Məlumat

Transkriptlərin əksəriyyəti hiss zəncirindəndir?

Transkriptlərin əksəriyyəti hiss zəncirindəndir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Maraqlıdır, transkriptlərin əksəriyyəti 5'->3' zəncirindən transkripsiya olunubmu? Çünki “antisens transkriptləri” kimi ifadələrlə çox rastlaşıram. Kimsə bunu aydınlaşdırmağa kömək edə bilərmi? təşəkkürlər.


Mənim anlayışımdan məna və anti məna kontekstlidir. Əgər siz 5'->3' geninə (konvensiyadır) baxırsınızsa, bu zəncir hissi zəncirdir və genin tamamlayıcısı antihiss telidir.

Bununla belə, DNT boyunca 'orijinal' antisensitiv zəncirdə bir gen ola bilər, əgər bu yeni geni müzakirə edirsinizsə, yeni kontekst var və o, indi hiss zəncirindədir (yönümlü 5'->3'), və o, anti-sens xəttini tamamlayır.

Ümid edirəm ki, bu aydındır.


DNT-nin Sense və Antisens zəncirləri arasındakı fərq

DNT-nin antisens zəncirinə qarşı həssas zəncir
DNT molekulu iki zəncirli quruluşa malikdir. İki ipdən ibarətdir. mRNT-nin formalaşması və ya transkripsiyası üçün şablon kimi xidmət edən zəncir əsasında bir zəncir sensual zəncir, digəri isə antisens zəncir adlanır.

Hiss xətti
1. Bu zəncir kodlaşdırıcı zəncir, üstəgəl zəncir və ya şablon olmayan ip kimi də adlanır.
2. DNT-dəki timin RNT-də Urasil ilə əvəzlənməsi istisna olmaqla, kodlaşdırıcı zəncir mRNT ilə eynidir.
3. Kodlama zolağında kodonlar var.
8
Antisens ip
1. Bu zəncir kodlaşdırmayan strand, minus strand və ya şablon zəncir kimi də adlanır.
2. Bu zəncir mRNT-nin sintezi üçün şablon kimi çıxış edir. Buna görə də, antisens zəncir zəncirinə və mRNT-yə (T yerinə RNT-də U) tamamlayıcıdır.
3. Kodlanmayan zəncirdə antikodonlar var.

Xoşunuza gələ bilər

11 Şərhlər

Sizdən eşitməyi sevirik :) Bu saytı təkmilləşdirmək üçün bizə Şərh yazın
Ziyarət üçün təşəkkür edirik.

Anti-sens zəncirində 13-cü nukleotid Sitozin olmalıdır. Ümumiyyətlə, bütün prosesin əla xülasəsi!


Fon

Protozoa paraziti Plasmodium falciparum insan malyariyasının ən ölümcül formasından məsuldur və hər il bir milyon insanın ölümünə səbəb olur. Malyariyanın klinik simptomları, ev sahibinin qırmızı qan hüceyrələrinin (RBC) içərisində çoxalan parazitin intraeritrositar mərhələlərindən qaynaqlanır. Son onilliklər ərzində bir çox tədqiqat gen tənzimləməsinin necə əldə edildiyini başa düşməyə yönəlmişdir Plazmodium. nəşri P. falciparum 2002-ci ildə genom ardıcıllığı [1] ardınca mikroarraylar [2, 3] istifadə edərək transkriptom analizləri və daha yaxınlarda cDNT-nin (RNA-Seq) yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı [4𠄷] izlədi. Bu analizlər çox sayda gen üçün transkript səviyyələrini təyin etməyə imkan verdi, orijinal gen modelini dəqiqləşdirməyə kömək etdi və intraeritrositar inkişaf dövrü (IDC) boyunca gen ifadəsinin sərt tənzimlənməsini aşkar etdi. P. falciparum. Buna baxmayaraq, əksər genlər üçün 5 və 3 tərcümə edilməmiş bölgələr (UTR) və antisens transkripsiya dərəcəsi ilə bağlı məlumat hələ də yoxdur.

Kodlaşdırmayan RNT (ncRNA) transkripsiyası eukariotlarda geniş yayılmışdır, məsələn, insan genomunun 90%-dən çoxu transkripsiya olunur [8] halbuki yalnız

Onun 1,5%-i zülalları kodlayır. Ölçülərinə və transkripsiya mənşəyinə əsasən, ncRNA-lar ümumiyyətlə kiçik (𼈀 nt) və ya uzun ncRNA-lar (lncRNA-lar, 𾈀 nt) və intronik, genik və ya intergenik ncRNA-lar (CDS-lər arasındakı bölgələrdən transkripsiya edilmiş) adlandırılır. Bundan əlavə, digər endogen RNT-ləri tamamlayan RNT-lərə təbii antisens transkriptləri (NAT) deyilir. Bəzi NAT-lar bitişik genlərin transkripsiyasının natamam dayandırılması nəticəsində yaranır və transkripsiya səsini təmsil edir. Digər NAT-lar yüksək dərəcədə qorunur və inkişafla tənzimlənən şəkildə, toxumalara xas ifadə nümunələri ilə ifadə edilir [9], gen ifadəsi kimi bioloji proseslərdə tənzimləyici rolları üçün güclü arqumentlər təmin edir. Bir neçə orqanizmdə aparılan iş, mikroRNA adlanan xüsusi NAT qrupunun transkripsiyadan sonrakı gen susdurulmasını təşviq etdiyi RNT-müdaxilə (RNAi) yolu vasitəsilə NAT-ların tənzimləyici rolunu müəyyən etmişdir. Bu yol çoxlu sayda orqanizmdə təsvir edilmişdir, lakin o, xüsusilə yoxdur Saccharomyces cerevisiaeP. falciparum[10, 11]. Bununla belə, funksional RNTi-maşınları olmayan orqanizmlərdə belə, NAT-ların gen ifadəsinin tənzimlənməsində mühüm rol oynadığı göstərilmişdir [12] və NAT-ların RNT-dən asılı olmayan şəkildə gen ifadəsini tənzimləyə biləcəyi bir çox müxtəlif mexanizmlər təsvir edilmişdir. Transkripsiya səviyyəsində NAT-lar transkripsiya edən polimerazlar arasında fiziki toqquşmalar vasitəsilə transkripsiya müdaxiləsinə səbəb ola bilər [13]. Transkripsiyadan sonrakı səviyyədə tənzimləmə sens-antisens dupleks RNT-nin formalaşması yolu ilə baş verə bilər. NAT-ların nüvə saxlanması çox vaxt müşahidə olunur və dupleks formalaşması nüvədə mRNT-ni saxlayaraq gen ifadəsini tənzimləyə bilər. Sitoplazmada sens-antisens dupleks formalaşmasının mRNT sabitliyinə və tərcümə səmərəliliyinə təsir göstərdiyi göstərilmişdir ([14]-də nəzərdən keçirilmişdir).

Nəşr olunan transkriptomun əksəriyyəti təhlil edərkən P. falciparum sens və antisens transkriptləri arasında fərqləndirməyə imkan vermir, bəzi tədqiqatlar zəncirlə bağlı spesifik analiz təmin etmiş və genomun bir çox yerindən antisens transkripsiyasını aşkar etmişdir [7, 15, 16]. Bununla belə, sens və antisens RNT transkript səviyyələri arasında potensial korrelyasiyaların hərtərəfli təhlili aparılmamışdır və hətta yüksək AT ilə zəngin intergenik bölgələri əhatə edən parazitin IDC-də tam zəncirli spesifik transkriptom profili hələ də yoxdur.

RNT-Seq texnologiyasındakı son irəliləyişlər, xüsusən də zəncirlərə xas analizləri yerinə yetirmək bacarığı ([17]-də nəzərdən keçirilir), hətta son dərəcə AT-lə zəngin bölgələri də gücləndirə bilən polimerazanın müəyyən edilməsi [18, 19] və ardıcıllığın artması. uzunluğunu oxumaq, bizi bu təkmilləşdirmələri bir RNT-Seq protokolunda birləşdirməyə və genom geniş, spesifik transkripsiya profilini təyin etməyə sövq etdi. P. falciparum.

Bu protokoldan istifadə edərək, biz IDC-də parazitlər üçün, eləcə də ayrı-ayrılıqda təmizlənmiş nüvə və sitozolik RNT fraksiyaları üçün zəncirli spesifik RNT-Seq kitabxanaları yaratmışıq və nəticədə 90 milyarda yaxın nukleotidin ardıcıllığı baş verir. Məlumatlarımız genlərin 24%-i üçün əhəmiyyətli antisens transkripsiyasını, antisens transkriptlərinin inkişaf tənzimlənməsini, genlərin 3-ucuna qarşı antisens transkripsiyasının güclü meylini və sens və antisens transkript səviyyələri arasında korrelyasiyanın mürəkkəb mənzərəsini nümayiş etdirir. Bundan əlavə, yüksək AT ilə zəngin bölgələrin əhatə dairəsi bizə ilk dəfə 3443 aseksual qan mərhələsi geni üçün poliadenilləşmə yerlərinin xəritəsini çıxarmağa imkan verdi.


Düyü mRNA-larının və kiçik RNT-lərin ifadə atlası

Ardıcıl bir genomda bütün ifadə edilmiş transkriptlərin identifikasiyası həm genom analizi, həm də sistem biologiyasının məqsədlərinin həyata keçirilməsi üçün vacibdir. Düyünün hərtərəfli ifadə atlasını hazırlamaq üçün "kütləvi paralel imza ardıcıllığı" adlı transkripsiya profilləşdirmə texnologiyasından istifadə etdik (Oryza sativa cv Nipponbare). 22 kitabxanadan 46,971,553 mRNT transkriptini və 3 kitabxanadan 2,953,855 kiçik RNT-ni ardıcıllıqla sıraladıq. Məlumatlar, ən azı 25,500 annotasiya edilmiş genin məna ifadəsi və 9,000 annotasiya edilmiş genin antisens ifadəsi daxil olmaqla, genom boyunca geniş yayılmış transkripsiyanı nümayiş etdirir. Annotasiya edilməmiş genomik bölgələrə uyğunlaşdırılmış ~ 15.000 mRNT imzasının əlavə dəsti. Kiçik RNT məlumatlarının əksəriyyəti təkrarlanan ardıcıllıqlara, intergenik bölgələrə və genlərə uyğun gələn daha az bolluqlu qısa müdaxilə edən RNT-ləri təmsil edirdi. Bunların arasında yüksək səviyyədə tənzimlənən kiçik RNT-lərin çoxsaylı qrupları asanlıqla müşahidə edildi. Biz bu mühüm məhsulun transkripsiya profili məlumatlarına ictimai çıxış üçün genom brauzeri (http://mpss.udel.edu/rice) hazırladıq.


İstinadlar

Katayama S, Tomaru Y, Kasukawa T, Waki ​​K, Nakanishi M, Nakamura M, Nishida H, Yap CC, Suzuki M, Kawai J, Suzuki H, Carninci P, Hayashizaki Y, Wells C, Frith M, Ravasi T, Pang KC , Hallinan J, Mattick J, Hume DA, Lipovich L, Batalov S, Engström PG, Mizuno Y, Faghihi MA, Sandelin A, Chalk AM, Mottagui-Tabar S, Liang Z, Lenhard B: Məməli transkriptomunda antisens transkripsiyası. Elm. 2005, 309: 1564-1566.

Beiter T, Reich E, Williams RW, Simon P: Antisens transkripsiyası: hər iki istiqamətdə tənqidi bir baxış. Cell Mol Life Sci. 2008, 66: 94-112.

Ling MHT, Ban Y, Wen H, Wang SM, Ge SX: Məməlilərdə təbii antisens transkriptlərinin qorunmuş ifadəsi. BMC Genomics. 2013, 14: 243-

Faghihi MA, Wahlestedt C: Təbii antisens transkriptlərinin tənzimləyici rolları. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009, 10: 637-643. 10.1038/nrm2738.

Tufarelli C, Stanley JA, Garrick D, Sharpe JA, Əyyub H, Wood WG, Higgs DR: İnsan genetik xəstəliyinin yeni səbəbi kimi gen susdurulmasına və metilasiyaya səbəb olan antisens RNT-nin transkripsiyası. Nat Genet. 2003, 34: 157-165. 10.1038/ng1157.

Yu W, Gius D, Onyango P, Muldoon-Jacobs K, Karp J, Feinberg AP, Cui H: Antisens RNT ilə p15 şiş bastırıcı geninin epigenetik susdurulması. Təbiət. 2008, 451: 202-206. 10.1038/nature06468.

Faghihi MA, Zhang M, Huang J, Modarresi F, Van der Brug MP, Nalls MA, Cookson MR, St-Laurent G, Wahlestedt C: MikroRNT funksiyasının təbii antisens transkript vasitəçiliyi ilə inhibe edilməsinə dair sübut. Genom Biol. 2010, 11: R56-10.1186/gb-2010-11-5-r56.

Uchida T, Rossignol F, Matthay MA, Mounier R, Couette S, Clottes E, Clerici C: Uzun müddətli hipoksiya ağciyər epitel hüceyrələrində hipoksiyaya səbəb olan amil (HIF)-1alfa və HIF-2alfa ifadəsini diferensial şəkildə tənzimləyir: təbii antisens HIF-in təsiri 1alfa. J Biol Chem. 2004, 279: 14871-14878. 10.1074/jbc.M400461200.

Carlile M, Swan D, Jackson K, Preston-Fayers K, Ballester B, Flicek P, Werner A: Siçan toxumalarında Na/fosfat daşıyıcı gen Slc34a1-dən endo-siRNA-ların seçmə nəsli. Nuklein turşuları Res. 2009, 37: 2274-2282. 10.1093/nar/gkp088.

Chen J, Sun M, Hurst LD, Carmichael GG, Rowley JD: İnsan cis-kodlanmış məna-antisense transkriptlərinin koordinat ifadəsinin və təkamülünün genom miqyasında təhlili. Trendlər Genet. 2005, 21: 326-329. 10.1016/j.tig.2005.04.006.

Werner A, Carlile M, Swan D: Təbii antisens transkriptləri nəyi tənzimləyir? RNT Biol. 2009, 6: 43-48. 10.4161/rna.6.1.7568.


Müəlliflər heç bir maraq toqquşmasının olmadığını bəyan edirlər.

Əlavə məlumat, Əlavə cədvəl VI, Əlavə rəqəmlər S1-6

Transkript ifadə səviyyələri, etibarlılıq intervalları və diferensial ifadə FDR

Hiss-antisens cütlərinin siyahısı və onların ifadə səviyyələri

Transkripsiya amili hədəfi S və Y arasında diferensial şəkildə ifadə olunan genlər üçün zənginləşdirmə təyin edir

32 PHO yol geni (Ogawa et al, 2000 Wykoff et al, 2007) bizim məlumat dəstimizlə əhatə olunmuşdur (Y və S genomunun uyğunlaşdırılmasında və ən azı 20 prob ilə)

184 genotipli Y/S seqreqantı üçün mühit olan Arsenatda böyümə fenotipləri


NƏTİCƏLƏR VƏ MÜZAKİRƏ

Əks transkripsiya nəticəsində yaranan artefaktların həcmini qiymətləndirmək üçün zəngin mühitlərdə yetişdirilmiş mayadan RNT nümunələrində ActD (ActD−) olmayan standart əks transkripsiya reaksiyalarının beş təkrarını (bioloji) yerinə yetirdik və cDNT hədəflərini kirəmit massivlərinə hibridləşdirmə yolu ilə təhlil etdik. Hiss transkriptləri üçün hibridləşmə siqnalları bütün təkrarlar arasında uyğun idi. Bununla belə, ifadə edilmiş genomik bölgələrə qarşı antisens tellərində iki növ siqnal qeydə alınmışdır. Bir sinifdə siqnalın intensivliyi hiss tərəfdarlarının intensivliyinə mütənasib olaraq uyğun gəlirdi (Şəkil 2 A, yuxarı panel), bundan əlavə, təkrarlar arasında əhəmiyyətli dəyişkənlik mövcud idi (Şəkil 2 B və C, yuxarı panel). Digər sinifdə antisens siqnalları bütün replikasiyalarda yüksək dərəcədə təkrarlana bilirdi və hiss zəncirinin ifadə səviyyələri ilə uyğun gəlmirdi (Şəkil 2 D, yuxarı panel). Bu fərqlər, antisens siqnallarının birinci sinfinin, modellər tərəfindən təklif edildiyi kimi əks transkripsiya zamanı saxta ikinci zəncir sintezi ilə potensial olaraq tetiklenen artefaktlar ola biləcəyini təklif etdi (Şəkil 1). Zəngin mediada artımla yanaşı, bir neçə digər şərtlər üçün də eyni nümunəni gördük (məlumatlar göstərilmir). Biz fərz etdik ki, ehtimal olunan artefaktlar ActD istifadə edərək həll edilə bilər. Həqiqətən, ActD (ActD+) ilə yerinə yetirilən əks transkripsiya reaksiyalarının üç təkrarı birinci sinif üçün fondan aşağıda ifadə siqnalları ilə nəticələndi, lakin ikinci sinif antisens bölgələri üçün deyil (Şəkil 2 A–D, aşağı panellər). Şəkil 2-də göstərilən nümunələrə əlavə olaraq, bütün genomik bölgələr üçün profillər onlayn olaraq mövcuddur ( http://www.ebi.ac.uk/huber-srv/actinomycinD ).

Əks transkripsiya zamanı ActD-nin yoxluğunda (ActD−) və ya mövcudluğunda (ActD+) həyata keçirilən hibridləşmələrdən gələn məna və antisens siqnallarının genom miqyasında təhlili. ( A ) Antisens siqnalının intensivliyinin hissin ifadə səviyyəsindən asılılığı. Qırmızı əyrilər hamarlayıcı splinelardan istifadə edərək quraşdırılmış hibridləşmə siqnallarını təmsil edir. ( B ) Hiss və antisens telləri (SD) üçün bioloji təkrarlar arasında siqnal intensivliyinin dəyişməsi. ( C ) ActD tərəfindən həll edilən saxta antisens transkriptlərinin iki nümunəsi. ( D ) ActD-dən təsirlənməmiş ardıcıl antisens transkriptlərin iki nümunəsi. Hər iki paneldə C və D, normallaşdırılmış siqnal intensivliyi rəng gradientindən istifadə etməklə onların xromosom mövqeyi boyunca zondlar üçün göstərilir ( x -ox W, Watson strand C, Crick strand). Üst panel, beş ActD- təkrar ( y -ox, ActD−, 1–5) aşağı panel, üç ActD+ təkrarı ( y -ox, ActD+ 1–3). Bütün genomik bölgələr üçün profillər onlayn mövcuddur. ( www.ebi.ac.uk/huber-srv/actinomycinD ).

Əks transkripsiya zamanı ActD-nin yoxluğunda (ActD−) və ya mövcudluğunda (ActD+) həyata keçirilən hibridləşmələrdən gələn məna və antisens siqnallarının genom miqyasında təhlili. ( A ) Antisens siqnalının intensivliyinin hissin ifadə səviyyəsindən asılılığı. Qırmızı əyrilər hamarlayıcı splinelardan istifadə edərək quraşdırılmış hibridləşmə siqnallarını təmsil edir. ( B ) Hiss və antisens telləri (SD) üçün bioloji təkrarlar arasında siqnal intensivliyinin dəyişməsi. ( C ) ActD tərəfindən həll edilən saxta antisens transkriptlərinin iki nümunəsi. ( D ) ActD-dən təsirlənməmiş ardıcıl antisens transkriptlərin iki nümunəsi. Hər iki paneldə C və D, normallaşdırılmış siqnal intensivliyi rəng gradientindən istifadə etməklə onların xromosom mövqeyi boyunca zondlar üçün göstərilir ( x -ox W, Watson strand C, Crick strand). Üst panel, beş ActD- təkrar ( y -ox, ActD−, 1–5) aşağı panel, üç ActD+ təkrarı ( y -ox, ActD+ 1–3). Bütün genomik bölgələr üçün profillər onlayn mövcuddur. ( www.ebi.ac.uk/huber-srv/actinomycinD ).

Bütün kodlaşdırıcı genlər üzərində ActD ilə və ya olmayan ifadə siqnallarının genom miqyasında müqayisəsi [ORF-lər tərəfindən müəyyən edildiyi kimi Sakkaromislər Genom Database (SGD, http://www.yeastgenome.org )] və onların əks bölgələri ActD-nin artefaktual antisens siqnallarını azaltdığı şərhini dəstəklədi. Yuxarıda fonda ifadə edildiyi kimi aşkar edilən antisens bölgələrinin sayı ActD-də 1046-dan ActD+-da 325-ə qədər azaldı. Üstəlik, standart birinci zəncir cDNT sintezi zamanı müşahidə edilən halların yalnız 25%-i (260/1046) hələ də ActD+-da aşkar edilə bilər (Əlavə Cədvəl 1). Bundan əlavə, ikinci zəncir sintezindəki xüsusi roluna uyğun olaraq, ActD fonda aşkar edilmiş sensasiya transkriptlərinin sayına təsir göstərməmişdir. 5703 kodlaşdırıcı gendən (ORF) əksəriyyəti hər iki şəraitdə fondan yuxarıda ifadə edilir: ActD+-da 5214 ORF və ActD-də 5186 ORF− əlavə olaraq, iki gen siyahısı (5172 ORF) arasında demək olar ki, tam üst-üstə düşür (Əlavə Cədvəl 1).

Döşəmə massivləri üçün istifadə edilə bilər de novo transkriptlərin eyniləşdirilməsi (7). Buna görə də, zondların hibridləşmə siqnalları əvvəlki annotasiyadan asılı olmayaraq və hər bir zəncir üçün ayrıca onların xromosom mövqeləri boyunca tədqiq edilmişdir. Profillər seqmentləşdirmə alqoritmindən istifadə etməklə daimi hibridləşmə intensivliyi seqmentlərinə bölündü (7, 20). Seqmentasiya ilə müəyyən edilmiş məna və antisens transkriptləri üçün ActD-nin təsirini təhlil etdik (Əlavə Cədvəl 2). Antisens seqmentləri üç meyar əsasında müəyyən edilmişdir: (i) seqmentlər əks zəncirdə yerləşən, lakin eyni zəncirdə deyil, annotasiya edilmiş genləri ifadə edir və üst-üstə düşür, (ii) seqment uzunluqları 48 bp-dən uzundur və (iii) onlar hər iki tərəfdən azaldılmış hibridləşmə siqnalı olan seqmentlərlə əhatə olunmuşdur. Müqayisə göstərir ki, ActD-nin birinci zəncir cDNT sintezinə heç bir kəmiyyət təsiri yoxdur, çünki ActD+ və ActD- reaksiyalarında ölçülən hiss seqmentlərinin ifadə səviyyələri arasında uyğunluq var (Şəkil 3). Bununla belə, ActD-nin əlavə edilməsi antisens seqmentlərin yarısından çoxu üçün fonun altındakı ifadə səviyyəsini azaldır: cəmi 553 antisens seqment arasında 347-si yalnız ActD--də, 14-ü isə yalnız ActD+-da fondan yuxarı siqnal verir, 192 antisens seqment aşkarlanır. hər iki şəraitdə (Əlavə Cədvəl 3). Buna görə də təəccüblüdür ki, standart tərs transkripsiya protokolundan istifadə etməklə müşahidə edilən antisens seqmentlərinin sayı ActD daxil edilməklə 64% (347/539) azalır.

ActD ilə və olmadan yaradılan massivlər arasında seqment ifadə səviyyələrinin səpələnmə qrafiki. Yaşıl nöqtələr, ActD− nümunələrində fonun üstündə aşkar edilən antisens seqmentlər Qırmızı xətt, hər iki şəraitdə eyni ifadə kəsikli xətlər, fon hədləri.

ActD ilə və olmadan yaradılan massivlər arasında seqment ifadə səviyyələrinin səpələnmə qrafiki. Yaşıl nöqtələr, ActD− nümunələrində fonun üstündə aşkar edilən antisens seqmentlər Qırmızı xətt, hər iki şəraitdə eyni ifadə kəsikli xətlər, fon hədləri.

Üç müstəqil sübut xətti ActD-nin iştirakı ilə yaradılan massiv hibridləşdirmə nəticələri ilə uyğun gəlir. Birincisi, biz serial hibridləşdirmə məlumatlarımızı tam uzunluqlu cDNA ardıcıllığı ilə əldə edilən ciddi antisens transkript dəsti ilə müqayisə etdik (8). Bu iki üsul arasında bir-birini tamamlayan xüsusiyyətlərə, eləcə də fərqli eksperimental böyümə şərtləri (zəngin media ilə minimal media) arasında müqayisə olmasına baxmayaraq, ActD+ verilənlər bazasından daha yaxşı üst-üstə düşür. P 1.6e−9-un 2.5e−6-ya qarşı dəyəri, Fişerin dəqiq testi). İkincisi, hibridləşdirmə nəticələrindən ehtimal olunan antisens artefaktların çıxarılmasına ciddi hesablama filtrinin təsirini qiymətləndirdik. Bu filtr əvvəllər seqmentlərin uzunluğunun ən azı bir hissəsi üçün əks zəncirdə göründüyündən daha yüksək ifadə siqnalına malik olmasını tələb etməklə ehtimal olunan antisens artefaktlarını hesablama yolu ilə aradan qaldırmaq üçün hazırlanmışdır (7). ActD− məlumatlarında hesablama filtri antisens seqmentlərinin sayını 63% (337/539) azaldıb. Bunun əksinə olaraq, filtr ActD+-da aşkar edilmiş antisens seqmentlərin sayına yalnız yüngül təsir göstərmişdir: 206 antisens seqmentdən yalnız 39-u süzülüb. Bundan əlavə, süzgəcdən sonra ActD−-də aşkar edilmiş antisens seqmentləri ilə ActD+-da aşkar edilmiş antisens seqmentlərin müqayisəsi yaxşı (lakin qeyri-kamil) uyğunluq göstərir (158/250) (Əlavə Cədvəl 4 ) . Hesablama filtrləri həmişə yalan pozitivlər və yalan neqativlər arasında güzəşt dilemması ilə üzləşdiyi üçün ActD istifadə edərək eksperimental təkmilləşdirmə daha sərfəlidir. Antisens transkriptlərinin əksəriyyəti zəif ifadə olunduğundan (Əlavə Cədvəl 3) və beləliklə, səs-küydən ayırd etmək çətindir, çünki bu, antisens aşkarlanması üçün açıqdır. Qeyd edək ki, ActD−-də süzülmüş bir neçə antisens seqmenti (48 seqment, Şəkil 4 A narıncı nöqtələr) ActD+-da aşkar edilə bilər ki, bu da bu halların səhvən süzüldüyünü göstərir (əllə yoxlama bunu təsdiqləyir). Bundan əlavə, ActD+ həmçinin hesablama filtrindən səhv keçən artefakt antisens seqmentlərini də həll edir (44 seqment, Şəkil 4 A yaşıl nöqtələr). Üçüncüsü, biz 10 antisens seqmenti üçün yarı kəmiyyətli strand-spesifik RT-PCR təhlili apardıq (Şəkil 4 B): həm ActD+, həm də ActD– (ActD+)-da aşkar edilmiş üç antisens transkriptdən (Şəkil 4 B): MBR1, EPL1, MRK1 ), hər üçü strand-spesifik RT-PCR ilə bir siqnal verdi. Bunun əksinə olaraq, yalnız ActD-də aşkar edilmiş yeddi antisens seqmentindən CYS4, EMP24, PNC1, MDH3, HAC1, TRR1, PFK1 ), yeddisinin hamısı strand-spesifik RT-PCR ilə mənfi nəticələr verdi.

Antisens transkriptlərinin təsdiqi. ( A ) ActD və hesablama filtrinin müqayisəsi. (ActD+) və ActD (ActD−) ilə reaksiyalarda antisens seqmentlərinin ifadə səviyyəsi. ActD− məlumatları üçün yalnız hesablama filtrindən keçən antisens seqmentləri göstərilir. Nöqtəli xətlər fon eşiklərini təmsil edir. Mavi nöqtələr, ActD+ və süzülmüş ActD arasında ümumi seqmentlər− Narıncı nöqtələr, ActD+ üçün unikal yaşıl nöqtələr, süzülmüş ActD− üçün unikal. Bu seqmentlərin siyahısı mövcuddur (Əlavə Cədvəl 4). ( B ) Antisens transkriptlərinin strand-spesifik RT-PCR. Qarşısında üç antisens RNT MRB1, EPL1MRK1 RT-PCR məhsulu əldə etdi. Qarşısında sıra analizi ilə ehtimal olunan antisens artefaktların aşkar edildiyi yeddi bölgə CYS4, EMP24, PNC1, MDH3, HAC1, TRR1PFK1 RT-PCR məhsulu vermədi. ACT1 sens RT-PCR reaksiyaları hər bir fərdi RT-PCR üçün daxili nəzarət kimi xidmət etdi -RT əks transkriptazın buraxıldığı RT reaksiyalarını təyin edir gDNA şablon olaraq genomik DNT ilə PCR reaksiyalarını göstərir, reaksiyalar üç nüsxədə həyata keçirilir.

Antisens transkriptlərinin təsdiqi. ( A ) ActD və hesablama filtrinin müqayisəsi. (ActD+) və ActD olmadan (ActD−) reaksiyalarda antisens seqmentlərinin ifadə səviyyəsi. ActD− məlumatları üçün yalnız hesablama filtrindən keçən antisens seqmentləri göstərilir. Nöqtəli xətlər fon eşiklərini təmsil edir. Mavi nöqtələr, ActD+ və süzülmüş ActD arasında ümumi seqmentlər− Narıncı nöqtələr, ActD+ üçün unikal yaşıl nöqtələr, süzülmüş ActD− üçün unikal. Bu seqmentlərin siyahısı mövcuddur (Əlavə Cədvəl 4). ( B ) Antisens transkriptlərinin strand-spesifik RT-PCR. Qarşısında üç antisens RNT MRB1, EPL1MRK1 RT-PCR məhsulu əldə etdi. Qarşısında sıra analizi ilə ehtimal olunan antisens artefaktların aşkar edildiyi yeddi bölgə CYS4, EMP24, PNC1, MDH3, HAC1, TRR1PFK1 RT-PCR məhsulu vermədi. ACT1 sens RT-PCR reaksiyaları hər bir fərdi RT-PCR üçün daxili nəzarət rolunu oynadı -RT əks transkriptazın buraxıldığı RT reaksiyalarını təyin edir gDNA şablon olaraq genomik DNT ilə PCR reaksiyalarını göstərir, reaksiyalar üç nüsxədə həyata keçirilir.


Veqada genlərin və transkriptlərin annotasiyası üçün üç fərqli mənbə dəsti var. Bunlar müxtəlif treklər kimi göstərilir və müxtəlif rəng sxemlərinə malikdir.

  • Havana Əsas Genləri alternativ transkriptləri müəyyən etmək üçün dərindən şərh edilmişdir və bütün növlər üçün mövcuddur. Onlar WTSI-də Havana qrupu tərəfindən şərh edilmişdir.
  • LoF genləri insan transkriptlərinin funksional xassələri üzrə ardıcıllıqdakı dəyişikliklərin nəticələrini göstərmək.

Bu dəstlərin hər biri üçün genlər və transkriptlər aşağıda göstərildiyi kimi təsnif edilir.


Təşəkkürlər

Professor Jirong Huang və onun tələbəsi Fenhong Hu-ya (Bitki Fiziologiyası və Ekologiya İnstitutu, Şanxay Bioloji Elmlər İnstitutu, CAS) Northern Blot analizinin aparılmasına kömək etdikləri üçün təşəkkür edirik. Bu iş Şanxay Biologiya Elmləri İnstitutu, CAS (2010KIP203), Çin Milli Təbiət Elmləri Fondu (Qrant 31000560) və Çin Elmlər Akademiyasının (KSCX2-EW-Q-1-05) Bilik İnnovasiya Proqramı tərəfindən dəstəklənib. TL. Müəlliflər K.C.-nin dəstəyini minnətdarlıqla qəbul edirlər. Wong Təhsil Vəqfi, Hong Kongdan TL-yə. Bu iş həmçinin Çin Elmlər Akademiyası (KSCX2-YW-N-094), Elm və Texnologiya (2011CB100205) və Çinin Kənd Təsərrüfatı (2011ZX08001-004 və 2011ZX08009-002) nazirlikləri və Milli Təbiət Elmləri tərəfindən dəstəklənib. Çin Fondu (30821004) BH.


Gen redaktəsi üçün açma-söndürmə açarı

Son on ildə CRISPR-Cas9 gen redaktə sistemi elm adamlarına orqanizmlərin DNT-sində məqsədyönlü dəyişikliklər etməyə imkan verən gen mühəndisliyində inqilab etdi. Sistem müxtəlif xəstəliklərin müalicəsində potensial olaraq faydalı ola bilsə də, CRISPR-Cas9 redaktəsi hüceyrənin genetik materialında daimi dəyişikliklərə səbəb olan DNT zəncirlərinin kəsilməsini nəzərdə tutur.

İndi, onlayn nəşr olunan bir məqalədə Hüceyrə aprelin 9-da tədqiqatçılar CRISPRoff adlı yeni gen redaktə texnologiyasını təsvir edir ki, bu da tədqiqatçılara DNT ardıcıllığını dəyişmədən yüksək spesifikliklə gen ifadəsini idarə etməyə imkan verir. Whitehead İnstitutunun üzvü Jonathan Weissman, California University of San Francisco dosent-professor Luke Gilbert, Weissman lab postdoc James Nuñez və əməkdaşları tərəfindən hazırlanmış metod yüzlərlə hüceyrə bölünməsi vasitəsilə miras alınacaq qədər sabitdir və eyni zamanda tamamilə geri çevrilə bilir.

MIT-də biologiya professoru və Howard Hughes Tibb İnstitutunun müstəntiqi olan Weissman deyir: "Burada böyük hekayə indi genlərin böyük əksəriyyətini susdura biləcək sadə bir alətə sahibik". “Biz bunu eyni anda birdən çox gen üçün heç bir DNT zədəsi olmadan, böyük homojenliklə və tərsinə çevrilə biləcək şəkildə edə bilərik. Bu, gen ifadəsini idarə etmək üçün əla vasitədir”.

Layihə geri dönən gen redaktoru yaratmaq üçün Müdafiə Qabaqcıl Tədqiqat Layihələri Agentliyinin 2017-ci il qrantı ilə qismən maliyyələşdirilib. “[İlkin qrantdan] dörd il sürətlə irəliləyin və CRISPRoff nəhayət elmi fantastika şəklində nəzərdə tutulduğu kimi işləyir”, - baş müəllif Gilbert deyir. "Praktikada bu qədər yaxşı işlədiyini görmək həyəcan vericidir."

Genetik mühəndislik 2.0

Klassik CRISPR-Cas9 sistemi bakterial immun sistemlərdə olan Cas9 adlı DNT kəsici zülaldan istifadə edir. Sistem, Cas9 zülallarının DNT zəncirində kiçik qırılmalar yaratdığı tək bələdçi RNT istifadə edərək insan hüceyrələrindəki xüsusi genlərə yönəldilə bilər. Sonra hüceyrənin mövcud təmir maşınları deşikləri düzəldir.

Bu üsullar əsas DNT ardıcıllığını dəyişdirdiyi üçün onlar qalıcıdır. Üstəlik, onların “daxili” mobil təmir mexanizmlərinə etibarı nəticəni istənilən dəyişikliklə məhdudlaşdırmağın çətin olduğunu göstərir. Weissman deyir: "CRISPR-Cas9 nə qədər gözəl olsa da, mürəkkəb və çoxşaxəli təbii hüceyrə proseslərini təmir edir". "Nəticələrə nəzarət etmək çox çətindir."

Tədqiqatçılar fərqli bir gen redaktoru üçün fürsət gördülər - DNT ardıcıllığını özləri dəyişdirməyən, lakin hüceyrədə oxunma üsulunu dəyişdirdi.

Bu cür modifikasiya elm adamlarının "epigenetik" adlandırdığı şeydir - genlər DNT zəncirindəki kimyəvi dəyişikliklər əsasında susdurula və ya aktivləşdirilə bilər. Hüceyrənin epigenetikası ilə bağlı problemlər Fragile X sindromu və müxtəlif xərçənglər kimi bir çox insan xəstəliklərindən məsuldur və nəsildən-nəslə ötürülə bilər.

Epigenetik gen susdurulması tez-tez metilasiya yolu ilə işləyir - DNT zəncirindəki müəyyən yerlərə kimyəvi etiketlərin əlavə edilməsi - bu, DNT-nin RNT polimerazasına, DNT ardıcıllığında genetik məlumatı mesajçı RNT transkriptlərinə oxuyan fermentə əlçatmaz olmasına səbəb olur. nəticədə zülallar üçün planlar ola bilər.

Weissman və əməkdaşları əvvəllər CRISPRi və CRISPRa adlı daha iki epigenetik redaktor yaratmışdılar, lakin bunların hər ikisi bir xəbərdarlıqla gəldi. Onların hüceyrələrdə işləməsi üçün hüceyrələr dəyişiklikləri saxlamaq üçün davamlı olaraq süni zülalları ifadə etməli idilər.

Gilbert deyir: “Bu yeni CRISPRoff texnologiyası ilə siz yaddaşda qalan və hüceyrə tərəfindən qeyri-müəyyən müddətə həyata keçirilən proqram yazmaq üçün [qısaca bir protein ifadə edə bilərsiniz”. “O, oyunu dəyişdirir, buna görə də siz əsasən hüceyrə bölmələri vasitəsilə ötürülən dəyişiklik yazırsınız – bəzi yollarla biz CRISPR-Cas9-un daha təhlükəsiz və eyni dərəcədə effektiv olan və bütün bunları edə bilən 2.0 versiyasını yaratmağı öyrənə bilərik. başqa şeylər də.”

Keçidin qurulması

Təbii DNT metilasiyasını təqlid edə bilən epigenetik redaktor yaratmaq üçün tədqiqatçılar kiçik RNT-lərin rəhbərliyi altında metil qruplarını ipdəki xüsusi ləkələrə yapışdıra bilən kiçik bir protein maşını yaratdılar. Bu metilləşdirilmiş genlər daha sonra "susdurulur" və ya söndürülür, buna görə də CRISPRoff adı verilir.

Metod DNT zəncirinin ardıcıllığını dəyişdirmədiyi üçün tədqiqatçılar CRISPRon adlandırdıqları metodu metil qruplarını çıxaran fermentlərdən istifadə edərək susdurma effektini bərpa edə bilərlər.

CRISPRoff-u müxtəlif şəraitdə sınaqdan keçirən tədqiqatçılar yeni sistemin bir neçə maraqlı xüsusiyyətlərini aşkar ediblər. Birincisi, onlar bu metodu insan genomunda olan genlərin böyük əksəriyyətinə yönəldə bilərdilər - və bu, yalnız genlərin özləri üçün deyil, həm də DNT-nin gen ifadəsini idarə edən, lakin zülalları kodlaşdırmayan digər bölgələri üçün də işləmişdir. İlk müəllif Nuñez deyir: "Bu, hətta bizim üçün böyük bir şok idi, çünki biz bunun yalnız bir gen alt qrupu üçün tətbiq olunacağını düşündük" dedi.

Bundan əlavə, tədqiqatçılar üçün təəccüblü olan CRISPRoff hətta əvvəllər hər hansı DNT metilasiya mexanizmi üçün zəruri hesab edilən CpG adaları adlanan böyük metilləşdirilmiş bölgələrə malik olmayan genləri susdura bildi.

Gilbert deyir: "Bu işdən əvvəl CpG adasına malik olmayan genlərin 30 faizinin DNT metilasiyası ilə idarə olunmadığı düşünülürdü". “Ancaq bizim işimiz açıq şəkildə göstərir ki, metilasiya yolu ilə genləri söndürmək üçün CpG adasına ehtiyacınız yoxdur. Bu, mənim üçün böyük sürpriz oldu”.

Tədqiqat və terapiyada CRISPRoff

CRISPRoff-un praktik tətbiqlər üçün potensialını araşdırmaq üçün alimlər bu üsulu induksiya edilmiş pluripotent kök hüceyrələrdə sınaqdan keçiriblər. Bunlar məruz qaldıqları molekulların kokteylindən asılı olaraq bədəndə saysız-hesabsız hüceyrə tiplərinə çevrilə bilən hüceyrələrdir və beləliklə, müəyyən hüceyrə növlərinin inkişafı və funksiyasını öyrənmək üçün güclü modellərdir.

Tədqiqatçılar kök hüceyrələrdə susdurmaq üçün bir gen seçdilər və sonra onları neyron adlanan sinir hüceyrələrinə çevirməyə təhrik etdilər. Neyronlarda eyni geni axtardıqları zaman onun hüceyrələrin 90 faizində susqun qaldığını aşkar etdilər və bu, hüceyrələrin hüceyrə növünü dəyişdirərkən belə, CRISPRoff sistemi tərəfindən edilən epigenetik dəyişikliklərin yaddaşını saxladıqlarını ortaya qoydular.

Onlar həmçinin CRISPRoff-un terapevtiklərə necə tətbiq oluna biləcəyinə dair nümunə kimi istifadə etmək üçün bir gen seçdilər: Alzheimer xəstəliyində iştirak edən Tau proteinini kodlayan gen. Metodunu neyronlarda sınaqdan keçirdikdən sonra onlar göstərə bildilər ki, CRISPRoff istifadə edərək Tau ifadəsini tamamilə söndürməsə də, aşağı salmaq olar. Weissman deyir: "Bizim göstərdiyimiz budur ki, bu, Tau-nu susdurmaq və zülalın ifadə olunmasının qarşısını almaq üçün əlverişli strategiyadır". “Sual ondadır ki, bunu böyüklərə necə çatdırırsınız? Və həqiqətən də Alzheimer xəstəliyinə təsir etmək üçün kifayət edərmi? Bunlar böyük açıq suallardır, xüsusən də ikincisi.”

CRISPRoff Alzheimer müalicələrinə səbəb olmasa belə, potensial olaraq tətbiq oluna biləcək bir çox başqa şərtlər var. Xüsusi toxumalara çatdırılma CRISPRoff kimi gen redaktə texnologiyaları üçün problem olaraq qalır, "biz göstərdik ki, siz onu müvəqqəti olaraq DNT və ya RNT kimi çatdıra bilərsiniz, eyni texnologiya Moderna və BioNTech koronavirus peyvəndinin əsasını təşkil edir", Weissman deyir.

Weissman, Gilbert və əməkdaşlar CRISPRoff-un tədqiqat potensialından da həvəslidirlər. Weissman deyir: "İndi biz genomun istədiyimiz hər hansı bir hissəsini susdura bildiyimiz üçün bu, genomun funksiyasını araşdırmaq üçün əla vasitədir".

Plus, having a reliable system to alter a cell’s epigenetics could help researchers learn the mechanisms by which epigenetic modifications are passed down through cell divisions. “I think our tool really allows us to begin to study the mechanism of heritability, especially epigenetic heritability, which is a huge question in the biomedical sciences,” Nuñez says.


Videoya baxın: هل الخيوط زي الفيلر (Sentyabr 2022).


Şərhlər:

  1. Tolman

    Tam olaraq lazım olan şey. Birlikdə düzgün cavaba gələ bilərik. Mən əminəm.

  2. Dogore

    Çıxarılıb (qarışıq bölmə var)

  3. Per

    Təəssüf edirəm ki, bütün həyatım necə yaşamağı öyrənməyə sərf olunur.

  4. Endre

    Yaxşı, əla fikir

  5. Pahana

    cool pictures

  6. Kazilkis

    Your question how to regard?

  7. Ashlin

    Məncə siz haqlı deyilsiniz. Mən bunu sübut edə bilərəm.



Mesaj yazmaq