Məlumat

Transformasiya səmərəliliyinin artırılması - super sarğıya səbəb olur?

Transformasiya səmərəliliyinin artırılması - super sarğıya səbəb olur?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Elmlə bağlı məhdud biliklərimdən bilirəm ki, transformasiya klonlaşdırmada ən çətin addımlardan biri ola bilər və bu addımı təkmilləşdirmək üçün çoxlu araşdırma/sınaq və səhvlər aparılıb. Mən eşitmişəm ki, elektroporasiya ən səmərəli texnikadır, baxmayaraq ki, məndə heç bir istinad yoxdur və əlbəttə ki, hüceyrə, media və müddətin hamısı prosesdə mühüm rol oynayır.

Bununla belə, heç vaxt supercoiling-in vacib bir amil olduğunu eşitməmişəm. Plazmidin ölçüsü transformasiyada böyük rol oynayır, buna görə də intuitiv olaraq transformasiyadan əvvəl plazmidin super sarılmasının səmərəliliyi artıracağını düşünməyə vadar edir. Düşünürdüm ki, transformasiya sadəcə dəliklərdən yayılan DNTdir, lakin plazmidin hissələri ev sahibi ilə bağlanmaq/qarşılıqlı olmaq üçün tələb olunurmu?

Nəyə görə transformasiyadan əvvəl bizə supercoil təklif edilmir? Bir neçə fikrim var, ancaq təxmin edirəm:

  • Gyrase DNT-nin bütövlüyünü poza bilər?
  • Yoxsa bu, sadəcə bahalı bir fermentdir və qazanc buna dəyməz?
  • Və ya ola bilsin ki, supercoiling sonrakı plazmid hazırlıqlarının/transkripsiyasının səmərəliliyini azaldır (baxmayaraq ki, ev sahibinin təbii fermentləri hər halda supercoil olmayacaqmı?)

Budur, böyük plazmidlər üçün transformasiya səmərəliliyinin əhəmiyyətli dərəcədə artdığını göstərən bir hesabat (çevirmə elektroporasiya yolu ilə idi. Bununla belə, məqaləyə on dəfədən az istinad edilmişdir, belə ki, texnika başa düşmürdü.

Zhixing, Y və Nahon, J-L (1995) DNT girase böyük rekombinant plazmidlərlə E.coli hüceyrələrinin DNT transformasiyasını yaxşılaşdırır. Nuklein turşuları Res. 23:3353-3354


DNT Supercoiling

Mücərrəd

DNT supercoilling daha yüksək səviyyəli DNT strukturunu təsvir edir. DNT-nin ikiqat spiral quruluşu bir-birini tamamlayan iki telin bir-birinin ətrafında və ümumi spiral ox ətrafında dolanmasına səbəb olur. Bu spiral oxun kosmosda qıvrılması DNT-nin superhelikal strukturunu (DNT üçüncü strukturu) müəyyən edir. Dairəvi bir DNT və ya ucları bir döngə yaratmaq üçün lövbərlənmiş xətti DNT üçün, DNT-nin superhelikal quruluşu ilə ikiqat spiral quruluşu (DNT ikincil quruluşu) arasında sıx bir topoloji əlaqə mövcuddur. Beləliklə, DNT superhelikliyi DNT-nin sarılması/açılmasına təsir göstərə bilər və bununla da DNT-nin bioloji funksiyalarına təsir edə bilər. Təbiətdə DNT molekullarında topoloji transformasiyaya vasitəçilik edə bilən DNT topoizomerazlar sinfi mövcuddur.


Mücərrəd

üzüm (Vitis spp.) bütün dünyada iqtisadi cəhətdən ən vacib meyvə bitkilərindən biridir və daim dəyişən kənd təsərrüfatı mühitinə və istehlakçı tələblərinə cavab olaraq onun əsas aqrotexniki və enoloji xüsusiyyətlərinin yaxşılaşdırılmasına böyük maraq var. Xüsusilə sürətli texnoloji irəliləyişlərlə əlaqəli molekulyar genetik üsullar məhsuldarlığı, keyfiyyəti, stresə davamlılığı və xəstəliklərə davamlılığı ilə yeni üzüm sortlarının inkişafı üçün ənənəvi seleksiya yanaşmalarına cəlbedici alternativ təqdim edir. Bu günə qədər bir neçə üzüm sortları biolistik bombardman və/yaxud müxtəlif funksiyalarla əlaqəli genlərə çevrilmişdir. Aqrobakteriya-müəyyən edilmiş regenerasiya sistemlərindən istifadə etməklə vasitəçi transformasiya və transgen üzüm xətləri əldə edilmişdir. Buna baxmayaraq, genotip, eksplant mənbəyi və mədəniyyət mühiti də daxil olmaqla geniş spektrli amillərin bitki regenerasiyasının səmərəliliyinə təsir göstərdiyi sübut edilmişdir. Bundan əlavə, qəbuledici materialların seçilməsi və istifadəsi, bakteriya ştammı və hüceyrə sıxlığı, seçilə bilən markerlər və seçim üsulları da transformasiyanın səmərəliliyinə təsir göstərir. Bu yazı üzümün regenerasiyası və genetik transformasiya sahəsində son nailiyyətlərin icmalı və əsas məhdudlaşdırıcı amillərin dərin müzakirəsini təqdim edir və üzümdə möhkəm bitki regenerasiyası və genetik transformasiyanın inkişafı üçün perspektivli gələcək strategiyaları müzakirə edir.


Elektrotransformasiya səmərəliliyinin artırılması Corynebacterium glutamicum onun hüceyrə divarını zəiflətməklə və sitoplazmatik membranın axıcılığını artırmaqla

Transformasiyanın səmərəliliyini artırmaq üçün Corynebacterium glutamicum heterogen plazmid DNT və bir zəncirli DNT (ssDNA) olan hüceyrələr elektro-transformasiyaya əsaslanan metodologiyadan istifadə etməklə.

Nəticələr

Hüceyrə divarlarını zəiflətmək üçün qlisin və dl-treoninin əlavə edilməsi və sitoplazmatik membranın axıcılığını artırmaq üçün Tween 80 və izonikotinik turşu hidrazidinin əlavə edilməsi ilə yarımkompleks hipertonik mühit seçilmişdir. Onların məzmunu cavab səthi metodologiyası ilə optimallaşdırılmışdır. Hüceyrə böyüməsi, elektrotransformasiya tamponu və transformasiya protokolu da optimallaşdırıldı. Ev sahibi məhdudlaşdırıcı fermentin müvəqqəti istilik inaktivasiyası əhəmiyyətli təsir göstərdi. Nəhayət, yüksək transformasiya səmərəliliyi 3,57 ± 0,13 × 10 7 cfu/μg plazmid DNT və 1,05 × 10 6 Str. R ssDNA ilə 10 9 canlı hüceyrə başına cfu əldə edilmişdir.

Nəticə

Nəticələr funksional genomikada və genomun redaktəsində tətbiqi işıqlandırır C. glutamicum.


Müzakirə

Qapaq slaydları və muncuqlar arasında super qıvrılmış plazmidləri bağlamağa imkan verən PNA əsaslı bir analiz hazırladıq. Biz fərdi DNT bağlarının, həm supercoiled plazmidlərin, həm rahat plazmidlərin, həm də xətti bağların, həmçinin supercoiled sistemdə zülal vasitəçiliyi ilə DNT dövrəsinin daxili dinamikasını araşdırdıq.

Süper qıvrımlı, rahat və xətti DNT-nin RMSD-ləri müqayisə edildi və müəyyən edildi ki, dolaşıq superburulmuş plazmidin RMSD müqayisə edilə bilən rahat plazmid və xətti ipdən əhəmiyyətli dərəcədə kiçikdir. Bundan əlavə, biz aşkar etdik ki, super qıvrılmış plazmid rahat plazmid və xətti ipdən daha sürətli relaksasiya müddəti nümayiş etdirir ki, bu da super qıvrılmış vəziyyətdə inkişaf etmiş sahənin yan-yana gəlməsinə bənzəyir. Bu tapıntılar əvvəllər nəşr olunmuş molekulyar dinamika simulyasiyalarını (19) və in vitro transkripsiya analizlərini (18) dəstəkləyir.

DNT dövrəsinin termodinamik parametrləri əvvəllər in vivo (21, 22) və xətti DNT (14) istifadə edərək tək molekullu təcrübələrlə tədqiq edilmişdir. Xətti DNT-dən istifadə edilən sonuncu tədqiqatda nəticələr göstərdi ki, altı operator və altı CI dimerini əhatə edən DNT dövrəsi nisbi sabit idi, halbuki yalnız dörd dimerin (OR3 və OL3 işğal edilmədən) iştirak etdiyi döngə daha az sabit idi. Görünür ki, DNT-nin super qıvrılması xətti DNT zəncirinin ilmələnməsi ilə müqayisədə ilgək sabitliyini artırır. Eksperimental nəticə, termodinamik modelin in vitro supercoiled DNT eksperimental məlumatlarına əla uyğunlaşma təmin etməsi və in vivo müşahidələrə uyğun parametrlər verməsi ilə təsdiqlənir (21, 22). Transkripsiya analizində super sarılmış şablonlardan istifadə edərək daha yeni bir in vitro tədqiqatı oktamer vasitəçiliyi ilə pRM aktivasiyasının gücləndirilməsini və pRM repressiyasında OL3 və OR3-ün birgə rolunu təsdiqlədi (12). Bu tapıntılar göstərir ki, burada birbaşa müşahidə olunduğu kimi supercoiling loop sabitliyini artırır.

Xülasə, biz yerli supercoiled DNT istifadə edərək, bir molekul təhlili inkişaf etmişdir. Biz CI konsentrasiyasının bir funksiyası olaraq döngə ehtimallarını araşdırdıq və xətti DNT ilə müşahidə ediləndən daha ilmələnmiş və açılmamış vəziyyətlər arasında daha kəskin keçid tapdıq (14). Litik və lizogen vəziyyətlər arasında qərar verən tənzimləyici şəbəkə üçün bu daha kəskin keçid gözlənilir. Məlumatlarımıza bir termodinamik modeli uyğunlaşdırmaqla, biz in vivo təbii olaraq super qıvrılmış DNT üçün bildirilən dəyərlərə uyğun olan dövrə əmələ gəlməsi ilə əlaqəli sərbəst enerjilər üçün dəyərlər əldə etdik. Bizim işimiz supercoilingin lambda keçidinin dinamikasını, deşifrə edilən ilk epigenetik keçid və transkripsiya tənzimlənməsi üçün paradiqmaya çevrilmiş keçidin dinamikasını necə dəyişdirdiyinə dair mühüm fikir verir.


NR liflərinin qatlanması ilə bükülmə əsaslı soyutma

Ölçeklenebilirliği nümayiş etdirmək üçün çoxlu NR liflərini izometrik olaraq açarkən soyutma ölçüldü. Yeddi qatlı 2,2 mm diametrli NR lifləri (şək. 2, D və E) bükülməmiş lifdən 600% uzanan boşalma ilə müqayisədə daha yüksək maksimum (−19,1°C) və orta (-14,4°C) səthi soyutma təmin etmişdir. −12.2°C) (Şəkil 1B) və ya 100% dartılmış tək lifin izometrik olaraq açılması üçün (-15.5°C maksimum və −12.4°C orta) (şək. 1C və şəkil S15). Təxminən 100% izometrik ştammlardan ayrılaraq ən yüksək bükülmə soyutma əldə etdi (şək. S23 və S24).

Eyni uzanmaya malik tək liflər üçün büküm sıxlığı və gərilmiş lif diametrinin oxşar məhsulu (şək. S17) üçün bükümlü soyutma arasındakı yazışmaları rəhbər tutaraq, izometrik lifin qatlanması ilə əlaqəli bükülmə soyutmasının təxminən lif məhsulundan asılı olduğunu aşkar etdik. bükülmə sıxlığı və bağlamanın effektiv diametri (Deff = n 0.5 × Ds, harada n liflərin sayıdır və Ds uzanan lifin diametridir) (şək. 2E).


Transformasiya səmərəliliyinin artırılması - supercoiling yaradır? - Biologiya

DNT şablonunun super sarılmasının transkripsiya ilə induksiya oluna biləcəyi məlum olsa da, bu prosesin in vivo mexanizmi və effektivliyi tam başa düşülmür. Biz burada məlumat veririk ki, 16 S rRNA, stabil RNT növü və ya sitoplazmik polipeptidləri kodlayan genlərin transkripsiyası hətta Escherichia coli-də optimal şəraitdə belə çox az və ya heç bir aşkar edilə bilən DNT supercoilasiyasına gətirib çıxarır. Bu onu göstərir ki, transkripsiya kompleksində (RNT polimeraza, yeni yaranan RNT, ribosomlar və yeni yaranan polipeptidlər daxil olmaqla) hidrodinamik sürüklənmə birləşdirilmiş transkripsiya-tərcümə zamanı RNT polimerazanı bağlamaq üçün kifayət deyil. Digər tərəfdən, inteqral daxili membranı və ya ixrac edilmiş periplazmik polipeptidləri kodlayan membranla əlaqəli genlərin transkripsiyası DNT-nin açıq-aşkar bükülməsinə gətirib çıxarır. İnteqral daxili membran polipeptidlərini kodlayan genlərin transkripsiyası periplazmik polipeptidləri kodlayan genlərin transkripsiyasından daha çox RNT polimerazanın bağlanmasına səbəb olur. Bu, polipeptidlərin bu iki sinfinin ifadəsi zamanı transkripsiya-tərcümənin membran birliyi ilə birləşməsindəki fərqləri əks etdirə bilər. RNT polimerazanın bağlanmasının çox güman ki, birləşmiş transkripsiya-tərcümə zamanı daxili membranın sitoplazmatik səthi ilə yeni yaranan polipeptidlərin qarşılıqlı təsiri ilə əldə edildiyini göstərən dəlillər təqdim olunur. Üstəlik, membranla əlaqəli genin transkripsiyaları, müəyyən hallarda, adətən membranla əlaqəli olmayan qonşu geni transkripsiya edən RNT polimerazının topoloji bağlanmasına səbəb ola bilər. Nəhayət, tapıntılarımızın potensial bioloji nəticələri müzakirə olunur.


İstinadlar

Jiang W, Marraffini LA. CRISPR-Cas: bakterial immunitet sistemlərindən genetik manipulyasiyalar üçün yeni vasitələr. Annu Rev Mikrobiol. 201569:209–28.

Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao Y, Pirzada ZA, Eckert MR, Vogel J, Charpentier E. Trans-kodlanmış kiçik RNT və host faktor RNase III ilə CRISPR RNT olgunlaşması. Təbiət. 2011471:602–7.

Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. Adaptiv bakteriya toxunulmazlığında proqramlaşdırıla bilən ikili RNT-yə rəhbərlik edən DNT endonukleaz. Elm. 2012337:816–21.

Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. CRISPR/Cas sistemlərindən istifadə edərək multipleks genom mühəndisliyi. Elm. 2013339:819–23.

Ma X, Zhu Q, Chen Y, Liu YG. Bitkilərdə genomun redaktəsi üçün CRISPR/Cas9 platformaları: inkişaflar və tətbiqlər. Mol zavodu. 20169:961–74.

Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. Cas9 vasitəsilə RNT-yə rəhbərlik edən insan genomu mühəndisliyi. Elm. 2013339:823–6.

Bosher JM, Labouesse M. RNT müdaxiləsi: genetik çubuq və genetik nəzarətçi. Nat Cell Biol. 20002: E31–6.

Brodersen P, Voinnet O. Bitkilərdə RNT susdurma yollarının müxtəlifliyi. Trendlər Genet. 200622:268–80.

Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. RNT müdaxiləsinin başlanğıc mərhələsində bidentat ribonukleazın rolu. Təbiət. 2001409:363–6.

Schauer SE, Jacobsen SE, Meinke DW, Ray A. DICER-LIKE1: Arabidopsis inkişafında kor kişilər və fillər. Trends Plant Sci. 20027:487–91.

Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoades MW, Bartel B, Bartel DP. Bitkilərdə mikroRNT-lər. Genes Dev. 200216:1616–26.

Xie Z, Johansen LK, Gustafson AM, Kasschau KD, Lellis AD, Zilberman D, Jacobsen SE, Carrington JC. Bitkilərdə kiçik RNT yollarının genetik və funksional diversifikasiyası. PLoS Biol. 20042: E104.

Deleris A, Gallego-Bartolome J, Bao J, Kasschau KD, Carrington JC, Voinnet O. Antiviral müdafiədə bitki Dicer kimi zülalların iyerarxik hərəkəti və inhibisyonu. Elm. 2006313:68–71.

Hutvagner G, Simard MJ. Argonaute zülalları: RNT-nin susdurulmasında əsas oyunçular. Nat Rev Mol Cell Biol. 20089:22–32.

Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. RNT-yə yönəlmiş nukleaza Drosophila hüceyrələrində transkripsiyadan sonrakı genin susdurulmasına vasitəçilik edir. Təbiət. 2000404:293–6.

Mi S, Cai T, Hu Y, Chen Y, Hodges E, Ni F, Wu L, Li S, Zhou H, Long C və s. Kiçik RNT-lərin Arabidopsis argonaute komplekslərinə çeşidlənməsi 5′ terminal nukleotid tərəfindən idarə olunur. Hüceyrə. 2008133:116–27.

Singh RK, Pandey SP. Argonautes bitkiləri arasında struktur və funksional diversifikasiyanın təkamülü. Bitki Siqnal Davranışı. 201510: e1069455.

Carbonell A, Carrington JC. ARGONAUTES bitkisinin antiviral rolu. Curr Opin Bitki Biol. 201527:111–7.

Scholthof HB, Alvarado VY, Vega-Arreguin JC, Ciomperlik J, Odokonyero D, Brosseau C, Jaubert M, Zamora A, Moffett P. Nicotiana benthamiana-da antiviral RNT-nin susdurulması üçün ARGONAUTE-nin müəyyən edilməsi. Bitki fiziol. 2011156:1548–55.

Wang XB, Jovel J, Udomporn P, Wang Y, Wu Q, Li WX, Gasciolli V, Vaucheret H, Ding SW. 21-nükleotid, lakin 22-nükleotid deyil, viral ikincili kiçik müdaxilə edən RNT-lər Arabidopsis thaliana-da iki kooperativ arqonautun güclü antiviral müdafiəsini istiqamətləndirir. Bitki hüceyrəsi. 201123:1625–38.

Zilberman D, Cao X, Jacobsen SE. ARGONAUTE4 lokalizasiyaya xas siRNA yığılmasına və DNT və histon metilasiyasına nəzarət. Elm. 2003299:716–9.

Raja P, Sanville BC, Buchmann RC, Bisaro DM. Geminiviruslara qarşı epigenetik müdafiə kimi virus genomunun metilasiyası. J Virol. 200882:8997–9007.

Pumplin N, Voinnet O. Bitki patogenləri ilə RNT-nin susdurulması: müdafiə, əks-müdafiə və əks-müdafiə. Nat Rev Mikrobiol. 201311:745–60.

Csorba T, Kontra L, Burgyan J. Viral susdurucu supressorlar: host-patogen birgə mövcudluğunu tənzimləmək üçün saxta alətlər. Virusologiya. 2015479-480:85–103.

Silhavy D, Molnar A, Lucioli A, Szittya G, Hornyik C, Tavazza M, Burgyan J. Viral zülal RNT-nin susdurulmasını boğur və susdurma nəticəsində yaranan, 21-25-nükleotidli ikiqat zəncirli RNT-ləri bağlayır. EMBO J. 200221:3070–80.

Roth BM, Pruss GJ, Vance VB. RNT susdurucu bitki viral supressorları. Virus Res. 2004102:97–108.

Gao SJ, Damaj MB, Park JW, Beyene G, Buenrostro-Nava MT, Molina J, Wang X, Ciomperlik JJ, Manabayeva SA, Alvarado VY, et al. Virusla kodlanmış RNT susdurucu supressorların birgə ifadəsi ilə şəkər qamışında gücləndirilmiş transgen ifadəsi. PLoS One. 20138: e66046.

Senthil-Kumar M, Mysore KS. Virusun səbəb olduğu gen susdurulması 2 ildən çox davam edə bilər və həmçinin Nicotiana benthamiana və pomidorda nəsil fidanlarına ötürülə bilər. Plant Biotechnol J. 20119:797–806.

Saxena P, Hsieh YC, Alvarado VY, Sainsbury F, Saunders K, Lomonossoff GP, Scholthof HB. İnkişaf baxımından zərərsiz olması üçün dəyişdirilmiş RNT susdurucunun virusla kodlanmış supressorundan istifadə edərək bitkilərdə yad gen ifadəsinin təkmilləşdirilməsi. Plant Biotechnol J. 20109:703–12.

Chapman EJ, Prokhnevsky AI, Gopinath K, Dolja VV, Carrington JC. Viral RNT susdurucu supressorlar aralıq mərhələdə mikroRNT yolunu maneə törədir. Genes Dev. 200418:1179–86.

Chen J, Li WX, Xie D, Peng JR, Ding SW. Viral virulent zülal RNT-nin susdurulması vasitəsi ilə müdafiəni boğur, lakin ev sahibi gen ifadəsində mikrornanın rolunu tənzimləyir. Bitki hüceyrəsi. 200416:1302–13.

Mao Y, Botella JR, Zhu JK. Bitki üçün optimallaşdırılmış CRISPR sistemləri tərəfindən törədilən hədəflənmiş gen modifikasiyalarının irsiyyəti. Cell Mol Life Sci. 201674:1075–93.

Mao Y, Zhang H, Xu N, Zhang B, Gou F, Zhu JK. Bitkilərdə səmərəli genom mühəndisliyi üçün CRISPR-Cas sisteminin tətbiqi. Mol zavodu. 20136: 2008–11.

Miki D, Zhu P, Zhang W, Mao Y, Feng Z, Huang H, Zhang H, Li Y, Liu R, Qi Y, Zhu JK. Effektiv diRNA nəsli üçün transkripsiyadan sonrakı gen susdurma yolunda komponentlər lazımdır. Sci Rep. 20177:301.

Morel JB, Godon C, Mourrain P, Beclin C, Boutet S, Feuerbach F, Proux F, Vaucheret H. Transkripsiyadan sonrakı gen susdurulması və virus müqavimətində pozulmuş məhsuldar hipomorfik ARGONAUTE (ago1) mutantları. Bitki hüceyrəsi. 200214:629–39.

Schott G, Mari-Ordonez A, Himber C, Alioua A, Voinnet O, Dunoyer P. Viral susdurucu supressorların siRNA və miRNA yüklənməsinə diferensial təsiri ARGONAUTE1-in iki fərqli hüceyrə hovuzunun mövcudluğunu dəstəkləyir. EMBO J. 201534:2593–4.

Vargason JM, Szittya G, Burgyan J, Hall TM. siRNA-nın bir RNT susdurucu supressor tərəfindən ölçüsü seçici tanınması. Hüceyrə. 2003115:799–811.

Danielson DC, Pezacki JP. p19 zülalı ilə RNT susdurma yolunun öyrənilməsi. FEBS Lett. 2013587:1198–205.

Varallyay E, Valoczi A, Agyi A, Burgyan J, Havelda Z. miR168-in bitki virus vasitəçiliyi induksiyası ARGONAUTE1 yığılmasının repressiyası ilə əlaqələndirilir. EMBO J. 201029:3507–19.

Liu W, Zhu X, Lei M, Xia Q, Botella JR, Zhu J-K, Mao Y. Arabidopsis thaliana-da CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə gen redaktəsi üçün ətraflı prosedur. Elm bülleteni. 201560:1332–47.

Lobbes D, Rallapalli G, Schmidt DD, Martin C, Clarke J. SERRATE: bitki mikroRNT səhnəsində yeni oyunçu. EMBO Rep. 20067:1052–8.

Duan CG, Zhang H, Tang K, Zhu X, Qian W, Hou YJ, Wang B, Lang Z, Zhao Y, Wang X, et al. RNT yönümlü DNT metilasiyasında Arabidopsis AGO4 və AGO6 üçün spesifik, lakin qarşılıqlı asılı funksiyalar. EMBO J. 201434:581–92.

Henderson IR, Zhang X, Lu C, Johnson L, Meyers BC, Green PJ, Jacobsen SE. Kiçik RNT emalı, gen susdurulması və DNT metilasiya modelləşdirməsində Arabidopsis thaliana DICER funksiyasının parçalanması. Nat Genet. 200638:721–5.

Mao Y, Zhang Z, Feng Z, Wei P, Zhang H, Botella JR, Zhu JK. Arabidopsisdə irsi gen modifikasiyalarının istehsalını yaxşılaşdırmaq üçün mikrob xəttinə məxsus CRISPR-Cas9 sistemlərinin inkişafı. Plant Biotechnol J. 201514:519–32.

Zhang X, Henriques R, Lin SS, Niu QW, Chua NH. Çiçək daldırma üsulundan istifadə edərək Arabidopsis thaliana-nın aqrobakteriya vasitəçiliyi ilə transformasiyası. Nat Protoc. 20061:641–6.

Schmittgen TD, Livak KJ. Müqayisəli C(T) üsulu ilə real vaxt PCR məlumatlarının təhlili. Nat Protoc. 20083:1101–8.


BİTKİ DÖNÜŞMƏSİ: Praktik Tətbiq üçün Problemlər və Strategiyalar

mücərrədBitki transformasiyası indi bitki biologiyasında əsas tədqiqat aləti və çeşidin təkmilləşdirilməsi üçün praktiki vasitədir. 120-dən çox müxtəlif bitki növünün nüvə genomlarına yeni genlərin stabil şəkildə daxil edilməsi üçün təsdiqlənmiş üsullar mövcuddur. Bu icmal bitki transformasiyasını yoxlamaq üçün meyarları, transformasiya sistemləri üçün bioloji və praktiki tələbləri, inadkar növlərdə transformasiyaya nail olmaq üçün toxuma mədəniyyətinin inteqrasiyası, gen transferi, seçim və transgen ifadəsi strategiyalarını və tənzimləyici mühit, ictimai qavrayışlar da daxil olmaqla bitki transformasiyası üçün digər məhdudiyyətləri araşdırır. , əqli mülkiyyət və iqtisadiyyat. Müxtəlif genetik dəyişiklikləri göstərən populyasiyaların yoxlanılması xərcləri transformasiya xərclərini çox üstələyə bildiyinə görə, mütləq və faydalı transformasiya effektivliyini ayırd etmək vacibdir. Bitki transformasiya biologiyasının qarşısında duran əsas texniki problem, genetik zədələnmədən proqnozlaşdırıla bilən transgen ifadəsini göstərən bitkilərin yüksək nisbətini istehsal etmək üçün metodların və konstruksiyaların işlənib hazırlanmasıdır. Bunun üçün bir sıra bioloji və texniki suallara cavab tələb olunacaq, onlardan bəziləri müəyyən edilmişdir.


Məsləhətlər və tez-tez verilən suallar

Əgər siz transformasiya səmərəliliyi ilə maraqlanmırsınızsa (məsələn, plazmid DNT borusunuz varsa və sadəcə plazmiddən daha çox böyüyə bilmək üçün bakteriyaları çevirmək lazımdırsa) bir çox addımları qısaltmaqla və ya atlayaraq çox vaxta qənaət edə bilərsiniz. növbəti addımınız üçün hələ də kifayət qədər koloniya əldə edəcəksiniz. Unutmayın ki, bu qısa yolların hər biri transformasiyanın effektivliyini azaldacaq, buna görə də daha yüksək effektivliyə ehtiyac olduqda tam protokola əməl edin.

  • Əlinizdəki səlahiyyətli hüceyrələri buz üzərində əridin
  • İstilik şokundan əvvəl 4-cü addımı buz üzərində 20-30 dəqiqədən 2 dəqiqəyə qədər azaldın

Böyüməni qısaldın və ya atlayın (Ampisillinə qarşı müqavimət üçün böyüməni tamamilə atlamaq yaxşıdır, digər antibiotiklər üçün ən azı 20-30 dəqiqə böyümək yaxşıdır)

Kimyəvi cəhətdən bacarıqlı hüceyrələr sürətli və istifadəsi asandır, lakin daha böyük plazmidləri tutmaqda daha az səmərəlidir. Böyük plazmidləri çevirmək lazımdırsa, elektro-kompetent hüceyrələrdən istifadə etmək yaxşı bir fikirdir. Hüceyrələrin DNT-ni qəbul etməsinə səbəb olmaq üçün istilik şokuna güvənmək əvəzinə, membran keçiriciliyini induksiya etmək üçün hüceyrə/DNT qarışığına elektromaqnit sahəsi tətbiq edilir. Bunu etmək üçün sizə elektroporator və müvafiq küvetlərə daxil olmaq lazımdır. Hər biri üçün istehsalçının təlimatlarına əməl edin.

Tərkibində düzgün antibiotik olan LB Agar boşqabına taxdığınızı yoxlayın. Plazmidinizdəki müqavimət geni lövhədəki antibiotiklə uyğun olmalıdır. Transformasiya prosedurunuzun işlədiyini təmin etmək üçün siz həmçinin müsbət nəzarət əlavə etməlisiniz (bir çox şirkətlər öz səlahiyyətli hüceyrələri ilə müsbət nəzarət plazmidi daxildir).

Əks-intuitiv ola bilsə də, xüsusilə yüksək səlahiyyətli hüceyrələrdən istifadə edərkən daha az DNT ilə daha yüksək transformasiya effektivliyi əldə edəcəksiniz. Əgər bağlamada 100-1000 ng ümumi DNT istifadə etmisinizsə, birbaşa 1 μl deyil, 1 μl 1:5 və ya 1:10 seyreltmə istifadə etsəniz, çox vaxt daha çox koloniya əldə edəcəksiniz.


Videoya baxın: مضاعفة القدرات وبناء المهارات الشخصية (Noyabr 2022).