Məlumat

Eyni toxumada qırmızı və yaşıl flüoresanların ifadəsi

Eyni toxumada qırmızı və yaşıl flüoresanların ifadəsi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bu məqalədə (https://jcs.biologists.org/content/122/14/2351), xüsusilə Şəkil 1 və 2-də eyni toxumada GFP və qırmızı flüoresansın ifadəsini göstərirlər və mən o qırmızı kimi hiss edirəm GFP-nin ifadə olunduğu yerdə flüoresan var (baxmayaraq ki, GFP-nin olmadığı yerdən daha zəif), amma görəsən niyə sarı deyil? Adətən, bu ikisi eyni hüceyrələrdə ifadə olunduqda (bu halda GFP sitoplazmadadır və qırmızı isə membran zülalını göstərir) belə deyil, sarı rəng müşahidə olunur. Bu yazıda mənə elə gəlir ki, əgər məntiqli olarsa, yaşılın altında bir az qırmızı görürəm…

Bunun nə demək olduğunu bilən varsa, mənə bir məsləhət verin! Çox sağ ol.


Bu şəkillər adətən rəngli kameralardan istifadə edilmir. Onlar boz rəngli kameralardan, həyəcan dalğalarının nümunəyə dəyməsinə və emissiya dalğa uzunluqlarının kameraya keçməsinə imkan verən filtrlərdən istifadə etməklə çəkilir.

Vizuallaşdırma üçün bu qara və ağ şəkillər çox vaxt rəqəmsal təsvirdə qırmızı və ya yaşıl kanala yerləşdirilir (televizorlar və kompüter monitorları müxtəlif miqdarda qırmızı, yaşıl və mavi işığı qarışdıraraq rəng yaradır: RGB). Əgər sizdə qırmızı və yaşıl bir yerdə varsa, bu, insan gözünə sarı görünür, lakin bu, hər hansı bir sarı işığın iştirak etdiyi demək deyil: bu, sadəcə qavrayışdır.

Bu şəkillərdə sarı görmürsünüzsə, bunun səbəbi qırmızı və yaşıl emissiyanın eyni yerdə olmamasıdır.


Qırmızı flüoresan protein eqFP611: ali bitkilərdə hüceyrəaltı lokalizasiya tədqiqatlarında tətbiq

Özündən flüoresan zülallar molekulyar hüceyrə biologiyasında tədqiqatlarda inqilab etdi. Bu zülalların ikili və ya çox etiketli təcrübələrdə, məsələn, hüceyrəaltı lokalizasiya tədqiqatlarında paralel tətbiqi, hər bir etiketin birmənalı aşkarlanması üçün üst-üstə düşməyən emissiya spektrlərini tələb edir. Qırmızı spektral diapazonda bu gün demək olar ki, yalnız DsRed və onun törəmələri istifadə olunur. Qırmızı flüoresan zülal eqFP611-in ali bitkilərdə alternativ olaraq uyğunluğunu yoxlamaq üçün bu zülalın davranışı ifadə, hüceyrəaltı hədəfləmə və tütündə GFP ilə uyğunluq baxımından təhlil edilmişdir.

Nəticələr

Tütün protoplastlarında keçici olaraq ifadə edildikdə, eqFP611 gecə ərzində flüoresan mikroskopiya ilə asanlıqla aşkar edilə bilən səviyyələrə yığıldı. Doğma zülal nüvədə və sitozolda tapılmış və hüceyrənin canlılığına heç bir zərərli təsir müşahidə edilməmişdir. N-terminal mitoxondrial və peroksisomal hədəfləmə ardıcıllığı ilə birləşdirildikdə, qırmızı flüoresans yalnız transfeksiya edilmiş protoplastlarda müvafiq orqanellələrdə yerləşirdi. Eyni hüceyrələrdə GFP ilə birgə ifadə edildikdən sonra həm eqFP611, həm də GFP-nin flüoresansı asanlıqla fərqləndirilə bilər, bu da GFP ilə ikili etiketləmə təcrübələrində eqFP611-in potensialını nümayiş etdirir. Bitkilərdə eqFP611 ifadəsi və bu flüoresan zülalın GFP ilə eyni vaxtda ifadəsi üçün bir sıra plazmidlər qurulmuşdur. Mitoxondri olaraq hədəflənmiş eqFP611-ni konstitutiv şəkildə ifadə edən transgen tütün bitkiləri yaradıldı. Qırmızı flüoresan növbəti nəsillərə sabit şəkildə ötürüldü və bu bitkilər mitoxondriya üçün daxili marker olan protoplastlar üçün əlverişli mənbəyə çevrildi.

Nəticə

Bitkilərdə eqFP611 uyğun flüoresan reportyor zülaldır. Dəyişdirilməmiş zülal, bitki hüceyrələrinin canlılığına mənfi təsir göstərmədən epiflüoresan mikroskopiya ilə asanlıqla aşkar edilə bilən səviyyələrdə ifadə edilə bilər. Onun subcellular lokalizasiyası N-terminal siqnal ardıcıllığı ilə idarə oluna bilər. eqFP611 və GFP ikili etiketləmə təcrübələrində tam uyğun gəlir.


Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G. Ward, W. W. və Prasher, D. C. (1994) Gen ifadəsi üçün marker kimi Yaşıl Flüoresan Protein. Elm 263, 802–805.

Prasher, D. C. (1995) İşığı görmək üçün GFP-dən istifadə. Trendlər Genet. 11, 320–323.

Heim, R., Prasher, D. C. və Tsien, R. Y. (1994) Dalğa uzunluğu mutasiyaları və yaşıl flüoresan zülalın posttranslational autoksidləşməsi. Proc. Natl. akad. Sci. ABŞ. 91, 12501–12504.

Heim, R., Cubitt, A. B., and R. Y. Tsien (1995) Təkmil yaşıl flüoresan. Təbiət 373, 663–664.

Yang, F., Moss, L. G. və Phillips, G. N. (1996) Yaşıl Floresan Proteinin molekulyar quruluşu, Təbiət Biotexnologiyası 14, 1246–1251.

Ormo, M., Cubitt, A. B., Kallio, K., Gross, L. A. Tsien, R. Y., and Remington, S. J. (1996) Aequorea victoria yaşıl flüoresan zülalının kristal quruluşu. Elm 273, 1392–1395.

Sanger, J. M., Danowski, B. A. və Sanger, J. W. (2000) Canlı hüceyrələrə floresan etiketli alfa-aktinin mikroinyeksiyası. In: Molekulyar Biologiyada Metodlar: İnkişaf Biologiyası Protokolları (Redaktorlar: Tuan, R. S. və Lo, C. W.), Humana Press Vol. III, 449–456.

Dabiri, G. A., Turnacioglu, K. K., Sanger, J. M., and Sanger, J. W. (1997) Canlı embrion kardiyomiyositlərində görüntülənən Myofibrillogenesis. Proc. Natl. akad. Sci. ABŞ 94, 9493–9498.

Doyle, T. və Botstein, D. (1996) In vivo maya kortikal aktin sitoskeletonunun hərəkəti. Proc. Natl. akad. Sci. ABŞ 93, 3886–3891.

Ayoob, J. C., Turnacioglu, K. K., Mittal, B., Sanger, J. M., and Sanger, J. W. (2000) Canlı Kardiyomiyositlərdə Yaşıl Floresan Zülallara Qoşulmuş Titin Fraqmentlərinin Z-bandlarına Hədəflənməsi. Hüceyrə Motil. Sitoskeleton 45, 67–82.

Moores, S. L., Sabry, J. H., and Spudich, J. A. (1996) Canlıda miyozin dinamikası Dictyostelium hüceyrələr. Proc. Natl. akad. Sci. ABŞ 93, 443–446.

Gerisch, G., Albrecht, R., Heizer, C., Hodgkinson, S., and Maniak, M. (1995) Dictyostelium hüceyrələrinin qabaqcıl kənarında koroninin kemoatraktantla idarə olunan yığılması monitorinq edilir. Curr. Biol. 5, 1280–1285 (1995).

Heim, R. və Tsien, R. Y. (1996) Təkmilləşdirilmiş parlaqlıq, daha uzun dalğa uzunluqları və flüoresan enerji ötürülməsi üçün yaşıl flüoresan zülal mühəndisliyi. Curr. Biol. 6, 178–182.

Matz, M. V., Fradkov, A. F., Labas, Y. A. və b. (1999) Bioluminescent olmayan Anthozoa növlərindən flüoresan zülallar. Təbiət Biotexnologiyası 17, 969–973.

Lazarides, E. və Burridge, K. (1975) Alpha-aktinin: qeyri-əzələ hüceyrələrində əzələ struktur proteininin immunofluoresan lokalizasiyası. Hüceyrə 6, 289–298.

Zhukarev, V., Sanger, J. W., Sanger, J. M., Goldman, Y. və Shuman, H. (1997) əzələ ilə bağlanan rodamin phalloidinin sabit vəziyyətində flüoresan qütbləşmə təhlili. Hüceyrə Motil. Sitoskel. 37, 363–377.

Dabiri, G. A., Ayoob, J. C., Turnacioğlu, K. K. Sanger, J. M. və Sanger, J. W. (1999) Canlı hüceyrələrdə miyofibrilogenezi təhlil etmək üçün sitoskeletal zülallarla əlaqəli Yaşıl Flüoresan Zülalların istifadəsi. Enzimologiyada üsullar 302, 171–186.

Weber, M., Moller, K., Welzeck, M. və Schorr, J. (1995) Eukaryotik hüceyrələrdə lipopolisakkaridin transfeksiya səmərəliliyinə təsiri. Biotexnika 19, 930–940.

Turnacioglu, K. K., Sanger, J. W., and Sanger, J. M. (1998) Canlı PtK2 və REF-52 hüceyrələrində monomerik aktin birləşməsinin yerləri. Hüceyrə Motil. Sitoskel. 40, 59–70.

Dabiri, G. A., Turnacioglu, K. K., Ayoob, J. C., Sanger, J. M. və Sanger, J. W. (1999) Tam uzunluqlu və kəsilmiş əzələ zülalları ilə əlaqəli GFP üçün kodlaşdıran plazmidlərlə əsas əzələ hüceyrə mədəniyyətlərinin transfeksiyaları. Hüceyrə Biologiyasında Metodlar 58, 239–260.

Sanger, J. M. və Sanger, J. W. (2000) Sitoskeletal zülalların toxuma mədəniyyəti hüceyrələrinin parçalanma şırımlarına yığılması. Mikroskopiya Res. Tech. 49, 190–201.


İlkin antikorlar zond kimi

Bioloji tədqiqatlarda araşdırma tarixi olan zülal hədəfləri üçün minlərlə ilkin antikor ticari olaraq mövcuddur. Bir neçə çox məşhur tədqiqat hədəfi istisna olmaqla, bu əsas antikorlar aşkar edilə bilən etiketlər olmadan təklif olunur və bir növ ikincil (dolayı) aşkarlama metodu tələb olunur. Buna baxmayaraq, lazım gələrsə, demək olar ki, hər hansı bir antikor biotin, HRP fermenti və ya bir neçə flüorofordan biri ilə etiketlənə bilər.

Təchiz edilən birincil antikorda yerinə yetiriləcək tətbiqdən asılı olaraq müxtəlif saflıq səviyyələri və spesifiklik növləri lazımdır. Yalnız bir neçə parametri qeyd etmək üçün, antikorlar monoklonal və ya poliklonal ola bilər, antiserum və ya afinite ilə təmizlənmiş məhlul kimi təqdim olunur və yerli zülal və ya denatürləşdirilmiş protein aşkarlanması üçün təsdiqlənir.

Əgər maraq doğuran bir antigen üçün heç bir antikor yoxdursa, antigenin hazırlanmış formaları ilə heyvanların immunizasiyası üçün yaxşı qurulmuş üsullardan istifadə edərək yeni antikorlar istehsal edilə bilər (qaldırıla bilər). Antikor istehsalına və təmizlənməsinə kömək etmək üçün müxtəlif reagentlər mövcuddur və müxtəlif şirkətlər antikor istehsalı xidmətlərində ixtisaslaşmışdır.


Fotokonvertasiya olunan flüoresan zülallar: zebra balığının skeletinin təsvirində çox yönlü bir vasitədir

Andy Willaert, Tibbi Genetika Mərkəzi, Biomolekulyar Tibb Departamenti, Gent Universiteti-Universitet Xəstəxanası, Tibbi Tədqiqat Binası – MRB1, Giriş 34, Corneel Heymanslaan 10, B-9000 Gent, Belçika.

Tibbi Genetika Mərkəzi, Biomolekulyar Tibb Departamenti, Gent Universiteti-Universitet Xəstəxanası, Gent, Belçika

Tibbi Genetika Mərkəzi, Biomolekulyar Tibb Departamenti, Gent Universiteti-Universitet Xəstəxanası, Gent, Belçika

Tibbi Genetika Mərkəzi, Biomolekulyar Tibb Departamenti, Gent Universiteti-Universitet Xəstəxanası, Gent, Belçika

Təkamül inkişaf biologiyası, Biologiya şöbəsi, Gent Universiteti, Gent, Belçika

Təkamül inkişaf biologiyası, Biologiya şöbəsi, Gent Universiteti, Gent, Belçika

Təkamül inkişaf biologiyası, Biologiya şöbəsi, Gent Universiteti, Gent, Belçika

Tibbi Genetika Mərkəzi, Biomolekulyar Tibb Departamenti, Gent Universiteti-Universitet Xəstəxanası, Gent, Belçika

Tibbi Genetika Mərkəzi, Biomolekulyar Tibb Departamenti, Gent Universiteti-Universitet Xəstəxanası, Gent, Belçika

Andy Willaert, Tibbi Genetika Mərkəzi, Biomolekulyar Tibb Departamenti, Gent Universiteti-Universitet Xəstəxanası, Tibbi Tədqiqat Binası – MRB1, Giriş 34, Corneel Heymanslaan 10, B-9000 Gent, Belçika.

Maliyyələşdirmə məlumatları: Gent Universiteti, Qrant/Mükafat Nömrələri: BOFMET2015000401, BOF24J2015001401

Mücərrəd

Zebra balığında ən çox tətbiq olunan üsullardan biri (Danio rerio) tədqiqat transgen reportyor xətlərindən istifadə edərək xüsusi hüceyrə populyasiyalarının vizuallaşdırılması və ya manipulyasiyasıdır. Yaşıl Flüoresan Protein (GFP) və ya mCherry kimi tez-tez istifadə olunan flüoroforların hüceyrə və ya toxuma xüsusi ifadəsini göstərən bu transgen zebra balığının nəsli müasir texnikalardan istifadə etməklə nisbətən asandır. Fərqli dalğa uzunluqlarına malik olan və müxtəlif promotorlar tərəfindən idarə olunan flüoroforlar eyni heyvanda eyni vaxtda izlənilə bilər. Fotokonvertasiya olunan flüoresan zülallar (pcFPs) bu standart flüoroforlardan fərqlidir, çünki onların emissiya spektri UV işığına məruz qaldıqda dəyişir, bu prosesə fotokonversiya deyilir. Burada, əvvəllər yaradılan zebra balığı skeletinin tədqiqatında həm tək, həm də ikili flüoroxrom görüntüləmə üçün pcFP-lərdən istifadənin faydaları və çox yönlülüyü. osx:Kaede transgen xətti təsvir edilmişdir. Bu xəttdə Kaede'nin nəzarəti altında olduğu ifadə edilir osterix, başqa cür tanınır sp7, yetişməmiş osteoblastları etiketləyən promotor, UV işığı ilə şüalanma zamanı yaşıldan qırmızı flüoresansa keçə bilər. Birincisi, bu araşdırma bunu göstərir osx:Kaede əvvəllər təsvir edilənə bənzər bir ifadə nümunəsi nümayiş etdirir osx:nuGFP transgenik xətti həm sürfə, həm də yetkin mərhələdə, bununla da yetişməmiş osteoblastların təsviri üçün bu xəttin istifadəsini təsdiqləyir. Daha dərin təcrübələr müxtəlif tətbiqləri vurğulayır osx:Kaede, soy təqibi və onun birləşmiş istifadəsi kimi in vivo skeletin boyanması və digər transgenik fonlar. ilə birlikdə mineral boyama osx:Kaede, notokordun osteoblastdan müstəqil minerallaşmasını təsdiqləyir. Osteoblast nəslinin izlənməsi üzgəc regenerasiyası zamanı skleroblastların miqrasiyasını və deferensasiyasını aşkar edir. Nəhayət, bu tədqiqat göstərir ki, iki transgeni birləşdirən, osx:Kaede və osc:Oxşar emissiya dalğa uzunluqlarına malik GFP, Kaede kimi bir pcFP istifadə edərkən mümkündür.


Əlaqələr

NanoBiofotonika şöbəsi, Maks Plank Biofiziki Kimya İnstitutu, Am Fassberg 11, Göttingen, 37077, Almaniya

Steffen J. Sahl, Stefan W. Hell və Stefan Jakobs

Optik nanoskopiya şöbəsi, Maks Plank Tibbi Tədqiqatlar İnstitutu, Jahnstrasse 29, 69120, Heidelberg, Almaniya

Alman Xərçəng Araşdırma Mərkəzi (DKFZ), BioQuant, Im Neuenheimer Feld 267, 69120, Heidelberg, Almaniya

Nevrologiya şöbəsi, Göttingen Universiteti Tibb Fakültəsi, Robert-Koch-Strasse 40, 37075, Göttingen, Almaniya

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Töhfələr

Hər üç müəllif məqalənin hazırlanmasının bütün dörd aspektinə (məqalə üçün məlumatların araşdırılması, məzmunun müzakirəsinə əhəmiyyətli töhfələr, yazılması və təqdim edilməzdən əvvəl əlyazmanın nəzərdən keçirilməsi və redaktə edilməsi) bərabər töhfə veriblər.

Müvafiq müəlliflər


Metodlar

Bitki materialları və böyümə şəraiti

Populus klonlar P. davidiana × bolleana (Şanxin yang kimi tanınır, Prof. Zhang [63] tərəfindən hədiyyə edilmiş, Heilongjiang əyalətinin Meşə və Ətraf Mühit Akademiyasında yaranmışdır, Heilongjiang, Çin), P. tremula × alba ‘INRA 717-1B4’ (Fransa Kənd Təsərrüfatı, Qida və Ətraf Mühit üzrə Fransa Milli Tədqiqat İnstitutunda yaradılan Corciya Universiteti, ABŞ, Prof. Z. Yedən hədiyyə), P. alba × glandulosa '84 K' (Cənubi Koreyadan Çin Meşəçilik Akademiyası tərəfindən təqdim edilmişdir, Pekin, Çin), P. euramericana '74/76' (İtaliyadan Çin Meşəçilik Akademiyası tərəfindən təqdim edilmişdir, Pekin, Çin), P. tomentosa '741' (Hebei Kənd Təsərrüfatı Universiteti, Hebei, Çin), P. tomentosa 'B331' (Pekin Meşə Universiteti, Pekin, Çin), P. tomentosa 'BJHR01' (Pekin Kənd Təsərrüfatı və Meşə Elmləri Akademiyası, Pekin, Çin və Pekin Meşəçilik Universitetində, Pekin, Çin) birgə yetişdirilmişdir. P. popularis '35-44' (Çin Meşəçilik Akademiyası, Pekin, Çin), P. davidiana (Heilongjiang, Çin, Şimal-Şərqi Meşə Universiteti, Prof. T. Jiangdan hədiyyə, Heilongjiang, Çin), P. alba var. piramidalis (Prof. C. Xu, Cənub-Qərb Universiteti, Çonqinq, Çin, Sincanda, Çindən bir hədiyyə), P. trichocarpa (Nisqually-1, Şimali Amerika) ilkin olaraq 3% saxaroza və 0,6% agar əlavə edilmiş Murashige və Skoog (MS) mühitində (Phytotech, M519) becərildi. Qovaq bitkilərinin klonal yayılması Wang et al tərəfindən təsvir edildiyi kimi aparılmışdır. [68] və bitkilər böyümə kamerasında 25 °C-də 16 saat/8 saat gündüz/gecə fotoperiodu altında MS steril mühitində becərildi. 3 həftəlik böyümədən sonra, köklü bitkilər torpağa köçürüldü və iqlim kamerasında 25 °C-də 16 saat/8 saat gündüz/gecə fotoperiodu altında yetişdirildi. Torpağa köçürüldükdən sonra, yarpaqlardan artıq su itkisinin qarşısını almaq üçün bitkilər bir həftə şəffaf qapaqlarla örtülmüşdür. Qovaq klonlarının ekranlaşdırıldığı ilk təcrübələr üçün qovaq bitkiləri infiltrasiyadan bir ay əvvəl bir iqlim kamerasında yetişdirildi. Bitki yaşının və yarpaq yaşının təsirini qiymətləndirən təcrübə üçün P. davidiana × bolleana keçici ekspressiya səmərəliliyinə görə, 3 həftəlik in-vitro mədəni bitkilərin beş partiyası 3 gün ara ilə torpağa köçürüldü. Torpaqdakı bitkilərin ilk partiyası 3-4 həftəlik böyümədən sonra PI 14 yaşına çatdıqda, PI 10, 11, 12, 13, müxtəlif inkişaf mərhələsində olan bitkilərin LPI 4 yarpaqlarında aqroinfiltrasiya aparıldı [39, 40]. 14 və yarpaqlarda LPI 3-6 bitkilərdən PI 12. Sonrakı təcrübələr üçün AS konsentrasiyasının, bakteriya böyümə mərhələsinin, bakteriya hüceyrə sıxlığının, infiltrasiya mühitinin və keçici ekspressiyanın müddətinin keçici ekspressiya səmərəliliyinə təsirini qiymətləndirmək üçün bitkilər 2 həftə iqlim kamerasında yetişdirilir, yəni PI

Şpris yarpaqlarının sızması

Agrobacterium tumefaciens gərginlik GV3101, A. tumefaciens EHA105 və A. rhizogenes C58C1 laboratoriyadan alınmışdır və A. tumefaciens AGL1 və LBA4404 ştammları Shanghai Weidi Biotechnology Co., Ltd.-dən (Şanxay, Çin) alınmışdır. İnfiltrasiyadan bir gün əvvəl, agar plitələrindəki tək klondan başlayaraq spesifik binar vektoru olan aqrobakteriyalar (Şəkil S6) bir gecədə 28 °C-də çalkalayıcıda LB maye mühitində becərildi. Ertəsi gün səhər təzə mühitə köhnə süspansiyon kulturaları (1/50 nisbət, v/v) ilə OD-a qədər başqa 5-6 saat peyvənd edilərək yeni bakteriya kulturası başladıldı.600

1. Sonra mədəniyyətlər Eppendorf borularına köçürüldü və 8000-də sentrifuqa edildi. g otaq temperaturunda 2 dəqiqə və bildirilmiş infiltrasiya mühitində dayandırılıb [10 mM MgCl2, 5 mM MES-KOH (pH 5.6) və 0.2 mM AS] [29] yekun OD-yə qədər600

İlkin sınaqlarda 1. Sonrakı təcrübələr üçün aqrobakterial mədəniyyətlər dəyişdirilmiş infiltrasiya mühitində [10 mM MgCl] dayandırıldı.2, 5 mM MES-KOH (pH 5.6) və 1.6 mM AS] əvəzinə. Bakterial mədəniyyətin böyümə mərhələlərinin və hüceyrə konsentrasiyalarının keçici ekspressiya səmərəliliyinə təsirini qiymətləndirən təcrübələr üçün, ya OD ilə bir gecəlik mədəniyyət600 of

2.0 son OD ilə dəyişdirilmiş infiltrasiya mühitində dayandırıldıqdan sonra birbaşa infiltrasiya üçün istifadə edilmişdir.600 0,2, 0,5, 1,0, 1,5 və ya 2,0 və ya yenilənmiş mədəniyyət son OD-yə qədər böyüdüldü600 0,2, 0,5, 1,0, 1,5 və ya 2,0 və orijinal kultura ilə eyni OD ilə dəyişdirilmiş infiltrasiya mühitində yenidən dayandırılır. Bakterial süspansiyon aqroinfiltrasiyadan əvvəl otaq temperaturunda 1-2 saat qaranlıqda yerləşdirildi.

Şpris infiltrasiya üçün istifadə olunan bitkilər yuxarıda təsvir edilmişdir. Bakterial süspansiyonlar iynəsiz 1 ml-lik şprisin ucunu yarpağın aşağı tərəfinə basaraq və pistona yumşaq bir şəkildə basaraq stomata vasitəsilə qovaq yarpaqlarına infiltrasiya edilmişdir. Normalda infiltrasiya edilmiş hissələri böyütmək üçün bir yarpağa bir neçə inyeksiya tətbiq edilirdi. Yarpaqların sızmış sahəsi marker qələmlə dövrələnmiş, bundan sonra qovaq bitkiləri iqlim kamerasında 5 gün ərzində yetişdirilmiş və gen ifadəsinin qiymətləndirilməsi üçün istifadə edilmişdir. İki və ya daha çox hədəf genin birgə ifadəsi üçün bərabər həcmdə A. tumefaciens OD ilə suspenziya600

İnfiltrasiya mühitindəki 1,0 infiltrasiyadan əvvəl qarışdırıldı.

LUC fəaliyyət analizi

CaMV 35S:LUC vektor (Şəkil S6a) Prof. Vanqdan (Çin Kənd Təsərrüfatı Universiteti, Pekin, Çin) hədiyyə idi [69]. Yarpaqların infiltrasiya olunmuş hissəsindən ümumi zülal çıxarıldı və Lüsiferaza Təhlili Reagenti (Promega) və lüminesans oxuyucusu (Glo-Max®20/20 Promega) istifadə edərək atəşböcəyi lusiferaza aktivliyini aşkar etmək üçün 50 μL protein ekstraktı istifadə edildi. istehsalçının protokolu. Zülalın konsentrasiyası Bradford protein analizi ilə ölçüldü. LUC fəaliyyəti mikroqram zülal üçün işıq intensivliyi ilə hesablanmışdır. Hər bir məlumat nöqtəsi ən azı səkkiz təkrarı təmsil edirdi. Üç müstəqil təcrübə aparıldı.

GUS boyanması

pCAMBIA2301-CaMV ilə çevrilmiş yarpaqlar, kallus və bitki 35S:GUS-intro (Şəkil S6b) təsvir olunduğu kimi β-qlükuronidaza (GUS) aktivliyi üçün boyanmışdır [70]. İçərisinə bitki mənşəli intron daxil edilib GUS müxbir genin ifadəsindən qaçınmaq üçün Aqrobakteriya.

Hüceyrəaltı lokalizasiya və BiFC analizi

Bir sıra zülallar P. davidiana × bolleana onların subcellular lokalizasiyası üçün tədqiq edilmişdir. GFP etiketli vektorları hazırlamaq üçün, kodlaşdırma bölgələri CBL1, MTP1, C4H, GT47C, MYB221, və PrxQ Müvafiq məhdudlaşdırıcı fermentlərin daxil edildiyi xüsusi primerlərdən istifadə edərək əks transkripsiya polimeraza zəncirvari reaksiyası (RT-PCR) ilə gücləndirildi (Cədvəl S1), sonra pSuper1300- binar vektoruna klonlaşdırıldı.SUPER:GFP (Şəkil S6c). The A. tumefaciens Bu vektorlardan birini özündə saxlayan GV3101 asqısı LPI 4 yarpaqlarına sızmışdır. P. davidiana × bolleana yuxarıda Nəticələr bölməsində təsvir edilmiş optimal eksperimental parametrlər altında şprisdən istifadə edərək PI 11-12 bitkilərini. 5 dpi-də infiltrasiya edilmiş yarpaqlar ayrıldı və GFP flüoresan siqnalları 488 nm-də həyəcan dalğası uzunluğu və 510 nm-də emissiya dalğası ilə Nikon ters çevrilmiş flüoresan mikroskop TE2000-E altında müşahidə edildi. Hüceyrəaltı bölmələri müəyyən etmək üçün plazma membranı 1 dəqiqə ərzində FM4-64 (20 mq/L, Invitrogen) ilə boyandı, nüvə 10-20 dəqiqə ərzində DAPI (1 mq/mL, Sigma) ilə boyandı, ER ER marker füzyon zülalı HDEL-mCherry [71] istifadə edilməklə, Golgi isə Golgi marker füzyon proteini NAG-mCherry [71] istifadə edilməklə göstərilmişdir. FM4-64-ün flüoresansı 543 nm-də həyəcanlanma və 610 nm-də emissiya və DAPI 358 nm-də həyəcanlanma və 461 nm-də emissiya ilə aşkar edildi. HDEL-mCherry və NAG-mCherry füzyon zülallarının qırmızı flüoresan siqnalları 543 nm həyəcan dalğa uzunluğunda və 610 nm emissiya dalğa uzunluğunda monitorinq edildi. Xlorofil 488 nm həyəcanlandırmada və 681 nm emissiyada avtomatik flüoresans ilə aşkar edilmişdir.

BiFC analizi üçün kodlaşdırma bölgəsi AtWRKY40 xüsusi primerlərdən istifadə etməklə gücləndirilmişdir (Cədvəl S1) və pSPYNE173 (NE) və pSPYCEM (CE) vektorlarına klonlaşdırılmışdır (Şəkil S6e) [72]. YFP-nin flüoresan siqnalları 488 nm həyəcanlanmada və 510 nm emissiyada müşahidə edildi. Nüvənin DAPI boyası ilə vizuallaşdırılması yuxarıda göstərildiyi kimi aparılmışdır.

Split lusiferaza analizi

GV3101 Aqrobakteriyalar konstruksiyalarını daşıyır 35S:AtNRT3.1-Nluc, 35S:AtNRT2.1-Cluc, 35S:Nluc, və 35S:Cluc (Şəkil S6f) Prof. Vanqdan (Çin Kənd Təsərrüfatı Universiteti, Pekin, Çin) hədiyyə edilmişdir. Split-lusiferaza analizi təsvir edildiyi kimi [73] bəzi dəyişikliklərlə aparılmışdır. Xüsusilə, transformasiya edilmiş yarpaqlar iynəsiz şprisdən istifadə edərək 5 dpi-də 2 mM lusiferin ilə infiltrasiya edilmiş və sonra flüoresansı söndürmək üçün 6 dəqiqə qaranlıqda qalmışdır. Lüminesans intensivliyi kamera - 110 °C-ə qədər soyuduqda 5-10 dəqiqəlik ekspozisiya müddəti ilə aşağı işıqda soyudulmuş CCD görüntüləmə aparatı (Lumazone PyLoN2048B, Roper Scientific) tərəfindən çəkildi. Şəklin alınması Light Field proqramı tərəfindən idarə edilib və işlənib.

Western blot və co-immunoprecipitation testləri

Qərb ləkəsi üçün, sızmış yarpaqları ilə A. tumefaciens GV3101 və ya EHA105 daşıyan Super:GFP-Bayraq (Şəkil S6d) 5 dpi-də yığılmışdır. Yarpaqların infiltrasiya olunmuş hissələrindən ümumi zülalların çıxarılması və western blot analizi Ticconi et al. [71]. Qısaca, 10% SDS-PAGE-də 15-30 μg protein ayrıldı. Əsas antikorlar kimi Anti-Flag (MBL) və anti-Actin (Abmart) istifadə edilmişdir. Şəklin alınması CCD uzaqdan idarə olunan elmi görüntüləmə sistemi (LAS-4000, FUJIFILM) tərəfindən çəkilmişdir. Birgə immunopresipitasiya analizi üçün, A. tumefaciens GV3101 sığınacaq Super:PtoUBC34s-Bayraq və ya Super: PtoMYB221-Myc (Şəkil S6g) infiltrasiya üçün istifadə edilmişdir. Ko-immunopresipitasiya təhlili əvvəllər təsvir edildiyi kimi aparılmışdır [47].

FRET-FLIM analizi

PtoMYB221 və PtoUBC34s arasındakı qarşılıqlı əlaqə əvvəlki tədqiqatda təsvir edilmişdir [47]. Donor vektoru pGreen0029-35S:YFP-PtoUBC34s və reseptor vektoru pGreen0029-35S:PtoMYB221-RFP (Şəkil S6h) vasitəsilə qovaq yarpaqlarına birgə köçürülmüşdür Aqrobakteriya-yuxarıda təsvir olunduğu kimi vasitəli şpris infiltrasiya. FRET-FLIM, bildirilən metoda uyğun olaraq əlavə olaraq Picoquant picoHarp300 (Almaniya) nəzarətçisi ilə təchiz edilmiş Olympus inverted FV1200 mikroskopunda həyata keçirilmişdir [74]. YFP-PdbUBC34s bir obyektiv (40 × suya batırma, NA 1.2) vasitəsilə 40 MHz təkrar tezliyində işləyən pikosaniyə impulslu diod lazerindən istifadə edərək 488 nm-də həyəcanlandı. Buraxılan işıq eyni obyektivdə toplandı və 520/35 nm diapazonlu filtrlə süzüldü. Flüoresan daha sonra MPD SPAD detektoru ilə aşkar edildi. Şəkillərə maraq göstərən bölgə seçilmiş və 20.000 və ya daha çox foton əldə etməklə əldə edilmişdir. SymphoTime 64 proqramı (PicoQuant, Almaniya) hər pikselə görə çürümə əyrilərini hesablamaq üçün istifadə edilmiş və çürümə modeli ilə təchiz edilmişdir. Donor YFP-PdbUBC34s və PdbMYB221-RFP reseptoru ilə test birləşməsi üçün ikiqat eksponensial seçildi və mono-eksponensial model yalnız donor YFP-PdbUBC34s üçün nəzarət kimi tətbiq edildi.

Transaksiya təhlilləri

CaMV vektorları 35S-GAL4DB-SUPRD və CaMV 35S-GAL4-TATA-Ω-LUC-No Prof. Masaru Ohme-Takaqinin (Milli Qabaqcıl Sənaye Texnologiyaları və Elm İnstitutu, Tokio, Yaponiya) [47] hədiyyələri idi. GAL4DB-SUPRDGAL4-TATA-Ω primerlərlə gücləndirildi (Cədvəl S1) və müvafiq olaraq pGreenII 62-SK və pGreenII 0800-LUC ikili vektorlarına klonlaşdırıldı (Şəkil S6i), effektor vektoru və məruzəçi vektoru istehsal edildi. ifadə kaseti Renilla lusiferaza (RLuc) da daxili nəzarət kimi xidmət edən pGreenII 0800-LUC vektoruna daxil edilmişdir. Əməliyyat təhlilləri istehsalçının protokoluna uyğun olaraq Dual-Luciferase Reporter Assay System (#E1980, Promega) ilə aparılmışdır. Hər bir transformasiyanın LUC ifadə dəyərləri RLuc qiymətlərinə normallaşdırıldı. Hər bir məlumat nöqtəsi ən azı səkkiz təkrarı təmsil edir. Üç müstəqil təcrübə aparıldı.

İkinci dərəcəli divarların induksiyası

SCW biosintezinin üç əsas aktivatorunun kodlaşdırma bölgələri, yəni VNS07/WND6A, VNS09/WND2A, və MYB020, -dən gücləndirilmişdir P. davidiana × bolleana Primerlərlə cDNA (Cədvəl S1) və qovaq yarpaqlarında keçici həddindən artıq ifadə üçün pGreenII 62-SK binar vektoruna klonlanmış (Şəkil S6i). Mənfi nəzarət kimi pGreenII 62-SK vektorundan istifadə edilmişdir. Müvəqqəti olaraq dəyişdirilmiş yarpaqlar 10 dpi-də əsas fuksinlə boyandı və daha əvvəl təsvir edildiyi kimi konfokal mikroskopla ikincil divar çökməsi üçün müşahidə edildi [75].

Stabil çevrilmiş qovaq nəsli

İnfiltrasiya ilə yarpaqları Aqrobakteriya GV3101 ikili plazmid pSuper1300-Super:GFP (Şəkil S6c) hygromycin müqaviməti və ya CaMV ilə35S:GUS-intro (Şəkil S6b) kanamisin müqaviməti ilə 9 dpi-də bitkilərdən yığılmışdır. Bu yarpaqlar axan su altında yaxşıca yuyulur, 0,01% Tween 20 əlavə edilmiş 2% natrium hipoklorit məhlulunda 10 dəqiqə sterilizasiya edilir və üç dəfə steril su ilə yuyulur. İnfiltrasiya zamanı qeyd olunan yarpaqların infiltrasiya olunmuş hissəsi orta damardan qaçmaq üçün ehtiyatla parçalara kəsilmişdir. Transformasiya edilmiş bitkilər kallusun səbəb olduğu dolayı orqanogenez yolu ilə bərpa edilmişdir. Əvvəlcə kallusun induksiyası 1 mq/L 2,4-D, 0,1 mq/L NAA, 0,2 mq/L 6-BA, 0,01 mq/L TDZ, 0,1 q/L Tim, 0,1 q ilə əlavə edilmiş MS mühitində aparılmışdır. /L Cefo və 4,5 mq/L hiqromisin (GFP transformantları üçün) və ya 50 mq/l kanamisin (GUS transformantları üçün) 25 °C qaranlıqda 3-4 həftə ərzində. Daha sonra kalluslar atıcı mühitə köçürüldü [MS mühiti 0,1 mq/l NAA, 0,2 mq/L 6-BA, 0,01 mq/l TDZ, 0,1 q/l Tim, 0,1 q/l Cefo və 4,5 mq/ ilə əlavə edildi. L hiqromisin (GFP transformantları üçün) və ya 50 mq/L kanamisin (GUS transformantları üçün)] və 25 °C-də 16 saat işıq/8 saat işıq/qaranlıq dövrü ilə becərilir. Bu kallilər tumurcuqlar əmələ gələnə qədər hər 2 həftədən bir təzə atıcılıq mühitində alt kultura edilirdi. Tumurcuqlar apikal ucundan təqribən 1,0 sm aşağı kəsilmiş və kökləmə mühitində becərilmişdir (MS mühiti 0,1 mq/L NAA, 0,1 q/L Tim, 0,1 q/L Cefo və 4,5 mq/L hiqromisinlə əlavə edilmişdir (GFP transformantları üçün) ) və ya 50 mq/L kanamisin (GUS transformantları üçün)) 25 °C və 16 saat işıq/8 saat işıq/qaranlıq dövrlərində. GFP müsbət kallilər tumurcuqların bərpası üçün köçürülməzdən əvvəl DFP-1 İkili Floresan Zülallı Fənər (Gecə Dənizi, ABŞ) altında yoxlanıldı. Calli ilə tanış oldu GUS regenerasiya edilmiş tumurcuqlar kəsildikdən sonra GUS üçün boyanmışdır. Köklənmə mühitinə köçürüldükdən sonra 5-10 gün ərzində köklərin göründüyü kök regenerantları müxbirlərin GFP və ya GUS ifadəsi üçün yoxlanıldı. Birbaşa orqanogenez vasitəsilə transformasiya daha əvvəl təsvir edildiyi kimi aparılmışdır [63].

GFP məruzəçisini ifadə edən transformasiya edilmiş kallus və bütöv bitkilərdə GFP flüoresan siqnalları DFP-1 Dual Floresan Zülal Fənərindən (Gecə Dənizi, ABŞ) istifadə edilərək müşahidə edildi. Bitki materialları RB-Royal Blue (400-460 nm) ilə işıqlandırıldı və sarı filtr vasitəsilə müşahidə edildi və fotoşəkili çəkildi.

Mikroskopiya

Qovaq yarpaqları LPI 4, LPI 3 yarpaqları istisna olmaqla P. trichocarpa, yarpaqların daxili quruluşunu araşdırmaq üçün istifadə edilmişdir. Yarpaqların eninə kəsikləri əvvəllər təsvir edildiyi kimi hazırlanmışdır [76]. Beş mikrometr qalınlığında kəsiklər mikrotomla (Leica RM2265, Almaniya) kəsilmiş, əvvəllər [68] təsvir edildiyi kimi toluidin mavisi O (TBO) ilə boyanmış və Leica DM 5500 B işıq mikroskopu (Leica, Almaniya) ilə müşahidə edilmişdir.


Müzakirə

Yaşıl flüoresan GECI-lər hal-hazırda neyron siqnalının in vivo vizuallaşdırılması üçün ən yüksək effektiv vasitələr olsa da, biz gözləyirik ki, onlar bir gün daha uzun dalğa uzunluğunun flüoresansı ilə əlaqəli üstünlüklərə görə qırmızı flüoresan GECI-lər tərəfindən lazımsız hala salınacaq. Dalğa uzunluğu artdıqca toxumanın keçiriciliyi artır, buna görə də qırmızı flüoresan GECI-lər bütün digər xüsusiyyətlərin ekvivalent olduğunu fərz edərək, yaşıl flüoresan GECI-lərlə mümkün olduğundan daha dərin beyin toxumasında neyron fəaliyyətini təsvir etməyə imkan verəcəkdir [24, 30]. Bundan əlavə, qırmızı flüoresan GECI-lər yaşıl flüoresan göstəricilərlə birlikdə çoxparametrli təsviri təmin edir və ChR2 [42] kimi mavi işıqla aktivləşdirilə bilən optogenetik aktuatorlarla birlikdə istifadə edildikdə eyni vaxtda təsviri və optik aktivləşdirməni asanlaşdırır. Bununla belə, geniş şəkildə tanınan [13, 19, 22, 24], qırmızı GECI-lər hazırda ən yüksək optimallaşdırılmış yaşıl GECI-lərlə (yəni, GCaMP6) [17] ilə müqayisədə bir sıra məhdudiyyətlərdən əziyyət çəkirlər. Bu məhdudiyyətlərə RCaMP variantları üçün həssaslığın azalması və R-GECO variantları üçün mürəkkəb fotofizika və lizosomal yığılma daxildir. Həm yaşıl, həm də qırmızı GECI-lər analoji dizayna malik olduğundan və eyni Ca 2+ bağlayan domenləri ehtiva etdiyinə görə, bu arzuolunmaz xüsusiyyətlər qırmızı GECI-lərin yaradılması üçün istifadə olunan RFP skafoldu ilə əlaqədardır.

Mövcud RFP iskeleləri ilə əlaqəli məhdudiyyətləri aradan qaldırmaq üçün diqqətimizi ifadə edildikdə parlaq və bərabər paylanmış flüoresans verməyə meylli olan monomerik RFP-lərin (yəni, mKate və onun törəmələri) eqFP578 törəmə nəslinə yönəltdik [7,8,9]. transgen siçanların neyronlarında [31]. Yarım rasional dizayn və istiqamətləndirilmiş təkamüldən istifadə edərək, biz mKate variantı FusionRed [9] əsasında yeni qırmızı flüoresan Ca 2+ indikatoru K-GECO1 hazırladıq. Biz K-GECO1-in başlanğıc şablon RFP ilə əlaqəli əlverişli xüsusiyyətləri saxlayacağını gözləyirdik. Biz bu gözləntinin ümumiyyətlə doğru olduğunu gördük, çünki dissosiasiya olunmuş siçovul neyronlarında, zebra balığı neyronlarında və ya K-GECO1 ifadə edən sabit siçan beyin toxumasında lizosomal aqreqasiya müşahidə etmədik. Bəzi flüoresan nöqtələrə bənzər strukturlar in vivo funksional görüntüləmə zamanı müşahidə edilmişdir.

K-GECO1-in digər fərqləndirici xüsusiyyəti ckkap peptidinin Ca 2+ bağlayıcı motivi üçün CaM bağlayıcı tərəfdaş kimi istifadə edilməsidir. Əvvəlki hesabatlara [23, 35] uyğun olaraq, ckkap/CaM motivi daha aşağı görünən bir görünüş verdi. Kd Ca 2+ və daha sürətli kinetika üçün (RS20/CaM ilə müqayisədə) və 1-ə yaxın görünən Hill əmsalı. K-GECO1-in böyük flüoresan reaksiyasından göründüyü kimi, bu xüsusiyyətlər fizioloji diapazonlarda Ca 2+ dinamikasının daha həssas aşkarlanmasına imkan verməlidir. tək fəaliyyət potensialı üçün amplituda. 1-ə yaxın Hill əmsalı ilə K-GECO1 çoxlu stimuldan sonra daha xətti Ca 2+ cavabını təmin etməlidir.

K-GECO1-in rentgen kristal quruluşu indikatorun R-GECO1 [22, 29] üçün təklif edilənə bənzər öz-özünə flüoresan modulyasiya mexanizminə malik olduğunu göstərir. Flüoresan modulyasiya mexanizminin CaM qalığı ilə qarşılıqlı təsirdən asılı olduğu GCaMP-dən fərqli olaraq [43] (Şəkil 2l), K-GECO1 Ca 2+ ilə bağlı vəziyyət çox güman ki, fenolat qrupu arasında hidrogen bağı ilə sabitləşir. xromofor və linker1 qalığı Asn32 (şəkil 2i). This makes the cpFusionRed protein in K-GECO1 a potentially useful template as a signal transduction domain to be combined with other binding domains for development of new types of red fluorescent indicators. The crystal structure also reveals that the ckkap/CaM motif in K-GECO1 has a reversed binding orientation for CaM compared with the RS20/CaM binding patterns in R-GECO1, RCaMP, and GCaMP6 (Fig. 2e–h). These results indicate that the GCaMP-like design is versatile enough to tolerate different peptide conformations and CaM orientations, and that exploring a wider range of CaM binding partners is likely to lead to GECIs with new and improved properties.

First-generation red GECIs, including mApple-based R-GECO1 and mRuby-based RCaMP1h, have been optimized using a neuron screening platform [24, 44], resulting in jRGECO1a and jRCaMP1a/b with greatly improved in vivo performance for detection of action potentials. Although K-GECO1 is a first-generation red GECI, it already provides performance that, by some criteria, is comparable to second-generation red GECIs. Specifically, K-GECO1 has a fluorescent response to single action potentials that is similar to that of jRGECO1a (and superior to jRCaMP1a/b) and faster dissociation kinetics than either jRGECO1a or jRCaMP1a/b. However, by other criteria, K-GECO1 will require further optimization to match the performance of second-generation red GECIs. For example, K-GECO1 does not provide the same level of in vivo sensitivity as the highly optimized jRGECO1a. In addition, K-GECO1 showed some blue-light-dependent photoactivation during in vitro characterization, though less so than R-GECO1. The photoactivation of K-GECO1 was not detectable under the illumination condition in our characterizations in cultured dissociated neurons (Additional file 5: Figure S3c) or in iPSC-CMs (Fig. 4c), suggesting that it is more suitable than R-GECO1 for use with blue/cyan-excitable optogenetic actuators. Nevertheless, the occurrence (or absence) of photoactivation will depend on the specific illumination conditions, and so appropriate controls (i.e., blue-light illumination of tissue expressing K-GECO1 but no optogenetic actuator) must be performed. Future efforts to screen K-GECO variants in neuronal cells, as was done for R-GECO1 and RCaMP1h [24], could lead to the discovery of improved variants with higher levels of expression in neurons, Kds tuned to the range of neuronal cytoplasmic Ca 2+ concentrations, increased cooperativity of Ca 2+ binding to improve single action potential detection, diminished lysosomal accumulation, and minimum blue-light activation.


Proqramlar

Single or multiple promoter reporter monitoring studies

Live-cell monitoring of promoter reporters

Additional product information

Please see the product's Certificate of Analysis for information about storage conditions, product components, and technical specifications. Please see the Kit Components List to determine kit components. Certificates of Analysis and Kit Components Lists are located under the Documents tab.

Takara Bio USA, Inc.
Amerika Birləşmiş Ştatları/Kanada: +1.800.662.2566 &bull Asiya Sakit Okean: +1.650.919.7300 &bull Avropa: +33.(0)1.3904.6880 &bull Yaponiya: +81.(0)77.565.6999
YALNIZ TƏDQİQAT ÜÇÜN İSTİFADƏ. DİAQNOSTİK PROSEDURLARDA İSTİFADƏ ÜÇÜN DEYİL. © 2021 Takara Bio Inc. Bütün hüquqlar qorunur. Bütün ticarət nişanları Takara Bio Inc. və ya onun ABŞ və/və ya digər ölkələrdəki filial(lar)ının və ya onların müvafiq sahiblərinin mülkiyyətidir. Bəzi əmtəə nişanları bütün yurisdiksiyalarda qeydə alınmaya bilər. Əlavə məhsul, əqli mülkiyyət və məhdudlaşdırılmış istifadə məlumatı takarabio.com saytında mövcuddur.

Takara Bio Europe biotexnologiya vasitəsilə insan vəziyyətinin yaxşılaşdırılmasına sadiq olan aparıcı həyat elmləri şirkəti olan Takara Bio Group-un üzvüdür. Takara, Clontech və Cellartis brendlərimiz vasitəsilə bizim missiyamız kəşfi sürətləndirmək üçün yüksək keyfiyyətli innovativ alətlər və xidmətlər hazırlamaqdır.


Green Fluorescent Protein Quantification in Microplates

The assessment of gene expression is an important tool in molecular and cellular biology. Several methods have been developed, but most cannot provide real-time information concerning expression. Here we report the quantitation of cellular extracts from cells expressing the gene for green fluorescent protein (GFP) using the FL600 Fluorescent Microplate Reader in order to demonstrate the feasibility of GFP to assess "real-time" gene expression.

Giriş

The assessment of gene expression has become one of the most utilized tools in molecular and cellular biology today. The expression of transiently and/or permanently transfected cloned DNA sequences allows the investigator to determine the transcriptional activity of promoters. Unfortunately, in most instances the natural product of the promoter cannot be assayed in a quantitative manner. In the past, the promoter was joined to a reporter gene which encoded for a protein with unique enzymatic activity, such as ß-galactosidase or chloramphenicol acetyltransferase, that could be assayed easily. The level of gene activity would then be monitored as a function of that enzymatic activity. These assays, while easy to perform and generally quite quantitative, suffer from their inability to be measured in "real time". In these assays it was generally necessary to make cell lysates and perform the reaction at some later time on the lysates. The Achilles&rsquo heel of these experiments is the stability of the enzyme throughout storage and during the actual assay. Recently, the use of inherently fluorescent proteins, such as green fluorescent protein (GFP), has been described as a means to assess gene expression and transfection efficiency.

Green fluorescent protein (GFP) from the jellyfish Aequorea victoria is a 27-kDalton monomer protein consisting of 238 amino acids which is naturally fluorescent (1). Its role is to transduce, by energy transfer, the blue chemiluminescence of another protein, aequorin, into green fluorescent light (10). The wild type green fluorescent protein (wtGFP) has an absorbance/excitation peak at 395 nm with a minor peak at 475 nm (UV to blue light), and has a peak emission at 508 nm, with a shoulder at 540 nm (green light). The crystal structure of the protein suggests a closely packed b-can enclosing a a-helix (9). The chemical structure necessary for fluorescence has been determined and the data suggest a hexapeptide that contains a cyclic-tripeptide moiety, serine, dehydro-tyrosine, glycine, which is covalently linked through the protein&rsquos peptide backbone (2). The exact mechanism of formation of this unique structure is unknown, but it takes place post-translationally and requires molecular oxygen (6). Interestingly, the hexapeptide is contained within the a-helix portion of the protein suggesting that the b-can provides the means to exclude solvents and molecular oxygen, which tend to quench fluorescent signal (9). Unlike other bioluminescent reporters, which require additional proteins, substrates, or cofactors to emit light, GFP is inherently fluorescent and its fluorescence is not species-specific.

As shown in Table 1, several mutations have been made to the wild type protein (wtGFP) to improve one or more characteristics of the protein. The most widely used variants are the red-shifted GFPs. These mutants have a single excitation peak around 488 nm rather than the primary excitation peak and minor peak found in the wild type protein (Table 2). These variants do however, have the same emission spectra as wild type protein. EGFP, also known as GFPmut 1:23, has two mutations in the chromophore region (Table 1) and is reported to have a single, red-shifted excitation peak at 488 nm and fluoresces with greater intensity than wild type protein (3). The GFP-S65T mutant, with the Serine at position 65 mutated to a Threonine, also has a single red shifted excitation peak, fluoresces more intensely than wild type, and has an added advantage of acquiring fluorescence approximately four times faster than wild-type GFP (4).

Several mutants have been optimized for expression in bacterial cells. For example, GFPuv, which has been optimized to fluoresce when excited with ultra violet (UV) light contains three amino acid substitutions, none of which alter the chromophore sequence. These substitutions alter protein folding and chromophore formation. When expressed in E. coli GFPuv is more soluble than the wtGFP, which is primarily found in inclusion bodies in a nonfluorescent insoluble form. Also, five rarely used Arg codons from the wild type gene have been replaced by codons preferred in E. coli in order to increase expression efficiency. This protein does have a propensity to dimerize, which forms as a result of hydrophobic interactions and results in a four-fold reduction in absorbance at 470 nm and an increase in absorption at 395 nm. Despite the changes, the excitation and emission maxima remain the same as wild type. The Stemmer mutant is quite similar to the GFPuv, with the exception of the Arg codon changes.

Mutations have also been used to create blue emission GFP variants. The Y66H variant has a histidine residue at position 66 instead of a tyrosine. This results in excitation and emission maxima of 382 and 459 nm respectively. Other improvements on the blue emitting proteins have been made to improve their brightness. For example EBFP also contains amino acid changes at positions 64, 65, and 145 that improve brightness and resulting in an excitation and emission maxima of 380 and 440 respectively.

Other substitutions have been made to improve protein folding and chromophore formation. Besides the obvious amino acid substitutions previously described many different silent mutations have been made to the wild type sequence. Clontech has made over 150 sequence substitutions to the native DNA sequence in order to change codon usage to reflect the intended host&rsquos codon bias. Upstream sequences flanking the coding region have also been converted to a Kozak consensus translation initiation site in order to increase translation initiation efficiency.

Expression of GFP as a transgene has opened many exciting new windows of investigation in cell, developmental, and molecular biology. Fluorescent GFPs have been expressed in bacteria (1, 3) yeast (11), slime mold (12), plants (13), drosophilia (14), and mammalian cells (17). GFPs can function as a protein tag, tolerating either an N- or a C-terminus fusion to a broad variety of proteins, many of which have been shown to maintain native function (18). The enormous flexibility of these proteins as a noninvasive real-time marker in living cells allows for numerous applications. Here we describe several experiments demonstrating the use of fluorescence to quantitate various Green Fluorescent Proteins (GFPs) using the FL600 microplate fluorescence reader.


Table 1. GFP mutants and their amino acid substitutions

# These mutants also contain over 150 silent base mutations that correspond to human codon-usage preferences. & Upstream sequences flanking the coding region have been converted to a Kozak consensus translation initiation site. @ Five rarely used Arg codons from the wild type gene have been replaced by codons preferred in E. coli in order to increase expression efficiency.

Materiallar və metodlar

The 96 well clear microplates, catalogue number CFCP N96, were purchased from Biosearch, (Bedford, MA). Purified recombinant proteins for wtGFP, EGFP, GFP-S65T, and GFPuv were purchased from Clontech. Partially purified extracts containing recombinant wtGFP protein, as well as the EGFP, Y66H, and Stemmer mutant proteins were a generous gift of Daniel González (Rutgers, New Brunswick, NJ). A series of dilutions of each protein extract were made using Tris-EDTA buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0) as the diluent. Fluorescent determinations were made using an FL600 Fluorescence Microplate reader (BioTek Instruments, Winooski, Vermont) with KC4 data reduction software on an external PC controlling reader function and data capture (BioTek Instruments, Winooski, VT). Filter sets varied depending on the variant of GFP used. Determinations of wtGFP were made using a 400 nm, 30 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter. Stemmer, mutant and GFPuv were read using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter. The red-shifted mutants EGFP and GFP-S65T were determined using a 485 nm, 20 nm bandpass excitation filter and a 530 nm, 25 nm bandpass emission filter,while the "blue" emitting mutant, Y66H, was investigated using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter with a 460 nm, 40 nm bandpass emission filter. Table 2 indicates the excitation and emission maxima of several of the proteins used. Protein concentrations for each GFP variant were determined using absorbance at appropriate wavelength ( l max) and the concentration calculated using the reported extinction coefficients (e) for each variant (15, 16).


Table 2. Excitation and emission data of GFP variants

@ Note that both excitation peak wavelengths are indicated.

Nəticələr

Concentration curves were made using several GFP variants and the fluorescence determined. In all cases a linear correlation to concentration was observed. The fluorescence of partially purified wtGFP protein was measured from 0 to 140 ng. Determination of total protein content by the method of Lowry indicates that wtGFP represents 3% of the total protein. As demonstrated in Figure 1, using an excitation wavelength of 400 nm and an emission wavelength of 508 a linear response was observed (r 2 =0.998). In terms of detection limits as little as 5 ng per well of wtGFP can be detected. Using purified recombinant wtGFP obtained commercially, similar results were obtained in regards to linearity and detection limits.

When the fluorescence of the red-shifted proteins was determined, a linear relationship between concentration and fluorescence was also observed for either EGFP or GFP-S65T (Figure 2). With the fluorescein filter set, the increase in the extinction coefficient (Table 2) for EGFP results in a brighter fluorescence than with the wild-type protein. This may account for the lower detection limit of 1 ng per well we observed with this protein (data not shown). Quantitation of EGFP in extracts using a calibration curve determined by linear regression can be used with a high degree of confidence (r 2 = 0.998).

As demonstrated in Figure 3, the Stemmer mutant and GFPuv can utilize the same filter set. As with all the other GFP variants examined both proteins demonstrate a linear relationship between concentration and fluorescence signal (Figure 3). The detection limit of the Stemmer mutant was determined to be 2.5 ng (data not shown). These data are in close agreement with the extinction coefficient data that indicates that the Stemmer mutant is half as bright as the EGFP variant. Although they are optimized for excitation using UV light and in these experiments were excited at 360 nm, they can be quantitated very well with the same filter set as wtGFP, which utilized a 400 nm excitation filter.

The fluorescence from a serial dilution of the GFP-Y66H protein extract was performed. Although the Y66H blue emitting mutant sample was not pure enough to quantitate protein content using absorbance, there was sufficient protein to detect a fluorescent signal. With dilution of the protein extract, a linear relationship between dilution and fluorescence was observed (Figure 4).

As demonstrated in Figure 5 using the appropriate filter set is important in order to maximize the signal. Use of the red-shifted mutants such as EGFP allows the use of the traditional "fluorescein" filter set (485 nm excitation, 530 nm emission). When filters that maximize the signal with wtGFP (400 nm excitation and 508 nm emission) are used to detect EGFP, the signal returned is greatly diminished, despite having the same sensitivity setting. Unfortunately, filter overlap precludes the use of the 485 nm excitation filter with a 508 nm emission filter. Wild-type GFP, as previously described has a primary excitation centered at 395 nm with a shoulder located at 485 nm. With the traditional "fluorescein" filter set than a loss of fluorescent signal is observed as compared to the result when a 400 nm excitation and 508 nm emission is used. Due to the secondary excitation peak at 370 nm with wtGFP, the degree of loss is alleviated somewhat as compared to EGFP, which only has a single excitation peak. In the case of GFPuv, which has been optimized for excitation with UV light, the loss of fluorescent signal is much more profound when the "fluorescein" filter set is used (data not shown).

Figure 1. Concentration curve using partially purified wtGFP protein. Dilutions of wtGFP protein were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 400 nm, 30 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 175.

A

B

Figure 2. Concentration curves of red-shifted GFP proteins. Dilutions of (A) EGFP or (B) GFP-S65T proteins were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 485 nm, 20 nm bandpass excitation filter and a 530 nm, 25 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 135.

A

B

Figure 3. Concentration curves using partially purified Stemmer mutant GFP and rGFPuv proteins. Dilutions of partially purified Stemmer-mutant GFP protein (A) or rGFPuv protein (B) were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter and a 508 nm, 20 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 140.

Figure 4. Concentration curve using partially purified GFP-Y66H mutant protein. Dilutions of mutant GFP-Y66H protein were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using a 360 nm, 40 nm bandpass excitation filter and a 460 nm, 45 nm bandpass emission filter with an instrument sensitivity setting of 150.

A

B

Figure 5. Loss of signal when using alternative filter sets. Dilutions of (A) EGFP protein or (B) wtGFP were made using 10 mM Tris, 10 mM EDTA buffer as the diluent. Samples were read using an FL600 fluorescence plate reader with reader function controlled by KC4 data reduction software on an external PC. Fluorescence was determined using either a 485 nm, 20 nm bandpass excitation, 530 nm, 25 nm bandpass emission filter set or a 400 nm, 30 nm bandpass excitation, 508 nm, 20 nm bandpass emission filter set. For EGFP and wtGFP determinations using either filter set, a sensitivity setting of 170 was used.

Müzakirə

The utility of green fluorescent proteins has become increasingly obvious. Detection only requires the addition of near UV to blue light and is not limited by the availability of substrates, therefore providing information concerning gene expression and cellular localization in real time. Also GFPs do not interfere with cell growth in a wide variety of organisms and as such, are a convenient indicator of transformation. In this application note we describe the direct quantitation of several different mutant forms of GFP using fluorescence.

Because GFPs are actually proteins rather than small fluorescent molecules, the physical properties of GFPs as peptides must be taken into account. Despite being a peptide, GFP is resistant to denaturation. GFP, with a Tm=70°C, is quite resistant to heat denaturation once formed. In vivo it appears that the formation of GFP is somewhat temperature sensitive. In yeast GFP fluorescence is reported to be maximal at 15°C and decreases to about 25% of maximal when the incubation temperature is raised to 37°C (7). It has been demonstrated that mutations that increase efficiency of protein folding, as with EGFP and GFPuv, suppress the sensitivity of fluorescence to growth incubation temperature (3). In regards to redox status, GFP needs to be in an oxidized state in order to fluoresce, as the formation of the cyclic tripeptide chromophore requires molecular oxygen (6). Strong reducing agents, such as 5 mM Na2S2O4 or 2 mM FeSO4 convert GFP into a nonfluorescent moiety. Fortunately, weaker reducing agents such as, 2% ß-mercaptoethanol, 10 mM dithiotheitol (DTT), 10 mM glutathione, or 10 mM L-cysteine, do not seem to affect the fluorescence of GFP (16). Strong oxidizing agents such as 1% H2O2 will also abolish fluorescence as will complete denaturation. GFP is quite resistant to pH changes. For example, wtGFP is fluorescent over a very broad pH range (pH 5.5-12) with rapid loss of fluorescence with pH levels either above or below this range. The red-shifted mutants have been reported to have a narrower range of pH stability and exhibit fluorescence between pH 7.0 and 11.5.

In regards to fluorescence, GFP offers some advantages that one would not expect from proteins. Unlike many proteins, activity is not lost and fluorescence is maintained after fixation with either glutaraldehyde or formaldehyde. Most importantly, GFP and its most of its variants are reported to be quite resistant to photobleaching. Chaotropic agents such as 8M urea, and low concentrations of detergents (1% SDS) also do not effect fluorescence of the protein.

There are several issues that have to be kept in mind when using GFP as a reporter molecule. Expression of exogenous proteins in organisms can lead to solubility problems. Wild-type GFP, like many other proteins when expressed in bacteria, is primarily found in inclusion bodies in an insoluble form and is nonfluorescent. Mutations that increase protein folding and translation efficiency have been found to eliminate many of the solubility problems. Misal üçün, E. coli expressing GFPuv, with its mutations to improve protein folding and chromophore formation, are reported to be 18 times brighter than bacteria expressing wtGFP mostly due to increased protein solubility. In regards to the use of GFP as a means to measure transcription, the rate of chromophore formation and the apparent stability of wtGFP may preclude the use of GFP as a reporter to monitor rapid changes. Chromophore formation takes place post-translationally and requires molecular oxygen. Cells, bacteria in particular, grown in anaerobic conditions will be refractory to GFP fluorescence. Likewise if very rapid changes in transcription rates are being investigated, the lag between protein production and chromophore formation may preclude the use of GFP. Similarly, GFP proteins once produced are quite stable and resistant to degradation, again reducing their utility as a reporter for rapid changes. Another important point to consider in regards to using GFP as quantitative reporters is the lack of signal amplification. The signal associated with GFP does not have any enzymatic activity associated with it, therefore there is no opportunity for amplification as would be the case for reporters such as b-galactosidase, luciferase, or alkaline phosphatase.

Another problem associated with GFP fluorescence is background autofluoresence. Most autofluoresence in mammalian cells is due to the presence of the flavins FAD and FMN. These compounds have excitation and emission maxima of 450 nm and 515 nm respectively and tend to cause problems primarily with the red-shifted variants. Likewise, NADH, another commonly found cellular cofactor, has an excitation of 365 nm and an emission of 445 nm and may result in background fluorescence when wtGFP fluorescence is quantitated. If background autofluorescence is a problem, it may be necessary to tailor the GFP mutant to the type of autofluorescence encountered. It has been estimated that cytoplasmic concentration must be 1.0 µM in order for the wtGFP signal to be twice that generated from autofluorescence. Red-shifted variants, because they are brighter, have a lower threshold of 100-200 nM (16).

Although most experiments using GFP are performed using either fluorescence microscopy or flow cytometry, these data presented in this application note, demonstrate the utility of direct measurement of GFP using a fluorescence microplate reader. Microscopy can provide information on the number of cells expressing GFP, but is quite subjective in regards to quantitation. Flow cytometry can provide quantitative information, but throughput is quite limited. Determination of fluorescence using a microplate fluorometer allows quantitative information as well as high throughput.

Other Related Application Notes Excitation and Emission of Green Fluorescent Protein

İstinadlar

(1) Chalfie, M., Y. Tu, G.Euskirchen, W. Ward, D. Prasher (1994) Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression, Science 263:802-805.

(2) Cody, C. D. Prasher, W. Westler, F. Prendergast, W. Ward (1993) Chemical Structure of the Hexapeptide Chromophore of the Aequorea Green-Fluorescent Protein, Biochemistry, 32:1212-1218.

(3) Cormack, B.P. R. Valdivia, and S. Falkow. (1996) FACS-optimized Mutants of the Green Fluorescent Protein (GFP) Gene, 173:33-38.

(4) Heim, R., A.B. Cubitt, and R.Y. Tslen, . (1995) Improved Green Fluorescence, Nature, 373:663-664.

(5) Delagrave, S. R.E. Hawtin, C.M. Silva, M.M. Yang, and D.C. Youvan. (1995) Red-shifted Excitation Mutants of the Green Fluorescent Protein, Bio/Technology, 13:151-154.

(6) Heim, R. D.C. Prasher, and R.Y. Tsien (1994) Wavelength Mutations and Posttranslational Autoxidation of Green Fluorescent Protein, Proc. Natl, Acad. Sci, USA 91:12501-12504.

(7) Lim, C.R., Y. Kimata, M. Oka, K. Nomaguchi, and K. Kohno (1995) Thermosensitivity of Green Fluorescent Protein Fluorescence Utilized to Reveal Novel Nuclear-like Compartments in a Nucleoporin Nsp1. J. Biochemistry, 118:13-17.

(8) Cubitt, A., R. Heim, S. Adams, A. Boyd, L. Gross, R. and R. Tsien (1995) Understanding, improving and Using Green Fluorescent Proteins. Trends in Biochemical Sciences, 20:448-455.

(9) Yang, F., L.G. Moss, G.N. Phillips (1996) The Molecular Structure of Green Fluorescent Protein. Nature Biotechnology 14:1246-1251.

(10) Ward, W. in Photochemical and Photobiological Reviews, K. Smith Ed. 1979, Plenum NY. P. 1-57.

(11) Kahana, J., B. Schapp, and P. Silver (1995) Kinetics of Spindle Pole Body Separation in Budding Yeast. Proc. Natl. akad. Sci. USA 92:9707-9711.

(12) Moores, S., J. Sabry, and J. Spudich (1996) Myosin Dynamics in Live Dictyostelium Cells. Proc. Natl. akad. Sci. USA 93:443-446.

(13) Epel, B., H. Padgett, M. Heinlein, and R. Beachy (1996) Plant Virus Movement Protein Dynamics Probed with a GFP-protein Fusion. Gene. 173:75-79.

(14) Wang, S., and T. Hazelrigg (1994) Implications for bcd mRNA Localization from Spatial Distribution of exu Protein in Drosophila Oogenesis. Təbiət. 369:400-403.

(15) Gonzalez, D. Personal communication.

(16) Living Colors User Manual Clontech Laboratories Inc. Palo Alto CA.

(17) Crameri, A. E.A. Whitehorn, E. Tate, and W.P.C. Stemmer (1996) Improved Green Fluorescent Protein by Molecular Evolution Using DNA Shuffling. Nature Biotechnology 14:448-455.

(18) Stearns, T. (1995) The Green Revolution. Current Biology. 5:262-264.