfeksiya edilmiş məməlilərin ana hüceyrəsini əhatə edir. Hər hansı məməli hüceyrəsi istifadə oluna bilsə də, konkret bir təcəssümdə ana hüceyrə CHO hüceyrəsidir.

Transfeksiya edilmiş ana hüceyrələrə ifadə vektorları və ya zülal və ya polipeptidi kodlayan ardıcıllığı təşkil edən mRNT molekulları ilə transfeksiya edilmiş hüceyrələr daxildir. İfadə edilmiş zülallar seçilmiş nuklein turşusu ardıcıllığından asılı olaraq mədəniyyət mühitinə ifraz oluna bilər, lakin hüceyrədə saxlanıla və ya hüceyrə membranına yerləşdirilə bilər. Rekombinant zülalları ifadə etmək üçün müxtəlif məməli hüceyrə mədəniyyət sistemlərindən istifadə edilə bilər. Xüsusi seçim və ya gücləndirmə sxemləri üçün hazırlanmış digər hüceyrə xətləri də SEQ ID NO:1 ilə ən azı 80% homologiyaya malik olan hədəf lokusunun müəyyən edilməsi şərti ilə burada təqdim edilən üsullar və kompozisiyalar üçün faydalı olacaq. Təcəssüm olunmuş hüceyrə xətti K1 ilə təyin olunmuş CHO hüceyrə xəttidir. Rekombinant zülalların yüksək həcmdə istehsalına nail olmaq üçün müvafiq halda ev sahibi hüceyrə xətti bioreaktor mühitinə əvvəlcədən uyğunlaşdırıla bilər.

Bir neçə transfeksiya protokolları sənətdə məlumdur və Kaufman (1988) Meth. Enzimologiya 185:537. Seçilmiş transfeksiya protokolu ana hüceyrə növündən və GOI-nin təbiətindən asılı olacaq və adi təcrübə əsasında seçilə bilər. İstənilən bu cür protokolun əsas tələbləri əvvəlcə maraq doğuran zülalı kodlayan DNT-ni uyğun ana hüceyrəyə daxil etmək, sonra isə heteroloji DNT-ni nisbətən sabit, ifadəli şəkildə birləşdirmiş host hüceyrələri müəyyən etmək və təcrid etməkdir. Ev sahibi hüceyrə genomuna və ya digər funksiyaya inteqrasiya üçün faydalı olan zülalları kodlayan mRNT molekulları keçici ola bilər və buna görə də zamanla məhdudlaşa bilər.

Transfeksiya protokolları, həmçinin polipeptidlərin və ya polinükleotid ardıcıllığının hüceyrələrə daxil edilməsi üçün protokollar fərqli ola bilər. Qeyri-məhdud transfeksiya üsullarına kimyəvi əsaslı transfeksiya üsulları daxildir, bunlara liposomların nanohissəcikləri kalsium fosfatının istifadəsi daxildir (Graham et al. (1973). Virusologiya 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc Natl Acad Sci ABŞ 74 (4): 1590-4 və Kriegler, M (1991). Transfer və ifadə: Laboratoriya Təlimatı. Nyu York: W. H. Freeman və Şirkət. s. 96-97) dendrimerlər və ya DEAE-dekstran və ya poyetilinimin kimi kationik polimerlər. Qeyri-kimyəvi üsullara elektroporasiya Sono-porasiya və optik transfeksiya daxildir. Hissəcik əsaslı transfeksiyaya gen silahının istifadəsi, maqnit yardımlı transfeksiya daxildir (Bertram, J. (2006)) Cari Əczaçılıq Biotexnologiyası 7, 277-28). Transfeksiya üçün virus üsullarından da istifadə edilə bilər. mRNA çatdırılmasına TransMessenger™ və TransIT®-dən istifadə edən üsullar daxildir (Bire et al. BMC Biotexnologiyası 2013, 13:75).

Heteroloji DNT-ni hüceyrəyə daxil etmək üçün çox istifadə edilən üsullardan biri, məsələn, Wigler və digərləri tərəfindən təsvir edildiyi kimi kalsium fosfat çöküntüsüdür. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, 1980). Bu üsulla ana hüceyrəyə daxil edilən DNT tez-tez yenidən qurulur və bu proseduru müstəqil genlərin kotransfeksiyası üçün faydalı edir.

Bakteriya protoplastlarının məməli hüceyrələri ilə polietilenlə induksiya olunmuş birləşməsi (Schaffner et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163) heteroloji DNT-ni təqdim etməyin başqa bir faydalı üsuludur. Protoplast birləşmə protokolları tez-tez məməlilərin ev sahibi hüceyrə genomuna inteqrasiya olunmuş plazmid DNT-nin çoxsaylı nüsxələrini verir və bu texnika seçim və gücləndirmə markerinin GOI ilə eyni plazmiddə olmasını tələb edir.

Elektroporasiya həmçinin DNT-ni birbaşa ana hüceyrənin sitoplazmasına daxil etmək üçün istifadə edilə bilər, məsələn, Potter və digərləri tərəfindən təsvir olunduğu kimi. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161, 1988) və ya Shigekawa et al. (BioTechniques 6:742, 1988). Protoplast birləşməsindən fərqli olaraq, elektroporasiya seçim markerinin və GOI-nin eyni plazmiddə olmasını tələb etmir.

Lipofektin™ Reagenti və Lipofektamin™ Reagenti (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) kimi heteroloji DNT-ni məməli hüceyrəsinə daxil etmək üçün faydalı olan digər reagentlər təsvir edilmişdir. Kommersiya baxımından mövcud olan bu reagentlərin hər ikisi lipid-nuklein turşusu komplekslərinin (və ya lipozomların) əmələ gəlməsi üçün istifadə olunur ki, bunlar mədəni hüceyrələrə tətbiq edildikdə, nuklein turşusunun hüceyrələrə udulmasını asanlaşdırır.

Bir təcəssümdə, bir və ya bir neçə polinukleotidin hüceyrəyə daxil edilməsi elektroporasiya, intrasitoplazmik inyeksiya, viral infeksiya, adenovirus, lentivirus, retrovirus, transfeksiya, lipid vasitəçiliyi ilə transfeksiya yolu ilə və ya vasitəçilik olunur. Nucleofection™ vasitəsilə.

GOI-ni gücləndirmək üçün bir üsul rekombinant zülalın ifadəsi üçün də arzuolunandır və adətən seçim markerinin istifadəsini nəzərdə tutur (Kaufman yuxarıda nəzərdən keçirilir). Sitotoksik dərmanlara qarşı müqavimət seçim markeri kimi ən çox istifadə edilən xüsusiyyətdir və ya dominant əlamətin (məsələn, ana hüceyrə tipindən asılı olmayaraq istifadə edilə bilər) və ya resessiv əlamətin (məsələn, xüsusi host hüceyrə tiplərində faydalı) nəticəsi ola bilər. hansı fəaliyyət üçün seçilməsindən asılı olmayaraq çatışmazlıqlar). Bir neçə gücləndirilə bilən marker ixtiranın ifadə vektorlarında istifadə üçün uyğundur (məsələn, Sambrook, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N Y, 1989 səh. 16.9-16.14-də təsvir edildiyi kimi).

Dərmana davamlı məməli hüceyrələrində genin gücləndirilməsi üçün faydalı seçilə bilən markerlər Kaufman, RJ, yuxarıdakı Cədvəl 1-də göstərilmişdir və bunlara DHFR-MTX müqaviməti, P-qlikoprotein və çoxlu dərman müqaviməti (MDR) daxildir - müxtəlif lipofilik sitotoksik agentlər (məsələn, adriamisin) , kolxisin, vinkristin) və adenozin deaminaza (ADA)-Xyl-A və ya adenozin və 2′-deoksikoformisin.

Digər dominant seçilə bilən markerlərə mikrobial yolla əldə edilən antibiotik müqavimət genləri, məsələn, neomisin, kanamisin və ya hiqromisin müqaviməti daxildir. Bununla belə, bu seçim markerlərinin gücləndirilə bilən olduğu göstərilməmişdir (Kaufman, R. J., yuxarıda,). Məməlilər üçün bir neçə uyğun seçim sistemi mövcuddur (Sambrook supra, səh. 16.9-16.15). İki dominant seçilə bilən markerdən istifadə edən birgə transfeksiya protokolları da təsvir edilmişdir (Okayama and Berg, Mol. Cell Biol 5:1136,1985).

Əvvəllər təsvir edilmiş və ya bu sahədə məlum olan faydalı tənzimləyici elementlər də məməlilərin hüceyrələrini transfeksiya etmək üçün istifadə edilən nuklein turşusu konstruksiyalarına daxil edilə bilər. Seçilmiş transfeksiya protokolu və orada istifadə üçün seçilmiş elementlər istifadə edilən ana hüceyrənin növündən asılı olacaq. Bu sahədə bacarıqlı olanlar çoxsaylı müxtəlif protokollar və host hüceyrələrdən xəbərdardırlar və istifadə olunan hüceyrə mədəniyyəti sisteminin tələblərinə əsasən, arzu olunan zülalın ifadəsi üçün uyğun sistemi seçə bilərlər.

İxtiranın digər xüsusiyyətləri ixtiranın təsviri üçün verilmiş və onu məhdudlaşdırmaq üçün nəzərdə tutulmayan nümunəvi təcəssümlərin aşağıdakı təsvirləri zamanı aydın olacaq.

Aşağıdakı misallar, burada təsvir edilən üsul və kompozisiyaların necə hazırlanması və istifadə ediləcəyi, ixtiranın əhatə dairəsini məhdudlaşdırmaq üçün nəzərdə tutulmamaqla, bu sahədə adi bacarıqlara malik olanlara təqdim edilir. İstifadə olunan rəqəmlərlə (məsələn, miqdar, temperatur və s.) dəqiqliyi təmin etmək üçün səylər göstərilmişdir, lakin bəzi eksperimental xəta və sapma nəzərə alınmalıdır. Başqa cür göstərilməyibsə, hissələr çəkiyə görə hissələrdir, molekulyar çəki orta molekulyar çəkidir, temperatur Santigrad dərəcədir və təzyiq atmosferdə və ya ona yaxındır.

Nümunə 1. Maraq Lokusunun Müəyyənləşdirilməsi və İnteqrasiya Sahələrinin Xarakteristikası

CHO K1 hüceyrələri seçilə bilən markerlər kimi antikor ardıcıllığı və seçilə bilən antibiotik müqavimət genləri olan iki plazmidlə transfeksiya edildi. Stabil transfektantların seçilməsi antibiotiklərin iştirakı ilə hüceyrələrin genişləndirilməsi ilə həyata keçirilmişdir. Yüksək səviyyədə antikorları ifadə edən fərdi hüceyrə klonları FASTR® çeşidləmə texnologiyası ilə təcrid edilmişdir (bax. ABŞ Patenti No. 8,673,589B2). Ən yüksək antikor ifadə səviyyələrini nümayiş etdirən bir neçə klon müəyyən edilmişdir.

Bu klonlardan genomik DNT Covaris Adaptive Focused Acoustics (AFA)™ texnologiyası ilə parçalanmışdır (Fisher, S. et al. 2011)., Genom Biologiyası 12:R1). DNT kitabxanaları yaradıldı (Agilent SureSelectXT #G9612A) və CHO hüceyrələrinə daxil edilmiş bütün plazmid ardıcıllığına qarşı hazırlanmış xüsusi hazırlanmış biotinilləşdirilmiş RNT yemləri (Agilent SureSelectXT #5190-4811) ilə inkubasiya edildi. Plazmid ardıcıllıqlarını ehtiva edən genomik DNT fraqmentləri maqnit Streptavidin muncuqları ilə zənginləşdirilmiş və plazmid inteqrasiya sahələrini müəyyən etmək üçün Illumina MiSeq ardıcıllığına məruz qalmışdır. Həm plazmid ardıcıllığını, həm də CHO genom ardıcıllığını ehtiva edən füzyon ardıcıllığı təhlil edildi və CHO genomuna uyğunlaşdırıldı. Tək inteqrasiya sahəsi Southern blot analizi və PCR, sonra ardıcıllıqla təsdiqləndi. SEQ ID NO:1-in nukleotid ardıcıllığına malik inteqrasiya sahəsi ifadə qaynar nöqtəsi kimi müəyyən edilmişdir (həmçinin bax GenBank Locus ID No. AFTD01150902.1, nt35529:39558). Hüceyrə xətlərinin gələcək nəsli üçün uyğunluğunu müəyyən etmək üçün inteqrasiya sahələri təhlil edilmişdir. İnteqrasiya yerlərinin hüceyrənin normal genomik mexanizmlərini pozmayan kodlaşdırılmayan bölgədə yerləşməsi arzu edilirdi, məs. zülalların tərcüməsi və ya hüceyrənin fenotipini dəyişdirir.

Blat axtarışından (Kent W J., BLAT—BLAST kimi hizalama aləti. Genom Res. 2002 Aprel 12(4):656-64) uyğunlaşdırma, SEQ ID NO:1 siçan və insan genomu ardıcıllığı ilə çox aşağı homologiyanı paylaşır. SEQ ID NO:1-in CHO-1[ATCC]_refseq_transcript-ə qarşı ardıcıl partlayışı müəyyən etdi ki, müəyyən edilmiş lokus ardıcıllığında hər hansı məlum genlər üçün kodlaşdırma bölgələri yoxdur. SEQ İD NO:1-i əhatə edən daha geniş SED İD NO:4 ardıcıllığı da məqsədyönlü inteqrasiya üçün uyğun yer kimi müəyyən edilmişdir.

İnteqrasiya sahəsinin ardıcıllığının CHO və siçan genomlarının kodlaşdırılmayan bölgələrində yerləşdiyi müəyyən edildi və daha sonra aşağıda təsvir edilən təcrübələrdə istifadə edildi.

Nümunə 2. Host Hüceyrə İnteqrasiya Sahələrinə Səmərəli şəkildə daxil edilmiş ekzogen DNT

SEQ ID NO:1 kimi müəyyən edilmiş CHO genomunun spesifik lokusuna ekzogen genlərin məqsədli şəkildə daxil edilməsi TALE nukleazından (TALEN) istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. Nümunə 1-də olduğu kimi, təsadüfi olaraq hüceyrə genomuna inteqrasiya olunmuş antikor ağır və yüngül zəncir ardıcıllığını ehtiva edən konstruksiya TALEN tərəfindən hədəfə alınıb. TALEN antikor ifadə konstruksiyasının üç eyni Hyg geni daxilindəki yerlərə yönəldilmişdir (bax ŞEK. 1A). Hyg ardıcıllığı üçün TALEN hədəf parçalanma sahəsi ZiFit.partners.org (ZiFit Targeter Version 4.2) əsasında hazırlanmışdır. TALEN-lər məlum metodlar əsasında hazırlanmışdır (Boch J et al., 2009 Science 326:1509-1512).

Donor mKate vektoru (bax ŞEK. 1B) və TALEN-kodlaşdırma vektoru standart Lipofektin protokolundan (LIPOFECTAMINE, Life Technologies, Gaithersburg, Md.) istifadə edərək CHO host hüceyrələrinə köçürüldü. Hüceyrələr becərildi və arzu olunan xüsusiyyətlərə malik stabil klonlar təcrid olundu və FACS ilə çeşidləndi. İstənilən lokusda vahid inteqrasiya Southern blot və PCR ilə təsdiqləndi.

Nümunə 3. RMCE tərəfindən Maraq Lokusunda Mühəndislik Hüceyrələrinin Məqsədli Rekombinasiyası

Yüksək səviyyələrdə floresan geni ifadə edən CHO hüceyrə xətti, məs. mKate, burada genin maraq lokusu daxilində lox saytları ilə əhatə olunduğu, təcrid üçün seçilmişdir. İkinci floresan geni, dsRed-i ifadə edən ikinci CHO hüceyrə xətti, burada genin lox yerləri ilə əhatə olunduğu, nəzarət lokusu daxilində yerləşir, yəni EESYR (ABŞ Patenti № 8,389,239B2, 5 mart 2013-cü il tarixində).

Transfeksiya edilmiş CHO hüceyrələri zərdabsız istehsal mühitində süspansiyonda böyüməyə uyğunlaşdırılmışdır. Sonra hüceyrələr donor ifadə vektoru və Cre rekombinazını kodlayan plazmid ilə on santimetrlik boşqabda transfeksiya edildi. Donor ifadə vektoru Lox yerləri ilə əhatə olunmuş Fc birləşmə zülalını kodlayan maraq genini ehtiva edir (bax ŞEK. 3A və ya 3B). Transfeksiyadan sonra iki həftə ərzində hüceyrələr mədəniyyət mühitində 400 μg/ml hiqromisin ilə becərildi və eYFP ifadə edən, lakin mKate (və ya EESYR lokusu inteqrasiyası vəziyyətində dsRed) olmayan hüceyrələr axın sitometriyasından istifadə edərək təcrid olundu. eYFP ifadə edən hüceyrələr zərdabsız istehsal mühitində süspansiyon mədəniyyətlərində genişləndirildi və mRNA səviyyələri Fc füzyon zülalını kodlayan hər bir hüceyrə hovuzu üçün standart prosedurlardan istifadə etməklə qRT-PCR ilə müəyyən edildi (bax Şək. 4).

Rekombinasiya mübadiləsinin effektivliyi (qırmızı marker, yəni mKate və ya dsRed ilə mübadilə edilən donor kaset markerindən, yəni eYFP-dən ifadə edilən sağ qalan hüceyrələrin əhalisinin faizi) hüceyrə hovuzları arasında müqayisə edilmişdir (Cədvəl 1). Hər bir lokusda yüksək rekombinasiya mübadiləsi səmərəliliyi müşahidə edilmişdir.

Transkripsiya Nəzarət Lokusuna nisbətən mühəndis LOCUS1 olan hüceyrə hovuzunda daha yüksək sürətlə (1,5 dəfə yüksək) müşahidə edilmişdir (şəkil 4).

Hazırkı ixtira əhatə dairəsi burada təsvir edilən xüsusi təcəssümlərlə məhdudlaşdırılmamalıdır. Həqiqətən, burada təsvir edilənlərə əlavə olaraq ixtiranın müxtəlif modifikasiyaları əvvəlki təsvirdən və onu müşayiət edən rəqəmlərdən bu sahədə təcrübəli olanlar üçün aydın olacaqdır. Bu cür dəyişikliklərin əlavə edilmiş iddiaların əhatə dairəsinə daxil olması nəzərdə tutulur.