Məlumat

Bitki toxumlarında DNT tərkibi meyvə ətinə qarşı

Bitki toxumlarında DNT tərkibi meyvə ətinə qarşı


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Eyni meyvələrin toxumları ilə müqayisədə meyvə ətindən (məsələn, alma, portağal, albalı və s.) ekstraksiya edildikdən sonra DNT məhsuldarlığını və/və ya PCR-gücləndirilməsini müqayisə edən nəşr varmı?

Mən arayışa üstünlük verərdim, amma sizin dərc olunmamış təcrübəniz də mənim üçün maraqlıdır.


Bu, danışdığınız toxumdan və meyvədən asılıdır.

Bitki maddəsinin əzilmiş nümunənizdəki DNT miqdarı yalnız bir şeydən asılıdır - nümunənizdə neçə hüceyrə var. Qarğıdalı ləpəsinin bu diaqramına baxın (İndiana ştatı):

Hər sahədə fərqli hüceyrə sıxlığı var - endospermdə hüceyrələr nəhəng ola bilər (və buna görə də embrionla müqayisədə daha az DNT sıxlığına malikdir).

Gəlin ləkələnmiş xardal toxumuna baxaq (U of London):

Gördüyünüz kimi buradakı hüceyrələr çox sıxdır. Daha sıx daha çox DNT deməkdir vahid nümunə üçün.

Meyvələrə gəldikdə isə, eyni qayda tətbiq olunur. Verner, 1938, meyvə toxumasında hüceyrə sıxlığı haqqında fikir verə biləcək bəzi sərin alma toxuması histologiyasını göstərir (yenə də fərqli meyvələrdə fərqli olacaq - axtarın."meyvə adlarının histologiyası"maraqlanırsınızsa).

Ancaq indi sıxlıqdan danışdığımız üçün DNT-ni çıxarmaq barədə düşünməliyik. Çıxarma prosesi əslində çox son məhsulunuz baxımından daha vacibdir.

Bir çox bitki toxumlarında DNT-nin parçalanmasına səbəb ola bilən polifenollar var. Bu protokol (Cornell U) mümkün çatışmazlıqların çoxunu təfərrüatlandırır:

Bu birləşmələrin digər bitki növlərində də DNT təmizlənməsində çətinlik törətdiyi bildirilir; polisaxaridlər (Murray və Thompson, 1980; Fang et al., 1992); polifenolik birləşmələr (Katterman və Shattuck, 1983; Couch and Fritz, 1990; Howland et al. 1991; Collins and Symons, 1992); və yapışqan və qatranlı materiallar (Webb və Knapp, 1990).

Bu çirkləndiricilər DNT-ni parçalaya bilər, həm də onu PCR gücləndirilməsi və endonükleazın həzmində yararsız hala gətirir (Kim və b. 1997, Cornell U, EPICENTER Biotechnologies).

Ümumiyyətlə, meyvə/toxum bitki DNT tərkibində mütləq növə xas fərqlər var. Praktiki olaraq, lakin gələcək təcrübə üçün DNT məhsuldarlığı və canlılığında ən mühüm amil nümunənin saflığı və çirklənməsidir. Xüsusi meyvə və toxumlarda yuxarıda göstərilən çirkləndiricilərdən biri və ya bir neçəsi ola bilər, ona görə də "Toxum və ya meyvə?" mütləq işlədiyiniz bitki növündən asılıdır.


  • Meyvələr sadə, məcmu, çox və ya əlavə olaraq təsnif edilə bilər.
  • Sadə meyvələr tək yumurtalıqdan və ya birləşmiş karpeldən, məcmu meyvələr isə eyni çiçəkdə olan birdən çox karpeldən inkişaf edir.
  • Çoxlu meyvələr çiçək dəstəsindən, köməkçi meyvələr isə yumurtalıqdan deyil, bitkinin digər hissələrindən əmələ gəlir.
  • Meyvənin əsas hissələrinə ekzokarp (qabıq), mezokarp (orta hissə) və endokarp (daxili hissə) daxildir bu üç hissə perikarpı təşkil edir.
  • Sökülən meyvələr dərhal toxumlarını buraxırlar, mayasız meyvələr isə toxumlarını buraxmaq üçün çürüməyə güvənirlər.
  • ekzokarp: meyvələrin perikarpının ən xarici örtüyü dəridir
  • sadə meyvə: tək yumurtalığın tək karpeldən və ya ərimiş karpellərindən inkişaf edən meyvə
  • endokarp: meyvənin daxili hissəsi
  • mezokarp: meyvənin orta hissəsi
  • aksesuar meyvə: yumurtalıqdan deyil, çiçəyin başqa hissəsindən alınan meyvə

Mücərrəd

Dad meyvə keyfiyyətinin mühüm aspekti olsa da, alma və digər meyvə bitkilərində onun genetik nəzarəti haqqında anlayışımız hələ də çətin olaraq qalır. 497-nin genomik ardıcıllığının təhlili Malus birləşmələr alma yetişdirilməsinin səbəb olduğu genetik müxtəlifliyin eroziyasını və desert və sidr almalarının mümkün müstəqil əhliləşdirilməsi hadisələrini aşkar etdi. Meyvə turşuluğuna və ölçüsünə görə seçim imzaları həm əhliləşdirmə, həm də təkmilləşdirmə prosesində aşkar edilmişdir, lakin meyvə şəkərinin tərkibinə görə yox. O cümlədən meyvə dadına təsir edən əsas genlərdə tək mutasiyalar Ma1, MdTDT, və MdSOT2, müvafiq olaraq malat, sitrat və sorbitol yığılmasını kəskin şəkildə azaldır və mühüm əhliləşdirmə hadisələrinə uyğun gəlir. Pleiotrop təsirləri Ma1 üzvi turşu tərkibi və şəkər: turşu nisbəti meyvə dadının müəyyən edilməsində onun mühüm rolunu göstərir. Meyvə dadının, meyvə ölçüsünə kiçik təsirləri olan bir çox genin piramidalaşması nəticəsində yaranan daha böyük meyvələrin seçilməsi ilə əlaqədar olan əlaqə dirçəlməsinin mənfi təsir göstərməsi ehtimalı azdır. Tədqiqatımız almanın əhliləşdirilməsi zamanı meyvə keyfiyyətinin genetik əsasları və onun təkamül yol xəritəsi haqqında məlumat verir, həmçinin meyvə dadının genetik manipulyasiyası üçün hədəf genlərə işarə edir.


Nəticələr

Genom geniş identifikasiyası CLE xiyardakı genlər

üçün genom geniş axtarış CLE xiyardakı genlərin hizalanması istifadə edilərək edildi. Əvvəlcə məlum CLE zülallarını yüklədik Ərəbidopsis CLE Markov modelini öz-özünə qurmaq. Dizayn edilmiş CLE Markov modelindən istifadə edərək, genom montaj versiyası 3-də bütün 24,317 xiyar kodlaşdıran zülalları skan edərək, biz 26 CLE transkripsiya faktorunu müəyyən etdik (S1 Cədvəl). Əllə yoxlama zamanı yaxşı qorunmuş CLE transkripsiya faktorları aşkar edildi (seriya nömrəsi ilə “CsCLE” termini ilə istinad edilir və CLE domeninin E-qiymətinə görə çeşidlənir Cədvəl 1). CsCLE24 (1021 amin turşusu), CsCLE5 (416 amin turşusu) və CsCLE6 (404 amin turşusu) istisna olmaqla, bir çox xiyar CLE peptidləri qısa peptidlərdir (uzunluğu 90 amin turşusu). Xiyar CLE zülallarının molekulyar çəkisi 5293,84 (CsCLE9) ilə 113,323,11 (CsCLE24) arasında dəyişdi ki, bu da CLE zülallarının molekulyar çəkisi ilə çox oxşardır. Ərəbidopsis. CsCLE24 (pI = 6,52) istisna olmaqla, əksər xiyar CLE zülalları nəzəri pI 7,09 (CsCLE17) ilə 12,11 (CsCLE10) arasında dəyişən qələvidir. CsCLE4 zülalı stabildir, digərləri isə qeyri-sabitdir. Xiyar CLE zülallarının alifatik indeksi 49,03 (CsCLE6) ilə 106,78 (CsCLE17) arasında, GRAVY indeksi isə - 0,935 (CsCLE9) ilə 0,17 (CsCLE21) arasında dəyişdi.

26 CLE genlər chr5-də 7, chr6-da 6, chr1 və chr2-də hər biri 5, chr3, chr4 və chr7-də bir olmaqla, xromosomlar arasında paylanmış vəziyyətdə qaldı (Şəkil 1). The CLE genlər CsCLE24CsCLE25 1 kb qısa bir intergenik yerlə son dərəcə yaxın yerləşmişdir. Bundan başqa, CsCLE13CsCLE14 Bu tapıntı bu genlərin tandem şəkildə təkrarlana biləcəyini göstərdi. Bundan əlavə, bir gen cütü, CsCLE5CsCLE6, daxilində seqmental təkrarlama aşkar edilmişdir CsCLE ailə və müəyyən edilmiş seqmental duplikasiya gen cütləri xiyarda müxtəlif xromosomlara paylanmışdır (Şəkil 2).

Xromosomların paylanması CLE xiyardakı genlər. Fərqli xətt rəngləri müxtəlif xromosomları təmsil edir və üzərindəki işarələr müvafiq genlər və onların yerləşdiyi yerlərdir.

Seqmental dublikasiyanın paylanması CLE genlər CLE5CLE6 xiyar genomunda. Eyni seqmental dublikat gen cütünün iki geni qırmızı ilə işarələnmişdir

Xiyar CLE zülallarının filogenetik əlaqələri və fərqliliyi

Bu araşdırmada biz ilk növbədə Çin uzun '9930' genom yığıncağından istifadə edirik.

Yalnız 31 CLE Bu hesabatda genlər təsbit edildi (S2 Cədvəl), bir əvvəlki hesabat bunu göstərdi Ərəbidopsis 32-ni ehtiva edir CLE genlər [30]. Cəmi 25 CLE genlər hesablama yanaşmasından istifadə edərək bostanda müəyyən edilmişdir (S3 Cədvəl). Təkamülünü anlamaq üçün CLE Cucurbitaceae və model bitkidə genlər Ərəbidopsis, genləri müqayisə etdik Ərəbidopsis, qovun və xiyar çeşidi Çin uzun ‘9930’ (şək. 3). Bunlar CLEs filogenetik əlaqəsinə görə yeddi parafiletik qrupa (1-7-ci qruplar) bölünürdülər. Qrup 2 və Qrup 6 istisna olmaqla bütün qruplar təşkil edildi CLEs həm xiyardan, həm də digər bitki növlərindən, xiyar arasında sıx əlaqə olduğunu göstərir CLEs və digər bitkilərin. Xiyarın paylanması CLEs bu qruplarda qeyri-bərabər idi. Qrup 7 xiyarın təxminən yarısını təşkil edən 12 nəfərdən ibarət ən böyük qrup idi CLEs, ardınca 6 və 5 xiyar olan 1 və 5-ci qruplar CLEs, müvafiq olaraq. Ən az təmsil olunan alt ailələr xiyar olmayan 2 və 6-cı qruplar idi CLEs.

Filogenetik analiz CLE genlərdən Ərəbidopsis, xiyar və qovun. Təhlildə 26 xiyar CLE protein ardıcıllığı, 31 iştirak etdi Ərəbidopsis AtCLE protein ardıcıllığı və 25 qovun CLE protein ardıcıllığı. Qırmızı ulduzlar xiyarları təmsil edir CLE zülalları mavi kvadratları təmsil edir Ərəbidopsis CLE zülalları və yaşıl dairələr qovun CLE zülallarını təmsil edir

Xiyarın gen quruluşu CLE genlər

Xiyar genlərini müqayisə etmək üçün onların ekzon-intron strukturları proqnozlaşdırılıb (şək. 4). Filogenetik ağac xiyarın konservləşdirilmiş zülal ardıcıllığından istifadə edərək Maksimum Ehtimal üsulu ilə yaradılmışdır. CLE genlər. On dörd CLE genlər tək eksonlu genlər, on ikili ekson genləri və biri üçlü ekson genləri idi. Eyni filogenetik təsnifat qrupundakı ekson-intron nümunələri oxşarlıq göstərdi. Xiyar geni CLE24 19 introna bölünmüş diskret kodlaşdırma bölgələri ilə unikal idi.

Xiyarın proqnozlaşdırılan ekson-intron strukturları CLEs və xiyar CLE proteininin konservləşdirilmiş motivləri. a Filogenetik ağac MEGA V6.06 proqram təminatından istifadə etməklə 26 xiyar CLE zülalının tam uzunluqlu zülal ardıcıllığı əsasında qurulmuşdur. b Xiyar CLE zülallarında konservləşdirilmiş motivlər. 1-10 nömrəli motivlər müxtəlif rəngli qutularda nümayiş etdirilirdi. c Xiyarın ekzon-intron quruluşu CLE genlər. Eksonlar və intronlar müvafiq olaraq yaşıl qutular və tək xətlərlə göstərilir

Konservləşdirilmiş xiyar CLE protein motivləri

MEME proqramı xiyardakı CLE zülallarının qorunmuş domenlərini və motivlərini araşdırmaq üçün istifadə edilmişdir. Motiflər düzülmənin artan E-qiymətinə uyğun olaraq motiv 1-dən 10-a kimi siyahıya alınmışdır (şək. 4). Demək olar ki, bütün xiyar CLE zülallarında CsCLE9 istisna olmaqla, C-terminalının yaxınlığında tipik CLE domenini təmsil edən motiv 1 var idi. CsCLE5 və CsCLE6 zülalları C-terminalında fərqli idi, hər ikisi C-terminal CLE domeninin yaxınlığında motiv 4-dən ibarət idi. CsCLE11 zülalı dörd tandem yerləşmiş motiv 6 və bir CLE domeni, CsCLE24 isə tandemdə iki motiv 2 ehtiva edir. Bu nəticələr filogenetik ağacın hər budağında xiyar CLE zülalları arasında ardıcıl xarakteristikanın və bioloji funksiyanın geniş şəkildə fərqləndiyini göstərdi. Bu zülallar həmçinin N-terminalda və ya ortada digər funksional sahələrə malik idilər, onların CLE sahəsi isə siqnal yollarında funksional idi.

Upstream cis-tənzimləyici elementlər (CREs)

PlantCARE verilənlər bazasında yuxarı axın tənzimləyici bölgəsində cis-tənzimləyici elementi tapmaq üçün yuxarı promouterdə 1500 bp ardıcıllığından istifadə edilmişdir. 26 xiyarın yuxarı bölgəsində CRE-lərin bioloji funksiyalarını təhlil edərək CLE genlərdən belə nəticəyə gəlmək olar ki, promotorların normal ifadəsi üçün lazım olanlardan başqa komponentlərin əksəriyyəti, məsələn, AT

TATA-Box və CAAT-Box, aşağıdakı dörd kateqoriyaya bölünə bilər. 1) Birinci növ element ABRE (ABA cavab elementi), TCA elementi (salisilik turşuya cavab elementi), TATC-Box (giberellin cavab elementi) və TGA elementi (auxin cavabı) kimi hormon cavab elementləridir. element), başqaları arasında. Bu elementlər bu təcrübədə təsvir edilmişdir (şək. 5). 2) İkinci növ element işığa cavab verən elementlərdir, məsələn, ACE, G-box, ATA-motif, LAMP-element və s. 3). Üçüncü növ element meristematik ifadə elementləridir. Məsələn, HD-zip1 (mezofil hüceyrələrinin diferensiasiyası ilə əlaqəli elementlər) və TGACG-motifi (meristem inkişafı ilə əlaqəli elementlər) bitki meristeminin saxlanması və orqanogenezinin CLE geninin tənzimlənməsində mühüm rol oynayır. 4) Dördüncü növ stressə cavab verən elementlər, məsələn, ARE, MBS, TC ilə zəngin təkrarlar, LTR və s., həmçinin maddələr mübadiləsinin tənzimlənməsində rol oynayan digər tənzimləyici amillərdir.

Xiyarın yuxarı hissəsindəki hormon reaksiya elementləri CLEs. Hormonlara cavab verən elementlər müxtəlif rəngli qutularda göstərilir

Xiyar CLE zülallarının homoloji cütləri

Tək bir əcdad genindən şaquli enişi və duplikasiyanı başa düşmək üçün ortoloji, koortoloji və paraloq gen cütlərini müəyyən etmək üçün müqayisəli təhlil aparıldı. Ərəbidopsis, xiyar və qovun.

OrthoMCL proqramı 24 orfoloji, 23 koorfoloji və 8 paraloqu müəyyən etdi. CLE arasında gen cütləri Ərəbidopsis, xiyar və qovun. Bu homoloji gen cütü şəbəkəsi aydın şəkildə üç hissəyə bölünmüş filogenetik ağaca çox uyğun idi. Bu üç növ arasındakı ortoloji genlər Şəkil 6-da göstərilmişdir. 26 xiyardan CLE genlər, bostanda 15 ortoloji gen və 7 in Ərəbidopsis tapılmışdır.

Homoloji gen cütləşir Ərəbidopsis, xiyar və qovun. Boz xətlər müxtəlif genomlar arasındakı bütün homoloji cütləri, qırmızı xətlər isə genomların homoloji cütlərini təmsil edir. CLE gen ailəsi

Seçim və divergensiya vaxtı

Seçim mexanizmlərini araşdırmaq üçün CLE təkamül zamanı genlər üçün Ka, Ks və homoloji cütün divergensiya müddətini hesabladıq. CsCLE24-CsCLE25 (S4 Cədvəl). Bu cütün Ka 1,08 və Ks 0,82, Ka/Ks nisbəti isə 1,31 idi. P-0,0098 dəyəri, bu gen cütünün funksional fərqliliyə səbəb olan müsbət seçimdən keçdiyini göstərir.

Xiyarın ifadə nümunəsi CLE inkişaf zamanı genlər

Hər birinin ifadəsini araşdırdıq CLE vegetativ və reproduktiv inkişaf zamanı 23 müxtəlif xiyar toxuması üçün dərc edilmiş RNT seq məlumatlarından (S5 Cədvəl) istifadə edən gen. Hər bir genin ifadə səviyyəsi RPKM metodu ilə normallaşdırıldı. On xiyar CLE genlər də daxil olmaqla CsCLE1, 2, 4, 5, 14, 25, 24, 23, 15, və 17 23 nümunənin hamısında nisbətən aşağı ifadə səviyyəsi göstərərək, onların xiyardakı inkişaf proseslərində əhəmiyyətsiz rol oynadığını göstərdi. Genlər CsCLE9, 10, 18, və 22 çoxsaylı nümunələr arasında nisbətən yüksək ifadə səviyyəsini göstərdi (Şəkil 7a).

Xiyarın ifadə nümunəsi CLE genlər. a Xiyarın ifadə profilini əks etdirən istilik xəritəsi CLE RNT-seq məlumatları ilə təhlil edilən müxtəlif inkişaf mərhələlərində genlər. b Xiyarın ifadə profilini əks etdirən istilik xəritəsi CLE Çin uzun '9930'da qPCR tərəfindən təsdiqlənmiş müxtəlif inkişaf mərhələlərində genlər

qPCR istifadə edərək, xiyarın ifadəsini təhlil etdik CLE genlər (S6 Cədvəl) Çin uzun '9930' fidanlarının müxtəlif toxumalarında. 26 xiyardan CLE genlər, 21 nümunədə 24 gen aşkar edilmişdir. Genlər CLE1, 2, 7, 8, 9, 17, 18, 19,26 bütün nümunələr üzrə nisbətən aşağı səviyyələrdə, digərləri isə ən azı bir nümunədə nisbətən yüksək səviyyədə ifadə edilmişdir. xiyar CLE genlər böyüyən toxumalarda, o cümlədən nöqtə, gövdə və çiçəkdə nisbətən yüksək ifadə səviyyəsini, kökdə isə nisbətən aşağı ifadə səviyyələrini göstərmişdir. ifadə səviyyəsi CsCLE4, 6, 11, 14, 21, 23, 24, və 25 ən yüksək idi (şək. 7b). qPCR nəticələri ictimai verilənlər bazasında mövcud olan keçmiş RNT seq məlumatlarına yüksək dərəcədə uyğundur.

Heteroloji həddindən artıq ifadə CsCLV3 gen içində Ərəbidopsis

İfadə vektoru PHB plazmidində hədəf geni daşıyaraq uğurla quruldu və sonra CsCLV3 gen, təmsil edən gen CLE ailədə həddindən artıq ifadə edildi Ərəbidopsis biz bu transformasiya olunmuş bitkiləri müsbət ştam adlandırırıq. Nəticələr göstərdi ki, müsbət deformasiyanın fenotipində böyümə nöqtəsində zəiflik inkişaf edir. Vəhşi növü ilə müqayisədə, vəhşi növü artan nöqtə diametri Ərəbidopsis təqribən 0,66 mm (şəkil 8a) idi və o CsCLV3 gen overexpression müsbət gərginlik təxminən 0,54 mm (Şəkil. 8b) idi. Eyni şəraitdə müsbət ştamın böyümə nöqtəsi vəhşi növdən daha kiçik idi.

Heteroloji həddindən artıq ifadənin böyümə nöqtəsi CsCLV3 gen içində Ərəbidopsis. a Yabanı tipli böyümə nöqtəsi. a Yabanı tip üçün böyümə nöqtəsinin diametri 0,6584168 mm-dir. b Müsbət gərginliyin böyümə nöqtəsi. b Müsbət gərginlik üçün böyümə nöqtəsinin diametri 0,5429444 mm-dir. Artan nöqtənin diametri IPwin 32 proqramı ilə ölçüldü

Transplantasiyadan sonra demək olar ki, T1 nəslinin bütün transformasiya edilmiş bitkiləri böyümə nöqtəsinin inkişafının aşkar zəifliyi, boltların olmaması və bitki böyümə qabiliyyətinin azalması fenomenlərini göstərdi (Şəkil 9). T1 bitkilərindən əldə edilən irsi toxumlar son dərəcə az idi, bu da sonrakı nəsillərdə funksional analizi qeyri-mümkün etdi. Bundan əlavə, müsbət ştamların bir neçəsi böyümə və inkişaf proseslərini tamamladı. Bu tədqiqatda yalnız iki boltlu ştamm göstərdi ki, ya qabıq inkişaf etməyib, ya da qabıq qısa olub və onun inkişafı vəhşi tipdəkindən əhəmiyyətli dərəcədə aşağı olub (şək. 10a). Floresan kəmiyyət PCR aşkarlanması üçün on transformant təsadüfi seçilmişdir (Şəkil 10b). Nəticələr (S7 Cədvəl) göstərdi ki, hədəf genlər bütün transgenik materiallarda ifadə olunub və daha aşağı ekspressiyaya malik №15 və 8-ci fenotip ən zəif olub, meyvə verə bilər, lakin böyük meyvə vermə qabiliyyətinə malik deyil. Eyni zamanda, yüksək ifadə səviyyələrinə malik olan №1, 12 və 13, qabiliyyətli fenotiplərə və yüksək dərəcədə anormalliyə malik idi və bolt və ya fructify edə bilmədi. Ümumiyyətlə, ifadə səviyyəsi CsCLV3 gen onun fenotipinə uyğundur. Təcrübə nəticələri sübut etdi ki, xiyar CLV3 genlər böyümə nöqtələrinin və meyvələrin inkişafına nəzarət etmək üçün vacib bir şəkildə fəaliyyət göstərir və bitki boltlarını.

Heteroloji həddindən artıq ifadə CsCLV3 gen içində Ərəbidopsis. Vəhşi tip (WT) ştamm normal böyümə və inkişaf dövrünə malikdir və rozet yarpaqlarının, gövdələrinin, yarpaqlarının, qabıqlarının və s. fenotipik quruluşa malikdir. Müsbət gərginlik (4910-13) heteroloji həddindən artıq ifadə fenomeni idi. CsCLV3 gendir və gövdəsi, yarpağı, meyvə qabığı və ya digər morfoloji strukturları yoxdur, yalnız qırışmış rozet yarpaqlarını göstərir.

Müsbət ştammlarda aşağı ifadəli podlar. a Yabanı tipli pod fenotipləri (col-0) və müsbət ləkə (4910-15) boltlana bilər, lakin meyvə verə bilməz, 4910-8 isə bolt və meyvə verə bilər, lakin internodlar WT-dən daha qısa idi. Pod fenotipləri Ərəbidopsis Nikon D3300 mikroskopu altında müşahidə edilmişdir. Şəkildə göstərilən zolaqlar fenotiplərə uyğun gen ifadəsidir. b Flüoresan kəmiyyət PCR aşkarlanması üçün on transformant təsadüfi seçilmişdir


Bitki DNT-si ilə heyvan DNT-si arasındakı fərq nədir?

Hər bitki hüceyrəsinin mərkəzində, yosunlardan tutmuş səhləblərə və hər heyvan hüceyrəsinin mərkəzində, meduzadan tutmuş sizə və mənə qədər –- orqanizmin genetik materialının bir nüsxəsi var. Bu DNT orqanizmin tam planını daşıyır. Xüsusiyyətləri bir nəsildən digərinə ötürən budur.

Bitkilər və heyvanlar arasında olduqca açıq fərqlər var, lakin – kimyəvi səviyyədə – bütün bitkilərin və bütün heyvanların hüceyrələri eyni formada DNT-ni ehtiva edir – məşhur “qoşa spiral”. burulmuş nərdivan. Bundan əlavə, həm bitkilərdə, həm də heyvanlarda bütün DNT molekulları – – –, – nukleotidlər adlanan eyni dörd kimyəvi tikinti blokundan hazırlanır.

Fərqli olan, DNT-dəki bu dörd nukleotidin necə düzülməsidir. Hansı zülalların hazırlanacağını müəyyən edən onların ardıcıllığıdır. Nukleotidlərin düzülmə üsulu və onların şifrələdiyi məlumat orqanizmin pulcuqlar və ya yarpaqlar – ayaqları və ya sapı əmələ gətirəcəyinə qərar verir.

Tədqiqatlar göstərir ki, bitkilər və heyvanlar bəzi ümumi zülallar istehsal edə bilər. Görkəmli nümunələrdən biri Sitokrom C kimi tanınır. Lakin DNT-nin surətinin çıxarılması prosesi qeyri-mükəmməl olduğu üçün zamanla səhvlər yığılır və müxtəlif canlılarda Sitokrom C bir qədər fərqli olur. İnsan Sitokrom C-də amin turşusu ardıcıllığını təyin edən gen bölgələri dovşan kimi başqa bir məməlidə olanlara daha çox bənzəyir və günəbaxan kimi təkamül baxımından daha uzaq bir canlıya daha az bənzəyir.

Krallıqlarda heyvanların və bitkilərin təsnifatının sxemi rəqabətlə üzləşir. Bu yaxınlarda təkamül və molekulyar məlumatlara əsaslanan alternativ sistem yaranmışdır. Sitokrom c bəlkə də bu yanaşmada kanonik və ya paradiqmatik molekuldur.

Hər bir növün xromosom sayı adlanan xarakterik sayda xromosomları var. Heyvanlarda daha çox xromosom var, bitkilər daha azdır.


Orqanizmləri təsnif etmək üçün DNT-dəki oxşarlıqlardan istifadə

Lakin müasir texnologiya sayəsində növlər və orqanizmlər arasında genetik əlaqələrin təhlili artıq mümkün olub və həyat formaları arasındakı əlaqələrə fərqli baxmağa gətirib çıxarıb. 1990-cı ildə Carl Woese orqanizmlər arasındakı genetik oxşarlıqlara əsaslanan təsnifatın &ldquoÜç Domen Sistemini&rdquo təklif etdi. Sistem üç geniş sahəyə və Bakteriyalara, Arxeyalara və Eukaryotlara (DNT-lərini saxlamaq üçün nüvəsi olan orqanizmlər) bölünmüş bütün həyatın ortaq əcdadını göstərir.

Müxtəlif növlərin, həm heyvanların, həm də göbələklərin genləri araşdırılaraq, mutasiya dəyişiklikləri müşahidə oluna, milyonlarla il əvvələ uzanan şəcərə əlaqələri müəyyən edilə bilər.

Göründüyü kimi, heyvanlar və göbələklər ortaq əcdadı paylaşırlar və təxminən 1,1 milyard il əvvəl bitkilərdən ayrılıblar. Yalnız sonra heyvanlar və göbələklər həyat ağacında ayrı-ayrılıqda olub, göbələkləri insanlarla bitkilərdən daha yaxın qohum edib. Çox güman ki, bu ümumi əcdad spermaya bənzər xüsusiyyətlər (heyvan kimi) və daha sonra daha güclü hüceyrə divarı (göbələklər) ilə daha sonrakı inkişaf mərhələsini göstərən tək hüceyrəli bir orqanizm idi.

rRNT analizinə əsaslanan filogenetik ağac. Sağ tərəfdə bitkilərin, göbələklərin və heyvanların fərqliliyinə diqqət yetirin. (Foto krediti: Sting &ndash fr: Sting/Wikimedia Commons)

Göbələk tərəvəzdir?

Sadə cavab? Xeyr, göbələk tərəvəz deyil. Göbələklər makroskopik saplı göbələklərin meyvə gövdələridir. Mikologiya (göbələklərin öyrənilməsi) ilk dəfə yarananda botanikanın bir hissəsi idi, çünki göbələklər ibtidai bitkilər hesab olunurdu.

Bitki (tərəvəz) və göbələk arasındakı əsas fərq onların qidanı necə əldə etmələridir. Bitkilər xlorofilə malikdirlər və qidalarını fotosintez yolu ilə istehsal edirlər. Göbələklər təbiətdə çürüyən material üzərində mövcuddur. Bundan əlavə, yarpaqların, köklərin və toxumların olmaması kimi açıq struktur fərqlər var. Beləliklə, indi göbələklərin hüceyrə quruluşuna əsaslanan öz krallığı var.

Bununla belə, bu, işin elmi tərəfidir, amma gəlin digər tərəfə də nəzər salaq. Gündəlik həyatda biz yeməklərimizi təsnif etmək üçün elmdən istifadə etmirik. Pomidor və xiyar elmi olaraq bitkinin meyvələridir, amma biz yenə də tərəvəz deyirik. Eynilə, göbələklər tərəvəz və ya meyvə, hətta ət deyil. Onlar özlüyündə fərqli bir kateqoriyadır, lakin rahatlıq üçün onları tərəvəzlərlə birləşdiririk.

Müxtəlif növ göbələklərin müxtəlif sağlamlıq faydaları var. Tarixin bir nöqtəsində göbələklər o qədər yüksək qiymətləndirilirdi ki, adi insanlara onları yemək qadağan idi! Onlar yalnız kral ailələri üçün qorunurdu.


Bitki toxumlarında DNT tərkibi meyvə ətinə qarşı - Biologiya

Bitkilər insanlarla nə qədər DNT paylaşır? 99%-dən çox?

Bu, diqqətli olmağımız lazım olan bir nömrədir.

Birincisi, yalnız bir növ DNT var! BÜTÜN heyvanlar və bitkilər eyni DNT-ni paylaşırlar, bu, əsasən bütün zülalların əmələ gəldiyi eyni amin turşularını kodlayan yalnız 4 "hərf" kodudur. Bəzi amin turşularının onu təyin edən birdən çox koda malik olmasının bir çətinliyi var - kodların dəyişməsinin (məsələn, mutasiya) müəyyən edilmiş amin turşusunda DƏYİŞMƏYƏNMƏZİ ilə nəticələnə biləcəyi çoxlu misallar var.

Təəccüblü deyil ki, bütün heyvanlar və bitkilər öz genlərinin əksəriyyətinə malikdirlər. Şəkərlərin enerjisini (tənəffüs) sərbəst buraxmaq üçün oksidləşdiyi mexanizm demək olar ki, universaldır. Təkcə bu prosesdə iştirak edən onlarla ferment var. Hər bir ferment bir zülaldır və hər birinin DNT-də kodlanması lazımdır. DNT-nin özünün təkrarlanmasında iştirak edən bir çox ferment var. Digər proseslər də demək olar ki, universaldır.

Digər tərəfdən, bəzi genlər çox əhəmiyyətlidir. İnanıram ki, insan embrionunu qadınlıqdan daha çox kişiliyə aparan yolda qurmaqdan məsul olan yalnız bir gen var. Bununla belə, bu gen keçid rolunu oynayır və digər genləri kişilər və qadınlar arasında böyük fərqlər yaratmaq üçün istiqamətləndirir.

Bəzi genlər mövcuddur, lakin heç vaxt istifadə olunmur (heç vaxt işə salınmır). Deyəsən, keçmişimizdən miras qalmış çoxlu DNT var və bu, artıq faydalı olmaya bilər, lakin “təmizlənməmiş”. Bəzi genlər funksiyasını bilmədiyimiz uzun "səssiz" DNT ilə kəsilir. Ola bilsin ki, biz bir neçə orqanizmin (insan, Aarabidopsis və s.) bütün genomunun xəritəsini çəkmişik, lakin bu, “yol xəritəsi”ndən bir qədər artıqdır və biz hələ onların “evlərini” və daha da əhəmiyyətlisi, “sakinlərini” müəyyənləşdirməliyik. evlər.

DNT barmaq izinin bir insanı digərindən tanıya biləcəyindən xəbərdar olacaqsınız. Aydındır ki, qohumlarımızla (eyni əkizlər istisna olmaqla) belə bölüşmədiyimiz DNT uzantıları var - əlaqə nə qədər yaxın olsa, barmaq izimizdə bir o qədər çox "bandalar" paylaşırıq. Uşaqlarım yalnız DNT barmaq izimin yarısını paylaşırlar.

Genlərimizin təxminən 60%-ni bananla paylaşdığımız deyilir. Amma görürsən ki, belə bir bəyanat çox yanıltıcı ola bilər.

BÜTÜN orqanizmlərin paylaşdığı zülallarla bağlı maraqlı tədqiqatlar aparılmışdır. Bunlardan biri tənəffüsün bir hissəsi ilə əlaqəli olan Sitokrom C-dir. İnsan və digər orqanizmlər arasında müxtəlif amin turşularının/mutasiyaların sayı geniş şəkildə tədqiq edilmişdir. Bu kimi məlumatlar insan və digər növlər (bitkilər də daxil olmaqla) arasında ədədi fərq verə bilər. Ancaq bu fərqlər molekulun vacib olan hissəsində deyil - molekulun Sitokrom C-nin öz funksiyasını yerinə yetirməsinə imkan verən hissəsində. Bu cür məlumatlar tədqiqatlar üçün orqanizmlərin nə qədər yaxından əlaqəli olduğunu izah etmək üçün faydalıdır (və həqiqətən də bu ağacdakı əlaqələr haqqında bizə məlumat verir), lakin onlar bizə nə qədər "fərqli" olduğumuzu demir, çünki Sitokrom C BÜTÜN orqanizmlərdə EYNİ işləyir!


Toxumsuz meyvələr necə yaranır və necə yayılır?

Meyvə inkişafı normal olaraq çiçəyin yumurtalıq bölməsindəki bir və ya bir neçə yumurta hüceyrəsi polendən olan sperma nüvələri ilə dölləndikdə başlayır. Bəzi bitkilərdə isə meyvə mayalanmadan inkişaf edir, bu fenomen partenokarpiya adlanır. Partenokarpik meyvənin toxumlanmış meyvələrə nisbətən üstünlükləri var: daha uzun raf ömrü və daha çox istehlakçı cəlbediciliyi.

Toxum inkişafının olmamasının ən çox görülən səbəbləri tozlanma çatışmazlığı və ya funksional olmayan yumurta və ya spermadır. Bir çox bitkilərdə öz-özünə uyğunsuzluq genləri müvəffəqiyyətli mayalanmanı genetik cəhətdən fərqli kişi və qadın valideynlər arasında çarpaz tozlanma ilə məhdudlaşdırır. Bu əmlak göbək portağalı və klementin kimi toxumsuz meyvələr yetişdirən sitrus fermerləri tərəfindən istifadə olunur. Bu sortlar öz-özünə uyğun gəlmədiyi üçün eyni bitkilərdən (klonlardan) ibarət bağlarda əkiləndə toxum səpə bilmirlər. Bu bitkilərdə partenokarpiyanın yüksək tezliyi var, buna görə də hələ də meyvə verirlər. Belə ağacların yayılması üçün toxum tələb olunmur. Əslində, toxumla yayılma zərərli olardı, çünki nəsil valideyndən fərqli olardı. Bunun əvəzinə tingçilər meyvə ağaclarını cinsi yolla, adətən peyvəndlə çoxaldırlar.

Uğurlu gübrələmə olmamasının başqa bir tez-tez səbəbi xromosom balanssızlığıdır. Məsələn, adi banan triploiddir. Başqa sözlə, onun üç xromosom dəsti var. Hər bir valideyndən bir xromosom dəstinə sahib olmaq əvəzinə, bir valideyndən iki dəst və digər valideyndən bir dəst var. Triploidlər nadir hallarda balanslaşdırılmış xromosom dəstinə malik yumurta və ya sperma istehsal edir və belə uğurlu toxum dəsti çox nadirdir. Bananlar da partenokarpikdir və uğurlu gübrələmə olmadıqda meyvə verir. Bu bananlar cinsi yolla çoxalır. Sapı çiçəkləndikdən və meyvə verdikdən sonra ölür. Lakin əsas sapın dibində yan tumurcuqlar və ya əmziklər var ki, onları çıxarıb sortun davam etdirilməsi üçün yenidən əkmək olar. Yetiştiricilər bananları toxuma mədəniyyəti ilə də çoxaldırlar.

Toxumsuz qarpızlar xüsusilə maraqlıdır, çünki onlar toxumla çoxalmalıdırlar, lakin yetişdiricilər hələ də partenokarpiyadan istifadə edə bilərlər. Toxumsuz qarpız hazırlamağın bir yolu triploid toxum istehsal etməkdir. Banan vəziyyətində olduğu kimi, triploid qarpızlar funksional toxum istehsal edə bilmir, lakin partenokarpiya yolu ilə yaxşı meyvələr verirlər. Bitki yetişdiriciləri normal diploid valideyni tetraploid valideynlə keçərək triploid toxum istehsal edirlər ki, bu da öz xromosom sayını ikiqat artırmaq üçün diploidləri genetik manipulyasiya etməklə hazırlanır. Qarpızlara gəldikdə, bu manipulyasiya hər nəsil yerinə yetirilməlidir, buna görə də bu, bir qədər bahalı təklifdir, lakin yenə də dəyərlidir.

Bitki bioloqları öyrəndilər ki, əgər bitki hormonu auksin yumurtanın inkişafının əvvəlində istehsal olunarsa, partenokarpik meyvə adətən bu xüsusiyyəti nümayiş etdirməyən bitkilərdə böyüyə bilər. Beləliklə, gen mühəndisliyi çox güman ki, yaxın gələcəkdə istehlakçılara bir çox digər növlərdə partenokarpik meyvə verəcəkdir.


Müzakirə

P. trifoliata uzun müddət sitrus sortları üçün anaç kimi istifadə edilən trifoliolat yarpaqlı Çin yarpaqlı növüdür. Phytophthora, nematodlar və tristeza viruslarına qarşı davamlıdır və -26 °C 50,51 soyuq temperatura dözə bilir. Qədim insanlar mandarin və peyvəndin birləşməsini müşahidə etdilər P. trifoliata Cənubi Çində mandarin yetişdirilirdi, Şimali Çində isə peyvənd ittifaqı üçbucaqlı portağal idi. Bunu indi izah etmək asandır, çünki yalnız üçbucaqlı portağal kökü soyuq temperaturlara yüksək davamlıdır və Şimali Çində qışda yaşaya bilir, yaxşı meyvə keyfiyyətinə malik olan naringi isə soyuq temperaturlara həssasdır. P. trifoliata ilə cinsi uyğunluq da var sitrus cinsdir və ən çox yetişdirilən cinsi hibrid Troyer citrangedir ki, bu da bir çox ölkələrdə çox vacib sitrus köküdür 23 . Bu tədqiqatda biz bir torpaq irqinin yüksək keyfiyyətli genomunu ardıcıllaşdırdıq və yığdıq P. trifoliata Şanxi əyalətindən 169 birləşmənin genetik qiymətləndirilməsi əsasında. Beləliklə, bu genotip orijinal bir növü təmsil edir P. trifoliata ABŞ-dakı dar genetik fona nisbətən, üstəlik, bu genom bu yaxınlarda nəşr olunan genom 52-dən daha tamdır (Əlavə Cədvəl 6). Hər iki genom sitrus bitkilərinin genetikası və heyvandarlığın yaxşılaşdırılması üçün qiymətli genomik mənbə təmin edir. Bu genom mədəni sitrus bitkilərinin genomları ilə birlikdə (kök kimi) genomik səviyyədə kök-kök qarşılıqlı təsirinin dərindən başa düşülməsini asanlaşdırmalıdır. Bundan əlavə, genomik məlumat tibbi istifadə əsaslarının və soyuq davamlılıq, üçyarpaqlı yarpaq xarakteri və sitrus tristeza virusuna qarşı müqavimət kimi bəzi digər unikal bioloji xüsusiyyətlərinin tədqiqi üçün dəyərli ola bilər.

Peyvənd min illərdir ki, bağçılıq bitkilərinin məhsuldarlığını yaxşılaşdırmaq üçün geniş şəkildə istifadə olunur. Artan fizioloji dəlillər bitkilərdə 53 anaç-bulaq qarşılıqlı təsirinin mövcudluğunu göstərsə də, genetik və epigenetik səviyyədə anaç-bulaq qarşılıqlı təsirinin təsirini aşkar edən molekulyar sübutlar azdır. Bu yaxınlarda, DNT, RNT və zülallar kimi mobil genetik elementlərin kəşfi tədricən anaç-filiz qarşılıqlı təsirindən təsirlənən bir neçə aqronomik əlamətlərin altında yatan molekulyar mexanizmləri aşkar etdi 16 . Məsələn, microRNA399 kolza və balqabaqda bitki fosfat homeostazının tənzimlənməsi üçün uzun məsafəli siqnal kimi müəyyən edilmişdir 54 . Epigenetic modification may also play important roles in creating heritable phenotypic variation by grafting. In this study, we found that the DNA methylation level in the scion grafted on P. trifoliata decreased by

3% (Fig. 5). A previous study reported that DNA methylation levels in grafted cucumber and melon were significantly increased when pumpkin was used as rootstock, while there was no significant change in grafted watermelon 19 . Grafting between plant species of Solanaceae caused extensive DNA methylation variation, and some variation could be stably passed on to offspring 18 . Thus, we can conclude that grafting does cause variations in DNA methylation, but the degree and trend of DNA methylation variation may vary based on species and graft combinations. The effect of grafting on DNA methylation may be a regulatory mechanism for intercell interactions between scions and rootstocks 21 .

Our observation that the DNA demethylation pattern in the scions of heterografted plants is concomitant with reduced abundance of 24-nt sRNAs implies a possible mechanism of graft-induced alteration in DNA methylation. sRNA-mediated graft-transmissible epigenetic modifications have been confirmed in Arabidopsis thaliana by grafting experiments. Molnar et al. demonstrated that the movement of transgene-derived and endogenous sRNAs from shoot to root across graft unions can cause epigenetic changes in rootstock cells 55 . A subsequent study showed that mobile sRNAs originating in the shoots guided RdDM at thousands of loci in the roots 56 . Our finding that the sRNAs are associated with the methylation levels of the sRNA-overlapping regions suggests that the DNA demethylation in the scion of heterografted plants may be attributed to the reduction in sRNAs leading to reduced RdDM. As the genotypes of both the rootstock and scion in autografted plants are the same, it is difficult to determine whether the highly expressed sRNAs in the scions of autografted plants are from the rootstock. However, the higher expression of the sRNAs in the roots of sweet orange than in those of Poncirus, combined with the downregulation of the highly expressed sRNAs in the scions of autografted plants after griding treatment, suggested the possibility that the reduction in the rootstock-to-scion movement of sRNAs leads to decreased sRNA abundance in the scions of heterografted plants. Based on the above finding, the DNA demethylation in the scion of SWO/Pt was possibly caused by the reduced graft-transmissible epigenetic modifications mediated by rootstock-to-scion movement of sRNAs.

The high-quality citrus rootstock genome provides an important basis for future studies on rootstock genetic improvement, and our multiomic analysis of P. trifoliata may promote a deeper understanding of graft biology, not only in citrus plants but also in other horticultural crops. Given the important biological roles played by DNA methylation in plants, it is reasonable to suspect that graft-transmissible epigenetic modifications may have functional consequences. In the future, the use of transgenic plants as rootstocks for grafting will further enhance the opportunity to improve practical nontransgenic cultivars in the field.


ÜSULLAR

Plant Materials and Phenotypic Evaluation

Diploid Fragaria vesca Germplasm

An F2 mapping population of 145 lines between the everbearing, non-runnering Fragaria vesca cv Reine des Vallées (ESP138.660 RV660) and the WF F. vesca ESP138.596 (WV596) was developed from one F1 plant (F1-14) that was able to produce runners and had RFs. The population was grown in a greenhouse in Málaga, Spain and phenotyped for two years. The two traits, runnering and red/white fruits, were found to segregate independently as two single mutations. The remaining F. vesca accessions were grown under the same conditions and are described in Supplemental Data Set 3 and include cv South Queensferry, GER1, and GER2 from the Günter Staudt collection (Dresden, Germany) and UK13, SE100, and FIN12 from the T. Hytönen and D. Posé collection.

Octoploid Fraqariya Germplasm

The University of Florida breeding population 17.66 was derived from a cross between FL 13.65-160 (red) and FL 14.29-1 (white) selections ( Supplemental Figure 4 Supplemental Data Sets 3 and 8 ). The population (102 individuals) was grown under open field conditions with two plants per plot. Fruit skin color was assayed three times from December 2018 to February 2019 at the UF/IFAS Gulf Coast Research and Education Center (Balm, Florida).

To generate the SS×FcL F2 population of 105 progenies, a cross between Fraqariya ×ananassa cv Senga Sengana and F. chiloensis ssp. lucida USA2 was performed at Hansabred, Germany in 2008 ( Supplemental Figure 5 ). An F1 seedling, cloned under the number P-90999, was selected among the progeny based on key breeding traits such as tolerance to two spotted spider mite (Tetranychus urticae Koch), yield, and fruit aroma and color. The selected F1 individual was self-pollinated to obtain the F2 mapping population. The population was grown under field conditions at Hansabred and scored for fruit skin, flesh, and core color in three seasons (2014, 2016, and 2019). Skin color was evaluated using a five-score scale from completely white to dark red. Flesh and core color was evaluated using a three-score scale: 1, white 2, light red and 3, red ( Supplemental Figure 10 ). The parental line F. chiloensis ssp. lucida USA2 is a male individual that does not set fruit, and therefore USA1, a sister female plant collected from the same area, was included in phenotypic and molecular analyses, as were other F. chiloensis accessions from diverse origins ( Supplemental Data Set 3 ).

DNA Extraction and QTL-Seq Analysis of Diploid Fragaria vesca

DNA was extracted from young leaves of parental plants, F1 plants, and each F2 line using the CTAB method ( Doyle and Doyle, 1990) with minor modifications. For rapid mapping of the fruit color mutation, we performed whole-genome resequencing of DNA from two bulked populations as previously described by Takagi et al. (2013). The RF and WF pools were produced by mixing equal amounts of DNA from 34 RF and 32 WF F2 lines, respectively.

Pair-end sequencing libraries with insert sizes of ∼350 bp were prepared, and 100-bp sequences were produced with 50× genome coverage using an Illumina HiSeq 2000. The reads from the RF and WF pools were mapped independently against the latest version of the Fragaria vesca reference genome, F_vesca_H4_V4.1 ( Edger et al., 2018). The low-quality reads (<Q20 Phred scale) were filtered using the samtools method ( Li et al., 2009). Duplicates that originated from PCR were eliminated using the picard-tools program.

For the single nucleotide variants and small INDELs calling process, the gatk algorithm ( McKenna et al., 2010) was applied. The large INDELs were identified using the Manta algorithm ( Chen et al., 2016). The variants with coverage less than 20 reads in both samples were not considered in downstream analyses.

SNP frequencies in each pool were calculated as the proportion of reads harboring the SNP different from the reference genome. Thus, SNP frequency = 0 if all short reads match the reference sequence and 1 if they correspond to the alternative allele. SNP positions with read depth <7 and frequencies <0.3 in both pools were excluded, as they may represent spurious SNPs called due to sequencing or alignment errors. The parameter ΔSNP-index was calculated as the absolute difference between SNP frequencies in the RF and WF pool samples. To detect significant genomic regions, the genome was split into 3-Mb sliding windows with 10-kb increments. For each window, the average ΔSNP-index was calculated and used for the sliding window plot. To identify statistically significant regions, a Wilcoxon test was applied using a confidence P-value of 0.03.

Whole Genome Resequencing of FIN12 and Data Analysis

Whole genome resequencing of the FIN12 accession was performed at DNA Sequencing and Genomics Laboratory, Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Finland using an Illumina NextSeq 500 sequencer. Library preparation, pair-end sequencing (150 + 150 bp), and the alignment of the sequencing reads on the F. vesca H4 reference genome v4.1 ( Edger et al., 2018) were performed as described by Koskela et al. (2017).

GWAS Analysis of F. × ananassa Breeding Germplasm

A total of 95 individuals from UF family 17.66 were used for GWAS. Total genomic DNA was isolated from leaf tissues using a modified CTAB method described by Noh et al. (2018). Whole-genome SNP Genotyping was performed using the FanaSNP 50K Array ( Hardigan et al., 2020). A GLM, mixed linear model (MLM), and MLMM were used for association tests using GAPIT v2 performed in R ( Team, 2014 Liu et al., 2016 Tang et al., 2016). Manhattan plots were created using the R package qqman version 0.1.4 ( Turner, 2014).

Linkage Mapping and Detection of QTL in Octoploid Fraqariya

DNA was extracted from young leaves of parental plants, F1 plants, and the 105 F2 lines using the same CTAB method described for diploid Fraqariya. A total of 16,070 SNP markers were produced using the strawberry DArTseq platform ( Sánchez-Sevilla et al., 2015). SNP markers that were monomorphic in the progeny were removed, and markers that did not fit the expected 3:1 segregation ratio using the χ 2 test (P = 0.05). Next, markers with rowSums <400 were also removed. Finally, markers with more than 5% missing scores (more than five progeny lines) were excluded, resulting in a total of 9005 dominantly scored SNP markers. For 5856 markers, the reference and the alternative allele segregated at a 1:2:1 ratio (as expected for a F2 population) and were transformed into 2523 codominant markers (COD-SNPs). The 2523 COD-SNPs were used together with 2446 dominant SNPs (DOM-SNPs) for mapping using JoinMap 4.1 ( van Ooijen, 2006). First, JoinMap software was used (coding the markers as a CP population) to infer the phases of markers heterozygous in both parental lines and thus of unknown origin in the F1 xətt. Phase information was then used to assign phases and to code the SNP markers as a F2 əhali. Grouping was performed using independence LOD and the default settings in JoinMap 4.1, and LGs were chosen at a LOD of 9 for all 28 groups obtained. Map construction was performed using the maximum likelihood mapping algorithm and the following parameters: chain length 5,000, initial acceptance probability 0.250, cooling control parameter 0.001, stop after 30,000 chains without improvement, length of burn-in chain 10,000, number of Monte Carlo EM cycles 4, chain length per Monte Carlo EM cycle 2,000, and sampling period for recombination frequency matrix samples 5. A total of 422 identical loci and 517 loci with similarity > 0.99 were removed. The seven HGs were named HG 1 to 7 based on the corresponding LGs in the diploid Fraqariya reference map. BLAST analysis was performed using the SNP marker sequences as queries against the recently published Camarosa genome and assigned to the best matching chromosome. LGs within homoeologous groups were then named 1 to 4 according to the corresponding Camarosa chromosome number ( Edger et al., 2019).

QTL analyses were performed using MapQTL 6 ( van Ooijen, 2009). The raw relative data were first analyzed using a nonparametric Kruskal-Wallis rank-sum test. A stringent significance level of P ≤ 0.005 was used as a threshold to identify markers linked to QTLs. Second, transformed data sets for nonnormally distributed traits were used to identify and locate mQTLs using Interval Mapping with a step size of 1 cM and a maximum of five neighboring markers. Significance LOD thresholds were estimated with a 1,000-permutation test for each trait. The most significant markers were then used as cofactors for restricted multiple QTL mapping analysis. mQTLs with LOD scores greater than the genome-wide threshold at P ≤ 0.05 were declared significant. Linkage maps and QTLs were drawn using MapChart 2.2 ( Voorrips, 2002).

RNA Extraction and RT-quantitative PCR

Total RNA was extracted from three independent pools (20 to 25 ripe fruits each) of each WF and RF phenotype. Fruits for these biological triplicates were collected from the same F2 lines of the ‘RV660’ × ‘WV596’ population used for QTL-seq. We followed a CTAB method described by Gambino et al. (2008), kiçik dəyişikliklərlə. Briefly, 300 mg of powdered fruit sample was used as starting material and RNA was resuspended in 30 μL sterile water. Following digestion with a TURBO DNA-free Kit (Thermo Fisher Scientific AM1907), cDNA was synthesized from 1 μg of RNA using a High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific 4,368,814). RT-qPCR analysis was performed with iQ SYBR Green Supermix in an iCycler iQ5 system (Bio-Rad) following the manufacturer's instructions. Three technical replicates (within each experiment) were performed for each biological replicate. The relative expression level of a gene of interest in each sample was calculated as E -ΔCq and normalized by the E -ΔCq value for GADPH as the internal reference gene. The sequences of primers used in this study are listed in Supplemental Data Set 11 .

Semi-polar Metabolite Analysis Using UPLC-Orbitrap-MS/MS

To investigate the effect of FvMYB10 mutation, three independent pools of 20 to 25 ripe fruits from each phenotype (RF and WF) were analyzed. Fruits were collected from the same F2 lines used for QTL-seq and RT-qPCR. Fruit tissue from each pool was ground in liquid nitrogen and stored at −80°C. Secondary metabolite profiles of RF and WF pools were obtained as described by Vallarino et al. (2018) using a Waters Acquity UPLC system. Full documentation of metabolite profiling data acquisition and interpretation is provided in Supplemental Data Set 2 .

Quantification of Fruit Quality Parameters

To determine SSC, TA, Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), and ascorbic acid levels, frozen fruit powder from the same samples (in biological triplicate) used for expression and metabolomic studies were used. For SSC, ∼0.5 g of sample was defrosted to room temperature and the puree deposited onto the lens of a refractometer (Atago PR32, Japan). Titratable acidity was evaluated with an automatic titrator (Titroline easy, Schott North America) as previously described by Zorrilla-Fontanesi et al. (2011). Polyphenols were extracted in 80% (v/v) methanol, and the antioxidant capacity of fruit samples was measured based on the ability of antioxidant molecules to quench the ABTS •+ radical cation [2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) Sigma–Aldrich] compared with the antioxidant activity of standard amounts of Trolox. TEAC assays were performed as described ( Pellegrini et al., 1999 Re et al., 1999) using 2 μL of sample and 250 μL of radical reagent. The absorbance at 734 nm was measured after 5 min at 25°C in a spectrophotometer. Results were expressed as μmoles of Trolox equivalents per gram of fresh weight (μmol TE/g FW).

L-Ascorbic acid (L-AA) was measured by HPLC ( Davey et al., 2006 Zorrilla-Fontanesi et al., 2011). In brief, 0.25 g of fruit powder was homogenized in 1 mL cold extraction buffer (metaphosphoric acid 2% [w/v], EDTA 2 mM) and incubated at 0°C for 20 min. The samples were centrifuged at 14,000 rpm for 20 min at 4°C, and the supernatant was filtered (0.45-mm membrane) and transferred to HPLC vials kept on ice. Finally, a 5-mL sample was injected in a Rx-C18 reverse-phase HPLC column (4.6 × 100 mm, 3.5 mM, Agilent Technologies) and detection was performed at 254 nm in a photodiode array detector (G1315D, Agilent Technologies). The mobile phase consisted of a filtered and degassed solution of 0.1 M NaH2PO4, 0.2 mM EDTA pH 3.1 ( Harapanhalli et al., 1993), and the flow rate was 0.7 mL/ min. L-AA content was calculated by comparison with values obtained from a standard curve and were expressed as mg L-AA per 100 g of fresh weight.

Amplicon Sequence Analysis

Amplicon sequencing was performed using cDNA from WF and RF accessions from UF family 17.66. The fruits from each white-skinned and red-skinned accession were collected in the field, and 2-mm-thick fruit skin samples were collected for RNA extraction using a surgical blade. Total RNA was extracted from each sample with a RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany), and cDNA synthesis was performed using LunaScript RT SuperMix Kit (New England Biolabs, USA) following the manufacturer's instructions. For amplicon sequencing, primer sets were developed for the coding region of MYB10 (cv Camarosa, maker-Fvb1-2-snap-gene-157.15-mRNA-1) using IDT's PrimerQuest Software ( Supplemental Data Set 11 ). The PCR products were checked in 3% (w/v) agarose gels and further purified for amplicon sequencing at GENEWIZ (South Plainfield, NJ). The sequencing reads from each WF and RF pool (10 samples per pool) were mapped to the MYB10 gene (maker-Fvb1-2-snap-gene-157.15-mRNA-1) with Geneious v.11.0.5 using default values. The consensus sequences of the MYB10 coding region of white and red strawberry pools were aligned using T-coffee ( Notredame et al., 2000).

Gene and Promoter Cloning and Sequence Homology Analysis

Gene and promoter amplification were performed using MyFi™ DNA Polymerase (Bioline). FvMYB10-gypsy and Fvb1 FIN12 genomic fragments flanking the deleted region were amplified with the 5Prime PCR Extender System (5Prime) using the provided 10× Tuning Buffer following the manufacturer instructions.

PCR products <8 kb were purified with a FavorPrep GEL/PCR Purification Kit (Favorgen). PCR products >8 kb were precipitated (30% [w/v] PEG8000 30mN MgCl2). Purified products were cloned into the pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) for Sanger sequencing.

Multiple sequence alignment of MYB10 promoter fragments was performed using the Geneious algorithm (Gap open penalty = 30 Gap extension penalty = 0 50 refinement iterations) and used for homology tree construction (Genetic distance model: Jukes-Cantor Tree build method: Neighbor-Joining Resampling method: Bootstrap 1000 replicates), both in Geneious 7.1.9 ( Kearse et al., 2012). F. vesca MYB10 pro sequence was chosen as outgroup as it belongs to a different species. Promoter sequence alignment and machine-readable tree files are provided as Supplemental Data Sets 12 and 13 .

RNA-Seq Analysis, Differential Gene Expression, and Variant Calling

Total RNA was extracted from two biological replicates of ripe fruits from the seven selected octoploid accessions as described above. Each replicate consisted of a pool of 3 to 5 fruits collected throughout different days at the same time of day (Zeitgeber Time 7). The fruits were immediately frozen in liquid N2 and stored at −80°C until processing. RNA quantity, quality, and integrity were determined based on absorbance ratios at 260 nm/280 and 260 nm/230 nm using a NanoDrop spectrophotometer (ND-1000 V3.5, NanoDrop Technologies, Inc.) and agarose gel electrophoresis and further verified using a 2100 Bioanalyzer (Agilent, Folsom, CA). Sample RIN values ranged from 7.4 to 8.4. Libraries were produced following Illumina´s recommendations at Sistemas Genómicos facilities, where they were sequenced by pair-end sequencing (100 bp × 2) in an Illumina HiSeq 2500 sequencer. Over 200.4 million reads were generated and filtered for high-quality reads by removing reads containing adapters, reads shorter than 50 bp, and reads with Q-value ≤30 using Fastq-mcf from ea-utils ( Aronesty, 2011) with the parameters -q 30 -l 50. The following analyses were performed on processed clean reads.

Read mapping, differential gene expression analysis, and clustering of reads from the seven selected octoploid accessions and the previously described cv Camarosa’ tissues ( Sánchez-Sevilla et al., 2017) were performed using the Tuxedo suit (Hisat2/Cufflinks/CummRbund) following standard procedures ( Trapnell et al., 2012). For the reference genome ( Edger et al., 2019), we used the latest assembled F. ×ananassa genome (Camarosa Genome Assembly v1.0.a1: F_ana_Camarosa_6-28-17.fasta) and annotation (Fxa_v1.2_makerStandard_MakerGenes_woTposases.gff) downloaded from the Genome Database for Rosaceae website (https://www.rosaceae.org/). The overall alignment rate was 90.72%.

Variant calling was performed using the haplotype-based variant detector FreeBayes v1.0.2-16-gd466dde-dirty ( Garrison and Marth, 2012). To identify the different variants at each position in the reference F. ×ananassa genome, alignment BAM files of the different accessions were labeled with samtools. A VCF file was generated with FreeBayes with all parameters set to default. All bioinformatic processes were performed at the Picasso cluster facilities at Servicio de Supercomputación y Bioinformática Málaga (http://scbi.uma.es).

Transient Overexpression by Agro-infiltration of Fruit

Transient expression studies in strawberry fruits were performed as described ( Hoffmann et al., 2006) with minor modifications. Full-length wild-type FvMYB10 and the truncated fvmyb10-2 cDNAs were amplified from total cDNA from ripe fruits of the F2 RV660 × WV596 population RF or WF pools, respectively. Primers FvMYB10-attB1 F and FvMYB10-attB2 R were used to amplify wild-type FvMYB10, and FvMYB10-attB1 F and ccm29 were used to amplify fvmyb10-2 ( Supplemental Data Set 11 ). Primer ccm29 is complementary to a region of the retrotransposon 45 to 70 bp downstream of the insertion point, which includes the first stop codon generated after the insertion. Each gene version was cloned into the Gateway transfer vector pDONR221 and then into the binary vector pK7WG2D under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter (Gateway BP and LR Clonase II Enzyme mix, Invitrogen). The resulting plasmids were introduced into Agrobacterium strain AGL0 following the protocol of Höfgen and Willmitzer (1988). Immature fruits in the late green/early white stage were used for agro-infiltration using 1 mL suspension of each culture in combination (1:1) with a suspension of Agrobacterium LBA4404 with the p19 suppressor of gene silencing ( Voinnet et al., 2003). Agro-infiltrated fruits were labeled and left to ripen in planta for ∼7 to 10 d.

HRM Marker Development and Marker Data Analysis

The primer set targeting the 8-bp mutation was designed using IDT's PrimerQuest Software and ordered from IDT (San Jose, California Supplemental Data Set 11 ). PCR amplification was performed in a 5 μL reaction containing 0.5 μM of each primer set, 2× AccuStart TM II PCR ToughMix (Quantabio, Beverly, Massachusetts ), 1× LC Green Plus HRM dye (BioFire, Salt Lake City, Utah), and 0.5 μL of DNA. The PCR conditions were as follows: an initial denaturation at 95°C for 5 min 45 cycles of denaturation at 95°C for 10 s, annealing at 62°C for 10 s, and extension at 72°C for 20 s. After PCR amplification, the samples were heated to 95°C for 1 min and cooled to 40°C for 1 min. Melting curves were obtained by melting over the desired range (60° to 95°C) at a rate of 50 acquisitions per 1°C. The HRM assay was performed with the LightCycler 480 System II (Roche Life Science, Germany). The HRM data were analyzed using Melt Curve Genotyping and Gene Scanning Software (Roche Life Science, Germany). Analysis of HRM variants was based on differences in the shapes of the melting curves and Tm values.

SNP Genotyping using KASP

An SNP in MYB10-2 at position −20 from the initial ATG associated with white/red flesh color in the sequenced accessions was targeted for the KASP assay. To produce a subgenome-specific assay, a combination of four primers was used in each reaction: two common forward primers (ccm90 and ccm91) to account for a background-specific G/A SNP, and two allele-specific primers (ccm92 and ccm93), each carrying the standard FAM or HEX dye tails and the targeted SNP at the 3′ end. A single common primer is generally used for standard KASP assays, but the high degree of polymorphism in the targeted region made it necessary to include an extra common forward primer to account for a different, background-associated G/A SNP not linked to the white-fleshed trait. Reaction volumes of 5 μL for 384-well plates were used 2.5 μL of MasterMix, 0.07 μL of assay/primer mix, and 2.5 μL of DNA (12.5 ng total) were used for genotyping. The final primer concentrations in the reaction mix were 210 nM for ccm90 and ccm91 150 nM for ccm92 and 190 nM for ccm93. PCR was conducted in a BioRad CFX-384 instrument using the following protocol: An initial denaturation step at 94°C for 15 min, 12 touchdown cycles (94°C for 20 s, 65°C for 80 s, dropping 0.6°C per cycle), 29 cycles (94°C for 20 s, 58°C for 80 s), and a final recycling for 2 cycles (94°C for 20 s, 60°C for 80 s). BioRad software was used to estimate the final results.

Accession Numbers

F. vesca FIN12 accession sequencing data are stored at National Center for Biotechnology Information Short Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) under accession number PRJNA655237.

The raw reads data from (1) Illumina high-throughput sequencing of RF and WF DNA pools from F2 lines of the F. vesca RV660 × WV596 population and (2) RNA-seq from ripe fruits of white and red octoploid accessions were stored at the Sequence Read Archive (SRA) of the European Nucleotide Archive (ENA) under project reference number PRJEB38128. In the same project, Sanger sequences were stored under the following specific codes: (1) fvmyb10-3 mutant alleles sequences from SE100, GER1, and GER2: LR862245, LR862246, and LR862247 (2) MYB10 promoter sequences from F. chiloensis ssp. chiloensis FC157 MYB10-1 pro/MYB10-3B pro, MYB10-2 pro, və MYB10-3A pro (LR862237-LR862239), F. chiloensis ssp. lucida USA2 MYB10-3A pro, MYB10-1 pro/MYB10-3B pro, və MYB10-2 pro (LR862240-LR862242), Fragaria × ananassa cv Senga Sengana MYB10-3A proMYB10-1 pro/MYB10-3B pro (LR862243- LR862244) and (3) The FvMYB10-gypsy LTR-TE sequence from fvmyb10-2: LR8622681.

Supplemental Data

Supplemental Figure 1. . The LTR-TE insertion in FvMYB10 cosegregates with the white fruit phenotype in the entire RV660xWF596 population.

Supplemental Figure 2. . TEAC, soluble solid content (SSC), titratable acidity (TA), and L-ascorbic acid (L-AA) content in RF and WF F2 pools of the RV660 x WV596 population.

Supplemental Figure 3. . F. vesca accession FIN12 has a large deletion affecting an ∼100 kb region in Fvb1 that results in the loss of seven predicted genes including FvMYB10 (FvH4_1g22020).

Supplemental Figure 4. . Fruit skin color in UF population 17.66 (FL 13.65-160 × FL 14.29-1).

Supplemental Figure 5. . Fruit flesh and skin color phenotypes in the Hansabred SS×FcL population.

Supplemental Figure 6. . Senga Sengana x F. chiloensis ssp. lucida linkage map and comparison to the physical positions in the F. vesca reference genome.

Supplemental Figure 7. . Expression of cv Camarosa FaMYB10 homoeologs in different tissues and during fruit ripening.

Supplemental Figure 8. . Sequence alignment of WT and mutant MYB10-2 in UF breeding population 17.66.

Supplemental Figure 9. . Alignment of the MYB10 upstream region showing the SNP targeted for KASP genotyping.

Supplemental Figure 10. . Fruit color scale used to phenotype octoploid accessions.

Supplemental Data Set 1 .. List of significant SNPs and INDELs in the RV660 × WV596 population.

Supplemental Data Set 3 .. List of Fraqariya ssp. included in this study and description of mutations detected in MYB10.

Supplemental Data Set 4 .. QTLs detected for fruit color traits in the cv Senga Sengana × Fragaria chiloensis ssp. lucida F2 population by Kruskal-Wallis (KW) and restricted multiple QTL mapping (rMQM) analysis.

Supplemental Data Set 5 .. Polymorphisms at MYB10 homoeologs from F. chiloensis accessions and cv Senga Sengana vs. the cv Camarosa reference genome.

Supplemental Data Set 6 .. Expression of anthocyanin pathway genes in cv Senga Sengana and white-fleshed F. chiloensis accessions.

Supplemental Data Set 7 .. Predicted putative cis-elements specific to cv Camarosa FaMYB10-2 pro.

Supplemental Data Set 8 .. Predicted putative cis-elements specific to cv Camarosa FaMYB10-2 pro potentially significant in the context of fruit ripening and anthocyanin production.

Supplemental Data Set 9 .. Putative cis-elements predicted in FvMYB10 pro overlapping with those exclusively predicted in cv Camarosa FaMYB10-2 pro.

Supplemental Data Set 10 .. Phenotypes and WS_CID_1 marker genotypes of UF breeding population 17.66 (FL 13.65-160 × FL 14.29-1).

Supplemental Data Set 12 .. Sequence alignment file in fasta format of MYB10 pro variants.


Videoya baxın: Bağmızda hansı meyvələr var (Oktyabr 2022).