Məlumat

SDS-PAGE ilə bağlı problemlər, ayrılma yoxdur - problem nə ola bilər?

SDS-PAGE ilə bağlı problemlər, ayrılma yoxdur - problem nə ola bilər?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən laboratoriyada işləyirdim, bizdə 30% Akrilamid, TEMED, TRIS-HCl (pH6.8 və pH 8.8.) və 10% (ağırlıq/həc) SDS məhlulu pH 7.2 ümumi ehtiyatımız var idi.

Buferi yükləmək üçün reseptdən istifadə edirik (istifadə etməzdən əvvəl əlbəttə ki, BME ilə qarışdırırıq):

  • 3,15 ml MilliQ su
  • 1.25 mL 0.5M Tris-HCl
  • 2,9 ml 85% qliserin
  • 2 ml 10% SDS
  • 0,4 ml 0,5% (ağırlıq/həc) bromofenol mavisi

Bizim problemimiz odur ki, ayrılıq yoxdur.

Mən 2 gel hazırlamağa çalışdım, çünki ayırıcı və yığma geli qarışdırmış ola biləcəyimi düşünürdüm, amma ikinci dəfə bunu etmədiyimə əmin oldum. Sonra başqasından xahiş etdim ki, gel hazırlasın, bu da onlara yaramadı (geldə heç nə, nümunə yoxdur, nərdivan).

Sonra 10% SDS məhlulunu və hər iki TRIS tamponunu yenidən düzəltdim, lakin geldə heç nə əldə etmədiyimiz üçün yenə qəribə bir şey baş verir.

Ləkələmək və ləkələmək üçün çıxardığınız zaman jellər açıq-aydın polimerləşir və mən onu qarışdırsanız belə, yükləmə tamponunun bunu necə edə biləcəyini anlamıram (çünki nümunəniz göründüyü müddətcə geldə nəsə görməlisiniz. quyuda, hətta denaturasiya olmadan). Aydındır ki, yükləmə boyasını yenidən düzəltdik və yenidən cəhd etdik, lakin bu işləmir.

Nümunələrdə zülal olduğunu bilirəm, çünki mən hüceyrə qranulunu və təmizlənmiş zülalı (katalitik fəaliyyətini sınaqdan keçirmişəm) eyni gelə qoyuram.

Hər kəsin bunun üçün rasional izahı və ya adətən səhv ola biləcəyi ilə bağlı təklifləri varmı?

Aşağıdakı jelin 200V (80mAmp) gücündə təxminən 40 dəqiqə işləməsi demək olar ki, bitdiyi kimi göründüyü kimidir. Ləkə və ləkələdiyimiz zaman geldə heç nə yoxdur. Həmçinin məncə, rəng (bromofenol mavisi) gel üzərində bir az qəribə görünür, normalda olduğu kimi deyil, aşağıdakı şəklə baxın, amma bəlkə də bir az paranoyaklaşıram.


Hər şeyin pH-nı yenidən tənzimlədikdən və yeni SDS məhlulu ilə yeni çalışan tampon hazırladıqdan sonra, görünür ki, ayrılma geri qayıdır.


SDS-SƏHİFƏ "Utanc Zalı"

Siz çox yaxşı demək olar ki, mükəmməl gel hazırlamış ola bilərsiniz və məhsulu təkmilləşdirməkdə çətinlik çəkəcəksiniz. Əgər belədirsə, deməli, bundan öyün! Əgər belə isti bir iş görməmisinizsə, ümidsiz olmayın. Bütün yaxşı elm adamları öz səhvlərindən nəticə çıxarır, əslində səhv etmədən çoxumuz çox şey öyrənə bilməyəcəyik!

"Utanc Zalı" tədqiqat laboratoriyasından bir və ya iki nümunə ilə keçmiş laboratoriyalarda tələbələrin (və təlimatçının) işlədiyi ən pis gellərdən bəzilərinin nümunələrini təqdim edir. Onlar bir geli qarışdırmağın bir çox yollarını təmsil edir (lakin hamısı deyil - biz hələ də yeni yollar tapırıq!). Öz gelinizin hansı xüsusiyyətlərinin qeyri-qənaətbəxş (və ya ən azı mükəmməldən az) olduğuna baxın və texnikanızı təkmilləşdirmək üçün nə edə biləcəyinizi anlamaq üçün təsvirlərdən istifadə edin.


Protein nərdivanı ayrılmır - (Mart/10/2013)

Mən 10% həll və 5% yığma ilə bir neçə SDS-PAGE işlətmişəm. Mən həmişə 25kb protein nərdivanını həll edə bilmirdim. 50kb markerdən sonra qalanlar yığılır və ayrılmır. Bir dəfə var, cərəyan getsə də, boya cəbhəsi hətta erkən dayanır.
Bu mənim gelimdə və ya tamponlarımda problemdir?

Əksər protein boyaları pH-a həssasdır. Boya yüklədinizmi və ya nərdivan geldən aşağıya doğru hərəkət edərkən rəng dəyişdi? Hazır gellərdən istifadə edirsiniz yoxsa gelləri özünüz hazırlayırsız? Əgər əvvəlcədən hazırlanmış istifadə edirsinizsə, gellərin müddəti bitib, onlar düzgün saxlanılıbmı? Əgər gelləri özünüz hazırlayırsanız, ola bilsin ki, tamponlarınızdan biri çirklənib və ya pH sönükdür. Siz western blot çalışan buferinizdə hər hansı dəyişiklik etmisiniz? Yeni bir kimyəvi maddə ehtiyatından istifadə edirsiniz (məsələn, SDS, Tris, Glycine və s.).

Laboratoriyada kiminsə həmin western blot qurğusu ilə oxşar problemləri var? Aparatınızın düzgün gərginliyi saxladığından əminsinizmi? Vestern blot qurğunuzda işləyən buferinizin temperaturu (isti, qaynayan isti) nədir?

Bu suallardan bəziləri haqqında düşünün və bu, problemlərin aradan qaldırılmasına başlayacaq.

Təşəkkürlər, yükləmə boyası rəngini dəyişmədi. Geli özüm hazirlayiram. Eyni problemi olan bir laboratoriya yoldaşı var. Düşünürdüm ki, bu, işləyən bufer məsələsi ola bilər, çünki ümumi istifadə etdiyimiz yeganə şey çalışan buferdir. Çalışan bufer adətən 700ml H2O, 200ml 10X işləyən bufer və 100ml metanoldur. Adətən istifadə etdiyim gərginlik 30 dəqiqə üçün 60V, boya cəbhəsi demək olar ki, sonuna çatana qədər 1,5 saat ərzində 120V-dir.

Zülal nərdivanının yığılması səbəbindən bəzən boya cəbhəm erkən dayandı.

Bəli, sadəcə buferlərinizi yenidən yaratmağa çalışın və nə baş verdiyini görün. Çalışan tamponunuza metanol əlavə edirsiniz?

işləyən tampondakı metanol sds-ni zülaldan çıxaracaq və miqrasiya problemlərinə səbəb olacaq.

biz qaçışda boyanın dayandırılmasını izlədik. biz boyanın gelin dibinə "tullanacağını", itiləşəcəyini və köç etməyə davam edəcəyini qaçışa davam etsək gördük. nəticədə ləkələnmiş gel normal görünür. düşünürük ki, buna çalışan buferdəki komponentin (çox güman ki, SDS) qocalması səbəb olub.

Əgər zülal ölçülərinin geniş spektrinin ayrılmasını görmək lazımdırsa, onda siz gradient gel işlətməyi düşünə bilərsiniz.

ölçü standartları ilə birlikdə gələn məlumat (yaxud istehsalçının veb saytında tapıla bilər) müxtəlif gel konsentrasiyalarında işləyərkən standartların necə görünməsi lazım olduğunu sizə göstərməlidir.

Eh, belə ki, işləyən buferiniz 2x konsentrasiyadadır? 1L məhlula yalnız 100ml 10X tampon əlavə etməlisiniz.

Və mən çalışan buferə, ötürmə buferinə metanolun əlavə edilməsi barədə eşitməmişəm, əlbəttə ki, bu ümumidir, lakin işləyən buferə deyil. Bəlkə protokollarınızı qarışdırmısınız?


SDS-PAGE üçün poliakrilamid gelləri

Zülal elektroforezi üçün bir çox sistemlər hazırlanmışdır və SDS-PAGE üçün istifadə olunan aparatlar geniş şəkildə dəyişir. Bu səhifələrdə istifadə olunan metodologiya Laemmli metodundan istifadə edir. Materiallar və metodlar bölməsində Laemmli metoduna istinad buferləri, gellərin tökmələrini, aparatları və s. təsvir etmək ehtiyacını aradan qaldırır. Əgər məqalədə metoda bəzi dəyişikliklər edilməzsə, SDS-PAGE-in yeganə təfərrüatları hesabatda təqdim edilməlidir. üsullar bölməsi geldəki ümumi akrilamid (%T), nisbi faiz və çarpaz bağlayıcı növü (%C) və bəlkə də gel ölçülərinə istinaddır. Biz 3 1/4" x 4" gel kasetləri olan "mini-gel" sistemindən istifadə edirik.

SDS-PAGE, akrilamidlə işləməkdə çətinlik və təhlükədən xilas olmaqla, əvvəlcədən tökmə gellər üzərində aparıla bilər. Aşağıdakı təsvir kommersiyada mövcud olan avadanlıqdan daha ucuz olan dükan istehsalı tökmə və işləyən aparatlara aiddir. Xərclərin effektivliyinə əlavə olaraq, ilk dəfə öz gellərini hazırlamağın üstünlüyü prosesi daha dərindən başa düşməkdir.

Sistemdən asılı olmayaraq, hazırlıq şüşə lövhələr arasında iki fərqli akrilamid qatının tökülməsini tələb edir. Aşağı təbəqə (ayırıcı və ya həlledici, gel) polipeptidləri ölçüyə görə həqiqətən ayırmaqdan məsuldur. Yuxarı təbəqəyə (yığıcı gel) nümunə quyuları daxildir. O, iki hərəkətli sərhəd arasında nümunədəki zülalları süpürmək üçün nəzərdə tutulmuşdur ki, onlar ayırıcı gelə çatdıqda mikrometrin nazik təbəqələrinə sıxılır (yığılır).


Protokol

1. Gelin hazırlanması

Erlenmeyer kolbasına uyğun agaroz kütləsini çəkin. Agaroza gelləri w/v faizli məhluldan istifadə etməklə hazırlanır. Bir geldə agarozun konsentrasiyası ayrılacaq DNT fraqmentlərinin ölçülərindən asılı olacaq, əksər gellər 0,5%-2% arasında dəyişir. Buferin həcmi kolba tutumunun 1/3-dən çox olmamalıdır.

Tərkibində agaroza olan kolbaya işləyən bufer əlavə edin. Qarışdırmaq üçün çevirin. Ən çox yayılmış gel işləyən tamponlar TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) və TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA)dır.

Agaroz/tampon qarışığını əridin. Bu, ən çox mikrodalğalı sobada qızdırmaqla edilir, lakin Bunsen alovu üzərində də edilə bilər. 30 saniyəlik fasilələrlə kolbanı çıxarın və içindəkiləri yaxşıca qarışdırmaq üçün çevirin. Agaroz tamamilə həll olunana qədər təkrarlayın.

Etidium bromidi (EtBr) 0,5 μg/ml konsentrasiyasına əlavə edin. Alternativ olaraq, gel də 15-30 dəqiqə ərzində 0,5 μg/ml EtBr olan çalışan tamponda elektroforezdən sonra rənglənə bilər, ardınca isə bərabər müddət ərzində işləyən tamponda boyanır.

Qeyd: EtBr şübhəli kanserogendir və müəssisə qaydalarına uyğun olaraq düzgün şəkildə utilizasiya edilməlidir. Tərkibində EtBr olan gellərlə işləyərkən həmişə əlcək taxılmalıdır. DNT-nin boyanması üçün alternativ boyalar mövcuddur, lakin EtBr həssaslığına və dəyərinə görə ən populyar olaraq qalır.

Agarozun ya dəzgahın üstündə və ya 65 ºC su banyosunda inkubasiya yolu ilə soyumasına icazə verin. Bunu etməsəniz, gel qabı əyiləcək.

Gel qabını tökmə aparatına qoyun. Alternativ olaraq, bir qəlib yaratmaq üçün bir gel qabının açıq kənarlarını yapışdırmaq da olar. Quyuları yaratmaq üçün gel qəlibinə uyğun bir daraq qoyun.

Ərinmiş agarozu gel qəlibinə tökün. Agarozun otaq temperaturunda qurulmasına icazə verin. Tarağı çıxarın və geli gel qutusuna qoyun. Alternativ olaraq, gel də plastik paketə bükülə və istifadə olunana qədər 4 ºC-də saxlanıla bilər (Şəkil 1).

2. Gel aparatının qurulması və DNT fraqmentlərinin ayrılması

Ayrılacaq DNT nümunələrinə yükləmə boyası əlavə edin (Şəkil 2). Gel yükləmə boyası adətən 6X konsentrasiyada hazırlanır (0,25% bromfenol mavisi, 0,25% ksilen sianol, 30% qliserol). Boyanın yüklənməsi DNT nümunənizin nə qədər məsafə qət etdiyini izləməyə kömək edir və həmçinin nümunənin gelə batmasına imkan verir.

Enerji təchizatını istədiyiniz gərginliyə proqramlaşdırın (elektrodlar arasında 1-5V/sm).

Gelin səthini örtmək üçün kifayət qədər işləyən tampon əlavə edin. Gel hazırlamaq üçün istifadə olunan eyni işləyən tampondan istifadə etmək vacibdir.

Gel qutusunun tellərini enerji təchizatı ilə birləşdirin. Enerji təchizatını yandırın və həm gel qutusunun, həm də enerji təchizatının işlədiyini yoxlayın.

Qapağı çıxarın. DNT nümunələrini yavaş-yavaş və diqqətlə gelə yükləyin (şək. 3). Müvafiq DNT ölçüsü markeri həmişə eksperimental nümunələrlə birlikdə yüklənməlidir.

Qapağı gel qutusuna dəyişdirin. Katod (qara keçiricilər) anoddan (qırmızı keçiricilər) quyulara daha yaxın olmalıdır. Elektrodların enerji təchizatındakı düzgün yuvalara qoşulduğunu iki dəfə yoxlayın.

Gücü yandırın. Boya müvafiq məsafəyə köçənə qədər geli işlədin.

3. Ayrılmış DNT fraqmentlərinin müşahidəsi

Elektroforez başa çatdıqdan sonra enerji təchizatını söndürün və gel qutusunun qapağını çıxarın.

Gel qutusundan jeli çıxarın. Gelin səthindən artıq tamponu boşaltın. Əlavə işləyən tamponu udmaq üçün gel qabını kağız dəsmalların üzərinə qoyun.

Jeli gel qabından çıxarın və jeli ultrabənövşəyi şüalara məruz qoyun. Bu, ən çox gel sənədləşdirmə sistemindən istifadə etməklə həyata keçirilir (şək. 4). DNT lentləri narıncı flüoresan lentlər kimi görünməlidir. Gelin şəklini çəkin (Şəkil 5).

Müəssisənin qaydalarına uyğun olaraq gel və işləyən tamponu düzgün şəkildə atın.

4. Nümayəndəliyin nəticələri

Şəkil 5 PCR məhsullarının agaroz gel elektroforezindən sonra tipik nəticəni təmsil edir. Ayrıldıqdan sonra yaranan DNT fraqmentləri aydın şəkildə müəyyən edilmiş zolaqlar kimi görünür. DNT standartı və ya nərdivanı nümunə zolaqlarının ölçülərini faydalı təyin etməyə imkan verən dərəcədə ayrılmalıdır. Göstərilən nümunədə 765 bp, 880 bp və 1022 bp olan DNT fraqmentləri 2 log DNT nərdivanı ilə birlikdə 1,5% agaroz geldə ayrılır.

Şəkil 1. Darağı çıxardıqdan sonra bərkimiş agaroz gel.

Şəkil 2. Tələbə DNT nümunələrinə yükləmə boyası əlavə edir.

Şəkil 3. DNT nümunəsini geldəki quyuya yükləyən tələbə.

Şəkil 4. Bir gel sənədləşdirmə sisteminin nümunəsi.

Şəkil 5. Elektroforezdən sonrakı gel şəkli. EtBr elektroforezdən əvvəl gelə 0,5 μg/ml yekun konsentrasiyaya qədər əlavə edildi, sonra 100 V-də 1 saat ərzində ayrıldı. Gel UB işığına məruz qaldı və şəkil gel sənədləşdirmə sistemi ilə çəkildi.


Fasiləsiz Bufer Sistemi və İstifləmə Gel – Onları Başlanğıc Xəttində Birləşdirir

Cərəyanı katoddan (mənfi) anoda (müsbət) gel vasitəsilə keçirmək üçün açıq-aydın bir tampon lazımdır. Əsasən biz fasiləsiz Laemmli bufer sistemindən istifadə edirik. “Fasiləsiz”, sadəcə olaraq, gel və tankdakı buferin fərqli olduğunu bildirir.

Tipik olaraq, sistem Tris-HCl ilə tamponlanmış pH 6.8-də yığma gel, Tris-HCl tərəfindən pH 8.8-ə qədər tamponlanmış işləyən gel və pH 8.3-də elektrod tamponu ilə qurulur. Yığma geli akrilamidin aşağı konsentrasiyasına və zülalların hərəkətini ləngitməyə qadir olan daha yüksək konsentrasiyaya malikdir.


Bəs bütün bu müxtəlif pH-larla nə var?

Yaxşı, glisin pH-dan asılı olaraq müsbət, neytral və ya mənfi üç fərqli yük vəziyyətində mövcud ola bilər. Bu, aşağıdakı diaqramda göstərilmişdir. Müxtəlif tamponlar tərəfindən glisinin yüklənmə vəziyyətinə nəzarət bütün yığma gel işinin açarıdır.

Beləliklə, yığma gel necə işləyir. Güc işə salındıqda, pH 8.3 elektrod tamponunda mənfi yüklü qlisin ionları pH 6.8 olduğu yığma gelə daxil olmağa məcbur olur. Bu mühitdə qlisin əsasən zwitterionik (neytral yüklü) vəziyyətə keçir. Bu yük itkisi onların elektrik sahəsində çox yavaş hərəkət etməsinə səbəb olur.

Digər tərəfdən, Cl-ionları (Tris-HCl-dən) elektrik sahəsində daha sürətli hərəkət edir və qlisinin qabağında miqrasiya edən bir ion cəbhəsi meydana gətirirlər. Cl-nin Tris əks-ionundan ayrılması (hazırda anoda doğru hərəkət edir) qlisini arxasına çəkən dik gərginlik qradiyenti ilə dar bir zona yaradır, nəticədə miqrasiya edən ionların iki dar ayrılmış cəbhəsi yüksək mobil Cl olur. - ön, ardınca daha yavaş, əsasən neytral qlisin cəbhəsi.

Gel nümunəsindəki bütün zülallar, qlisin və Cl-nin həddindən artıq hərəkətliliyi arasında aralıq olan elektroforetik hərəkətliliyə malikdir, buna görə də iki cəbhə nümunəni yaxşıca keçdikdə, zülallar Cl arasındakı dar zonada cəmləşir. - və glisin cəbhələri.


Beetle Disseksiyasını araşdırın
Böcəklərin xarici hissəsi parlaq, mat və ya son dərəcə rəngli ola bilər. Bəs böcəklərin içərisində nə baş verir? Bu Beetle Disseksiya Aləti ilə böcəyin bədəninə virtual nəzər salın.
Özünüz araşdırın və ya Beetle Disseksiya Fəaliyyətimizi izləyin. Daha çox məlumat üçün Beetle Dissection Mərkəzinə baş çəkin.


Kütləvi Spektrometriya Rəqəmsal Resurs Mərkəzi

Kütləvi spektrometriya nəticələrini yaxşılaşdırın
Hədəflərinizə çatmağınıza kömək edəcək praktiki məlumat və məsləhətlər əldə etmək üçün yeni kütləvi rəqəmsal resurs mərkəzini araşdırın. Bu pulsuz resurslara giriş əldə etmək üçün sayta daxil olun:

  • Kütləvi Spektrometriya üçün Yüklənə bilən Termo Scientific Protein Nümunəsinin Hazırlanması və Kəmiyyəti Daha möhkəm və təkrarlana bilən nümunə emalı, zülalın kəmiyyəti və alətin kalibrlənməsi üçün alətlər və üsullar haqqında kitabçası
  • Hüceyrəaltı fraksiyalaşma, peptid fraksiyalaşdırma, izobarik etiketləmə və s. kimi xüsusi tətbiqlərə dair faydalı ağ sənədlər və gec qırılan plakatlar
  • Protein kəmiyyət üsullarını əhatə edən tələb üzrə vebinarlar

Uğurlu proteomik analiz nümunənin hazırlanmasını, cihazları və proqram təminatını vurğulayır.

Düzgün nümunə hazırlamaq daha yaxşı nəticələr deməkdir

Bioloji tədqiqatçıları maraqlandıran zülallar ümumiyyətlə digər zülalların kompleks qarışığında mövcuddur ki, bu da MS analizində iki mühüm problem yaradır:

  1. Böyük molekullar üçün istifadə edilən ionlaşdırma üsulları, qarışıqda təxminən bərabər miqdarda komponentlər olduqda yaxşı işləyir. Bununla belə, bioloji nümunələrdə zülal konsentrasiyalarının dinamik diapazonu 10 böyüklüyünü keçə bilər. Belə bir qarışıq elektrosprey ionlaşması (ESI) istifadə edərək ionlaşdırılarsa, məsələn, daha çox olan növlər daha az bol olanların siqnallarını "boğmağa" və ya boğmağa meyllidirlər.
  2. Mürəkkəb qarışığın kütlə spektrini komponentlərin çoxluğuna görə tam təhlil etmək çox çətindir. Bu problem bir protein nümunəsinin çox sayda peptid məhsullarına fermentativ həzm edilməsi ilə daha da güclənir. Maye xromatoqrafiya MS (LC-MS) və tandem MS (LC-MS/MS) müvəffəqiyyəti yüksək bol növlər tərəfindən ionlaşmanın boğulmasını minimuma endirmək və elüt peptidlərin MS nümunəsinin az seçilməsinin qarşısını almaq üçün məhdud nümunə mürəkkəbliyi ilə təmiz nümunələrdən asılıdır.

MS analizi üçün zülal hazırlığı bir çox üsulla həyata keçirilə bilər, buna görə də təhlilə aparan addımları başa düşmək vacibdir. Bütöv zülallar adətən gel elektroforezi ilə tədqiq edilsə də, kompleks zülal nümunələri üçün ən çox yayılmış kütləvi spektrometriya iş axınları LC ilə fraksiyalaşdırılması zülallardan daha asan olan peptidləri təhlil edir. Peptidlər həmçinin bütöv zülallara nisbətən daha effektiv şəkildə ionlaşır və parçalanır, nəticədə zülalın identifikasiyası üçün şərh edilməsi daha asan olan spektrlər yaranır. Peptid hazırlığı sisteinlərin reduksiyasını və alkilləşməsini, nümunənin peptidlərə həzmini, peptidlərin duzsuzlaşdırılmasını və konsentrasiyasını və bu peptidlərin ionlaşma (məsələn, ESI) və orbitrap əsaslı MS ilə yekun təhlilini əhatə edir.

Proteomik analiz üçün MALDI-MS və ya LC-MS və ya LC-MS/MS-dən istifadə etmək qərarı bir sıra amillərdən, o cümlədən nümunənin hazırlanma səviyyəsi və ötürmə potensialından asılıdır. Məsələn, bir neçə nümunə bir MALDI matrisi üzərində qurudula bildiyi üçün, LC-MS və ya LC-MS/MS ilə yalnız bir nümunə ilə müqayisədə bir saat ərzində 96 nümunə təhlil edilə bilər. Əksinə, nümunə mürəkkəbliyindəki bütün azalmalar MALDI-MS ilə off-line həyata keçirilməlidir və buna görə də nümunənin hazırlanması LC-MS və ya LC-MS/MS ilə müqayisədə bu yanaşma üçün əhəmiyyətli dərəcədə vacibdir. MS analizindən əvvəl nümunənin mürəkkəbliyini azaltmaq üçün istifadə olunan tərs fazalı LC.

Nümunə hazırlamaq iş prosesi. Lizat nümunələri bioloji nümunələrdən və ya becərilmiş hüceyrələrdən hüceyrə lizisi, subhüceyrəvi fraksiyalaşma, yüksək bolluqlu zülalların tükənməsi, hədəf zülalların zənginləşdirilməsi, dializ və duzsuzlaşdırma daxil ola bilən xüsusi protokolla hazırlanır. Məhluldaxili həzm reduksiya və alkilləşmə yolu ilə disulfid bağlarının geri dönməz şəkildə qırılmasını və ardınca zülalların peptid fraqmentlərinə həzm olunmasını tələb edir. Alternativ yanaşma əvvəlcə 1D və ya 2D elektroforez (müvafiq olaraq 1DE və ya 2DE) ilə zülalları həll etmək və sonra istədiyiniz band(lar)ı ehtiva edən gel dilimlərini toplamaqdır. Bu gel tıxaclarındakı zülallar daha sonra azaldılır, alkilləşir və həzm olunur yerində. Peptidlər gel matrisindən çıxarıldıqdan sonra peptidlər zənginləşdirilir və duzlar və yuyucu vasitələr çıxarılaraq MS analizi üçün hazırlanır. Bu diaqram nümunənin hazırlanmasının ən ümumi addımlarını əhatə etsə də, optimal nəticələr üçün protokol xüsusi nümunələrə və MS texnikalarına uyğunlaşdırılmalıdır.

Daha ətraflı

Məhsulları seçin


İon mübadiləsi xromatoqrafiyası ilə bağlı problemlərin aradan qaldırılması

Əgər bu yaxşı həll edilmiş ayırmada yalnız müəyyən zirvələr maraq doğurursa, vaxta və tampona qənaət etmək üçün pilləli elüsiyaya keçmək faydalı ola bilər. Bu bölmənin qalan hissəsi qeyri-ideal IEX ayrılmasına səbəb ola biləcək praktiki problemlərə diqqət yetirir.

Şəkil 2. Duz qradiyenti başlamazdan əvvəl nümunə süzülür

Buferlərin düzgün qablarda olduğundan əmin olun. Duzsuzlaşdırma yolu ilə nümunənin ion gücünü azaldın, səhifə 156 və ya başlanğıc tamponu ilə seyreltmə. Anion dəyişdiricisi üçün bufer pH-nı artırın, kation dəyişdiricisi üçün bufer pH-ını azaldın. Zülallar hələ də heç bir pH-da bağlanmırsa, sütunun yuyucu vasitə ilə çirklənməsi mümkündür.

Şəkil 3. Nümunə qradiyent başlayanda hələ də süzülür

Nümunə tətbiqindən sonra elüsyon başlamazdan əvvəl UV izi ilkin vəziyyətə qayıtmalıdır, əks halda sütuna bağlanmayan zülallar ayrılmağa mane olur. Gradient elüsyonuna başlamazdan əvvəl başlanğıc buferinin həcmini artırın (tarazlaşma addımı).

Şəkil 4. Yüksək duzlu yuyulma zamanı nümunə süzülür

Zülallar çox güclü bağlanır. Buferlərin düzgün qablarda olduğundan əmin olun. Anion dəyişdiricidən istifadə edirsinizsə, bufer pH-ını azaldın, kation dəyişdiricidən istifadə edirsinizsə, bufer pH-ını artırın.

Qradientdə gec yayılan maraq doğuran zülal(lar).

Zülallar çox güclü bağlanır. Gradientin ion gücünü artırın. Elüsyon üçün çox yüksək duz konsentrasiyası tələb olunarsa, pH-ın dəyişdirilməsinə üstünlük verilir. Anion dəyişdiricisi üçün bufer pH-ını azaldın və kation dəyişdiricisi üçün bufer pH-ını artırın. Həmçinin müraciət edin Cədvəl 6.

Qradiyentdə çox erkən ayrılan maraq doğuran zülal(lar):

Zülallar güclü şəkildə bağlanmır. Gradientin ion gücünü yoxlayın. Anion dəyişdiricisi üçün pH-ı dəyişdirin, bufer pH-nı artırın və bir kation dəyişdiricisi üçün bufer pH-ını azaldın. Həmçinin müraciət edin Cədvəl 6.

Maraqlanan zülal(lar) kifayət qədər həll olunmayıb

Qətnaməni yaxşılaşdırmaq üçün əsas parametrləri nəzərdən keçirmək üçün bu fəslin məzmununa baxın. Həmçinin müraciət edin Cədvəl 6.

*Metanol, etanol, izopropanol və asetonitril kimi qütb üzvi həlledicilər 0-20% konsentrasiyalarda istifadə edilə bilər, lakin unutmayın ki, bəzi zülallar üzvi həlledicilərin iştirakı ilə öz bioloji aktivliyini geri dönməz şəkildə itirə bilər. Sütun işlətməzdən əvvəl nümunənin və tamponun həllolma qabiliyyətini, tampon pH-ını və mühitin kimyəvi sabitliyini yoxlayın.
Qeyd edək ki, üzvi məhlullarla işləyərkən arxa təzyiq arta bilər.


Dağıdıcı davranış pozuntularının qarşısının alınması

Bəzi uşaqlarda pozucu davranış pozğunluqlarının niyə inkişaf etdiyi dəqiq bilinmir. Bir çox amillər, o cümlədən bioloji və sosial amillər rol oynaya bilər. Məlumdur ki, uşaqlar digər zorakılıq və cinayət davranışlarına məruz qaldıqda, pis rəftar və ya sərt və ya qeyri-ardıcıl valideynlik ilə qarşılaşdıqda və ya valideynlərində maddə istifadəsi pozğunluğu, xarici ikona, depressiya xarici ikona kimi psixi sağlamlıq problemləri olduqda daha çox risk altında olurlar. və ya diqqət çatışmazlığı/hiperaktivlik pozuqluğu (DEHB). Erkən uşaqlıq qayğısının keyfiyyəti də uşağın davranış problemlərinin olub-olmamasına təsir göstərə bilər.

Bu amillər pozucu davranış pozğunluqları riskini artırsa da, uşaqların onları yaşama şansını azaltmağın yolları var. Bu risklərin qarşısını almaq üçün ictimai sağlamlıq yanaşmaları haqqında məlumat əldə edin:


Videoya baxın: SDS PAGE SDS電気泳動 (Oktyabr 2022).