Məlumat

Haemophilus influenzae - Biologiya

Haemophilus influenzae - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Orqanizm

  • Haemophilus influenzae kiçik qram-mənfi basildir.

  • Hərəkətsizdir.
  • Fakultativ anaerob (def).
  • Sürətli böyümə ehtiyacları. Böyümək üçün zənginləşdirmə tələb olunur.

Yaşayış yeri

  • İnsanlarda tənəffüs yollarının selikli qişaları.

Mənbə

  • Xəstənin öz selikli qişaları və ya xəstədən xəstəyə ötürülür.

Epidemiologiya

  • Haemophilus parainfluenzae və kapsulsuz H. influenzae adətən həyatın ilk bir neçə ayı ərzində insanlarda yuxarı tənəffüs yollarını koloniyalaşdırır. Bu bakteriyalar adətən sinüzit, otit media səbəb olur (def), bronxit(def), və pnevmoniya (def).
  • Kapsullaşdırılmış H. influenzae, ilk növbədə H. influenzae b növü, yuxarı tənəffüs yollarının normal florası kimi nadirdir, lakin uşaqlarda ciddi infeksiyanın ümumi səbəbi ola bilər.
  • Uşaqlara qarşı peyvənd olunana qədər H. influenzae B növü inkişaf etmiş ölkələrdə adi hala çevrildi, bu bakteriya sətəlcəm, sepsisemiyanın ən çox yayılmış səbəbi idi.(def), meningit (def), və epiglottit (def) dörd yaşından kiçik uşaqlarda. İmmunizasiya bu bakteriya ilə sistemli infeksiya hallarını 95% azaldıb.

Klinik Xəstəlik

  • Haemophilus influenzae qripə səbəb olmur. Qrip virus infeksiyasıdır.
  • Haemophilus parainfluenzae və kapsulsuz H. influenzae adətən sinüzit, otit media səbəb olur (def), bronxit (def), və pnevmoniya (def).
  • H. influenzae b növü sətəlcəm, septisemiyanın ən çox yayılmış səbəbidir (def), meningit (def), epiqlottit (def), və peyvənd olunmayan dörd yaşından kiçik uşaqlarda selülit.

From Haemophilus influenzae İnfeksiyalar, Mark R Schleiss, MD, Dosent, Pediatriya Departamenti, Yoluxucu Xəstəliklər Bölməsi, Cincinnati Universiteti və Uşaq Xəstəxanası Araşdırma Fondu.


Bakteriofaq Haemophilus influenzae III. HP1-in Morfologiyası, DNT Homologiyası və İmmunitet Xüsusiyyətləric1, S2 və Ştammdan Qüsurlu Bakteriofaq Rd

HP1 faqlarıc1 və S2 və qüsurlu faq Haemophilus influenzae müqayisə edilmişdir. Fagların morfologiyası və onların DNT-lərinin mol kütləsi oxşardır, baxmayaraq ki, qüsurlu fajın fərqli quyruq boşqab bölgəsi var. Elektron mikroskopun müşahidəsi göstərir ki, qüsurlu faj hüceyrə səthinə yapışmır və onun DNT-sinin yapışqan ucları yoxdur. Fagların DNT-lərinin homologiyası hidridləşmə ilə ölçüldü. Qüsurlu fajın DNT-si digər fag DNT-ləri ilə çox az homologiya və ya heç bir homologiya göstərmir. HP1c1 və S2 DNT-ləri yüksək səviyyəli homologiya göstərir. Bu faqların hər biri digər faqın lizogeninin çəmənliklərində lövhələr əmələ gətirə bilər, lakin örtük effektivliyi azalır və bu, iki faqın əlaqəli, lakin eyni olmayan immunitet sisteminə malik olduğunu göstərir.


Giriş

Yazılmayan (kapsullaşdırılmayan) Haemophilus influenzae Qram-mənfi kokko-baccillus (NTHi) normal olaraq insanın nazofarengeal komensal orqanizmidir və həm böyüklərdə, həm də uşaqlarda mühüm insan patogeninə çevrilə bilər. Keçmiş illərdə bəzi tədqiqatçılar NTHi-nin kapsullaşdırılmış variant formaları olduğunu irəli sürdülər H. influenzae keçid zamanı kapsullarını itirmişlər in vitro. Kapsul biosintez genlərinin identifikasiyası və bütöv genom analizinin ortaya çıxması ilə müəyyən edilmişdir ki, NTHi ştammlarında kapsul biosintezində iştirak edən genetik mexanizm yoxdur. Bundan əlavə, yazıla bilməz H. influenzae müxtəlif xəstə populyasiyalarına təsir edir, müxtəlif infeksiyalara səbəb olur, ev sahibinə müxtəlif səth antigenləri təqdim edir və kapsullaşdırılmış suşlardan genetik olaraq fərqlənir.

NTHi ştammlarının kapsul antigeninin olmaması faktını nəzərə alaraq, tədqiqatçılar bu orqanizmlə əlaqəli olan virulentlik faktorlarını axtarıblar ki, bu da ana müdafiə mexanizmlərindən, xüsusən də komplement vasitəçiliyi ilə bakterisid fəaliyyəti ilə əlaqəli olanlardan qorunma təmin edir. Digər qram-mənfi növlər arasında lipopolisakkarid (LPS) tez-tez komplement vasitəçiliyi ilə lizisə müqavimət göstərən amildir. Bu orqanizmlərdə ümumiyyətlə təkrarlanan LPS var O-bakteriyanın səthində komplement hücum kompleksinin əmələ gəlməsinə mane olan qalxan rolunu oynayan antigen strukturları. NTHi ilə əlaqəli genlər də yoxdur O-antigen əmələ gəlir və doqquz-on şəkərdən çox olmayan lipid A-ketooksioktanoat-heptoz nüvə bölgəsinə malik olan səth qlikolipid strukturu əmələ gətirir. Bu quruluş orqanizmin xarici membranına yerləşdirilmişdir. Qısa karbohidrat komponenti nəzərə alınaraq, bu qlikolipid onu digərlərindən fərqləndirmək üçün "Clipoligosaccharide (LOS)" adlandırılmışdır. O- mədə-bağırsaq traktında və ya ətraf mühitdə mövcud olan qram-mənfi bakteriyalarda aşkar edilmiş LPS strukturları olan antigen. Ümumiyyətlə, qram-mənfi bakteriyalar (Neisseria, Haemophilus, və Moraxella) tənəffüs yollarının və genital traktın qeyri-mədə-bağırsaq selikli qişasında tapılan LPS-dən daha çox əsas qlikolipidlər kimi LOS var. Bu növlərin bəziləri müstəsna insan müstəmləkəçiləridir və onların LOS strukturları paraqlobosid, pK antigeni və “i də daxil olmaqla insan qlikosfinqolipid antigenlərini təqlid edəcək şəkildə inkişaf etmişdir.” Bu mimikanın mühüm komponenti N-asetil-5-neyraminik turşusu (Neu5Ac) LOS strukturlarının ucuna. Bu, antigenik mimika tərəfindən təmin edilən immun yayınma qabiliyyətini artırır və orqanizmin səthinə güclü mənfi yük və hidrofillik əlavə edir ki, bu da orqanizmlər üçün zərərli ola biləcək anadangəlmə immun faktorları ilə hidrofobik qarşılıqlı əlaqə potensialını azaldır. Mandrell və iş yoldaşları əvvəlcə NTHi ştammlarının əksəriyyətinin sialilləşmiş LOS strukturlarını ifadə etdiyini və insan qlikosfinqolipid antigenlərini təqlid edən strukturları əmələ gətirdiyini göstərdilər (Mandrell et al., 1992). NTHi-nin LOS-a Neu5Ac əlavə edilməsi orqanizmin normal insan zərdabının öldürməsinə qarşı müqavimətini artırır. Otit mediasının şinşilla modellərində, NTHi-nin Neu5Ac-ni LOS-a daxil etmək qabiliyyəti infeksion prosesin inkişafı üçün çox vacibdir. Bu, orqanizmin LOS strukturlarını Neu5Ac ilə örtmək qabiliyyətinin orqanizmin patogen potensialı üçün çox vacib olduğunu göstərir.

NTHi-nin genomu nisbətən kiçikdir (𢏂.1𠄲.2 Mb) və o, yerləşdiyi çox dar nazofarengeal ətraf mühit yuvasına yaxşı uyğunlaşıb. Bu, daha böyük genomları olan digər Qram-mənfi orqanizmlərdə tapılan sintetik imkanların itirilməsi ilə nəticələndi. Ətraf mühitə uyğunlaşmanın əla nümunəsi olaraq NTHi Neu5Ac sintez etmək qabiliyyətini itirdi. Neu5Ac-ın insan mühitində patogen kimi yaşaması üçün əhəmiyyətini nəzərə alsaq, bu, təəccüblü ola bilər. Bununla belə, NTHi tənəffüs yollarının səthlərində tapılan musinlərlə (karbohidrat strukturunun 15%-i Neu5Ac-dir) əlaqəli sial turşusu (Neu5Ac) dənizində yaşayır. Orqanizm bu mühüm şəkəri əldə etmək, idarə etmək və membran strukturlarına daxil etmək üçün bir sıra mexanizmləri uyğunlaşdırmışdır.


Gliserofosforilkolin Haemophilus influenzae glpQ gen ifadəsini tənzimləyir

Ev sahibinin selikli qişasında yuva yaratmaq üçün Haemophilus influenzae tərəfindən qəbul edilən mühüm virulentlik strategiyası onun lipopolisaxaridlərinin fosforilxolin (ChoP) bəzəyidir ki, bu da ana hüceyrələrə yapışmağa kömək edir. Haemophilus influenzae ChoP sintezi üçün hostdan qliserofosforilkolini (GPC) istifadə edə bilir. GPC-nin istifadəsi qliserofosfodiester fosfodiesteraza fermentini kodlayan glpQ tələb edir. Bu işdə biz real vaxtda PCR və H. influenzae glpQ promotorunun Escherichia coli lacZ reportyor geninə transkripsiya füzyonundan istifadə edərək glpQ geninin transkripsiya tənzimlənməsini araşdırırıq. GlpQ promotor fəaliyyətləri temperatur, oksigen, yüksək duz və minimal inkişaf mühitində dəyişikliklər daxil olmaqla ətraf mühit şəraitində yoxlanılıb. Məlumatlarımız göstərdi ki, otaq temperaturu və anaerob şəraitdə glpQ geninin ifadə səviyyələri digər böyümə şərtləri ilə müqayisədə xeyli yüksək idi. Bundan əlavə, GPC-nin iştirakı ilə glpQ geninin ifadə səviyyələri yüksəldi. Bu nəticələr göstərir ki, H. influenzae tənəffüs yollarının səthlərindən (otaq temperaturu) dərin toxumalara (anaerob) qədər infeksiya zamanı qarşılaşdığı müxtəlif mühitlərə cavab olaraq glpQ ifadəsini yüksəldə bilər. GPC tərəfindən glpQ-nun yüksəldilməsi qida mənbəyi kimi H. influenzae tərəfindən məməli hüceyrələrindən bol GPC-dən səmərəli istifadə etməyə və bakteriyanın host hüceyrələrə yapışmasını və infeksiya zamanı böyüməsini asanlaşdıran lipopolisakkaridin ChoP dekorasiyası üçün imkan verə bilər.


Transformasiya prosesi və virulentlik bakteriya qabiliyyətinə təsiri ilə qrafen oksidi nanohissəciklərinin vasitəçiliyi ilə Haemophilus influenzae porine ompP2 gen transferi

Fon: H. influenzae ətraf mühitdən DNT götürə və bakteriya genomuna rekombinasiya edə bilən təbii səlahiyyətli bakteriyadır. Braziliya purpurik qızdırmasının yayılması, fərqli H. influenzae bioqrupunun - aegyptiusun - çox çirklənmiş əraziləri, həmçinin Neisseria meningiti arasında gen transferi transformasiya prosesini mühüm təkamül faktoruna çevirir. Bu iş asılı hissəciklərlə zəngin atmosferi təqlid etmək üçün qrafen oksid nanohissəciklərinin təsiri altında H. influenzae 07 (NTHi) çoxdavamlı ştamından ompP2 geninin üfüqi ötürülməsini öyrəndi və bu yolla CFU transformantlarının sayının olub olmadığını yoxladı. artıb.

Material və üsullar: Bu məqalədə ompP2 geni asqıdakı qrafen oksid nanohissəciklərinin vasitəçiliyi ilə və ya olmayan müxtəlif H. influenzae ştammlarına çevrildi, ardınca Hec-1B (insan endometriumunun adenokarsinoması) və A549 (ağciyər epitelial karsinoması) hüceyrə xəttlərində yapışma testləri aparıldı. Transformasiya tezliyi və yapışma qabiliyyəti ompP2 geninin köçürüldüyü bütün mutantlarda müəyyən edilmiş və onların vəhşi tipli suşları ilə müqayisə edilmişdir.

Nəticələr: Nanohissəciklər pnevmoniya hadisəsindən təcrid olunmuş xüsusi bir ştamın transformasiya nisbətini artırdı. Bu mutasiyaya uğramış bakteriyaların A549 və Hec1b hüceyrə xətlərinə yapışma nümunələri vəhşi tiplə müqayisədə onların tutumu artmışdır.

Nəticələr: Qrafen oksidi nanohissəcikləri transformasiya prosesinə kömək edir, CFU-ların sayını artırmağa kömək edir və H. influenzae davamlı ştamından ompP2 geni ilə əmələ gələn mutantlar yalnız xloramfenikol müqaviməti təqdim etmir, həm də A549 və Hec1B hüceyrə xəttlərində artan yapışma nümunələrinə malikdir. .


Müzakirə

Biz bunu bu yaxınlarda göstərdik H qripi IL-17.17-dən asılı olan neytrofilik allergik tənəffüs yolları xəstəliyinin inkişafına təkan verir. H qripi infeksiya və allergik tənəffüs yolları xəstəliyi steroidə davamlı olan neytrofilik allergik tənəffüs yolları xəstəliyinin inkişafına təkan verən xroniki infeksiya ilə nəticələnir. Həm də nümayiş etdiririk ki, allergik tənəffüs yolları xəstəliyində xroniki infeksiya hava yolu neytrofillərinin və makrofaqlarının aktivləşməsini və funksiyasını pozur, bu da bakterial davamlılığa və tənəffüs yolu neytrofiliyasına kömək edə bilər. Xüsusilə infeksiyanın təsiri davamlı idi və OVA-dan əvvəl və allergik tənəffüs yolları xəstəliyinin induksiyasından sonra ən azı 5 gün ərzində aydın idi.

Xroniki infeksiya adətən KOAH və bronşektazi və potensial neytrofilik astma kimi neytrofil iltihabla xarakterizə olunan bir çox xroniki tənəffüs yolları xəstəlikləri ilə əlaqələndirilir.4 , 7 , 15 , 16 , 24 Neytrofilik astmada infeksiyanın xronikiliyini az sayda tədqiqat araşdırıb. arasında izah olunmayan əlaqə H qripi və neytrofilik astma xəstələri göstərilmişdir.4 , 15 Bu tədqiqat bu əlaqəni anlamamıza kömək edir. Assosiasiyanın daha yaxşı başa düşülməsi neytrofilik astma və digər xroniki tənəffüs yolları xəstəlikləri olan xəstələrə fayda verəcək terapiya üçün optimal hədəfləri (infeksiyaya qarşı iltihab/immunitet) müəyyən edə bilər. Bu yaxınlarda aparılan bir araşdırma göstərdi ki, bütün astma xəstələri üçün 15% və neytrofil astmalı xəstələr üçün 41% tənəffüs yollarının sekresiyalarında potensial patogen bakteriyaların əhəmiyyətli bir yükü var və H qripi neytrofil fenotipli xəstələrin 60%-də aşkar edilmişdir.15 Bizim məlumatlarımız allergik mühitin və H qripi infeksiya, xroniki infeksiyaya səbəb ola biləcək anadangəlmə immun hüceyrələrin aktivləşdirilməsi və funksiyasının yatırılması ilə nəticələnir. Maraqlıdır ki, allergik tənəffüs yolları xəstəliyinin infeksiyaya qarşı antikor reaksiyalarını, yalançı həssas qruplarla müqayisədə azaldığını göstəririk ki, bu da infeksiyanın davamlı olmasına kömək edə bilər.

Nəticələrimiz də canlı olduğunu göstərir H qripi infeksiya və öldürülən idarə H qripi Allergik tənəffüs yolları xəstəliyində eozinofilik astmanın, o cümlədən eozinofilik iltihabın və allergenlə induksiya edilən Th2 sitokinlərinin bastırılmış xüsusiyyətləri. Allergik tənəffüs yolları xəstəliyində infeksiya eyni vaxtda intensiv tənəffüs yollarının neytrofil iltihabı və AHR daxil olmaqla neytrofil astmanın xüsusiyyətlərini induksiya etdi, bu da eozinofilik allergik tənəffüs yolları xəstəliyi ilə müqayisədə azaldı, lakin neytrofiliyalı xəstələrdə olduğu kimi hələ də qeyri-allergik nəzarətdən yuxarı qalxdı. Beləliklə, aydındır ki, bakteriyalara məruz qalma yoluxucu proses tələb etməyən və həssaslığın dəyişdirilməsi və ya çağırış və ya hər ikisi ilə baş verə bilən allergik tənəffüs yolları xəstəliyinin induksiyasını boğur. İştirak edən mexanizmlərin tədqiqi infeksiyanın müxtəlif antigen təqdim edən hüceyrələrə, B-hüceyrələrinə və T-hüceyrələrinə təsirinin ətraflı öyrənilməsini tələb edir ki, bu da bu tədqiqatın əhatə dairəsindən kənardadır. Daha əvvəl tənəffüs yolu infeksiyası ilə sübut etmişdik Xlamidiya həmçinin neytrofil allergik tənəffüs yolları xəstəliyinin inkişafına təkan verir və infeksiya zamanı neytrofillərin bastırılması bu fenotipin inkişafına mane olur.20

Neytrofilik astmalı xəstələrin mühüm xüsusiyyəti onların astma müalicəsinin əsasını təşkil edən kortikosteroidlərə yaxşı reaksiya verməmələridir.3 Tədqiqatımız göstərir ki, tənəffüs yollarının eozinofilləri və neytrofilləri də daxil olmaqla, infeksiyanın səbəb olduğu neytrofil allergik tənəffüs yolları xəstəliyinin bütün əsas xüsusiyyətləri , Th1, Th2 və Th17 sitokin reaksiyaları və AHR deksametazon müalicəsinə davamlıdır. Başqa bir araşdırma göstərdi ki, Th17 hüceyrələri ilə yenidən qurulan ağır birləşmiş immun çatışmazlığı (SCID) siçanları deksametazon müalicəsinə davamlıdır, Th2 hüceyrələri ilə yenidən qurulan siçanlarda müalicə isə iltihabı və AHR-ni əhəmiyyətli dərəcədə azaldır. Əhəmiyyətli odur ki, in vitro neytrofil apoptozu steroidlərin neytrofillərin sağ qalma müddətini uzatdığını nümayiş etdirir. .3 Maraqlıdır ki, IL-17 astmatik epitel hüceyrələrində GR-β mRNT ifadəsini induksiya edə bilir. in vitro.26 Bu tədqiqat və digərləri birlikdə götürdükdə, neytrofil astması olan xəstələrdə steroid müqavimətini artırmaqda neytrofil iltihab, Th17 hüceyrələri və IL-17 istehsalında infeksiya səbəbli artımların əhəmiyyətli ola biləcəyini göstərir.

Steroid müalicəsi 16-cı gündə allergik tənəffüs yolları xəstəliyində bakteriya sayının kiçik azalmasına səbəb oldu. Müalicə, infeksiyanın aradan qaldırılmasından sonra qeyri-allergik qruplarda infeksiyanı əhəmiyyətli dərəcədə şiddətləndirdi. Bu onu göstərir ki, infeksiya aşkar edilə bilməyən səviyyələrdə, bəlkə də hüceyrədaxili olaraq davam edib və immun cavabları boğduğu bilinən steroid müalicəsi ilə yenidən aktivləşdirilə bilər.3

Biz həmçinin xroniki infeksiyanın induksiyasında iştirak edən mexanizmləri araşdırdıq. Allergik tənəffüs yolları xəstəliyində xroniki infeksiya yoluxmuş allergik qruplarda tənəffüs yolu neytrofillərinin, yoluxmamış allergik nəzarət qrupları ilə müqayisədə artmasına baxmayaraq, saxlanılmışdır. Sağlam tənəffüs yollarında inhalyasiya edilmiş hissəciklərin və bakteriyaların normal mukosiliar təmizlənməsi normal döyünən tənəffüs kirpikləri və onun üzərindəki selik yorğanının qarşılıqlı təsirini tələb edir. Tənəffüs yollarında siliyer funksiyanın və selik istehsalının azalması bakteriyanın təmizlənməsini poza bilər. İnfeksiya və iltihab hüceyrələrinin siliyer döyünmə tezliyini və mukosiliar klirensi pozduğu bildirilmişdir.22 Bununla belə, biz aşkar etdik ki, yoluxmamış allergik qruplarla müqayisədə yoluxmuş allergik xəstələrdə MSC və ya siliyer döyünmə tezliyində heç bir azalma yoxdur, bu, bu fitri immun müdafiə sistemlərində dəyişikliklərin olduğunu göstərir. neytrofilik astmada xroniki infeksiyaya cavabdeh deyil.

Anadangəlmə toxunulmazlığın ən vacib hüceyrə komponentləri neytrofillər və makrofaqlardır ki, onlar aktivləşdirildikdə dərhal qeyri-spesifik reaksiya verir və faqositozla bakteriyaları təmizləyir. Buna görə də biz infeksiya və allergik tənəffüs yolları xəstəliyinin tənəffüs yolu neytrofillərinin və makrofaqlarının aktivləşməsinə və funksiyasına birgə təsirlərini araşdırdıq. TLR-lər neytrofillər və makrofaqlarda ifadə edilir və onların aktivləşməsi və siqnalizasiyasındakı artımlar bu faqositik hüceyrələrin aktivləşdirilməsində, kemokin reseptorlarının ifadəsində və funksiyasında iştirak edir.27 TLR2 vacib olsa da, TLR4 ev sahibinin müdafiəsi və ağciyərin təmizlənməsi üçün çox vacibdir. H qripi infeksiya.28 Biz burada göstəririk ki, yoluxmuş allergik qruplarda TLR2-müsbət hüceyrələr yoluxmamış allergik nəzarətlərlə (16 və 21-ci günlərdə) müqayisədə dəyişməz qalıb, yeganə istisna 16-cı gündə TLR2-müsbət makrofaqların artmasıdır. Maraqlıdır ki, biz göstəririk. ki, 21-ci gündə TLR4-müsbət neytrofillər və makrofaqlar allergik nəzarətlə müqayisədə azalıb, H qripi Allergik tənəffüs yollarında xəstəlik TLR4-müsbət fitri immun hüceyrələrin axınını boğur, bu da infeksiyanın davamlı olmasına kömək edə bilər.

Neytrofil və makrofaqların aktivləşməsi də araşdırıldı. Neytrofillərin və makrofaqların aktivləşməsi mərhələlərlə baş verir və bir sıra fenotipik və funksional dəyişiklikləri əhatə edir. Aktivləşdirmənin aşağı səviyyələri səth reseptorlarının modulyasiyasına və sonrakı qıcıqlanmalara səbəb olur, daha yüksək səviyyələr isə funksiyanı artırır.29, 30 CD62L (L-selektin) istirahət halında olan neytrofillər və dövran edən monositlər üzərində yüksək şəkildə ifadə olunan səth reseptorudur və onların işində vasitəçilik edir. iltihab yerinə miqrasiya. Normal aktivləşmə, miqrasiya və yetkinləşmə zamanı CD62L ifadəsi tökülmə ilə aşağı tənzimlənir və onun ifadəsi aktivləşmənin və yetkinliyin azalmasının göstəricisidir.30–32 Araşdırmamız göstərir ki, xroniki H qripi allergik tənəffüs yolları xəstəliyi zamanı infeksiya CD62L ifadə edən neytrofillərin və makrofaqların sayının artması ilə nəticələnir. Bu onu göstərir H qripi neytrofilik astmada xroniki infeksiyaya səbəb ola biləcək bu hüceyrələrin aktivləşməsini boğa bilər.

Neytrofillərin və makrofaqların funksiyası da araşdırıldı. Aktivləşdirildikdən sonra neytrofillər və makrofaqlar mikrobisid funksiyalar qazanırlar, bunlardan ən vacibi faqositoz və invaziv patogenlərin aradan qaldırılmasıdır.33, 34 Tənqidi olaraq göstəririk ki, allergik tənəffüs yolları xəstəliyində infeksiya faqositoz edən neytrofillərdə və makrofajların axını və/və ya inkişafını tamamilə maneə törədir. tənəffüs yolları yoluxmamış allergik nəzarət vasitələri ilə müqayisədə. Yoluxmuş allergik qruplarda faqositozun bu inhibəsini dəstəkləyən mexanizmlər hazırda məlum deyil və araşdırılır. Bununla belə, mümkün mexanizmlərə faqositozlaşdıran neytrofillərin və makrofaqların apoptozunun artması, bu hüceyrələrin nekrozunun artması və ya patogenin tanınması reseptorunun siqnalının dəyişməsi daxildir. 11, 16 və 21-ci günlərdə yoluxmamış allergik qruplarla müqayisədə yoluxmuş allergik xəstələrdə faqositoz edən neytrofillər və makrofaqlar əhəmiyyətli dərəcədə az olmuşdur. Həmçinin yoluxmuş allergik xəstələrdə bu faqositoz edən hüceyrələr tək yoluxmuş qruplarla müqayisədə daha az olmuşdur, lakin yalnız 11 və 16-cı günlərdə deyil, gün 21. Bu nəticələr göstərir ki, faqositozun azalmasında dominant rol oynayan infeksiyanın təsiri deyil, astma fenotipi ola bilər. Bununla belə, infeksiya faqositlərin funksiyasının azalmasına da kömək edə bilər.

Faqositlərin aktivləşməsinin və axınının olmaması tənəffüs yollarının neytrofil allergik xəstəliyində və neytrofil astmada xroniki infeksiyanın inkişafının səbəbləri ola bilər. Bununla belə, bu, anadangəlmə immun disfunksiyanın digər mexanizmlərinin xroniki infeksiya və neytrofilik astmaya səbəb ola biləcəyi ehtimalını istisna etmir. Potensial var ki, neytrofilik astmada müşahidə olunan neytrofil iltihabın artması onların funksiyalarının azalmasını kompensasiya etmək üçün neytrofil axınının artmasının nəticəsi ola bilər.

Nəticələrimiz də göstərir ki, yoluxmuş allergik qrupların ağciyər hüceyrələri yoluxmamış allergik nəzarət qruplarından daha çox oksidləşdirici partlama əmələ gətirir. Oksidləşdirici partlama oksidləşdirici stressi artırır və iltihabın artması və tənəffüs yollarının hamar əzələlərinin daralması kimi astmanın patofiziologiyasına əhəmiyyətli təsir göstərir.35 Artan oksidləşdirici stress, sağlam nəzarətçilərlə müqayisədə bakterial yükü artırmış astmalı xəstələrdə baş verir ki, bu da yəqin ki, artmış neytrofil iltihabdan daha çox bakterial yük.15

Modelin əvvəlində biz artan antikor reaksiyalarını göstəririk H qripi infeksiyanın artmasının nəticəsi ola bilən OVA həssas qruplarda infeksiya. Lakin sonradan infeksiya və allergik tənəffüs yolları xəstəliyinin birləşməsi antikor reaksiyalarını azaldır və bu da xroniki infeksiyaya səbəb ola bilər. Antikor reaksiyalarının azalması, ehtimal ki, T-hüceyrəsinin köməyi tələb edən B-hüceyrə fəaliyyətinin yatırılması nəticəsində baş verir. Biz T-hüceyrə fəaliyyətinə oxşar supressiv təsir göstəririk.

Bu nəticələr birlikdə götürüldükdə infeksiyanın neytrofilik astma ilə əlaqəsini izah edə bilər. Allergik tənəffüs yolları xəstəliyi davamlı infeksiyanı təşviq edir və bakteriyaları təmizləyə bilməyən, lakin oksidləşdirici stressi artıra bilən qüsurlu anadangəlmə immun hüceyrələrin axınına səbəb olur.

Sonda, biz allergik tənəffüs yollarının xəstəlik və birləşməsi göstərir H qripi infeksiya xroniki infeksiyaya səbəb olur. Xroniki infeksiya Th17 hüceyrələrində infeksiyanın səbəb olduğu artımlar və IL-17 istehsalı ilə birlikdə neytrofil allergik tənəffüs yolları xəstəliyinin və astmanın inkişafına səbəb ola bilər. Bu fenotipin steroidlərə davamlı olduğunu nümayiş etdiririk, bu, artan neytrofillər və Th17 hüceyrələrinin birləşməsinin nəticəsi ola bilər. Xroniki infeksiya, ehtimal ki, anadangəlmə hüceyrə aktivləşməsinin və funksiyasının yatırılması nəticəsində yaranır, lakin xəstəliyin gedişatını daha yaxşı başa düşmək üçün neytrofilik astmanın mexanizmlərinin əlavə tədqiqatları tələb olunur. Bu cür tədqiqatlar bu xəstəlik fenotipi olan xəstələr üçün daha effektiv müalicələrin inkişafına imkan verəcək, bununla da infeksiyaya və astmatik reaksiyalara yönəldilməsi faydalı ola bilər.


Transferrinlə əlaqəli dəmirin Haemophilus influenzae tərəfindən istifadəsi bütöv bir tonB geni tələb edir.

Haemophilus influenzae in vitro böyümə üçün dəmir mənbəyi kimi dəmirlə yüklənmiş insan transferrinindən istifadə edə bilər. H. influenzae tonB mutantları, tonB genlərində xloramfenikol asetiltransferaza geni ehtiva edərək, dəmir yüklü insan transferrinini hüceyrə səthlərinə bağlaya bildilər, lakin onlar in vitro böyümə üçün bu serum qlikoproteinini yeganə dəmir mənbəyi kimi istifadə edə bilmədilər. Bunun əksinə olaraq, bu tonB mutantları böyümə üçün dəmir xelatından (dəmir ammonium sitrat) istifadə edə bildilər. tonB mutantının vəhşi tipli H. influenzae tonB genini kodlayan plazmidlə transformasiyası tonB mutantının dəmir yüklü insan transferrinindən istifadə etmək qabiliyyətini bərpa etdi. Bu nəticələr H. influenzae tərəfindən insan transferrinindən dəmirin alınmasının TonB-dən asılı proses olduğunu göstərir.


Xroniki obstruktiv ağciyər xəstəliyində rolu?

Kapsulsuz Haemophilus influenzae adətən xroniki obstruktiv ağciyər xəstəliyi (KOAH) olan xəstələrin tənəffüs yollarında həm stabil xəstəlik zamanı, həm də kəskinləşmə zamanı aşkar edilir. Neytrofillər həmçinin KOAH xəstələrinin bəlğəmində çoxlu miqdarda tapılır ki, bu da elastaz kimi sərbəst buraxılan neytrofil məhsulları ehtiva edir. Niyə H. influenzae KOAH xəstələrinin ağciyərlərini kolonize edir, bu qədər çox sayda infiltrasiya edən neytrofillərin varlığı bilinmir. Aralarında anormal qarşılıqlı əlaqə olub olmadığını müəyyən etmək üçün yola çıxdıq H. influenzae və neytrofillər KOAH patologiyasına təsir göstərə bilər. Kapsulsuz H. influenzae kliniki izolatlar inkubasiya edilmişdir in vitro sağlam könüllülərdən alınan neytrofillərlə və tənəffüs partlama fəaliyyəti, sitokin və kemokin istehsalı, faqositoz və bakteriyaların öldürülməsi, neytrofil apoptozu və nekrozu ölçüldü. Bəlğəm nümunələrində neytrofillərin morfologiyası müəyyən edilmişdir. H. influenzae neytrofillər tərəfindən faqositozlanmış, bununla da tənəffüs partlamasını və neytrofil kemoatraktantı IL-8 sekresiyasını aktivləşdirmişdir. Bununla belə, bakteriyaları öldürmək əvəzinə, neytrofillərin özləri öldürüldü (əsasən nekroz yolu ilə) və onların qranul məzmununu hüceyrədənkənar mühitə buraxdılar. Neytrofildən əldə edilən IL-8, qarşılıqlı təsirindən sonra yaranır H. influenzae neytrofillərlə, neytrofillərin ağciyərlərə daha da infiltrasiyası ilə nəticələnə bilər və bununla da iltihab reaksiyasını gücləndirə bilər. Bununla belə, infiltrasiya edən neytrofillər bakteriyaları öldürə bilmir və əvəzində nekroz keçirdikləri üçün toxuma zədələyən məhsulları ağciyərə buraxırlar. Bu nəticələr KOAH-da klinik mənzərəni izah etməyə kömək edə bilər.

Bu iş xroniki obstruktiv ağciyər xəstəliyinin klinik mənzərəsini izah etməyə kömək edir: çox sayda tipsiz Haemophilus influenzae çoxlu sayda nekrotik, hərəkətsiz neytrofillər toxuma zədələnməsini müşahidə edir. Biz göstəririk ki, neytrofillər bu bakteriyanı öldürə bilməz, əksinə nekrozla öldürülür.

KOAH irəlilədikcə xəstələrin aşağı tənəffüs yollarının bakterial və/və ya viral infeksiyaları ilə əlaqəli simptomlarının kəskinləşməsi barədə məlumat vermə ehtimalı daha yüksəkdir (10, 11), müəyyən edilmiş ən çox yayılmış patogen Haemophilus influenzae. Bu orqanizm KOAH olan xəstələrin aşağı tənəffüs yollarını xroniki şəkildə koloniyalaşdıra bilər və üstünlük təşkil edən serotipdəki dəyişikliklər kəskinləşməni sürətləndirmək üçün kifayət ola bilər (12, 13). Necə H. influenzae bunu edir və niyə digər orqanizmlərdən daha çox onun üstünlük verilən kolonizasiya patogeni olduğu hələ aydın deyil (14).

Bu işdə neytrofillərin kapsul olmayanlarla qarşılıqlı təsirini araşdırdıq H. influenzae in vitro və göstərir ki, bakteriyaları öldürməkdənsə, neytrofillər özləri faqositozdan sonra sürətlə hüceyrə ölümünə məruz qalırlar. Belə bir fenomen KOAH xəstələrinin yoluxmuş ağciyərlərindəki klinik mənzərəni izah edə bilər (15, 16): çox sayda canlı H. influenzae, yüksək sayda qeyri-funksional neytrofillər və nekrotik neytrofillərdən sitotoksik məhsulların sərbəst buraxılması nəticəsində yarana bilən ağciyər toxumasının zədələnməsi.

Polymorphprep AXIS-SHIELD-dən idi (Oslo, Norveç). Rapid Romanowsky Stain HD Supplies-dən (Aylesbury, Böyük Britaniya) idi. Columbia agar və CampyGen OXOID Ltd-dən (Hampshire, Böyük Britaniya) idi. Fetal buzov serumu (FCS) Harlan Seralabs (Loughborough, UK) şirkətindən idi. Defibrinləşdirilmiş at qanı TCS Biosciences-dən (Bukingem, Böyük Britaniya) idi. Annexin-V–FITC konjugatı Biosource-dan idi (Niveles, Belçika). Təkmilləşdirilmiş kemilüminesans (ECL) aşkarlama agentləri, Hyperfilm və anti-dovşan Ig horseradish peroxidase (HRP) ilə əlaqəli tam antikor (eşşəkdə yetişdirilmiş) Amersham Life Sciences (Bucks, Böyük Britaniya) şirkətindən idi. Qoyun anti-insan miyeloperoksidazı (MPO) və eşşək anti-dovşan IgG HRP konjugatı Amershamdan idi (Little Chalfont, Bucks, Böyük Britaniya). Beadlyte Human Multi-Sytokin Detection System 3 Upstate Cell Signaling Solutions şirkətindən (Lake Placid, NY) idi. Fluorokine MAP Human IL-1β, IL-6, IL-8 və TNF-α dəstləri R&D Systems-dən (Abingdon, Böyük Britaniya) idi. Monosit Mənfi İzolyasiya Kiti və Dynabeads CD3/CD28 T Hüceyrə Genişləndiricisi Dynal (UK) Ltd (Wirral, Böyük Britaniya) şirkətindən idi. İnsan birləşdirilmiş kişi AB serumu, insan IgG və insan IgA Sigma-Aldrichdən (Poole, Böyük Britaniya) idi.

İnsan neytrofilləri istehsalçının təlimatlarında təsvir olunduğu kimi Polymorphprep vasitəsilə bir addımlı sentrifuqa ilə sağlam könüllülərin heparinləşdirilmiş venoz qanından təcrid edilmişdir. Çirkləndirici eritrositlər hipotonik lizis yolu ilə çıxarıldı və neytrofillər mədəniyyət mühitində yenidən dayandırıldı. Rapid Romanowsky boyanması ilə qiymətləndirildiyi kimi təmizlik > 95%, canlılıq isə Trypan Blue istisnası (17) tərəfindən qiymətləndirildiyi kimi təmizlənmədən dərhal sonra > 97% olmuşdur. Neytrofillər həmçinin astma və KOAH xəstələrinin bəlğəmindən aşağıdakı kimi təcrid edilmişdir. Bəlğəm ekspektorasiya yolu ilə 50 ml steril konteynerə toplanır. Nümunələr toplanandan sonra 2 saat ərzində işlənmişdir. Bəlğəm tıxacları toplandı və maşa istifadə edərək tüpürcəkdən ayrıldı. Bəlğəm əvvəlcədən çəkilmiş Falcon borusuna köçürülüb və bəlğəmin çəkisi müəyyən edilib. Bəlğəmin hər qramına 10 ml PBS əlavə edildi. Qarışıq bəlğəmi dağıtmaq üçün çalxalandı və sonra silkələnmə ilə 30 dəqiqə 37°C-də inkubasiya edildi. Bu təzə PBS ilə təkrarlandı. Qarışıq PBS ilə 50 ml-ə qədər seyreltildi və 48 μm neylon doka ilə süzüldü. Hüceyrələr sentrifuqa ilə toplanmış və iki dəfə PBS ilə yuyulmuşdur. Hüceyrələr daha sonra 10 ml PBS-də yenidən dayandırıldı. Məhlul Ficoll Paque məhlulunun üzərinə qatlanmış və 1000 ×-də sentrifuqa edilmişdir g 30 dəq. Supernatant çıxarıldı və qranullaşmış hüceyrələr (neytrofillər) 10% (həcm/həcm) FCS və 2 mM L-Qlutamin ilə əlavə edilmiş 25 mM HEPES ehtiva edən RPMI 1640-da yenidən dayandırıldı.

Neytrofillər HOCl üçün analiz istisna olmaqla, 25 mM HEPES ehtiva edən ya RPMI 1640 mühitində becərildi (aşağıya baxın) analizlərdə göstərilən hüceyrə konsentrasiyalarında. 2 saatdan çox mədəniyyətlər üçün neytrofillər 10% (həcm/həcm) FCS və 2 mM L-Qlutamin ilə əlavə edilmiş 25 mM HEPES ehtiva edən RPMI 1640 mühitində yenidən dayandırıldı. Bütün mədəniyyətlər 37°C-də yumşaq çalkalama ilə aparılmışdır. Mətndə göstərildiyi hallarda, stimullaşdırmadan əvvəl neytrofillər GM-CSF (45 dəqiqə ərzində 50 U/ml) və ya TNF-α (15 dəqiqə ərzində 10 ng/ml) əlavə edilməklə astarlandı.

Kapsül olmayanın klinik izolatı H. influenzae (G682) 5% (həcm/həcm) CO ilə 37°C-də şokoladlı agar plitələrində yetişdirildi.2 və ya mikroaerofil mühit yaratmaq üçün CampyGen paketi olan şam qabında. Staphylococcus aureus (Oksford ştammı) gecə ərzində 37°C-də LB agar plitələrində yetişdirildi. Bakteriyalar steril tampon istifadə edərək plitələrdən çıxarıldı və OD-ni təyin etmək üçün fosfat tamponlu salin (PBS, 10 mM kalium fosfat, 0,9% NaCl, pH 7,4) köçürüldü.540 uyğun kalibrləmə əyrilərindən istifadə edərək bakteriya/ml sayını hesablamaq. Kapsullaşdırılmamış on əlavə klinik təcrid H. influenzae və iki izolatı H. influenzae b tipi (Hib) də eyni şəraitdə becərilirdi.

Canlı H. influenzaeS. aureus hüceyrələr 1600 ×-də sentrifuqa edilərək bakteriyaların qranullaşması yolu ilə yığılmışdır g 10 dəqiqə, supernatant atılır. Bakteriyalar insan IgG (5 mq/ml), insan IgA (1.6 mq/ml) və ya 30% (həcm/həcm) istiliklə təsirsizləşdirilmiş birləşdirilmiş insan AB serumunda qranulların yenidən dayandırılması ilə opsonizasiya edilmişdir. Qeyd edək ki, bu tədqiqat boyu eyni IgG, IgA və AB serum partiyalarından istifadə edilmişdir. 37°C-də 20 dəqiqə inkubasiyadan sonra, yumşaq çalkalama ilə bakteriyalar üç dəfə PBS ilə yuyuldu və nəhayət, məlum bakteriya/ml konsentrasiyasını vermək üçün PBS-də yenidən suspenziya edildi. Unopsonized nümunələr yenidən dayandırıldı, PBS-də yuyuldu və 37 ° C-də 20 dəqiqə inkubasiya edildi.

Lüminol ilə gücləndirilmiş kimilüminesansdan istifadə edərək reaktiv oksidləşdirici istehsal 37°C-də 10 6 neytrofil və 10 μM luminol ehtiva edən 1 ml-lik süspansiyonlarda LKB 1251 lüminometrdən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir (18, 19). HOCl ifrazı aşağıdakı analiz tamponundan (10 mM NaH2PO4.H2O, 140 mM NaCl, 5 mM taurin, 0.5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 1 mg/ml glucose, pH 7.4). A quantity of 0.25 × 10 6 neutrophils (in a total volume of 200 μl) was transferred to a 96-well plate and incubated with bacteria. Phorbol myristate acetate (PMA 1 μg/ml final concentration) and was used as a positive control, while incubation with assay buffer alone was used to determine the background rate of HOCl secretion. After stimulation, the plate was incubated for 45 min at 37°C, with gentle agitation. Neutrophils were pelleted by centrifugation at 1,000 × g for 10 min, and 100 μl of supernatant was transferred to another 96-well plate. Trimethylbenzidine (TMB) developing reagent (10 mM TMB in DMF, 400 mM acetic acid and 100 μM KI) was added to each well and the plate incubated for 5 min at room temperature for the (blue) color to develop. The absorbance of each well was then measured at 655 nm using a microtiter plate reader. The concentration of HOCl secreted was calculated using a taurine chloramine calibration curve.

Neutrophils at 2.5 × 10 6 /ml RPMI 1640 supplemented with 10% FCS and 2 mM L-Glutamine were cultured as described in the text and then centrifuged at 1,000 × g for 10 min. A 200-μl aliquot of supernatant from each sample was transferred to a polypropylene 96-well plate and stored at −40°C until analysis. The Luminex 100 LabMAP System was used to measure and quantify multiple cytokines from a single sample as per the manufacturer's instructions.

Neutrophils were resuspended in RPMI 1640 supplemented with 10% FCS and 2 mM L-Glutamine at concentrations of 1 × 10 6 /ml, and then incubated with bacteria at 25:1, 20:1, 10:1, and 5:1 ratios of bacteria to neutrophils, as indicated in the text. Incubation was at 37°C, with gentle agitation for 3 h. In addition, cultures of bacteria were incubated under identical conditions in the absence of neutrophils to determine the effects of culture conditions on bacterial growth and viability. After incubation, aliquots of suspensions were first diluted in distilled water (to lyse the neutrophils) before further dilutions in PBS and plating for measurements of viable counts. Viable bacteria that were present both in the medium and within the neutrophils were thus detected by this assay. This procedure had no effect on bacterial viability (20).

After culture, cell-free supernatants were heated with SDS-sample buffer and then separated using SDS-PAGE and transferred to Immobilon membranes, as described previously (21). Membranes were blocked for 1 h at room temperature in blocking buffer (Tris-buffered saline [TBS 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0], 0.5% [wt/vol] Marvel dried skimmed milk, 0.075% [vol/vol] Tween 20), with gentle agitation. Membranes were then washed for 2 × 30 s, with wash buffer (TBS pH 8.0, 0.075% [vol/vol] Tween 20), before being incubated with primary antibody in antibody buffer (TBS pH 8.0, 0.5% [wt/vol] Marvel dried skimmed milk, 0.075% [vol/vol] Tween 20) at 4°C overnight, with gentle agitation. Membranes were then washed for 2 × 30 s, 1 × 15 min, and 2 × 5 min in wash buffer before incubation with HRP-linked secondary antibody in antibody buffer, for 1 h at room temperature, with gentle agitation. After further washes in wash buffer, bound antibodies were identified using ECL detection agents and Hyperfilm using several exposures of film to avoid signal saturation.

Neutrophils were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% (vol/vol) FCS and 2 mM L-Glutamine, containing Annexin-V–FITC conjugate (2 μl/ml) and PI (1 μg/ml) (22). Cells were observed on a Zeiss LSM 510 microscope. Annexin-V–FITC was excited with 488 nm, and the emission at 530 nm was recorded with a 505- to –550-nm band pass filter. Propidium iodide (PI) excitation was at 543 nm, and emission was recorded at 585 nm with a 585-nm long pass filter. Cells were imaged initially every 6 min, then every hour overnight to observe apoptosis (binding of FITC–annexin V) or necrosis (permeability to PI). Images were analyzed using LSM510 software.

Neutrophils were cultured at 5 × 10 6 /ml in RPMI 1640 supplemented with 10% FCS and 2 mM L-Glutamine. One-milliliter cultures of control neutrophils, or neutrophils plus H. influenzae (1:100 ratio) or S. aureus (1:100 ratio), were incubated at 37°C with gentle agitation for 2 h. Cells were pelleted at 500 × g for 10 min and resuspended in EM fixative (2.5% [vol/vol] cacodylate-buffered glutaraldehyde), for 1 h. Cells were pelleted as before, washed in distilled water, and resuspended in 1 ml 50% (vol/vol) ethanol. Fixed cells were embedded in methacrylate and thin sections cut using a diamond microtome. These sections were stained with Reynold's lead citrate and uranyl acetate, carbon re-enforced and examined using a Philips 301 electron microscope. Neutrophil morphology was also determined in sputum samples from patients with asthma and with COPD, including those with and without a recent history of H. influenzae infeksiya.

Data are expressed as mean ± SD unless otherwise stated and, where appropriate, the significance of differences between groups were tested using the Student's t test.

When neutrophils were incubated with unopsonized H. influenzae, no increase in luminol-dependent chemiluminescence was detected ( Figure 1A ), even when the ratio of bacteria to neutrophils was increased up to 1,000:1. However, when the bacteria were opsonized with either IgG, serum ( Figure 1A ), or IgA (data not shown), chemiluminescence activity increased, resulting from activation of reactive oxidant production via the combined activities of the NADPH oxidase and myeloperoxidase. As a positive control, the responses of neutrophils to H. influenzae were compared with those of the more commonly studied bacterium, S. aureus ( Figure 1B ). Responses to H. influenzae were generally lower than those to S. aureus at the ratios of bacteria:neutrophil used, but the kinetics of the responses were very similar ( Figure 2 ). The magnitude of the chemiluminescence response was increased as the ratio of opsonized bacteria:neutrophils was increased. Chemiluminescence of opsonized bacteria was enhanced by prior exposure of the neutrophils to the priming agents, GM-CSF or TNF-α ( Figure 2 ), but cytokine-primed neutrophils still did not generate a respiratory burst in response to unopsonized bacteria (data not shown). Unlike the responses to the phorbol ester, PMA, phagocytosis of the bacteria did not result in the secretion of significant amounts of HOCl irrespective of the opsonization state of the bacteria, or the ratio of bacteria:neutrophils (data not shown). This indicates that the majority of the reactive oxidants generated during phagocytosis and detected by chemiluminescence were intracellular. This is in accord with previous reports showing that luminol chemiluminescence is capable of detecting both intracellular and extracellular reactive oxidant production (18, 19).

Şəkil 1. Activation of the respiratory burst by H. influenzaeS. aureus. Neutrophils (10 6 cells/ml) were suspended in RPMI 1640 medium supplemented with 10 μM luminol. Chemiluminescence responses were measured over a 60-min incubation period after no additions (control) or after the addition of (A) H. influenzae or (B) S. aureus at bacteria: neutrophil ratios of 250:1, 500:1, 750:1, or 1,000:1. Bacteria were either unopsonized (open bars) or opsonized with IgG (shaded bars) or serum (solid bars) as described in M aterials and M ethods . Values shown are means (± SD, n = 6).

Şəkil 2. Effects of cytokine priming on neutrophil respiratory burst activity stimulated by H. influenzaeS. aureus. Neutrophils were incubated as described in the legend to Figure 1 for measurement of luminol chemiluminescence. Serum-opsonized S. aureus (A) və ya H. influenzae (B) were added to either unprimed neutrophils (dairələr) or neutrophils previously primed with either GM-CSF (open squares) or TNF-α (solid squares), as described in M aterials and M ethods . Typical result of at least five separate experiments.

Neutrophils were then incubated with H. influenzae to determine if this interaction resulted in the secretion of IL-8, an important chemokine that has been implicated in the pathology of COPD. Hər ikisi S. aureusH. influenzae induced the production of IL-8 by neutrophils ( Figures 3A and 3B ), and expression of this chemokine was detected during incubation with unopsonized bacteria (unlike chemiluminescence), but was not significantly increased further when the bacteria were opsonized with either serum or IgG. When neutrophils were incubated with S. aureus, the levels of IL-8 release detected after 21 h incubation were significantly elevated above levels detected after 3 h incubation ( Figure 3A ). However, levels of IL-8 production in response to H. influenzae at 21 h were only slightly increased above levels at 3 h ( Figure 3B ). Further analysis showed that after 3 h incubation, levels of IL-8 release triggered by either S. aureus və ya H. influenzae were very similar, but unlike for S. aureus, this production was not sustained by neutrophils incubated with H. influenzae ( Figure 3C ). Thus, while the initial triggering of IL-8 production by neutrophils was comparable for both bacteria, there was something unusual about the interaction with IL-8 that prevented sustained secretion of this cytokine. IL-8 secretion was enhanced after addition of H. influenzae to neutrophils that had previously been primed with LPS (data not shown). While incubation of neutrophils with S. aureus also resulted in the secretion of TNF-α and IL-1β, these cytokines were not released in significant levels after incubation with H. influenzae (məlumatlar göstərilmir). However, these low levels of IL-1β detected after incubation of neutrophils with S. aureus were not detected in neutrophil preparations that were immunodepleted of T cells or monocytes, whereas TNF-α and IL-8 production were unaffected by removal of these contaminating cells, confirming their production by neutrophils (data not shown).

Şəkil 3. IL-8 secretion by neutrophils in response to H. influenzae və ya S. aureus. Neutrophils were incubated in RPMI 1640 medium as described in M aterials and M ethods . Unopsonized (open bars), IgG-opsonized (lightly shaded bars), serum-opsonized (darkly shaded bars), or IgA-opsonized (solid bars) S. aureus (A) və ya H. influenzae (B) were added at a ratio of 500:1. C shows IL-8 production in response to serum-opsonized S. aureus (shaded bars) və ya H. influenzae (solid bars) at 3 h and 21 h incubation. Values shown are means (± SD, n = 3). Basal levels of IL-8 secretion by unstimulated neutrophils were 10–15 pg/10 6 cells and 40–50 pg/10 6 cells after 3 h and 21 h incubation, respectively. In C at 3 h there was no significant difference in IL-8 production in response to S. aureus və ya H. influenzae, while by 21 h, the difference in production was significant (P < 0,01).

The above experiments clearly indicate that human neutrophils recognize and phagocytose H. influenzae and that during this process cell activation occurs, resulting in the generation of the respiratory burst and IL-8 secretion. However, the fact that IL-8 secretion was not sustained suggested that the neutrophil–H. influenzae interaction was somewhat unusual and different to that with S. aureus.

Next we measured the efficiency of killing of bacteria by neutrophils. IgG-opsonized S. aureus were efficiently killed after incubation with neutrophils ( Figure 4 ), with ∼ 73% of the initial inoculum killed (± 10%, n = 8) within 3 h incubation at this ratio of bacteria:neutrophil (10:1), in line with previous publications (20, 23). Similar results were obtained when the bacteria were opsonized with serum (data not shown). In contrast, under these identical experimental conditions, neutrophils failed to kill H. influenzae ( Figure 4 ), whether the bacteria were opsonized or not. This inability of neutrophils to kill H. influenzae was not affected by the bacteria:neutrophil ratio (at ratios of bacteria:neutrophils of 5:1, 10:1, or 25:1), was independent of the opsonisation state of the bacteria (with IgG, IgA or serum), and was not improved by prior incubation of neutrophils with priming cytokines (data not shown).

Şəkil 4. Neutrophil-dependent bacterial killing. Neutrophils (10 6 /ml) were incubated with 10:1 IgG-opsonized S. aureus və ya H. influenzae and after 3 h incubation, viable bacteria were measured by plate counting, as described in M aterials and M ethods . Parallel cultures of bacteria only (no neutrophils) were set up and viable bacteria measured at 0 h and 3 h by the same method. Values shown are % killing of bacteria at 3 h, compared with viable count at 3 h as means (± SD, n = 6). *P < 0.01.

The reason for this failure of neutrophils to kill H. influenzae was investigated and first it was necessary to confirm that the bacteria were taken up into phagolysosomes. Examination of electron micrographs revealed that S. aureus (which were efficiently killed by neutrophils) were taken up into compact phagolysosomes, typically containing 1–3 bacteria per vacuole (at the ratio of bacteria:neutrophils used in this study, Figures 5A and 5B ). There was clear evidence of discharge of granule contents into these phagolysomes containing the bacteria (oxlar in Figures 5C and 5D showing neutrophil granules entering the phagosome). In contrast, many more H. influenzae were visible with phagosomes of neutrophils (typically 6–8 bacteria per vacuole, Figures 5E–5J ). These vacuoles were also large and essentially devoid of granule enzymes ( Figures 5 E, 5I, and 5J ). Furthermore, the morphology of the neutrophils after phagocytosis of the H. influenzae was unusual in that (1) many of the phagocytic vesicles appeared to be either disintegrating or fusing with one another (dark arrows in Figures 5G and 5J ), (2) some bacteria appeared to be present in the neutrophil cytoplasm and were not contained within a phagosome (light arrows in Figures 5E and 5F ), and (3) some neutrophils were showing signs of cell death as shown by loss of integrity of their plasma membrane ( Figures 5E, 5G, and 5J ).

Figure 5. Electron micrographs of neutrophils after phagocytosis of serum-opsonized S. aureusH. influenzae. Neutrophils were incubated with serum-opsonized S. aureus (at a bacteria: neutrophil ratio of 100:1 A–D) və ya H. influenzae (E–J) for 3 h before fixation and analysis of morphology by electron microscopy. The results presented here are typical of three separate experiments in which at least 10 plates from each experiment were analyzed.

This unusual neutrophil morphology was confirmed by Romanowsky staining, 1 h and 4 h after incubation with S. aureusH. influenzae ( Figure 6 ). Even by 1 h incubation with H. influenzae ( Figure 6C ), many neutrophils had unusual morphology (e.g., round nucleus) and appeared to be extremely fragile, apparently having spilled their cytoplasmic contents onto the microscope slide after centrifugation. Such gross morphological changes and cytoplasmic spillage were not seen in control cells ( Figure 6A ) or in neutrophils after incubation with S. aureus ( Figure 6B ).

Şəkil 6. Neutrophil morphology after phagocytosis. Neutrophils were incubated for either 1 h or 4 h in the (A) absence (control) or presence of IgG-opsonised (B) S. aureus or (C) H. influenzae at a bacteria:neutrophil ratio of 100:1. Samples were cyto-centrifuged and stained with Romanowsky. Typical result of four separate experiments.

The above experiments indicated that incubation of neutrophils with H. influenzae (lakin yox S. aureus) resulted in morphologic changes indicative of increased cell death. The cells were extremely fragile after incubation with H. influenzae and so we sought a less invasive method for measurement of neutrophil function after phagocytosis. We thus used a continuous assay to follow, in real time by confocal microscopy, the effects of S. aureusH. influenzae on neutrophil apoptosis (as assessed by binding of FITC–annexin V to exposed phosphatidylserine residues) and necrosis (assessed by increased plasma membrane permeability of propidium iodide). Neutrophils were incubated in microtiter plates on a gas- and temperature-regulated microscope chamber in the absence and presence of S. aureusH. influenzae. Images were collected every hour for 16 h.

Cultured neutrophils (in the absence of bacteria) progressively underwent apoptosis and acquired green fluorescence as they bound FITC–annexin V ( Figure 7A ). Thus, by 16 h incubation ∼ 10% of the population were annexin V–positive ( Figure 7B ) and ∼ 3% of the cells were PI-positive, indicating that secondary necrosis was occurring ( Figure 7C ). Levels of both apoptosis (phosphatidylserine exposure) and necrosis (PI permeability) were increased in neutrophil cultures incubated with S. aureus compared with control cultures ( Figure 7 ). By 7 h incubation, ∼ 10% of the cells were annexin V–positive, and secondary necrosis increased markedly (to 30%) by 16 h incubation. In contrast, levels of neutrophil apoptosis reached almost 40% by 7 h incubation with H. influenzae ( Figures 7A and 7B ), and by this incubation period over 50% of the cells displayed necrotic morphology ( Figure 7C ). PI permeability increased markedly by 3 h incubation with H. influenzae, and by 15 h incubation, over 80% of the cells were PI permeable indicating extensive necrosis.

Şəkil 7. Neutrophil apoptosis and necrosis following phagocytosis. Neutrophils were incubated in the absence (control) or presence of serum-opsonized S. aureus və ya H. influenzae at a bacteria:neutrophil ratio of 500:1. Cultures were supplemented with FITC–annexin V and PI and incubated in a gas- and temperature-controlled microscope chamber, as described in M aterials and M ethods . Yaşıl (annexin V binding) and qırmızı (PI-permeability) were automatically measured at 1-h intervals over 16 h. In A, representative images are shown, while B shows FITC–annexin V fluorescence and C shows PI fluorescence of control (solid circles), S. aureus (open circles)–, or H. influenzae (squares)–containing cultures. Values shown are means (± SD, n = 6).

This acceleration of neutrophil apoptosis and necrosis by H. influenzae was dependent on the bacteria:neutrophil ratio, with PI permeability significantly increased above control values at ratios as low as 10:1 (data not shown). Comparable levels of PI permeability in response to S. aureus were only detected at ratios of 2,000:1 data not shown), indicating that H. influenzae is ∼ 200-fold more potent at inducing neutrophil necrosis.

To confirm that incubation of neutrophils with H. influenzae results in necrosis and release of granule enzymes, culture supernatants were collected after incubation of control (untreated) neutrophils and after incubation with H. influenzae və ya S. aureus. Figure 8 shows that after 3 h incubation, both myeloperoxidase (an azurophilic granule enzyme) and lactoferrin (a specific granule enzyme) were both detected extracellularly after incubation with H. influenzae, but not S. aureus.

Şəkil 8. Release of neutrophil granule enzymes during incubation with H. influenzae. Neutrophils were incubated in the absence (−) or presence (+) of serum-opsonized H. influenzae və ya S.aureus (at ratios of 100:1) for 3 h. After this incubation, cell-free supernatants were analyzed for the presence of myeloperoxidase or lactoferrin by western blotting. Typical result of three separate experiments.

Neutrophils in the sputum were analyzed by electron microscopy to determine if the gross morphologic changes seen after incubation with H. influenzae in vitro were also detected in vivo. We analyzed sputum from a patient with asthma, and from two patients with COPD, one with a recent history of H. influenzae infection and the other with no previous known history of infection with this bacterium. Neutrophils in the sputum of the patient with asthma showed morphologic signs of activation (e.g., ruffled cytoplasm and several vacuoles) ( Figures 9A and 9B ), and a similar neutrophil morphology was observed in the sputum of a patient with COPD without a previous known history of H. influenzae infection ( Figures 9C and 9D ). However, in the sample from a patient with COPD with a known recent H. influenzae infection, the morphology of the neutrophils was grossly abnormal, with large vacuoles that appeared to be fusing with each and clear signs of necrosis ( Figures 9E–9H ). We have observed these typical morphologic features in the neutrophils of three separate patients with asthma, six patients with COPD without detectable H. influenzae infection, and four patients with COPD with a recent history of H. influenzae infeksiya. The morphologic features shown in Figures 9E–9H for the patients with COPD with H. influenzae infection were observed in > 90% of over 900 cells analyzed from the four patients studied.

Şəkil 9. Morphology of sputum neutrophils. Sputum samples from a patient with asthma (AB) or COPD, but with no detectable colonization with H. influenzae (CD), or COPD with a recent history of H. influenzae infeksiya (E–H) were fixed and analyzed by electron microscopy.

Noncapsulate H. influenzae are commonly found as commensal organisms in the upper respiratory tract of adults and seldom cause pneumonia or septicemia in immunocompetent individuals. However, these organisms are the most frequent isolates in patients with COPD both during exacerbations and in stable disease, whether based on quantitative microbiology of sputum or protected brush sampling (12, 13). Moreover, colonizing H. influenzae produces significant airway inflammation, which is increased during exacerbations (24). Several mechanisms have been proposed for this persistence, but our data suggest a different sequence of events that helps explain why H. influenzae is not eliminated despite producing a neutrophilic inflammatory response and moreover, why this inflammatory response should persist in the face of continued infection. The key elements in this process as defined in our experiments are first an interaction of H. influenzae with the resident neutrophil population (in the presence of local secretory IgA), leading to phagocytosis and release of IL-8, which recruits more neutrophils. However, the secretion of IL-8 is not maintained because instead of killing the bacteria, the neutrophils themselves are killed during phagocytosis with H. influenzae. These necrotic neutrophils may release their cytoplasmic contents, including elastase, other proteinases, and reactive oxidants that damage and dysregulate lung epithelial cell function. For example, high concentrations of released elastase may increase mucus gland hyperplasia and mucus secretion and reduce ciliary activity while inducing epithelial cell injury.

Our data are compatible with current theories on lower respiratory tract infections and COPD, specifically the reported increases in IL-6, IL-8, and TNF-α production, together with LTB4, and do not challenge accepted mechanisms of neutrophil recruitment involving ICAM-1 and E-selectin or the potential role of released neutrophil products in pathology. However, our data offer insight into three important further mechanisms that we believe are likely to be relevant in disease.

First, our model explains the persistence of bacteria in the lungs and evasion of host defense: H. influenzae are not killed during phagocytosis by neutrophils but instead kill the neutrophils. Our preliminary data indicate that bacterial survival and replication may actually be enhanced after phagocytosis. Second, our model predicts that the release of neutrophil products arises, not via the tightly regulated process of degranulation, but rather by the uncontrolled release of degradative enzymes via necrosis induced by the bacteria. Third, rather than dying by apoptosis when their function is complete, the neutrophils instead die via necrosis an uncontrolled process that will lead to the release of toxic neutrophil products. Necrotic neutrophils may accumulate in the lung, and it is noteworthy that we found such neutrophils in the sputum of a patient with COPD with a recent history of H. influenzae infeksiya.

The interactions between neutrophils and H. influenzae that we have identified are unlikely to be the only ones involved in explaining the persistence of infection in COPD, and in many cases patients can satisfactorily eradicate this organism after it has precipitated an exacerbation. Many of the mechanisms identified previously help explain why the response to bacterial inflammation is amplified, such as excess mucus production and impaired ciliary function (25, 26). Changes in the antigenic nature of H. influenzae may help it evade the immune response (27), but this would be expected to lessen the resulting inflammation. Our data showing a direct toxic effect of this organism on neutrophils explains why the inflammation persists in many patients despite an appropriate antibody response (28). Cigarette smoking increases the number of patients colonized by H. influenzae (29) and provides an important additional source of oxidative stress. Whether this cigarette smoking and oxidative stress interact with the already impaired bacterial killing mechanisms merits further study.

Both the duration and resolution of acute inflammation are regulated by the mechanisms that control neutrophil cell death and survival. These cells have a short life span in the circulation—only 12–18 h—and rapidly die by apoptosis (30, 31). Inflammatory activation by cytokines, adhesion, and transmigration can all delay neutrophil apoptosis and extend their lifespan to allow them to perform their function in inflammation (32). Thus, neutrophils recruited into tissues exhibit prolonged survival and generally undergo apoptosis when their function is complete (33). Neutrophil apoptosis has been reported to be decreased in the circulation of patients with COPD during exacerbations, but this was not explained by increased serum levels of IL-8, TNF-α, or IL-6, even though sputum levels of these cytokines were increased (34). Enhanced neutrophil respiratory burst activity has also been reported in circulating neutrophils of patients with COPD (35). These processes are also regulated by bacteria and their products such as bacterial LPS, which is a potent anti-apoptotic agent. However, some bacteria have evolved mechanisms that can perturb these processes (36). For example, bacteria such as Anaplazma faqositofil can evade phagocytic killing and delay neutrophil apoptosis, allowing the bacterium to replicate within the neutrophil and be dispersed throughout the body (37, 38). Other bacteria such as Pseudomonas aeroginosa can induce apoptosis (39, 40), whereas others such as Şigella flexneri are reported to induce necrosis (41). Identifying the mechanisms by which bacteria such as these regulate neutrophil apoptosis and necrosis will shed new insights into the molecular processes that control these events, will help understand disease pathology and could lead to new anti-microbial therapeutic strategies.

Our data help explain why H. influenzae is the most frequent pathogen seen in acute and chronic infection of the airways in COPD and why the sputum of those colonized patients is so frequently green containing increased amounts of inflammatory mediators such as myeloperoxidase and neutrophil elastase. This enhanced proteinase burden is likely to be one of the factors which accelerates the decline of lung function in colonized patients who exacerbate frequently (42). Current treatment for COPD can reduce the number of these exacerbations by 25–30%, but does not prevent them altogether (43, 44). This may be because none of the existing treatments modify the mechanism by which these organisms evade neutrophil-mediated killing and instead produce an increased elastase burden due to necrosis. A better understanding of the factors which control this process may lead to novel approaches that could have important clinical benefits.


Haemophilus influenzae Disease (Including Hib)

Haemophilus influenzae disease is a name for any illness caused by bacteria called H. influenzae. Some of these illnesses, like ear infections, are mild while others, like bloodstream infections, are very serious. In spite of the name, H. influenzae do not cause influenza (the flu). Vaccines can prevent one type of H. influenzae (type b or Hib) disease.

Hib can cause severe infections of both the lining of the brain and spinal cord (meningitis) and the bloodstream. Vaccines can prevent Hib disease. CDC recommends Hib vaccination for all children younger than 2 years old.

People can spread H. influenzae, including Hib, by coughing or sneezing while in close contact with others. People around them then can breathe in the bacteria. Even people who are not sick can have the bacteria in their noses and throats and spread the bacteria.


תוכן עניינים

בשנת 1930 הוגדרו שתי קבוצות עיקריות של H. influenzae: זנים שהם ללא קפסולה (unencapsulated) וזנים שהם בעלי קפסולה (encapsulated). זנים בעלי קפסולה סווגו על בסיס האנטיגנים הקפסולריים הנבדלים שלהם. ששת סוגי הזנים של H. influenzae הם: a, b, c, d, e ו-f [4] . השונות הגנטית בין זנים חסרי קפסולה גדולה יותר מזו שבקבוצה בעלת הקפסולה. זנים חסרי קפסולה נחשבים כלא ניתנים לאפיון (נקראים nontypable-NTHi) בשל העדר סרוטיפים קפסולריים עם זאת, ניתן לסווגם על פי רצף הבסיסים הנוקלאוטידים. הפתוגנזה של זיהומים על רקע H. influenzae אינה ברורה במלואה, אם כי נוכחות של הקפסולה בסוג B ‏(Hib), סרוטיפ הגורם למצבים כגון דלקת מכסה הגרון, ידועה כגורם מרכזי לאלימות החיידק. הקפסולה שלהם מקנה להם עמידות כנגד פגוציטוזיה וליזיס בתיווך מערכת המשלים של המאכסן הבלתי מחוסן. זנים חסרי קפסולה הם כמעט תמיד פחות פולשניים עם זאת, הם עלולים, לייצר תגובה דלקתית בבני אדם, אשר עלולה להוביל לתסמינים רבים. חיסון עם תרכיב נגד Hib יעיל במניעת זיהום Hib, אך לא מונע זיהום עם זני NTHi [5] .

רוב הזנים של H. influenzae הם פתוגנים אופורטוניסטים כלומר, הם בדרך כלל חיים בפונדקאי שלהם מבלי לגרום בהם למחלה, אך גורמים לבעיות בשילוב עם גורמים אחרים (כגון מזיהום ויראלי, מירידה בתפקוד המערכת החיסונית או ברקמות דלקתיות כרוניות, למשל מאלרגיות) ליצירת הזדמנות. הם מדביקים את הפונדקאי על ידי כך שהם נדבקים לתא הפונדקאי באמצעות חלבוני הדבקות חוץ ממברנליים (trimeric autotransporter adhesins).

מחלה נרכשת באופן טבעי, שנגרמה על ידי H. influenzae, מתרחשת כנראה בבני אדם בלבד. אצל תינוקות וילדים קטנים הזן Hib עלול לגרום לבקטרמיה, דלקת ריאות, דלקת מכסה הגרון, ודלקת קרום המוח חיידקית חריפה. לפעמים, נגרמים גם צלוליטיס, דלקת העצם, וכן דלקת מפרקים זיהומית. זוהי גם אחת מהסיבות לזיהום ולדי [6] .

בשל השימוש השגרתי בחיסון תרכיב Hib בארצות הברית מאז 1990, שכיחות מחלת Hib הפולשנית ירדה ל-1.3 לכל 100,000 ילדים. ברם, Hib נשאר כגורם העיקרי לדלקות בדרכי הנשימה התחתונות אצל תינוקות וילדים במדינות מתפתחות, שבהן החיסון אינו מצוי בשימוש נרחב. זנים לא קפסולרים של H. influenzae אינם מושפעים על ידי תרכיב Hib, וגורמים לדלקות אוזניים (דלקת האוזן התיכונה), דלקות עיניים (דלקת הלחמית) וסינוסיטיס אצל ילדים, וכן לדלקת ריאות במבוגרים.

תכונות קליניות עשויות לכלול סימפטומים ראשוניים של דלקת בדרכי הנשימה העליונות המחקות זיהום וירלי, כרוכה לעיתים בחום, בדרך כלל ברמה נמוכה. הדבר עלול להתקדם תוך כמה ימים לדרכי הנשימה התחתונות, עם סממנים הדומים לעיתים קרובות לאלה של ברונכיטיס חרחורי. הכיח עשוי להיות צמיגי ולעיתים קרובות בעל צבע אפור או קרם. השיעול עלול להימשך שבועות ללא הטיפול ההולם. מקרים רבים מאובחנים רק לאחר הדגמת זיהומים שאינם מגיבים לפניצילין בחזה או לדור הראשון של צפלוספורינים. בצילום רנטגן חזה או בטומוגרפיה ממוחשבת של הראות (CT) ניתן לזהות קונסולידציה אלוואולרית [7] .

אבחון קליני של H. influenzae מבוצע בדרך כלל על ידי תרבית חיידקים או על ידי מבחן אגלוטינצית לטקס חלקיקית. האבחנה נחשבת כמאושרת כאשר החיידק מבודד מאתר סטרילי בגוף. במובן זה, H. influenzae שתורבת מחלל הלוע והאף (nasopharyngeal), או מהכיח, לא יהווה אישור חד-משמעי למחלה של H. influenzae, כיוון שבאתרים אלו ניתן למצוא את החיידק באנשים ללא מחלה [8] . עם זאת, H. influenzae המבודד מנוזל שדרה-מוח, או מדם יהווה אינדיקציה לזיהום ודאי.

תרבית עריכה

תרבית חיידקים של H. influenzae מתבצעת על צלחות אגר, בעדיפות לאגר שוקולד, תוך הוספת הגורמים X (המין) ו- V (ניקוטינאמיד אדנין דינוקלוטיד - NAD) והדגרה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור בסביבה מועשרת ב-CO2 [9] . צמיחת אגר הדם מושגת רק כתופעת לוואי סביב חיידקים אחרים. מושבות של H. influenzae מופיעות כמושבות קמורות, חלקות, חיוורות, אפורות או שקופות.

בחינה מיקרוסקופית של תבחינים בצביעת גראם של H. influenzae תדגים קוקובצילים גראם-שליליים. ניתן לאפיין יותר את האורגניזם המתורבת באמצעות בדיקות קטלאז ואוקסידאז, ששניהם אמורים להיות חיוביים. יש צורך בבדיקה סרולוגית נוספת בכדי להבחין בפוליסכריד הקפסולרי ולהבחין בין H. influenzae למינים שאינם קפסולריים.

על אף רגישותה של תרבית החיידקים לבידוד החיידק, שימוש באנטיביוטיקה לפני איסוף הדגימה מפחית במידה נכרת את שיעור בידודי H. influenzae. [10] . מעבר לכך, H. influenzae הוא חיידק הדורש תשומת לב מרובה לגידולו בתרבית, וכל שינוי של נוהלי התרבית עלל להפחית מאוד את שיעורי הבידוד. הרמה הנמוכה של מעבדות רפואיות במדינות מתפתחות גרמה לשיעור בידודו הנמוך.

H. influenzae יכול לצמוח בסביבה ההמוליטית של Staphylococcus aureus על צלחות אגר דם המוליזה של כדוריות דם אדומות באגר דם על ידי Staphylococcus aureus משחררת פקטור V החיוני לצמיחתו של H. influenzae. לכן H. influenzae לא יצמח מחוץ לאזור ההמוליטי של S. aureus, בשל היעדר בחומרים מזינים כמו פקטור V באזורים אלה. אגר פילדס מועדף לצורכי בידוד. במדיום לוינטל, זנים קפסולויים מדגימים נצנוץ ססגוני מובהק (Iridescence).

אגלוטינצייה חלקיקית בלטקס עריכה

מבחן אגלוטינציה חלקיקית בלטקס (agglutination particle latex -LAT) היא שיטה רגישה יותר לגילוי H. influenzae מאשר בתרבית [11] . מכיוון שהשיטה מסתמכת על מציאותו של אנטיגן ולא על חיידקים ברי קיימא, התוצאות אינן מופרעות בגין שימוש קודם באנטיביוטיקה. יש לה גם את היתרון הנוסף של שיטה מהירה בהרבה משיטות תרבית. עם זאת, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה אינה אפשרית בשיטת LAT בלבד, ולכן יש צורך להשתמש במקביל בשיטת התרבית.

שיטות מולקולריות עריכה

סוג אבחון נוסף הוא אבחון מולקולרי באמצעות PCR, שהוא רגיש יותר מאשר מבחני הלטקס או תרבית חיידקים. שיטות PCR הוכחו כרגישות יותר מבדיקות LAT או תרבית, והן ספציפיות ביותר [12] . עם זאת, מבחני PCR טרם הפכו לשגרה במסגרות קליניות.

ריצוף עריכה

H. influenzae היה האורגניזם הראשון שכל הגנום שלו רוצף. הפרויקט הושלם על ידי קרייג ונטר (Craig Venter and his team) וצוותו ב"מכון לחקר הגנום" ( The Institute for Genomic Research). חיידק זה נבחר מכיוון שאחד ממובילי הפרויקט, חתן פרס נובל המילטון סמית', עבד על כך במשך עשרות שנים והצליח לספק ספריות DNA איכותיות. הגנום מורכב מ־1,830,140 זוגות בסיסים של DNA בכרומוזום מעגלי יחיד המכיל 1740 גנים המקודדי חלבון, 2 גנים של tRNA ו- 18 גנים נוספים של RNA. שיטת הרצוף ששימשה הייתה של ריצוף גנום שלם "בשיטת רובה הציד", שהושלם ופורסם בעיתון המדעי Elm בשנת 1995 [13] .

הן את H. influenzae והן את S. pneumoniae ניתן למצוא בדרכי הנשימה העליונות של בני האדם. במחקר שנערך התברר ש-S. pneumoniae תמיד התגבר על השפעתו של H. influenzae על ידי התקיפה שלו בהידרוגן פרארוקסיד, תוך הסרת מולקולות השטח החיוניות להישרדורתו של H. influenzae [14] .

כאשר שני החיידקים ממוקמים יחד בתוך חלל האף, תוך שבועיים, רק H. influenzae שורד. כאשר כל אחד מהם ממוקם בנפרד בחלל האף, כל אחד מהם שורד. כאשר בדקו את רקמת דרכי הנשימה העליונות בעכברים שנחשפו בו זמנית לשני מיני החיידקים, נמצא מספר גדול במיוחד של נויטרופילים (תאי חיסון). בעכברים שנחשפו רק לאחד המינים, לא נצפתה נוכחות של תאים נויטרופילים.

בבדיקות המעבדה נמצא כי נויטרופילים שנחשפו לחיידקי H. influenzae מתים, היו תוקפניים יותר בתקיפת S. pneumoniae מאשר נויטרופילים שלא נחשפו. לחשיפה לחיידקי H. influenzae מתים לא הייתה כל השפעה על חיידקי H. influenzae חיים.



Şərhlər:

  1. Coyan

    Əla ideyadır

  2. Zololkis

    Bu mövzuda sonsuz danışa bilərsiniz.

  3. Palaemon

    What a useful question

  4. Turg

    Əlbəttə. Bu idi və mənimlə. Gəlin bu sualı müzakirə edək. Burada və ya PM-də.

  5. Araramar

    Mövzuyla əlaqədar bir çox məqalənin olduğu saytı ziyarət etməyinizi təklif edirəm.

  6. Warrick

    Nə isə, xoşuma gəldi. Təşəkkürlər!

  7. Lele

    Təsdiq edirəm. Yuxarıda göstərilənlərin hamısına abunə oldum.



Mesaj yazmaq