Məlumat

Prolin iminopeptidaza və prolin aminopeptidaza

Prolin iminopeptidaza və prolin aminopeptidaza


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Biz bakalavr səviyyəsində müstəqil tədqiqat komandasıyıq və biz kommersiya prolin iminopeptidazı almaqda çətinlik çəkirik, çünki o, Sigma Aldrich-də mövcud deyil və digər vebsaytlarda çox bahalıdır. Test etməliyik ki, bu peptidaz e coli-də sintez etdiyimiz bir sıra tripeptidləri kəsəcək.

Prolin ala bilərik aminprolin əvəzinə peptidaza iminopeptidaza; peptidaz eyni şəkildə fəaliyyət göstərəcəkmi?

Bu kağız onların eyni olduğunu deyir, amma bu kağız onların fərqli olduğunu deyir. Bu kommersiya peptidazı ilə hər hansı bir təcrübəsi olan varmı?


N-terminal qalığını parçalayan iki əlaqəli ferment var. Növbəti qalıq prolin olduqda 3.4.11.9 fermenti peptiddən istənilən qalığı ayırır. 3.4.11.5 fermenti N-terminal prolini peptiddən ayırır. Təəssüf ki, hər ikisinin bəzən prolin aminopeptidaza adlandırıldığı görünür. Bununla belə, yalnız 3.4.11.5 prolin iminopeptidaza kimi istinad edilir.

Satıcı mütləq hansı fermenti təklif etdiyini dəqiqləşdirməlidir.


Aminopeptidaza

7 transmembran domeni olan rezident ER zülalı olan SPP, hər biri bitişik transmembran sarmallarında iki qorunmuş aspartat qalıqlarını ehtiva edir. Yuxarıda müzakirə edildiyi kimi, bu cür motivlər aspartik proteazın presenilin tipinə xasdır. S2P kimi, SPP tərəfindən parçalanma onun siqnal peptid substratlarının transmembran domenində spiral qıran qalıqları tələb edir.

SPP tərəfindən vasitəçilik edilən Rip-in ən yaxşı öyrənilmiş nümunəsi HLA-A, -B, -C və -G kimi MHC sinif I molekullarından siqnal peptidlərinin proteolitik emalıdır. Bu molekullar sekretor yola yönəlmək üçün tipik bir siqnal ardıcıllığı ilə ifadə edilir. ER membranı vasitəsilə onların translokasiyası zamanı siqnal ardıcıllığı siqnal peptidazası ilə pre-zülaldan ayrılır. 2-ci tip oriyentasiya ilə membrana bağlı qalan parçalanmış siqnal peptidləri daha sonra NH-ni azad etmək üçün membranın ortasında SPP tərəfindən parçalanır.2-sitozolda siqnal peptidlərinin terminal yarısı (Şəkil 1). Bu sitozolik fraqmentlər daha sonra qeyri-klassik MHC sinif I molekulu olan HLA-E ilə birləşdiyi ER lümeninə daşınır. HLA-E/peptid kompleksləri təbii killer (NK) hüceyrələrindəki CD94/NKG2A reseptorlarına bağlandığı və NK hüceyrə vasitəçiliyi ilə lizisi maneə törətdiyi hüceyrə səthinə keçir. Bu yol normal MHC sinif I molekullarını ifadə edən hüceyrələri NK hüceyrələri tərəfindən öldürülməkdən qoruyur.


Xaa-Pro Aminopeptidaza (Prokaryot)

Fərqləndirici Xüsusiyyətlər

Struktur olaraq əlaqəli Xaa-Pro dipeptidaza (prolidaza) (Fəsil 337) bakteriyalarda aşkar edilmişdir və Xaa-Pro dipeptidləri üçün spesifikdir. Bunun əksinə olaraq, XProAP Xaa-Pro-Xbb peptidlərini Xaa-Pro dipeptidlərindən daha tez parçalayır. Prolil aminopeptidaza (Fəsil 760), prokaryot XProAP kimi, poli-l-prolini parçalamağa qadirdir, lakin N-terminal Pro-Xaa bağı üçün spesifikdir.

Bir genomik analiz göstərdi ki, bir ortoloq E. coli XProXP digər γ-proteobakteriya növlərinin yalnız 65%-də və təhlil edilən α-proteobakteriya növlərinin heç birində mövcuddur [42]. Növlərin əksəriyyəti bir olmadan E. coli XProAP ortoloqunun əvəzinə N-terminusunda əlavə (üçüncü) domeni olan məməli aminopeptidaza P1 (APP1) ortoloqu var (Fəsil 342). Bu forma hələ prokaryotlarda xarakterizə olunmamışdır. Bəziləri Pseudomonas növlərin hər iki ortoloqu var. Maraqlıdır ki, insanlarda da var E. coli APP1 və membrana bağlı APP2 ( Fəsil 343 ) [42] ilə yanaşı, aminopeptidaza P3 (APP3) kimi istinad edilən XProAP ortoloqu. APP3 ilə 33% amin turşusu ardıcıllığı eynidir E. coli XProAP, lakin insan APP1 və APP2-nin son iki domenində müvafiq olaraq yalnız 12 və 16% eynilik. APP3 transkripti mitoxondrial və sitozolik izoformlar istehsal edərək alternativ birləşməyə məruz qalır [24,41]. Baxmayaraq ki, APP3 hələ təcrid olunmamış və xarakterizə edilməmişdir, onun genindəki spesifik mutasiyaların böyrəklərin kistoz xəstəliyi ilə nəticələndiyi aşkar edilmişdir [41,43].


Xanthomonas campestris pv-dən prolin iminopeptidazın quruluşu. sitri: prolil oliqopeptidaza ailəsi üçün prototip.

Xanthomonas campestris pv-dən olan prolin iminopeptidaza. citri yüksək spesifikliklə peptidlərdən N-terminal prolin qalıqlarının çıxarılmasını kataliz edən serin peptidazadır. Biz onun üçölçülü strukturunu çoxsaylı izomorf dəyişdirmə yolu ilə həll etdik və 2,7 A rezolyusiyaya malik olan rentgen məlumatlarından istifadə edərək onu 19,2% kristalloqrafik R faktoruna qədər dəqiqləşdirdik. Protein iki bitişik domenə qatlanır. Daha böyük domen alfa/beta hidrolaza qatının ümumi topologiyasını göstərir, mərkəzi səkkiz telli beta vərəqi iki spiral və bir tərəfdən 11 N-terminal qalıqları, digər tərəfdən isə dörd spiral ilə əhatə olunmuşdur. Kiçik domen daha böyük domenin üstünə yerləşdirilir və mahiyyətcə altı sarmaldan ibarətdir. Hər iki domen arasındakı interfeysdə dərin cibin sonunda yerləşən aktiv sayt Ser110, Asp266 və His294 katalitik triadasını ehtiva edir. Katalitik triadaya çox yaxın olan aktiv sahənin dibində yerləşən Cys269, ehtimal ki, tiol-spesifik reagentlər tərəfindən inhibəni təşkil edir. Bu iminopeptidazın ümumi topologiyası maya serin karboksipeptidazasının topologiyasına çox oxşardır. İnsan limfositik prolil oliqopeptidaza və dipeptidil peptidaza IV ilə təəccüblü ikinci dərəcəli quruluş oxşarlığı bu prolin iminopeptidaza strukturunu bu ailənin digər peptidazalarının üçölçülü quruluşu üçün uyğun bir model edir.


Proline Spesifik Aminopeptidazın Həddindən artıq İfadəsi Aspergillus oryzae JN-412 və Kollagen Deqradasiyasında Onun Tətbiqi

Hüceyrədaxili proline spesifik aminopeptidaza (PAP) fəaliyyətini nümayiş etdirən bir ştam soya sousu kojidən təcrid olundu və müəyyən edildi Aspergillus oryzae JN-412. PAP kodlayan gen klonlaşdırıldı və effektiv şəkildə ifadə edildi Escherichia coli BL21 bioloji aktiv formada. Optimal becərmə şəraitində ən yüksək spesifik aktivlik 52,28 Umq −1-ə çatmışdır. Rekombinant ferment Ni-yaxşılıq sütunu xromatoqrafiyasından istifadə edərək hüceyrəsiz ekstraktdan 36,7% bərpa etməklə homogenliyə qədər 3,3 dəfə təmizləndi. SDS-PAGE-də molekulyar kütləsi təxminən 50 kDa olan tək zülal zolağı kimi ortaya çıxdı. Təmizlənmiş ferment 60 °C və pH 7.5-də ən yüksək aktivliyi nümayiş etdirdi. Fermentin fəaliyyəti PMSF və Zn 2+ və Cu 2+ kimi ionlar tərəfindən inhibə edilmişdir. DTT, β-merkaptoetanol, EDTA və Co 2+, Mg 2+, Mn 2+ və Ca 2+ kimi ionların ferment aktivliyinə heç bir təsiri olmadı, Ni 2+ isə fermentin aktivliyini artırdı. Kollageni substrat kimi istifadə edərək, təmizlənmiş rekombinant prolil aminopeptidaza neytral proteaza ilə birlikdə istifadə edildikdə kollagenin hidrolizinə töhfə verdi və kollagenin hidrolizatlarında sərbəst amin turşuları əhəmiyyətli dərəcədə artdı.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Ağ çürüklü basidiomycetes Phanerochaete chrysosporium-dan unikal prolin iminopeptidazın xarakteristikası.

Prolin iminopeptidazı (PchPiPA) kodlayan ehtimal olunan gen Phanerochaete chrysosporium BKM-F-1767-dən RT-PCR vasitəsilə klonlaşdırılıb və Escherichia coli-də uğurla ifadə edilib. cDNA 942 bp uzunluğundadır və 313 amin turşusunu kodlayır. Rekombinant ferment yalnız sınaqdan keçirilmiş sintetik substratlar arasında Pro-pNA-nı hidroliz edə bildi. Leu-pNA, Phe-pNA və Tyr-pNA, həmçinin GGG-pNA, SGR-pNA, AAV-pNA, AAPL-pNA, AAVA-pNA-ya qarşı aktivlik aşkar edilmir. Və rekombinant ferment ferment-hidrolitik təbii zülallardan əldə edilən peptidləri parçalayaraq sərbəst lizini buraxa bildi ki, bu da substrat kimi N sonlarında lizin ilə sintetik oliqopeptidlərdən istifadə etməklə təsdiqləndi. Bu ferment üçün optimal pH və temperatur müvafiq olaraq 8,0 və 45 dərəcə C olmuşdur. Katalitik aktivliyi Mg(2+), Al(3+), Ca(2+), Fe(3+), Fe(2+) və Ba(2+) güclü şəkildə Ni(2+) ilə inhibə etmişdir. Mn(2+) və Co(2+) və demək olar ki, Zn(2+), Cu(2+) və Hg(2+) tərəfindən təsirsiz hala gətirilir. Bundan əlavə, ferment EDTA-Na(2), həmçinin DTT, beta-ME və H(2)O(2) redokslarına qarşı həssas deyildi. Benzamidin hidroxlorid və fenilmetil sulfonifloridin proteaz inhibitorları orta dərəcədə inhibə səbəb oldu. Pro-pNA-ya doğru V(max), K(m) və k(pişik) müvafiq olaraq 347.86 mumol min(-1) mq(-1), 2.15 mM və 218.10 S(-1) olmuşdur. Ser(107), Asp(264) və His(292)-nin çıxarılmış katalitik triadası sahəyə yönəldilmiş mutagenezlə təsdiq edilmişdir, çünki Ser(107)-nin Asp-ə, Asp(264)-ün Ala və ya His(292) ilə fərdi şəkildə dəyişdirilməsi. Leu tam inaktivasiyaya rəhbərlik etdi. RT-PCR ilə transkripsiya təhlili göstərdi ki, PchPiPA liqinolitik və qeyri-liqinolitik şəraitdə ifadə edilə bilər. Nəticə olaraq, prolin iminopeptidazın bu göbələkdə proteolitik sistemin üzvü ola biləcəyi təklif edildi. Rekombinant zülalın mövcudluğu müəyyən proteolitik emalda potensial olaraq istifadə edilə bilər.


Proline-Spesifik Hüceyrədənkənar Aminopeptidazadan təmizlənmişdir Streptomyces lavendulae

Aminopeptidazalar zülal və ya peptid substratlarının amin terminalından xüsusi amin turşularının parçalanmasını katalizləyir. Proline spesifik aminopeptidaza kulturasız ekstraktdan homojenliyə qədər təmizləndi. Streptomyces lavendulae Q-sefaroza və Sephadex G-100-də ammonium sulfat çöküntüsü, ultra filtrasiya və sütun xromatoqrafiyasından ibarət ardıcıl addımlarda ATCC 14162. Təmizlənmiş zülal SDS-PAGE-də təxminən 60 kDa göstərdi və pH 6,5 və 40 °C-də optimal aktiv idi. Kinetik tədqiqatlar göstərdi K mV maks Pro- istifadə edərək, müvafiq olaraq 0,23 mM və 0,087 μmol/dəq.səh-NA, maksimum spesifikliyi olan substrat. Ferment fəaliyyəti PMSF və Zn 2+, Co 2+ və Ni 2+ kimi ionlar tərəfindən inhibə edilmişdir. Bununla belə, digər aminopeptidazalardan fərqli olaraq, DTT, 1,10-fenantrolin, EDTA, amastatin və bestatinin iştirakı ilə aktivlik artmışdır. Ca 2+, Mg 2+ və Mn 2+ kimi ionlar da aktivliyi artırır.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Walter, R., Shlank, H., Glass, J. D., Schwartz, I. L. and Kerenyi, T. D., 1971. Science 173, 827-829.

Shlank, H. və Walter, R., 1972. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 141, 452–455.

Walter, R., 1973. Peptidlər 1972, Proc. 12-ci Avropa. Peptid Simp., (Hanson, H. və Jakubke, H. D., redaktorlar) səh. 363-378, Şimali Hollandiya Amsterdam Elsevier, Nyu York.

Walter, R., 1976. Biochim. Biofiz. Akta 422, 138–158.

Koida, M. və Walter, R., 1976. J. Biol. Kimya. 251, 7593–7599.

Yoshimoto, T., Orlowski, R. C. və Walter R., 1977. Biochemistry 16, 2942-2948.

Yoshimoto, T., Fischl, M., Orlowski, R. C. və Walter R., 1978. J. Biol. Kimya. 253, 3708–3716.

Walter, R. və Yoshimoto, T., 1978. Biochemistry 17, 4139-4144.

Yoshimoto, T., Ogita, K., Walter, R., Koida, M. və Tsuru, D., 1979. Biochim. Biofiz. Acta 569, 184–192.

Yoshimoto, T. və Tsuru, D., 1978. Agric. Biol. Kimya. 42, 2417–2419.

Yoshimoto, T., Tsuru, D., Koida, M., Simmons, W. və Walter, R., 1979. XIth Int. Konq. Biochem., Toronto səh. 231.

Schechter, I. and Berger, A., 1967. Biochem. Biofiz. Res. Kommun., 27, 157–162.

Walter, R. və Simmons, W. H., 1977. in Neyrohipofiz (Moses, A. M. və Share, L. redaktorlar), səh. 167-188, Karger, Basel.

Prasad, C. və Peterkofsky, A., 1976. J. Biol. Kimya. 251, 3229–3234.

Orlowski, M., Pearce, S., Wilk, E. and Wilk, S., 1978. Fed. Proc. 37(5), 915.

Rupnow, J. H., Taylor, W. L. və Dixon, J. E., 1979. Biochemistry 18, 1206-1212.

Emerson, C. H. və Vogel, W., 1979. Fed. Proc. 38, 3963.

Knisatschek, H. və Bauer, K., 1979. XIth Int. Konq. Biochem., Toronto, səh. 600.

Hersh, L. B. və McKelvy, J. F., 1979. Brain Res. 168, 553–564.

Oliveira, E. B., Martins, A. R. və Camargo, A. C. M., 1976. Biochemistry 15, 1967-1974.

Rauner, R. A., Schmidt, J. J. və Nəccar, V. A., 1976. Mol. Hüceyrə. Biokimya. 10, 77–80.

Van Eerd, J. P., Capony, J. P., Ferraz, C. və Pechere, J. F., 1978. Eur. J. Biochem. 91, 231–242.

Fleer, E. A. M., Verheij, H. M. və DeHaas, G. H., 1978. Eur. J. Biochem. 82, 261–269.

Hopsu-Havu, V. K. və Glenner, G. C., 1966. Histochem. 7, 197–201.

Hopsu-Havu, V. K. və Sarimo, S. R., 1967. Hoppe-Seylerin Z. Physiol. Kimya. 348, 1540–1550.

Barth, A., Schulz, H. and Neubert, K., 1974. Acta. Biol. Med. Mikrob. 32, 157–174.

Kenny, A. J., Booth, A. G., George, S. G., Ingram, J., Kershaw, D., Wood, E. J. and Young, A. R., 1976. Biochem. J. 157, 169–182.

Krutzsch, H. C. və Pisano, J. J., 1979. Biochim. Biofiz. Akta 576, 280–289.

Oya, H., Nagatsu, I. və Nagatsu, T., 1972. Biochim. Biofiz. Akta 258, 591–599.

Svensson, B., Danielsen, M., Jeppesen, L., Noren, O. and Sjostrom, H., 1978. Eur. J. Biochem. 90, 489–498.

Yoshimoto, T. və Walter, R., 1977. Biochim. Biofiz. Akta 485, 391–401.

McDonald, J. K., Callahan, P. X., Ellis, S. and Smith, R. E., 1971. Tissue Proteinases (Barrett, A. J. and Dingle, J. T., redaktorlar) səh. 69-107, Şimali Hollandiya, Amsterdam.

Hopsu-Havu, V. K. və Ekfors, T. O., 1969. Histochemie 17, 30-38.

Kato, T., Hama, T., Kojima, K., Nagatsu, T. və Sakakibara, S., 1978. Clin. Kimya. 24, 1163–1166.

Hopsu-Havu, V. K., Rintola, P. və Glenner, G. G., 1968. Akta. Kimya. Qaldırmaq. 22, 299–208.

Fukasawa, K. M., Fukasawa, K. və Harada, M., 1978. Biochim Biophys. Acta 535, 161–166.

Wolf, B., Fischer, G. and Barth, A., 1978. Acta Biol. Med. Mikrob. 37, 409–420.

Kullertz, G., Fisher, G. and Barth, A., 1978. Acta Biol. Med. Mikrob. 37, 559–567.

Barth, A., 1979. Wiss. Z. Univ. Halle 3, 23–48.

Kato, T., Nagatsu, T., Fukasawa, K., Harada, M., Nagatsu, I. və Sakakibara, S., 1978. Biochim. Biofiz. Acta 525, 417–422.

Heymann, E. və Mentlein, R., 1978. FEBS Lett. 91, 360–364.

Yajima, H., Kitagawa, K. və Segawa, T., 1973. Chem. Əczaçılıq. Buğa 21, 2500–2506.

Hino, M., Nagatsu, T., Kakumu, S., Okuyama, S., Yoshii, Y. və Nagatsu, I., 1975. Clin. Çim. Fəaliyyət 62, 5–11.

Fuyamada, H., Hino, M., Nagatsu, T., Ogawa, K. və Sakakibara, S., 1977. Clin. Çim. Fəsil 74, 177–181.

Kar, N. C. və Pearson, C. M., 1978, Klinika. Çim. Akta 82, 185–192.

McDonald, J. K., Callahan, P. X. və Ellis, S., 1972. Meth. Enzimol. 25, 272–281.

Sarid, S., Berger, A. və Katchalski, E., 1959. J. Biol. Kimya. 234, 1740–1746.

Sarid, S., Berger, A. və Katchalski, E., 1962. J. Biol. Kimya. 237, 2207–2212.

Nordwig, A. and Mayer, H., 1973. Hoppe-Seylerin Z. Physiol. Kimya. 354, 380–383.

Brecher, A. S. və Suszkiw, J. B., 1969. Biochem. J. 112, 335–342.

Marks, N., Datta, R. K. və Lajtha, A., 1968. J. Biol. Kimya. 243, 2882–2889.

Simmons, W. H. və Brecher, A. S., 1973. J. Biol. Kimya. 248. 5780–5784.

Hayashi, M. və Oshima, K., 1977. J. Biochem. 81, 631–639.

Khilji, M. A. və Bailey, G. S., 1978. Biochim. Biofiz. Acta 527, 282–288.

Yaron, A. və Berger, A., 1970. Meth. Enzimol. 19, 521–534.

Yaron, A. və Mlynar, D., 1968. Biochem. Biofiz. Res. Kommun. 32, 658–663.

Dehm, P. və Nordwig. A., 1970. Eur. J. Biochem. 17, 364–371.

Kenny, A. J., Booth, A. G. and Macnair, R. D. C., 1977. Acta Biol. Med. Mikrob. 36, 1575–1585.

Odya, C. E., Marinkovic, D. V., Hammon, K. J., Stewart, T. A. və Erdos, E. G., 1978. J. Biol. Kimya. 253, 5927–5931.

Dehm, P. və Nordwig, A., 1970. Eur. J. Biochem. 17, 372–377.

Yang, H. Y. T., Erdos, E. G. and Chiang, T. S., 1968. Nature 218, 1224-1226.

Yang, H. Y. T., Erdos, E. G., Chiang, T. S., Jenssen, T. A. and Rodgers, J. G, 1970. Biochem. Farmakol. 19, 1201–1211.

Kakimoto, T., Oshima, G., Yeh, H. S. J. və Erdos, E. G., 1973. Biochim. Biofiz. Akta 302, 178–182.

Smith, E. L., 1955. Meth. Enzimol. 2, 93–109.

Davis, N. C. və Adams, E., 1955. Arch. Biokimya. Biofiz. 57, 301–305.

Grassmann, W., Von Schoenebeck, O. and Auerbach, G., 1932. Hoppe-Seylerin Z. Physiol. Kimya. 210, 1–14.

Davis, N. C. və Smith, E. L., 1953. J. Biol. Kimya. 200, 373–384.

Mayer, H. və Nordwig, A., 1973. Hoppe-Seylerin Z. Physiol. Kimya. 354, 371–379.

Akrawi, A. F. və Bailey, G. S., 1976. Biochim. Biofiz. Akta 422, 170–178.

Akrawi, A. F. və Bailey, G. S., 1977. Biochem. Soc. Trans. 5, 271–274.

Bergmann, M. and Fruton, J. S., 1937. J. Biol. Kimya. 117, 189–202.

Rapley, S., Lewis, W. H. P. və Harris, H., 1971. Ann. zümzümə. Genet. 34, 307–320.

Baksi, K. və Radhakrishnan, A. N., 1974. Indian J. Biochem. Biofiz. 11, 7–11.

Ryden, A. C., 1971. Acta Chem. Scan. 25, 847–858.

Davis, N. C. və Smith, E. L., 1957. J. Biol. Kimya. 224, 261–275.

Sjostrom, H., Noren, O. və Josefson, L., 1973. Biochim. Biofiz. Akta 327, 457–470.

Lin, L. N. və Brandts, J. F., 1979. Biochemistry 18, 43-47.

Sjostrom H., 1974. Acta Chem. Qaldırmaq. B. 28, 802–808.

Sjostrom, H. və Noren, O., 1974. Biochim. Biofiz. Acta 359, 177–185.

Sjostrom, H. və Noren, O., 1978. Int. J. Pept. Prot. Res. 11, 159–165.

Wingard, M., Matsueda, G. and Wolfe, R. S., 1972. J. Bact. 112, 940–949.

Lewis, W. G., Basford, J. M. and Walton, P. L., 1978. Biochim. Biofiz. Akta 522, 551–560.

Pitlick, F. A., Nemerson, Y., Gottlieb, A. J., Gordon, R. G. və Williams, W. J., 1971. Biochemistry 10, 2650-2657.

Simmons, W. H., Burkholder, D. E. and Brecher, A. S., 1976. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 152, 576–584.

Kasper, C. B., 1975. Protein ardıcıllığının təyin edilməsində (Needleman, S. B., redaktor), səh. 114-161, Springer-Verlag, New York.

Bennick, A., Wong, R. and Cannon, M., 1977. Kalsium bağlayan zülallar və kalsium funksiyasında (Wasserman, RH, Corradino, RA, Carafoli, E., Kretsinger, RH, MacLennan, DH and Siegel, FL, redaktorlar), səh. 391–400, Şimali Hollandiya, Amsterdam.

Schlesinger, D. H. və Hay, D. I., 1979. 6-cı Am. Peptid Simp. (mətbuatda.)

Marks, N. və Walter R., 1972. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 140, 673–676.

Nair, R. M. G., Kastin, A. J. və Schally, A. V., 1971. Biochem. Biofiz. Res. Kommun. 43, 1376–1381.

Khilji, M. A., Akrawi, A. F. və Bailey, G. S., 1979. Mol. Hüceyrə. Biokimya. 23, 45–52.

Adams, E., Davis, N. C. və Smith, E. L., 1952. J. Biol. Kimya. 199, 845–856.

Sobel, R. E. və Brecher, A. S., 1971. Can J. Biochem. 49, 676–685.

Chenoweth, D., Mitchell, R. E. J. and Smith, E. L., 1973. J. Biol. Kimya. 248, 1672–1683.

Marks, N. və Lajtha, A., 1970. Meth. Enzimol. 19, 534–543.

Doumeng, C. və Maroux, S., 1979. Biochem. J. 177, 801–808.

Marks, N., Abrash, L. və Walter, R., 1973. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 142, 455–460.

Abrash, L., Walter, R. and Marks, N., 1971. Experientia 27, 1352-1353.

Suszkiw, J. B. və Brecher, A. S., 1970. Biochemistry 9, 4008-4017.

McDonald, J. K. Mid Schwabe, C., 1977. Məməli hüceyrələrinin və toxumalarının zülallarında (Barrett, A. J., redaktor), səh. 311-391, Şimali Hollandiya, Amsterdam.

Hayashi, R., 1976. Meth. Enzimol. 45, 568–587.

Zuber, H., 1976. Meth. Enzimol. 45, 561–568.

Hofmann, T., 1976. Meth. Enzimol. 45, 587–599.

Matsuda, K., 1976. J. Biochem. 80, 659–669.

Ambler, R. P., 1972. Meth. Enzimol. 25, 262–272.

Carraway, R. and Leeman, S. E., 1975. J. Biol. Kimya. 250, 1907–1911.

Soffer, R. L., 1976. Ann. Rev. Biochem. 45, 73–94.

Yaron, A., 1976. Met. Enzimol. 45, 599–610.

Hayman, S. və Patterson, E. K., 1971. J. Biol. Kimya. 246, 660–669.

Noren, O., Sjostrom, H. və Josefsson, L., 1973. Biochim. Biofiz. Akta 327, 446–456.

Orlowski, M., Wilk, E., Pearce, S. and Wilk, S., 1979, J. Neurochem. 33, 461–469.


Nəticələr

Ardıcıllıq təhlili xccR/pip yer

Ardıcıl genomların axtarışı Xcc ATCC 33913 (da Silva və b., 2002) və Xcc 8004 (Qian və b., 2005 ) tərəfindən tblastn-ın yalnız bir nüsxəsi olduğunu aşkar etdi xccR/pip lokus və ya onun komponentlərinin hər biri. Lokusda, xccR gen yuxarıda və eyni oriyentasiyadadır pip və intergenik ardıcıllıq 438 bp uzunluğundadır (şəkil 1A).

Ardıcıllıq təhlili xccR/pip yer. A. Genetik arxitektura xccR/pip yer və pip promotor ardıcıllığı. 2.1 kb DNT ardıcıllığı xccR/pip yeri Xcc 8004 müvafiq olaraq XccR və PIP kodlayan iki birbaşa yönümlü ORF-dən (XC_1295 və XC_1296) ibarətdir. 438 bp-lik intergenik ardıcıllıq, ehtimal olunan promotorunu ehtiva edir pip, 20 bp palindromik ardıcıllığı (luxXc qutusu), −35 elementi və −10 elementi. B. Alignment Xcc luxXc ilə qutu lüks digər bakterial genlərin promotor bölgələrində müəyyən edilmiş qutular. Genlərin adları ardıcıllığın sağında göstərilir. C. xccR/pip-digər bakteriya növlərində rast gəlinən lokuslar kimi.

PIP-in çıxarılan amin turşusu ardıcıllığı hesablanmış molekulyar kütləsi 34 kDa olan 313 amin turşusu qalığından ibarətdir. partlayış axtarışı (Altschul və b., 1997 ) məlumat bazalarına qarşı PIP-nin olduğunu ortaya qoydu Xcc dən PIP-lərlə əhəmiyyətli ardıcıl oxşarlıqları paylaşdı Lactobacillus delbrueckii (CAA81556, E = 2 × 10 −40 ) ( Klein və b., 1994 ), Thermoplasma acidophilum (1MU0_A, E = 2 × 10 −39 ) ( Goettig və b., 2002) və Bacillus coagulans (BAA01792, E = 2 × 10 −39 ) (Kitazono və b., 1992). Pfam analizi (Bateman və b., 2004) göstərdi ki Xcc PIP, bütün bildirilmiş PIP-lər kimi, tipik katalitik triadanı təşkil edən Ser106, Asp246 və His273 qalıqları ilə α/β-hidrolaz qatını ehtiva edir. Ardıcıllığı Xcc PIP, LaaA (l-amin turşusu amidaza) ilə daha çox oxşardır Pseudomonas azotoformans IAM 1603 (BAD15092 E = 2 × 10 −104 ) ( Komeda və b., 2004). Maraqlıdır ki, substratın spesifikliyi təhlili LaaA-nın peptidləri deyil, l-amin turşusu amidlərini hidroliz edə bilməyəcəyini göstərdi.

Proqnozlaşdırılan XccR zülalında 254 amin turşusu var. partlayış təhlili göstərdi ki, XccR funksional QS tənzimləyiciləri ilə əhəmiyyətli ardıcıllıq oxşarlıqlarını bölüşür, o cümlədən AhyR Aeromonas hidrofila (CAA61654 E = 2 × 10 −13 ) ( Swift və b., 1997), BviR-dən Burkholderia cepacia (AAK35156 E = 3 × 10 −11 ) ( Lutter və b., 2001) və LasR-dən Pseudomonas aeruginosa (BAA06489 E = 1 × 10 −10) (Gambello və Iglewski, 1991). Pfam və SMART ilə təhlillər ( Letunic və b., 2004) göstərdi ki, XccR N-terminal avtoinduser-bağlayıcı domenə və C-terminal spiral-dönmə-heliks DNT-ni bağlayan domenə malikdir. Bununla belə, LuxR tipli zülalların ən azı 95%-də eyni olan doqquz qalıq arasında ( Zhang və b., 2002 ), Trp57 və Tyr61 (TraR-a görə nömrələnmiş) XccR-də qorunub saxlanılmamışdır. Hər iki qalığın TraR və AHL-lər arasındakı qarşılıqlı əlaqədə iştirak etdiyi göstərildi (Zhang və b., 2002), XccR-nin AHL tipli molekulları bağlamaq qabiliyyətinin olmaya biləcəyini göstərir. Həqiqətən, XccR-ni işə salmaq üçün təcrübələrimizdə sınaqdan keçirilmiş AHL-lərin heç biri tərəfindən aktivləşdirilə bilməyəcəyini gördük. pip promotorla idarə olunan GUS ifadəsi (məlumatlar göstərilmir). Genom axtarışı da bunu ortaya qoydu Xcc LuxI (Fuqua və b., 1996), LuxM (Basler və b., 1993) və HdtS (Laue və b., 2000), sənədləşdirilmiş nəticəyə uyğundur Xcc AHL aktivliyi olan birləşmələr yaratmadı (Ch və b., 1998 ).

438 bp-lik intergenik ardıcıllıq daxilində 20 bp-lik palindromik ardıcıllığın tərcümə başlanğıc yerindən -70.5-də mərkəzləşdiyi aşkar edilmişdir. pip (Şəkil 1A) və çox oxşardır lüks qutu ardıcıllığı (Boz və b., 1994 Şuster və b., 2004 Urbanovski və b., 2004 Weingart və b., 2005 ) (şək. 1B). Bu araşdırmada biz bu ardıcıllığı belə adlandırdıq luxXc Qutu. Genlərarası ardıcıllıqda, həmçinin aşağı axınında -35 elementə bənzər TTATCC ardıcıllığı və iki nukleotid ilə üst-üstə düşür. luxXc qutusu və −10 elementə bənzər TAGGCT ardıcıllığı (şək. 1A). Bu ardıcıllıq motivlərinin yeri əvvəlki sənədlərlə uyğundur lüks qutular həmişə bir və ya iki nukleotid tərəfindən σ 70 tipli promotorların -35 elementi ilə üst-üstə düşür ( Fuqua və b., 1996). Ümumi strukturu Xcc xccR/pip locus bizi XccR və ya onun aktivləşdirilmiş forması ilə bağlana biləcəyini təxmin etməyə sövq etdi luxXc içərisində qutu pip ifadəsini tənzimləmək üçün intergenik bölgədə yerləşən promotor pip.

Daha sonra tblastx-dan istifadə edərək 2.1 kb-lıq DNT ardıcıllığını əhatə edir xccR/pip digər bakteriya genomları ilə lokus və oxşar lokuslar bir neçə digər bitki patogen və simbiotik növlərdə aşkar edilmişdir (Şəkil 1C). Əksəriyyəti üçün pip onlarda genlər xccR/pip-lokus kimi, a lüks qutuşəkilli element ehtimalda yerləşir pip promotor bölgəsi (Şəkil 1C). Bu lokusların bioloji funksiyası və ifadə tənzimlənməsi araşdırılmamışdır.

The xccR/pip patogenliyi üçün lokus tələb olunur Xcc ev sahibi üzərində

olub olmadığını müəyyən etmək üçün xccR/pip lokusu patogenlik fenotipinə təsir göstərmişdir Xcc, biz inşa etdik xccR- və ya pip- pozuldu Xcc gərginlik, adlı Xcc müvafiq olaraq 8515 və 8702. Mutant ştammların, eləcə də yabanı tipli ştammın virulentliyi yarpaqları kəsmə üsulu ilə hər birində 20 kələm yarpağında sınaqdan keçirilmiş və simptomlar aşılamadan 9 gün sonra şiddət şkalası (0-4) üzrə qiymətləndirilmişdir. Cədvəl 1-də göstərildiyi kimi, orta virulentlik səviyyəsi səbəb olur Xcc 8702 vəhşi növdən əhəmiyyətli dərəcədə aşağı idi (3,80-ə qarşı 0,40, P < 0,01). Nə vaxt Xcc 8702 a daşıyan pFR419 ilə dəyişdirildi lak promouter tərəfindən idarə olunur pip gen (lak-P/pip), tamamlanmış ştam vəhşi növ ştamla oxşar virulentlik səviyyəsini nümayiş etdirdi (3.70-ə qarşı 3.80, P > 0,05). Nəzarət olaraq, boş vektor pLAFR3-ün tətbiqi Xcc 8702 mutantın virulentliyini artırmadı. Beləliklə, belə qənaətə gəlirik ki, pip patogenliyi üçün gen tələb olunur Xcc ev sahibi kələm üzərində.

Ştammlar Orta virulentlik balı (SD) a
Xcc 8004 3.80 (0.51)
Xcc 8702 0.40 (0.58)
Xcc 8702/pFR419 3.70 (0.71)
Xcc 8515 0.55 (0.67)
Xcc 8515/pFR420 3.60 (0.80)
  • a. Hər bir ştam üçün orta və standart kənarlaşma (SD) peyvənddən sonra 9 gün ərzində səkkiz müxtəlif fərdi bitkidə 20 yarpağın virulentlik ballarından hesablanmışdır.

pozulması xccR virulentliyini azaldıb Xcc 0,55 bala qədər (Cədvəl 1, Xcc 8515) ilə oxşardır Xcc 8702. An ilə tamamlama xccR a daşıyan pFR420 plazmidi ilə gen lak-P/xccR kimerik gen virulentlik səviyyəsini 3.60-a bərpa etdi, bu da ona yaxın idi Xcc 8004 (P > 0,05). Yenə pLAFR3-ün tətbiqi Xcc 8515 mutantın virulentliyini artırmadı. Bu məlumatlar onu dəstəklədi xccR gen tam virulentliyi üçün də əvəzsizdir Xcc.

Bir çox bakterial mutantlar auksotrofikdir və onlar tez-tez auksotrofiyaya görə sağ qalmalarına təsir edərək, patogenlik fenotipinin azalmasına səbəb olurlar. Bu mutantlar minimal mühitdə böyüyə bilməzdilər. Şiddətli dərəcədə zəifləmiş virulent olub olmadığını araşdırmaq Xcc 8702 və Xcc 8515 auksotrofiyanın təsirindən yaranmışdır, biz hər iki mutantın minimal mühitdə böyüməsini təhlil etdik. Hər iki mutant ştammın böyümə sürətinin vəhşi növə bənzədiyini aşkar etdik Xcc 8004 və ya müvafiq tamamlanmış ştammlar (məlumatlar göstərilmir), bunu göstərir pip və ya xccR öz başına virulentliyi üçün tələb olunur Xcc ev sahibi üzərində.

XccR-nin həddindən artıq ifadəsi aktivləşdirir pip təşviqatçı

XccR-nin aktivləşdirib-aktiv etdiyini yoxlamaq üçün pip promotor, biz XccR-ifadə edən pFR420 plazmidini təqdim etdik Xcc 8004 və PIP fəaliyyəti Xcc Erkən və orta eksponensial, keçid və stasionar fazalar da daxil olmaqla müxtəlif bakteriya artım mərhələlərində 8004/pFR420 yoxlanılmış və yabanı tipli ştamlarla müqayisə edilmişdir. Xcc 8004. Biz tapdıq ki, PIP fəaliyyəti Xcc 8004 bakteriya artım fazaları boyunca çox aşağı qaldı, plazmidlə ifadə olunan XccR isə hər bir ölçmə vaxtı nöqtəsində PIP aktivliyini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (məlumatlar göstərilmir). Bu nəticələr ifadənin zəif olduğunu göstərir Xcc Vəhşi fonda PIP mədəniyyət mühitində bakteriya artımı ilə birlikdə dəyişmir və XccR potensial aktivatordur. pip təşviqatçı. induksiyasını daha da təsdiqləmək üçün pip təşviqatçı (pip-P) plazmidlə ifadə olunan XccR ilə biz qurduq Xcc hər iki xromosomu ehtiva edən 8008 ştammı pip-P/pippip-P/gusA birləşmələr (şək. 2). Gözlənildiyi kimi, in Xcc 8008-də həm PIP, həm də GUS fəaliyyəti çox aşağı səviyyədə idi, pFR420-nin gərginliyə daxil edilməsi isə həm PIP, həm də GUS-un ifadə səviyyələrini müvafiq olaraq 20 və 400 dəfə artırdı (Şəkil 3A). Bütün genom axtarışı Xcc iki zülal (GenBank Girişi No. XC_0928 və XC_3394) müəyyən etmişdi ki, onlar zülal topologiyasını və PIP-inkinə oxşar enzimatik aktiv sahə qalıqlarını proqnozlaşdırmış, lakin PIP ilə ümumi ardıcıllıq oxşarlığının yalnız 15-17%-ni bölüşürlər. Bu iki zülalın yuxarıda qeyd olunan XccR həddindən artıq ifadə təcrübələrində iştirak edib-etmədiyini araşdırmaq üçün PIP aktivliyi Xcc pFR420 plazmidi ilə və ya olmayan 8702 ölçüldü. Yalnız nəzərə alınmayan PIP fəaliyyəti aşkar edilmişdir Xcc 8702 və ya Xcc 8702/pFR420 (məlumatlar göstərilmir), bu, bu iki zülalın müşahidə olunan artan PIP aktivliyinə az töhfə verdiyini göstərir. Xcc 8004/pFR420 və Xcc 8008/pFR420 suşları.

Tikintisi Xcc 8008 və Xcc 8116. vasitəsilə homoloji rekombinasiya yolu ilə pip promotor ardıcıllığı klonlanmış (birlikdə gusA) intihar vektorunda pKnockout-Ω3 və təqdim olunur Xcc xromosom, bütün vektor ardıcıllığı inteqrasiya edilmişdir Xcc xromosom. Nəticə Xcc 8008 hər ikisini ehtiva edir pip-P/gusA kimerik gen və yerli pip-P/pip gen. İnşa etmək Xcc 8116, a pip promotordan məhrumdur luxXc Qutu [pip-P(Δbox)] ifadəsi rekombinasiya ardıcıllığı kimi istifadə edilmişdir gusA tərəfindən idarə olunacaqdı pip-P(Δbox), vəhşi tip isə pip və onun promotoru toxunulmaz saxlanılırdı. Silinmişlərin mövqeyi luxXc qutu boz düzbucaqlı ilə göstərilir.

Plazmid kodlu xccR -dən ifadəyə səbəb olur pip bütövlükdə daşıyan promouter luxXc Qutu. Bütün ştamlar maye NYG mühitində becərildi və analizlər OD hüceyrə sıxlığında aparıldı.600 = 1.5. A. Həm PIP, həm də GUS-un fərqli ifadə səviyyələri Xcc enzimatik fəaliyyətlərlə yoxlanılan suşlar. B. Səviyyələri pipgusA müxtəlif transkriptlər Xcc real vaxt rejimində RT-PCR ilə ölçülən suşlar. Digər suşlarda transkriptlərin bolluğu buna nisbətən təqdim olunur Xcc 8008. (A) və (B) bəndlərindəki orta və SD hər biri təkrarlanan təsbitlərlə beş müstəqil mədəniyyətdən əldə edilmiş məlumatlardan hesablanmışdır.

XccR-nin həddindən artıq ifadəsinin artıb artmadığını müəyyən etmək üçün real vaxt rejimində əks transkripsiya polimeraza zəncirvari reaksiyası (RT-PCR) aparıldı. pip və ya gusA transkripsiya səviyyəsində ifadə. Ümumi RNT kulturasından çıxarılıb Xcc OD-də 8008 və ya 8008/pFR420 gərginliyi600 1.5. The gusApip mRNA səviyyələri Xcc 8008/pFR420, müvafiq olaraq, 70 və 11 dəfə yüksək idi. Xcc 8008 (Şəkil 3B). Bu nəticələr enzimatik aktivlik testlərinin nəticələrinə uyğun idi və daha sonra XccR-nin həddindən artıq ifadəsinin aktivləşdirdiyini göstərdi. pip təşviqatçı.

The luxXc qutu XccR üçün vacibdir pip təşviqatçı

Kimi luxXc qutunun rolu olan XccR-nin bağlanma yeri olacağı proqnozlaşdırılırdı luxXc qutunun induksiyasında oynadı pip XccR tərəfindən promouter araşdırıldı. tikdik Xcc ifadəsi olan 8116 ştammı pip yerlinin nəzarəti altında idi pip promouter, isə gusA geninin bir variantına birləşdirildi pip promotordan məhrumdur luxXc Qutu [pip-P(Δbox)] (Şəkil 2). Sonra pFR420 plazmidi ştama daxil edildi. Enzimatik analiz göstərdi ki, PIP aktivliyi Xcc 8116/pFR420 ondan 18 dəfə yüksək idi Xcc 8116-da müşahidə edilən təkmilləşdirməyə bənzər Xcc 8008/pFR420, pFR420-nin tətbiqindən sonra GUS aktivliyinin səviyyəsi dəyişməz qaldı. Xcc 8116-da müşahidə ediləndən kəskin fərqli olaraq Xcc 8008/pFR420 (Şəkil 3A). XccR-nin hər ikisinin ifadəsinə təsiri pipgusA içərisində genlər Xcc 8116 həmçinin real vaxt rejimində RT-PCR ilə transkripsiya səviyyəsində təhlil edilmişdir. Yenə XccR-nin həddindən artıq ifadəsi transkript səviyyəsini artırdı pip bütöv promotorla 11 dəfə, lakin buna az təsir göstərmişdir gusA mutasiyaya uğramış promotorun olmaması ilə luxXc qutu (Şəkil 3B). Bu nəticələrdən aydın olur ki luxXc qutu lazimdir cis-induksiyasındakı element pip potensial transaktivator XccR tərəfindən promotor. Bu təklif bir nümayişlə dəstəkləndi in vitro XccR-nin bağlanması luxXc qutusu gel-hərəkətlilik dəyişikliyi təcrübələri ilə göstərildiyi kimi. Ümumi zülal olduqda Xcc 8004/pFR420 32 P-etiketli 46 bp DNT zondu ilə inkubasiya edilib. luxXc qutu ardıcıllığı, yerdəyişmiş zolaq kimi zülal-DNT kompleksi əmələ gəldi (Şəkil 4A, zolaq 2). Bu yerdəyişmiş zolaq etiketlənməmiş zond (Şəkil 4A, 3 və 4 zolaqlar) ilə rəqabət apara bilərdi, lakin DNT fraqmenti ilə deyil. luxXc qutu ardıcıllığı (Şəkil 4A, zolaq 5). XccR-nin müşahidə olunan zülal-DNT kompleksində iştirakı, ümumi zülalın ümumi zülalı olduqda, yerdəyişmə zonasının olmaması ilə təsdiq edilmişdir. xccR- pozulmuş 8515 ştammı zond bağlama təcrübəsində istifadə edilmişdir (şəkil 4A, zolaq 6) və superdəyişmiş zolağın görünüşü ilə yalnız immun öncəsi zərdab deyil, anti-XccR antiserum ümumi ilə birgə inkubasiya edildikdən sonra zülalı Xcc 8004/pFR420 və etiketli zond (Şəkil 4B, zolaqlar 1 və 2). Bundan əlavə, XccR ilə spesifik əlaqə luxXc qutu ardıcıllığı Xcc üzərində aparılan xromatin immunoprecipitation (ChIP) təcrübələri ilə hüceyrələr göstərilmişdir Xcc 8116, XccR-aşırı ifadə edən pFR420 plazmidi ilə çevrildi. The anti-XccR antiserum was used to precipitate DNA sequences cross-linked to XccR. Real-time PCR analyses of the precipitated DNA sequences indicated that the abundance of the pip promoter containing an intact luxXc box in front of the pip gene was threefold higher than that of the luxXc box-deleted pip promoter sequence upstream of gusA as well as that of a gusA-coding region which was served as a control of apparently not bound by XccR (data not shown).

Gel-mobility shift experiments characterizing in vitro binding of XccR to the luxXc box. A. A 32 P-labelled 46 bp DNA fragment containing the luxXc box sequence (Probe) was used in the protein-binding assays (lane 1). A protein–DNA complex (Shift) was formed when the total protein of Xcc 8004/pFR420 was incubated with the probe (lane 2). The shifted band could be competed by 50- (lane 3) or 100-fold (lane 4) excess of the unlabelled probe, but not by 200-fold excess of a DNA fragment (Δbox) without the luxXc box sequence (lane 5). There was no such a shifted band when the total protein of the xccR-disrupted strain Xcc 8515 was incubated with probe (lane 6). The dried gel was exposed to X-ray film at −20°C for 12 h. B. Supershift assays. Involvement of XccR in the shifted band was revealed by a supershifted band (Super shift) when the anti-XccR antiserum (lane 2), not the rabbit pre-immune serum (lane 1), was co-incubated with the total protein of Xcc 8004/pFR420 and the labelled probe. The supershifted band was significantly enhanced when Xcc 8004/pFR420 was pre-incubated in the cabbage extract for 12 h before the total protein was extracted (lane 4). The dried gel was exposed to X-ray film at −20°C for 10 days.

As the sequence of the luxXc box overlaps with the predicted −35 element of the pip promoter by two nucleotides, deletion of the luxXc box may change the basal activity of the pip təşviqatçı. To clear this, we constructed Xcc strain 8173 in which gusA was under the control of a truncated pip promoter lacking only the upstream half of the luxXc Qutu. When plasmid pFR420 was introduced into this strain, the GUS activity was not increased (Wang, L., unpublished data). This result further confirmed the importance of an intact luxXc box in activation of the pip promoter by XccR. In addition, as half-site of the palindromic sequence was not enough for the induction by XccR, we predicted that XccR may be an ambidextrous activator, similar to most of LuxRs which functioned as dimers.

The pip expression is induced by the host plant via the cis-element luxXc box

We have shown that in NYG medium culture, the pip promoter was induced by the overexpressed XccR and the luxXc box was essential for this induction. kimi pip was shown to be required for Xcc's pathogenicity, we were interested to see if pip expression in Xcc is also enhanced by the host in the Xcc-infected plants and the function of the luxXc box in the enhancement. For this purpose, we first assayed the expression level of gusA in Xcc 8008 grown bitkilərdə. The bacterial cells re-suspended in sterile water (OD600 = 0.5) were vacuum-infiltrated into 2- to 3-week-old cabbage seedlings. After 33 h, the bacterial cells were recovered from the plant leaves and GUS activity was assayed. The level of GUS activity in Xcc 8008 grown bitkilərdə was eightfold higher than that in the bacterium cultured either in NYG medium (Fig. 5A) or in minimal medium MMX (data not shown), indicating that the pip promoter was induced by the host cabbage. Digər tərəfdən, nə vaxt Xcc 8116 was vacuum-infiltrated into the cabbage seedlings, the bitkilərdə growth of Xcc 8116 did not enhance the GUS expression compared with the GUS activity in this strain grown in NYG medium (Fig. 5A), indicating that the luxXc box was required for the bitkilərdə induction of the pip təşviqatçı.

Expression of the chromosomal pip-P/gusA fusion gene is induced bitkilərdə. A. In planta cultivation significantly increased the GUS activity from Xcc 8008 while had no influence on that of Xcc 8116. The bacteria were recovered from infiltrated cabbage leaves 33 h post infiltration and GUS activity was assayed. GUS activity in the bacteria grown in NYG medium was assayed at an OD600 1.5. The mean and SD were calculated from the data derived from 10 independent experiments. B. The growth rates of Xcc 8008 and 8116 after infiltrating into cabbage seedlings. The experiments were repeated four times with similar results. The figure shows a representative set of data.

We also examined the growth rate of Xcc strains 8008 and 8116 bitkilərdə. Both strains exhibited similar growth curves (Fig. 5B), thus excluding the possibility that the different responses of GUS expression to the host induction between strains 8008 and 8116 was caused by the difference in their growth bitkilərdə.

To further confirm the induction of the pip promoter by the host plant and through the luxXc box, we constructed GUS reporter plasmids pFR421 that carried a pip-P/gusA fusion and pFR422 carrying a gusA gene fused to pip-P(Δbox). The two plasmids were separately introduced into Xcc 8004, and the resultant strains were infiltrated into the cabbage seedlings. As predicted, the bitkilərdə cultivation increased the GUS activity in Xcc 8004/pFR421 by eightfold (Fig. 6, A), while had no influence on that in Xcc 8004/pFR422 (Fig. 6, B). The results were consistent with those observed by using Xcc strains containing chromosomal pip-P/gusA (8008) or pip-P(Δbox)/gusA (8116) (Fig. 5A). We then conclude from these results that the expression of pip was induced by the host plant, and the luxXc box was required for this bitkilərdə induction.

Induction of the pip promoter by the host plant monitored by reporter plasmids. Vəhşi tip Xcc 8004 carrying a plasmid-borne pip-P/gusA fusion construction (Xcc 8004/pFR421) exhibited increased GUS activity when grown bitkilərdə (A). -nin silinməsi luxXc box in the pip-P/gusA fusion (Xcc 8004/pFR422) (B) or disruption of xccR içində Xcc xromosom (Xcc 8515/pFR421) (C) resulted in a failure in bitkilərdə induksiyası gusA expression. Disruption of the chromosomal pip gen (Xcc 8702/pFR421) enhanced the induction of the pip promoter by the host plant (D). GUS activity was assayed on the bacteria grown in NYG medium at an OD600 of 0.5, or cultured in the host 28 h post infiltration. The mean and SD were calculated from the data derived from five independent cultures.

The bitkilərdə induction of the pip promoter is dependent on XccR

We have shown that overexpression of XccR could activate the pip promoter in medium culture and that the pip promoter was induced bitkilərdə in the absence of the plasmid-expressed XccR but in the presence of the chromosomal xccR gen. To explore whether XccR expressed from the chromosomal xccR contributes to the induced expression of pip in the host plant, we constructed an xccR-disrupted strain 8515 from Xcc 8004 to determine the effect of vanishing of XccR on the induction of the pip promoter by the host. Plasmid pFR421 was introduced into Xcc 8515 and then Xcc 8515/pFR421 was vacuum-infiltrated into the cabbage seedlings. Bacterial cells were recovered 28 h post infiltration, and GUS activity was assayed. The result showed that the GUS activity in recovered Xcc 8515/pFR421 was much lower (Fig. 6, C) than that in Xcc 8004/pFR421 cultured bitkilərdə (Fig. 6, A), suggesting that the chromosomally expressed XccR was indeed necessary for the bitkilərdə induction of the pip təşviqatçı. We also compared the gusA expression level in Xcc 8004/pFR421 with that in Xcc 8515/pFR421 when they were cultured in NYG medium. No obvious difference in GUS activity was found between the two strains (Fig. 6, A and C), suggesting that when Xcc was grown in NYG medium, the chromosomal xccR expressed at a very low level or yielded a dysfunctional product unable to activate the pip təşviqatçı. We assume that the plant environment or some specific plant factors may help XccR become an active transcription regulator. This assumption was partly substantiated by the result of a supershift experiment in which a total protein of Xcc 8004/pFR420 that had been incubated in a cabbage extract for 12 h was used for formation of the ternary complex with the anti-XccR antiserum and the luxXc box-containing probe. The formed supershift band (Fig. 4B, lane 4) was significantly intensified compared with that formed with the total protein of the same strain cultured in NYG medium (Fig. 4B, lane 2), indicating that the host plant extract can enhance the activity of XccR to bind to the pip təşviqatçı.

PIP negatively regulates the pip təşviqatçı bitkilərdə

In a classic QS regulation system, LuxR, LuxI and AHL constitute a positive feedback circuit ( Engebrecht və b., 1983 ). Disruption of either gene can result in a failed induction of the luxI promoter by the LuxR/AHL complex. We were interested to see whether PIP also had some influence on its own expression. Plasmid pFR421 which carries a pip-P/gusA fusion was introduced into the pip-disrupted strain Xcc 8702. GUS activity in Xcc 8702/pFR421 grown in medium or recovered from the cabbage leaves was assayed and compared with that in Xcc 8004/pFR421 from the same growing condition. When cultured bitkilərdə, GUS activity in Xcc 8702/pFR421 (Fig. 6, D) was 2.3-fold higher than that in Xcc 8004/pFR421 (Fig. 6, A). However, when grown in medium, the two strains showed a similar low level of gusA expression (Fig. 6, A and D). We can conclude from these results that PIP negatively regulated the activity of its own promoter only when Xcc was grown bitkilərdə. Apparently, when Xcc was grown bitkilərdə, the pip promoter was subject to both positive and negative regulations by XccR and PIP respectively. The physiological implications of such a counteraction on Xcc pip expression remain to be elucidated.

PIP is a periplasmic protein

Information about subcellular localization of bacterial proteins may provide useful clues to the elucidation of their biological functions. To examine the subcellular localization of the Xcc PIP, total cellular protein from Xcc cells cultured in NYG medium was fractionated into periplasmic and cytoplasmic fractions by osmotic shock and PIP activities in each fraction were assayed. Because the GUS protein is known to accumulate in the cytoplasm, it was used as a marker to monitor the leakage of proteins from the cytoplasmic space. We used several strains to analyse the distribution of PIP and GUS in periplasm and cytoplasm, including Xcc 8008 in which both gusApip expressed at low levels, Xcc 8008/pFR419 in which PIP is overexpressed from the plasmid pFR419 carrying a lac-P/pip fusion gene, and Xcc 8008/pFR420 in which both genes expressed at high levels. Typically in Xcc 8008/pFR420, 93.4% of the total cellular PIP activity was found in the periplasmic fraction, while only 5.6% of the total GUS activity was in this fraction (Fig. 7). Similar distribution patterns of PIP and GUS were found in Xcc 8008 and Xcc 8008/pFR419 (data not shown). Moreover, only neglectable PIP activity was detected in the cell–free culture supernatants (data not shown), indicating that PIP was not secreted extracellularly. From these results, the Xcc PIP proved to be localized predominantly in the periplasm. Because PIP was shown to be capable of regulating its own expression, it is very likely that the self-regulation of PIP is through an indirect way.

Xcc PIP is localized in the periplasmic space. Xcc 8008/pFR420 was cultured in NYG medium and the total cellular protein was fractionated into periplasmic and cytoplasmic fractions by osmotic shock. PIP and GUS activities in each fraction were determined and are expressed as percentages of the total cellular activities of PIP and GUS respectively. The mean and SD were calculated from the data derived from three independent cultures harvested at OD600 1.5.


Materiallar və metodlar

Crystal data

XCPIP was purified and crystallized using NaCl as precipitating agent as previously described ( Medrano və b., 1997 ). These crystals belong to the orthorhombic space group C222, contain one homodimer per asymmetric unit and have cell constants a = 147.2 Å, b = 167.8 Å and c = 85.6 Å. These crystals diffract beyond 2.7 Å resolution.

Heavy-atom derivatives of the enzyme were prepared at room temperature by soaking crystals in heavy-atom solutions (Table I). One native and several derivative X-ray diffraction data sets were collected on a 300 mm MAR-Research image plate detector attached to a Rigaku RU200 rotating anode generator providing graphite monochromatized CuKα radiation at −15 to −20°C. Data were processed with the MOSFLM package ( Leslie, 1991 ), and loaded, scaled and merged with the CCP4 package ( CCP4, 1994 ). Statistics for native and heavy-atom derivative data are given in Table I.

Compound Konsentrasiya Vaxt Limiting resolution (Å) No. of collected/unique reflections Completeness of data (%) Rmerge d d Rmerge = Σ|I−<I>|/ΣI, where I is the measured intensity and <I> is the average intensity obtained from multiple measurements of symmetry-related reflections.
Riso e e Riso = Σ‖FP|−|FPH‖/Σ|FP|, where |FP| is the protein structure-factor amplitude and |FPH| is the heavy-atom derivative structure-factor amplitude.
Phasing power f f Phasing power = r.m.s. (|FH|/E), where |FH| is the heavy-atom structure-factor amplitude and E is the residual lack of closure calculated for acentric data (20-3.0 Å).
Sites
Doğma 2.7 154 900/29 854 93.9 9.6 - - -
HG1 a a 0.1 M sodium citrate, pH 6.0 and 4.0 M NaCl.
HgS Saturated 3 gün 3.6 27 028/9781 78.4 7.4 0.311 1.54 3
HG2 b b 0.2 M Tris-HCl, pH 8.1 and 15% polyethylene glycol monomethyl ether 5000.
1-(4-chloromercuriphenylazo)-2-naphthol (C16H11ClHgNO2) Saturated 2 gün 3.0 64 607/18 837 84.6 12.8 0.256 0.16 2
PT1 b b 0.2 M Tris-HCl, pH 8.1 and 15% polyethylene glycol monomethyl ether 5000.
Pt(II)-(2,2′-6′,2′′-terpyridine)-chloride Saturated 2 gün 3.0 65 116/20 036 93.8 14.7 0.177 0.88 2
PT2 a a 0.1 M sodium citrate, pH 6.0 and 4.0 M NaCl.
K2PtCl4 10 mM 16 h 3.0 52 678/19 170 88.7 8.9 0.242 0.29 3
URA c c 0.1 M sodium citrate, pH 5.0 and 4.0 M NaCl.
Na2U2O7 Saturated 16 h 3.0 71 979/14 608 68.4 12.9 0.101 0.12 1
  • a 0.1 M sodium citrate, pH 6.0 and 4.0 M NaCl.
  • b 0.2 M Tris-HCl, pH 8.1 and 15% polyethylene glycol monomethyl ether 5000.
  • c 0.1 M sodium citrate, pH 5.0 and 4.0 M NaCl.
  • d Rmerge = Σ|I−<I>|/ΣI, where I is the measured intensity and <I> is the average intensity obtained from multiple measurements of symmetry-related reflections.
  • e Riso = Σ‖FP|−|FPH‖/Σ|FP|, where |FP| is the protein structure-factor amplitude and |FPH| is the heavy-atom derivative structure-factor amplitude.
  • f Phasing power = r.m.s. (|FH|/E), where |FH| is the heavy-atom structure-factor amplitude and E is the residual lack of closure calculated for acentric data (20-3.0 Å).

Structure determination and refinement

The structure was solved by multiple isomorphous replacement (MIR). Heavy-atom positions were localized by difference Patterson maps, vector verification calculations and difference Fourier maps using the program PROTEIN ( Steigemann, 1974 ). The correct handedness was established using the procedure described by Hoeffken (1988) . Heavy-atom positions, occupancies and isotropic B-factors were refined with the program MLPHARE as implemented in the CCP4 package. The mean figure of merit at 3.0 Å resolution was 0.33 (see Table I for heavy-atom refinement and phasing statistics).

The initial 3.0 Å Fourier map was improved by density modification, including solvent flattening, solvent flip and skeletonization in two cycles with DM as implemented in the CCP4 package. After this step, the average figure of merit increased to 0.80, in particular due to the high solvent content (65%). The boundaries of both crystallographically independent molecules were clearly visible. An initial discontinuous poly-alanine polypeptide model was built into this modified electron density using the program TURBO-FRODO ( Roussel and Cambilleau, 1992 ). Atomic models were refined applying NCS restraints using the program X-PLOR ( Brünger, 1992 ). The electron density was additionally improved performing 2-fold averaging with the RAVE package ( Kleywegt and Jones, 1994 ).

Calculated phases, obtained from intermediate models in successive cycles of manual rebuilding, were combined with the phases obtained after density modification using the program SIGMAA as implemented in the CCP4 package these combined phases were used for calculation of 2FoFcFoFc maps. The amino acid sequence ( Alonso and García, 1996 ) was successively built in to completion of the final model containing residues 1-313 for each crystallographically independent molecule. Additionally, 199 solvent molecules placed at stereochemically reasonable positions were added with the help of the program WATPEAK of CCP4 and checked visually. Positional and individual constrained isotropic B-factor refinement was performed with X-PLOR. A summary of the refinement statistics is shown in Table II. A Ramachandran plot of the main chain torsion angle pairs, calculated with the program PROCHECK ( Laskowski və b., 1993 ), show all residues but Ser110 situated in allowed regions, with only the latter in a generously allowed position. Pro44 and Pro76 exhibit a cis uyğunluq. No significant differences are observed between both crystallographically independent molecules, reflected by the low r.m.s. deviation of 0.11 Å for all 313 common Cα atoms. The polypeptide chains of both molecules could be entirely traced only six side chains of molecule A and five of molecule B had to be inactivated due to partially discontinuous density.

Space group C222
Cell constants
a 147.2 Å
b 167.8 Å
c 85.6 Å
Limiting resolution 2.7 Å
Non-hydrogen protein atoms 6140
Solvent molecules 199
Reflections used for refinement 26 672
Resolution range 7.0-2.7 Å
R-factor 19.2%
Rpulsuz 25.3%
R.m.s deviations from target values
bond length 0.010 Å
bond angles 1.530°
bonded B-factors 2.613 Å 2

Comparison of the XCPIP structure with other known three-dimensional structures was carried out with the program DALI ( Holm and Sander, 1993 ).

The X-ray coordinates of XCPIP will be deposited at the Brookhaven Protein Data Bank.