Məlumat

Tərs mikroskop üzərində dik mikroskopdan istifadə etmək üçün hər hansı bir səbəb varmı?

Tərs mikroskop üzərində dik mikroskopdan istifadə etmək üçün hər hansı bir səbəb varmı?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən heç vaxt ters çevrilmiş mikroskop sahibi olmamışam, lakin görünür, onun dik mikroskopla müqayisədə yalnız üstünlükləri var: daha uzun, daha ağır nümunələr; obyektiv şüşə sürüşməyə dəyməz; işləmək daha asan və s.

Niyə insanlar hələ də adi, dik mikroskoplardan istifadə edirlər? Mənə çatmayan bir mənfi cəhət varmı?


Artıq şərhlərdə qeyd edildiyi kimi, sadə işıq mikroskoplarına baxdığınız zaman qiymət əsas səbəblərdən biridir. Ters çevrilmiş əhatə dairələri daha mürəkkəb optikaya malikdir və daha böyük nümunələri araşdırmaq, ümumiyyətlə daha sabit çərçivəyə malik olmaq və s.

Daha kiçik şaquli diapazonlar üçün düşünə biləcəyim bir üstünlük, nümunənin qeyri-şəffaf olduğu və onu yuxarıdan görməli olduğunuz yerdə onları parçalama sahəsi kimi istifadə etmək imkanıdır. Digər bir üstünlük budur:

Bir çox flüoresan mikroskoplar dik vəziyyətdədir, çünki göz qapağına əlavə olaraq, lazerlər, səhnə mühərrikləri, kameralar və digər detektorlar da daxil olmaqla əlavə avadanlıq quraşdırılmalıdır. Bu ala bilər çox və rahatlıq naminə onu əlçatan yerdə yuxarıya quraşdırmaq çox vaxt asan olur.


Ters çevrilmiş mikroskop nədir?

Mikroskoplar bir çox elmi proseslərdə, xüsusən də kiçik obyektlərin, o cümlədən hüceyrələrin müşahidəsi zamanı istifadə olunur.

Ənənəvi tibb elmi və ya məhkəmə ekspertizası üçün olsun, mikroskoplar vacib alətlərdir. Bununla belə, elm inkişaf etdikcə, yeni texnoloji irəliləyişlər daha yaxşı nəticələr əldə etmək üçün daha çox böyütmə təmin etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. Bu, tərs mikroskopun şəkilə girdiyi yerdir.

Ancaq elm sahəsində bu yenilikdə yenisinizsə, ters çevrilmiş mikroskop haqqında daha çox öyrənmək üçün bu məqaləni oxumağa davam edin.


GİRİŞ

Ən geniş şəkildə işıq mikroskopiyası üsullarını iki kateqoriyaya bölmək olar: parlaq sahə və flüoresan. Parlaq sahə mikroskopiyasında işıq mənbəyi və aşkarlama obyekti nümunənin əks tərəflərinə yerləşdirilir və nümunə işığı udduqca, səpdikcə və ya yönləndirərkən onun üzərindən keçən işığa təsiri ilə nümunə təsvir edilir. Hüceyrələrin əksəriyyəti nazik və şəffaf olduğundan, çox işığı udmurlar və buna görə də hüceyrələrin yaratdığı işığın faza yerdəyişməsini görmək imkanı verən optika əlavə etmədən görmək çətindir. Bu faza sürüşməsini vizuallaşdırmaq üçün ən çox istifadə edilən iki üsul açıq fonda hüceyrələrin tünd görünməsinə səbəb olan faza kontrastı və hüceyrələrə yalançı üçölçülü (3D) kölgəli görünüş verən diferensial müdaxilə kontrastıdır (DIC). Murphy və Davidson, 2012). Faza kontrastı və ya DIC olmayan parlaq sahə adətən hüceyrələrin ümumi konturlarını görmək üçün kifayətdir, lakin ətraflı, yüksək kontrastlı parlaq sahə şəkillərinə nail olmaq üçün faza kontrastı və ya DIC lazımdır.


Fərqli Mikroskoplar

Mikroskopun ən sadə forması böyüdücü şüşədir. Siz onu mikroskop kimi düşünməyə bilərsiniz, amma elədir! O, təsviri böyüdür, lakin şəkli çevirmir və ya mikroskopik elmi tədqiqatlar üçün zəruri olan hüceyrə strukturları və ya digər detallar kimi kiçik şeyləri həqiqətən görmək üçün kifayət qədər böyütmür.

Normal olaraq mikroskop kimi təsnif etdiyiniz şey məktəb sinifində və ya elmi televiziya şousunda gördüyünüz şeydir və bunlara mürəkkəb mikroskoplar deyilir. Qarışıq mikroskoplar şəkilləri çevirir! Bunu əllərindəki iki linza və artan böyütmə səviyyəsinə görə edirlər. Onları tanınır edən də budur.

Aydındır ki, digər növ mikroskoplar da şəkilləri çevirir və təsviri orijinal oriyentasiyasına qaytaran əlavə linzalı başqaları da var. Bu o deməkdir ki, gördüyünüz şəkil ters çevrilib və sonra ilkin olaraq eyni mövqeyə çevrilib.

Elektron mikroskoplar və rəqəmsal mikroskoplar da daxil olmaqla bir neçə mikroskop sizə tərs təsvirləri göstərməyəcək. Dürbün və parçalayıcı mikroskoplar da böyütmə səviyyəsinin artması səbəbindən tərs görüntü göstərməyəcəklər. Harada olduğunuz və hansı işlərlə məşğul olduğunuz, hansı obraza baxdığınızla çox bağlıdır.

Hətta tərsinə çevrilmiş bir şəkil olsa belə, mikroskoplar görüntünün böyüdülməsini fenomenal şəkildə artıra bilər. Onlar həkimlərə, mühəndislərə, tələbələrə və hər kəsə çılpaq gözlə gördüyümüz dünyanı görməyə kömək etməklə dünyanın tərəqqisinə kömək ediblər. Onlar toxumalar və hüceyrələr, eləcə də xəstəliklər və antibiotiklərlə tibb sahəsində heyrətamiz nailiyyətlər əldə etdilər.

Bu, təkcə yaratdığımız strukturlarda və icra etdiyimiz prosedurlarda irəliləyişimizə kömək etmir, həm də məhkəmə elmi, biologiya və mikrobların, virusların və bakteriyaların öyrənilməsi kimi sahələrdə də kömək edir. Mikroskopik təsvirlər dünyaya yeni bir perspektivdən baxmağa kömək edir ki, onlarsız mümkün olmayacaqdır. Biz sadəcə olaraq şəklin sağ tərəfi yuxarı olanda tanımalıyıq!

Brandon mikroskopiya dünyasında həvəskar, hobbi və həvəskardır. Elmə və mikroskopik hər şeyə olan sevgisi onu mikroskopiya və mikrobiologiya haqqında bildiyi hər şeyi paylaşmağa sövq edir.

Son Mesajlar

Dünyaya kiçik nöqteyi-nəzərdən baxmağı öyrənmək bizim həyata baxışımızda böyük fərq yaradır. İstər müəllim, istər tələbə, istərsə də sadəcə bir mikroskop həvəskarı olmağınızdan asılı olmayaraq, bu pərçimlər.

İnsan gözünün görə biləcəyindən kənarda yaşayan mikroorqanizmləri dərk etməklə, canlılar olaraq tariximizi daha yaxşı anlaya bilərik. Bu mikroskopik dünya arasında orqanizmlər var.


Olympus FV3000: Əsas Mikroskop Əməliyyatı

Vacib qeyd- FV3000 tərs mikroskopdur, yəni insanlar öz nümunələri üçün müxtəlif qablardan istifadə edəcəklər. Nümunələri daha da yuxarı qaldıran mərhələ üstü inkubatordan istifadə variantı da var. Bunun mənası odur ki, fokus müstəvisi hər yerdə ola bilər və olacaq və siz onu nümunəniz üçün tapmaq üçün bir az vaxt ayırmağa hazır olmalısınız.

I. XYZ hərəkətinə nəzarət

Bu nəzarətlər hava masasının sağ tərəfindədir. Fokus düymələrini özünüzə çevirmək məqsədləri yüksəldir (nümunəyə doğru), onları sizdən uzaqlaşdırmaq məqsədləri aşağı salır. Qısa iş məsafəsi olan yağ obyektlərindən istifadə edərkən, ilk növbədə incə fokus düyməsindən istifadə etməlisiniz. X-Y düymələri yalnız səhnəni hərəkət etdirmək üçün istifadə edilməlidir.

Bu cihaz baxış rejimini (göz parçaları və ya konfokal), göz hissələri üçün işıqlandırma formasını (Epi-flüoresan və ya DIC parlaq sahəsi), məqsədləri idarə edir və səhnəni göndərə bilməniz üçün 8 ayrı xy koordinatını qeyd etməyə imkan verir. maraq doğuran bölgələrə.

“Qaçış” düyməsi neft obyektlərinin istifadəsi üçün lazım olan obyektiv qülləni aşağı salır (daha sonra ətraflı müzakirə olunacaq).

“Fokus Axtarış” funksiyası örtüyü tapan gözəl qısa yoldur. Cihaz örtüyü uğurla incələyirsə, bir səs siqnalı eşidəcəksiniz (yaxşı). Bunu edə bilmirsinizsə, 3 səs siqnalı eşidəcəksiniz (pis). Əgər uğursuz olarsa, ən çox ehtimal olunan səbəb çox fərqli nümunə konteynerindən istifadə edən və fokus müstəvisini dəyişdirən əvvəlki istifadəçidir. Ən yaxşı mərciniz, 2x obyektivinə fokuslanmaq üçün lamel və ya quyunun kənarına getmək, sonra hədəfinizi tapmaq üçün yenidən 10x-a keçməkdir. Daha sonra Fluoview proqramında Z mənşəyini və Z-limitini (lazım olduqda) sıfırlaya bilərsiniz. ZDC DM “In” əvəzinə “Out” (Fluoview proqramında Mikroskop) nişanı olduqda axtarış funksiyası da uğursuz olacaq.

"EPI" nişanı filtr kubunu idarə etməyə imkan verir:

3 filtr mövcuddur: DAPI, FITC (yaşıl/sarı fluorlar) və TRITC (narıncı/qırmızı florlar). 600+ nm diapazonunda flüoresan olan boyalara baxmaq üçün heç bir filtr yoxdur, lakin siz onları 640 nm lazerlə konfokal rejimdə görə biləcəksiniz.

İşıq intensivliyini tənzimləmək üçün "DIA" ekran seçimi ən çox istifadə olunur.

Sabit nümunələriniz üçün 3 mərhələli əlavə seçiminiz var: 1) quyu boşqab tutacağı, 2) universal sürüşmə tutacağı (bir slayd və ya 60 mm və ya daha kiçik qab üçün istifadə edə bilərsiniz) və 3) 4 sürüşdürmə sahibi. Slayd örtüyünüzü aşağı yerləşdirməyi unutmayın. Əgər plastik qabdan istifadə edirsinizsə, siz hava hədəfləri ilə məhdudlaşırsınız (2x, 10x və 20x). Əgər siz yağ obyektivindən istifadə etmək istəyirsinizsə, müvafiq qalınlıqda bir şüşə dibi və ya örtükdən istifadə etməlisiniz (

IV. Tokai Hit səhnəsi

Otağımız susuz olduğundan və termostatı idarə edə bilmədiyimiz üçün sistemimizə səhnə bloku daxildir. Sabit nümunələr üçün ön lyuku yuxarıda saxlaya bilərsiniz. İstənilən böyük uzunluqda fasiləsiz skan üçün səhnə mühitini daha sabit saxlamaq üçün bu qapağı aşağı qoymaq seçiminiz var. Bu korpus kondensatorun geri əyilməsi üçün əlavə bir addım təqdim edir (bunu mərhələ əlavələrini yerləşdirərkən və ya məqsədləri yağlayarkən/silərkən etməlisiniz).

Kondensator ətrafındakı boşluğu açmaq üçün iki sürüşdürmə çubuğunu (qırmızı oxlar) kənara itələyin. Daha sonra kondensatoru geri əymək üçün fokus düymələrini yuxarı və geri itələyə bilərsiniz. Qaralamaları səhnədən kənarda saxlamağa ehtiyac yoxdur, üstü açıq qoya bilərsiniz. Bu tənzimləmənin bir mənfi tərəfi odur ki, kondensatoru geri əyməyi unutmaq çox asandır. Konfokal rejimdə şəkil əldə etmirsinizsə, etməli olduğunuz ilk şey, bunu görüb-görmədiyinizi yoxlamaq üçün sola baxmaqdır. Kondensator işləməyincə lazerlər bloklanacaq.

V. Havadan Neftə Keçmə Məqsədləri

Ters çevrilmiş mikroskop quyu boşqablarında və ya qablarda və ya quyu slaydlarında daha yüksək N/A neft məqsədləri ilə nümunələri təsvir etməyə imkan verir ki, neft nümunəni çirkləndirməsin. İşin mənfi tərəfi odur ki, hədəfləri yağlamaq dik bir sistem üçün olduğundan daha çətin olur. Ters konfiqurasiyada yağ damcısı obyektiv linzanın ucunda bir az təhlükəli şəkildə yerləşəcək və o, linza ilə örtük/çanağın dibi arasında qalmalıdır. Yağ çox azdır və işıq üçün düzgün yolunuz olmayacaq. Həddindən artıq yağ və o, digər şüşə parçası ilə təmasda olduqdan sonra obyektiv tərəflərdən aşağı axmağa başlayacaq. Şüşə parçaları arasında istifadə edilə bilən yağ parçasının əldə edilməsi bir sənət növüdür və hətta təcrübəli istifadəçilər bir neçə dəfə cəhd etməli ola bilər. Onu düzgün yerləşdirdikdən sonra, siz səhnəni yağ ləkənizin hüdudları daxilində hərəkət etdirə və çoxlu şəkil çəkə bilərsiniz. Ancaq cari yağ ləkənizin diapazonundan kənarda təsvir etməli olduğunuz zaman və ya nümunələri dəyişdirdiyiniz zaman obyektiv kağızı ilə bütün yağı silməli və yeni damcı tətbiq etməlisiniz. Bu, əngəldir, lakin zəruridir, çünki çoxlu yağ aşağı axır, bu da bir çox səbəblərə görə pisdir.

Əgər quyu boşqabından istifadə edirsinizsə, boşqabınızı səhnəyə qoymazdan əvvəl istifadə etməyi planlaşdırdığınız yağ obyektini əvvəlcədən yağlamalısınız.

Bizdə 2 növ yağ var: 60x məqsədi üçün mavi şüşə (ne = 1.518) və 30x və 40x Si hədəfləri üçün yaşıl şüşə Silikon yağı (ne = 1.406).

Obyektiv keçid haqqında bir neçə daha ətraflı məlumat

Səhnə korpusunun sol alt hissəsində həmin məkanı işıqlandırmaq üçün işığı yandıracaq bir düymə var ki, bu da yağlama məqsədlərini görməyi asanlaşdırır. Şəkil çəkməyə başlamazdan əvvəl onu yenidən söndürməyi unutmayın. Yanındakı düymə parlaqlığı idarə edir.

Universal mərhələ əlavəsi obyektləri yağlayarkən istifadə etmək ən asandır, çünki nümunə sahibinin ətrafında obyektə daxil olmaq üçün istifadə etmək üçün açıq yer var. 4 sürüşdürmə yeri ilə, hətta 4 slaydı quraşdırsanız belə, istifadə etmək üçün sol və ya sağ tərəfdə kifayət qədər boş yer var. Əgər quyu boşqabından və ya mərhələ üstü inkubatordan istifadə edirsinizsə, nümunənizi/kameranı səhnə açılışına qoymazdan əvvəl obyektivinizi əvvəlcədən yağlamalı, sonra 2x və ya 10x-ə keçməlisiniz.

Məqsəd “qaçarkən” heç bir fokus düyməsinə toxunmayın. Bunu etsəniz, o, "qaçacaq" və geri qalxacaq. Bu funksiyadan istifadənin məqsədi məqsədlər və mərhələ əlavəsi arasında toqquşmaların qarşısını almaqdır. Fluoview proqram təminatı boz və qeyri-aktiv olacaq.

Slaydınızdan yağı çıxarmaq üçün linza kağızı ilə silin (kompüter masasındakı qutuda) və qalanını bir az etanol ilə silin. Kimwipes istifadə etməyin məqsədlər və ya hədəflərə yaxın olacaq hər hansı bir şey (slayd və ya qablar kimi) üzərində. Nümunə sahibləriniz Nüvəyə gətirdiyiniz zaman yağdan təmizlənməlidir, xüsusən də əvvəllər onlara fərqli marka mikroskopda yağla baxmısınızsa. Hər bir mikroskop istehsalçısının müxtəlif refraktiv indeksləri olan daldırma yağlarının öz versiyası var, buna görə də onlar uyğun deyil.


Dik Metallurgiya Mikroskopları

Dik metalurgiya mikroskoplarını digərlərindən fərqləndirən, işıqlandırma sisteminin nümunə mərhələsinin üstündə yerləşməsidir ki, bu da işığın nümunəyə (obyektivlərdən) və yenidən göz qapaqlarına yönəldilməsinə imkan verir.

Mikroskop istifadəçinin ehtiyaclarından asılı olaraq sütun dayağı və ya tipik əsas dayaqla təchiz oluna bilər. Məsələn, adətən əsas stend nisbətən kiçik nümunələr üçün mikroskopun daha çox dayanıqlılığına imkan verirsə, sütun dayağı müxtəlif ölçülü nümunələrə baxmağa imkan verən təkmilləşdirilmiş elastikliyə imkan verir.

Dik mikroskopun bəzi xüsusiyyətlərinə tənzimlənən intensivliyə nəzarət, diopter, 10x geniş sahəli göz qapaqları, həmçinin plan akromatik sonsuzluqda düzəldilmiş məqsədlər daxildir.

MicroscopeMaster Dik Metallurgiya Rəyləri:

Metallurgiya mikroskoplarının müxtəlif növləri onların təyinatına görə üstünlük təşkil etsə də, ters çevrilmiş mikroskopun dik mikroskopla müqayisədə bir sıra üstünlükləri olduğu sübut edilmişdir. Bunlara daxildir:

Daha çox azadlıq - Ters çevrilmiş mikroskopda optiklər mikroskop mərhələsinin altında yerləşir, nümunə isə adətən hədəflərin üstündə yerləşdirilir. Bu, dik mikroskopun nümunənin ölçüsü ilə bağlı üzləşdiyi məhdudiyyətləri aradan qaldırır.

Burada istifadəçi daha böyük iş məsafəsindən faydalanır ki, bu da müşahidələr üçün mikroskopda daha böyük və daha ağır nümunələr yerləşdirməyə imkan verir (30 kq-a qədər)

Səmərəlilik - Ters çevrilmiş mikroskopdan istifadə edərək, istifadəçilər daha qısa müddət ərzində daha çox nümunəyə baxmaqdan faydalanırlar.

Dik mikroskop üçün nümunəyə baxmaq bir sıra addımları əhatə edir, o cümlədən səhnənin aşağı salınması, onun tənzimlənməsi, səhnə tutucusunda nümunənin qorunmasına diqqət yetirilməsi və s. səhnədə obyekt və fokuslandıqdan sonra onu təsvir edin.

Fokus müxtəlif böyütmələr üçün saxlanılır, yəni eyni növ nümunə üçün istifadəçi baxmağı daha asan tapacaq.

Məqsəd qorunur - Ters çevrilmiş mikroskopun obyekti, zədələnmə şansını minimuma endirməklə obyekti hər zaman qoruyan fokus dayandırma funksiyasının (bəzi mikroskoplarda) olması ilə yanaşı səhnənin altında yerləşir. Bu, obyektiv nümunənin istənilən vaxt nümunə və ya digər sərt cisimlərlə təmasda ola biləcəyi nümunə mərhələsinin üstündə olduğu dik mikroskoplarda belə deyil.


Müəlliflərin Bioqrafiyası və Əlaqə Məlumatı

Bio: Robert Berdan AB-nin Kalqari şəhərində yaşayan, təbiət, vəhşi təbiət və elmi fotoqrafiya üzrə ixtisaslaşmış peşəkar təbiət fotoqrafıdır. Robert illər əvvəl tam zamanlı fotoqrafiya ilə məşğul olmaq üçün CellNeurobiology tədqiqatından təqaüdə çıxdı. Robert təbiət fotoqrafiyasının bütün aspektləri və Adobe Photoshop təlimi, o cümlədən fotomikroqrafiya və makrofotoqrafiya üzrə foto bələdçiliyi və fərdi təlimat təklif edir. Robert Berdanın portreti, onun bəzi elmi nəşrlərindən Dr. Şərif Qalal tərəfindən çəkilmiş şəkillərlə. Onun ilk tədqiqat mikroskopu sağda göstərilir.


Məlumat

Digərləri

Fortune 500 şirkəti olan Avantor ® biofarma, səhiyyə, təhsil və hökumət, qabaqcıl texnologiyalar və tətbiq olunan materiallar sənayesində müştərilərə missiya baxımından mühüm məhsul və xidmətlərin aparıcı qlobal təchizatçısıdır. Portfelimiz xidmət etdiyimiz sənayelərdə ən vacib tədqiqat, təkmilləşdirmə və istehsal fəaliyyətlərinin faktiki olaraq hər mərhələsində istifadə olunur. Ən güclü tərəflərimizdən biri müştərilərimizin ehtiyaclarını dəstəkləmək üçün strateji cəhətdən yerləşmiş qlobal infrastruktura malik olmaqdan irəli gəlir. Qlobal izimiz bizə 225.000-dən çox müştəri məkanına xidmət göstərməyə imkan verir və 180-dən çox ölkədəki tədqiqat laboratoriyalarına və alimlərə geniş çıxış imkanı verir. Biz daha yaxşı bir dünya yaratmaq üçün elmi hərəkətə gətiririk. Məlumat üçün www.avantorsciences.com saytına daxil olun və bizi LinkedIn, Twitter və Facebook-da tapın.

© 2021 VWR International, LLC. Bütün hüquqlar qorunur.
© 2021 FORTUNE Media IP Limited Bütün hüquqlar qorunur. Lisenziya altında istifadə olunur.


Tərs mikroskop üzərində dik mikroskopdan istifadə etmək üçün hər hansı bir səbəb varmı? - Biologiya

Stephen M. Wolniak
professor
Hüceyrə Biologiyası və Molekulyar Genetika Bölməsi
Merilend Universiteti
Kollec Parkı, Merilend, 20742
[email protected]

Tədris Maraqları - Mikroskopiya

Aşağıda təqdim olunan məlumatları işıq mikroskopunda təsvirin formalaşmasının əsasları haqqında ümumiyyətlə az bilən tələbələr üçün təqdim edirəm. Bu məlumatdan istifadə etmək istəyirsinizsə, sənədi yaratmaq üçün çəkdiyim səylərə görə mənə borclu olun (günahlandırın).

Mikroskopiyanın prinsipləri


Parlaq sahə mikroskopiyası

Bu laboratoriyada ümumi istifadəniz üçün mövcud olan mikroskop sizə müxtəlif nümunələrin yüksək ayırdetmə təsvirlərini təqdim edə bilən mürəkkəb optik alətdir. Şəklin keyfiyyəti əsasən mikroskopdan düzgün istifadə etmək bacarığınıza əsaslanır. Aşağıda siz yəqin ki, əvvəllər eşitdiyiniz, lakin nadir hallarda hərtərəfli şəkildə təqdim olunan bəzi əsas məlumatları tapa bilərsiniz.

Kiçik şeylərin böyüdülməsi bioloji tədqiqatın zəruri tərəfidir, lakin hüceyrələrdə və hüceyrəaltı komponentlərdəki incə detallar hər hansı bir görüntü sisteminin kiçik məsafələrdə məkan məlumatı təmin edə bilməsini tələb edir. Qətnamə çox kiçik və bir-birinə yaxın olan iki obyekti ayrı-ayrı varlıqlar kimi ayırd etmək qabiliyyəti kimi müəyyən edilir. İki kiçik obyekti ayıran məsafə kiçik olduqda qətnamə ən yaxşısıdır. Qətnamə işığın dalğa uzunluğu və obyektiv və kondensator linzalarının işıq toplama gücü daxil olmaqla müəyyən fiziki parametrlərlə müəyyən edilir. Sadə riyazi tənlik ən kiçik məsafəni təyin edir (dmin) iki çox kiçik obyekti ayırmaq:


dmin = 1,22 x dalğa uzunluğu / N.A. obyektiv + N.A. kondensator

Bu, işıq mikroskopunun nəzəri həlletmə qabiliyyətidir. Praktikada nümunənin keyfiyyəti adətən məhdudlaşdırır dmin nəzəri alt limitindən daha böyük bir şeyə.

N.A. (Numerical Aperture) linzanın işıq toplama imkanlarının riyazi hesablanmasıdır. Hər bir obyektiv lensin N.A.-sı metal boruya yazılmışdır və 0,25-1,4 arasında dəyişir. N.A. nə qədər yüksək olarsa, linzanın işıq toplama xüsusiyyətləri bir o qədər yaxşı olar və ayırdetmə qabiliyyəti bir o qədər yaxşı olar. Yüksək N.A. dəyərləri həm də daha qısa iş məsafəsi deməkdir (obyektivi obyektə yaxınlaşdırmalısınız). 1.0-dan yuxarı olan N.A dəyərləri də linzanın immersion yağı kimi bəzi immersion maye ilə istifadə edildiyini göstərir.

Yuxarıdakı tənlikdən bilməlisiniz ki, ayırdetmə qabiliyyətini təyin etmək üçün kondensatorun N.A.-sı obyektiv lensin N.A.-sı qədər vacibdir. Məhz bu səbəbdən kondensator diafraqmasının bağlanması ayırdetmə qabiliyyətinin itirilməsi ilə nəticələnir. Təcrübədə, tam diafraqmada və yaxşı yağa batıran linzalarla (həm kondensator, həm də obyektiv üçün N.A. 1,4) 0,2 & mikrondan bir qədər yaxşı həll etmək mümkündür. Yuxarıdakı tənlikdən o da aydın olmalıdır ki, daha qısa dalğa uzunluğunda işıq (daha mavi işıq) sizə daha yaxşı ayırdetmə (daha kiçik d) təmin edəcək.min dəyərlər). Bununla belə, dalğa uzunluğunun nə qədər qısa ola biləcəyi ilə bağlı praktiki mülahizələr var. 1950-ci illərin əvvəllərində UV mikroskop dizayn edildi, lakin kvars obyektləri və xüsusi görüntüləmə cihazı tələb olundu. Kvars linzaları bir az daha yaxşı ayırdetmə təmin etdi (dmin = 0,1 &mikrom), lakin istehsalçıların kvarsın səbəb olduğu aberrasiyaları düzəldə bilməməsi şəkil keyfiyyətinə təsir etdi. İnsan gözü yaşıl işığa ən yaxşı uyğunlaşdırılmışdır və təfərrüatları görmək qabiliyyətimiz mavi və ya bənövşəyi rənglərin istifadəsi ilə müəyyən dərəcədə pozula bilər. Mikroskop istehsalçılarının əksəriyyəti ən sadə linzalarını (axromatlar) yaşıl işıq üçün düzəldirlər.


- Böyütmə və görüntüləmə -

Hal-hazırda istifadə edilən mikroskopların əksəriyyəti mürəkkəb mikroskoplar kimi tanınır, burada obyektin böyüdülmüş təsviri obyektiv lens tərəfindən hazırlanır və bu görüntü baxmaq üçün ikinci linza sistemi (okulyar və ya okulyar) tərəfindən böyüdülür. Beləliklə, mikroskopun son böyüdülməsi obyektivlərin böyütmə gücündən göz qabığının böyüdücü gücündən asılıdır. Obyektiv böyütmə gücləri 4X ilə 100X arasında dəyişir. Şəkil korreksiyası və işıqlandırma ilə məkan məhdudiyyətləri səbəbindən mürəkkəb mikroskop stendində aşağı böyütmə qeyri-mümkündür. Çox güclü linzalar üçün tələb olunan işıq toplama qabiliyyətinin məhdudlaşdırılması və iş məsafələrinin qısalması səbəbindən daha yüksək böyütmə praktiki deyil. Gözlərin böyüdülməsi diapazonları adətən 8X-12X olur, baxmayaraq ki, 10X okulyar ən çox yayılmışdır. Nəticədə, standart mikroskop sizə son böyütmə diapazonunu təqdim edəcəkdir

Hər bir obyektiv obyektiv obyektin aydın təsvirini yaratmaq üçün birləşən altı və ya daha çox şüşə parçasından ibarətdir. Obyektiv obyektivdəki altı və ya daha çox linza görüntü aydınlığı yaradan düzəlişləri təmin etmək üçün lazımdır. Lensdəki şüşə ilə işığın qarşılıqlı təsiri görüntü keyfiyyətinin itirilməsi ilə nəticələnən aberrasiyalar yaradır, çünki işıq dalğaları linzanın müxtəlif hissələrində fərqli şəkildə büküləcək və ya sınacaq və işığın müxtəlif rəngləri müxtəlif dərəcədə sınacaq. şüşə. Məkan aberrasiyaları (məs., sferik aberasiya) səthlərində müxtəlif əyriliklərə malik linzalardan istifadə etməklə və xromatik (yəni., rəng) aberrasiyaları bir neçə növ şüşədən kombinasiyada istifadə etməklə minimuma endirilə bilər. Bu düzəlişlər linzanın qiymətini o dərəcədə artırır ki, tam rəng korreksiyası və son dərəcə yüksək N.A nümayiş etdirən apoxromatik obyektiv lens bir neçə min dollara başa gələ bilər. Bu obyektiv linza təxminən baş barmağınızın ölçüsündədir.

Əksər mikroskoplarda obyektiv linzalar akromatlardır və yaşıl işıqla təsvir etmək üçün ən uyğundur. Yaşıl filtrlər işığın bant genişliyini daraldır və akromat məqsədlərini əksər gündəlik istifadələr üçün kifayət qədər effektiv edir. Akromat linzaları ağ işıqla kritik yüksək ayırdetmə təsviri üçün uyğun deyil, çünki qırmızı və mavi işıq yaşıl işıqla eyni müstəvidə fokuslanmır. Xromatik aberasiyalar akromatik məqsədlərlə əldə edilmiş rəngli təsvirlərdə ayırdetmə qabiliyyətini aşağı salacaq. Ən yüksək qətnamə və görüntü aydınlığına yönəlmiş rəngli fotomikroqrafiya tamamilə düzəldilmiş apoxromatik obyektiv linzalarla aparılmalıdır. Flüorit linzalar, akromatlardan daha yaxşı, lakin apoxromatlar qədər yaxşı olmayan, orta səviyyəli korreksiya təklif edir. Flüorit linzaları daha qısa dalğa uzunluğunda işığın yüksək keçiriciliyinə görə flüoresan mikroskopiya üçün çox uyğundur. Daha yüksək səviyyəli düzəlişlər obyektiv linzaları daha bahalı edir, apokromatik məqsədlər üçün qiymət diapazonu təxminən 3000 dollardan 10.000 dollara qədərdir.

Əksər mikroskoplarda olan okulyarlar eyni istehsalçının obyektiv linzaları ilə optimal işləmək üçün nəzərdə tutulub. Hər bir istehsalçı obyektivdə bəzi rəng və məkan korreksiyalarını, qalan korreksiyaları isə gözdə edir. Brendləri qarışdırmaq adətən imicinin pisləşməsi ilə nəticələnir. Bundan əlavə, mikroskopla baxdığınız zaman okulyardan gördüyünüz böyüdülmüş və düzəldilmiş görüntü əslində virtual görüntüdür (real görüntüdən fərqli olaraq). Gözlə baxıldıqda düzəldilmiş virtual görüntü təmin etmək üçün nəzərdə tutulmuş okulyar mikroskop vasitəsilə foto və ya video görüntülərin yaradılması üçün uyğun deyil. Fotoqrafiya və ya video mikroskopiya üçün düzəldilmiş real görüntü yaradan proyeksiya obyektivindən istifadə etmək lazımdır. Yeni mikroskopların çoxu obyektiv linzada ümumi görüntü korreksiyasını təmin edir, beləliklə, eyni istehsalçının şüşə komponentlərinin uyğunlaşdırılması ilə bağlı bir çox narahatlığı aradan qaldırır. Buna baxmayaraq, bir istehsalçının hissələrini digər istehsalçının hissələri ilə qarışdırmamaq yaxşı təcrübədir, çünki arzuolunmaz görüntünün pozulması nəticələnə bilər.

İşıq mikroskopu ilə yaxşı görüntü əldə etmək üçün vacib amil nümunədə və ya obyekt müstəvisində adekvat işıq səviyyələrinin əldə edilməsidir. Yalnız obyektin ətrafında parlaq işıq əldə etmək lazım deyil, optimal təsvir üçün işıq baxış sahəsi boyunca vahid olmalıdır. Nümunəni işıqlandırmağın ən yaxşı yolu kondensator kimi tanınan başqa bir linza sisteminin istifadəsini nəzərdə tutur. Kondensatorun ön elementi adətən nümunənin altında oturan böyük, yastı lensdir. Onun daşınan stenddə yerləşdirilməsi sizə obyektin yanından gələn işıq şüasını fokuslamaq və intensivliyi maksimuma çatdırmaq və işıqlandırmanın vahidliyinə nəzarət etmək üçün vasitələr təqdim edir. İşıqlandırma sistemindəki iki diafraqma irisin diafraqmalarını bağlayaraq və ya açaraq işıqlandırma şüasının diametrini tənzimləməyə imkan verir. Bu diafraqmalardan biri, parlaq sahə kondensatorunun içərisində yerləşmiş və kondensator diafraqması kimi tanınan, kontrastı artırmağa imkan verir, lakin qətnamənin pisləşməsi hesabına. Sahə diafraqması diafraqması kimi tanınan bu diafraqmalardan ikincisi həllediciliyə kəskin təsir göstərmir və optimal işıqlandırma üçün müntəzəm olaraq tənzimlənir.

Hal-hazırda istehsal edilmiş bütün mikroskoplarla nümunənin optimal işıqlandırılması Kohler İşıqlandırmasının variasiyasından istifadə etməklə əldə edilir, burada (sizlər texnofillərsiniz) işıq mənbəyinin filamenti obyektiv lensin arxa fokus müstəvisində diqqət mərkəzindədir. Əməliyyat baxımından, hər hansı bir nümunəni əvvəlcə səhnəyə yerləşdirmək və diqqəti obyektə yönəltməklə parlaq sahə (və ya faza kontrastı) üçün optimal işıqlandırma əldə etmək asandır. Sonra, sahə diafraqması diafraqması üçün halqanı (mikroskopun ən aşağı diafraqması) çevirin ki, onun kənarları baxış sahəsinin periferiyasını örtsün. Sonra, qaldırın və ya aşağı salın kondensator sahə diafraqmasının kənarları aydın şəkildə fokuslanana qədər. Kondensatoru tənzimləyərkən obyekti yenidən nümunəyə yönəltməyin. Kondensator mərkəzləşdirmə vintlərindən istifadə edərək sahə diafraqmasının mərkəzləşdirilməsi lazım ola bilər. Mikroskop düzgün işıqlandırıldıqda, həm obyekt, həm də sahə diafraqmasının diafraqmasının kənarları eyni fokus müstəvisində olmalı və sahənin iris diafraqması baxış sahəsində mərkəzləşməlidir.


Faza Kontrast Mikroskopiyası

İnsan gözü işığın amplitudasında (intensivliyində) dəyişiklikləri qəbul edə bilir. Canlı hüceyrələr kimi ləkələnməmiş bioloji nümunələr gözlərimiz üçün mahiyyət etibarı ilə şəffafdır, lakin onlar işıq şüasının keçidini dalğa uzunluğunun təxminən 1/4 ( />) gecikdirərək (yavaşlatmaqla) kifayət qədər vahid şəkildə işıqla qarşılıqlı əlaqədə olurlar. . Bir işıq şüasını ətraf mühitdən keçən digər işıq şüasına nisbətən bu qədər yavaşlatmaqla, bioloji nümunə şüaların fazasını dəyişir. İntensivlik (amplituda) əlavədir və 1/2 />fazadan kənar olan işıq şüaları qaranlıq kimi qəbul edilir. Zernicke başa düşdü ki, ətraf mühitdən keçən işığa təsir etmədən bioloji nümunələrdən keçən işığı gecikdirə bilsə, canlı hüceyrələrdə amplituda dəyişikliklər yarada bilər. Faza kontrast mikroskopu 1930-cu illərdə Zernicke tərəfindən bioloji nümunələrdə kontrast yaratmaq vasitəsi kimi icad edilmişdir və bu görünməz faza fərqlərini görünən amplituda fərqlərinə çevirmişdir.

Zernicke, nümunə ilə qarşılıqlı əlaqədə olan işıq şüalarını nümunə ilə qarşılaşmayanlardan ayırmaq üçün optik hiylə işlətdi. İşıq şüalarını bir-birindən ayırmaq üçün o, qeyri-şəffaf diskə şəffaf bir halqa (halqa kimi tanınır) yerləşdirdi və bu diski mikroskopun optik yoluna, kondensatorun içərisinə daxil etdi. O, obyektiv linzanın içərisinə tamamlayıcı üzük qoydu. Nümunədən keçən, lakin nümunəni qaçıran işığın demək olar ki, hamısı obyektiv lensdən bu halqadan keçir. Nümunədən keçən işığın çox hissəsi səpələnmişdir və onun bir hissəsi obyektiv linza halqasından keçməyəcək şəkildə obyektiv linzaya daxil olur, lakin bu müstəvini başqa yerdə keçir. O, üzüyü tutan şüşə lövhəni elə dizayn etdi ki, üzükdə olmayan bütün işıq nümunə ilə qarşılıqlı əlaqədə olmayan işıq şüalarına nisbətən əlavə 1/4 /> gecikmə ilə qarşılaşsın və nümunə ilə qarşılıqlı əlaqədə olan işıq şüalarını yerləşdirdi. Nümunə ilə 1/2 /> qarşılıqlı əlaqədə olmayan şüalarla fazadan kənar. O, müəyyən etdi ki, nümunədən keçməmiş işığın intensivliyinin azalması boz fon yaradacaq və kontrastı daha da artıracaq, nümunənin bəzi hissələri daha tünd, nümunənin digər hissələri isə fondan daha parlaq olacaq.

İstənilən mikroskopun faza kontrast rejimində işləməsi ilk növbədə kənarları nümunə müstəvisində fokusda olan mərkəzləşdirilmiş sahə iris diafraqması ilə düzgün parlaq sahə işıqlandırmasını qurmağı tələb edir. Sonra kondensator qülləsinin silindrini kondensator qülləsindəki nömrə obyektiv obyektivdə həkk olunmuş nömrəyə uyğun gələnə qədər fırladın. Bu vəziyyətdə, kondensator həlqəsi obyektivdə mövcud olan faza halqasına uyğunlaşdırılır. Sonra, okulyarlardan birini çıxarın və Bertrand fokus teleskopunu göz dəliyinə daxil edin. Bu lens obyektiv lensin arxa fokus müstəvisini, halqanın yerləşdiyi müstəvini görməyə imkan verir. Siz parlaq işıq dairəsi (kondensator həlqəsi) və qaranlıq bir halqa (obyektiv daxilində mövcuddur) görəcəksiniz. Qaranlıq üzük sabitdir, lakin parlaq həlqə deyil. Halqanı üzüklə hizalamağınız lazım ola bilər ki, ikisi üst-üstə düşsün. Kondensatorunuzun arxa tərəfində siz bu hizalamağa imkan verən iki tənzimləmə vintini tapa bilərsiniz. Üzük və həlqə düzləndikdə, okulyar yenidən mikroskopun içinə qoyun. Canlı hüceyrələrin müşahidəsi üçün faza kontrastı ilə parlaq sahə arasındakı fərq əhəmiyyətlidir.

Floresan mikroskopiyası

Atom və molekulların müəyyən siniflərində elektronlar işığı udur, enerji alır və sonra bu enerjini istilik və işıq emissiyası şəklində sürətlə itirirlər. Elektron öz spinini saxlayırsa, elektronun singlet vəziyyətə girdiyi deyilir və elektron əsas vəziyyətə qayıtdıqda yayılan işıq növü flüoresans adlanır. Elektron həyəcanlandıqda spinini dəyişirsə, üçlü vəziyyətə keçir və elektron əsas vəziyyətə qayıtdıqda yayılan işıq növü fosforessensiya kimi tanınır. Fosforessensiya flüoresansdan daha uzun ömürlüdür. Həm flüoresan, həm də fosforessensiya emissiyaları xüsusi həyəcanlanmış elektronlar üçün xüsusi dalğa uzunluqlarına malikdir. Emissiyanın hər iki növü həyəcan işığının xüsusi dalğa uzunluqlarından asılıdır və hər iki emissiya növü üçün həyəcan enerjisi emissiya enerjisindən daha böyükdür. Described another way, />of excitation light is shorter than />of emission light. In biology, we can utilize fluorescence in localization reactions, to identify particular molecules in complex mixtures or in cells. Fluorescence has the advantage of providing a very high signal-to-noise ratio, which enables us to distinguish spatial distributions of rare molecules. To utilize fluorescence, we need to label the specimen (a cell, a tissue, or a gel) with a suitable molecule (a fluorochrome) whose distribution will become evident after illumination. The fluorescence microscope is ideally suited for the detection of particular fluorochromes in cells and tissues.

The fluorescence microscope that is in wide use today follows the basic "incident-light" design of Ploem, who employed a novel arrangement of filters with a chromatic beam splitter (often wrongly called a dichroic filter both by biologists and microscope sales people). With the incident light fluorescence microscope, the object is illuminated with fluorescence excitation light through the objective lens. The object emits longer-l fluorescence in response to the shorter- excitation light. The objective lens then serves both for illumination and imaging. The chromatic beam splitter transmits or reflects light, depending on its color. For this application, shorter light is reflected and longer light is transmitted by the splitter. Ploem placed the chromatic splitter in the optical path between the objective lens and the ocular, at a 45° angle, so that it would reflect shorter light downward toward the objective. The longer- fluorescence emission light would be transmitted through the chromatic beam splitter toward the ocular.

The microscopes that you have utilized in this and other courses all operate in the same general fashion. Light beams pass through a condenser lens system and provide illumination of an object at many points simultaneously. For incident light fluorescence microscopy, the objective lens also acts as a condenser for the excitation light beam. In its interaction with the object, some of this light is absorbed, some of this light is scattered, some of this light is reflected, and some of this light is slowed or retarded (relative to a beam of light that does not pass through the object). A portion of the light that has interacted with the object then passes through the imaging lens system of the microscope where it provides us with visual or pictorial image information about the object. Like the process of illumination, the process of image generation operates in a parallel fashion, where large numbers of light beams contribute to the image simultaneously. Resolution is limited by the closeness of overlapping points of brightness or darkness. In a practical sense, the limit of resolution is 0.18-0.2 µm with the best available objective lenses and a good specimen.

To observe cells with the fluorescence microscope, it is important to know the spectral characteristics of the fluorochrome that has been employed. In order to excite the fluorochrome properly and then observe its fluorescence emission, the appropriate filter packages must be present in the microscope. The fluorochrome may not fluoresce at all if the cells are illuminated with the inappropriate filter pack present in the optical path. Finally, for any kind of fluorescence localizations to be performed, it is essential to have the appropriate controls, to be sure that the cells do not exhibit excessive autofluorescence (that is, they do not glow in the absence of the fluorochrome), and that the fluorochrome is responsible for the localization pattern observed. In the laboratory, we have several microscopes equipped for incident light fluorescence microscopy.

Confocal Scanning Optical Microscopy

In the incident light fluorescence microscope, a light beam passes through a chromatic beam splitter and then the objective lens to illuminate a specimen. This light beam is used to excite electrons in fluorochrome molecules present in the object. As some of those excited electrons return to their ground state, the emission of light is detectable through the oculars of the microscope, or with a camera or video printer. The image is generated continuously, across the entire field of view. A primary problem with the fluorescence images generated in this way is that out-of-focus fluorescence appears as 'flare' in the object, and reduces the signal substantially. In addition, human eyes are not sufficiently sensitive photodetectors for the lowest levels of fluorescence, and most video-based imaging systems are only slightly better than your eyes. Under conditions where there is sufficient signal for you to easily observe fluorochrome distribution patterns, the excitation light can be of sufficient intensity to photooxidize (yəni., burn) your specimen. Much information can be lost with just a few seconds of exposure to the excitation lamp. The Confocal Scanning Optical Microscope, an expensive piece of instrumentation that illuminates the object with a small beam of light in a point-by-point (yəni., serial) fashion, eliminates most of the photoxidation problems, permitting the observation of objects for extended periods at very high resolution with little loss of signal. The placement of a small aperture in the beam path generates a small depth of field, and effectively eliminates out of focus information in image formation.

The confocal scanning optical microscope is designed to illuminate an object in a serial fashion, point by point, where a small beam of light (from a LASER) is scanned across the object rapidly in an X-Y raster pattern. The raster pattern can be created in several ways, but in one of the more popular instruments, it occurs as a consequence of the simultaneous rotation and vibration of a polygonal mirror. The vibration is caused by the activity of a servogalvanometer, while the rotation is caused by the activity of a small electric motor. Thus, a bright spot of light scans across an object from top to bottom, line by line. The image is also generated point-by-point. Image formation is translated into intensities at each spot in the X-Y raster by a photomultiplier tube. The intensity information is digitized and stored in a computer. A complex image processing software package permits visualization and manipulation of the images. Resolution is limited by spot size for the LASER and approaches 0.12-0.15 µm for an ideal specimen and with the best available objective lenses.

The manufacturers of confocal scanning optical microscopes include a pinhole diaphragm at a very special place in the optical path, near to the site of the photomultiplier tube. This pinhole is situated in a plane where the light from the in-focus part of the image converges to a point. Light from object planes above or below that of the focused image do not converge at the spot in the optical path occupied by the pinhole. Because of this design, out of focus image information is darkened to the extent that it is not detectable. The consequence is that all out of focus information is removed from the image and the confocal image is basically an 'optical section' of what could be a relatively thick object. The 'thickness' of the optical section may approach the limit of resolution, but in practice, the resolution in the Z-direction is somewhat greater, approximately 0.4-0.8 µm. The value of optical sectioning is best realized with fluorescence microscopy, where out-of-focus information alters, distorts, or even degrades the image. Because the confocal images are stored in a computer, it is possible to stack them up and generate three-dimensional reconstructions. The image processing programs also enable us to rotate these images and observe three-dimensional aspects of cellular structure. It may be clear to you that the computer responsible for these image manipulations must be fast and powerful. The biggest problem is one of image storage, where single images can routinely occupy >1,000,000 bytes of space. In rather short periods of use, it is easy to accumulate sufficient numbers of images to fill the largest of hard disks.

Two of the three the confocal scanning optical microscopes located on campus were manufactured by Carl Zeiss, located in Germany. The newest instrument (model 510) has three lasers and four photomultipliers and is designed so that we could illuminate with two or three colors of light in rapid succession and detect as many as three superimposed signals (essentially) simultaneously. The signals are separated from each other on the basis of color, using an acoustical optical tunable filter (AOTF). The optical microscope is an inverted stand. The most important operational difference between this microscope and the upright microscope in most laboratories is that with this instrument, the slide is placed in the stage holder upside-down. Like most modern research microscopes, this microscope is equipped for phase contrast, differential interference contrast and fluorescence microscopy and can be used with these imaging techniques for conventional imaging. However, it is equipped with a number of very highly corrected (read expensive) objective lenses attached to the turret, just below the stage. These lenses are necessary for high resolution confocal microscopy. The confocal part of this microscope is contained in a box that is attached to the inverted stand through an access port. As is the case with incident light fluorescence, the laser light passes through the objective lens to illuminate the specimen. An air suspension table is designed to eliminate vibrations present in the building.

Deconvolution Microscopy and Image Reconstruction

An alternative approach for eliminating flare from fluorescent image stacks is to perform intensive, iterative image analysis and processing, from objects that have been illuminated and photographed at multiple, adjacent focal planes. The images are obtained with a high-performance CCD camera, operating at very high magnification, using standard incident light fluorescence microscopy. The excitation source is a mercury arc lamp, and bandwidth for excitation and emission are controlled by filters placed in rotating filter wheels. The lamp is stabilized and the beam is randomized for uniform illumination of the specimen. Unlike confocal scanning instruments, the whole field of view is illuminated simultaneously with this microscope. It is possible to perform rapid sequential imaging (4 colors) from multiple fluorochromes with this microscope. At very high magnification, fluorescence from any spot in a cell acts as a point source. By knowing the image spread functions above and below the plane of focus, it is possible to determine points of origin for fluorescence, and spreading beams of light from that point source, above and below the plane of focus. An iterative algorithm, which is essentially a linear combination is performed by a computer on the adjacent pixels within a single image plane, and in successive image planes through the thickness of the object. Spreading light beams are subtracted from reconstructed image stack, and that light is added back to the source, thereby reducing noise and increasing signal, respectively. We have recently acquired a sophisticated DeltaVision microscope from Applied Precision, Inc., which is designed to acquire these images and then perform the computer-intensive operations. This kind of microscope is particularly well suited for generating three-dimensional fluorescence images from small, living cells.

Polarization Light Microscopy

When light passes through an object, it interacts with some or all of the atoms and molecules present in that object. In these interactions, sometimes light of a particular (i.e., color) is absorbed by the atoms or molecules, while sometimes light is scattered. The interaction of light with a translucent object often results in a slight reduction in the velocity of the light beam. The extent of this reduction in velocity can be measured as the refractive index of the object. For certain kinds of objects, especially those with high order in particular axes of the object, such a crystalline or paracrystalline arrays, the interaction with light beams is vastly different, depending on the orientation of the object relative to the impinging light beam. As a result, the refractive indices are measurably different in different axes of the object. Such an object with multiple refractive indices is termed birefringent. Birefringence (multiple refractive indices) results from the alignment of atoms or molecules in particular planes of an object these atoms or molecules interact strongly with light beams impinging on them from a particular direction, and to a far lesser extent with light beams impinging on them from a different direction. There are two kinds of birefringence, intrinsic birefringence, which results from atomic or molecular order in a crystalline or paracrystalline array (i.e., calcite crystals, membranes) and form birefringence, which results from supramolecular associations in paracrystalline arrays (i.e., microtubules in a spindle).


- Polarized Light and Birefringent Retardation -

Any light beam shining in a particular direction vibrates in all directions around the axis of travel. Light beams whose vibration has been restricted to a single plane, or to a few planes is known as polarized light. Birefringence is directly observable as differences in intensity in different axes of crystalline or paracrystalline objects when they are viewed with polarized light. Since birefringence results from differences in the number of interactions between the light beam and atoms or molecules in the object in different directions, in practice, the object is rotated around the plane of vibration for the polarized light beam to maximize the intensity differences in the object (usually, the dominant object axis is at a 45o angle relative to the plane of polarization). The extent of the difference in refractive indices in different axes of the object is a measurable quantity known as birefringent retardation (BR). BR is measured (as a distance) by placing an object with known birefringent retardation into the light beam, and, by rotating the calibrated object around the optic axis, extinguishing the brightness in the sample. Using this compensation technique, BR has been shown to be directly related to the number of aligned microtubules in mitotic spindles in living cells. This principle and procedure can be of importance in studying microtubule dynamics, where mitotic spindles of developing sea urchins can be visualized in a totally noninvasive way.


Stereo Dissecting Microscope Focusing

If you are trying to get a stereo microscope into focus, the body of the microscope is either too far away or too close to your sample. If you know the working distance for the stereo microscope, you can properly set up the microscope so the head is the correct distance from the stand. Working distance is the distance that is required between the lens of the stereo microscope body and the top of your sample in order for your sample to appear in focus when looking through the microscope.

Keep in mind that when you add or remove a stereo microscope auxiliary lens, the working distance of your stereo microscope will change as well.


Videoya baxın: Fransada ovsunlanan tərk edilmiş 17-ci əsr Chateau 26 il ərzində tamamilə donmuş (Dekabr 2022).