Məlumat

Neyronların elektrik aktivliyini ölçməklə öyrənmə və plastikliyin rəqabət aparan molekulyar mexanizmlərini ayırd edə bilərikmi?

Neyronların elektrik aktivliyini ölçməklə öyrənmə və plastikliyin rəqabət aparan molekulyar mexanizmlərini ayırd edə bilərikmi?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən uzunmüddətli plastiklik adlandırdığımız şeyin əsasında duran bir neçə molekulyar və hüceyrə miqyaslı mexanizmlər və struktur dəyişiklikləri haqqında heyranlıqla oxuyuram. Məsələn, [1], [2], [3].

Xüsusilə, ən azı var görünür: sinaptik miqyas, sinaptik budama, sinaptogenez, spinogenez, neyrogenez.

Suallarım:

  1. Yuxarıdakı mexanizmlərin/hadisələrin hər biri klassik hüceyrədənkənar tək/çox vahidli sünbüllərə, postsinaptik potensiallara (LFP) və yerli elektrik sahələrinə necə təsir edir? Sinaps səviyyəsindəki dəyişikliklərdən sünbüllərə və LFP-lərə biofiziki çevrilməni təyin edən mexaniki irəli model mövcuddurmu? Bu xassələri modelləşdirən sünbül simulyatorları varmı?

  2. Belə bir irəli modeldən istifadə edərək, bu LTP/LTD-nin yaratdığı kiçik miqyaslı struktur və funksional dəyişikliklər haqqında heç bir nəticə çıxarmaq üçün statistik tərs problemi həll edə bilərikmi?

  3. Məsələn, təhlilin bir metrikası ola bilər: statistik nöqtə-proses modellərindən istifadə etməklə nəticələnən post-spike-zaman filtrləri (öz-özünə terminlər və çarpaz terminlər). Digəri, adətən yalnız sünbüllərin çeşidlənməsi üçün istifadə edilən və sonra atılan fəaliyyət potensialının forması ola bilər.

  4. Bu xətlər üzrə nəsə görülübmü? Yoxsa mümkünsüzdür? Əgər belədirsə, niyə?

  5. Nəhayət, kimsə bu mexanizmləri xarakterizə etmək üçün istifadə olunan sinaps miqyaslı fizioloji/görüntüləmə üsullarının gamutuna qısa məlumat verə bilsə, mən çox minnətdar olaram!


Sadəcə bura bir az əlavə edirəm. STDP əsasında əlaqədə dəyişiklikləri qiymətləndirmək çətindir http://klab.smpp.northwestern.edu/wiki/images/2/2b/Stevenson_Inferring_Plasticity_2011.pdf

amma bəli - bu suallar böyük bir sahəni məşğul saxlamaq üçün kifayətdir uzun vaxt.


Təşəkkürlər!

Aşağıdakı sətirlər boyu düşünürdüm.

(1) Verilmiş bir şəbəkə daxilində neyronlar üçün kabel tənliklərini yazın: şəbəkənin anatomik quruluşu, dendritlərin, onurğaların, sinapsların və sinaptik güclərin məkan paylanması (irəli model).

(2) Birgə mikroskopiya + elektrofiziologiya məlumat dəstini əldə edin.

(3) İrəli modeli sərbəst parametrlər kimi sinaptik güclərə çevirin.

(4) Zamanla bu ehtimal olunan parametrləri izləyin və ya şərtlər arasında müqayisə edin.


Neyronların elektrik aktivliyini ölçməklə öyrənmə və plastikliyin rəqabət aparan molekulyar mexanizmlərini ayırd edə bilərikmi? - Biologiya

Yuxunun filogenezdə hər yerdə olmasına baxmayaraq, onun funksiyası çətin olaraq qalır. Bu araşdırmada biz bir cəlbedici namizədi nəzərdən keçiririk: yaddaşın işlənməsi ilə əlaqəli beyin plastikliyi. Gəmiricilərdə və insanlarda əsasən hipokampusdan asılı yaddaşa diqqət yetirərək, həm ilkin yaddaşın kodlaşdırılmasına hazırlıqda, həm də yaddaşın sonrakı oflayn konsolidasiyasında yuxunun rolunu müəyyən edən molekulyar, hüceyrə, şəbəkə, bütün beyin və davranış sübutlarını təsvir edirik. Yuxu və yuxunun olmaması sinaptik gücü tənzimləyən və plastisiya ilə əlaqəli gen transkripsiyasını və zülal tərcüməsini idarə edən molekulyar siqnal yollarını iki istiqamətli olaraq dəyişdirir. Hüceyrə səviyyəsində yuxu çatışmazlığı sinaptik potensiyaya səbəb olmaq üçün zəruri olan hüceyrə həyəcanlılığını pozur və sinaptik plastisiyanın uzunmüddətli formalarının çürüməsini sürətləndirir. Bunun əksinə olaraq, sürətli göz hərəkəti (REM) və qeyri-sürətli göz hərəkəti (NREM) yuxusu əvvəllər yaranmış sinaptik potensiyanı artırır, baxmayaraq ki, yuxu zamanı sinaptik de-potensiallaşma da müşahidə edilmişdir. Tək hüceyrə dinamikasından əlavə, geniş miqyaslı hüceyrə ansamblları sonrakı NREM yuxusu zamanı əvvəlki öyrənmə ilə əlaqəli atəş nümunələrinin əlaqələndirilmiş təkrarını ifadə edir. Bütün beyin səviyyəsində insanlarda NREM yuxusu zamanı bir qədər analoji öyrənmə ilə əlaqəli hipokampal (yenidən) aktivasiya bildirilmişdir. Üstəlik, gəmiricilərdə təkrar oynatma ilə əlaqəli eyni kortikal NREM salınımları da insanın hipokampal yaddaşının konsolidasiyasına kömək edir və bu proses yuxu zamanı ekzogen reaktivasiya siqnallarından istifadə etməklə idarə oluna bilər. Gəmiricilərdə molekulyar tapıntıların əks etdirilməsi, kodlaşdırmadan əvvəl xüsusi NREM yuxu rəqsləri insanın hipokampal öyrənmə qabiliyyətini təzələyir, yuxudan məhrum olmaq isə əksinə, sonrakı hipokampal fəaliyyəti və əlaqəli kodlaşdırmanı pozur. Birlikdə, bu çarpaz təsviri səviyyəli tapıntılar yuxunun unikal neyrobiologiyasının həm ilkin öyrənməni, həm də sonrakı uzunmüddətli yaddaşın konsolidasiyasını idarə edən molekulyar, hüceyrə və şəbəkə plastisiya mexanizmlərinə güclü təsir göstərdiyini nümayiş etdirir.


Tapıntılar

Neyronların populyasiyasından elektrik aktivliyini izləmək üçün 2 həftə ərzində MEA üzərində böyüdülmüş dissosiasiya olunmuş neyron kulturalarından istifadə etdik [9]. MEA-lar bütün populyasiyadan hüceyrədənkənar siqnalların sabit və uzunmüddətli qeydlərini (saatlarla günlər) əldə etməyə imkan verir və müəyyən edilmiş neyronlardan tək sünbüllərin xüsusiyyətlərini xarakterizə etməyə və izləməyə imkan verir. Beləliklə, şəbəkənin ümumi elektrik aktivliyi kimi qlobal xüsusiyyətlərini təsvir etmək və tək müəyyən edilmiş sünbüllərin neyron plastikliyi zamanı dəyişikliklərin xarakteristikasını əldə etmək mümkün olmuşdur. Bu analiz hipokampal dilimlər və ya MEA-larda yetişdirilən orqanotipik kulturalarla aparıla bilməz. in vivo, çünki bu hallarda yerli sahə potensialları (LFP) müşahidə edilir və bir sünbül səviyyəsində neyron plastisiyasının ətraflı tədqiqi demək olar ki, mümkün deyil. Hipokampal mədəniyyətləri 30 dəqiqə müalicə etməklə sinaptik effektivliyi və ümumi elektrik aktivliyini artırdıq. GABA iləA reseptor antaqonisti gabazin (GabT). GabT-dən sonra gabazin yuyuldu və evokasiya edilmiş elektrik aktivliyinin zaman kursu izlənildi/öyrənildi. MEA-nın hüceyrədənkənar elektrodları qeyd etmək və stimullaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir, beləliklə, evokasiya edilmiş fəaliyyətin dəyişikliklərini ölçmək üçün. Qısa (200 μs) bipolyar impulslar bir sıra elektrodlara tətbiq olundu (Şəkil ​ Şəkil 1A-nın şəbəkəsindəki qara çubuq 1A ) və evokasiya edilmiş sünbüllərin şəbəkə boyu yayılması qeydə alınıb. Doymanın qarşısını almaq üçün GabT-dən əvvəl, zamanı və sonrasında ən azı bir sıçrayışa səbəb olan ən aşağı gərginlik impulsundan istifadə edilmişdir (Şəkil ​ (Şəkil 1). 1). Onun amplitudası mədəniyyətdən asılı olaraq 200 ilə 450 mV arasında dəyişirdi. GabT-dən sonra tək elektrod səviyyəsində (Şəkil ​ (Şəkil 1B) 1B ) və bütün şəbəkədə (şəkil ​) demək olar ki, bütün sınaqlarda oyanmış sünbüllərin sayı hər zaman artmışdır. 1C 1C).

GabT-nin yaratdığı oyandırılmış cavabın güclənməsi. A, 0,5, 1 və 2 mm məsafədə yerləşən üç təmsil elektrod üçün tək sınaq üçün evokasiya edilmiş fəaliyyətin vaxt kursunun nümunələri (bax. daxil) müvafiq olaraq stimullaşdırıcı elektroddan (qara bar daxil). Uyarılan sünbüllərin sayı GabT-dən sonra artır. Hipokampal kulturalar ən aşağı intensivliklə (200º13450 mV) stimullaşdırılaraq reaksiya doğurdu. Nəbzlərarası interval 4s olan 40 impuls (sınaq) istifadə edilmişdir. MEA şəbəkəsinin daxili, qrafik təsviri. Hər kvadrat bir elektrodu təmsil edir. Elektrodlar arasındakı məsafə 500 μm-dir. Qara çubuq stimullaşdırılmış elektrodlara, boz nömrəli kvadratlar isə aktivliyi göstərilən elektrodlara uyğun gəlir (A). B, Hər bir zaman nöqtəsində təhlil edilən bir elektrodda yaranan sünbüllərin rastr qrafikləri. Hər bir üfüqi xətt stimulun başlamasından sonra 250 ms-ə qədər qeydə alınmış bir sınaq üçün cavabı təmsil edir. C, NFR-nin vaxt kursu. Oyanan sünbüllərin ümumi sayı elektrik stimullaşdırılmasından sonra 10 ms qutularda hesablandı. Uyarılan sünbüllərin artması stimullaşdırmadan sonrakı ilk 100 ms-də xüsusilə nəzərə çarpır. Tək bir təcrübədən əldə edilən məlumatlar (A-C). D, NFR-nin orta vaxt kursu (n = 5 mədəniyyət). NFR nəzarət dəyərlərinə nisbətən normallaşdırıldı. Bin ölçüsü 250 ms idi. E, Nəzarət şəraitində on üst-üstə düşən sünbül izləri (qara izlər) və fərdi elektrodun gabazin yuyulmasından 3 saat sonra (qırmızı izlər) ilk evoked sünbülün gecikmə müddətinin azaldığını göstərir. Aydınlıq üçün artefaktlar kəsilib. F, GabT-dən sonra gecikmə və titrənin azaldığını göstərən üç neyron üçün ilk sünbülün gecikmə (mavi izlər) və titrəmə (qırmızı izlər) vaxt kursu. Hər bir simvol fərqli bir neyrona uyğundur. G, GabT-dən sonra aktivliyin yayılmasının artmasını göstərən yayılma sabitinin zaman kursu (λ Metodlara baxın). Daxil edilmiş, 100 ms vaxt pəncərəsindəki sünbüllərin sayı, elektrodların stimullaşdırılmış çubuğundan 0,5, 1 və 2 mm məsafədə yerləşən elektrodlar üçün hesablanmış və orta hesablanmış və eksponensial funksiya ilə təchiz edilmişdir. Ae -d/λ (boz xətt). Şəkildəki kimi rənglər (E).

Uyarılan reaksiyanın dəyişiklikləri, stimulun başlanğıcından 100 ms-lik bir zaman pəncərəsində oyanmış sıçrayışların ümumi sayını hesablamaqla ölçüldü, o, evokasiya edilmiş cavab NFR-nin şəbəkə atəş sürəti olaraq adlandırıldı. NFR GabT-dən sonra 1 ilə 6 saat arasında əhəmiyyətli dərəcədə artdı (Şəkil 1C, D): oyandırılan cavab GabT-dən 3 saat sonra maksimum gücləndi və 6 saatdan sonra azalmağa başladı, GabT-dən 24 saat sonra nəzarət səviyyəsinə yaxınlaşdı.

GabT-nin yaratdığı neyron plastisiya təkcə sinaptik effektivliyi dəyişdirmədi, həm də evokasiya edilmiş sünbüllərin sürəti və etibarlılığı kimi bir sıra digər şəbəkə xüsusiyyətlərini də dəyişdirdi. Sürət evokasiya edilmiş cavabın gecikmə müddətini, yəni oyanmış sünbülün stimulundan gecikməni ölçməklə, etibarlılıq isə gecikmənin standart sapması (jitter) ilə ölçüldü. Bəzi təcrübələrdə eyni neyron tərəfindən istehsal olunan sünbülləri müəyyən etmək mümkün oldu (Şəkil ​ (Şəkil 1E) 1E) və buna görə də biz neyronların plastikliyi zamanı onun gecikmə və titrəyişinin necə dəyişdiyini ölçə bildik. Stimulun başlanğıcından nəzarət şəraitində gecikmə 6 ilə 9 ms arasında dəyişdi, GabT-dən sonra 2 ms azaldı və onun titrəməsi də eyni şəkildə azaldı (Şəkil ​ (Şəkil 1F). 1F). Biz həmçinin evokasiya edilmiş fəaliyyətin λ boşluq sabitini (qıcıqlanandan olan məsafənin funksiyası kimi oyanmış sünbüllərin ümumi sayı) ölçməklə şəbəkədə sünbüllərin necə yayıldığını təhlil etdik. 4 mədəniyyətdən toplanmış məlumatlar göstərdi ki, λ GabT-dən sonra 1 saat ərzində təxminən 25% artıb və 24 saata qədər nəzarət dəyərlərindən daha böyük qalıb (Şəkil ​ (Şəkil 1G). 1G). Bu nəticələr göstərir ki, eyni vaxtda güclü və ya tetanik elektrik stimulyasiyası olmadıqda, tək gabazinin təsiri ilə sinaptik effektivliyin artması, kulturada yayılan elektrik reaksiyasını gücləndirdi və bu şəkildə LTP formasını induksiya etdi, biz bunu orta vaxt adlandırırıq. LTP (M-LTP), gabazinin çıxarılmasından sonra maksimal olaraq təyin olunmadığı üçün, GabT-dən 1 saat sonra inkişaf etdi və təxminən 6 saat davam etdi. Buna görə də, M-LTP, çox güman ki, təkcə yerli zülal alveri ilə deyil, həm də bir neçə saatlıq zaman miqyasında baş verən gen ifadəsi dəyişiklikləri ilə əlaqələndirilir. M-LTP-nin altında yatan molekulyar hadisələri başa düşmək üçün biz eyni farmakoloji müalicənin, yəni 30 dəq. Affymetrix mikroarrayları (RAT 230_2.0 Gen Çipi) ilə gabazinə məruz qalma (Broccard və başqaları, əlyazma hazırlanır). Uyarılan elektrik aktivliyinin gücləndiyi vaxtla eyni vaxtda əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimlənən 342 geni müəyyən etdik. Buna baxmayaraq, gen profilləri bütün mədəniyyətdən əldə edildiyi üçün yuxarı tənzimlənən genlərin ifadə edildiyi neyronların növünü müəyyən edə bilmədik. Bu genlərin çoxu LTP kimi tanınmış oyunçulardır Bdnf və onun reseptoru TrkB [11], qövs [12], Egr1 [13] və Homer 1 [14]. Müəyyən edilmiş genlərin böyük əksəriyyətinin LTP-nin induksiyası və saxlanmasının əsasını təşkil etdiyini və onların aktivləşdirilməsinin neyron plastisiyasını təşkil etdiyini fərz etdik. Əslində, PuBMed verilənlər bazasında aparılan axtarış göstərir ki, 284 annotasiya edilmiş genin 40%-i LTP ilə əlaqəli sinaptik güc dəyişikliklərində iştirak edir və ya ola bilər. 43 gen artıq LTP-də iştirak etmiş, 25 gen kimi təsnif edilmişdir Struktur genlər Hüceyrə funksiyasındakı struktur rolu və onların yuxarı tənzimlənməsi LTP ilə əlaqəli struktur və morfoloji dəyişikliklərin əsasını təşkil edə bilər. Analoji olaraq, 25 Pre-sinaptik və 24 Postsinaptik skrininqimizdə tapılan genlər LTP zamanı baş verən sinaptik xüsusiyyətlərin dəyişməsinə vasitəçilik edə bilər.

ERK1/2 siqnalı sinir sistemində plastisiya ilə bağlı bir sıra proseslərdə mühüm rol oynayır [15]. Buna görə də, biz PD98059 və U0126 tərəfindən ERK1/2 yolunun inhibəsinin oyanmış cavabın potensiyasına təsirini araşdırdıq (Şəkil ​ (Şəkil 2). 2). Bu inhibitorların neyron mədəniyyətlərinə tətbiqi bütün hüceyrədənkənar elektrodlar üçün ölçülən kortəbii aktivliyi azaldır (Şəkil ​ (Şəkil 2A). 2A). Şəbəkənin atəş sürəti bütün sınaqdan keçirilmiş mədəniyyətlərdə (n = 4) demək olar ki, iki dəfə azaldı (Şəkil ​ (Şəkil 2B) 2B), lakin daha böyük elektrik aktivliyi dövrləri hələ də müşahidə edilə bilər. Bu mədəniyyətlərdə ERK1/2 inhibitorları GabT-dən əvvəl 45 dəqiqə inkubasiya edilmiş və oyandırılmış cavab dəyişiklikləri təhlil edilmişdir. Bu inhibitorların iştirakı ilə GabT hələ də oyandırılmış cavabı gücləndirdi, baxmayaraq ki, bu inhibitorların olmadığı zaman müşahidə olunan vaxta bənzər bir zaman kursu ilə daha az dərəcədə (Şəkil ​ Fig.2C-də qırmızı iz), 2C (Şəkil ​ Fig.2C-də qara iz). 2C). GabT-dən 3 saat sonra oyanmış sünbüllərin sayı normal şəraitdə 198 º 41 % -ə çatdı, lakin PD98059 və U0126-nın mövcudluğunda yalnız 39 º 15 % artdı. Buna görə də, ERK1/2 yolunun inhibəsi GabT-nin yaratdığı oyandırılmış reaksiyanın potensialını azaltdı, lakin ləğv etmədi.

ERK1/2 yolunun inhibitorlarının təsiri. A, Nəzarət şəraitində (solda) və 50 μM PD98059 (sağda) mövcudluğunda iki fərdi hüceyrədənkənar elektroddan nümayəndə izləri. B, Normal şəraitdə (solda) və PD98059 tərəfindən kortəbii elektrik fəaliyyətinin depressiyasını göstərən 50 º003bcM PD98059 (sağda) mövcud olduqda 25 ms eni ilə hesablanmış müvafiq şəbəkə atəş sürəti. Nöqtəli xətt sıfır sünbül göstərir. C, ERK1/2 yolu GabT-dən əvvəl bağlandıqda oyandırılan fəaliyyət hələ də güclənir (Nəticələrə baxın). Kəsik xətt, GabT-dən əvvəl ERK1/2 yolunu bloklamadan evokasiya edilmiş fəaliyyətin gücləndirilməsinə uyğundur. PD98059 (50 μM n = 3) və U0126 (20 μM n = 3) üçün məlumatlar eyni şəkildə şəbəkə xassələrinə təsir göstərdiyi üçün birlikdə birləşdirildi. D, Real-Time PCR ilə ölçülən GabT-dən 1,5 saat sonra baş verən gen ifadəsində dəyişikliklər Egr1, Egr2, Egr3, Nr4a1, Bdnf, Homer1aqövs gabazin və PD98059 (boz çubuqlar) varlığında, tək gabazinin (qara çubuq) iştirakı ilə normallaşdırılmış ifadəyə nisbətən.

Biz real vaxt PCR ilə ERK1/2 inhibitorlarının mikroarray skrininqimizdə yuxarı tənzimlənən LTP ilə əlaqəli bəzi genlərə təsirini təhlil etdik: Egr1 [13],Egr2 [16],Egr3 [17],Nr4a1 [18],Bdnf [11],Homer1a [14] və qövs [12]. Şəkil ​ Şəkil 2D, 2D-də göstərildiyi kimi, EGR ailəsinin genlərinin GabT tərəfindən induksiya edilən yuxarı tənzimlənməsi, Nr4a1qövs əhəmiyyətli dərəcədə azaldı və demək olar ki, ERK1/2 yolunun inhibitorları tərəfindən bloklandı, lakin yuxarı tənzimləmə deyil. BdnfHomer1a.

Hazırkı tədqiqatda təsvir edilən nəticələr göstərir ki, GabT-dən sonra evokasiya edilmiş elektrik aktivliyinin güclənməsi orta vaxtlarda (M-LTP) baş verir. Kimyəvi induksiya edilmiş LTP-nin bu formasının şəbəkədə mövcud olan sinapsların böyük əksəriyyətini dəyişdirəcəyi və buna görə də onun qlobal xüsusiyyətlərinə təsir edəcəyi gözlənilir. LTP yerli elektrik stimullaşdırılması ilə induksiya edildikdə, yalnız məhdud sayda sinapsların dəyişdirilməsi gözlənilir.

Şəkil ​ Fig.2, 2-də göstərildiyi kimi, M-LTP-nin potensialı azaldı, lakin ERK1/2 yolunun inhibitorları tərəfindən aradan qaldırılmadı, neyron plastisiyasının bir neçə fərqli yol ilə vasitəçilik etdiyi anlayışı ilə razılaşaraq. birlikdə işləmək. Bu nəticələr bizə neyronların plastikliyi zamanı baş verən elektrik xassələrindəki dəyişiklikləri konkret əsas molekulyar hadisələrlə əlaqələndirməyə imkan verdi.

MEA və DNT mikroarraylarını birləşdirən hazırkı analiz neyronların plastisiyasını öyrənmək üçün sadə sistemi təmsil edir [4], lakin gen ifadəsində aşkar edilmiş dəyişikliklərin hüceyrə mənşəyini müəyyən etməyə imkan vermir. Hipokampal mədəniyyətlərdə və kəskin dilimlərdə piramidal neyronların çoxluğunu nəzərə alsaq, çox güman ki, bu neyronlarda aşkar edilmiş gen ifadə dəyişiklikləri baş verir, lakin onların interneyronlarda və qlial hüceyrələrdə də baş verməsi mümkündür. Bu problemi həll etmək üçün bütöv hipokampusda tək hüceyrəli gen profilini aparmaq lazımdır. Laboratoriyamızda pozulmamış orqanotipli dilimlərdə aparılan ilkin təcrübələr göstərir ki, gabazinlə müalicə dissosiasiya edilmiş mədəniyyətlərdə gen ifadəsində çox oxşar dəyişikliklərə səbəb olur, burada istifadə edilənlər və orijinal fizioloji əlaqəni qoruyan neyron dilimlərində.


İstinadlar

Marder, E. & amp Thirumalai, V. Neyromodulyasiyanın hüceyrə, sinaptik və şəbəkə təsirləri. Neyron şəbəkəsi. 15, 479–493 (2002).

Abbott, L. F. & amp Nelson, S. B. Sinaptik plastiklik: heyvanı ram etmək. Təbiət nevrologiyası. 3 (əlavə), 1178–1183. (2000).

Sjostrom, P. J. və Nelson, S. B. Spike vaxtı, kalsium siqnalları və sinaptik plastiklik. Curr. Rəy. Neyrobiol. 12, 305–314 (2002).

Kandel, E. R. Yaddaş saxlanmasının molekulyar biologiyası: genlər və sinapslar arasında dialoq. Elm 294, 1030–1038 (2001).

Martin, K. C. və Kosik, K. S. Sinaptik etiketləmə - bu kimdir? Təbiət Rev. Neurosci. 3, 813–820 (2002).

Dayan, P. & amp Abbott, L. F. in Nəzəri Nevrologiya (MIT, Cambridge, 2001).

Marder, E., Abbott, L. F., Turrigiano, G. G., Liu, Z. & Golowasch, J. Daxili membran cərəyanlarının dinamikasından yaddaş. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 93, 13481–13486 (1996).

Zhang, W. & amp Linden, D. J. Engramın digər tərəfi: neyronların daxili həyəcanlılığında təcrübəyə əsaslanan dəyişikliklər. Təbiət Rev. Neurosci. 4, 885–900 (2003).

Daoudal, G. & amp Debanne, D. Daxili həyəcanlılığın uzunmüddətli plastikliyi: öyrənmə qaydaları və mexanizmləri. Öyrən. Mem. 10, 456–465 (2003).

Prinz, A. A., Abbott, L. F. & amp Marder, E. Dinamik sıxac yaşlanır. Trendlər Neurosci. 27, 218–224 (2004).

Sharp, A. A., Skinner, F. K. & amp Marder, E. Dinamik sıxacda salınma mexanizmləri iki hüceyrəli yarım mərkəzli sxemlər qurdular. J. Neyrofiziol. 76, 867–883 (1996).

Cajal, R.S. Histologie du Système Nerveux de l'Homme və Vertébrés (Maloine, Paris, 1909).

Rall, W. Sinaptik girişin müxtəlif soma-dendritik paylanması üçün hesablanmış nəzəri sinaptik potensialların fərqləndirilməsi. J. Neyrofiziol. 30, 1138–1168 (1967).

Rall, W. Zaman sabitləri və membran silindrlərinin və neyronların elektrotonik uzunluğu. Biofiz. J. 9, 1483–1508 (1969).

Rall, W. & amp Rinzel, J. Branch giriş müqaviməti və dendritik neyron modelinin bir qoluna daxil olmaq üçün sabit zəifləmə. Biofiz. J. 13, 648–687 (1973).

Johnston, D., Magee, J. C., Colbert, C. M. & Cristie, B. R. Neyron dendritlərinin aktiv xüsusiyyətləri. Annu. Rev. Neurosci. 19, 165–186 (1996).

Migliore, M. & Shepherd, G. M. Aktiv dendritik keçiriciliklərin paylanması üçün yaranan qaydalar. Təbiət Rev. Neurosci. 3, 362–370 (2002).

Yuste, R. & Tank, D. W. Cajaldan bir əsr sonra məməlilərin neyronlarında dendritik inteqrasiya. Neyron 16, 701–716 (1996).

Stuart, G., Spruston, N. & Hausser, M. dendritlər (MIT, Cambridge, Massachusetts, 2000).

Schwindt, P. C. & amp Crill, W. E. Neokortikal neyronların apikal dendritində davamlı natrium keçiriciliyi ilə sinaptik cərəyanın gücləndirilməsi. J. Neyrofiziol. 74, 2220–2224 (1995).

Magee, J. C. Dendritic Ih, hipokampal CA1 neyronlarında müvəqqəti toplamanı normallaşdırır. Təbiət nevrologiyası. 2, 508–514 (1999).

Williams, S. R. & amp Stuart, G. J. EPSP vaxt kursunun sayt müstəqilliyi neokortikal piramidal neyronlarda dendritik I(h) tərəfindən vasitəçilik olunur. J. Neyrofiziol. 83, 3177–3182 (2000).

Magee, J. C. & amp Johnston, D. Hipokampal neyronlarda Hebbian plastikliyi üçün sinaptik olaraq idarə olunan, assosiativ siqnal. Elm 275, 209–213 (1997).

Markram, H., Lübke, J., Frotscher, M. & Sakmann, B. Postsinaptik AP-lərin və EPSP-lərin təsadüfi ilə sinaptik effektivliyin tənzimlənməsi. Elm 275, 213–215 (1997).

Hines, M. L. və Carnevale, N. T. NEURON simulyasiya mühiti. Neyron hesablama. 9, 1179–1209 (1997).

Koch, C. & Segev, I. Neyron modelləşdirmə üsulları (MIT, Cambridge, 1998).

Bower, J. & Beeman, D. GENESIS Kitabı (Springer, Berlin, 1994).

Golding, N. L., Staff, N. P. & Spruston, N. Dendritic tırmanışları kooperativ uzunmüddətli gücləndirmə mexanizmi kimi. Təbiət 418, 326–331 (2002).

Turrigiano, G. G. & amp Nelson, S. B. İnkişaf etməkdə olan sinir sistemində homeostatik plastiklik. Təbiət Rev. Neurosci. 5, 97–107 (2004).

Marder, E. & amp Prinz, A. A. Neyron və şəbəkə funksiyasında sabitliyin modelləşdirilməsi: homeostazda fəaliyyətin rolu. Bioesselər 24, 1145–1154 (2002).

Turrigiano, G. G., Leslie, K. R., Desai, N. S., Rutherford, L. C. & Nelson, S. B. Neokortikal neyronlarda kvant amplitüdünün fəaliyyətdən asılı miqyası. Təbiət 391, 892–896 (1998).

Desai, N. S., Ruterford, L. C. və Turrigiano, G. G. Kortikal piramidal neyronların daxili həyəcanlılığında plastiklik. Təbiət nevrologiyası. 2, 515–520 (1999).

Goldman, M. S., Golowasch, J., Marder, E. & Abbott, L. F. Qlobal struktur, möhkəmlik və neyron modellərinin modulyasiyası. J. Nevrosci. 21, 5229–5238 (2001).

MacLean, J. N., Zhang, Y., Johnson, B. R. & Harris-Warrick, R. M. Ritmik olaraq aktiv neyronlarda fəaliyyətdən asılı olmayan homeostaz. Neyron 37, 109–120 (2003).

Golowasch, J., Abbott, L.F. & amp Marder, E. Crabın stomatogastric ganglionunun müəyyən edilmiş bir neyronunda kalium cərəyanlarının fəaliyyətdən asılı tənzimlənməsi Xərçəng borealis. J. Nevrosci. 19, RC33 (1999).

Selverston, A. I. Mərkəzi model generatorları başa düşüləndirmi? Davranış. Beyin Elmi. 3, 535–571 (1980).

Getting, P. A. Neyron şəbəkələrinin işini tənzimləyən yaranan prinsiplər. Annu. Rev. Neurosci. 12, 185–204 (1989).

Friesen, W. O. Qarşılıqlı inhibə: salınan heyvan hərəkətlərinin altında yatan bir mexanizm. Nevroloq. Biodavranış. Rev. 18, 547–553 (1994).

Vanq, X.-J. & Rinzel, J. Qarşılıqlı inhibitor model neyronlarda alternativ və sinxron ritmlər. Neyron hesablama. 4, 84–97 (1992).

Van Vreeswijk, C., Abbott, L. F. & amp Ermentrout, G. B. Inhibe olmadıqda həyəcanlanma sinir atışını sinxronlaşdırır. J. Comput. Nevroloq. 1, 313–321 (1994).

White, J. A., Chow, C. C., Ritt, J., Soto-Trevino, C. & Kopell, N. Heterojen, qarşılıqlı inhibe edilmiş neyronlarda sinxronizasiya və salınım dinamikası. J. Comput. Nevroloq. 5, 5–16 (1998).

Marder, E. & amp Calabrese, R. L. Ritmik motor nümunəsinin yaradılması prinsipləri. Fiziol. Rev. 76, 687–717 (1996).

Nusbaum, M. P. & amp Beenhakker, M. P. Motor nümunəsinin yaradılmasına kiçik sistemli yanaşma. Təbiət 417, 343–350 (2002).

Harris-Warrick, R. M. et al. Xərçəngkimilərin pilorik şəbəkəsində dopamin modulyasiyasının paylanmış təsirləri. Ann. N Y Akad. Sci. 860, 155–167 (1998).

Katz, P. S. və Frost, W. N. Daxili neyromodulyasiya: neyron dövrələrini içəridən dəyişdirmək. Trendlər Neurosci. 19, 54–61 (1996).

Steriade, M., Jones, E. G. & amp McCormick, D. A. Talamus (Elsevier, Amsterdam, 1997).

Destexhe, A. & amp Sejnowski, T. J. Talamokortikal yavaş dalğa salınımlarının altında yatan membran keçiricilikləri arasında qarşılıqlı əlaqə. Fiziol. Rev. 83, 1401–1453 (2003).

McCormick, D. A. Talamokortikal emalın xolinergik və noradrenerjik modulyasiyası. Trendlər Neurosci. 12, 215–221 (1989).

Mountcastle, V. B. in Neyrologiya: Dördüncü Tədqiqat Proqramı (eds Schmidt, F. O. & Worden, F. G.) 21-42 (MIT Press, Cambridge, 1979).

Hubel, D.H. & Wiesel, T.N. Pişikin zolaqlı korteksindəki sütunların forması və düzülüşü. J. Fiziol. 165, 559–568 (1963).

Douglas, R. J. & amp Martin, K. A. Pişiklərin vizual korteksi üçün funksional mikrosxem. J. Fiziol. 440, 735–769 (1991).

Szentagothai, J. Sinir mərkəzlərinin modul memarlıq prinsipi. Rev. Physiol. Biokimya. Farmakol. 98, 11–61 (1983).

Barlow, H. in Vizual korteksin modelləri (red. Rose, D. & Dobson, V.) 37-46 (Wiley, Chichester, 1985).

Braitenberg, V. & Schuz, A. Korteks: neyron əlaqənin statistikası və həndəsəsi (Springer, Berlin, 1998).

Destexhe, A., Rudolph, M. & Pare, D. Neokortikal neyronların yüksək keçiricilik vəziyyəti in vivo. Təbiət Rev. Neurosci. 4, 739–751 (2003).

Ho, N. & amp Destexhe, A. Sinaptik fon fəaliyyəti neokortikal piramidal neyronların həssaslığını artırır. J. Neyrofiziol. 84, 1488–1496 (2000).

Wiesenfeld, K. & Moss, F. Stokastik rezonans və səs-küyün faydaları: buz dövründən xərçəngkimilərə və SQUID-lərə qədər. Təbiət 373, 33–36 (1995).

Chance, F. S., Abbott, L. F. & Reyes, A. D. Fon sinaptik girişindən modulyasiya qazanın. Neyron 35, 773–782 (2002).

Shu, Y., Hasenstaub, A., Badoual, M., Bal, T. & amp McCormick, D. A. Sinaptik fəaliyyətin barajları kortikal neyronların qazancını və həssaslığını idarə edir. J. Nevrosci. 23, 10388–10401 (2003).

Rudolph, M. & Destexhe, A. Neokortikal neyronlar üçün sürətli keçirici, stoxastik inteqrativ rejim. in vivo. J. Nevrosci. 23, 2466–2476 (2003).

Wei, D. S. və başqaları. Hipokampal piramidal neyronlarda terminal dendritlərin bölməli və ikili davranışı. Elm 293, 2272–2275 (2001).

Shepherd, G. M. & Brayton, R. K. Məntiq əməliyyatları həyəcanlı dendritik tikanlar arasında kompüterlə simulyasiya edilmiş qarşılıqlı təsirlərin xassələridir. Nevrologiya 21, 151–165 (1987).

Mel, B. W. Dendritik ağaclarda məlumatların işlənməsi. Neyron hesablama. 6, 1031–1085 (1994).

Softky, W. Aktiv dendritik ağaclarda sub-millisecond təsadüf aşkarlanması. Nevrologiya 58, 13–41 (1994).

Shalden, M. N. & amp Newsome, W. T. Kortikal neyronların dəyişən boşalması: əlaqə, hesablama və məlumat kodlaşdırması üçün təsirlər. J. Nevrosci. 18, 3870–3896 (1998).

Moore, G. P., Perkel, D. H. & Segundo, J. P. Neyron sünbül məlumatlarının statistik təhlili və funksional şərhi. Annu. Rev. Physiol. 28, 493–522 (1966).

Rao, R., Olshausen, B. & Lewicki, M. Beynin Ehtimal Modelləri (MIT, Cambridge, 2002).

Hopfield, J. J. Neyron şəbəkələri və meydana çıxan kollektiv hesablama qabiliyyətləri olan fiziki sistemlər. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 79, 2554–2558 (1982).

Roskies, A. Məcburi problem: xüsusi buraxılış. Neyron 24, 7–125 (1999).

von der Malsburg, C. & Schneider, W. Sinir kokteyl partiyası prosessoru. Biol. Kibern. 54, 29–40 (1986).

Engel, A. K., Fries, P. & Singer, W. Dinamik proqnozlar: yuxarıdan aşağıya emalda salınımlar və sinxroniya. Təbiət Rev. Neurosci. 2, 704–716 (2001).

Abeles, M. Kortikoniklər: Serebral korteksin neyron dövrələri (Cambridge University Press, Cambridge, 1991).

Rudolph, M. & Destexhe, A. Paylanmış səs-küy mənbələri ilə sinir sistemlərində korrelyasiya aşkarlanması və rezonans. Fizik. Rev. Lett. 86, 3662–3665 (2001).

Barlow, H. B. in Sensor Kommunikasiyalar (red. Rosenblith, W.) Ch. 13, 217–234 (MIT, Cambridge, 1961).

Barlow, H. & amp Foldiak, P. in Hesablama Neyronu Ç. 4 (red. Durbin, R., Miall, C. & amp G, M.) 54-72 (Addison-Wesley, New York, 1989).

Srinivasan, M. V., Laughlin, S. B. & Dubs, A. Proqnozlaşdırıcı kodlaşdırma: retinada inhibənin yeni bir görünüşü. Proc. R. Soc. London. B 216, 427–459 (1982).

Ito, M. Serebellar uzunmüddətli depressiya: xarakteristikası, siqnal ötürülməsi və funksional rollar. Fiziol. Rev. 81, 1143–1195 (2001).

Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y. & Grant, K. Beyincik kimi strukturda sinaptik plastisiya müvəqqəti nizamdan asılıdır. Təbiət 387, 278–281 (1997).

Foldiak, P. Yerli anti-Hebbian öyrənmə ilə seyrək nümayəndəliklərin formalaşdırılması. Biol. Kibern. 64, 165–170 (1990).

Wang, X. J., Liu, Y., Sanchez-Vives, M. V. & amp McCormick, D. A. Birincil vizual korteksdəki tək neyronlar tərəfindən uyğunlaşma və müvəqqəti dekorasiya. J. Neyrofiziol. 89, 3279–3293 (2003).

Goldman, M. S., Maldonado, P. & amp Abbott, L. F. Stokastik depressiv sinapslarla ehtiyatların azaldılması və davamlı atəş. J. Nevrosci. 22, 584–591 (2002).

Peters, A. & Yılmaz, E. Pişik vizual korteksinin 17-ci sahəsində neyron təşkilatı. Cereb. Cort. 3, 49–68 (1993).

Olshausen, B. A. & amp Field, D. J. Təbii şəkillər üçün seyrək kodu öyrənməklə sadə hüceyrə reseptiv sahə xüsusiyyətlərinin yaranması. Təbiət 381, 607–609 (1996).

Perez-Orive, J. et al. Göbələk gövdəsində qoxu təmsillərinin salınması və seyrəkləşməsi. Elm 297, 359–365 (2002).

Hahnloser, R. H., Kozhevnikov, A. A. & Fee, M. S. Nəğmə quşunda sinir ardıcıllığının yaranmasının əsasını ultra seyrək kod təşkil edir. Təbiət 419, 65–70 (2002).

Baranyi, A. & Feher, O. Pişiyin motor korteksində sinaptik ötürülmənin şərti dəyişiklikləri. Exp. Brain Res. 33, 283–298 (1978).

Kirkwood, A. & amp Bear, M. F. Vizual korteksdə Hebbian sinapsları. J. Nevrosci. 14, 1634–1645 (1994).

Tomson, A. M. Mərkəzi sinapslarda asanlaşdırma, gücləndirmə və gücləndirmə. Trendlər Neurosci. 23, 305–312 (2000).

Hebb, D.O. Davranışın təşkili (Wiley, New York, 1949).

Gupta, A., Wang, Y. & amp Markram, H. Neokorteksdə GABAergic interneurons və sinapsların müxtəlifliyi üçün təşkili prinsipləri. Elm 287, 273–278 (2000).

Silberberg, G., Gupta, A. & Markram, H. Neokortikal mikrosxemlərdə stereotiplər. Trendlər Neurosci. 25, 227–230 (2002).

Buonomano, D. V. & amp Merzenich, M. M. Müvəqqəti məlumat real xassələrə malik neyron şəbəkəsi tərəfindən məkan koduna çevrilir. Elm 267, 1028–1030 (1995).

Maass, W., Natschlager, T. & Markram, H. Stabil vəziyyətlər olmadan real vaxt hesablamaları: pozğunluqlara əsaslanan sinir hesablamaları üçün yeni çərçivə. Neyron hesablama. 14, 2531–2560 (2002).

Monier, C., Chavane, F., Baudot, P., Graham, L. J. & Fregnac, Y. Vizual kortikal neyronlarda sinaptik girişlərin oriyentasiyası və istiqamət seçiciliyi: müxtəlif birləşmələr sünbül tənzimləməsini yaradır. Neyron 37, 663–680 (2003).

Steriada, M. və McCarley, R. W. Oyanma və Yuxunun Beyin Gövdəsinə Nəzarət (Plenum, Nyu-York, 1990).

Bear, M. F. & Singer, W. Asetilkolin və noradrenalin ilə vizual kortikal plastikliyin modulyasiyası. Təbiət 320, 172–176 (1986).

Shulz, D. E., Sosnik, R., Ego, V., Haidarliu, S. & Ahissar, E. Dövlətdən asılı öyrənmənin neyron analoqu. Təbiət 403, 549–553 (2000).

Stickgold, R., Hobson, J. A., Fosse, R. & Fosse, M. Yuxu, öyrənmə və yuxular: oflayn yaddaşın yenidən işlənməsi. Elm 294, 1052–1057 (2001).

Hinton, G. E., Dayan, P., Frey, B. J. & Neal, R. M. Nəzarət olunmayan neyron şəbəkələri üçün 'oyan-yuxu' alqoritmi. Elm 268, 1158–1161 (1995).

Fregnac, Y. in Beyin Nəzəriyyəsi və Sinir Şəbəkələri Təlimatları (red. Arbib, M. A.) 515–522 (MIT, Cambridge, 2002).


Müzakirə

Hərtərəfli elektrofizioloji tədqiqat, hesablama modelləşdirmə və molekulyar analiz apararaq, hiperpolyarizasiya ilə aktivləşdirilmiş siklik nukleotid qapılı (HCN) və T tipli kalsiumun (Ca)V3) kanallar, ilkin dissosiasiya olunmuş neyronların, eləcə də xroniki fəaliyyətdən məhrumetmə nəticəsində yaranan hipokampal orqanotip dilim kulturalarının homeostatik plastikliyində mühüm rol oynayır.

Əvvəlki araşdırmalar göstərdi ki, bu kanallar normal şəraitdə sinaptik inteqrasiyanı və daxili həyəcanlılığı tənzimləyir və patoloji şəraitdə, xüsusən də epilepsiya zamanı disfunksional şəbəkə fəaliyyətinə kömək edir 26 – 29 . Bu işdə biz h- və T-cərəyanlarının 48 saat TTX müalicəsindən sonra homeostatik uyğunlaşmalar zamanı yuxarı tənzimləndiyini sübut edirik. Məlumatlarımız göstərir ki, HCN və T tipli kalsium kanallarının bütün alt bölmələri ilkin dissosiasiya olunmuş hipokampal mədəniyyətlərdə mövcuddur. Sünbül vasitəsilə ötürülmənin bloklanması Ca artmışdırV3.1 mRNT ifadəsi, lakin biz subunit zülalının miqdarında və ya plazma membranının lokalizasiyasında dəyişiklik aşkar etmədik. Qeyd etmək lazımdır ki, mRNA səviyyələrindəki dəyişikliklər funksional protein ifadəsinin 30 birbaşa korrelyasiyası kimi şərh edilə bilməz. Buna baxmayaraq, mümkün bir izahat budur ki, T tipli Ca kanallarının məkanda yenidən bölüşdürülməsi və/və ya post-tərcümə modifikasiyası homeostatik bir şəkildə induksiya edilmişdir ki, bu da T tipli kanal keçiriciliklərinin artmasına və xarakterik fizioloji imza olan daha böyük rebound potensialının yaradılmasına səbəb olur. T tipli Ca cərəyanlarının.

HCN kanallarının daxili həyəcanlılığa təsiri bir qədər iki yönlüdür: bir tərəfdən, HCN kanalları dendritik postsinaptik cərəyanların manevrləri vasitəsilə həyəcanlandırıcı postsinaptik potensialın (EPSP) cəmlənməsini azaldır 31, 32. Digər tərəfdən, onlar istirahət membranının (RMP) potensialının depolarizasiyasına kömək edirlər 10 . Bundan əlavə, Dyhrfjeld-Johnsen et al. 33 göstərdi ki, qızdırma səbəb olan qıcolmalar zamanı Ih epilepsiyaya səbəb ola bilən dendritik hiperexcitability oyadır. Razılaşmaya əsasən, mədəni neyronlarımızda aktivlikdən məhrumetmə gərginliyin azalması müsbət neyronlarının depolarizasiyasına səbəb oldu. Maraqlıdır ki, gərginliyə malik hüceyrələrin sayının çox olmasına baxmayaraq, HCN mRNA-da və ya mədəniyyət lizatlarında zülal səviyyələrində TTX-in səbəb olduğu dəyişiklikləri aşkar edə bilmədik. Xüsusilə, hipokampus 19, 20-də HCN kanallarının səth ifadəsini tənzimləyən TRIP8b (1a-4) izoform səviyyələrində də əhəmiyyətli bir artım aşkar etdik. Məlumdur ki, HCN kanalının lokalizasiyası ilk növbədə somada ölçülən gərginlik düşmə reaksiyalarının dərəcəsini müəyyən edir. Razılaşaraq, 48 saatlıq fəaliyyətdən məhrumiyyətdən sonra orqanotipik hipokampal dilimlər içərisində CA1 neyronlarında daha proksimal HCN1 kanalının yenidən bölüşdürülməsini aşkar etdik. Thus, our results show a specific redistribution of HCN channels that is considered as a very effective way of homeostatic upregulation of intrinsic excitability.

It is known that network activity gradually develops in dissociated hippocampal cultures and from DIV12, neurons exhibit robust firing and mature integrative properties 34 . Our data show that two days of TTX treatment started between DIV12 to 14 increased burst activity. This is in agreement with earlier observations on treating immature cultures with TTX for 9ꃚys, starting from DIV5 until DIV14 35 . Additionally, our pharmacological experiments showed that HCN and T-type Ca channels participate in the formation of global network bursting activity amplified by TTX-evoked homeostatic regulation. In accordance with previous reports showing that these channels have fundamental role in bursting 36 – 39 , we found that selective blocking of these channels decreased burst frequency. At the same time, we found no changes in other burst parameters or the mean firing rate. It is known that T-type voltage-gated channels and HCN channels work together and regulate the firing frequency during post-inhibitory rebound, first spike latency and spike precision in the deep cerebellar nuclear neurons 40 . In addition, HCN1 channels were reported to create signaling complexes with certain CaV3 subunits 41 . Nevertheless, we cannot rule out the possibility that sodium channels are also affected by activity-deprivation as this has been verified by earlier reports using similar model systems 11 . It is likely that differential regulation of sodium, HCN and T-type calcium channels all contribute to the formation of the bursting phenotype during homeostatic plasticity.

Homeostatic regulation of intrinsic excitability has been described as an efficient way to prevent neurons from becoming hyper- or hypoactive in case of sustained loss of neuronal inputs or highly elevated neuronal activity, respectively. Initial research on activity-deprived neurons identified several voltage-dependent membrane conductances, including mostly potassium currents 42 , which are associated with spike generation and are subjects of homeostatic regulation. Indeed, up- or downregulation of such conductances can have a profound effect on the excitability of neurons often manifesting as changes in the rheobase or input–output gain parameters. Our previous experimental data on extended amygdala neurons 43 , as well as present computational models, have shown that homeostatic regulation of other voltage-gated currents including T-type and HCN channels can dramatically alter the neuron’s integrative properties while standard parameters of their static excitability appear to be less influenced. Considering these, even those intrinsic changes that introduce minor shifts in the static input–output functions of neurons (e.g. LTP of intrinsic excitability) can have a robust functional impact when neurons operate under fluctuating synaptic inputs. Our present model simulations also support this idea by showing that upregulation of both the h- and T-currents boosts firing under the action of excitatory synaptic inputs more than firing under standard current step stimulation.

In summary, our data show that in hippocampal neurons, HCN and T-type voltage-gated calcium channels participate in the activity-dependent homeostatic regulation of their integrative properties facilitating synchronization of network activity and bursting.


Mücərrəd

Addiction is caused, in part, by powerful and long-lasting memories of the drug experience. Relapse caused by exposure to cues associated with the drug experience is a major clinical problem that contributes to the persistence of addiction. Here we present the accumulated evidence that drugs of abuse can hijack synaptic plasticity mechanisms in key brain circuits, most importantly in the mesolimbic dopamine system, which is central to reward processing in the brain. Reversing or preventing these drug-induced synaptic modifications may prove beneficial in the treatment of one of society's most intractable health problems.


Supporting Information

Şəkil S1

Morphology of adult Panx1 +/+ and Panx1 −/− mouse brains. Photographs of fixed 9 month-old male control (Panx1 +/+ , left panels) and Panx1 −/− (right panels) brains showing no macroscopic differences in dorsal (A, B) and ventral views (C, D). Scale Bars A𠄽 =𠂥 mm.

Figure S2

Comparison of frontal brain sections Panx1 +/+ and Panx1 −/− mouse brains. (A, B) Overview representing slices (1.5 mm) at the level of the dorsal hippocampus reveals no obvious regional differences between cortex (Cx), hippocampus, thalamus, (Th), hypothalamus (Hy) and amygdala (Amy) between Panx1 +/+ (left panels) and Panx1 −/− mice (right panels). All animals were 9 months old. (C–H) Toluidine-blue stained semithin sections (0.8 µm) of the hippocampus showing regions CA1 (C, D), CA3 (E, F) and dentate gyrus (DG in G, H). All regions display normal cellular and dendritic composition in both genotypes. Cp, cerebral peduncle GR, granule cell layer, PO, polymorph layer PY, pyramidal cell layer RAD, stratum radiatum SLU, stratum lucidum Scale bars in A, B =𠂠.5 mm bar in C–H =� µm.

Figure S3

Calbindin and Parvalbumin immunohistochemistry of hippocampus in Panx1 +/+ and Panx1 −/− mice. (A, B) Frontal overview vibratome sections, 50 µm thick, show the characteristic calbindin staining pattern of the hippocampal subregions CA1, stratum lucidum (SLU) of CA3 with the positive mossy fibers and the strongly stained dentate gyrus (DG) in Panx1 +/+ (left panels) and Panx1 −/− mice (right panels). Enlargements of the CA1 area exhibit no difference in staining of the pyramidal cell layer (PY), stratum oriens (OR) and stratum radiatum (RAD) between both genotypes. Overview micrograph of Parvalbumin immunostaining displays similar staining of Panx1 +/+ (E) and Panx1 −/− mice (F). Enlargements of CA1 (G, H) show immunpositive somata of interneurons in the pyramidal cell layer and stratum oriens with the dendrites spanning all layers. Bar in A, B, E, F =� µm bar in B, D, G, H =� µm.

Figure S4

Expression of selected glutamate receptor family genes. Real Time PCR was performed to analyze relative expression changes of grm1 (mGlu family I), grm2 (mGlu family II), grm4 (mGlu family III), grin1 (AMPA receptor family) and gria1 (NMDA receptor family). HSP90 and 18 sRNA expression was used for normalization.

Table S1

Summary of the mean ± SEM values for Panx1 +/+ and Panx1 −/− derived early phase LTP and late phase LTP. Data are listed according to the bath applied pharmacological treatment. Note, that wash in of pharmacology was performed at least 10 min in advance to measurements and was kept upright during the whole phase of LTP recordings. P-Values reveal significances for Holm-Sidack post hoc comparisons, which were performed following one-way ANOVA analyses. ns = non-significant

Cədvəl S2

Summary of RNA expression profiling data. Summary of data analysis using PCRArrayDataAnalysis_V3.3 software, version August 2010, (http://www.sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php). Metabotropic glutamate receptor 4 (GRM4) is highlighted in red. Samples in wells H01–H05 were used for normalization of the data set.

Methods S1

This section describes methods used to obtain the data described in the supporting information section.

Movie S1

Typical behavior of trained control (Panx1 +/+ cage on the left) and knock-out (Panx1 −/− cage on the right) mice in cookie finding assay. The “X” presented in the lower left corner ifadə edir where the cookie was stored during training sessions. Control mice immediately try to find the cookie in this corner, and when unsuccessful choose the top right hand corner instead. The Panx1 −/− explores the cage, however, lack indications of a systematic, memory-based exploration strategy.


Biography

Louis-Solal Giboin obtained his PhD in France under the supervision of Véronique Marchand-Pauvert, with whom he studied the cortical control of cervical propriospinal neurons in humans. He is now a post doctorant in charge of the Sensorimotor Performance Lab in the Human Performance Research Centre lead by Markus Gruber at the University of Konstanz in Germany. He is currently working on the neural adaptations induced by motor training and on the role of self-control in the regulation of strenuous physical activity.


Nəticələr

Previous results have shown that PKA anchoring is important for striatal LTP [26] and striatal dependent behavior [72], but these experiments did not delineate whether PKA needs to be anchored near its target molecules, such as DARPP-32 and the AMPA receptor GluA1 subunit, or near a source of activator molecules, such as adenylate cyclase. Though disruption of PKA anchoring prevents phosphorylation of targets such as sodium channels [23] or adenylate cyclase 5 [73] in response to a general elevation in cAMP, the role of anchoring in response to spatially constrained cAMP has not been investigated. In order to clarify which of these two associations is critical to PKA function, a model of the signaling pathways implicated in striatal synaptic plasticity ( Fig. 1A ) was implemented using NeuroRD [57], in a 7.75 µm long dendrite with four spines ( Fig. 1B ).

Validation of the Model

Prior to evaluating the role of PKA and adenylate cyclase location, the model was validated by comparison with experiments that measured phosphorylation of PKA targets in response to bath application of agonists. For this validation, both PKA and adenylate cyclase were located in the spine and dendrite in equal amounts.

The first validation simulates the response to bath application of 10 µM dopamine. Fig. 2A shows that a simulated increase in dopamine from 10 nM (basal level) to 10 µM leads to a 6-fold increase in phosphoThr34 DARPP-32 within 2 min, and a decrease of phosphoThr75 DARPP-32 to 60% of basal ( Fig. 2B ) comparable to the changes measured experimentally using dopamine D1R agonists [74]. In addition, simulated phosphoSer845 GluA1 increases by 8 fold within 5 to 10 minutes ( Fig. 2C ), comparable to measurements performed in the absence of D2 receptor stimulation [48].

(A) Change in phosphoThr34 DARPP-32 is similar to that observed experimentally in response to 10 µM dopamine alone, 600 nM calcium alone (inset), and the combination of dopamine with calcium. (B) Decrease in phosphoThr75 DARPP-32 for same three conditions as (A). (C) Change in phosphoSer845 GluA1 for same three conditions as (A). All responses are similar to experimental measurements.

The second validation simulates the response to a sustained increase in intracellular calcium concentration, as occurs due to experimental activation of NMDA receptors and voltage dependent calcium channels [75]. In response to this calcium increase, simulated phosphorylation of both DARPP-32 residues decreases, to half (Thr34) or two-thirds (Thr75) the basal level ( Fig. 2A and 2B ), in agreement with experimental data [56], [76]. Furthermore, the simulated calcium elevation leads to dephosphorylation of phosphoSer845 GluA1 ( Fig. 2C ) as previously reported [75].

The last model validation evaluates the change in phosphorylation of Thr34 and Thr75 in response to paired dopamine and calcium elevations. As demonstrated experimentally [75], [76], the addition of calcium reduces the increase in phosphoThr34 caused by dopamine ( Fig. 2A ), and enhances the decrease in phosphoThr75 ( Fig. 2B ). Furthermore, paired elevation of dopamine and calcium completely blocks the simulated phosphorylation of GluA1 Ser845 ( Fig. 2C ).

PKA Activity is Greater when Anchored near Adenylate Cyclase

Using this validated model, we explore the function of PKA anchoring relative to the location of both adenylate cyclase that activates it and PKA targets such as AMPA receptors ( Fig. 1C ). The D1 receptor is a metabotropic G protein coupled receptor functionally associated with adenylate cyclase [30], [31]. Immunohistochemical studies have shown D1 receptors located in spine heads and necks [77]. On the other hand, studies using immunogold labeling suggest D1 receptors are localized in extra synaptic sites homogeneously distributed in dendritic shafts and spines [78]. Therefore, prior to evaluating the effect of colocalization, we first examine the cAMP distribution when the adenylate cyclase/G protein/D1 receptor complex is located either in the spine head or in the submembrane region of the dendritic shaft.

Simulations show that when the adenylate cyclase-D1 receptor complex is located in the spine head, cAMP concentration is significantly higher in the spine head compared to the dendrite ( Fig. 3A ). This gradient is independent of PDE10 distribution (Suppl Fig S1). Conversely, when the complex is located in the submembrane compartment of the dendrite, cAMP concentration is higher in the dendrite than in the spine head ( Fig. 3B ). In summary, regardless of adenylate cyclase location, a cAMP gradient develops, with the highest concentration near the source (adenylate cyclase-D1 receptor complex) therefore, subsequent evaluations of the role of colocalization take into account the local cAMP concentration.

(A) When adenylate cyclase (AC) is in the spine head, there is a large difference (gradient) between spine cAMP and dendrite cAMP. (B) When adenylate cyclase is in the dendrite, there is a small gradient from dendrite to spine.

PKA location is regulated by interaction with A-Kinase anchoring proteins [19]. Various AKAPs anchor PKA to different locations, such as to the spine (e.g. AKAP5) [79], [80] or the dendritic shaft (e.g. MAP2) [81]. Recent evidence suggests that AKAP5 also anchors adenylate cyclase [22], [24], which would colocalize adenylate cyclase, PKA and GluA1 receptors. Alternatively, a pool of adenylate cyclase may be in the dendrite together with the dopamine D1 receptors found there [78]. In order to evaluate whether the critical function of anchoring is to place PKA near adenylate cyclase or near phosphoprotein targets, PKA is localized either in the spine heads or in a small submembrane region of the dendrite. For both of these spatial variations of PKA, the adenylate cyclase/D1 receptor complex is placed either in the spine heads or in the small submembrane region of the dendrite. Thus, four different spatial configurations are simulated ( Fig. 1C ). Note that the volume of the small dendrite region equals the volume of the spine head thus, both global and local concentrations of these molecules are equal for all simulations. This 2൲ experimental design ( Fig. 1C ) allows assessment of the role of PKA location relative to adenylate cyclase - the source of cAMP, or a non-diffusible target - the AMPA receptor GluA1 subunit. Note that membrane associated molecules have limited mobility in the membrane [62] and pools of PKA are anchored in multiple regions within the neuron nonetheless, our approach serves to enhance the effect of colocalization and facilitates evaluation of distinct functions of anchoring.

Simulations show that PKA colocalization with adenylate cyclase, either in the dendrite or the spine, produces a higher quantity of the active catalytic subunit than when PKA is apart from the adenylate cyclase ( Fig. 4A, B ). The large fluctuations in catalytic subunit are caused by its low quantity, which is due to a high affinity for the regulatory subunit and DARPP-32. Both the large fluctuations and the slow dynamics of PKA activation obscure the individual pulses that are visible in the cAMP traces. Colocalization in the spine produces greater PKA activity than colocalization in the dendrite because local spine cAMP is greater when adenylate cyclase is in the spine due to impeded cAMP diffusion. The effect of local cAMP (measured at the site of PKA anchoring) and colocalization (whether PKA was colocalized with adenylate cyclase or not) were evaluated using the SAS procedure GLM. Analysis revealed that local cAMP concentration predicted PKA activity (Pπ.0001, R 2  =𠂠.91), whereas colocalization did not reach significance (P =𠂠.083) thus the role of colocalization is primarily to place PKA in a microdomain of high cAMP concentration.

(A, B) Concentration of free catalytic subunit (PKAc) is greater for the two colocalized cases. (A) Traces are averaged over 4 trials nonetheless the stochastic fluctuations are so large that the traces overlay each other and are difficult to distinguish. (B) Mean and S.E.M. of the total PKA activity (PKAc summed between 50 and 350 s). (C,D) Concentration of phosphoThr34 DARPP-32 is greater for the two colocalized cases. (C) Traces are the average over four trials. (D) Mean and S.E.M. of the concentration of phosphoThr34 DARPP-32 averaged between 50 and 350 s. (E, F) Percent of phosphoSer845 GluA1 is greater for the two colocalized cases. (E) Traces are the average over four trials. (F) Mean and S.E.M. of the percent of phosphoSer845 GluA1 averaged between 50 and 300 s.

The effect of colocalization is propagated to downstream targets: Colocalization of PKA and adenylate cyclase (in spine or dendrite) leads to increased phosphoThr34 DARPP-32 ( Fig. 4C,D ) and phosphoSer845 GluA1 ( Fig. 4E,F ) compared to non-colocalized cases. In fact, both phosphoThr34 DARPP-32 and phosphoSer845 GluA1 are completely predicted by PKA activity (P =𠂠.0001, R 2  =𠂠.999 and P =𠂠.0001, R 2  =𠂠.93, respectively). The concentration of phosphoThr34 DARPP-32 (total quantity divided by volume of entire morphology) is illustrated because the gradients are much smaller than those of cAMP (Suppl Fig. S1). Evaluation of GluA1 in single spines on individual trials (Suppl Fig. S2) reveals that GluA1 phosphorylation varies considerably, exceeding 20% more often when PKA and adenylate cyclase are colocalized in the spine. This variability would not be evident in deterministic simulations.

Previous experiments have shown that disruption of PKA anchoring using Ht31 peptide blocks L-LTP induction in hippocampus [25] and LTP induction in the striatum [26]. To evaluate this experimental observation, we performed simulations with PKA uniformly distributed in the morphology, mimicking the disruption of anchoring by Ht31 peptide [23], [25]. The simulation shows that phosphoThr34 DARPP-32 and phosphoSer845 GluA1 are reduced (ratioρ) when PKA is uniformly distributed ( Fig. 5 ), especially for the case of adenylate cyclase located in the spine. This decreased PKA activity supports experimental studies showing that PKA anchoring is required for LTP induction.

When adenylate cyclase (AC) is in the spine, disruption of PKA anchoring reduces by 30% both phosphoThr34 DARPP-32 (p =𠂠.0006) and phosphoSer845 GluA1 (p =𠂠.0036). When adenylate cyclase is in the dendrite, disruption of PKA anchoring produces a significant decrease in phosphoThr34 DARPP-32 (p =𠂠.0005), but not phosphoSer845 GluA1 (p =𠂠.16). Most of the diffusely distributed PKA is in the dendrite thus, cAMP diffusion out of the spine (when adenylate cyclase is in the spine) to reach the PKA is more difficult than cAMP diffusion within the dendrite (when adenylate cyclase is in the dendrite). Consequently, disruption of PKA anchoring has a larger effect when adenylate cyclase is in the spine. PhosphoThr34 DARPP-32 is averaged between 50 and 350 s and phosphoSer845 GluA1 is averaged between 50 and 300 s.

Spine Neck Length Enhances the Effect of Colocalization

Recent studies have demonstrated that synaptic function and plasticity are correlated with synaptic structure and spine morphology [82], [83]. In particular, spine-neck geometry is an important determinant of NMDA receptor-dependent calcium signaling in the dendrite [84], [85]. To evaluate how spine morphology affects the interaction between PKA and cAMP, simulations are repeated using a spine with either a longer (1.0 µm) or shorter (0 µm) spine neck, representing the range of experimentally measured values in striatal dendrites [86]. Keeping the spine head the same size and shape maintains both the same quantity and concentration of molecules localized in the spine head. For these simulations, the four configurations of PKA and adenylate cyclase introduced previously are used.

Simulations show that spine neck enhances the effect of colocalization through control of cAMP concentration. An increase in spine neck length increases the cAMP gradient due to reduced diffusional coupling. Thus, an increase in neck length produces a larger cAMP in the spine when adenylate cyclase is in the spine, and a smaller cAMP in the spine when adenylate cyclase is in the dendrite. The effect of neck length on cAMP concentration gradient propagates downstream to PKA targets ( Fig. 6A,B ), yielding a larger effect of colocalization for the longer spine neck. Furthermore, local cAMP concentration predicts PKA activity regardless of neck length (Pπ.0001, R 2  =𠂠.93), and PKA activity predicts both phosphoThr34 DARPP-32 (Pπ.0001, R 2  =𠂠.99) and phosphoSer845 GluA1 (Pπ.0001, R 2  =𠂠.93). These results reinforce the observation that colocalization of PKA with its source of cAMP functions to locate PKA in a microdomain of high cAMP concentration, and also show that the effect of colocalization is robust to variation in spine neck length.

(A) The difference in phosphoThr DARPP-32 between colocalized and non-colocalized cases increases with a longer spine neck. (B) The difference in phosphoSer845 GluA1 between colocalized and non-colocalized cases increases with spine neck length. (C) Increase in diffusion constant decreases the activity of PKA when colocalized in the spine with adenylate cyclase (AC), but maintains enhancement over the non-colocalized case. (D) Changes in rate of GluA1 phosphorylation changes the level of phosphoSer845 GluA1, but maintains the difference between colocalized and non-colocalized cases. PhosphoThr34 DARPP-32 is averaged between 50 and 350 s and phosphoSer845 GluA1 is averaged between 50 and 300 s.

Several other simulations were performed to demonstrate that the results were robust to variations in parameters. The effect of colocalization was evaluated for different values of diffusion constants, rate of GluA1 dephosphorylation, and PDE10 location. For all these parameter variations, simulations demonstrate that colocalization of PKA with its activator still yields the greatest PKA activity. GluA1 dephosphorylation rate had no effect on PKA activity (results not shown), whereas an increase in diffusion constant ( Fig. 6C ) predictably decreased, but did not eliminate the effect of colocalization on PKA activity. Similarly, the GluA1 dephosphorylation rate changed the level of GluA1 Ser845 ( Fig. 6D ), but maintained the enhancement in phosphoSer845 GluA1 due to colocalization. Fig. S1 illustrates the effect of distributing PDE10 throughout the morphology (instead of locating it in the spine and submembrane region) for the two cases with adenylate cyclase in the spine. Though cAMP concentration and phosphoThr34 DARPP-32 are slightly increased when PKA is in the dendrite, PKA colocalization with adenylate cyclase still produces a much greater activity.

Effect of Calcium on Dopamine Response

Experimental evidence demonstrates that calcium influx through NMDA receptors is required for plasticity [87], [88] however the molecular mechanisms of calcium action are less clear. One possibility suggested by a previous model [27] is that keçici calcium elevation (in contrast with prolonged calcium elevation) paired with dopamine enhances phosphoThr34 DARPP-32 compared with dopamine alone. Another possibility is that multiple kinases are required for synaptic plasticity, and, in particular, that calcium is required for CaMKII activation [45]. Therefore to explore the interaction between dopaminergic and glutamatergic transient signals in the medium spiny projection neuron, the model was stimulated with simultaneous dopamine and calcium pulses.

Transient calcium influx to spines was applied at 100 Hz for 1 sec, which approximates the calcium influx through NMDA receptors during LTP protocols [59]. This calcium influx generates a transient increase in calcium concentration that is constrained to the stimulated spines, as observed experimentally. Peak calcium levels in the stimulated spines (1500� nM) are much higher than both the non-stimulated spines (500� nM) and the dendrite (� nM), regardless of PKA and adenylate cyclase location.

Independent of whether PKA and adenylate cyclase were colocalized in the spine or dendrite, the PKA activity, phosphoThr34 DARPP-32, and phosphoSer845 were 10% smaller in response to calcium plus dopamine than in response to dopamine alone ( Fig. 7 ). The inhibition in PKA activity is caused by three pathways: inhibition of adenylate cyclase 5, activation of phosphodiesterase 1B and activation of calcineurin that dephosphorylates phosphoThr34 DARPP-32. The small increase in PKA activity in response to calcium alone is due to enhanced dephosphorylation of phosphoThr75 DARPP-32 by calcium bound PP2A ( Fig. 7B ) which cannot compensate for the other inhibitory actions of calcium, regardless of PP2A distribution or affinity for calcium (results not shown).

(A) Calcium alone produces a large increase in CaMKII phosphorylation and a small increase in PKA activity. Calcium together with dopamine leads to CaMKII phosphorylation only 10% lower than that observed with calcium alone, and PKA activity only 10% lower than that observed with dopamine alone. Both PKA and CaMKII activity are summed between 50 and 350 sec. (B) The calcium induced increase in PKA activity is caused by a small activation in PP2A, leading to a small decrease in phosphoThr75 (not shown).

To evaluate the possibility that calcium is needed for activation of other kinases, we measured the quantity of phosphorylated CaMKII, implicated in striatal LTP [89], in response to calcium, dopamine, and calcium plus dopamine. Fig. 7A shows that calcium stimulation alone causes a tremendous increase in phosphoCaMKII when compared with dopamine stimulation alone, while the combination of dopamine and calcium produces only a 10% reduction compared to calcium alone. This suggests that the increase in phosphoCaMKII more than compensates for the small decrease in PKA activity due to calcium. Though PKA and CaMKII have distinct targets in the model, extracellular signal-regulated kinase type II, important for dopamine signaling in the striatum [90], is phosphorylated by several kinases [91], and other points of PKA and CaMKII convergence are possible. In summary, these results suggest that both dopamine and calcium are required for LTP due to the need for activation of multiple kinases.

Colocalization of Dopamine Terminals and Receptors

There are two conflicting hypotheses on the relationship between the extracellular concentration of dopamine and the activation of dopamine receptors [92]: either dopamine concentration exhibits a spatial gradient and preferentially activates receptors near terminals, or dopamine concentration does not exhibit a spatial gradient and activates receptors homogenously through volume transmission. The latter hypothesis is supported by the microscopic anatomy of dopamine receptors and terminals [78], [93]. On the other hand, voltammetry experiments coupled with modeling demonstrate a spatial gradient of dopamine concentration, suggesting that nearby low affinity receptors (e.g. D1R) are activated preferentially [66], [94], [95]. Therefore the next set of simulations evaluates the extent to which an extracellular microdomain in dopamine would produce an intracellular microdomain of D1R activated second messengers.

To approximate the spatio-temporal profile of dopamine observed in voltammetry experiments [66], dopamine diffusion was decreased by a factor of 3. This approach avoided the need for dopamine uptake via the dopamine transporter and subsequent degradation, which was beyond the scope of the current paper that focuses on post-synaptic mechanisms. The quantity of dopamine released at the spine was adjusted so that dopamine concentration at the release site remained the same, which yielded no change in PKA activity when PKA, D1R and adenylate cyclase were colocalized with the dopamine terminals in the spine. The effect of the resulting dopamine spatial gradient was evaluated by measuring the change in PKA activity when PKA, D1R and adenylate cyclase were colocalized in the dendrite, but 3 µm from the dopamine terminals.

Simulations show that the dopamine spatial gradient ( Fig. 8B1 inset) leads to a small but significant decrease in amplitude of cAMP concentration (p =𠂠.0012) and phosphoThr34 DARPP-32 (p =𠂠.046), compared to no dopamine gradient ( Fig. 8 ). In contrast, the time of the peak cAMP concentration ( Fig. 8A1 ), phosphoThr34 DARPP-32 ( Fig. 8B1 ) and phosphoSer845 GluA1 ( Fig. 8C1 ) were not altered. This small change in intracellular signaling molecules caused by the dopamine spatial gradient suggests that small distances between receptor and terminal may not be important, especially if the intracellular molecules do not exhibit a spatial gradient. This idea was further evaluated with the next simulation, in which spatial gradients of intracellular signaling molecules were evaluated in a longer dendrite.

A spatial gradient of dopamine decreases (A) cAMP and PKA activity as measured by (B) phosphoThr34 DARPP-32 and (C) phosphoSer845 GluA1, but no delay in time course. A1, B1 and C1 show the time course of a single simulation, A2 show mean and stdev (n =𠂤) of cAMP averaged between 50 and 200 s B2 and C2 show mean and stdev (n =𠂤) of phosphoThr34 DARPP-32 averaged between 50 and 350 s, and phosphoSer845 GluA1 averaged between 50 and 300 s, respectively. The inset of B1 shows the gradient in dopamine concentration from the PSD to the dendrite. Traces are the average of four simulations.

Microdomains and Spatial Specificity

The effect of close proximity between dopamine terminals and receptors can only be important when accompanied by mechanisms for limiting the spread of intracellular signaling molecules. Spatial specificity of intracellular signaling is critical for information processing, in particular for a neuron to discriminate between different patterns of input. To evaluate if spatial specificity of dopamine signaling would propagate to downstream targets, we performed simulations using a longer dendrite with an average spine density of 1/µm, as experimentally measured [86]. These simulations use the slow dopamine diffusion which produces a gradient in dopamine to ensure that only the dopamine receptors at one end are activated.

Fig. 9A shows that dopamine stimulation of one end of the dendrite produces a spatial gradient in cAMP concentration, reaching � nM at the stimulated end, and decaying to basal concentration within 13 µm of the stimulation site. The spatial profile of cAMP is well described by a single spatial decay constant of 4.69ଐ.14 µm ( Fig. 9B ). This gradient does not propagate to PKA activity, as measured by phosphoThr34 DARPP-32 activity ( Fig. 9C ), or phosphoSer845 GluA1 ( Fig. 9E ). The lack of intracellular gradient of PKA activity supports the ineffectiveness of extracellular gradients in dopamine. This result further suggests that PKA anchoring is not sufficient by itself to produce PKA microdomains, in part because when PKA is activated, the catalytic subunit diffuses.

(A) cAMP concentration versus time and distance from dopamine release site. (B) cAMP concentration, averaged from 50 to 150 sec, is well fit by single exponential decay. (C) phosphoThr34 DARPP-32 concentration versus time and distance from dopamine release site exhibits minimal spatial gradient. (D) Concentration of phosphoThr34 DARPP-32, averaged between 100 and 250 sec, exhibits a spatial gradient when diffusion of all DARPP-32 forms is zero (red), or diffusion of PKA bound DARPP-32 is zero (blue). Blocking the phosphoThr75-PKA interaction does not change the gradient that appears when diffusion of all DARPP-32 forms is zero (black). All three cases overlap and have the same decay space constant thus, they are difficult to distinguish in the figure. The inset shows the fits alone, which also overlap. (E) Percent of GluA1 phosphorylated on Ser845, averaged between 100 and 250 sec, versus distance from dopamine release site. (F) Percent of GluA1 phosphorylated on Ser845, averaged between 100 and 250 sec, exhibits a spatial gradient when diffusion of the DARPP-32 forms is zero (red), or diffusion of PKA bound DARPP-32 is zero (blue). Blocking the phosphoThr75-PKA interaction does not change the gradient that appears when diffusion of all DARPP-32 forms is zero (black).

The decay length of a molecule's concentration gradient is governed not only by its diffusion constant but also by its inactivation rate [17], [96]. Though PKA is inactivated by the large quantity (� µM) of phosphoThr75 DARPP-32, this inactivation is reversible, similar to calcium binding to calcium buffers [97]. In addition, diffusion of phosphoThr34 DARPP-32 could obscure the gradient of PKA activity. Therefore, to evaluate the role of DARPP-32, simulations were repeated with diffusion constants for various forms of DARPP-32 set to zero.

Fig. 9D and 9F show that a gradient in phosphoThr34 DARPP-32 and phosphoSer845 GluA1 is observed in the absence of diffusion of any form of DARPP-32 (red traces). The gradient has a spatial decay constant of 14.7ଘ.5 µm for phosphoThr34 DARPP-32, which does not differ significantly from the spatial decay constant of 16.1넒.2 µm for phosphoSer845 GluA1 (P =𠂠.84). To demonstrate that DARPP-32 acts similar to calcium buffers in spreading PKA activity, simulations were repeated with diffusion for only the PKA-bound forms set to zero (both the PKA-DARPP-32 complex and the inhibited PKA-phosphoThr75 DARPP-32 complex), but diffusion of phosphoThr34 DARPP-32 enabled. əncir. 9D and 9E show that a gradient in phosphoThr34 DARPP-32 and phosphoSer845 GluA1 are observed in these conditions (blue traces). More importantly, the spatial decay constants of the gradient do not differ between these two cases (P =𠂠.8 for phosphoThr34 DARPP-32 and P =𠂠.4 for phosphoSer845 GluA1). As a further demonstration that PKA binding to phosphoThr75 DARPP-32 does not act as an inactivation mechanism, simulations were repeated with this reaction blocked, in the absence of DARPP-32 diffusion. Fig. 9D and 9F (black traces) show that blocking this reaction does not decrease the gradient, and thus the reaction does not act as an inactivation mechanism at this spatial scale.


Metodlar

Neuronal culture preparation

Hippocampal neurons dissociated from Wistar rats (P0–P2) were plated on polyorhitine/matrigel pre-coated MEA at a concentration of 8 × 10 5 cells/cm 2 and maintained in a neuron medium as previously described [9]. After 48 h, 5 μM cytosine-β- D-arabinofuranoside (Ara-C) was added to the culture medium in order to block glial cell proliferation. Neuronal cultures were kept in an incubator providing a controlled level of CO2 (5%), temperature (37°C) and moisture (95%).

Electrical recordings and electrode stimulation

Multi electrode array (MEA) recordings were carried out with a MEA60 system (Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany). Stimulations and recordings were carried out after 21–35 days in vitro. Synchronous network bursting was induced by 30 min. treatment with GABAA receptor antagonists, gabazine (20 μM). In some experiments, blockers of the ERK1/2 pathway (50 μM PD98059 and 20 μM U0126) were used. These drugs were pre-incubated before application of gabazine for 45 min. The voltage pulse was bipolar with a duration of 200 μsec. For a given culture, the same amplitude was used as before, during and after GabT. The pattern of stimulation consisted of a train of 40 bipolar pulses separated by an inter-pulse interval of 4s and applied to a bar of six neighbouring electrodes.

Məlumatların təhlili

Acquired data were analyzed using MATLAB (The Mathworks, Inc.) as previously described [10, 19]. The network firing rate (NFR) is defined as the sum of all electrodes firing rates (i.e. the number of all spikes recorded in the network for each bin). The total number of spikes as a function of the distance d was fitted by the exponential function from which λ was obtained (inset Fig. 1G).

Quantitative RT-PCR

RNA (250 ng) was reverse transcribed using SuperScript II reverse transcriptase and random hexamer (Invitrogen, Milan, Italy). Real-time PCR was performed using iQ SYBR Green supermix (Biorad, Milan, Italy) and the iQ5 LightCycler. Gene specific primers were designed using Beacon Designer (Premier Biosoft, Palo Alto, CA, USA). The thermal cycling conditions comprised 3 min at 95°C, and 40 cycles of 10 seconds for denaturation at 95°C and 45 sec for annealing and extension at 58°C. The expression level of the target mRNA was normalized to the relative ratio of the expression of Gapdh mRNA. The forward primer for Gapdh was 5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3', the reverse primer was 5'-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-3'. Fold changes calculations were made between treated and untreated samples at each time point using the 2 -ΔΔCT method. The forward primer for Egr1 was 5'-AAGGGGAGCCGAGCGAAC-3', the reverse primer was 5'-GAAGAGGTTGGAGGGTTGGTC-3' forward primer for Egr2 was 5'-CTGCCTGACAGCCTCTACCC-3', reverse primer was 5'-ATGCCATCTCCAGCCACTCC-3' forward primer for Egr3 was 5'-ACTCGGTAGCCCATTACACTCAG-3', reverse primer was 5'-GTAGGTCACGGTCTTGTTGCC-3' forward primer for Nr4a1 was 5'-GGTAGTGTGCGAGAAGGATTGC-3', reverse primer was 5'-GGCTGGTTGCTGGTGTTCC-3' forward primer for Arc was 5'-AGACTTCGGCTCCATGACTCAG-3', reverse primer was 5'-GGGACGGTGCTGGTGCTG-3' forward primer for Homer1a was 5'-GTGTCCACAGAAGCCAGAGAGGG-3', reverse primer was 5'-CTTGTAGAGGACCCAGCTTCAGT-3' forward primer for Bdnf was 5'-CGATTAGGTGGCTTCATAGGAGAC-3', reverse primer was 5'-GAAACAGAACGAACAGAAACAGAGG-3'.