Məlumat

DNT hasilatı üçün nümunəni lizis buferində nə qədər müddətə saxlamaq olar?

DNT hasilatı üçün nümunəni lizis buferində nə qədər müddətə saxlamaq olar?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən bəzi DNT hasilatı etməyə çalışır professorum üçün və mən bir proteinaz K ilə lizis tamponu. Proseduru davam etdirməyə vaxtım yox idi saç və tampon təxminən 12 gündür otaq temperaturunda bir yerdə oturur. Professorum DNT təcrid prosedurumu davam etdirməyin "yaxşı" olacağını söylədi, lakin mənim şübhələrim var.

DNT hasilatıma davam etməliyəmmi?(vorteksləmə, qaynatma, sentrifuqalama və supernatantın toplanması, -20 dərəcə Selsidə saxlama) yoxsa indiki vaxtda bu mənasız olardı? Məqsədim PCR və sonra gel tətbiq etməkdir.

DÜZENLE:

Budur lizis tamponunun tərkibi:

20 ml Lizis buferində:

son konsentrasiyalar $0,1 M$ TAE, $0,5M$ $ce{NaCl}$, 0,2% SDS-dir.

$800 ul$ Lysis buferinə $250 ug/ml$ konsentrasiyasında $5 ul$ proteinaz K əlavə etdim.

(Proteinaz K 0.0025 g$-dan 10 ml$-a qədər TAE tamponu ($1 M $) vasitəsilə hazırlanmışdır)

Bu, 12 gündür oturan 1,5 ml dollarlıq sentrifuqa borusunda idi.


Yaxşı olmalıdır. DNase ilə çirklənmədikcə, komponentlərin heç biri DNT-ni zədələməyəcək və ya denatürasiya etməyəcək. Mən təmizlənmiş plazmid DNT-ni həftələr boyunca heç bir aşkar deqradasiya olmadan skamyada qoymuşam. etməlidir yaxşı ol (bunu müntəzəm olaraq etməyi məsləhət görmürəm). Professorunuzun tövsiyəsi ilə mən təmizlənməyə davam edərdim, çünki siz artıq bura qədər gəlmisiniz. Ən pisi ən pisə gəlsə, heç nə əldə etməyəcəksiniz və yenidən təmizlənməli olacaqsınız. Ancaq əldə etmə şansınız bir şey olduqca yüksəkdir, buna görə də onunla gedə bilərsiniz.


EDTA konsentrasiyanız kifayət qədər yüksək görünür. DNT çıxarılması üçün lizis həyata keçirərkən, mən adətən liziz tamponunda 1 mM EDTA istifadə edirəm. Çox yüksək konsentrasiyalar, DNT ilk dəfə təmizlənmədiyi halda, sonradan PCR reaksiyasının inhibə edilməsi ilə nəticələnə bilər.

Bu, reaksiyanızın uğursuz olmasının səbəbi ola bilər.


QIAzol Lizis Reagenti

QIAzol Lizis Reagenti yağ toxumalarının lizisi üçün optimallaşdırılmışdır. Standart QIAzol protokolu QIAzol lizisini standart homogenləşdirmə üsulları və izopropanol çöküntüsü ilə birləşdirərək asan icra olunan proseduru təmin edir.

Performans

Rəqəmlərə baxın

Prinsip

Fenol/guanidin əsaslı QIAzol Lizis Reagenti bütün sinif toxumalarını lizis etmək üçün istifadə oluna bilər, lakin beyin və yağ toxumaları kimi yağ toxumalarının lizisi üçün optimallaşdırılmışdır. Üzvi ekstraksiya və xaotropik pozulmanın birləşməsi səmərəli lizisə və ümumi RNT-nin daha yüksək məhsuldarlığına kömək edir. Üzvi ekstraksiya mərhələsi həm zülalları, həm də DNT-ni çıxarır, sonrakı təmizləmə mərhələlərinin, məsələn, çökmə və ya spin sütunlarının səmərəliliyini artırır. QIAGEN, QIAzol lizisi və RNeasy silisium membranının təmizlənməsi texnologiyalarını tək, sadələşdirilmiş protokollarda (məsələn, istənilən növ toxuma üçün RNeasy Plus Universal Dəstlər) birləşdirən səmərəli RNT təmizlənməsi üçün bir neçə həll təklif edir.

Prosedur

Standart QIAzol protokolu QIAzol lizisini standart homogenləşdirmə üsulları və izopropanol çöküntüsü ilə birləşdirərək asan icra olunan proseduru təmin edir. Toxuma nümunələri QIAzol Lizis Reagentində homogenləşdirilir. Xloroform əlavə edildikdən sonra homogenat sentrifuqa ilə sulu və üzvi fazalara ayrılır. RNT yuxarı, sulu faza, DNT isə interfaza və zülallar isə aşağı, üzvi faza bölünür. RNT izopropanolun əlavə edilməsi ilə sulu fazadan çökdürülür. Sonra pellet etanol ilə yuyulur və RNase-siz suda yenidən həll edilir. Aşağı axın tətbiqlərində yüksək performans üçün hər hansı çirkləndirici fenolun çıxarılması və RNT-nin konsentrasiyası üçün RNeasy MinElute Təmizləmə Kitindən istifadə etməklə RNT-nin sonrakı təmizlənməsi tövsiyə olunur.

Proqramlar

Fenol/guanidin əsaslı QIAzol Lizis Reagenti bütün toxumalar üçün uyğundur və beyin və yağ toxumaları kimi yağ toxumalarının lizisi üçün optimallaşdırılmışdır. İstənilən aşağı axın tətbiqində yüksək performans üçün RNT məhsulunun RNeasy Plus Universal Kit və ya RNeasy MinElute Cleanup Kit ilə təmizlənməsini tövsiyə edirik.

Dəstəkləyici məlumatlar və rəqəmlər

Yüksək keyfiyyətli RNT.

Ümumi RNT RNeasy Lipid Tissue Midi Kit (QIAzol ilə) istifadə edərək 200 mq siçovul yağ toxumasından təcrid edilmişdir. RNT-nin yüksək keyfiyyəti Agilent 2100 BioAnalyzer ilə skan edilməklə göstərilir.


Nanodrop işığı, Qubit və QIAGEN Qiaxpert arasında hər hansı bir aləti seçə bilərsiniz, lakin bəzi laboratoriyalar həm Nanodrop Light, həm də Qubit istifadə etməyi üstün tuturlar.

Aşağıdakı rəqəm DNT ekstraksiya laboratoriyasının ümumi quruluşudur.

DNT ekstraksiya laboratoriyasından kənarda:

Nümunə DNT ekstraksiya laboratoriyasına daxil edilməzdən əvvəl nümunə etiketlənməli və laboratoriya idarəetmə sisteminə qeyd edilməlidir.

Bunun üçün laboratoriya üçün unikal kod və ya laboratoriya üçün unikal barkod yaradın.

Həmçinin, xəstənin birbaşa laboratoriyaya baş çəkdiyi halda laboratoriyada nümunə toplama imkanları var. Bunun üçün laboratoriyadan kənarda şpris, iynə, pambıq, qan toplama borusu və spirtimiz var.

Əgər nümunə qandırsa, nümunə EDTA flakonunda toplanmalıdır.

Yanğın təhlükəsizliyi üçün qurğu laboratoriyadan kənarda olmalıdır.

Həmçinin, laboratoriya əsas etiketlərlə etiketlənməlidir.
Nümunənin hazırlanmasından başlayaraq, nümunə DNT ekstraksiya laboratoriyası üçün bir daha etiketlənməlidir. Bu yer nümunələrin hazırlanması və digər kimyəvi maddələrin əlavə edilməsi üçün ayrılmışdır.

Bundan sonra sentrifuqanı, su banyosunu və zirvəni nümunə hazırlama sahəsinin yanına qoyun (şəklə bax).

Bundan sonra laboratoriyanın növbəti tərəfinə çəkin, əvvəlcə soba, elektroforez qurğusu və ultrabənövşəyi transilluminatorun ardınca çəkini qoyun.

Burada bu stansiyada çıxarılan DNT nümunəsi elektroforezdir. Gel hazırlanır və DNT agaroz gel elektroforezində aparılır, DNT UV transilluminatoru altında təhlil edilir.

Bunun yanında DNT kəmiyyəti var.

Elektroforez edildikdən sonra nümunə kəmiyyət təyinatına göndərilir. Burada çıxarılan DNT-nin saflığı və miqdarı yoxlanılır və sonra növbəti stansiyaya göndərilir.

İndi nümunəmiz PCR və digər aşağı axın tətbiqləri üçün hazırdır. DNT anbara göndərilir (dondurulur və ya dərin dondurulur). Nümunədən DNT-miz çıxarılır, indi DNT genetik laboratoriyamızın növbəti bölməsinə göndərilə bilər.

Genetik laboratoriyanın ümumi dəsti aşağıdakı şəkildə göstərilmişdir.

DNT çıxarma laboratoriyası genetik laboratoriyanın vacib hissəsidir. DNT ekstraksiya laboratoriyasından başlayaraq anbar otağına açılır.

Saxlama otağında dondurma, dərin dondurma və köməkçi raflar var. DNT DNT ekstraksiya laboratoriyasından çıxarıldıqdan sonra DNT kəmiyyəti müəyyən edilir və qısamüddətli saxlama üçün dondurucuda və uzunmüddətli saxlama üçün dərin dondurucuda saxlanılır.

Saxlama otağı reaksiya hazırlamaq otağına açılır. Reaksiya hazırlama otağında PCR reaksiyalarının hazırlandığı PCR iş stansiyası var.

Reaksiya hazırlama otağı şablon əlavə otağına açılır, burada DNT şablonu PCR reaksiyasına əlavə edilir və PCR maşınına yerləşdirilir.

Ekstraksiya laboratoriyası üçün təsvir edilən quraşdırma genetik laboratoriya üçün NABL təlimatına uyğundur. Burada, NABL təlimatına uyğun olaraq, genetik laboratoriya mahiyyətcə xüsusi bir şablon əlavə otağı tələb etdi.

Çünki reaksiya hazırlama laboratoriyasında və DNT ekstraksiya laboratoriyasında çarpaz çirklənmə ehtimalı çox yüksəkdir.

Qeyd: Post-amplifikasiya sahəsi yuxarıdakı şəkildə göstərilmir.


Təmizləmə nümunəsi

Adətən 1-D gel elektroforezindən əvvəl nümunələri müalicə etmək lazım deyil, lakin 2-D gel elektroforez tətbiqlərində bu çox vacibdir. Bununla belə, bulanıq zolaqlar kimi ayrılma ilə bağlı problemlər yaşayırsınızsa, nümunənin təmizlənməsi nuklein turşuları, polisaxaridlər və duzlar kimi potensial müdaxilə edən birləşmələri çıxararaq performansı yaxşılaşdıra bilər. Məsələn, DNaz-ın əlavə edilməsi, nuklein turşularının sərbəst buraxılması nəticəsində yaranan özlülük problemlərinin qarşısını almaq üçün istifadə edilə bilər. Cədvəl 4 ümumi çirkləndiricilərin siyahısını və onlarla mübarizə variantlarını təqdim edir.

Təmizləmə məhsullarının nümunəsi

SDS-PAGE Təmizləmə Kiti duzların olması və ya aşağı protein konsentrasiyası səbəbindən təhlili çətin olan nümunələrin hazırlanması üçün nəzərdə tutulmuşdur (Şəkil 1). Bu dəst məhlulda yuyucu vasitələr, duzlar, lipidlər, fenollar və nuklein turşuları kimi müdaxilə edən maddələri tərk edərək nümunə zülallarını kəmiyyətcə çökdürmək üçün çöküntü və birgə çöküntü birləşməsindən istifadə edir. Zülallar sentrifuqa üsulu ilə qranullanır. Qeyri-zülal çirkləndiriciləri çıxarmaq üçün qranul daha da yuyulur və yenidən sentrifuqa edilir. Nəticə qranul yenidən dayandırılır, SDSPAGE nümunə tamponu ilə qarışdırılır və qızdırılır. Bundan sonra nümunə SDS-PAGE üçün hazırdır. Prosedur 2 saatdan az müddətdə tamamlana bilər.

Şəkil 1. SDS-PAGE Təmizləmə Dəstinin etanol çöküntüsü ilə müqayisəsi. (A) 10 həcm etanol ilə çökdürülmüş sidik proteini. (B) SDS-PAGE Clean-Up Kit ilə çökdürülmüş sidik proteini. Gel: 8 × 9 sm, 12,5% akrilamid, 0,1% SDS, SE 260 Mini Şaquli Birlikdə işləyir. Ləkə: Coomassie** Mavi R-250.

2-D Təmizləmə Dəsti 2-D gel elektroforezi üçün nümunələr hazırlamaq üçün nəzərdə tutulmuşdur (Şəkil 2), lakin Western Blotting proqramlarında da istifadə edilə bilər. Reagentlər yuyucu vasitələr, duzlar, lipidlər, fenollar və nuklein turşuları kimi müdaxilə edən maddələri məhlulda buraxarkən zülalları kəmiyyətcə çökdürür. Nümunənin 2-D Clean-Up Kit ilə müalicəsi 2-D gel elektroforez nəticələrinin keyfiyyətini əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırır, zolaqları, fon rəngini və digər artefaktları azaldır. 2-D Clean-Up Kit haqqında ətraflı məlumat üçün Cytiva-dan 2-D Elektroforez, Prinsiplər və Metodlar Təlimatına baxın (2).

Şəkil 2. 2-D Təmizləmə Dəsti qalıq SDS nəticəsində yaranan üfüqi zolaqların çoxunu aradan qaldırır. Nümunə: 4% SDS, 40 mM Tris bazası ilə çıxarılan siçovul qaraciyəri. Birinci ölçü: Təxminən 20 μg siçovul qaraciyər proteini, Immobiline™ DryStrip (pH 4-7, 7 sm). Ettan™ IPGphor™ 3 İzoelektrik Fokuslama Bölməsi 17,5 kVh. İkinci ölçü: SDS-PAGE (12,5%), SE 260 Mini Şaquli Bölmə (8 × 9 sm gel) üzərində işləyir. Ləkə: PlusOne™ Gümüş Boyama Dəsti, Zülal.

Serum və ya Plazma Nümunələrindən Yüksək Bol Proteinin tükənməsi

Plazma və ya serumu Western blotlama üsulu ilə araşdırarkən, albumin və IgG kimi bol plazma zülalları daha az zəngin zülalların siqnallarını gizlədə bilər. HiTrap™ Albumin & IgG Depletion kimi əvvəlcədən qablaşdırılan sütunlar müvafiq olaraq >95% albumin və >90% IgG-ni çıxararaq, bu potensial problemli zülalların nümunələrinin tükənməsi üçün nəzərdə tutulub.

HiTrap Albumin & IgG Depletion 1 mL sütunu normal səviyyələrdə albumin ehtiva edən təxminən 150 μL seyreltilməmiş insan plazması və ya serumunun nümunə həcmlərindən albumin və IgG-nin tükənməsi üçün nəzərdə tutulmuşdur (

15 mq/ml). Tükənmə proseduru təxminən 35 dəqiqə çəkir və ÄKTA™ dizayn platformasından maye xromatoqrafiya sistemindən, peristaltik nasosdan və ya şprislə əl ilə həyata keçirilə bilər. Daha kiçik həcmlərlə işləyərkən, həcmlər üçün nəzərdə tutulmuş Albumin və IgG Depletion SpinTrap™

50 μL insan plazması və ya serumu tövsiyə olunur.

Duzsuzlaşdırma və Konsentrasiya Nümunələri

Nümunənizi elektroforez gelinə tətbiq etməzdən əvvəl həlledicidə duzların və ya digər aşağı molekulyar ağırlıqlı çirkləndiricilərin həddindən artıq konsentrasiyası olmaması vacibdir. Nümunələrdəki yüksək duz səviyyələri zülalların uyğun olmayan və gözlənilməz şəkildə miqrasiyasına səbəb ola bilər. Duzsuzlaşdırma gel filtrasiyası əsasında bir addımda və eyni zamanda nümunənin istənilən buferə köçürülməsi ilə əldə edilə bilər. Bununla belə, duzsuzlaşdırma və bufer mübadiləsi prosedurları çox vaxt nümunənin seyreltilməsi ilə nəticələnir. Elektroforez tətbiqlərində yaxşı nəticələr üçün nisbətən yüksək nümunə konsentrasiyası tələb olunur və buna görə də nümunə konsentrasiyası lazım ola bilər. Nümunə membran ultrafiltrasiya ilə səmərəli və asanlıqla konsentrasiya edilə bilər.

Cytiva tərəfindən təqdim edilən bəzi duzsuzlaşdırma və konsentrasiya məhsulları burada ümumiləşdirilmişdir Cədvəl 5.


Müzakirə

Sürətli, yüksək məhsuldarlıqlı və sərfəli viral nuklein turşusunun birgə ekstraksiya üsullarının hazırlanması üçün böyük səylər göstərilmişdir. RNT və DNT-nin birgə çıxarılması üçün əsas kimyəvi tərkiblər GTC, DTT, natrium dodesil sulfat (SDS) və β-merkaptoetanol 12,13,15-dir. 1990-cı illərdə I. Casas, L serebrospinal mayedən viral RNT və DNT çıxarmaq üçün "GuSCN-DNT/RNT" hasilatı metodunu qurdu, bu üsul ən sonrakı birgə ekstraksiya üsulları üçün əsas idi 15 . Bu kimyəvi tərkib hissələrini maqnit muncuqlarla birləşdirərək bəlğəmdən ya DNT, ya da RNT-ni daha səmərəli şəkildə çıxardıq. Əvvəlki araşdırmamızda viral liziz tamponunu birləşdirmək üçün SDS və β-merkaptoetanoldan da istifadə etdik. Bununla belə, SDS asanlıqla kristallar əmələ gətirə bilər ki, bu da nümunənin işlənməsi zamanı narahatlıq yaradır və β-merkaptoetanol xoşagəlməz qoxuya malikdir və insan sağlamlığı üçün risk və ətraf mühiti çirkləndirir. Buna görə də müəyyən etdik ki, GTC, DTT, glikogen və natrium sitrat eyni vaxtda bəlğəmdən DNT və RNT çıxarmaq üçün lizis tamponunun kifayət və uyğun komponentləridir.

GTC RNaz və DNaz fəaliyyətini maneə törədə bilən və RNT və DNT bütövlüyünü qoruyan nuklein turşuları və nukleoproteini ayıra bilən güclü denaturantdır 12,15 . Bir sıra tədqiqatlar göstərdi ki, əgər liziz tamponunda GTC 12 yoxdursa, nə DNT, nə də RNT maqnit muncuqlarının səthlərinə adsorbsiya olunmur. Bu tədqiqat göstərdi ki, ən yüksək ekstraksiya səmərəliliyi DNT və RNT birgə ekstraksiya məhsuldarlığına əsaslanan 2,0 M GTC konsentrasiyası ilə baş verir. Müxtəlif GTC konsentrasiyaları hasilatın səmərəliliyinə az təsir göstərmişdir. Qeyd edək ki, GTC onun konsentrasiyası 6,0 M olduqda kristallaşdı, bu da nümunənin işlənməsi zamanı narahatçılığa səbəb oldu. DTT yalnız zülalların əlavə fəaliyyətini itirməsinə səbəb olmur, həm də bəlğəmi mayeləşdirmək üçün tanınmış bir qabiliyyətə malikdir 19,23. Buna görə də, DTT nuklein turşusunun çıxarılması prosesinə daxil edildikdə bəlğəmin prepossessiyasını tələb etmirdi. Nuklein turşusunun çökməsini asanlaşdırmaq üçün qlikogen istifadə edilmişdir 15 . Ənənəvi nuklein turşusunun çıxarılması üsullarının avtomatlaşdırılması mərkəzdənqaçma addımları 24 səbəbindən həyata keçirmək çətindir. Maqnit bionanohissəciklərinin inkişafı nuklein turşusunun çıxarılmasının avtomatlaşdırılması prosesini böyük dərəcədə təşviq etmişdir 12,25 . Çoxlu tədqiqatlar göstərdi ki, maqnit muncuqları DNT və RNT-ni udmaq qabiliyyətinə malikdir 12,26,27 və onların adsorbsiya qabiliyyəti bəzi həlledicilərin, o cümlədən GTC-nin müvafiq konsentrasiyaları ilə xeyli artırıla bilər. Bu gücləndirmənin səbəbləri aşağıdakı kimi ola bilər 28,29: maqnit muncuqlarının və nuklein turşularının səthlərində anionlar mövcuddur və GTC və ya ammonium nuklein turşuları və maqnit muncuqları arasında körpü rolunu oynaya bilər 30 yüksək konsentrasiyalı duz ionları həm nuklein turşularının, həm də maqnit muncuqlarının səthlərində su qatını susuzlaşdıran hidratlı ionlar əmələ gətirir ki, bu da maqnit muncuqlarını nuklein turşularını adsorbsiya etməyə sövq edir və GTC cüt zəncirli DNT-ni tək zəncirli hala gətirir, çünki tək zəncirli DNT-nin əsas qrupu və maqnit muncuq səthindəki hidroksil qrupu yapışmanı daha güclü edən kimyəvi bir əlaqə yaradır. Buna görə də, DNT və RNT GTC olmadan maqnit muncuq səthinə çətinliklə adsorbsiya olunur.

Maqnit muncuqların bu ekstraksiya üsulunda əvəzsiz rol oynamasına baxmayaraq, maqnit muncuqlarının artması ilə ekstraksiya səmərəliliyi mütləq artmır. Bu tədqiqatda istifadə edilən maqnit muncuqları böyük miqdarda hidroksillə dəyişdirilmişdir. Yüksək duzlu mühitdə maqnit muncuqları zülallardan və digər çirklərdən ayıraraq nuklein turşularını udur. Nəticələr müəyyən etdi ki, ekstraksiya səmərəliliyi maqnit muncuqlarının həddindən artıq çoxluğunun əlavə edilməsi ilə azalıb, maqnit muncuqlarının səthlərindəki nuklein turşuları yuyulma mərhələsi zamanı itirmiş ola bilər, çünki maqnit muncuqları ekstraksiya reagentini aşır, nəticədə son mərhələdə çıxarılan nuklein turşusu. Bu işdə 20 μl maqnit muncuq yüksək hasilat səmərəliliyini təmin etmək üçün kifayət idi.

Bir çox nuklein turşusunun çıxarılması üsulları otaq temperaturunda 12,31 həyata keçirilir, digər tədqiqatlar isə artan temperaturda daha çox DNT və RNT-nin buraxıldığını göstərmişdir. Eksperimental məlumatlarımız göstərdi ki, RNT deqradasiyası 60-100 °C-də aydın deyildi, halbuki otaq temperaturunda inkubasiya daha aşağı RNT hasilatı səmərəliliyi ilə nəticələndi. Qarışığın pH-ı nuklein turşusunun çıxarılmasında mühüm rol oynayır. Məlumatlarımızdan göründüyü kimi, qələvi şəraitdə maqnit muncuqlarının adsorbsiya qabiliyyətində bir neçə fərq müşahidə edildi, halbuki asidik şəraitdə, xüsusən də pH 5-dən az olduqda, adsorbsiya qabiliyyəti kəskin şəkildə azaldı. Bu nəticələr zülallar və ya aminlər səbəbindən baş verə bilər. turşular pH çox aşağı olduqda müsbət yük daşıyan maqnit muncuqlarının səthlərinə yapışdı, bu da nuklein turşusunun maqnit muncuqlarına bağlanmasına təsir etdi.

Daşıyıcı RNT olmayan maqnit muncuqlarına əsaslanan bu birgə ekstraksiya üsulu çoxsaylı RT-qPCR analizinin tələblərinə cavab verdi, lakin hasilat səmərəliliyi kommersiya dəstlərinin ekstraksiya effektivliyindən aşağı idi. RNT daşıyıcısının əlavə edilməsi ekstraksiya səmərəliliyini xeyli yaxşılaşdırdı və həm RNT, həm də DNT üçün kommersiya dəstləri üçün hasilat səmərəliliyindən daha yüksək səviyyəyə çatdı, ola bilsin ki, RNT daşıyıcısı nuklein turşusunun çökməsinə yaxşı təsir göstərdi.


Yeni Birbaşa PCR Lizis Buferi Ət Matrislərindən PCR-ni təkmilləşdirə bilər

PCR-ə əsaslanan molekulyar texnologiyalar bir çox bioloji analiz sahələrində, xüsusən də genetik analiz və DNT-nin barkodlanması üçün geniş istifadə edilmişdir. Bu tədqiqatda adi PCR gücləndirilməsi üçün uyğun olan təzə və işlənmiş ətdən heç bir təmizlənmə mərhələsi olmadan sürətli DNT lizisi mayesi hazırlanmışdır. Birbaşa PCR üçün seçim və daha da optimallaşdırma üçün üç müxtəlif lizis maye düsturları nəzərdə tutulmuşdur və hər bir formulun təsirini qiymətləndirmək üçün DNT konsentrasiyası və PCR-də udma spektrləri istifadə edilmişdir. Nəticələr göstərdi ki, tərkibində NaOH, EDTA, SDS, Tween 20 və Tris-HCl olan düstur ən yaxşı nəticələrə nail olub və optimallaşdırılmış düstur praktiki PCR tətbiqləri ehtiyacını ödəyib. Protokol istənilən ət nümunələrindən DNT replikasiyası üçün sürətli lizis tamponu təmin etdi. Yekun formulun icrası bütün sınaqdan keçirilmiş ət nümunələri üçün yüksək DNT lizis effektivliyi ilə nəticələndi və PCR gücləndirmə effektivliyi kommersiya dəstindən istifadə edərək təcrid olunmuş DNT şablonuna bənzədi. Bütün proses 30 dəqiqə ərzində tamamlana bilər. Buna görə də, bu tədqiqat DNT əsasında ətin molekulyar analizi üçün sadə, alternativ, sərfəli sürətli həlli təmin edir.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


AAVpro Extraction Solution

İstehsalçı 293T hüceyrələrindən AAV hissəciklərinin çıxarılması üçün reagent dəsti olan AAVpro Extraction Solution ilə AAV məhsuldarlığını ən azı üç dəfə artırın. AAV hissəciklərinin izolyasiyası adətən dondurma-ərimə və ya sonication metodlarından istifadə etməklə həyata keçirilir. Lakin bu üsullar çox vaxt aparır və xüsusi avadanlıq tələb edir. AAVpro Ekstraksiya Həlli AAV hissəciklərinin təcrid edilməsi üçün təkmilləşdirilmiş üsuldan istifadə edir, sadəcə olaraq ekstraksiya məhlulunu virus istehsal edən hüceyrələrə əlavə edin və sentrifuqa ilə viral hissəcikləri bərpa edin.

İstehsalçı 293T hüceyrələrindən AAV hissəciklərinin çıxarılması üçün reagent dəsti olan AAVpro Extraction Solution ilə AAV məhsuldarlığını ən azı üç dəfə artırın. AAV hissəciklərinin izolyasiyası adətən dondurma-ərimə və ya sonication metodlarından istifadə etməklə həyata keçirilir. Lakin bu üsullar çox vaxt aparır və xüsusi avadanlıq tələb edir. AAVpro Ekstraksiya Həlli AAV hissəciklərinin təcrid edilməsi üçün təkmilləşdirilmiş üsuldan istifadə edir, sadəcə olaraq ekstraksiya məhlulunu virus istehsal edən hüceyrələrə əlavə edin və sentrifuqa ilə viral hissəcikləri bərpa edin. Sadə bir protokola əlavə olaraq, ekstraksiya məhlulu ana zülalın və nuklein turşusunun çirklənməsini azaldır, hüceyrə infeksiyasına və ya AAVpro Təmizləmə Dəsti ilə sonrakı təmizlənməyə hazır olan viral hissəcik məhlulları verir.


DNT hasilatı üçün nümunəni lizis buferində nə qədər müddətə saxlamaq olar? - Biologiya

DNT istənilən qan və ya toxuma nümunəsindən çıxarıla bilər. Əldə edilən DNT-nin keyfiyyəti və miqdarı nümunənin ölçüsünə, yaşına və hüceyrə sayına görə dəyişəcək. Bir qayda olaraq, EDTA-da 3 ml qan kifayət edəcəkdir. DNT bütün nüvəli hüceyrələrdən alınır və genomik DNT adlanır.

Nüvədə DNT xromatin kimi bir çox fərqli zülalla sıx bağlıdır. DNT-ni çıxarmaq üçün bunları və digər hüceyrə zülallarını çıxarmaq vacibdir. Bu, üzvi həlledicilərin və ya duzun çökməsinin istifadəsi ilə əldə edilir. DNT-nin sulu məhlulu alınır, ondan DNT etanol çöküntüsü ilə daha da təmizlənir.

Bir sıra DNT ekstraksiya dəstləri indi kommersiya baxımından mövcuddur. Bunlar DNT-nin çıxarılması üçün tələb olunan vaxtın miqdarını əhəmiyyətli dərəcədə azalda bilər, üzvi həlledicilərin istifadəsindən yan keçə bilər və istifadə olunan reagentlərin keyfiyyətli nəzarətini təmin edə bilər. Bununla belə, molekulyar biologiyanın bütün aspektlərində dəstlərin istifadəsi təkmilləşdirmələrin inkişafına mane ola bilər.

Protokol: Genomik DNT-nin çıxarılması (Burada təsvir olunan protokol əl üsuludur)

Nəzərə alın ki, bütün buferlər və məhlullar üçün mövcud olan ən yüksək dərəcəli reagentlərdən və ikiqat distillə edilmiş deionlaşdırılmış sudan istifadə etmək tövsiyə olunur.

  • NaCl 5 mol/l. 146,1 q NaCl-i stəkana çəkin və həll olunana qədər su ilə qarışdıraraq həcmini 500 ml-ə çatdırın.
  • Tris-HCl, 1 mol/l, pH 8,5. 60,5 q Trizma əsasını (tris[hidroksi]metilaminometan) 350 ml suda həll edin, konsentratlaşdırılmış HCl əlavə edin, pH 8,5-ə düşənə qədər su ilə 500 ml-ə qədər əlavə edin.
  • Tris-HCl, 1 mol/l, pH 7,4. Yuxarıdakı kimi hazırlayın, lakin HCl ilə pH-ı 7.4-ə endirin.
  • NaOH, 5 mol/l. 800 ml suya 200 q NaOH əlavə edin və 1 litr su ilə həll olunana qədər qarışdırın.
  • EDTA, 0,5 mol/l, pH 8,0. 93 q EDTA disodium duzunu (dihidrat) çəkin və 400 ml suya əlavə edin, çoxu həll olunana qədər qarışdırın. 0,5 mol/l NaOH əlavə edin ki, pH 8,0-ə yüksəlsin, bərkin qalan hissəsi məhlula daxil olsun. 500 ml-ə qədər su ilə doldurun.
  • Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.3.
  • Nonidet P-40 (NP40), 10%. 90 ml suya 10 ml NP40 əlavə edin və yaxşı qarışdırın.
  • Natrium dodesil sulfat (SDS, lauril sulfat), 20%. 100 q SDS çəkin və 350 ml suya əlavə edin. Qarışdırın və məhlul halına gələnə qədər 65ºC-yə qədər qızdırın və 500 ml-ə qədər su əlavə edin.

Diqqət: SDS tənəffüs yollarını qıcıqlandırır. Üz maskası taxın və duman başlıqında çəkin.

  • PBS + 0,1% NP40. 495 ml PBS-ə 5 ml 10% NP40 əlavə edin.
  • On dəfə konsentratlaşdırılmış (吆) lizis tamponu). 60 ml 5 mol/l NaCl, 20 ml 0,5 mol/l EDTA, 10 ml 1 mol/l Tris pH 7,4 və 10 ml suyu qarışdıraraq 100 ml 3 mol/l NaCl, 100 mmol/l əldə edin. EDTA və 100 mmol/l Tris.
  • Lizis məhlulu. 21 q karbamid (7 mol/l) çəkisi üçün 50 ml üçün hər dəfə bu məhluldan müvafiq miqdarda təzə hazırlayın, 5 ml lizis tamponu əlavə edin və su ilə son həcmi 50 ml-ə çatdırın.
  • Xloroform/izoamil spirti (24:1). 480 ml xloroforma 20 ml izoamil spirti əlavə edin.
  • Etanol 70%. 70 ml mütləq etanola 30 ml su əlavə edin.
  • Tris EDTA (TE) (10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA). 494 ml suya 5 ml 1 mol/l Tris pH 7,4 və 1 ml 0,5 mol/l Na2 EDTA əlavə edin.
  • TE balanslaşdırılmış fenol. Fenolun vəziyyəti alınan DNT-nin keyfiyyəti üçün çox vacibdir. DNT turşulu su ilə doymuş fenolda həll olunur və buna görə də onu neytral pH-a tarazlaşdırmaq lazımdır.

  1. 500 ml su ilə doymuş fenol götürün. 500 ml 0,5 mol/l Tris pH 8,5 hazırlayın, bundan 150 ml fenola əlavə edin və inversiya ilə 2 dəqiqə qarışdırın. Sulu və üzvi fazalar ayrılana qədər dayanmağa buraxın.
  2. Üst sulu təbəqəni çıxarın və atın. Daha 125 ml 0,5 mol/l Tris əlavə edin, qarışdırın, dayanın, əvvəlki kimi sulu təbəqəni çıxarın və sonra təkrarlayın.
  3. Qalan 100 ml 0,5 mol/l Tris-ə 500 ml 0,1 mol/l Tris vermək üçün 400 ml su əlavə edin. Bundan 150 ml fenola əlavə edin, sonra qarışdırın, dayanın və çıxarın. Daha iki dəfə təkrarlayın.
  4. Qalan 50 ml 0,1 mol/l Tris-ə 449 ml su və 1 ml 0,5 mol/l EDTA əlavə edərək 500 ml TE əldə edin. Əvvəlki kimi üç mərhələdə əlavə edin, qarışdırın, dayanın və çıxarın. Bu prosedur zamanı fenolun həcmi azalacaq, lakin indi TE balanslaşdırılmış və istifadəyə hazırdır.
  1. Antikoaqulyasiya edilmiş qan nümunəsini -20ºC-də dondurun. EDTA üstünlük verilən antikoaqulyantdır. Qanı birdəfəlik plastik 25 ml universal konteyner kimi sentrifuqa edilə bilən bir boruya toplamaq rahatdır. 2-dən 20 ml-ə qədər istənilən nümunənin ölçüsü qənaətbəxş olacaqdır. Qan otaq temperaturunda, alındıqdan sonra bir neçə gün ərzində, tercihen bir referans laboratoriyaya göndərilə bilər. Nümunə -20ºC-də bir neçə həftə saxlanıla bilər, daha uzun müddət saxlanması -80ºC-də daha yaxşıdır.
  2. Qanı əridin və 700 q-da 15 dəqiqə sentrifuqa edin. Süpernatantı diqqətlə tökün. Bu mərhələdə qranul görmək çətindir və olduqca boş ola bilər.
  3. Geniş delikli standart plastik köçürmə pipetində yuxarı və aşağı qarışdırmaqla pelleti 1'82112 ml PBS + 0,1% NP40-da yenidən suspenziya edin. Süspansiyonu orijinal həcmə qədər PBS + 0,1% NP40 ilə doldurun.
  4. Yenidən 700 q-da 15 dəqiqə sentrifuqa edin və supernatantı tökün. Lazım gələrsə, qranul qırmızı rənginin çox hissəsini itirənə qədər təkrarlayın.
  5. 2 damcı lizis məhlulu əlavə edin. Nəmləndirilməmiş steril çubuq (məsələn, birdəfəlik plastik bakteriya aşılama ilgəsi) və ya təmiz silikonlaşdırılmış şüşə çubuqdan istifadə edərək qranulları bu məhlulun içinə bölün. Məhlul viskoz olacaq. Mümkün qədər homojen olun.
  6. Lizis məhlulunun ardıcıl 0,5 ml həcmi əlavə edin, hər dəfə qarışdırın, özlülük məhlulu çətinlik çəkmədən yuxarı və aşağı pipetləmək mümkün olana qədər. Son həcm qan nümunəsinin ölçüsündən, təbiətindən və keyfiyyətindən asılı olacaq. 10 ml təzə dondurulmuş normal qan üçün 2𔃁 ml lizis məhlulu istifadə edin.
  7. 1/10 həcmdə 20% SDS əlavə edin. Transfer pipeti ilə yumşaq qarışdırın və 37ºC-də minimum 15 dəqiqə inkubasiya edin. Bu mərhələdə nümunələr bir gecədə buraxıla bilər.
  8. Nümunəni qapaqlı polipropilen boruya köçürün. Bərabər həcmdə xloroform/izoamil spirti və bərabər həcmdə fenol əlavə edin. 5 dəqiqə inversiya ilə yumşaq qarışdırın. 1300 q-da 15 dəqiqə sentrifuqa edin.
  9. Üst sulu fazanı yeni bir polipropilen boruya köçürün. Ağ zülal interfeysini və üzvi fazanı geridə buraxın. Əgər məhlul çox özlüdürsə, bu çətin ola bilər, bu halda lizis məhlulu ilə əlavə seyreltmə lazımdır.
  10. Ən azı bir dəfə 8 və 9-cu addımları təkrarlayın və interfeys aydın olana qədər davam edin. Bərabər həcmdə xloroform/izoamil spirti əlavə edin və 5 dəqiqə ərzində inversiya ilə yumşaq qarışdırın. Əvvəlki kimi sentrifuqa edin və yenidən sulu fazanı universal və ya qapaqlı 10 ml boruya köçürün.
  11. 2,5 həcm mütləq etanol əlavə edin. Borunu bir neçə dəfə çevirərək məhlulu qarışdırın. DNT “pambıq” top kimi çökməlidir. Mikropipet ucundan istifadə edərək, DNT-ni 1 ml 70% etanol olan mikrosentrifuqa borusuna köçürün.
  12. 5 dəqiqə ərzində 12000 q-da mikrosentrifuqada sentrifuqa edin. Qalıq etanolu tökün və bütün bunları mikropipetlə çıxarın.
  13. Skamyada 10 dəqiqə qurumağa buraxın.
  14. Peletin ölçüsündən asılı olaraq 50� μl TE əlavə edin. DNT konsentrasiyasının təxminən 0,5 mq/ml olmasını hədəfləyin. Ən azı bir gecə yenidən dayandırmaq üçün buraxın. Tüpü heç vaxt burulğan etmədən ovuşduraraq yumşaq bir şəkildə qarışdırın. DNT 4ºC-də uzun müddət saxlanıla və ya -20ºC-də dondurula bilər.

Digər mənbələrdən DNT-nin çıxarılması
Ig və TCR genlərinin yenidən qurulmasının təhlili üçün DNT ekstraksiyasından əvvəl limfositlər üçün periferik qan nümunəsini zənginləşdirmək lazımdır. Bu, Ficoll/Hypaque (və ya Lymphoprep) üzərində mononüvəli hüceyrələrin ayrılması yolu ilə əldə edilir. Hüceyrə qranulunu PBS-də yuduqdan sonra lizis və DNT çıxarılması 5-ci addımdan etibarən davam edə bilər.

DNT sümük iliyi aspiratlarından periferik qanla eyni şəkildə çıxarılır, yalnız dondurulmazdan əvvəl ən azı 5 həcmdə PBS-də seyreltilir.

Toxuma biopsiyaları təbiətinə, ölçüsünə və hüceyrə tərkibinə görə çox dəyişir və nəticədə onlardan alınan DNT-nin keyfiyyəti və kəmiyyəti də dəyişir. Southern blot analizi üçün kifayət qədər yüksək molekulyar çəkili DNT əldə etmək üçün biopsiya bir neçə mm3 ölçüdə və təzə dondurulmuş olmalıdır. Əgər belə bir biopsiya varsa, əvvəlcə təmiz bıçaqla xırda doğrayaraq, sonra 5 ml-lik şpris pistonunun küt ucu ilə parçalayaraq PBS-yə mexaniki şəkildə parçalamaqla kifayət qədər hüceyrə əldə etmək olar. Süspansiyon qranul əldə etmək üçün sentrifuqa edilir, ondan əvvəlki kimi DNT çıxarılır (5-ci addımdan). Daha kiçik biopsiyalar üçün nümunəni çıxarmadan əvvəl proteinaza K ilə aşağıdakı kimi müalicə etmək daha yaxşıdır:

  1. Toxumanı 700 μl 50 mmol/l Tris-HCl, pH 8.0, 100 mmol/l NaCl, tərkibində 100 μg/ml proteinaz K olan 1% (ağırlıq/v) SDS-ə qoyun.
  2. Toxumanı incə qayçı ilə kəsin və bir gecədə 50ºC-də inkubasiya edin.
  3. Fenol/xloroformun çıxarılması və DNT çöküntüsü ilə əvvəlki addım 8-də olduğu kimi davam edin.

DNT konsentrasiyasının təyini
5 μl DNT məhlulunu götürün və 245 μl suda seyreltin. Vortekslə yaxşıca qarışdırın. (Bu DNT atılmalıdır və buna görə də bu şəkildə müalicə oluna bilər.) Su blankına qarşı 260 nm-də spektrometrdə absorbansı (A) oxuyun. 50 μg/ml konsentrasiyada DNT məhlulundan A 1,0 alınır. Buna görə də, orijinal DNT məhlulunun μg/ml-də konsentrasiyasını əldə etmək üçün əldə edilən A göstəricisini 2500-ə vurun. A260-ın A280-ə nisbəti DNT məhlulunun təmizliyinə işarə edir. Bu nisbət 1,7𔃀,0 diapazonunda olmalıdır.


E. Arroyo, E.K. Wheeler, R. Shediac, B. Hindson, S. Nasrabadi, G. Vrankoviç, P. Bell, C. Bailey, T. Sheppod, A.T. xristian, Biobriefcase-in pcr modulu vasitəsilə axın. Smart Medical and Biomedical Sensor Technology III, Proceedings of the SPIE, Vol. 6007, Proceedings of the SPIE (2005)

P. Belqrad, D. Hansford, G.T. Kovacs, K. Venkateswaran, R. Mariella Jr., F. Milanoviç, S. Nasabadadi, M. Okuzumi, F. Pourahmadi, M.A. Northrup, DNT analizi üçün bakterial sporları sürətlə pozmaq üçün minisonikator Anal. Kimya. 71(19), 4232–4236 (1999). doi: 10.1021/ac990347o

S. Bent, B.K. Nallamotu, D.L. Simel, S.D. Fihn, S. Saint, Bu qadında kəskin fəsadsız sidik yolları infeksiyası varmı? JAMA 287(20), 2701–2710 (2002). doi: 10.1001/jama.287.20.2701

A. Bhattacharyya, C.M. Klapperich, birdəfəlik diaqnostika üçün nuklein turşularının çip üzərində təmizlənməsi üçün termoplastik mikrofluidik cihaz Anal. Kimya. 78(3), 788–792 (2006). doi: 10.1021/ac051449j

R. Boom, C.J. Sol, M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M. Wertheim-van Dillen, J. van der Noordaa, Nuklein turşularının təmizlənməsi üçün sürətli və sadə üsul J. Clin. Mikrobiol. 28(3), 495–503 (1990)

M.C. Breadmore, S. Shrinivasan, K.A. Wolfe, M.E. Power, J.P. Ferrance, B. Hosticka, P.M. Norris, J.P. Landers, Mikroçip əsaslı xromatoqrafik platformaya doğru. 1-ci hissə: Kapilyar elektroxromatoqrafiya üçün sol-gel fazalarının qiymətləndirilməsi Elektroforez 23(20), 3487–3495 (2002). doi:10.1002/1522-2683(200210)23:20<3487::AID-ELPS3487>3.0.CO2-5

M.C. Breadmore, K.A. Wolfe, I.G. Arcibal, W.K. Leung, D. Dickson, B.C. Giordano, M.E.Power, J.P.Ferrance, S.H. Feldman, P.M. Norris, J.P. Landers, bioloji nümunələrdən DNT-nin mikroçip əsasında təmizlənməsi Anal. Kimya. 75(8), 1880–1886 (2003). doi:10.1021/ac0204855

P.D. Brown, A. Freeman, B. Foxman, Prevalence and predictors of trimethoprim-sulfamethoxazole resistance among uropathogenic Escherichia coli isolates in Michigan Clin. Yoluxdurmaq. Dis. 34(8), 1061–1066 (2002). doi:10.1086/339491

X.W. Chen, Z.R. Xu, B.Y. Qu, Y.F. Wu, J. Zhou, H.D. Zhang, J. Fang, J.H. Wang, DNA purification on a lab-on-valve system incorporating a renewable microcolumn with yerində monitoring by laser-induced fluorescence Anal. Bioanal. Kimya. 388(1), 157–163 (2007). doi:10.1007/s00216-007-1196-0

D. Di Carlo, K.H. Jeong, L.P. Lee, Reagentless mechanical cell lysis by nanoscale barbs in microchannels for sample preparation Lab Chip 3(4), 287–291 (2003). doi:10.1039/b305162e

D. Di Carlo, C. Ionescu-Zanetti, Y. Zhang, P. Hung, L.P. Lee, On-chip cell lysis by local hydroxide generation Lab Chip 5(2), 171–178 (2005). doi:10.1039/b413139h

C.J. Easley, J.M. Karlinsey, J.M. Bienvenue, L.A. Legendre, M.G. Roper, S.H. Feldman, M.A. Hughes, E.L. Hewlett, T.J. Merkel, J.P. Ferrance, J.P. Landers, A fully integrated microfluidic genetic analysis system with sample-in-answer-out capability Proc. Natl. akad. Sci. U S A 103(51), 19272–19277 (2006). doi:10.1073/pnas.0604663103

B. Foxman, B. Gillespie, J. Koopman, L. Zhang, K. Palin, P. Tallman, J.V. Marsh, S. Spear, J.D. Sobel, M.J. Marty, C.F. Marrs, Risk factors for second urinary tract infection among college women Am. J. Epidemiol. 151(12), 1194–1205 (2000)

M. Franz, W.H. Horl, Common errors in diagnosis and management of urinary tract infection. I: Pathophysiology and diagnostic techniques Nephrol. yığın. Transplantasiya. 14(11), 2746–2753 (1999). doi:10.1093/ndt/14.11.2746

C.A. Gaydos, M. Theodore, N. Dalesio, B.J. Wood, T.C. Quinn, Comparison of three nucleic acid amplification tests for detection of chlamydia trachomatis in urine specimens J. Clin. Mikrobiol. 42(7), 3041–3045 (2004). doi:10.1128/JCM.42.7.3041-3045.2004

K. Gupta, T.M. Hooton, W.E. Stamm, Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections Ann. Təcrübəçi. Med. 135(1), 41–50 (2001)

C. Hara, C., N., Wheeler, E., Sorensen, K., Arroyo, E., Vrankovich, G., A. Christian, Small sample whole-genome amplification. Smart Medical and Biomedical Sensor Technology III, Proceedings of the SPIE (2005)

T.M. Hooton, R. Besser, B. Foxman, T.R. Fritsche, L.E. Nicolle, Acute uncomplicated cystitis in an era of increasing antibiotic resistance: a proposed approach to empirical therapy Clin. Yoluxdurmaq. Dis. 39(1), 75–80 (2004). doi:10.1086/422145

G.L. Koenig, Viability of and plasmid retention in frozen recombinant Escherichia coli over time: a ten-year prospective study Appl. Ətraf. Mikrobiol. 69(11), 6605–6609 (2003). doi:10.1128/AEM.69.11.6605-6609.2003

J.C. Liao, M. Mastali, V. Gau, M.A. Suchard, A.K. Moller, D.A. Bruckner, J.T. Babbitt, Y. Li, J. Gornbein, E.M. Landaw, E.R. McCabe, B.M. Churchill, D.A. Haake, Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens J. Clin. Mikrobiol. 44(2), 561–570 (2006). doi:10.1128/JCM.44.2.561-570.2006

J.C. Liao, M. Mastali, Y. Li, V. Gau, M.A. Suchard, J. Babbitt, J. Gornbein, E.M. Landaw, E.R. McCabe, B.M. Churchill, D.A. Haake, Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection J. Mol. Diaqnoz. 9(2), 158–168 (2007). doi:10.2353/jmoldx.2007.060052

C. Lindan, M. Mathur, S. Kumta, H. Jerajani, A. Gogate, J. Schachter, J. Moncada, Utility of pooled urine specimens for detection of chlamydia trachomatis and neisseria gonorrhoeae in men attending public sexually transmitted infection clinics in mumbai, india, by pcr J. Clin. Mikrobiol. 43(4), 1674–1677(2005). doi:10.1128/JCM.43.4.1674-1677.2005

T. Poeckh, S. Lopez, A.O. Fuller, M.J. Solomon, R.G. Larson, Adsorption and elution characteristics of nucleic acids on silica surfaces and their use in designing a miniaturized purification unit Anal. Biokimya. 373(2), 253–262 (2008). doi:10.1016/j.ab.2007.10.026

T. Rohr, C. Yu, M.H. Davey, F. Svec, J.M. Frechet, Porous polymer monoliths: Simple and efficient mixers prepared by direct polymerization in the channels of microfluidic chips Electrophoresis 22(18), 3959–3967 (2001). doi:10.1002/1522-2683(200110)22:18<3959::AID-ELPS3959>3.0.CO2-5

T.B. Stachowiak, T. Rohr, E.F. Hilder, D.S. Peterson, M. Yi, F. Svec, J.M. Frechet, Fabrication of porous polymer monoliths covalently attached to the walls of channels in plastic microdevices Electrophoresis 24(21), 3689–3693 (2003). doi:10.1002/elps.200305536

J. Stenman, A. Orpana, Accuracy in amplification Nat. Biotexnol. 19(11), 1011–1012 (2001). doi:10.1038/nbt1101-1011b

A. Tan, S. Benetton, J.D. Henion, Chip-based solid-phase extraction pretreatment for direct electrospray mass spectrometry analysis using an array of monolithic columns in a polymeric substrate Anal. Kimya. 75(20), 5504–5511 (2003). doi:10.1021/ac030196w

H. Tian, A.F. Huhmer, J.P. Landers, Evaluation of silica resins for direct and efficient extraction of DNA from complex biological matrices in a miniaturized format Anal. Biokimya. 283(2), 175–191 (2000). doi:10.1006/abio.2000.4577

M.A. Van Dilla, R.G. Langlois, D. Pinkel, D. Yajko, W.K. Hadley, Bacterial characterization by flow cytometry Science 220(4597), 620–622 (1983). doi:10.1126/science.6188215

H.Y. Wang, P.P. Banada, A.K. Bhunia, C. Lu, Rapid electrical lysis of bacterial cells in a microfluidic device Methods Mol. Biol. 385, 23–35 (2007). doi:10.1007/978-1-59745-426-1_3

K.A. Wolfe, M.C. Breadmore, J.P. Ferrance, M.E. Power, J.F. Conroy, P.M. Norris, J.P. Landers, Toward a microchip-based solid-phase extraction method for isolation of nucleic acids Electrophoresis 23(5), 727–733 (2002). doi:10.1002/1522-2683(200203)23:5<727::AID-ELPS727>3.0.CO2-O


Discussion and conclusions

Sample acquisition and preparation is becoming the most time consuming step in large scale genomic analyses of solid tumors. We have therefore designed, implemented and validated an automated method for the serial extraction of DNA and RNA molecules from tissues of various types, with a particular view to using this method in cancer genomic and transcriptomic studies. The automation solution proposed here enables a high-throughput, cost-effective preparation of samples with minimal hands-on time.

Tissue extraction presents a distinct set of problems not applicable to blood or body fluids. Most extraction methods, in particular with regard to RNA, require a titration of input material to determine the optimal input, to avoid overloading the binding capacity [1]. Here we describe a method that can extract uniformly from a similar amount (approximately 25 mg each) of a variety of input tissue types. The technique produces, on a large scale, nucleic acids of high quality suitable for many downstream processes. The process is suited to a wide variety of tissue types, and has successfully been used to extract more than ten different tumor and normal tissues, including those of the liver, prostate, tonsil, colon, breast, thymus, kidney, skin, uterus and lung (data not shown). The extraction yield and purity is identical with manual extraction using the same chemistry [5]. The method presented here performs well when compared to other established extraction techniques, despite the omission of extensive tissue homogenization steps. (Using a standard phenol-chloroform extraction technique with an overnight Proteinase K digestion on 25 mg of colon tissue resulted in a DNA yield of 0.8 – 1.2 μg as measured on the Nanodrop).

The quality of the extracted biomolecules was validated by several different methods, commonly employed in cancer genetics. The extracted DNA was of high molecular weight with no apparent fragmentation, which is essential in whole genome sequencing approaches. The OD 260:280 ratio (measured by Nanodrop), frequently used as an indication of protein contamination, was within a range suitable for DNA analysis [9]. The OD 260:230 ratio (Nanodrop), used as a measure of the purity of DNA, is slightly low, likely due to the absorbance of residual guanidine at 230 nm [10]. This is inherent to methods using chaotropic lysis buffers. However, the performance of extracted DNA in any of the downstream applications tested was not affected, even when using microarrays known to be sensitive to low OD 260:230 ratios [11]. The concentration of double stranded DNA measured by the fluorometric Qubit method, proved to be a more useful measurement of amplifiable DNA, and compared well with real time PCR amplification of LINE1 elements (data not shown) [12]. The differences between Qubit and Nanodrop measurements may be explained by the fact that the Nanodrop instrument measures both single and double stranded DNA, as well as single nucleotides, giving an overall higher DNA yield than the Qubit method [10]. The performance and uniformity in next-generation sequencing applications was validated by targeted enrichment and sequencing of the exons of 540 genes in 192 tumor and normal colorectal tissue samples (Figure 4). RIN values for RNA extracted from tissue can be variable and depend greatly on the sectioning process and storage conditions prior to extraction [13]. The extracted RNA had RIN values near 7, which is suitable for many techniques used to study RNA, e.g. cDNA generation by RT-PCR and microarray analyses. In fact, values above 5.5 are sufficient for most applications [13]. We noted during development of the process that prior recovery of DNA facilitates RNA recovery, thereby contributing to increased quality of the RNA obtained [5].

Future developments include adapting the method to extraction of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues. In addition, in light of the finding that sample mix up is a common problem in cancer genetic studies (here illustrated by two mismatched pairs out of 96), we have recognized the need for robust and scalable identification methods. An automatable genotyping method for possible incorporation to the process, targeting insertion and deletion polymorphisms has also been developed [14]. Taken together, we have developed a walk-away automation solution to process fresh-frozen tissue specimens to high quality biomolecules ready for use in cancer research and diagnostics. This novel technology enables the simultaneous processing of many different types of tissue samples in the pathology biobank workflow with a time and cost reduction for the user.


Videoya baxın: Göy göyərtinin təbii halda Qışa можно оставить свежие зелены на зиму? (Oktyabr 2022).