Məlumat

4.4: SELEX (Liqandların Eksponensial Zənginləşdirmə ilə Seçilmiş Təkamülü) - Biologiya

4.4: SELEX (Liqandların Eksponensial Zənginləşdirmə ilə Seçilmiş Təkamülü) - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Turerk və qızıl, Elm (1990) 249:505-510

Phage T4 genomu bir DNT polimerazını (T4 DNA pol) kodlayır

T4 DNT pol üçün mRNT, T4 DNT pol üçün bağlanma yaxınlığına malik ardıcıllığı ehtiva edir. Bu ardıcıllıq Shine/Dalqarno ardıcıllığı ilə üst-üstə düşür və T4 DNT pol-un bağlanması mRNT-nin transkripsiyasının qarşısını alır (və daha çox T4 DNT pol istehsal edir). Beləliklə, T4 DNT polunun ifadəsi özünü tənzimləyir (autogen tənzimləmə). Bu bölgədəki mRNT-nin quruluşu gövdə-halqa quruluşunu əmələ gətirir

Şəkil 4.4.1: T4 DNT polimeraza mRNA

Eksperimental dizayn:

Sadə dillə desək, döngə bölgəsində təsadüfi bir nukleotid ardıcıllığı ilə mRNT molekullarının kitabxanasını yaradın. Bu kitabxananın ölçüsü 4 olacaq8 və ya 65,536 unikal fərqli ardıcıllıq (yalnız döngə bölgəsi təsadüfi olduqda). T4 DNT pol üçün yüksək yaxınlığa malik həmin ardıcıllıqları müəyyən edin və onların ardıcıllığını təyin edin.

Şablon tikintisi

Bir "sintetik gen" dupleks DNT şablonu beş primerdən qurulur:

Şəkil 4.4.2: Şablon tikintisi

  • Sintetik genin uzunluğu 110 nukleotiddir. O, #3, #4 və #5 oliqonukleotidlərdən ibarətdir. №1 və №2 oliqonukleotidləri №3, №4 və 5-i birləşdirməyə imkan verən "körpü" oliqos kimi düşünmək olar.
  • Oliqonukleotid #4, mRNA Parıltı/Dalqarno ardıcıllığına uyğun gələn T4 DNT Pol geninin 5' ucunu və T4 DNT pol bağlama pilləsini/döngəsini ehtiva edir. O, ehtiva etmək üçün sintez edilir təsadüfi əsaslar T4 DNT pol bağlama domeninin 8 əsaslı uzun döngə quruluşunda.
  • Oliqonukleotid №1 T7 RNT polimeraza promotor bölgəsi üçün ardıcıllığı ehtiva edir. Transkripsiya bu promotordan T7 RNT polimeraza və ribonukleotidlərin əlavə edilməsi ilə həyata keçirilə bilər.

In vitro transkripsiya

  • 110 nukleotid geni (iki zəncirli DNT forması) transkripsiya edilə bilər in vitro tərəfindən T7 RNA pol
  • Transkripsiya 92 nukleotid uzunluğunda bir RNT molekulu istehsal edir. Potensial olaraq 65,536 unikal RNT molekulunun kitabxanası olacaq

Şəkil 4.4.3: In vitro transkripsiya

T4 DNT poluna bağlanaraq seçim

T4 DNT pol üçün məcburi spesifikliyi təmin edən ardıcıllıqla RNT transkriptləri üçün seçilmişdir RNT kitabxanasını nitroselüloz filtrlərində immobilizasiya edilmiş T4 DNT pol ilə inkubasiya etməklə. Qeyri-spesifik olaraq bağlanmış RNT molekullarını çıxarmaq üçün filtrlər yuyulur. Sıx (spesifik) bağlayıcı RNT molekulları T4 DNT pol zülalından çıxarılır və toplanır.

Şəkil 4.4.4: Xüsusi bağlama

CDNA quruluşu

Elüt edilmiş RNT molekulları bir primer kimi oliqonukleotid #5 istifadə edərək və əks transkriptaza və dNTP əlavə edərək tək zəncirli cDNA-ya çevrilir. Dupleks DNT tək zəncirli cDNA-dan №1 və №5 oliqonukleotidlərdən istifadə edərək PCR vasitəsilə istehsal olunur.

Şəkil 4.4.5: cDNA konstruksiyası

In vitro transkripsiya

  • In vitro transkripsiya T4 DNT pol üçün bağlanma yaxınlığı olan ardıcıllıqla zənginləşdirilmiş RNT molekullarının (kiçik) kitabxanasını yaradır.
  • seçmə və zənginləşdirmə prosesi yüksək yaxınlıqlı bağlama ardıcıllıqlarının kolleksiyası alınana qədər davam etdirilir.

Eksperimental nəticələr

1. Kitabxananın tikintisi

  • Orijinal "sintetik gen" kitabxanası ardıcıllıqla tərtib edilmişdir kütləvi şəkildə
  • Təsadüfi mövqedə olan bazaların "nərdivanı" kitabxananın bu bölgədə az-çox tamamilə təsadüfi ardıcıllıqlar toplusundan ibarət olduğunu göstərdi (yəni molekulların kolleksiyasında heç bir ardıcıllıq meyli görünmədi)

2. Ardıcıl seçim və gücləndirmə raundlarından nümunələr ardıcıllıq təhlili üçün saxlanıldı

  • Nəticələr göstərdi ki, seleksiya və gücləndirmə prosesi davam etdikcə 8 baza mutagenləşmiş bölgədə konkret mövqelərdə müəyyən əsaslar müşahidə edilmişdir.

Şəkil 4.4.6: Mutant ardıcıllığı

Vəhşi tipli ardıcıllıq sıx bağlanma ardıcıllığının bu heterojen qarışığı içərisində tapıla bilər. Bu son kitabxanadan 20 klon ardıcıllıqla tərtib edilmişdir.

Şəkil 4.4.7: Sıx bağlama ardıcıllığının qarışığı

  • Əsasən yalnız iki fərqli ardıcıllıq mövcud idi: məlum vəhşi növ ardıcıllıq və başqa bir fərqli ardıcıllıq (dörd mövqedə dəyişən)
  • Hər ikisi oxşar sıx bağlama xüsusiyyətlərinə malik idi (müəyyən edilmiş kiçik ardıcıllıqlar daha zəif bağlanma nümayiş etdirdi)
  • Bu alternativ ardıcıllıq vəhşi tipdən fərqli gövdə döngə quruluşuna malik ola bilər

Şəkil 4.4.8: Kök döngə quruluşunda dəyişiklik

Nəticələr

  1. SELEX metodu vəhşi tip ardıcıllığı və yüksək yaxınlıq T4 DNT pol bağlama xassələrinə malik alternativ (əvvəllər naməlum) ardıcıllığı uğurla müəyyən etdi.
  2. Nəticələr göstərir ki, vəhşi tipli tərcümə operatorunun ardıcıllığı bağlama üçün demək olar ki, optimallaşdırılıb (daha da təkmilləşdirmək mümkün deyil?)
  3. SELEX metodu arasında qarşılıqlı əlaqənin öyrənilməsi sadələşdirilməlidir
    • transkripsiya aktivatorları və repressorlar və promotor yerlərindəki transkripsiya kompleksləri
    • replikasiya köməkçi zülalları və replikasiyanın başlanğıcında DNT polları
    • ribosomlar və ribosomların bağlanma yerlərində translyasiya repressorları
  4. Nəticələr müəyyən hallarda DNT/zülal bağlayan qarşılıqlı təsirlərə aid ola bilər (məsələn, qarşılıqlı təsirlər 2' hidroksil qrupunu əhatə etmirsə və DNT-nin qəbul edə biləcəyi struktur iştirak edirsə)
  5. Bütün mümkün ardıcıllıqla başlamaq əvəzinə, daha kiçik bir kitabxana ilə başlayın və əlavə ardıcıllıqlar yaratmaq üçün replikasiyanı xətaya meylli polimerazalarla birləşdirin.


Videoya baxın: معدل نمو الجماعة الاحيائية 12العام (Oktyabr 2022).