Məlumat

12.4: Ekstraksiya üsulları - Biologiya

12.4: Ekstraksiya üsulları - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

12.4: Ekstraksiya üsulları

Fermentlərin istehsalı və təmizlənməsi: Ekstraksiya və Ayrılma Metodları | Sənaye Mikrobiologiyası

Bu yazıda fermentlərin istehsalı və təmizlənməsi haqqında danışacağıq. e haqqında məlumat əldə edin ekstraksiya və ayırma üsulları fermentlərin təcrid edilməsi və təmizlənməsi üçün. Ekstraksiya üsulları bunlardır: 1. Bərk substrat kulturalarının çıxarılması 2. Hüceyrələrin çıxarılması və ayırma üsulları: 1. Bərk maddələrin ayrılması üsulları 2. Membranların ayrılması üsulları 3. Gel filtrasiyası 4. Adsorbsiya üsulları 5. Çöküntü texnikası. Həmçinin fermentlərin dözümlülüyü haqqında fikir əldə etmək üçün aşağıdakı məqaləyə nəzər salın və e nzim immobilizasiyası .

Ferment istehsalında xammalın daxil olması ilə məhsulun çıxışı arasında çox əlverişsiz nisbət var. Bu, konsentrasiya və utancaqlıq prosedurlarının quraşdırılmasını tələb edir. Enzim tətbiqinin iqtisadi səbəblərinə görə sənaye ferment preparatları üçün 10 qata qədər konsentrasiya adətən qənaətbəxşdir.

Məsələn, yuyucu vasitələrdə istifadə olunan ferment məhsullarında təxminən 5-10% proteaz var, un emalında istifadə üçün amilaz preparatları isə cəmi 0,1% saf a-amilazadan ibarətdir. Bununla belə, yüksək təmizlikli fermentlərin tələb olunduğu tətbiqlərdə, məsələn, ferment analizində 1000 qat təmizlənmə olduqca yaygındır.

Çörək bişirmə və dekstroz istehsalı kimi bəzi tətbiqlərdə çirkləndirici fermentlərin mövcudluğu çox aşağı olmalıdır və ya sərt şəkildə idarə olunmalıdır. Üstəlik, mikrob kulturalarından əldə edilən xam ferment məhlulları, mənbəyindən asılı olmayaraq, müxtəlif növ əlavə məhsullar ehtiva edir. Bütün bu maddələrin ayrılması arzuolunmaz təsirlər ehtimalına görə lazım ola bilər.

Ferment sabitliyini nəzərə alsaq, xam ferment preparatlarının müalicəsinin başqa bir səbəbi var. Ferment tətbiqlərindəki tendensiya maye preparatların və utancaq şəkildə istifadəsi olduğundan, stabilləşdirmə mühüm prosedurdur.

Mikro və şibial mənbələrdən fermentlərin geniş miqyaslı izolyasiyası və (qismən) təmizlənməsi üçün üsullar əsasən ənənəvi prosedurlardan istifadə edir. Avadanlıq və utancaqlığın çox hissəsi qida emalı zavodlarında tapıla bilər. Fermentlərin təcrid olunması üçün xüsusi olan iri miqyaslı avadanlıq bazara çıxarılmır.

Qurutma istisna olmaqla, demək olar ki, bütün proses əməliyyatları aşağı temperaturda (tercihen 0°-10°C) həyata keçirilir.

Ayırma prosesləri bir qayda olaraq yox, partiyalar şəklində aparılır. Bununla belə, toplu əməliyyatların miqyasının genişlənməsi təbii olaraq uzadılmış emal vaxtlarına səbəb olur ki, bu da bir çox fermentlər üçün ferment zülalının denatürasiyası səbəbindən aktivliyin artması ilə nəticələnir.

Bu səbəbdən fasiləsiz əməliyyatların tətbiqi faydalı görünür, lakin yüksək etibarlı maşınlara ehtiyac və utancaqlıq davamlı metodların tətbiqini gecikdirir. Bundan əlavə, yağıntı zamanı bir proses addımı partiya şəklində aparıldıqda davamlı emalın dəyəri itirilir.

Ekstraksiya üsulları :

Fermentlərin təcrid edilməsində ilk addım onların çıxarılmasıdır. Bu qrupa daxil olan üsullar ya fermentləri bərk substrat mədəniyyətindən ayırmaq, ya da mikrob hüceyrələrinin daxili hissəsindən fermentləri buraxmaq üçün istifadə olunur.

Bərk Substrat Kulturalarının çıxarılması:

Bərk sub­strate becərilməsi ilə istehsal olunan fermentlər əvvəllər hüceyrədənkənar tipli idi. Buna görə asanlıqla başa düşülür ki, kif kəpəklərinin çıxarılması daha çox yuyulma prosesidir. Əks cərəyan süzülmə üsulları ən çox istifadə edilən vahid əməliyyatdır.

Bir çox hallarda kif kəpəkləri çıxarılmazdan əvvəl qurudulur. Müəyyən ferment preparatının istifadəsi mövsümi olduqda, bu, cəlbedicidir. Kulturalar bütün il boyu nisbətən kiçik avadanlıqlarda istehsal oluna bilər, hasilatı isə ferment tələbatının olduğu vaxtlarda aparılır.

Digər tərəfdən, qurudulmuş kəpəkdən ekstraksiya daha yüksək ferment konsentrasiyası olan məhlulların əldə ediləcəyi asanlıqla görünür. Və nəhayət, qurutma təzə kulturaların canlı hüceyrələrinin fəaliyyəti nəticəsində yaranan qarşılıqlı və utancaqlığın qarşısını alır. Bununla belə, bu mübahisə və utancaqlıq davamlı olaraq fəaliyyət göstərən mədəniyyət bitkilərində tətbiq olunmaya bilər.

Bütün hallarda ekstraktor sudur, lakin tərkibində turşular (qeyri-üzvi və ya üzvi), duzlar, tamponlar və ya fermentin həllini asanlaşdırmaq və ya məhlulda dayanıqlığını artırmaq və ya səbəb olduğu arzuolunmaz təsirləri istisna etmək və ya minimuma endirmək üçün digər maddələr ola bilər. çirkləndirici əlavə məhsullar və ya mikroorqanizmlər.

Bütün hüceyrələrin biokimyəvi proses üçün istifadə edilməsi və ya təcrid olunmuş fermentlərin istifadə edilməsi ilə bağlı qərar bir çox amillərdən asılıdır. Texniki çətinliklər və geniş miqyaslı izolyasiya ilə əlaqədar xərclər mühüm rol oynayır.

Hughes et al tərəfindən nəzərdən keçirildiyi kimi hüceyrənin pozulması üçün bir sıra üsullar mövcuddur. (1971). Kimyəvi və biokimyəvi üsullar, məsələn, avtoliz, həlledicilər, yuyucu vasitələr və ya litik fermentlərlə müalicə və utandırmanın prinsipcə toplu əməliyyatlar olması dezavantajına malikdir. Onların davranışını standartlaşdırmaq və optimallaşdırmaq çətindir. Daha çox tövsiyə olunan mexaniki üsullardır.

Hazırda APV-Manton-Gaulin homogenizatoru hüceyrə parçalanması üçün ən çox yönlü tip kimi görünür. Bu maşında hüceyrə süspansiyonu seçilmiş iş təzyiqində homogenləşdirici klapandan keçir və zərbə halqasında hərəkət edir. Ani dekompressiya ilə birlikdə güclü kəsici qüvvələr hüceyrə divarının pozulmasına səbəb olur. Mayanın parçalanmasını tədqiq edən Dunnill və Lilly (1972), zülalın sərbəst buraxılmasının birinci dərəcəli sürət tənliyi ilə təsvir edilə biləcəyini tapdılar.

Burada R hər kq hüceyrə kütləsi üçün g-də ayrılan həll olunan zülalın miqdarıdır, Rm ayrılan həll olunan zülalın maksimum miqdarı, K temperaturdan asılı sürət sabiti, N hüceyrə suspenziyasının homogenizatordan neçə dəfə keçdiyi və P iş təzyiqi. Sənaye modelləri ilə, maşının ölçüsündən asılı olaraq, saatda 50 ilə 9000 litr arasında bakterial suspenziya müalicə edilə bilər. Bazarda mövcud olan bilyalı dəyirmanların həcmi 0,6-250 litrdir.

Ayırma üsulları :

Burada fermentlərin geniş miqyaslı istehsalında daha geniş tətbiq tapan üsulların yalnız ən bariz təsvirini vermək olar.

Bərk maddələrin ayrılması üsulları:

Belə üsullar kultura məhlullarının və ekstraktlarının aydınlaşdırılmasında, çöküntülərin ayrılmasında və maye ferment preparatının mexaniki üsullarla sterilizasiyasında iştirak edir.

Ayrılmalı olan bərk maddələrin ayrılması prosesini çətinləşdirən bir sıra xüsusiyyətlər ola bilər. Məsələn, onlar yağlı, bəzən kolloid ola bilər və çox vaxt bərk hissəciklər ilə maye faza arasında sıxlıq fərqləri çox kiçik olur. Buna görə də, mayenin ilkin təmizlənməsi adətən qaçılmazdır, çünki turşulaşdırma, su ilə qarışan məhlulların və ya maye poliionların əlavə edilməsi, yumşaq qızdırma və s.

Böyük miqyaslı bərk-maye ayrılması problemləri mürəkkəb və müxtəlifdir. İki yanaşma var - sentrifuqa və filtrasiya. Sənaye sentrifuqaları incə bölünmüş bioloji bərk maddələrin çıxarılması üçün ideal deyil. Qatı boşalma olmayan disk tipli sentrifuqalar yağlı hissəciklərin asanlıqla çökən süspansiyonlarının ayrılması üçün ən effektiv olduğunu sübut etmişdir. Dekanterlər bərk maddələrin yüksək olduğu, lakin asanlıqla çökdüyü hallarda, məsələn, qurudulmuş aseton çöküntülərinin istehsalında istifadə olunur.

Zəif çökən zülal çöküntüləri halında, fraksiyalaşdırılmış ferment çöküntüsü zamanı əldə edilən az bərk süspansiyonlardan ayrılması üçün içi boş kasa sentrifuqalarından istifadə olunur. Bütün hallarda axın sürətləri empirik olaraq müəyyən edilməlidir. Bəzən (məsələn, çöküntülərlə) ötürmə qabiliyyəti nominal tutumun 10%-dən azına endirilir. Bu, soyutma cihazlarının inteqrasiyasını tələb edir.

Çox vaxt filtrlər bioloji hissəciklərin ayrılması üçün daha uyğundur. Ümumiyyətlə böyük nisbətdə filtr köməkçiləri tələb olunur. Davamlı və utancaq proseslərdə vakuum baraban filtrləri, diatomlu torpaq, ağac xəmiri və ya nişasta ilə örtülmədən əvvəl istifadə olunur. Partiya əməliyyatları filtr presləri ilə aparılır.

Membran ayırma üsulları:

Membran prosesləri heç bir faza dəyişməsi və ya fazalararası kütlə ötürülməsi olmadan məhlulların bir-birindən və ya həlledicidən ayrılmasına və ayrılmasına imkan verir. Çox müxtəlif növ membran prosesləri var, onların təsnifatı məhlulların membran vasitəsilə ötürülməsinə səbəb olan hərəkətverici qüvvələrə əsaslanır. Belə bir qüvvə dializdə elektrik potensialı və şitial, elektro-dializdə və ya hidrostatik təzyiqdə, mikrofiltrasiyada, ultrafiltrasiyada və əks osmosda olduğu kimi konsentrasiyalarda trans-membran fərqləri ola bilər.

Hazırda ultrafiltrasiya geniş miqyaslı ferment istehsalında əhəmiyyət kəsb edən yeganə membran prosesidir. Normal filtrasiya proseslərindən yalnız ayrılacaq hissəciklərin ölçü diapazonu ilə fərqlənir (molekulyar çəki kəsikləri 500 ilə 300.000 arasında). Nəqliyyat mexanizmləri və ayırma xüsusiyyətləri ilə fərqlənən iki növ ultrafiltrasiya membranı istifadə olunur.

İzotrop məsaməli membranlar adi filtrlərə ən çox bənzəyən növdür. Orta ölçüsü 0,05 ilə 0,5 mikron arasında olan son dərəcə kiçik təsadüfi məsamələri olan süngər bir quruluşa malikdirlər. Diametri ən kiçik məsaməninkindən kiçik olan molekullar kəmiyyətcə membrandan keçəcək, ən böyük məsamədən daha böyük hissəciklər isə filtr səthində saxlanılacaq. Ancaq orta ölçülü molekullar yalnız müəyyən dərəcədə keçəcəklər.

Bu hissəciklərin başqa bir hissəsi membranın strukturunda saxlanılacaq. Bu, birincisi, membranın nəticədə çirklənməsi ilə tutmanın azalmasına (və ya əksinə, keçiriciliyin), ikincisi, müxtəlif ölçülü məhlullar arasında ayrı-seçkiliyin azalmasına gətirib çıxarır. Çirklənməni minimuma endirmək üçün orta məsamə ölçüsü saxlanılacaq məhluldan xeyli aşağı olan membranlardan istifadə etmək faydalıdır. Buna görə məsaməli membranlar yüksək molekulyar ağırlıqlı məhlulların konsentrasiyası üçün məqsədəuyğundur (molek. Çəki < 1 x 10 6).

Diffuziv membranlar daha çox seçici molekulyar diskriminasiya və utancaqlıq qabiliyyətinə malikdir. Onlar mahiyyətcə homojen hidrojel təbəqələridir, onların vasitəsilə həlledici, eləcə də məhlul konsentrasiyanın və ya kimyəvi potensial qradiyentin hərəkətverici qüvvəsi altında molekulyar diffuziya yolu ilə daşınır. Bir molekulun membran vasitəsilə daşınması xeyli kinetik enerji tələb edir.

Bu, əlbəttə ki, yayılan molekulun ölçülərindən və membran matrisi daxilində tək polimer zəncirlərinin hərəkətliliyindən asılıdır. Bir qayda olaraq, matrisin polimer seqmentləri yalnız boş bir şəkildə bir-birinə qarışdıqda, yəni gel matrisi yüksək nəmləndirildikdə diffuziya sürəti yüksək olur. Bu səbəbdən hidrofilik polimerlərdən hazırlanmış və müəyyən dərəcədə suda şişməyə qadir olan bütün membranlar sulu məhlullar üçün təzyiq filtrasiya membranları kimi əsasən uyğundur.

Membran tutma potensialına əlavə olaraq, axın iqtisadi səbəblərə görə vacibdir. Həm məsaməli, həm də diffuziv filtr tiplərində axın əsasən membranın qalınlığından asılı olduğundan, membranı mümkün qədər nazik saxlamaq lazımdır.

Bu tələb anizotrop membranların qurulması ilə yerinə yetirildi. Onlar nisbətən qalın (1-20 mikron) yüksək məsaməli dayaq üzərində yüksək dərəcədə konsolidasiya edilmiş, lakin çox nazik (0,1-5 μm) aktiv təbəqədən ibarətdir. Bu anizotrop membranların üstünlüyü ondan ibarətdir ki, membran daxilində tıxanma olmadığı üçün sabit hidrostatik təzyiqdə həlledici keçiriciliyində azalma yoxdur.

İstənilən ultrafiltrasiya sistemində məhlulların membran səthində toplanması baş verir ki, bu da məhlulun membrana konvektiv daşınması geri diffuziya sürətinə bərabər olana qədər membrandan həlledici axınına getdikcə mane olan “lil” əmələ gəlir. membrandan uzaqlaşdırın. Bu fenomen “konsentrasiya qütbləşmə&şizləşmə” adlanır.

Zülallar və kolloid hissəciklər müəyyən bir nöqtədən kənarda cəmləşdikdə bərk və ya tiksotrop gellər əmələ gətirir. Membran səthində məhlulun konsentrasiyası yuxarı həddə çatır ki, bu da adətən həcm üzrə 20-70% həlledicidir. Qütbləşmə effektini azaltmaq üçün sənaye ultrafiltrasiya avadanlığında qida məhlulu yüksək axınla membran səthindən keçir.

Makromolekulyar məhlul ultra süzüldükdə, həlledici axını əlaqə ilə ayrılır.

A membran sabiti (temperaturdan, normal iş diapazonunda təzyiqdən asılı olmayaraq) olduğu yerdə ΔP hidrostatik təzyiqin hərəkətverici qüvvəsidir və Δπ membrandakı osmotik təzyiq fərqidir. Konsentrasiyası 1% w/v-dən çox olan makromolekulyar məhlullar üçün 10-50 psi-dən çox osmotik təzyiqlər nadir deyil.

Bir neçə əsas növ ultra filtrlər var – nazik kanal, boru, spiral borular, spiral bükülmüş və içi boş lif sistemləri. Tək bir növün uyğunluğu müalicə ediləcək sistemin xüsusiyyətlərindən asılıdır.

Ultrafiltrasiya texnikası həm çirklərin ayrılmasını, həm də istədiyiniz fermentin konsentrasiyasını birləşdirmək üstünlüyünə malikdir. Lakin öz prinsipinə görə bu, kifayət qədər qeyri-seçimli bir prosesdir. Molekulların bir-birindən ayrılması ilə bağlı daha yaxşı nəticələr gel filtrasiyası ilə əldə edilə bilər, lakin bir çox hallarda onun tətbiqi iqtisadi cəhətdən mümkün deyil.

Prinsipcə, gel filtrasiyası məhlulun asanlıqla hərəkət edən həlledici fazası ilə stasionar fazı təşkil edən məsaməli gel hissəcikləri daxilindəki boşluqlar arasında diffuziya ilə bölünməsidir. Məhlulların diffuziya mübadiləsi stasionar və mobil fazalar arasında baş verir. Molekulun stansiya və şar fazasına nüfuz etmə dərəcəsi K bölmə əmsalı ilə təmsil olunur.av, tənliyə görə

Harada Ve gel sütunundan məhlulun ayrılması üçün tələb olunan həlledicinin həcmidir, V0 boşluq həcmidir (yəni, gel hissəciklərindən kənarda olan mayenin həcmi) və Vt sütun yatağının ümumi həcmidir. Kav empirik şəkildə göstərildiyi kimi molekulyar çəkinin logu ilə tərs mütənasibdir.

Gel filtrasiyası, ultrafiltrasiyada olduğu kimi mexaniki stress olmadan, sürətli və qoruyucu şəkildə işləyir. Bununla belə, gel sütununda zülalların çökməsi duzsuzlaşdırma nəticəsində baş verə bilər. Bəzi hallarda ferment dördüncü strukturlarının metal körpülərinin ayrıldığı müşahidə edilmişdir.

Adsorbsiya üsulları:

Yüksək selektiv ayırmaların mümkünlüyü səbəbindən adsorbsiya proseslərindən getdikcə daha çox istifadə olunur. En­zim molekullarının fərqli xüsusiyyətləri, məsələn, lipofiliya, elektrik yükü, spesifiklik və s., ayrılmanın əsasını təşkil edir. Bu, aktiv karbon, hidroksiapatit, ion dəyişdiricilər, daşıyıcı sabit substratın analoqları və s. kimi çox sayda adsor və şibentlərlə nəticələnir.

Bütün adsorbsiya texnologiyalarının ümumi xüsusiyyəti adsorbsiya prinsipidir, sonra desorbsiya və ya elüsyondur. Ayrılma ya fermentin, ya da impu&şiritin adsorbsiya və elüsyonu ilə əldə edilir. İki üsul mövcuddur, toplu müdrik adsorbsiya və ya sütun xroması və şitoqrafiya. Sonuncu proses daha yüksək ayırma səmərəliliyinə malikdir və əlavə olaraq, yarı davamlı əməliyyat imkanını təklif edir.

Müxtəlif adsorbsiya üsulları arasında yaxınlıq xromatoqrafiyası çox böyük maraq kəsb edir, lakin geniş miqyasda tətbiq olunmaqdan uzaqdır. Geniş miqyaslı proseslər üçün mövcud olan ion dəyişdiriciləri qatran, iri məsaməli gellər və ya sellüloza tiplidir. Xüsusilə, ion dəyişdirici qatranlar fermentlərin sənaye istehsalı üçün faydalı xüsusiyyətlər nümayiş etdirir.

Bununla belə, nəzərə almaq lazımdır ki, yüksək yük sıxlığına malik qatran matrisinin yaxınlığı fermentlərin struktur bütövlüyünə təsir edə bilər. Böyük məsaməli ion dəyişdiriciləri və sellüloza dəyişdiriciləri bir sıra xüsusiyyətlərə malikdir ki, bu da onları fermentlərin ayrılması prosesləri üçün çox əlverişli edir, lakin birincisi çox bahadır. Aydındır ki, onlar yalnız toplu proseslər üçün uyğundur, çünki onlar sütunlarda sıxılırlar.

Yağış texnikası:

Duzlama yolu ilə məhluldan ayrılması fermentlərin konsentrasiyası və təmizlənməsinin ən qədim, lakin ən vacib prosedurlarından biridir. Konsentratlaşdırılmış elektrolit məhlullarında zülalın həllolma qabiliyyətinin azalmasının loqarifmi tənlik ilə təsvir olunduğu kimi duz konsentrasiyasının (ion gücü) artırılmasının xətti funksiyasıdır.

burada s zülalın q/litr məhlulda həllolma qabiliyyətidir τ litrdə mol ilə ion gücü B 1 , kəsilmə sabiti pH, tempera­turadan asılıdır və məhluldakı zülalın təbiəti K 1 duzlanma sabitidir. pH və temperaturdan asılı olmayan, lakin məhluldakı zülal və istifadə edilən duza görə dəyişir. Əvvəlki əlaqədən belə nəticə çıxarmaq olar ki, ion gücü tənliyi təmin etdikdə məlum konsentrasiyalı zülalın çökməsi baş verəcəkdir.

Bu o deməkdir ki, zülal çöküntüsü və şitasiyası üçün tələb olunan elektrolit konsentrasiyası protein konsentrasiyasına görə dəyişir.

Ən mühüm yağıntı parametrlərinin təsiri qısaca aşağıdakı kimi təsvir edilə bilər – Daha yüksək valentlik duzları aşağı valentlik duzlarına nisbətən daha yüksək ion gücü yaradır. Sabit ion gücündə zülalın həllolma qabiliyyəti onun izoelektrik nöqtəsindən uzaqlaşdıqca (hər iki istiqamətdə) artır. Nəticədə, zülalın izoelektrik nöqtəsində həyata keçirildikdə, çöküntü və şlam üçün daha aşağı ion gücü tələb olunur.

Yağıntı üçün ən çox istifadə edilən duz ammonium sulfatdır. Səbəbləri bu duzun yüksək həllində və aşağı qiymətində tapmaq olar. Bundan əlavə, ammonium sulfat əksər fermentlər üçün toksik deyil və bir çox hallarda sabitləşdirici agent kimi çıxış edir. Ammonium sulfat məhlullarında çökmüş fermentlər aşağı temperaturda saxlandıqda çox vaxt əhəmiyyətli itki olmadan illərlə saxlanılır.

Neytral duzlardan fərqli olaraq, həlledicilər fermentlərin geniş miqyaslı çökməsi üçün daha az adətlidir. Səbəb xammal və avadanlıqların daha yüksək qiymətidir. Partlayışa davamlı avadanlıq və həlledicilərin təkrar emalı qaçılmaz tələblərdir.

Həlledicinin çökməsi, həlledicinin dielektrik davamlılığının (ϵ) azalması ilə fermentlərin həllolma qabiliyyətinin azalmasına əsaslanır. Tələb olunan konsentrasiya aşağı olarsa, həlledici daha az hidrofilikdir. Beləliklə, metanol seriyasında artan çökdürmə effekti əldə edilə bilər (ϵ25 = 33), etanol (ϵ25 = 24), izopropanol (ϵ25 = 18). Alifatik spirtlərdən başqa, aseton (ϵ25 = 20) tez-tez çöküntü kimi istifadə olunur.

Həlledici çöküntülər duz çöküntülərindən asanlıqla çökmə qabiliyyətinə görə fərqlənir. Lakin 4°C-dən yuxarı temperaturda ferment zülalının denatürasiyası baş verə bilər. Buna görə də, sıfırdan aşağı temperaturda işləmək olduqca normaldır. Bununla belə, bu, sənaye istehsalında böyük soyutma qabiliyyəti tələb edir.

Molekulyar çəkisi 6000 olan polietilenqlikoldan istifadə etməklə bütün bu çətinliklərin qarşısını almaq olar. Bu çöküntü fermentin denaturasiyasına təsir etmir və temperaturdan və elektrolit konsentrasiyasından və şitrasiyasından nisbətən müstəqildir. Bununla belə, hidrogen ionunun konsentrasiyasına güclü asılılıq var. Ən yaxşı nəticələr çökdürüləcək fermentin izoelektrik nöqtəsində alınır.

Zülal molekulunun həllolma qabiliyyəti onun izoelektrik nöqtəsində ən aşağı olduğu üçün pH-ı dəyişdirməklə məhluldan müxtəlif fermentlərin ardıcıl çökdürülməsinə nail olmaq olar. Bu çöküntülər asanlıqla çökür və sentrifuqa ilə məhluldan asanlıqla ayrıla bilər.

Saxlama Formasına Dönüşüm :

Fermentin saxlanması üçün uyğun saxlama formasının hazırlanması tələb olunur. Ticarət ferment məhsulları ya məhlulda, ya da bərk halda mövcuddur. Ümumiyyətlə, istifadəçilər daha asan həll olunduğuna görə məhlullara üstünlük verirlər, lakin fermentlər adətən sulu məhlulda çox qeyri-sabitdirlər.

Bu səbəbdən həll olunmuş fermentlərin stabilləşdirilməsi maye ferment preparatlarının istehsalında çox mühüm addımdır. Saxlama dayanıqlığı aşağıdakı iki amildən təsirlənir - ferment məhlulunun mikrobioloji cəhətdən pisləşməsi və ferment zülalının denaturasiyası. Bu iki problemin bir-biri ilə sıx əlaqəli olduğu görünür.

Mikroorqanizmlərin və şıqanizmlərin böyüməsinin qarşısını almaq üçün bir çox müalicə üsulları sınanmışdır. Metodlara, məsələn, kimyəvi qoruyucu və qoruyucu maddələrin daxil edilməsi, pasterizasiya, duzların və polihidrik spirtlərin əlavə edilməsi və şüalanma daxildir. Lakin bu müalicələrin bəziləri hüquqi aspektlərə görə arzuolunmazdır. Buna görə də, mikrob artımının qarşısını almaq üçün ən uyğun üsul fermenti duzların və şəkərlərin yüksək konsentrasiyalı məhlulunda həll etməkdir.

Maye preparatlarla aşağı temperaturda və uyğun pH-da saxlama mahiyyətcə qaçılmazdır. Məlumdur ki, substratlar demək olar ki, həmişə müvafiq fermenti fiziki, kimyəvi və ya fiziki-kimyəvi agentlərdən qoruyur. Bu, ya konformasiya sabitləşməsi və ya sterik və ya rəqabətli qorunma ilə əlaqələndirilə bilər.

Bir sıra nəşrlərdən görmək olar ki, fermentin sabitliyinə demək olar ki, hər hansı bir təsir, fermentin aktiv yerindən başqa yerlərdə hücuma görə apriori allosterik ola bilər. Məsələn, bakterial proteaz olan termolizində Ca ionları ferment molekulunu sabitləşdirir, Zn ionları isə fəaliyyət üçün tələb olunur. Bakterial α-amilazanı sabitləşdirməkdə Ca ionlarının böyük dəyəri çoxdan məlumdur.

Stabilizasiya üçün bir sıra texnikalar mövcuddur.

Onlardan bəziləri aşağıdakı siyahıda təqdim olunur, immobilizasiya üsulları istisna olunur:

(1) Tamponlar, qliserin, substratlar və ya inhibitorlardan istifadə etməklə konformasiya və ya yük sabitləşməsi və/və ya durulaşma-dissosiasiyadan qorunma.

(2) Tiollar, redoks boyaları, oksigen bağlayan maddələr və ya xelatlaşdırıcı maddələrlə disulfid mübadiləsi yolu ilə aktiv sahə tiolunun qorunması.

(3) Müxtəlif üsullara, məsələn, proteo və şilitik fermentlərin işığa həssas boyalar vasitəsilə qarşısının alınması və ya çıxarılması, suyun özlülük effektorları, duzlar və ya şəkərlər vasitəsilə aktivliyinin aşağı salınması, köpük əleyhinə maddələrin soyudulması ilə səth enerjisinin azalması və zərərli agentlərin antifrizin çıxarılması və sterilizasiya ilə kristallaşmanın qorunması daxildir. mikrob hücumundan qorunmaq üçün.

Ticarətdə mövcud olan bərk ferment preparatları qurudulmuş kif kəpəkləri, qurudulmuş çöküntülər və ya qurudulmuş məhlullardır. Sprey qurutma iqtisadi səbəblərə görə ferment məhlullarından suyun çıxarılması üçün üstünlük verilən üsuldur. Hər halda, bu, yalnız bu prosesin tempera və şüurlu şərtlərinə kifayət qədər davamlı olan fermentlərə aiddir. Digər tərəfdən, dondurulmuş qurutma ən çox qoruyucudur, lakin onun istifadəsi qiymət mülahizələri ilə, həmçinin ferment məhlulunun duz konsentrasiyaları kifayət qədər azaldılmadıqda, evtektik qarışıqların əmələ gəlməsi ilə məhdudlaşır.

Bu, tam qurumaya və ya güclü köpüklənməyə və zülalın denatürasiyasına səbəb ola bilər. Bəzən istifadə edilən xüsusi qurutma üsulu, daşıyıcı kimi süd şəkəri və ya maltodekstrin ilə mayeləşdirilmiş yataqda qranulyasiyadır. Bu halda, təbii ki, kommersiya preparatının qənaətbəxş fəaliyyətini təmin etmək üçün fermentin kifayət qədər yüksək spesifik aktivliyi tələb olunur.

Fermentlərin immobilizasiyası :

Kommersiya tətbiqlərində fermentlər adətən həll olunan və ya “free”” şəklində istifadə olunur. Lakin bu təcrübə çox israfçıdır, çünki optimal şəraitdə aparılan reaksiyalarda aktivliyi çox az azalsa da, reaksiyanın sonunda ferment boşalır.

Immobiliza­tion reaksiya qarışığında fermentlərin diffuziyasının qarşısını alır və sadə bərk-maye ayırma üsulları ilə onların məhsul axınından bərpasına imkan verir. Nəticədə, reaksiya məhsullarında ferment yoxdur və fermentin təkrar istifadəsi mümkündür. İmmobilizasiya olunmuş fermentlərin digər üstünlüyü ondan ibarətdir ki, onlar fasiləsiz işləyən reaktorlarda istifadə oluna bilər.

İmmobilizasiya üsulları:

Prinsipcə, fermentin immobilizasiyasına onu suda həll olunmayan materialın səthində fiksasiya etməklə, onu fermentin substratı və məhsulları üçün keçirici olan matrisin içərisində tutmaqla və uyğun agentlərlə çarpaz əlaqə yaratmaqla nail olmaq olar. həll olunmayan hissəciklər vermək. Bağlanmış fermentlər aktiv matrislərə kovalent birləşmə yolu ilə və ya heteropolyar və/yaxud van der Waals ilə adsorbentlərə və ya ion ex&şiddəyişdiricilərə bağlanmaqla hazırlana bilər.

Aktivləşdirilmiş daşıyıcı materiallara kovalent birləşmə peptid və zülal kimyasında məlum olan üsullarla əldə edilir. Bu modeldə immo­bilizasiya olunmuş fermentlərin bəzi nümunələri Cədvəl 15.3-də verilmişdir. Kovalent bağların əmələ gəlməsi pH, ion gücü və ya substrat tərəfindən dəyişdirilməyən bir birləşmənin üstünlüyünə malikdir. Bununla belə, kovalent bağlanma, fermentin aktiv sahəsinin immobilizasiya reaksiyasında istifadə edilən kimyəvi reaksiya və aktiv olmayan ferment vasitəsilə bloklana biləcəyi ehtimalını təklif edir.

Kovalent birləşmənin çoxlu sayda üsulları var. Kimyəvi bağın əmələ gəlməsində iştirak edən ferment qrupları bunlardır: amin, imino, amid, hidroksil, karboksi, tiol, metiltiol, quanidil, imidazol qrupları və fenol halqası. Fermentlərin alüminium oksidi, şüşə, silisium oksidi, paslanmayan polad və s.

Fermentlərin bərk səthlərdə adsorbsiyası (Cədvəl 15.4) son dərəcə sadəlik üstünlüyünü təklif edir. Xromatoqrafiyanın prinsiplərinə uyğun olaraq həyata keçirilir. Adsorbsiya şərtləri heç bir reaktiv növə malik deyil və buna görə də fermentin modifikasiyası ilə nəticələnmir. Fermentlərin bağlanması isə geri çevrilir və bu səbəbdən adsorbsiya olunmuş fermentlər substratın mövcudluğunda və ya artan ion gücündə desorbsiya problemi yaradır.

Ümumi istifadə edilən adsorbentlərə alüminium oksidi, karbon, sellüloza, gil, şüşə (o cümlədən idarə olunan məsaməli şüşələr), hidroksiapatit, metal oksidləri və müxtəlif silisli materiallar kimi bir çox üzvi və qeyri-üzvi materiallar daxildir. İon dəyişdirici qatranlar fermenti elektrostatik qarşılıqlı təsirlərlə bağlayır. İmmo və şibilləşdirilmiş aminoasilazanın ilk uğurlu kommersiya tətbiqi (DL-amin turşularının həlli üçün) fermentin daşıyıcı kimi DEAE-Sephadex-ə adsorbsiya yolu ilə fiksasiya edilməsindən ibarət idi.

Polimer gellərə, mikrokapsulalara və ya filamentli strukturlara fermentlərin daxil edilməsi nisbətən mülayim reaksiya şəraitinin üstünlüyünə malikdir. Bu üsul, fermentin öz doğma vəziyyətində saxlandığı kimyəvi bağlarla ferment molekulunda aktiv sahə qruplarını bloklamaq riskindən azaddır.

Bu immobilizasiya texnikasının əsas çatışmazlıqları substratın və məhsulların (xüsusilə yüksək molekulyar ağırlıqlı substratlar və/yaxud məhsullarla) daşınmasına diffuziya nəzarəti səbəbindən ferment reaksiyasının iki dəfə gecikməsi və məsamə ölçülərinin paylanması səbəbindən fermentin davamlı itkisidir. . Tutma üçün istifadə olunan materiallara silikon kauçuk, silisium gel, nişasta və tercihen poliakrilamidlər daxildir. Tutulma ilə immobilizasiya olunmuş fermentlərin imtahan və nümunələri Cədvəl 15.5-də verilmişdir.

Daxiletmə metodunun bir variantı yarımperme və utancaq membranlar daxilində kapsulyasiyadır. Kollodion poli&şistirol, sellüloza törəmələri və ən çox yayılmış neylon kimi materiallar immobilizasiya ediləcək fermenti ehtiva edən mikro&şikapsul şəklində nazik, sferik, yarıkeçirici membranlar yaratmaq üçün istifadə edilmişdir. Kapsulların ölçüsü mkm-dən çox mkm-ə qədər dəyişə bilər. Kitajima və Kondo (1971) tərəfindən maya ilə nümayiş etdirildiyi kimi, hüceyrə ekstraktlarından çox fermentli sistemləri əhatə etmək və belə süni hüceyrələrdə fermentasiya aparmaq mümkündür.

Fermentlər aşağı molekulyar ağırlıqlı çoxfunksiyalı agentlərlə çarpaz əlaqə yolu ilə polimerləşdirilə bilər (bax Cədvəl 15.6). Bu üsul dəstək olmadıqda reaksiya aparıldıqda ferment molekullarının üçölçülü şəbəkəsinin yaranmasına gətirib çıxarır. Lakin, adətən bu, əhəmiyyətli dərəcədə fəaliyyət itkisi ilə nəticələnir. Bir qayda olaraq, fermentlər uyğun bir daşıyıcıya adsorbsiya edildikdən sonra çarpaz bağlanır.

Ən çox istifadə edilən çarpaz birləşdirici maddələrə diazobenzidin və onun törəmələri, xüsusən də glutaraldehid daxildir. Digər tərəfdən, fermentlər kopolimerləşmə ilə, yəni polimerlərə kovalent daxil olmaqla hərəkətsizləşə bilər. Ən çox istifadə edilən üsullar malein anhidrid və etilenlə kopolimerləşməni əhatə edir. Tutulmuş və mikrokapsullaşdırılmış fermentlərdə olduğu kimi, bu törəmələr makromolekulyar substratlara qarşı az və ya heç bir fəaliyyət göstərmir.

Təcrid olunmuş fermentlərin immobilizasiyasına alternativ bütöv mikrob hüceyrələrinin immobilizasiyasıdır. Bu üsul bahalı fermentlərin təmizlənməsi əməliyyatlarından qaçmaq üçün bir vasitə təmin edir. Müəyyən bir prosesdə müxtəlif fermentlər iştirak etdikdə fermentlərin bütün hüceyrələrə tutulması da faydalı ola bilər.

Və nəhayət, immobilizasiya edilmiş bütöv hüceyrələr, katalitik fəaliyyətinə vasitəçilik etmək üçün kofaktorlar tələb edən fermentləri əhatə edən proseslərdə effektivliyini sübut etdi. Bütün hüceyrə immobilizasiyasının bəzi nümunələri Cədvəl 15.7-də göstərilmişdir. Hüceyrələri liflər və ya dənəvər materiallar kimi daşıyıcılara bərkitməklə və ya tutaraq hərəkətsizləşdirmək olar.

İmmobilizasiya olunmuş fermentlərin xüsusiyyətləri:

En­zimin immobilizasiyasından sonra onun xassələri əhəmiyyətli dərəcədə dəyişə bilər. Bu cür dəyişikliklər (1) istifadə olunan daşıyıcının fiziki və kimyəvi təbiətinə, (2) ferment strukturunda kimyəvi və/və ya konformasiya dəyişikliklərinə və (3) immobilizasiya nəticəsində yaranan katalizin “heterojen təbiətinə” aid edilə bilər. .

Dəyişdirilmiş reaktivliyin təsirlərinə kinetik sabitlər (aktivləşmə enerjisinin dəyişməsi nəticəsində), optimal pH, Michaelis sabiti və sub­strate spesifikliyi daxildir. Matris yükü, birləşdirilmiş fermentin lokusunda hidrogen ionunun konsentrasiyasına təsir göstərə bilər və beləliklə, ya kationik, ya da anion daşıyıcıların istifadəsindən asılı olaraq, onun görünən pH optimalını bir istiqamətdə və ya digər istiqamətdə dəyişə bilər və substratlar olduqda görünən Michaelis sabiti. həm də yüklənir, əgər matris və substrat yükləri eynidirsə, artır, əks olduqda isə azalır. Fermentin spesifikliyindəki dəyişikliklər, əlavənin özünün səbəb olduğu ferment molekulunda konformasiya dəyişikliklərindən qaynaqlana bilər.

Fermentin immobilizasiyasının ən mühüm nəticələrindən biri də uyğun saxlama şəraitində aktivliyin xeyli müddət ərzində saxlanması və saxlanmasıdır. İmmobilizasiya olunmuş fermentlərin saxlama, istilik və pH-a davamlılığı əsasən fermentin bağlı olduğu daşıyıcı səthin təbiətindən asılıdır.

Melrose (1971) həll olunan həmkarları ilə müqayisədə 50 immobilizasiya edilmiş ferment arasında həll olunan formalardan 30 daha sabit və 8 daha az dayanıqlı olduğunu tapdı 12, sərbəst sistemlərdən heç bir fərq göstərmədi. Sabitliyin müşahidə edilən artımının səbəbləri aydın deyil. Bu, məsələn, konformasiya inaktivasiyasının qarşısının alınması və ya fermentdəki aktiv qrupların məhluldakı reaktiv qruplardan qorunması ilə əlaqələndirilə bilər.


Qida Materiallarının Qorunması: Ən Yaxşı 12 Metod

Bu məqalə qida materialının qorunması üçün istifadə edilən ilk on iki üsula işıq salır. Metodlar bunlardır: 1. Asepsiya 2. Pasterizasiya 3. Sterilizasiya 4. Soyuducu 5. Dondurma 6. Kimyəvi maddələr 7. Susuzlaşdırma 8. Karbonatlaşma 9. Şəkərlər 10. duzlar 11. Turşular 12. Antibiotiklər.

Metod № 1. Asepsiya:

Aseptik qida materiallarının yığılması, çeşidlənməsi, qablaşdırılması və daşınması zamanı ümumi təmizliyi qorumaqla mikrobların qarşısının alınmasıdır.

Metod № 2. Pasterizasiya:

Pasterizasiya qida materialı kimi istilik müalicəsi kimi 72°C-də 15 saniyəyə və ya 63°C-də 30 dəqiqəyə və ya 90°C-də 0,5 saniyəyə dərhal sonra 7-4°C-ə qədər sürətlə soyudulur. Yüksək temperatur-qısa müddətli (HTST) müalicələr qidaların qida tərkibinə və sensor xüsusiyyətlərinə daha az ziyan vurur və buna görə də aşağı temperaturlu uzunmüddətli (LTLT) müalicələrə üstünlük verilir.

Metod №3. Sterilizasiya:

Sterilizasiya mikrobların tamamilə xaric edilməsidir. Pomidor kimi meyvə və turşu tərəvəzlər 100°C-də 30 dəqiqə sterilizasiya oluna bilər, qeyri-asid tərəvəzlər isə 30 dəqiqə ərzində 116°C temperaturda müalicə tələb edir.

Metod № 4. Soyuducu:

Bir çox qida materialının saxlama müddəti 4°C və ya daha aşağı temperaturda saxlanılmaqla artırıla bilər. Ümumilikdə soyuducuda saxlanılan qidalara təzə meyvə və tərəvəz, yumurta, süd məhsulları və ət daxildir. Bununla belə, bəzi qidalar, məsələn, tropik meyvələr (məsələn, banan) aşağı temperaturlara məruz qaldıqda zədələnir.

Metod № 5. Dondurma:

Dondurma qidaların qida keyfiyyətini qorumaq üçün əla vasitədir. -18°C ilə -4°C arasında aparılır. Şirələr əsasən dondurulmaqla saxlanılır.

Metod № 6. Kimyəvi maddələr:

FPO-ya görə (1955), iki kimyəvi maddə, yəni. Kükürd dioksidi və benzoy turşusunun Hindistanda konservant kimi istifadəsinə icazə verilir.

(a) Kükürd dioksidi antioksidant və ağartma agenti kimi çıxış edir. Sulfit, bi-sulfit və metabisulfit kimi duzları şəklində istifadə olunur. RTS və nektar da daxil olmaqla meyvə şirələrində icazə verilən miqdar 100 ppm, squash, crush və şirniyyatda isə 350 ppm-dir. Kükürd dioksidi benzoy turşusundan daha uzun müddət içkilərin orijinal rəngini saxlayır.

(b) Benzoy turşusu natrium benzoat şəklində istifadə olunur və RT5 və nektarda 100 ppm-ə qədər, balqabaqda, əzməkdə və şirniyyatda 600 ppm-ə qədər icazə verilir.

Metod № 7. Susuzlaşdırma:

Dehidrasiya konservasiya üçün qida materiallarından nəmin çıxarılmasıdır. Susuzlaşdırmanın ilkin temperaturu adətən 43°C-də olur, tədricən 60-66°C (tərəvəz üçün) və 66-71°C (meyvə üçün) qədər artır.

I. Qurudulmuş məhsullarda nəmlik tərəvəzlər üçün 6-8%-dən, meyvələr üçün isə 10-20%-dən çox olmamalıdır.

II. Tərləmə konservləşdirilmiş materialı qutularda və ya qutularda saxlamaqla rütubəti bərabərləşdirmək üçün edilən prosesdir.

III. Kükürdləşmə, rəngsizləşmənin qarşısını almaq üçün qida materiallarının (xüsusilə də kartof dilimlərinin) kükürd dioksid vasitəsilə buxarlanması prosesidir.

IV. Dondurularaq qurutma xüsusi temperatur və təzyiqə imkan verən yüksək vakuum şəraitindən istifadə etməklə həyata keçirilir.

Metod № 8. Karbonatlaşma:

Karbonatlaşma mikrob fəaliyyətini maneə törətmək üçün suda və ya içkilərdə kifayət qədər karbon qazının həll edilməsi prosesidir. Mikrob fəaliyyətinin tam inaktivasiyasına (maya daxil olmaqla qəliblər) 14,6 q CO qarışdırmaqla nail olmaq olar.2 şirə və ya içki üçün litr başına.

Metod № 9. Şəkərlər:

Şəkər qidaları osmos prosesi ilə qoruyur. Meyvələrin konservasiyası üçün təxminən 66% və ya daha çox şəkər lazımdır. Meyvə siropu. Mürəbbə, jele, marmelad, konserv, konfet, kristallaşmış meyvə və şirli meyvələr şəkərdən istifadə edilərək konservləşdirilir.

Metod № 10. Duzlar:

Təxminən 15-25% konsentrasiyalı duzlar qida məhsullarının əksəriyyətini qorumaq üçün kifayətdir.

Metod № 11. Turşular:

Sirkə, sirkə turşusu, limon turşusu və laktik turşu kimi turşular qidanın xarab olmasına səbəb olan mikrobların böyüməsini maneə törətməklə, meyvələr də daxil olmaqla, qida materiallarının qorunması üçün istifadə olunur. Tərkibində 1-5% sirkə turşusu məhlulu olan qida materialı daha uzun müddət təzə saxlanıla bilər.

Metod № 12. Antibiotiklər:

Antibiotiklər qida materialları üçün konservant kimi də istifadə olunur. Nisin göbələk, pomidor və süd məhsullarının konservləşdirilməsi üçün istifadə olunur. Pimaricin (əsasən Pythium spp. qarşı istifadə olunur) meyvə şirələri üçün meyvələrin müalicəsi üçün istifadə olunur.


Nəticələr və Müzakirə

Kopiya-nömrə analizi boru kəmərinin icmalı

Xərçəng nüsxə sayı təhlilləri beş diskret mərhələyə bölünə bilər (Şəkil 1): 1) hər bir xərçəng nümunəsinin surət nömrəsi profilinin dəqiq müəyyən edilməsi 2) bu ümumi profillərin yaranmasına səbəb olan SCNA-ların müəyyən edilməsi və onların fon dərəcələrinin təxmin edilməsi formalaşması 3) hər bir bölgədə SCNA-ların təsadüfən meydana gəlmə ehtimalına görə qiymətləndirilməsi 4) SCNA-nın statistik əhəmiyyətli səviyyələrinə məruz qalan müstəqil genomik bölgələrin müəyyən edilməsi və 5) əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilmiş hər bir bölgənin ehtimal olunan gen hədəfinin(lərinin) müəyyən edilməsi. Şəkil 1-də bu prosesin sxematik icmalı təsvir edilmiş və bu əlyazmada qeyd edəcəyimiz xüsusi metodoloji təkmilləşdirmələr vurğulanmışdır.

Surət-nömrə analizi çərçivəsinin sxematik icmalı. Bu əlyazmada təsvir edilən orijinal GISTIC alqoritmi [15] və GISTIC 2.0 boru kəməri arasında xüsusi fərqləri vurğulayan xərçəng nüsxə-nömrə analizi çərçivəmizin yüksək səviyyəli icmalı. Birinci addım, hər bir nümunədə surət nömrəsi profilinin dəqiq müəyyən edilməsi GISTIC və GISTIC2.0 üçün ümumidir.

Hər bir xərçəng nümunəsinin nüsxə nömrəsi profilini dəqiq müəyyən edən ilk addım bir çox əvvəlki tədqiqatlar [28-35] tərəfindən həll edilmişdir və burada ətraflı müzakirə edilmir. Güman edirik ki, bütün nümunələr üçün seqmentləşdirilmiş surət nömrəsi profilləri əldə edilib və bütün rüşeym xəttinin surət nömrəsi variasiyaları (CNVs) silinib, somatik hadisələrin profilləri əldə edilib. Aşağıdakı bölmələr 2-5 addımlardakı təkmilləşdirmələri təsvir edir. Biz bu təkmilləşdirmələri Xərçəng Genomu Atlasının (TCGA) bir hissəsi kimi Affymetrix Tək Nukleotid Polimorfizmi (SNP) 6.0 massivi ilə hibridləşdirilmiş 178 glioblastoma multiforme (GBM) xərçəng DNT-dən ibarət sınaq dəstində qiymətləndiririk. layihə [10] ('TCGA GBM dəsti') və simulyasiya edilmiş verilənlər üzərində. Hər bir addım üçün tam texniki təfərrüatlar Əlavə Metodlarda təsvir edilmişdir (Əlavə fayl 1).

Seqmentləşdirilmiş surət nömrəsi profillərinin əsas SCNA-lara dekonstruksiyası

Seqmentləşdirilmiş surət sayı profilləri xərçəng inkişafı zamanı baş vermiş bütün SCNA-ların ümumi nəticəsini təmsil edir. Kopya nömrəsinin dəyişməsinin fon sürətinin dəqiq modelləşdirilməsi ayrı-ayrı SCNA-ların təhlilini tələb edir. Bununla belə, SCNA-lar üst-üstə düşə bildiyinə görə, yalnız son seqmentləşdirilmiş surət nömrəsi profilindən əsas hadisələri birbaşa çıxarmaq mümkün deyil. Bununla belə, SCNA fon dərəcələri ilə bağlı müəyyən fərziyyələri nəzərə alaraq, ən çox ehtimal olunanı seçmək üçün hər hansı bir namizəd SCNA-nın ehtimalını qiymətləndirmək mümkündür.

Biz hər bir seqmentləşdirilmiş surət-nömrə profilini əsas SCNA-lar dəstinə dekonstruksiya edən bir alqoritm ("Ziqqurat Dekonstruksiyası" (ZD)) hazırlamışıq (Əlavə fayl 1-də Əlavə Metodlara və Əlavə fayl 2-də Əlavə Şəkil S1-ə baxın). ZD, alternativ olaraq SCNA formalaşması üçün fon modelini qiymətləndirən və sonra hər bir surət-nömrə profilinin ən çox ehtimal edilən dekonstruksiyasını müəyyən etmək üçün bu modeldən istifadə edən iterativ optimallaşdırma alqoritmidir. Onun çıxışı, hər bir xərçəng nümunəsindəki fərdi SCNA-ların kataloqudur, hər biri təyin olunmuş uzunluq və amplituda, orijinal seqmentləşdirilmiş surət profilini yaratmaq üçün cəmidir. Biz güman edirik ki, bu SCNA-ların əksəriyyəti sərnişindir, beləliklə onların paylanması ilk təqribi olaraq “fon” mutasiya prosesinin işini əks etdirir (Əlavə fayl 3-də Əlavə Şəkil S2-ə baxın).

Fokus və qol səviyyəli SCNA-ların uzunluğa əsaslanan ayrılması

ZD metodunun əsas üstünlüyü onun qol səviyyəli və fokuslu SCNA-ları açıq şəkildə uzunluğuna görə ayırmaq qabiliyyətidir. Əvvəlki tədqiqatlar yüksək amplituda hədləri təyin etməklə qol səviyyəli SCNA-ları istisna etməyə çalışmışdır [10, 16], çünki fokus SCNA-lardan fərqli olaraq, bir neçə qol səviyyəli SCNA yüksək amplituda çatır (Şəkil 2a). Bununla belə, bu yanaşma ən azı iki arzuolunmaz nəticədən əziyyət çəkir: birincisi, aşağı və orta amplituda fokus surətinin sayı hadisələri təhlildən çıxarılır, müsbət seçilmiş bölgələri müəyyən etmək üçün həssaslığı azaldır və ikincisi, amplituda həddi sərbəst parametr kimi qalır. , təhlilin istənilən nəticəyə potensial həddən artıq uyğunlaşdırılmasına imkan verir.

Qol səviyyəli və fokus SCNA-ların hesablama ayrılması. (a) TCGA-dan 178 GBM profilində gücləndirilmiş fokus (xromosom qolunun uzunluğu < 98%) və qol səviyyəsində (xromosom qolunun uzunluğu > 98%) SCNA-lar üçün surət sayı dəyişikliklərinin paylanmasını göstərən qutu. Qara nöqtəli xətt artefaktual SCNA-ları aradan qaldırmaq üçün istifadə edilən tipik aşağı səviyyəli amplituda həddini, yaşıl nöqtəli xətt isə qol səviyyəli SCNA-ları aradan qaldırmaq üçün GISTIC-in əvvəlki versiyasında istifadə olunan tipik yüksək səviyyəli amplituda həddini bildirir. (b) 178 GBM nümunəsi üzrə verilmiş uzunluqlu SCNA-ların müşahidə tezliyini göstərən histoqram. Tam bir xromosom qolunu tutan hadisələrin yüksək tezliyi bizi fokus və qol səviyyəli SCNA-ları fərqləndirməyə vadar etdi. (c) TCGA GBM dəstinin ümumi seqmentləşdirilmiş surət nömrəsi profilini göstərən istilik xəritələri (ən sol panel) və bu nümunələrin qol səviyyəli profillərə (orta panel) və fokus profillərinə (ən sağ panel) hesablama yolu ilə ayrılması nəticələrini qol səviyyələri ilə fokusları cəmləməklə SCNAs. Hər bir istilik xəritəsində xromosomlar yuxarıdan aşağıya doğru şaquli olaraq, nümunələr isə soldan sağa düzülür. Qırmızı və mavi müvafiq olaraq qazanc və zərəri təmsil edir.

Əvvəllər göstərmişdik ki, müxtəlif toxuma mənşəli xərçənglər üzrə SCNA tezliyi SCNA uzunluqları ilə tərs mütənasibdir, SCNA-lar tam olaraq xromosom qolunun və ya bütün xromosomun uzunluğuna bərabərdir (çox tez-tez olur) [4]. Bu tendensiya TCGA GBM nümunələrində qorunub saxlanılır (Şəkil 2b). Bu təkrarlana bilən paylama hadisələri sırf uzunluğa əsaslanaraq “qol səviyyəsində” və “fokus” kimi təsnif etmək üçün təbii əsas verir. Hadisələrin bu cür uzunluğa əsaslanan filtrasiyası xərçəng genomunun "qol səviyyəli" və "fokal" təsvirlərinin hesablama rekonstruksiyasına imkan verir (Şəkil 2c) və son nəticəyə aşağı və orta amplituda fokus nüsxə nömrəsi hadisələrinin daxil edilməsinə imkan verir. təhlil.

Bu yanaşmanın faydalarını müəyyən etmək üçün biz üç fərqli hədd yanaşmasından istifadə edərək TCGA GBM dəstində orijinal "GISTIC 1.0" alqoritmini işlətdik (Şəkil 3 Əlavə fayl 4-də Əlavə Cədvəl S1): 1) aşağı amplituda həddi (log2 nisbəti ± 0.1) bu, yalnız aşağı səviyyəli artefakt seqmentlərini aradan qaldırır 2) kol səviyyəsində hadisələri aradan qaldırmaq üçün əvvəllər istifadə edilmiş yüksək amplituda həddi (log2 nisbəti 0,848 və -0,737 gücləndirmələr/delesiyalar üçün) [16] və 3) aşağı amplituda həddi, həm də aradan qaldıran bütün SCNA-lar xromosom qolunun 98%-dən çoxunu tutur və yalnız fokus hadisələri buraxır.

Qol səviyyəsində hadisələrin amplituda və ya uzunluğa əsaslanan filtrasiyasının GISTIC nəticələrinə təsiri. (a-c) Bütün verilənlərdən və aşağı amplituda həddi (a), bütün məlumatlardan və yüksək amplituda həddi (b) və fokus məlumatı və aşağı amplituda həddi (c) istifadə edərək GISTIC gücləndirmə (yuxarı) və silmə (alt) qrafikləri. Genom şaquli olaraq yuxarıdan aşağıya yönəldilmişdir və hər bir lokusda GISTIC q-dəyərləri log miqyasında soldan sağa çəkilmişdir. Yaşıl xətt əhəmiyyətlilik həddini (q-dəyəri = 0,25) təmsil edir. Hər bir süjet üçün məlum və ya maraqlı namizəd genlər hər üç analizlə müəyyən edildikdə qara, yüksək amplituda və ya fokus uzunluğu analizləri ilə müəyyən edildikdə qırmızı, aşağı amplituda və ya fokus uzunluğu analizləri ilə müəyyən edildikdə bənövşəyi rənglə və yaşıl rənglə vurğulanır. yalnız fokus uzunluğu analizində müəyyən edilir.

Amplituda və ya uzunluq hədlərinin istifadəsi ilə qol səviyyəsində hadisələrin süzülməsi fokus gücləndirmələri və silinmələri aşkar etmək üçün GISTIC-in həssaslığını xeyli artırdı (Şəkil 3 Əlavə Cədvəl S1 Əlavə fayl 4). Bütün xromosomlar, 7-ci xromosomun qazanması və 10-cu xromosomun itirilməsi daxil olmaqla, yalnız aşağı amplituda həddi istifadə etməklə əhəmiyyətli olaraq qiymətləndirilsə də (Şəkil 3a), ətrafdakı gücləndirmələr də daxil olmaqla, bir sıra təkrarlanan fokus dəyişiklikləri qaçırıldı. CDK6, CCND2, və HMGA2. Bu dəyişikliklər ya yüksək amplituda (Şəkil 3b) və ya fokus uzunluğu filtrlərindən (Şəkil 3c) istifadə etməklə aşkar edilmişdir.

Uzunluğa əsaslanan filtrləmənin faydaları aşağı və orta amplituda fokus hadisələrinin daxil edilməsi ilə nəticələnir. Gücləndirilməsi PIK3CAAKT1 və silinməsi WWOX uzunluğa əsaslanan süzgəcdən istifadə etməklə aşkar edilir, lakin yüksək amplitudalı filtr altında əhəmiyyətli deyil (Şəkil 3b və 3c ilə müqayisə edin). Bundan əlavə, uzunluğa əsaslanan təhlil amplituda əsaslı analizlərin heç birində aşkarlanmayan əhəmiyyətli SCNA-ları, o cümlədən MLLT10 və silinmələri CDKN1BNF1.

Uzunluğa əsaslanan analizlə də aşkar edilməyən amplituda əsaslanan analizlərin heç birində məlum GBM hədəf geni aşkar edilməmişdir. Bu nəticələr göstərir ki, qol səviyyəsində hadisələrin uzunluğa əsaslanan filtrasiyası fokus SCNA-nın müvafiq bölgələrini müəyyən etmək üçün GISTIC-in həssaslığını əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırır.

SCNA-ların ehtimalla qiymətləndirilməsi

Dəyişikliklərin fon dərəcələrini daha dəqiq əks etdirən SCNA-lar üçün qiymətləndirmə çərçivəsini müəyyən etməyə başladıq. İdeal olaraq, biz genomun hər bir bölgəsini müşahidə edilən SCNA dəstinin təsadüfən baş vermə ehtimalına uyğun olaraq qiymətləndirməyi hədəfləyirik. Bu çərçivədən istifadə edən xalların aydın şərhi var: regiona təyin edilmiş bal nə qədər yüksək olarsa, həmin regionda SCNA-ların tamamilə təsadüfən müşahidə olunma ehtimalı bir o qədər azdır və onların müsbət seçimdən keçmə ehtimalı bir o qədər yüksəkdir.

Verilmiş uzunluq və amplituda olan tək SCNA-nı müşahidə etmək ehtimalı bütün verilənlər toplusunda oxşar uzunluq və amplituda hadisələrin baş vermə tezliyi ilə təqribi hesablana bilər (Əlavə fayl 3-də Əlavə Şəkil S2-də olduğu kimi). Bununla belə, xərçəng genomlarında sürücülər olduğundan, bu prosedur null model altında SCNA-ları müşahidə etmək ehtimalını çox qiymətləndirir. Xüsusilə, sürücü hadisələri sərnişinlərə nisbətən daha qısa və daha yüksək amplituda olur və buna görə də onların uzunluq/amplituda qonşuluğunda baş verən hadisələrin əksəriyyətini təşkil edir (Əlavə fayl 5-də Əlavə Şəkil S3).

Fon modelimizə qərəzli yanaşmamaq üçün biz SCNA-ların log-ehtimal paylanmasını verilənlərdə sürücü hadisələrinin mövcudluğuna qarşı həssas olmayan funksional formaya uyğunlaşdırmağa başladıq (Əlavə fayl 1-də Əlavə Metodlar). Biz Affymetrix 250K StyI SNP Array [4] üzərində işləyən 3,131 xərçəng nümunəsinin böyük kolleksiyasından və Affymetrix SNP6.0 Massivində işləyən bir neçə yüz əlavə nümunədən istifadə etdik (məlumatlar göstərilmir). Bu massivlər tərəfindən təmin edilən ayırdetmə səviyyəsində, fon modeli altında verilən lokusda fokus SCNA-nı müşahidə etmək ehtimalı təxminən uzunluqdan asılı deyil. Nəticə olaraq, log-ehtimal paylanması üçün funksional forma orijinal GISTIC G-xal tərifinə bənzəyir (G = Tezlik × Genlik), nəzərə çarpan istisna olmaqla, yeni xal nüsxə sayı məkanındakı amplituda mütənasibdir. log-surəti-nömrə sahəsi əvəzinə.

Baxmayaraq ki, bu funksional forma iki müxtəlif massiv əsaslı platformada işləyən böyük nümunələr toplusundan empirik olaraq əldə edilmişdir, bu, platformalar arasında dinamik diapazondakı fərqlərə, eləcə də eyni massiv platforması daxilində zondların diferensial doyma xüsusiyyətlərinə qarşı həssaslığın artmasına səbəb olur. Bu problemin qarşısını almaq üçün biz müntəzəm olaraq seqmentləşdirilmiş surət nömrəsi məlumatlarını siqnal intensivliyini təmsil edən səviyyədə məhdudlaşdırırıq ki, çoxu zondlar doymağa başlayır (Əlavə fayl 1-də Əlavə Metodlar). Bu, zondların cavab əyrilərinin xətti rejimindən yaranan və buna görə də platformalar arasında daha müqayisə oluna bilən məlumatlardan istifadə etməyimizi təmin edir.

GISTIC 1.0 ilə olduğu kimi, biz də əldə edirik P-Hər bir nümunədə marker yerlərinin təsadüfi dəyişdirilməsi ilə yaradılan fon xalının paylanması ilə hər bir lokusdakı xalın müqayisəsi yolu ilə hər bir marker üçün dəyərlər (Əlavə fayl 1-də Əlavə Metodlar). Bu prosedur surət nömrəsinin dəyişmə sürətində nümunəyə xas dəyişikliklərə nəzarət edir. Nəticəni düzəldirik P- Benjamini-Hochberg yalançı kəşf dərəcəsi metodundan istifadə edərək çoxlu fərziyyə testi üçün dəyərlər [36].

Üst-üstə düşməyən silmələri olan şiş bastırıcılar üçün alternativ gen səviyyəli qiymətləndirmə

Bəzi genlər ya bir nümunədə müxtəlif allellərdə, ya da bir neçə nümunədə üst-üstə düşməyən silinmələrdən təsirlənir. Bu cür genlər üçün, markerə əsaslanan hesab, bu hadisələrin gen funksiyasına eyni dərəcədə zərərli təsir göstərə biləcəyinə baxmayaraq, həmin genə təsir edən bütün silinmələrin mövcudluğunu nəzərə almır. Biz GeneGISTIC adlanan, markerlərdən daha çox genləri qiymətləndirən dəyişdirilmiş qiymətləndirmə və permutasiya prosedurunu işləyib hazırlamışıq (Əlavə fayl 1-də Əlavə Metodlar). Hər bir nümunədə biz hər bir genə həmin gen daxilində olan hər hansı markerin minimal surət sayını təyin edirik və sonra gen hesabını hesablamaq üçün bütün nümunələr üzrə cəmləşdiririk. Daha çox markerləri əhatə edən genlərin təsadüfən daha ifrat dəyər əldə etmə ehtimalı daha yüksək olduğundan, permutasiya proseduru gen ölçüsünü əhatə edən bir gen üçün hesaba uyğunlaşdırılır. n markerlər minimum ümumi işləyən pəncərələrin hesablanması ilə yaradılan ölçülü xüsusi null paylanma ilə müqayisə edilir n hər bir nümunədə və sonra təsadüfi olaraq bu minimal dəyərlərin genomda dəyişdirilməsi.

Silinmələrin gen əsaslı qiymətləndirilməsinin təsirini müəyyən etmək üçün biz TCGA GBM dəstində gen əsaslı və marker əsaslı qiymətləndirmənin nəticələrini müqayisə etdik (bütün digər parametrləri bərabər tutaraq). Gözlənildiyi kimi, GeneGISTIC məlum şiş bastırıcı genləri daha yüksək sıralayır və üst-üstə düşməyən silinmələrə məruz qalan genlər üçün daha həssasdır (Əlavə fayl 6-da Əlavə Cədvəl S2). Misal üçün, RB1 gen əsaslı qiymətləndirmədən (q-dəyəri = 2.6e-10) istifadə edərək 39 bölgə arasında 5-ci yeri tutdu, lakin marker əsaslı qiymətləndirmədən (q-dəyəri = 0.0013) istifadə edən 38 bölgədən yalnız 13-cü oldu və CDKN1B marker əsaslı qiymətləndirmə (q-dəyəri = 0.19) ilə 38-ci ilə müqayisədə gen əsaslı qiymətləndirmə (q-dəyər = 0.08) istifadə edərək 26-cı sırada yer aldı. NF1 178 GBM nümunəsindən 12-də (6,7%) fokus olaraq silindi və bu silinmələr tez-tez üst-üstə düşmürdü (Əlavə Şəkil 7-də Əlavə Şəkil S4a). Nəticədə, NF1 İstifadə olunan parametrlərdən asılı olaraq, markerə əsaslanan xaldan istifadə etməklə, əhəmiyyət həddinin bir qədər üstündə və ya sadəcə altında qiymətləndirilmişdir. Əksinə, NF1 bütün parametr birləşmələri üzrə gen əsaslı qiymətləndirmədən istifadə etməklə möhkəm şəkildə müəyyən edilmişdir (Əlavə fayl 6-da Əlavə Cədvəl S2 və məlumatlar göstərilmir).

Bununla belə, bu qiymətləndirmə metodu genomun şərhli genlərdə olmayan bölgələrini qiymətləndirmədiyi üçün, qeyri-genik bölgələrdə baş verən silinmələri zəiflədə və ya tamamilə qaçıra bilər. Məsələn, GBM nümunələrimizdə gen əsaslı hesablama yalnız xaricində bir bölgə müəyyən etmədi PCHD9 chr13q21.3-də standart marker əsaslı baldan istifadə edərək yüksək əhəmiyyətli (q-dəyəri = 4.4e-9) qazandı (Əlavə fayl 7-də Əlavə Şəkil S4b). Bir çox qeyri-genik silinmə faktiki olaraq texniki artefaktları və ya nadir cücərmə xətti hadisələrini təmsil edə bilsə də, bəziləri funksional olaraq müvafiq ola bilər.

Müstəqil əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilmiş bölgələrin müəyyən edilməsi

Fərdi SCNA-lar və həqiqətən də genomun əhəmiyyətli dərəcədə gücləndirilmiş və ya silinmiş bölgələri birdən çox onkogen və ya şiş supressor geninə yayıla bilər. Digər əhəmiyyətli bölgələrdə onkogenlər və ya şiş bastırıcı genlər olmaya bilər, lakin onların hədəf geninə yaxınlığı səbəbindən aydın əhəmiyyətə malikdir. Beləliklə, müstəqil əhəmiyyətli bölgələri müəyyən etmək üçün genom miqyasında qiymətləndirmədən sonra əlavə bir addım tələb olunur.

GISTIC 1.0 bu problemi hər bir xromosomda maksimal zirvəyə bütün SCNA-ları acgözlüklə təyin edən, onları məlumatlardan silən və heç bir qalan bölgə əhəmiyyət həddini keçməyincə yenidən hesablayan iterativ “sökülmə” alqoritmindən istifadə etməklə bu problemi həll edir. Bu yanaşma əvvəllər müəyyən edilmiş əhəmiyyətli bölgələrə yaxın olan ikinci dərəcəli zirvələri müəyyən etmək gücünü azaldır (Şəkil 4a). Bununla belə, ayrı-ayrı SCNA-ların bir çox sürücü bölgələrinə təsir göstərməsi mümkün olduğundan, daha az acgöz yanaşma saxta kəşf dərəcəsini əhəmiyyətli dərəcədə artırmadan əlavə zirvələri müəyyən edə bilər.

İkinci dərəcəli sürücü hadisələrini aşkar etmək üçün soyma həssaslığı. Standart soyma metodundan (mavi xətt) və ya arbitraj soymadan (qırmızı xətt) istifadə etməklə GISTIC tərəfindən müstəqil (əsas sürücü olmayan) piklərdə bərpa edilən ikinci dərəcəli sürücü hadisələrinin orta hissəsi iki simulyasiya edilmiş verilənlər dəsti üçün göstərilir. (a) Məlumat 300 nümunə üzrə 1000 simulyasiya edilmiş xromosomdan götürülüb, nümunələrin 10%-də əsas sürücü hadisəsi, 5%-də isə müəyyən bir məsafədə olan ikincil sürücü hadisəsi mövcuddur. (b) Məlumatlar 300 nümunə üzrə 10.000 simulyasiya edilmiş xromosomdan əldə edilib, nümunələrin 10%-də əsas sürücü hadisəsi və nümunələrin 5%-ində ikincil sürücü hadisəsi mövcuddur, burada əsas sürücü hadisəsi ilə üst-üstə düşən ikinci dərəcəli sürücü hadisələrinin hissəsi dəyişilir. 100% (uzaq solda tam asılılıq) və 0% (tam müstəqillik ən sağda) arasında. Səhv çubuqları ortanın orta ± standart xətasını əks etdirir (bəziləri görünmək üçün çox kiçikdir).

Buna görə də, SCNA-ların birdən çox zirvəyə ("arbitrajlı soyulma") töhfə verməsi üçün metodu dəyişdirdik. Biz ilk növbədə tamahkarlıqla SCNA-nın bütün xalını əhatə etdiyi ən əhəmiyyətli zirvəyə təyin edirik. Bununla belə, sonrakı addımlarda ehtimal olunan bölgənin əhəmiyyətli olub-olmadığına qərar verməzdən əvvəl əvvəllər təyin edilmiş seqmentlərin xallarının yenidən bölüşdürülməsinə icazə veririk (Əlavə fayl 1-də Əlavə Metodlar). Orijinal alqoritm kimi, heç bir bölgədə əhəmiyyət həddini aşan düzəliş edilmiş xal olmadıqda proses başa çatır. GISTIC-in oxşar modifikasiyası bu yaxınlarda təklif edilmişdir [37].

Arbitrajlı soyma orijinal alqoritmdən daha həssasdır (Əlavə fayl 8-də Şəkil 4a Əlavə Cədvəl S3). Biz hər biri 300 nümunədən ibarət 10.000 simulyasiya edilmiş verilənlər toplusu yaratdıq, hər bir xromosomda nümunələrin 10%-də əsas sürücü hadisəsi və nümunələrin 5%-də ikinci dərəcəli sürücü hadisəsi var. İlkin sürücü pikini üst-üstə düşən ikinci dərəcəli sürücü hadisələrinin faizini 0% ilə 100% arasında dəyişdiyimiz üçün ikinci dərəcəli piki aşkar etmək üçün standart və arbitrajlı soyulmanın həssaslığını təhlil etdik (Əlavə fayl 1-dəki Əlavə Metodlar). 0% üst-üstə düşür, iki üsul ikinci dərəcəli zirvənin müəyyən edilməsində təxminən eyni dərəcədə həssas idi. Bununla belə, arbitrajlı soyma standart soyma ilə müqayisədə xeyli daha həssas idi, çünki biz ilkin və ikincili zirvələr arasında üst-üstə düşmə dərəcəsini 5-dən 50%-ə qədər artırdıq (Şəkil 4b), orta hesabla 2,4 dəfə (1,2-3,8 diapazonu) bərpa etdik. ikinci dərəcəli zirvələr. Arbitrajlı soyma yolu ilə müəyyən edilmiş yeni zirvələrin 80%-dən çoxu faktiki simulyasiya edilmiş sürücü pikinə uyğundur və bu, artan həssaslığın yüksək spesifikliklə müşayiət olunduğunu nümayiş etdirir.

Birincili və ikincili zirvələr üst-üstə düşmə 50%-dən yuxarı olduqda birləşir və bu iki üsul arasında hər hansı nəzərəçarpacaq fərqi gizlədir (Əlavə Şəkil 9-da Əlavə Şəkil S5). Həqiqətən də, heç bir üsul üst-üstə düşmə faizi 80%-dən yuxarı qalxdıqdan sonra ikinci dərəcəli zirvəni müstəqil olaraq müəyyən etməyə qadir deyildi. Bu simulyasiyalar həm arbitrajlı soyulmanın üstün həssaslığını, həm də qonşu sürücülərin müəyyən edilməsinin çətinliyini nümayiş etdirir.

Hər bir əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirilmiş bölgə üçün hədəf genlərin lokallaşdırılması

GISTIC boru kəmərində son addım SCNA-nın hər bir müstəqil əhəmiyyətli bölgəsi üçün hədəflənən gen və ya genləri ehtiva etmə ehtimalı yüksək olan bölgəni müəyyən etməkdir (“pik bölgə”). Standart yanaşma, üst-üstə düşmənin minimal ümumi bölgəsinə (MCR) diqqəti yönəltməkdir (Şəkil 5a), ən çox sayda nümunədə dəyişdirilən və buna görə də hədəf genləri ehtiva edən ən çox ehtimal edilən bölgə. Bununla belə, hədəf geninə bitişik, lakin üst-üstə düşməyən bir və ya daha çox sərnişin SCNA-sı həqiqi hədəfi daxil etməyən MCR ilə nəticələnə bilər. Bu, xüsusilə sürücü hadisəsinin tezliyi aşağı olduqda tez-tez baş verir (< 5% Şəkil 5b). Alternativ üsul (GISTIC 1.0 tərəfindən istifadə olunur) hər bir zirvə bölgəsinin sərhədlərini müəyyən etmək üçün evristik 'çıxmaq' prosedurunu tətbiq etməkdir (Şəkil 5a) [15]. Bu prosedur, k-yə qədər sərnişin SCNA-nın (adətən, k = 1) pik bölgənin hər bir sərhədini anormal şəkildə müəyyən edə biləcəyini nəzərdə tutur. 'Çıxış-k-çıxarma' proseduru hədəf geni MCR-dən daha tez-tez düzgün müəyyənləşdirsə də (Şəkil 5b), o, 'k' sərbəst parametri tərəfindən təqdim edilən həddindən artıq uyğunlaşma potensialından əziyyət çəkir. Üstəlik, 'çıxmaq' dəqiqliyi nümunələrin sayından və sözügedən hadisənin tezliyindən asılı olaraq dəyişir. Sabit k üçün, sürücü tezliyinin artması üçün "tərk etmə" həssaslığı artır (Şəkil 5b) və nümunə ölçüsünü artırmaq üçün azalır (Şəkil 5c).

Pik tapma alqoritmlərinin həssaslığı. (a) Müxtəlif pik tapma üsullarını nümayiş etdirən sxematik diaqram. Sol panel xromosoma təsadüfi səpələnmiş qeyd olunan hədəf geni və sərnişin hadisələrini əhatə edən sürücü hadisələrinin qarışığını ehtiva edən simulyasiya edilmiş xromosom üçün GISTIC xal profilini göstərir. Sağdakı daxiletmə maksimal G-hesabının ətrafındakı bölgəni (sol paneldəki boz qutu) daha ətraflı şəkildə göstərir. MCR (qırmızı nöqtəli xətlər) maksimum seqmentin üst-üstə düşmə bölgəsi və ya ən yüksək G-balı olan bölgə kimi müəyyən edilir.Çıxarma proseduru (göy nöqtəli xətlər, burada k = 1 üçün göstərilir) hər bir nümunəni növbə ilə tərk etdikdən sonra MCR-nin təkrar hesablanması və sol və sağ sərhədlər kimi MCR-nin minimal və maksimal həcmini götürməklə əldə edilir. RegBounder, sərhəd və maksimal pik xal arasındakı fərqin yerli diapazon paylanmasının gth faizində olduğu bölgəni (nöqtəli yaşıl xətt) tapmağa çalışır (Əlavə fayl 1-də Əlavə Metodlar). Burada RegBounder ya MCR və ya tərk-k-out prosedurlarından daha geniş bir bölgə istehsal edir, lakin sərhədi əsl sürücü genini ehtiva edən yeganə üsuldur. (b,c) Pik bölgədə olan sürücü hadisələrinin orta hissəsi (10 Mb ərzində GISTIC pikinin tapılması şərti ilə) MCR (qırmızı), buraxılış üçün sürücü tezliyi (b) və ya nümunə ölçüsü (c) funksiyası kimi qurulur. 1-çıxış (mavi) və RegBounder alqoritmləri (sonuncu müxtəlif etibarlılıq səviyyələrində: 50%, magenta 75%, yaşıl 95%, qara). (b) bəndində məlumatlar sürücü tezliyinin 1-dən 10%-ə qədər dəyişdiyi 500 nümunə üzrə 10.000 simulyasiya edilmiş xromosomdan əldə edilir. (c) bəndində məlumat sürücü tezliyinin 5%-də sabit olduğu dəyişkən sayda nümunələr üzrə 10.000 simulyasiya edilmiş xromosomdan əldə edilir. Səhv çubuqları ortanın orta ± standart xətasını təmsil edir (bəziləri görünmək üçün çox kiçikdir).

Hadisə tezliyindən və tədqiq olunan nümunələrin sayından asılı olmayaraq, hədəf genlərin əvvəlcədən müəyyən edilmiş etimad səviyyəsinə daxil ediləcəyi şəkildə pik bölgənin sərhədlərini müəyyən etmək üçün yeni bir yanaşma ("RegBounder" adlanır) inkişaf etdirdik (Şəkil 5a Əlavə). Əlavə fayldakı üsullar 1). RegBounder hər hansı verilmiş pəncərə ölçüsü daxilində G-ballarında gözlənilən təsadüfi dəyişməni modelləşdirir və bu paylanmadan zamanın ən azı γ%-də həqiqi sürücünü ehtiva edən güvən bölgəsini müəyyən etmək üçün istifadə edir, burada γ arzu olunan güvən səviyyəsidir. Hər bir bölgəni müəyyən etmək üçün bir və ya bir neçə seqment sərhədindən yüksək dərəcədə asılı olan MCR və 'çıxmaq' prosedurlarından fərqli olaraq, RegBounder təsadüfi səhvlərə (texniki artefaktlara və ya sərnişin seqmentlərinə görə) nisbətən davamlı olmaq üçün nəzərdə tutulmuşdur. sərhəd tapşırığı. Real məlumatlara tətbiq edildikdə, RegBounder yerli səs-küyün artdığı bölgələrdə (Şəkil 6a) məlum sürücü genlərini "1-çıxış" (və MCR) ilə müqayisədə daha effektiv şəkildə ələ keçirir və bununla belə, "1-çıxış" ilə müqayisədə daha dar sərhədlər yarada bilir. ' az səs-küy olan bölgələrdə (Şəkil 6b).

RegBounder-in MCR ilə müqayisəsi və birincil ağciyər adenokarsinomalarına tətbiq edilən tərk-1-out prosedurları. RegBounder-in əvvəlki pik tapma prosedurları ilə müqayisədə üstünlükləri Affymetrix 250K StyI SNP massivində ([16]-da dərc edildiyi kimi) xarakterizə olunan 371 ağciyər adenokarsinoma nümunəsinin GISTIC analizində müəyyən edilmiş iki yaxşı təsvir edilmiş onkogen zirvəsi üçün təsvir edilmişdir. (a) Yaxşı təsvir edilmiş gücləndirmə zirvəsi 12p12.1 xromosomunda məlum ağciyər xərçəngi onkogeninə yaxın, lakin tərkibində olmayan MCR (qırmızı nöqtəli xətlər) ilə müəyyən edilir. KRAS. Bu bölgədə ikidən çox aydın sərnişin hadisəsi olduğundan, 1-dən çox pik (mavi nöqtəli xətlər) yoxdur KRAS. Bununla belə, RegBounder (yaşıl nöqtəli xətlər) tutan daha geniş zirvə yaradır KRAS. (b) 5p15.33 xromosomunda gücləndirmə pikini ehtiva edir hTERT, insan telomeraz holoenziminin katalitik alt bölməsi, MCR daxilində (qırmızı nöqtəli xətlər). Bu halda, RegBounder (yaşıl nöqtəli xətlər) müvafiq tərk-1-çıxış zirvəsindən (mavi nöqtəli xətlər) daha dar bir pik bölgəsi yaradır və RegBounder-in pik bölgə ölçüsü və dəqiqlik arasında daha böyük tarazlığa nail olmaq qabiliyyətini nümayiş etdirir. Hər iki (a) və (b), y oxu gücləndirmə G-hesabını, x oxu isə müvafiq xromosom boyunca mövqeyi göstərir.

Simulyasiya edilmiş məlumat dəstlərində RegBounder-in performansı geniş diapazonlu sürücü SCNA tezlikləri (Şəkil 5b) və nümunə ölçüləri (Şəkil 5c) üzrə ardıcıl idi və həqiqətən də sürücünün daxil olma ehtimalına nəzarət edirdi. RegBounder, müvafiq olaraq 50, 75 və 95% arzuolunan güvən səviyyəsi (γ) ilə işləyərkən müxtəlif tezlikli sürücü bölgələrinin orta hesabla 72%, 85% və 95%-də əsl sürücü genini tutdu. Nümunə ölçüsü, sürücü tezliyi və γ birləşmələri üçün RegBounder-in orta dəqiqliyi γ-dan aşağı düşdü.

RegBounder həmçinin MCR və ya 'çıxmaq' yanaşmalarından fərqli olaraq pik bölgə həssaslığı (hədəf genin daxil olma ehtimalı) və spesifiklik (əlavə genlərin sayı) arasında daha optimal uyğunlaşma nümayiş etdirdi. Pik bölgələrin orta ölçüsü hər üç yanaşma üçün sürücü tezliyi (Şəkil 7a) və nümunə ölçüsü (Şəkil 7b) artdıqca azalır. Bununla belə, RegBounder bu dəyişənlərə digər üsullara nisbətən daha həssasdır, belə ki, RegBounder pik bölgələri (75% etibarla) 'çıxmaq-çıxmaq' pik bölgələrindən orta hesabla 90 dəfə böyük ola bilər (az məlumat dəstləri üçün) Hədəf gen yerlərinin həqiqətən qeyri-müəyyən olduğu ümumi sürücü hadisələri 'çıxmaq' prosedurundan 37%-ə qədər kiçikdir (bir çox ümumi sürücü hadisəsi olan məlumat dəstləri üçün). Beləliklə, RegBounder-in artan inamı hətta 'çıxmaq' prosedurundan daha dar bölgələr istehsal edərkən əldə edilə bilər.

Pik tapma alqoritmlərinin spesifikliyi. (a,b) MCR (qırmızı), tərk-1-out (mavi) və RegBounder (yaşıl, 75% etibarlılıq) tərəfindən istehsal olunan pik bölgələrin median ölçüsü sürücü tezliyi (a) və nümunə ölçüsü (b) funksiyası kimi göstərilir. . (a) bəndində məlumatlar sürücü tezliyinin 1-10% arasında dəyişdiyi 500 nümunə üzrə 10.000 simulyasiya edilmiş xromosomdan əldə edilir. (b) bəndində məlumat sürücü tezliyinin 5%-də sabit olduğu dəyişkən sayda nümunələr üzrə 10.000 simulyasiya edilmiş xromosomdan əldə edilir. (c) RegBounder (yaşıl xətt) tərəfindən əldə edilən pik bölgə ölçülərinin, oxşar etibarlılıq səviyyəsinə malik istənilən pik tapma alqoritmi ilə əldə edilə bilən nəzəri olaraq minimal pik bölgə ölçüləri (qara xətt) ilə müqayisəsi (Əlavə fayl 1-də Əlavə Metodlar). Səhv çubuqları ortanın orta ± standart xətasını təmsil edir (bəziləri görünmək üçün çox kiçikdir).

RegBounder, həmçinin MCR və 'çıxmaq' metodlarından daha çox məlumat dəstləri arasında daha ardıcıldır. Biz TCGA GBM dəstini təsadüfi olaraq iki qrupa ayırdıq və RegBounder və MCR tərəfindən istehsal olunan pik bölgələri və hər birində "çıxmaq" prosedurlarını müqayisə etdik. Yalnız hər iki məlumat dəstində GISTIC tərəfindən müəyyən edilmiş zirvələri nəzərə alsaq, MCR-lərin yalnız 23%-i və “çıxmaq-çıxmaq” pik bölgələrinin 31%-i iki məlumat dəsti arasında üst-üstə düşür ki, bu da bu regionların təyin olunduğu aşağı inamı əks etdirir. Əksinə, RegBounder pik bölgələrinin əksəriyyəti (53%) (75% etibarla) gözlənildiyi kimi üst-üstə düşür (0,75 2 = 56%). Bu artan üst-üstə düşmə RegBounder zirvə rayonlarının (370 kb) tərk-k-out (163 kb) və ya MCR (115 kb) pik bölgələri ilə müqayisədə yalnız bir qədər artmış median ölçüsü ilə baş verdi.

RegBounder bölgələri, geniş diapazonlu sürücü tezlikləri (Şəkil 7c) və etibarlılıq səviyyələri (Əlavə fayl 10-da Əlavə Şəkil S6) üçün nəzəri olaraq minimal pik bölgə ölçüsündən orta hesabla cəmi 19% böyükdür. Bu nəzəri cəhətdən minimal pik bölgə ölçüləri simulyasiyalarımızda hədəf gen və MCR arasındakı məsafələrin paylanmasından əldə edilmişdir (Əlavə fayl 1-də Əlavə Metodlar). Bizim simulyasiyalarımız göstərir ki, RegBounder eyni vaxtda daha çox hədəf gen geri çağırılmasına nail olmaqla “tərk et” yanaşmasından daha kiçik pik bölgələr yaratmağa qadirdir (Şəkil 5b və 7a “RegBounder 75%” ilə “1-çıxar” ilə müqayisə edin. sürücü tezlikləri > 5%). Beləliklə, RegBounder əvvəlki evristik yanaşmalara nisbətən statistik inam və pik həlli arasında daha optimal uyğunluğu nümayiş etdirən pik bölgə sərhədinin təyini üçün güclü alqoritmdir.

Mənbə kodu və modulun mövcudluğu

GISTIC2.0 boru kəməri üçün MATLAB mənbə kodu, əvvəlcədən tərtib edilmiş unix icraedici faylı ilə birlikdə [38] ünvanında yükləmək üçün əlçatan olacaq. Bundan əlavə, bütün boru kəmərinə [39] ünvanında GenePattern analiz portalı vasitəsilə daxil olmaq olar.

Bu əlyazmada təsvir edilən bütün metodoloji təkmilləşdirmələrə əlavə olaraq, GISTIC2.0 mənbə kodu seqmentləşdirilmiş surət nömrəsi məlumatlarının saxlanmasında yaddaşdan səmərəli istifadə etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur (Əlavə fayl 1-də Əlavə Metodlar). Bu təkmilləşdirilmiş yaddaş səmərəliliyi məhdud hesablama resursları olan istifadəçilərə tipik ölçülü verilənlər bazalarında GISTIC2.0-ı işlətməyə imkan verməlidir və surət nömrəsini ölçən platformaların sıxlığı sürətlə artmağa davam etdiyi üçün bütün istifadəçilər üçün getdikcə daha vacib olacaq.


  • Bir neçə fərqli başlanğıc materialdan DNT-nin çıxarılması üçün təlimat verən bir sıra laboratoriya məşqləri. Məşq 6-12-ci siniflər üçün nəzərdə tutulub.

Aşağıdakı mənbələrə əvvəlcə biologiya elmləri təhsili üçün Milli Elm Rəqəmsal Kitabxanası (NSDL) yolu olan BioSciEd Net (BEN) rəqəmsal resurslar kolleksiyası vasitəsilə daxil olub. Daha çox tədris resursları üçün axtarış edilə bilən verilənlər bazasından istifadə etmək üçün BEN-ə baş çəkin. BEN-dən istifadə etmək pulsuzdur, lakin qeydiyyat tələb olunur.

    - AccessExcellence-dən olan bu laboratoriya tələbələrə elm adamlarının istifadə etdiyi eyni əsas alət və metodlardan istifadə edərək xromosom DNT-ni asanlıqla təcrid etməklə DNT ilə konkret işləməyə imkan verir. - bu Science NetLinks vebsaytı DNT hasilatı prosesini modelləşdirməklə DNT anlayışını inkişaf etdirən dərs planları təqdim edir.
  • [link https://web.archive.org/web/20190222033127/http://www.apsnet.org/edcenter/K-12/TeachersGuide/DNA_Easy/Pages/default.aspx 'DNA the Easy Way (və Gram) Stain Without the Mess)'] - Amerika Fitopatologiya Cəmiyyəti tərəfindən hazırlanan bu resurs tələbələrə bakteriya hüceyrələrindən DNT-nin təcrid edilməsi prosedurlarını öyrədən qısa laboratoriya məşqidir. Bundan əlavə, tələbələr bakterial izolatların Qram boyama reaksiyasını təyin etməyi öyrənirlər. : Bu Access Excellence resursu tələbələrin qondarma cinayəti törədəni müəyyən etmək üçün DNT barmaq izi analizindən istifadə etdiyi laboratoriya fəaliyyətini təmin edir. - Bu resurs baxmaq üçün sizdən BEN-ə daxil olmanızı tələb edir (bunun üçün pulsuz olan BEN-ə abunə olmaq lazımdır). Bu PDF sənədi, tələbələrin öz saçlarından DNT barmaq izlərini yaratmaq üçün polimeraza zəncirvari reaksiyadan istifadə etdikləri molekulyar biologiya və kenetika üzrə bakalavr laboratoriya məşğələsinin aparılması üçün protokolların və təlimat məlumatlarının ətraflı təlimatını təklif edir. Buraya tələbə konturları, təlimatçının qeydləri və laboratoriya hesabatları üçün təklif olunan suallar daxildir.

Haqqında

Yenidən istifadə

Aşağıda başqa cür qeyd edilmədiyi təqdirdə bu səhifədəki materiallar Creative Commons lisenziyası əsasında təklif olunur.


Biologiya/DNT

Mücərrəd

Həm DNT hasilatı, həm də DNT-nin kəmiyyəti etibarlı və keyfiyyətli nəticələr əldə etmək üçün məhkəmə işində mühüm addımlardır. DNT ekstraksiya üsullarında axtarılan əsas xüsusiyyətlərə DNT-nin yüksək bərpası, çirkləri və inhibitorların çıxarılması və yüksək məhsuldarlıqlı emal daxildir. Bu tələbləri ödəmək üçün müxtəlif strategiyalar hazırlanmışdır. Hal-hazırda, məhkəmə laboratoriyalarında ən çox yayılmış DNT ekstraksiyasının təsdiqlənmiş üsulları üç strategiyaya qruplaşdırıla bilər: üzvi ekstraksiya, bərk fazalı DNT ekstraksiya üsulları və ion xelatlaşdırıcı qatranlar. Bu məqalə boyu əsas prinsiplər, xüsusi prosedurlar, avtomatlaşdırılmış hasilat sistemləri və yeni irəliləyişlər təsvir edilmişdir. Optimal şəraitdə polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) multipleksini həyata keçirmək üçün adekvat DNT daxilolmasını qiymətləndirmək üçün insan nüvə DNT-sinin dəqiq kəmiyyəti məhkəmə DNT tipləmə laboratoriyaları üçün keyfiyyət təminatı standartlarının tələbidir. Həssas PCR real vaxt analizlərinə əsaslanan məhkəmə laboratoriyalarında nüvə DNT-nin qiymətləndirilməsi üçün ən son kimyalar bu məqalədə əhatə olunur. Bu təsdiqlənmiş real vaxt prosedurları yalnız ümumi DNT-nin kəmiyyətini deyil, həm də DNT ekstraktının digər faydalı məlumatlarını təklif edir: PCR inhibitorlarının olması, DNT-nin deqradasiyası, cinsin təyini və ya kişi/qadın qarışıqlarında kişi komponentinin nisbətinin kəmiyyətcə qiymətləndirilməsi. Nəhayət, PCR real vaxt gücləndirilməsində və ya nüvə DNT hədəfləri ilə birlikdə müxtəlif bölgələrin tək hədəf kimi istifadəsinə əsaslanan mitoxondrial DNT-nin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün müxtəlif yanaşmalar da araşdırılır.


3. Nəticələr və müzakirə

3.1. Birbaşa zülalın təyini

Amin turşularının təhlili

Amin turşusu analizi zülal təyini üçün analitik prinsiplərdən biridir. Burada zülallar peptid bağlarının hidrolizi ilə onların tərkib amin turşularına parçalanır. Daha sonra sərbəst buraxılmış amin turşusu qalıqları, əksər hallarda xromatoqrafik olaraq müəyyən edilir və zülal tərkibi H-nin molekulyar kütləsi çıxarıldıqdan sonra fərdi amin turşusu qalıqlarının cəmi kimi hesablanır.2O. Bu metodun əsas çatışmazlıqlarından biri analizdən əvvəl zülalın hidrolizidir. Ən çox yayılmış üsul, Moore və Stein [12] tərəfindən təsvir edildiyi kimi, 6 M HCl-də 110 ºC-də 24 saat ərzində hidrolizdir. Bu prosedur peptid bağlarının əksəriyyətini effektiv şəkildə hidroliz edir, lakin eyni zamanda bəzi amin turşularının tərkibi azalır və ya hətta tamamilə məhv edilir [19] və beləliklə, bu üsulla təhlil edilən zülalın tərkibi lazımi səviyyədə qiymətləndirilə bilər. Bu metodun başqa bir çatışmazlığı investisiya və təhlillə bağlı xərclərdir. Bu, üsulu bir çox qida elmi laboratoriyaları üçün əlçatmaz edir. Amin turşusu analizi zülalın tərkibini birbaşa təyin edən yeganə zülal analiz metodu olduğuna görə (yalnız amin turşusu qalıqlarına əsaslanaraq və müdaxilə edən maddələrin nəticələrə təsir etmədiyi hallarda) bu tədqiqatda istinad metodu kimi bu metoddan istifadə edilməsi qərara alınmışdır. bunun nəticələri ilə digər təhlillər. Bu, həmçinin BMT-nin Ərzaq və Kənd Təsərrüfatı Təşkilatının (FAO) qida zülallarının təyini ilə bağlı verdiyi tövsiyələrə uyğundur [20].

3.2. Dolayı zülalın təyini

3.2.1. Azotun təyin edilməsinə əsaslanan zülal tərkibi

Qida zülalının təyini üçün ən çox istifadə edilən üsullardan bəziləri nümunələrdə ümumi azot miqdarının təhlilinə əsaslanır. Belə üsullara misal olaraq Dumas metodunu [21] və Kjeldahl metodunu [15] göstərmək olar. Hər iki üsulda nümunədəki ümumi azot yüksək temperaturda sərbəst buraxılır. Kjeldahl metodunda azot güclü turşuya buraxılır və neytrallaşdırma və titrləmədən sonra tərkibi ölçülür. Dumas metodunda azot qaz halında ayrılır və karbon qazı və su aerozolları çıxarıldıqdan sonra istilik keçiriciliyi detektoru ilə təyin edilir. Bu tədqiqatda bu analitik prinsipin nümunəsi kimi Kjeldahl metodu seçilmişdir, çünki o, hələ də AOAC İnternational [14] tərəfindən qida zülalının təyini üçün rəsmi üsul kimi tanınır. Azotun təyinindən sonra xam zülalın tərkibi konversiya əmsalı ilə hesablanır. Orijinal və hələ də tez-tez istifadə edilən çevrilmə əmsalı 6.25, qida zülallarında ümumi azot miqdarının 16% olması və qidalardakı bütün azotun zülala bağlı olması fərziyyəsinə əsaslanır. Bununla belə, nisbi azot miqdarı amin turşuları arasında, amin turşusu tərkibi isə qida zülalları arasında dəyişdiyi üçün bunlar olduqca kobud fərziyyələrdir [22]. Bundan əlavə, nitrat, ammonyak, sidik cövhəri, nuklein turşuları, sərbəst amin turşuları, xlorofillər və alkaloidlər kimi digər birləşmələrin geniş spektrində azot var. Bu birləşmələr qeyri-zülal azot adlanır və onların nisbi məzmunu çox vaxt tərəvəzlərdə heyvan mənşəli qidalardan daha yüksək olur [5]. İllər boyu sübut edilmişdir ki, 6.25-ə çevrilmə əmsalı əksər hallarda zülal tərkibini çox qiymətləndirir və bu variasiyaları tənzimləmək üçün bir neçə növə xas çevrilmə faktoru təklif edilmişdir [6,7,16,22]. azotdan proteinə çevrilmə daha dəqiqdir.

3.2.2. Amin turşularının təhlili və Kjeldahl metodu arasında müqayisə

Cədvəl 1-də xammalın amin turşusu analizinin və Kjeldahl analizinin nəticələri göstərilir. Həm ənənəvi çevrilmə əmsalı 6,25, həm də müvafiq növə xas çevrilmə əmsalı təqdim olunur. Balıq, karides və un üçün bu hesablamalarda istifadə edilən növə xas faktorlar Mariotti və digərlərinin təklif etdiyi orta çevrilmə faktorları idi. [7], yəni balıq və karides üçün 5,6 və dənli bitkilər üçün 5,4. Dulse üçün istifadə edilən çevrilmə faktoru Louren və digərləri tərəfindən təklif olunan amildir. [16] qırmızı yosunlar üçün orta hesabla, yəni 4,59.

Cədvəl 1

Morina, qızılbalıq, karides, ağ və tam buğda unu və dulsenin (qırmızı dəniz yosunu) amin turşusu analizindən və Kjeldahl azot analizindən zülal tərkibi.

Xammal
NövlərAmin turşularının təhliliKjeldahl (faktor 6.25)Kjeldahl (Növlərə Xüsusi Faktorlar)
Cod111,6 ± 9,1 a 185,7 ± 15,0 b 166,4 ± 13,4 b (5,6)
qızılbalıq121,4 ± 6,3 a 208,1 ± 7,3 c 186,5 ± 6,6 b (5,6)
Karides83,8 ± 8,6 a 132,7 ± 4,7 c 117,8 ± 4,4 b (5,6)
Ağ un (buğda)77,9 ± 6,5 a 117,6 ± 7,3 c 101,6 ± 6,3 b (5,4)
Bütün un (buğda)88,2 ± 3,8 a 133,4 ± 7,8 c 115,3 ± 6,8 b (5,4)
Dulse (qırmızı dəniz yosunu)105.3 ± 9.1 a 152,1 ± 10,0 b 111,7 ± 7,3 a (4,59)

Kjeldahl analizi üçün istifadə edilən çevrilmə əmsalları unlar üçün 5,4, balıq və karides üçün 5,6 və dəniz yosunu üçün 4,59 [15] üçün ümumi istifadə edilən çevrilmə əmsalı 6,25 və növə xas çevrilmə əmsalı (mötərizədə) dir. Dəyərlər orta dəyər ± standart sapma (SD) kimi bildirilir (n = 5) və g protein kq 𢄡 xammal. Eyni cərgədə müxtəlif hərflər hər növ daxilində analizlər arasında əhəmiyyətli fərqləri göstərir.

Gözlənildiyi kimi, ənənəvi çevrilmə amilindən istifadə edən bütün Kjeldahl nəticələri müvafiq amin turşusu analizi nəticələrindən əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olub, 44%-dən 71%-ə qədər yüksək olub. Daha təəccüblüdür ki, qırmızı yosunlar istisna olmaqla, növə xas çevrilmə faktorları da amin turşusu analizindən əhəmiyyətli dərəcədə yüksək protein tərkibi verdi. Mümkün izahatlardan biri nümunədəki bəzi amin turşularının konsentrasiyasının amin turşusu analizindən əvvəl hidroliz prosesi nəticəsində azaldılması və bu analizdən hesablanmış zülal konsentrasiyasının əslində düzgün qiymətləndirilməməsi ola bilər. Başqa bir mümkün izahat ola bilər ki, bu növlər üçün “creal” çevrilmə faktorları əslində Mariotti və digərlərinin bildirdiyi orta dəyərlərdən də aşağı olmalıdır. [7]. Bu tədqiqatın nəticələrinə əsasən çevrilmə əmsallarının hesablanması müvafiq olaraq balıq və karides üçün 4,9 və un üçün 4,7 əmsal verdi.

Azotdan zülalın hesablanması və nəticədə protein tərkibinin həddən artıq qiymətləndirilməsi ilə bağlı risklər var.Bunlardan biri qidanın saxtalaşdırılması ehtimalıdır, çünki yüksək protein tərkibi çox vaxt məhsulun iqtisadi dəyərini artırır [23]. Bəzi hallar olub ki, istehsalçı qida məhsulunun görünən protein tərkibini [24] və sonradan iqtisadi dəyərini artırmaq üçün melamin kimi qeyri-zülal azotu əlavə edib. Bu, istehlakçılar üçün qida təhlükəsizliyini poza bilər və buna görə də bu cür qida saxtakarlığının qeyri-mümkün olması vacibdir. Digər risk odur ki, yeni xammalın istifadə potensialı və iqtisadi məqsədəuyğunluğu həddindən artıq qiymətləndirilə bilər, çünki zülal məhsulda əlavə dəyər potensialına malik komponentlərdən biridir. Beləliklə, həddindən artıq qiymətləndirmə yeni sənaye sahələrinin yaradılması üçün yanlış əsaslar verə bilər. Məsələn, son onilliklərdə dəniz yosunlarının sənaye istifadəsinə marağı xeyli artmışdır. Bir sıra tədqiqatlar bəzi qırmızı dəniz yosunu növlərinin zülal tərkibini 30% [25,26] təqdim etdi, halbuki amin turşusu analizi ilə təhlil edildikdə, adətən 10% ilə 20% arasında dəyişir [11,27,28]. Belə bir fərq kiçik sənayelərin iqtisadiyyatı üçün həlledici ola bilər.

3.2.3. Spektrofotometrik üsullar və zülalların çıxarılması

Protein analizi üçün üçüncü ümumi analitik texnika spektrofotometriyadır. Burada prinsip ondan ibarətdir ki, zülalın tərkibindəki funksional qruplar və ya bölgələr elektromaqnit spektrinin ultrabənövşəyi və ya görünən diapazonunda (200 º2013800 nm) işığı udurlar. Bu absorbans oxunur və məlum protein standartları ilə müqayisə edilir. Belə funksional qruplara və ya bölgələrə misal olaraq əsas qruplar, aromatik qruplar, peptid bağları və ya yığılmış zülalları göstərmək olar.

Həm azot analizi, həm də amin turşusu analizi xammalın heç bir ilkin təmizlənməsi olmadan həyata keçirilə bilsə də, materialı spektrofotometrik analizə təqdim etməzdən əvvəl zülalların çıxarılması ilkin şərtdir. Protein çıxarılması üçün də mövcud üsullar çoxdur. Ən çox yayılmış zülal çıxarma protokolları toxumanın zəif tamponlara və ya suya məruz qalmasına əsaslanır ki, bu da yaranan hipotonik şoka cavab olaraq hüceyrədaxili zülalların sonradan sərbəst buraxılması ilə hüceyrələrin dağılmasına səbəb olur. Bu, hüceyrə divarları olmayan hüceyrələr (heyvan hüceyrələri) olan toxumalar üçün çox effektivdir, lakin hüceyrə divarları olan hüceyrələr (bitki hüceyrələri) üçün effektiv deyil. Sonuncu, hüceyrəni çökməyə qarşı qoruyan hüceyrə divarları ilə bağlıdır [29]. Bu araşdırmada bu fərqləri qiymətləndirmək üçün həm heyvan mənşəli protein mənbələri, həm də bitki mənşəli protein mənbələri daxil edilmişdir.

Ən çox yayılmış zülal çıxarma üsullarından, xüsusən də elektroforezdən əvvəl, Good's tamponları adlanan, ilk dəfə 1966-cı ildə Good et al tərəfindən təsvir edilmiş bir sıra tamponların istifadəsidir. [8]. Bu tamponların tərkibində bir və ya bir neçə yuyucu vasitə ilə birlikdə zwitterion xassələri olan kimyəvi maddələr var və bioloji analizlərə yüksək dərəcədə uyğun olduğu bilinir. Onlar suda yüksək dərəcədə həll olurlar, duz təsirləri azdır və bioloji funksiyalara minimal müdaxilə edirlər [10]. Bu protokolların əsas çatışmazlığı ondan ibarətdir ki, onlar bir neçə bahalı kimyəvi maddəni ehtiva edir və bəzi kimyəvi maddələrin sağlamlığa ziyan vurduğundan şübhələnirlər. Bu işdə HEPES (zwitterion agent) və CHAPS (yuyucu) qarışığı bu prinsipə nümunə olaraq seçilmişdir.

Zülallar həll olma xüsusiyyətlərinə görə çox vaxt dörd əsas sinfə bölünür. Dörd sinif suda həll olunan albuminlər, zəif ion məhlullarında həll olunan qlobulinlər, zəif turşu və ya əsas məhlullarda həll olunan glutelinlər və 70% etanolda həll olunan prolaminlərdir. Əksər qidalar mürəkkəb matrislərdir, ehtimal ki, bu zülal siniflərindən bir neçəsini özündə cəmləşdirir və bir neçə məhlulun birləşməsi hasilatın məhsuldarlığını optimallaşdıra bilər. Mæhre et al. [9] göstərildi ki, H2O, 0.1 M NaOH və 3.5% NaCl yüksək temperaturda ənənəvi ekstraksiya üsulları ilə müqayisədə ekstraksiya məhsuldarlığını artırdı və buna görə də bu üsul bu tədqiqatda daha sadə zülal çıxarma metoduna nümunə kimi seçildi.

Cədvəl 2-də iki müxtəlif ekstraksiya üsulunun hasilatı amin turşusu analizindən sonra hesablanmış müvafiq xammala nisbətən zülal tərkibi kimi təqdim olunur. Göründüyü kimi, HEPES/CHAPS protokolundan istifadə edərək zülalların çıxarılması kifayət qədər səmərəsiz idi və nəticədə bütün xammallar üçün çox aşağı məhsuldarlıq əldə edilmişdir. Duz/qələvi ekstraksiyasının bütün xammallar üçün əhəmiyyətli dərəcədə yüksək məhsuldarlıq verdiyi göstərilmişdir. Bundan əlavə, duz/qələvi protokolunun heyvan mənşəli zülalları çıxarmaq üçün çox səmərəli olduğu, zülalın 100% -dən çoxunu və ya daha azını çıxarmağı bacardığı göstərildi. O, həmçinin yüksək emal olunmuş bitki xammalından (ağ undan) zülal çıxarmaq üçün olduqca səmərəli idi və təxminən 80% məhsuldarlıq verirdi. Ekstraksiya məhsuldarlığı daha az emal edilmiş və daha mürəkkəb bitki materiallarında, məsələn, bütöv un və dulsedə aşağı olmuşdur, sonuncusu əvvəlki tədqiqatla müqayisə edilə bilər [9].

Cədvəl 2

Balıq, qızılbalıq, karides, ağ və tam buğda unu və dulsenin amin turşusu analizindən hesablanmış zülal ekstraktı məhsuldarlığı.

Xammal
NövlərEkstraksiya məhsuldarlığı duz/qələviEkstraksiya məhsuldarlığı HEPES/CHAPS
Cod106,8 ± 11,2 b 13,8 ± 3,0 a
qızılbalıq99,9 ± 13,3 b 31.9 ± 2.1 a
Karides113,3 ± 17,0 b 14.4 ± 2.2 a
Ağ buğda unu78,5 ± 11,1 b 15.0 ± 3.7 a
Tam buğda unu66,1 ± 20,9 b 20.4 ± 3.2 a
Dulse (qırmızı dəniz yosunu)34,9 ± 6,7 b 12.0 ± 1.6 a

Dəyərlər orta dəyər kimi bildirilir ± SD (n = 5) və müvafiq xammalda amin turşusu tərkibinin % ilə (cədvəl 1-də göstərildiyi kimi). Eyni cərgədə müxtəlif hərflər hər növ daxilində müxtəlif üsulların hasilatı məhsuldarlığı arasında əhəmiyyətli fərqləri göstərir. HEPES: 4-(2-hidroksietil)piperazin-1-etansülfonik turşu CHAPS: 3-((3-holamidopropil)dimetilamonio)-1-propansulfonat.

Seçilmiş iki ekstraksiya metodu arasındakı fərqlərdən biri duz/qələvi ekstraksiyasının 60 ºC-də, HEPES/CHAPS isə buz üzərində aparılması idi və bu, hasilat məhsuldarlığında fərqə kömək edə bilərdi. Buz üzərində ekstraksiya, ehtimal ki, zülalları deqradasiyadan qoruyur, istilik müalicəsi isə bunu sürətləndirə bilər. Beləliklə, ekstraksiya üsulu sonrakı istifadə məqsədinə əsasən seçilməlidir. Bununla belə, bu işdə məqsəd sadəcə üsullar arasında zülal çıxarma məhsuldarlığında fərqləri araşdırmaq idi və beləliklə, zülalın deqradasiyası təhlil edilməmişdir.

Ekstraksiyadan sonra iki fərqli spektrofotometrik metoddan, Bradford metodundan [18] və dəyişdirilmiş Louri üsulundan [17] istifadə edərək zülal təyini sınaqdan keçirilmiş və amin turşusu analizi ilə müqayisə edilmişdir. Bradford metodunda Coomassie G-250 boyası zülaldakı ionlaşan qruplarla reaksiyaya girərək zülalların üçüncü strukturunu pozur və hidrofobik cibləri ifşa edir. Bunun ardınca 595 nm-də oxuna bilən stabil komplekslər meydana gətirən hidrofobik amin turşularına boya bağlanır [3]. Dəyişdirilmiş Lowry üsulu Biuret metodunun birləşməsidir, burada mis ionları zülaldakı peptid bağları ilə reaksiya verir və Folin-Ciocalteu reagenti ilə aromatik amin turşuları üzərində halqa quruluşu arasındakı reaksiya. Ümumi reaksiya 650 º2013750 nm-də oxuna bilən sabit, tünd göy rəngli kompleks əmələ gətirir [3].

3.2.4. Amin turşularının təhlili və spektrofotometrik metodların müqayisəsi

Cədvəl 3-də amin turşusu analizi, Bradford metodu və dəyişdirilmiş Louri üsulu ilə zülalın təyin edilməsinin nəticələri duz/qələvi ekstraktları üçün, Cədvəl 4-də isə HEPES/CHAPS ekstraktları üçün eyni analizlər göstərilmişdir. Duz/qələvi ekstraktlarında həm Bradford metodu, həm də dəyişdirilmiş Louri metodu heyvan mənşəli zülallar üçün amin turşusu analizindən daha yüksək protein təxminləri verdi. Eyni şey, bitki zülalları üçün dəyişdirilmiş Lowry metodundan istifadə edərkən müşahidə edildi, Bradford metodu isə amin turşusu analizinə nisbətən bərabər və ya aşağı protein təxminləri ilə nəticələndi. HEPES/CHAPS ekstraktlarında dəyişdirilmiş Lowry metodundan istifadə etməklə heç bir nəticə əldə etmək mümkün olmamışdır. Bradford metodu, dulse istisna olmaqla, bütün xammallar üçün amin turşusu analizindən daha yüksək protein təxminləri verdi.

Cədvəl 3

Morina, qızılbalıq, karides, ağ və tam buğda unu və dulsenin duz/qələvi zülal ekstraktlarında amin turşusu analizi, Bradford analizi və dəyişdirilmiş Lowry analizi əsasında hesablanmış zülal tərkibi.

Duz/qələvi zülal ekstraktları
NövlərAmin turşularının təhliliBradfordDəyişdirilmiş Lowry
Cod118,8 ± 9,8 a 198,7 ± 24,1 b 194,5 ± 11,4 b
qızılbalıq120,9 ± 13,9 a 234,6 ± 10,6 c 211,9 ± 9,2 b
Karides93,9 ± 7,8 a 165,5 ± 10,3 b 151,2 ± 8,2 b
Ağ un (buğda)60,9 ± 8,1 b 45,0 ± 6,6 a 85,7 ± 12,3 c
Bütün un (buğda)58,2 ± 18,6 a 46,2 ± 18,5 a 88,8 ± 27,3 b
Dulse (qırmızı dəniz yosunu)36,9 ± 9,1 a 48,4 ± 3,9 a 89,5 ± 15,9 b

Dəyərlər orta dəyər kimi bildirilir ± SD (n = 5) və g protein kq 𢄡 xammal. Eyni cərgədə müxtəlif hərflər hər növ daxilində metodlar arasında əhəmiyyətli fərqləri göstərir.

Cədvəl 4

Morina, qızılbalıq, karides, ağ və tam buğda unu və dulsenin HEPES/CHAPS zülal ekstraktlarında amin turşusu analizi, Bradford analizi və dəyişdirilmiş Lowry analizindən hesablanmış zülal tərkibi.

HEPES/CHAPS zülal ekstraktları
NövlərAmin turşularının təhliliBradfordDəyişdirilmiş Lowry
Cod15.3 ± 2.7 a 39,4 ± 7,5 b n.a.
qızılbalıq38,7 ± 3,3 a 98,4 ± 3,1 b n.a.
Karides11,9 ± 0,7 a 25,7 ± 1,6 b n.a.
Ağ un (buğda)11.6 ± 2.7 a 18,5 ± 3,9 b n.a.
Bütün un (buğda)18.0 ± 2.8 a 30,0 ± 5,0 b n.a.
Dulse (qırmızı dəniz yosunu)12,5 ± 1,4 b 7.8 ± 1.3 a n.a.

Dəyərlər orta dəyər kimi bildirilir ± SD (n = 5) və g protein kq 𢄡 xammal. Eyni cərgədə müxtəlif hərflər hər növ daxilində metodlar arasında əhəmiyyətli fərqləri göstərir. n.a.: tətbiq edilmir.

Louri metodu sadəliyi və əlçatanlığına görə bir çox onilliklər ərzində zülalın təyini üçün geniş istifadə olunur. Bununla belə, aromatik amin turşuları ilə yanaşı, geniş spektrli digər birləşmələr də Folin𠄼iocalteu reagenti ilə reaksiya verir [30]. Tərkibində bir neçə müdaxilə edən birləşmələr olan kompleks qida matrislərində bu, normal olaraq zülal tərkibinin həddən artıq qiymətləndirilməsinə gətirib çıxarır ki, bu da duz/qələvi ekstraksiyasının nəticələrini göstərir. Lowry protokoluna müdaxilə etdiyi sübut edilmiş birləşmələrdən biri HEPES-dir [31]. Bu tədqiqatda HEPES/CHAPS buferi və Lowry reagenti arasındakı reaksiya həm standartlarda, həm də ekstraktlarda çox güclü fon rəngi əmələ gətirdi və bu, dəqiq protein nəticələrini əldə etməyi qeyri-mümkün etdi. Normalda, Bradford metodunun bu cür müdaxilələrə daha az meylli olduğu qəbul edilmişdir. Bununla belə, bu tədqiqatın nəticələri göstərir ki, bəzi xammallar üçün də zülal təxminləri amin turşusu analizi ilə müqayisədə çox yüksəkdir və bu, bir növ müdaxilənin ola biləcəyini göstərir. Müxtəlif amin turşularının ekstraksiya effektivliyindəki fərqlər də mümkün izahat ola bilər. Bradford analizində əsas amin turşuları digər amin turşularına nisbətən son rəngə daha çox kömək edir [3], aromatik amin turşusu isə dəyişdirilmiş Lowry metodunda rəngin inkişafına daha çox kömək edir. Cədvəl 5-də göründüyü kimi, hidrofobik (prolin, qlisin, alanin, valin, izolösin, lösin və fenilalanin), aromatik (tirozin, fenilalanin, triptofan və histidin) və əsas (lizin, histidin və arginin) amin turşuları. Bununla belə, bu təsir növlər arasında dəyişirdi və bütün materiallara baxarkən yeganə əhəmiyyətli təsir, HEPES/CHAPS metodunun hidrofobik amin turşularını digər üsullara nisbətən daha səmərəli çıxarması idi.

Cədvəl 5

HEPES/CHAPS və treska, qızılbalıq, karides, ağ buğda unu, tam buğda unu və dulsedə duz/qələvi istifadə edərək ekstraksiyadan sonra xammal və zülal ekstraktlarında hidrofobik, aromatik və əsas amin turşularının (AA) nisbi miqdarı bütün növlər.

XammalHEPES/CHAPSDuz/qələvi
CodHidrofobik AA37,8 ± 0,9 ab 42,8 ± 3,2 b 35,7 ± 1,3 a
Aromatik AA9.3 ± 1.79.4 ± 2.48.0 ± 2.7
Əsas AA19,6 ± 0,319.2 ± 1.218,7 ± 0,6
qızılbalıqHidrofobik AA39,4 ± 1,0 a 44,3 ± 1,0 b 39,5 ± 1,6 a
Aromatik AA10.1 ± 1.49.0 ± 3.38.7 ± 3.0
Əsas AA20,0 ± 0,218.2 ± 1.420.0 ± 3.1
KaridesHidrofobik AA38,4 ± 0,4 a 47,3 ± 1,2 b 38,0 ± 2,5 a
Aromatik AA10,2 ± 0,9 b 4.2 ± 0.9 a 8.7 ± 2.1 b
Əsas AA19,8 ± 0,2 b 17.6 ± 1.1 a 19,8 ± 0,7 b
Ağ un (buğda)Hidrofobik AA41,2 ± 0,9 b 40,5 ± 1,4 b 37,4 ± 0,6 a
Aromatik AA8.9 ± 1.1 a 9,4 ± 2,7 ab 11,5 ± 0,5 b
Əsas AA8,6 ± 0,3 a 11,0 ± 0,5 b 7,9 ± 0,7 a
Bütün un (buğda)Hidrofobik AA40,9 ± 0,5 b 38,6 ± 0,6 a 40,0 ± 1,7 ab
Aromatik AA9.4 ± 1.110,6 ± 0,38.1 ± 2.2
Əsas AA10,2 ± 0,2 b 12,4 ± 0,5 c 8,4 ± 0,4 a
Dulse (qırmızı dəniz yosunu)Hidrofobik AA43,5 ± 1,4 b 34,6 ± 2,7 a 46,3 ± 2,3 b
Aromatik AA10,3 ± 0,5 b 1,6 ± 0,2 a 9,3 ± 1,8 b
Əsas AA14,0 ± 1,7 c 4,4 ± 0,8 a 6,9 ± 0,7 b
Bütün növlərHidrofobik AA40.2 ± 2.1 ab 41,4 ± 4,5 b 39,5 ± 3,8 a
Aromatik AA9.7 ± 1.27.4 ± 3.89.1 ± 2.3
Əsas AA15.4 ± 4.813.8 ± 5.413.6 ± 6.2

Dəyərlər orta ± SD kimi verilir (n = 5) və ümumi amin turşularının % ilə. Eyni cərgədə müxtəlif hərflər əhəmiyyətli fərqi göstərir (səh < 0,05) xammalda və iki ekstraktda amin turşusu kompozisiyaları arasında.


Əlaqədar Texniki Məqalələr

Hüceyrələri pozmaq və onların məzmununu analiz üçün hazırlamaq üçün çoxsaylı üsullar mövcuddur. Ümumiyyətlə, nümunə asanlıqla parçalanmış kultura hüceyrələrdən və ya qan hüceyrələrindən ibarət olduqda yumşaq üsullar tətbiq edilir, daha möhkəm bakterial və ya bitki hüceyrələrinin və ya birləşdirici toxuma daxil olan məməlilərin hüceyrələrinin pozulması üçün daha güclü üsullardan istifadə olunur.

    Yuyucu vasitələrə əsaslanan lizis: Yuyucu vasitələrə əsaslanan liziz: Yuyucu lizis məməli hüceyrələri, bakteriya hüceyrələri, mayalar və bitkilər üçün istifadə oluna bilən yumşaq bir üsuldur. Hüceyrə süspansiyonları yumşaq bir şəkildə sentrifuqa edilir və hüceyrə membranını pozan yuyucu vasitələr olan liziz məhlulunda yenidən dayandırılır. Membranlar həll olunur, hüceyrələri parçalayır və tərkibini azad edir. Təhlil və ya istehsala mane olan yuyucu vasitələr aşağı axınla çıxarılmalı ola bilər. Dondurma-ərimə lizisi: Bu üsul məməli və ya bakteriya hüceyrələrinin süspansiyonlarına tətbiq edilir. Hüceyrə süspansiyonu maye azotdan istifadə edərək sürətlə dondurulur. Daha sonra nümunə əridilir və lizis tamponunda pipetləmə və ya yumşaq burulğanla təkrar dayandırılır, prosesi bir neçə dəfə təkrarlayır. Dövrlər arasında nümunə sentrifuqalanır və tərkibində həll olunan protein olan supernatant saxlanılır. Osmotik şok: Bu, yuyucu vasitələrdən istifadə etmədən asılmış məməlilərin və ya bakteriya hüceyrələrinin parçalanması üçün kifayət edə biləcək çox yumşaq bir üsuldur. Tez-tez mexaniki pozulma ilə birləşən üsul yüksək osmotik mühitdən aşağı osmotik mühitə keçməyə əsaslanır və lizatın sonradan hüceyrəaltı komponentlərə fraksiyalaşdırılacağı tətbiqlər üçün yaxşı uyğun gəlir. Ultrasonikasiya: Zülal çıxarılmasının bu üsulu ən çox hüceyrə süspansiyonlarına tətbiq edilir. Hüceyrələr nümunəyə daxil edilmiş bir zond vasitəsilə yüksək tezlikli səs dalğaları ilə pozulur. Səs dalğaları aşağı təzyiq bölgəsini yaradır və hüceyrə membranlarının pozulmasına səbəb olur. Mexanik üsullar: Zülallar müxtəlif xam, lakin effektiv "əzmə və üyütmə" tədbirləri ilə hüceyrə və toxumalardan çıxarıla bilər. Məsələn, hüceyrə membranları Dounce və ya Potter-Elvehjem homogenizasiyasından istifadə edərək maye kəsmə qüvvələri ilə pozula bilər. Dokular Waring qarışdırıcısı və ya Polytron® homojenizatoru ilə soyudulmuş tamponda doğranmaqla və ya xırdalamaqla homojenləşdirilə bilər. Dokular və ya hüceyrələr maye azotda dondurulub, alüminium oksidi və ya qumlu havan və havan istifadə edərək incə toz halına gətirilə bilər. Hüceyrələrin incə şüşə muncuqlarla sürətlə qarışdırılması əksər Qram-müsbət və Qram-mənfi bakteriyalar üçün təsirli olan hüceyrə divarlarını pozur. Enzimatik həzm: Enzimatik həzm: Hüceyrə membranlarının möhkəm qoruyucu strukturla əhatə olunduğu lifli toxumalara yerləşdirilmiş bakteriya, maya və ya eukaryotik hüceyrələrdən zülal çıxararkən fermentativ üsullar tez-tez istifadə olunur. Hüceyrə lizisi fermentləri və ya Lizozim, Mutanolizin, MetaPolizim, Lizonaz və Pronaza kimi kokteyllər toxuma həzm fermentləri (məsələn, Kollagenaz, Xondroitinaz, Hialoronidaza) ilə birlikdə hüceyrə divarlarını, örtüklərini, kapsullarını və ya digər strukturlarını, qapaqlarını həll etmək və ya pozmaq üçün istifadə edilə bilər. təkcə mexaniki üsullarla asanlıqla kəsilmir. Enzimatik həzm lizis tamponunda homojenləşdirmə, sonikasiya və ya güclü burulğanla izlənilə bilər.

Bundan əlavə, endogen proteazlar və fosfatazlar hüceyrənin pozulması zamanı sərbəst buraxıla və hədəf molekulu deqradasiya edə bildiyinə görə, hədəfin nəzarətsiz itkisinin qarşısını almaq üçün hüceyrənin pozulması və sonradan proteaza və fosfataz inhibitorlarından istifadə edərək təmizlənmə zamanı nümunə qorunmalıdır.


Zülalların təmizlənməsi üsulları: 4 üsul

Zülalların təmizlənməsində istifadə olunan üsulları təqribən analitik və preparativ üsullara bölmək olar.

Fərqlilik dəqiq deyil, lakin həlledici amil bu üsulla praktiki olaraq təmizlənə bilən zülalın miqdarıdır. Analitik üsullar qarışıqda zülalın aşkarlanması və müəyyən edilməsi məqsədi daşıyır, hazırlıq metodları isə struktur biologiya və ya sənaye istifadəsi kimi digər məqsədlər üçün böyük miqdarda protein istehsal etməyi hədəfləyir. Ümumiyyətlə, hazırlıq üsulları analitik tətbiqlərdə istifadə edilə bilər, lakin əksinə deyil.

Metod № 1. Çıxarma:

Mənbədən asılı olaraq, zülal onu ehtiva edən toxuma və ya hüceyrələri parçalayaraq məhlula gətirilməlidir. Buna nail olmaq üçün bir neçə üsul var.Seçim üsulu zülalın nə qədər kövrək olmasından və hüceyrələrin nə qədər möhkəm olmasından asılıdır.

Bu ekstraksiya prosesindən sonra həll olunan zülal həlledicidə olacaq və mərkəzdənqaçma yolu ilə hüceyrə membranlarından, DNT-dən və s. ayrıla bilər. Ekstraksiya prosesi həmçinin məhluldakı zülalları həzm etməyə başlayacaq proteazları çıxarır. Əgər zülal proteolizə həssasdırsa, proteolizi yavaşlatmaq üçün adətən tez davam etmək və ekstraktın soyudulması arzu edilir.

Metod № 2. Yağıntı və Diferensial Həllləşmə:

Kütləvi zülalların təmizlənməsində zülalları təcrid etmək üçün ümumi ilk addım ammonium sulfat (NH) ilə çöküntüdür.4)2BELƏ Kİ4. Bu, artan miqdarda ammonium sulfat əlavə etməklə və çöküntü zülalının müxtəlif fraksiyalarını toplamaqla həyata keçirilir. Bu metodun bir üstünlüyü ondan ibarətdir ki, çox böyük həcmdə ucuz şəkildə həyata keçirilə bilər.

Təmizlənəcək ilk zülallar suda həll olunan zülallardır. İnteqral membran zülallarının təmizlənməsi, eyni membran bölməsində olan hər hansı bir xüsusi proteini digərlərindən təcrid etmək üçün hüceyrə membranının pozulmasını tələb edir. Bəzən mitoxondrial membranda yerləşən zülalın təmizlənməsindən əvvəl hüceyrələrdən mitoxondriyanın təcrid edilməsi kimi ilk növbədə xüsusi bir membran dartma təcrid edilə bilər.

Natrium dodesil sulfat (SDS) kimi bir yuyucu vasitə hüceyrə membranlarını həll etmək və təmizlənmə zamanı membran zülallarını məhlulda saxlamaq üçün istifadə edilə bilər, lakin SDS denatürasiyaya səbəb olduğundan, zülalları saxlamaq üçün Triton X-100 və ya CHAPS kimi daha yumşaq yuyucu vasitələrdən istifadə edilə bilər. Təmizləmə zamanı 8217-nin yerli uyğunlaşması.

Metod №3. Ultrasentrifuqalama:

Mərkəzdənqaçma, mayedə asılı vəziyyətdə olan müxtəlif kütlələrə və ya sıxlıqlara malik hissəciklərin qarışıqlarını ayırmaq üçün mərkəzdənqaçma qüvvəsindən istifadə edən bir prosesdir. Tərkibində zülalların və ya digər hissəciklərin, məsələn, bakteriya hüceyrələrinin qarışığı olan gəmi (adətən boru və ya butulka) yüksək sürətlə fırlandıqda, bucaq momentumu hər hissəcik üçün kütləsinə mütənasib olan xarici qüvvə verir.

Müəyyən bir zərrəciyin bu qüvvəyə görə mayedə hərəkət etmə meyli mayenin hissəcikə göstərdiyi müqavimətlə əvəzlənir. Nümunənin sentrifuqada “spinning” xalis təsiri ondan ibarətdir ki, kütləvi, kiçik və sıx hissəciklər daha az kütləli hissəciklərdən və ya mayedə daha çox “drag” olan hissəciklərdən daha sürətli xaricə doğru hərəkət edir.

Hissəciklərin süspansiyonları bir sentrifuqada “əyirildikdə”, mayedə aşağı sürükləmə ilə ən kütləvi hissəciklər üçün zənginləşdirilmiş qabın dibində “pellet” əmələ gələ bilər. Qalan, hələ də əsasən mayedə qalan sıxılmamış hissəciklər “supernatant” adlanır və supernatantı qranuldan ayırmaq üçün qabdan çıxarıla bilər.

Mərkəzdənqaçma sürəti nümunəyə tətbiq edilən bucaq sürəti ilə müəyyən edilir, adətən g ilə müqayisədə ölçülür. Nümunələr kifayət qədər uzun müddət sentrifuqa edilərsə, qabdakı hissəciklər tarazlığa çatacaqlar ki, burada hissəciklər xüsusi olaraq gəminin üzmə sıxlığının mərkəzdənqaçma qüvvəsi ilə tarazlaşdırıldığı bir nöqtədə toplanır. Belə bir “tarazlıq” sentrifuqalama verilmiş hissəciyi geniş şəkildə təmizləməyə imkan verə bilər.

Saxaroza gradient sentrifuqalanması:

Şəkərin xətti konsentrasiya qradiyenti (adətən saxaroza qliserin və ya Percoll) ən yüksək konsentrasiyanın altda və ən aşağı hissəsində olması üçün bir boruda yaradılır. Daha sonra zülal nümunəsi gradientin üstünə qatlanır və ultrasentrifuqada yüksək sürətlə fırlanır. Bu, ağır makromolekulların daha yüngül materialdan daha sürətli borunun dibinə doğru miqrasiyasına səbəb olur.

Saxaroza olmadıqda mərkəzdənqaçma zamanı hissəciklər fırlanma mərkəzindən getdikcə uzaqlaşdıqca, onlar getdikcə daha çox mərkəzdənqaçma qüvvəsi ilə qarşılaşırlar (nə qədər irəli getsələr, bir o qədər sürətlə hərəkət edirlər). Bununla bağlı problem, gəmi daxilində faydalı ayırma diapazonunun kiçik müşahidə olunan pəncərə ilə məhdudlaşdırılmasıdır.

Nümunəni iki dəfə daha uzun fırlatmaq, maraq hissəciyinin əslində iki dəfə uzağa getməsi demək deyil, əhəmiyyətli dərəcədə irəli gedəcəkdir. Lakin zülallar saxaroza qradiyenti ilə hərəkət etdikdə sıxlığı və özlülüyü artan maye ilə qarşılaşırlar.

Düzgün tərtib edilmiş saxaroza qradiyenti artan mərkəzdənqaçma qüvvəsinə qarşı olacaq, beləliklə hissəciklər mərkəzdənqaçma sahəsində olduqları vaxta yaxın nisbətdə hərəkət edirlər. Bu qradiyentlərlə ayrılan nümunələr “rate zonal” sentrifuqalar adlanır. Zülal/hissəciklər ayrıldıqdan sonra gradient fraksiyalaşdırılır və toplanır.

Metod № 4. Xromatoqrafik üsullar:

Adətən zülalların təmizlənməsi protokolu bir və ya daha çox xromatoqrafik addımdan ibarətdir. Xromatoqrafiyada əsas prosedur, tərkibində zülal olan məhlulun müxtəlif materiallarla dolu sütundan axmasıdır. Müxtəlif zülallar sütun materialı ilə fərqli şəkildə qarşılıqlı təsir göstərir və beləliklə, sütundan keçmək üçün tələb olunan vaxt və ya zülalın sütundan ayrılması üçün tələb olunan şərtlərlə ayrıla bilər. Adətən zülallar sütundan çıxarkən 280 nm-də udma qabiliyyəti ilə aşkar edilir.

Bir çox müxtəlif xromatoqrafik üsullar mövcuddur:

1. Ölçü İstisna Xromatoqrafiyası:

Xromatoqrafiya məsaməli gellərdən istifadə edərək məhlulda və ya denaturasiya şəraitində zülalları ayırmaq üçün istifadə edilə bilər. Bu texnika ölçüsü istisna xromatoqrafiyası kimi tanınır. Prinsip ondan ibarətdir ki, kiçik molekullar məsaməli bir matrisdə daha böyük həcmdən keçməlidir. Nəticə etibarilə, müəyyən diapazonlu zülallar gel sütununun digər ucunda toplanmazdan əvvəl dəyişən həcmdə eluant (həlledici) tələb edəcəklər.

Zülalın təmizlənməsi kontekstində eluant adətən müxtəlif sınaq borularında yığılır. Tərkibində zülalın ölçülə bilən izi olmayan bütün sınaq boruları atılır. Qalan məhlul təmizlənmək üçün zülaldan və hər hansı digər oxşar ölçülü zülallardan hazırlanır.

2. İon mübadiləsi xromatoqrafiyası:

İon mübadiləsi xromatoqrafiyası birləşmələri ion yükünün təbiətinə və dərəcəsinə görə ayırır. İstifadə olunacaq sütun növünə və yüklənmə gücünə görə seçilir. Anion mübadilə qatranları müsbət yükə malikdir və mənfi yüklü birləşmə funtlarını saxlamaq və ayırmaq üçün istifadə olunur, kation dəyişdirici qatranlar isə mənfi yükə malikdir və müsbət yüklü molekulları ayırmaq üçün istifadə olunur.

Ayrılma başlamazdan əvvəl əks yüklü ionları tarazlaşdırmaq üçün sütundan bir tampon vurulur. Nümunənin yeridilməsi zamanı məhlulun molekulları bufer ionları ilə mübadilə edəcəklər, çünki hər biri qatrandakı bağlanma yerləri üçün rəqabət aparır. Hər bir həll olunan maddə üçün saxlama müddəti onun yükünün gücündən asılıdır.

Ən zəif yüklü birləşmələr əvvəlcə, daha sonra ardıcıl olaraq daha güclü yüklərə malik olanlar süzülür. Ayırma mexanizminin təbiətinə görə, pH, tampon növü, tampon konsentrasiyası və temperaturun hamısı ayırmaya nəzarətdə mühüm rol oynayır. İon mübadiləsi xromatoqrafiyası zülalların təmizlənməsində istifadə üçün çox güclü vasitədir və tez-tez həm analitik, həm də preparativ ayırmalarda istifadə olunur.

3. Yaxınlıq Xromatoqrafiyası:

Yaxınlıq Xromatoqrafiyası, tez-tez tətbiq olunan xüsusi qatranlardan istifadə edən molekulyar uyğunlaşmaya əsaslanan ayırma üsuludur. Bu qatranların səthlərinə ayrılan birləşmələr üçün xüsusi olan liqandlar var. Çox vaxt bu liqandlar antikor-antigen qarşılıqlı təsirinə bənzər şəkildə fəaliyyət göstərirlər. Bu “kilid və açar” liqand və onun hədəf birləşməsi arasında uyğunlaşır, onu yüksək dərəcədə spesifik edir, tez-tez tək zirvə yaradır, halbuki nümunədə qalan hər şey saxlanılmır.

Bir çox membran zülalları qlikoproteinlərdir və lektin yaxınlıq xromatoqrafiyası ilə təmizlənə bilər. Yuyucu vasitə ilə həll olunan zülalların kovalent bağlanmış lektinə malik olmaq üçün dəyişdirilmiş xromatoqrafiya qatranına bağlanmasına icazə verilə bilər.

Lektinə bağlanmayan zülallar yuyulur və sonra xüsusi olaraq bağlanmış qlikoproteinlər, lektin bağlanma yerində bağlanmış qlikoproteinlərlə rəqabət aparan yüksək konsentrasiyalı şəkər əlavə etməklə elüt edilə bilər. Bəzi lektinlər şəkərlərlə rəqabət aparmaq çətin olan qlikoproteinlərin oliqosakkaridlərinə yüksək yaxınlığa malikdir və lektini denatürasiya etməklə bağlı qlikoproteinlər buraxılmalıdır.

4. Metal bağlama:

Ümumi bir texnika zülalın C-terminalına 6-8 histidin ardıcıllığının mühəndisləşdirilməsini əhatə edir. Polihistidin nikel və kobalt kimi ikivalentli metal ionlarına güclü şəkildə bağlanır. Zülal, polihistidin etiketini bağlayan immobilizasiya edilmiş nikel ionları olan bir sütundan keçirilə bilər. Bütün etiketlənməmiş zülallar sütundan keçir.

Zülal sütuna bağlanmaq üçün polihistidin etiketi ilə rəqabət aparan imidazol ilə və ya pH-ın azalması (adətən 4,5-ə qədər) ilə elüt edilə bilər, bu da etiketin qatran üçün yaxınlığını azaldır. Bu prosedur, bir qayda olaraq, dizayn edilmiş yaxınlıq etiketi (məsələn, 6xHis-teq və ya Clontech'in HAT etiketi) ilə rekombinant zülalların təmizlənməsi üçün istifadə edilsə də, iki valentli kationlara xas yaxınlığı olan təbii zülallar üçün də istifadə edilə bilər.

5. İmmunoaffinlik Xromatoqrafiyası:

İmmunoaffinlik xromatoqrafiyası zülalın seçici şəkildə təmizlənməsi üçün hədəf zülala antikorun spesifik bağlanmasından istifadə edir. Prosedur, antikorun sütun materialına immobilizasiyasını əhatə edir, daha sonra zülalı seçici şəkildə bağlayır, qalan hər şey axır. Zülal pH və ya şoranlığı dəyişdirərək Ix-dən ayrıla bilər. Bu üsul bir etiketdə mühəndisliyi əhatə etmədiyi üçün təbii mənbələrdən zülallar üçün istifadə edilə bilər.

6. HPLC:

Yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası və ya yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyası məhlulları sütundan daha sürətli sürmək üçün yüksək təzyiq tətbiq edən xromatoqrafiya formasıdır. Bu o deməkdir ki, diffuziya məhduddur və ayırdetmə qabiliyyəti yaxşılaşır. Ən çox yayılmış forma “ters faza” HPLC-dir, burada sütun materialı hidrofobikdir.

Zülallar asetonitril kimi üzvi həlledicinin artan miqdarının gradienti ilə elüt edilir. Zülallar hidrofobikliyinə görə ayrılır. HPLC ilə təmizləndikdən sonra zülal yalnız uçucu birləşmələri ehtiva edən məhlulda olur və asanlıqla liyofilləşə bilər. HPLC-nin təmizlənməsi tez-tez təmizlənmiş zülalların denatürasiyası ilə nəticələnir və bu səbəbdən kortəbii şəkildə yenidən qatlanmayan zülallara tətbiq edilmir.


Təcrübəni təyin edən kimyəvi prinsiplər

Müəllim şagirdlərə DNT çıxarma texnikasının əsasını təşkil edən kimyəvi prinsiplərdən cavab vermək üçün suallar yarada bilər.

DNT-nin sərbəst buraxılması üçün hüceyrəni və nüvəni açmaq üçün yuyucu əlavə edildi. Yuyucu vasitə iki membranı meydana gətirən lipid iki qatına kimyəvi reaksiya verərək hüceyrə membranını və nüvə membranını məhv edir. Reaksiya qablarınızı yuyarkən boşqablardakı yağları təmizləmək üçün maye yuyucu vasitənin hərəkətinə bənzəyir.

DNT-yə yapışan zülalları ayırmaq üçün ət yumuşatıcı əlavə edildi. Ət yumşaldıcısında proteini peptidlər və amin turşuları kimi daha kiçik formalara parçalayan proteinazlar adlı fermentlər var.

DNT-ni bir-birinə yapışdırmaq üçün duz əlavə edildi. Bu, DNT-ni çılpaq gözlə görmək üçün lazımdır. Tələbələrin gördükləri ağ ipli əşyalar bir-birinə yığılmış DNT zəncirləridir.

DNT normal olaraq suda həll olur, lakin duzlu DNT spirtə məruz qaldıqda çökür. Bu, etil spirti əlavə etdikdən dərhal sonra ağ iplikləri görmənizin səbəbidir.



Şərhlər:

  1. Nigrel

    No matter how hard I tried, I could never imagine such a thing. How is it possible, I don't understand

  2. Kill

    Nə yaxşı ifadə

  3. Nizragore

    google.com saytında axtarış etməyi məsləhət görürəm

  4. Doughlas

    Fikrinizi tamamilə bölüşürəm. Bunda bir şey var və bu yaxşı fikirdir. Mən səni dəstəkləyirəm.

  5. Theron

    Əlbəttə, üzr istəyirəm, bu mənə heç uyğun gəlmir. yardım üçün təşəkkür edirik.

  6. Linwood

    Sən düzgün deyilsən. Mən əminəm. Sizi müzakirə etməyə dəvət edirəm. Baş nazir yaz, ünsiyyət quracağıq.



Mesaj yazmaq