Məlumat

12.3D: Genetik zondlar və PCR istifadə edərək DNT analizi - Biologiya

12.3D: Genetik zondlar və PCR istifadə edərək DNT analizi - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Patogen izolatların genotiplənməsi şübhəli epidemiyaların tədqiqi zamanı və yoluxucu xəstəliklərin izlənməsi zamanı dəyərli dəstək verir.

Öyrənmə Məqsədləri

  • DNT və ya RNT və ya mikroorqanizm daxilində unikal nukleotid ardıcıllıqlarını aşkar etmək üçün genetik zondların necə istifadə oluna biləcəyini təsvir edin.

Əsas Nöqtələr

  • Hibridləşmə bakteriya növünü onun DNT seqmentlərini təhlil edərək müəyyən edə bilər.
  • Genetik zondlar müəyyən bir mikrobdan DNT-nin xüsusi ardıcıllığını tamamlayan kiçik DNT və ya RNT fraqmentləridir.
  • Bu yanaşma kulturası çətin olan mikroorqanizmlər səbəbindən infeksiyaların aşkarlanmasında ən faydalıdır.

Əsas Şərtlər

  • polimeraza zəncirvari reaksiya: Nümunədən DNT-nin çoxsaylı nüsxələrini yaratmaq üçün molekulyar biologiyada texnika; genetik barmaq izində istifadə olunur və s.

Genetik zondlar mikroorqanizmin DNT və ya RNT ilə unikal nukleotid ardıcıllığının aşkarlanmasına əsaslanır. Virulentlik geninin və ya xromosom DNT-nin bir hissəsini təmsil edə bilən belə unikal nukleotid ardıcıllığı tapıldıqdan sonra, o, təcrid olunur və klonlama vektoruna (plazmid) daxil edilir, sonra o, Escherichia coli-yə çevrilir və bir neçə nüsxə çıxarır. prob. Ardıcıllıq sonra plazmidlərdən yenidən təcrid olunur və diaqnostik istifadə üçün izotop və ya substratla etiketlənir. DNT və ya RNT-nin tamamlayıcı ardıcıllığı ilə ardıcıllığın hibridləşməsi nümunədəki mikroorqanizmin ikiqat zəncirli DNT-nin parçalanmasından sonra baş verir. Yoluxucu xəstəliklərin diaqnostikasında molekulyar texnologiyanın istifadəsi, DNT polimerazanın DNT-nin tamamlayıcı zəncirlərini uzatmaqla DNT zəncirini kopyalaya bildiyi polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) kimi gen gücləndirmə üsullarının tətbiqi ilə daha da gücləndirilmişdir. yaxın məsafədə yerləşən bir cüt oliqonukleotid primerindən başlamışdır. Bu yanaşmanın becərilməsi çətin olan (məsələn, insanın immunçatışmazlığı virusu) və ya hələ uğurla becərilməmiş mikroorqanizmlərin (məsələn, Whipple xəstəliyi çöpü) səbəb olduğu infeksiyaların aşkar edilməsində əsas tətbiqləri olmuşdur.

Müəyyən edilmişdir ki, patogen təcridlərin genotipləşdirilməsi şübhəli epidemiyaların tədqiqinə, şübhəsiz ötürülmənin aşkarlanmasına, icma daxilində yoluxucu agentlərin axtarışına və yeni diaqnoz qoyulmuş hallar üçün mümkün infeksiya mənbələrinin müəyyən edilməsinə dəyərli dəstək verir. Milli və ya beynəlxalq səviyyədə barmaq izi müxtəlif coğrafi ərazilərdən olan ştammları müqayisə etməyə və ayrı-ayrı ştammların hərəkətini izləməyə imkan verir. Barmaq izi texnikası yüksək keyfiyyətli genomik DNT tələb edir ki, bu da təkcə hazırlamaq çətin deyil, həm də orqanizmin kultivasiyasını tələb edir, nəticədə uzun müddətə çevrilir. Bundan əlavə, barmaq izinin təfsiri və uyğunlaşdırılması mürəkkəb ola bilər və geniş miqyaslı analiz üçün mürəkkəb kompüter proqramı tələb edir.

Bunun əksinə olaraq, nuklein turşusunun gücləndirilməsinə əsaslanan analizlər orqanizmlərin kultivasiyasını tələb etmir, bu da nümunələrin real vaxtda təhlilinə imkan verir. Bir çox PCR-əsaslı tipləmə analizlərində maraq doğuran hədəf DNT PCR ilə gücləndirilir və etiketlənir və etiketlənmiş məhsullar bir sıra immobilizasiya edilmiş diaqnostik zondlara hibridləşdirilir. Bu üsul Mycobacterium tuberculosis-in dərmanlara davamlılıq genlərində mutasiyaların aşkarlanması və Mycobacterium növlərinin identifikasiyası üçün uğurla istifadə edilmişdir. Birbaşa təkrar (DR) lokusunda bir sıra unikal boşluqların mövcudluğunu aşkar edən tərs nöqtə ləkəsi analizi olan Spoligotyping, M. tuberculosis kompleks ştammlarını ayırd etmək üçün sadə və sürətli metod ehtiyacını qarşılayır. Bununla belə, spoloqotipləmə barmaq izinə nisbətən daha az ayrı-seçkilik gücünə malikdir.


Polimeraza Zəncirvari Reaksiya (PZR): PCR üzrə Biologiya Qeydləri

PCR, in vitro DNT sintezi ilə xüsusi və şəfalı DNT ardıcıllığının eksponensial gücləndirilməsi üçün sadə və bacarıqlı bir üsul təqdim edir, yəni bu texnika çox miqdarda DNT fraqmentlərini klonlaşdırmadan sintez etməyə imkan verir.

Kary Mulis 1985-ci ildə Taq DNT polimeraza adlı fermentin istifadəsinə əsaslanan texnikanı inkişaf etdirdi. PCR texnikası artıq avtomatlaşdırılmışdır və xüsusi və utancaq şəkildə hazırlanmış maşın tərəfindən həyata keçirilir.

Texnika aşağıdakı üç addımı əhatə edir (Şəkil 22.16):

i. DNT fraqmentinin denatürasiyası:

Gücləndiriləcək hədəf DNT-ni ehtiva edən ardıcıllıq onun tamamlayıcı zəncirlərini ayırmaq üçün istiliklə denatürasiya olunur (təxminən 94°C-də 15 saniyə), bu proses hədəf DNT-nin əriməsi adlanır.

ii. Astarların yumşaldılması:

Primerlər həddindən artıq əlavə edilir və temperatur 60 saniyə ərzində təxminən 68°C-ə endirilir, nəticədə primerlər hidrogen bağları əmələ gətirir və DNT ardıcıllığının hər iki tərəfində DNT-yə bağlanır.

Nəhayət, reaksiya qarışığına müxtəlif nukleozid trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) və termostabil DNT polimeraza (Thermus aquaticus-dan Taq polimeraza və Thermococcus litoralis-dən Vent polimeraz) əlavə olunur, primerlərin polimerləşmə prosesinə kömək edir və buna görə də , hədəf DNT ardıcıllığının çoxlu nüsxələrinin sintezində nəticə verən primerləri (68°C-də) genişləndirir.

Bütün bu addımları bir dövrədə tamamladıqdan sonra eyni prosesdən sonra yenidən ikinci dövrə təkrarlanır. Əgər 20 belə sikl baş verərsə, o zaman hədəf DNT ardıcıllığının təxminən bir milyon nüsxəsi istehsal olunur. Bu yaxınlarda bu texnologiya daha çox təkmilləşdirilmişdir, burada Taq polimeraza əvəzinə RNT-ni DNT-yə köçürən və sonra DNT-ni gücləndirən rT-ci polimeraza istifadə olunur.

PCR-nin dəyişdirilmiş formaları:

Ənənəvi PCR simmetrik PCR üsuludur. Müxtəlif məqsədlər üçün istifadə olunan bir neçə başqa dəyişdirilmiş PCR formaları var:

AP-PCR (ixtiyari astarlanmış polimeraza zəncirvari reaksiya):

Bu, PCR-də istifadə olunan primerlərlə müqayisədə nisbətən daha kiçik uzunluqda yalnız bir primer tələb edir. Bu texnologiyadan DNT profilinin yaradılması, heyvan və bitki biotexnologiyasında, eləcə də məhkəmə tibbdə istifadə olunur.

Bir zəncirinin hədəf ardıcıllığı və ardıcıllığı tamamlayıcı zəncirlə müqayisədə bir neçə miqyasda gücləndirilə bilər. Bu yanaşma DNT-nin ardıcıllığı üçün istifadə ediləcək tək zəncirli DNT fraqmentinin yaradılması üçün xüsusilə faydalıdır.

IPCR (ters çevrilmiş polimeraza zəncirvari reaksiya):

Bu üsulda o, məlum DNT ardıcıllığını əhatə edən DNT-nin gücləndirilməsinə imkan verir, primerlər xaricə baxır. Tərs PCR-dən istifadə edərək, məlum ardıcıllıqları əhatə edən naməlum ardıcıllıqlar asanlıqla gücləndirilə bilər.

RT-PCR (əks transkriptaza polimeraza zəncirvari reaksiya):

PCR gücləndirilməsi ümumiyyətlə DNT şablonunda həyata keçirilsə də, bu texnikadan istifadə etməklə RNT gücləndirmə üçün də istifadə edilə bilər. Bu texnika genlərin ifadəsini öyrənmək və gizlətmək və mRNT-nin qaranlıq növlərini izləmək üçün xüsusilə faydalıdır.

Yuvalanmış PCR primerləri birinci primer cütünün daxili olanlardır. PZR-nin birinci raundunun yaratdığı daha böyük fraqmentlər ikinci PCR üçün şablon kimi istifadə olunur. Bu texnika hər hansı saxta qeyri-spesifik gücləndirmə məhsullarını aradan qaldırır.

Biotexnologiyada PCR tətbiqi:

PCR-in bir çox qat tətbiqi var.

1. Klonlaşdırmanın sürətli alternativi kimi gen fraqmentlərinin gücləndirilməsi:

(a) Bakterial plazmidlərin əlavələri primerlərlə gücləndirilə bilər.

(b) məlum ardıcıllıqdan DNT primerlərin layihələndirilməsi ilə əldə edilə bilər.

(c) PCR əlaqəli orqanizmlərdən homoloji ardıcıllıqların müəyyən edilməsinə kömək edir.

(d) RT-PCR istifadə edərək cDNA-nın 3-cü ucu gücləndirilə bilər (RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends).

(e) Əks PZR məlum DNT klonunun cinah ardıcıllığını bilməyə kömək edir.

2. DNT fraqmentlərinin modifikasiyası:

PCR primerləri kimi oliqonukleotidlərdən istifadə edərək sayta yönəldilmiş mutagenez struktur-funksiya əlaqəsini öyrənmək üçün güclü yanaşma təmin edir.

3. Patogen mikroorqanizmin diaqnostikası:

İnsanın və ya heyvanın yoluxmuş hissələrinin DNT-si patogenin primer spesifik geni ilə PCR-ə məruz qala bilər və DNT-nin gücləndirilməsi ilə diaqnostika və şinoz edilə bilər.

4. Arxeoloji Nümunələrin DNT Analizi:

DNT nisbətən sabit olduğundan və uzun müddət toxunulmaz qaldığından, PCR həmin daxil edilmiş və gizlənmiş materiallardan DNT-nin təhlilinə kömək edə bilər.

5. İrsi xəstəliklər üçün uyğun mutasiyaların aşkarlanması:

İstənilən nöqtə mutasiyası, silinmə və ya daxiletmə və genişləndirilmiş tandem trinukleotid təkrarı PCR ilə aşkar edilə bilər. Onkogenlərdə və ya şiş repressor genlərindəki somatik mutasiyalar, əlavələr və ya silinmələrin yanında olan primerlərlə PCR ilə də aşkar edilə bilər.

6. Atalığın yoxlanılması və irsi əlamətlərin xəritələşdirilməsi üçün Məhkəmə Tətbiqləri üçün Genetik Markerlərin Təhlili.

(b) ixtiyari, tez-tez qısa (10 bp) primerləri olan RAPD (Random Amplified Polimorphic DNT).

7. SINE ardıcıllığına əsaslanan primerdən istifadə edərək kəsişən təkrar elementlər (IRS) arasında DNT Seqmentlərinin Növlərə Xüsusi Gücləndirilməsi (Qısa Aralıq Nüvə Elementləri).

8. PCR istifadə edərək genetik mühəndislik:

PCR-dən istifadə edərək biz 5-ci ucunda primerə ardıcıllığı dəyişdirərək, silməklə və ya əlavə etməklə son məhsula dəyişiklik və ya mutasiyanı daxil edə bilərik. Rekombinant PCR texnikası ilə iki DNT fraqmentini bir-birini tamamlayan üst-üstə düşmələr vasitəsilə xüsusi və şəfalı bir yerdə birləşdirmək mümkündür (Bu texnika splicing adlanır). Dəyişdiriləcək daxili sahəni əhatə edən iki mutagen primeri sintez etməklə, bir fraqment daxilində mutasiyaları təqdim etmək mümkündür.


PCR və DNT ardıcıllığı Molekulyar Biologiyanın bir çox sahələrində çox vacib alətlərdir. DNT fraqmentlərinin gücləndirilməsi PCR texnikası ilə həyata keçirilir, DNT fraqmentinin nukleotidlərinin düzgün sırası isə DNT ardıcıllığı ilə müəyyən edilir. Bu, PCR və DNT ardıcıllığı arasındakı fərqdir.

İstinad:
1. “Polymerase Chain Reaction (PCR).” National Center for Biotechnology Information. ABŞ Milli Tibb Kitabxanası, n.d. Veb. 21 fevral 2017-ci il.
2. Shendure, Jay və Hanlee Ji. “Növbəti nəsil DNT ardıcıllığı.” Təbiət Xəbərləri. Nature Publishing Group, 09 Oktyabr 2008. Veb. 21 fevral 2017-ci il

Şəkil Nəzakət:
1. “PCR Steps” By Tinojasontran – Commons Wikimedia vasitəsilə öz işi (İctimai Sahə)
2. “Polimeraza zəncirvari reaksiya” Enzoklop tərəfindən – Commons Wikimedia vasitəsilə öz işi (CC BY-SA 3.0)
3. “DNT ardıcıllığı” Sjef tərəfindən – Commons Wikimedia vasitəsilə öz işi (İctimai Sahə)

Oxşar yazılar:

Müəllif haqqında: Samanthi

Dr.Samanthi Udayangani bakalavr dərəcəsinə malikdir. Bitki Elmləri, M.Sc. Molekulyar və Tətbiqi Mikrobiologiya və Tətbiqi Mikrobiologiya üzrə PhD. Tədqiqat maraqlarına Bio-gübrələr, Bitki-Mikrob qarşılıqlı təsirləri, Molekulyar Mikrobiologiya, Torpaq Göbələkləri və Göbələk Ekologiyası daxildir.

Bir cavab buraxın Cavabı ləğv edin

Seçilmiş Yazılar


12.3D: Genetik zondlar və PCR istifadə edərək DNT analizi - Biologiya

Biz hər hansı bir xüsusi patogen üçün qPCR testlərini qurur, təsdiqləyir və paketləyirik. 2 həftədən az müddətdə

Çoxlu patogenlərin təhlili heç bir məhdudiyyət olmadan sadə standart protokol

eyni vaxtda bir neçə patogenin eyni vaxtda təhlili.

CoVID-19 N / S MONODOSE dtec-RT-qPCR Dupleks CE / IVD

GenoClean buferi ilə nümunənin çıxarılması/təmizlənməsi yoxdur (5 dəqiqə)

• S gen hədəfi, maksimum eksklüzivlik (J. Appl. Microbiol. 130, 2-13. 2020) və 100% diaqnostik spesifiklik (ISCIII, Madrid PHE, London)

• N geninin hədəfi, maksimum həssaslıq (CDC, Atlanta, 2020)

• Otaq temperaturunda daşınma (susuz) • Ekzogen daxili nəzarət

• Fast-Cycling bir saatdan az • Standart müsbət nəzarət

-nin böyük uğuru Şəbəkə RISA (İspaniyada Heyvan Sağlamlığına həsr olunmuş tədqiqatçılar) konfransla: "Afrika donuz taunu virusu: Qlobal həllər tələb edən qlobal xəstəlik".

Bu gün 24 mart Ümumdünya Vərəmlə Mübarizə Günüdür Şəbəkə RISA (İspaniyada Heyvan Sağlamlığına həsr olunmuş tədqiqatçılar) harada genetik PCR həlləri™ üzvüdür, bu zoonoz xəstəliklə əlaqədar müvafiq hesabat dərc etmişdir.

Hesabata baxmaq üçün şəkilə klikləyin

Şirkət genetik PCR həlləri ™ Böyük Britaniyada ortaya çıxan SARS-CoV2-nin yeni nəsli B.1.1.7 üçün eksklüziv PCR dəsti hazırlayır

genetik PCR həlləri ™ mövsümi qripi aşkar etmək və onu CoVID-19-dan fərqləndirmək üçün qPCR dəsti hazırlayır

genetik PCR həlləri ™ onun təsisçisi və direktoru Dr. Martínez-Murcia ilə hesabat və müsahibə.

Hesabata və müsahibəyə baxmaq üçün şəklin üzərinə klikləyin

genetik PCR həlləri™ Səhiyyə mərkəzlərində istifadə olunacaq koronavirusların aşkarlanması üçün genetik test üzərində işləyir, nəticələr cəmi 30 dəqiqəyə alına bildi.

Xəbərə baxmaq üçün şəklin üzərinə klikləyin

RAPID MİKROBİOLOGİYA - Jurnal

İlk CoVID-19 qPCR Kiti Ticarətdə Mövcuddur

Xəbərə baxmaq üçün şəklin üzərinə klikləyin

RAPID MİKROBİOLOGİYA - Jurnal

CEO Prof. Dr. Martínez-Murcia ilə müsahibə - GPS™ CoVID-19 İstifadəyə Hazır qPCR Kitinə dair fikir

Müsahibəyə baxmaq üçün şəklin üzərinə klikləyin

Dr Martinez-Murcia ilə RTVE-də müsahibə (Direktor genetik PCR həlləri™) aşkarlanması üçün tam xüsusi olan qPCR dəstinin son dizaynı haqqında Covid-19 ( Ağır kəskin tənəffüs sindromu koronavirus 2)

Covid-19 ( Ağır kəskin tənəffüs sindromu koronavirus 2) - genetik PCR həlləri™

genetik PCR həlləri™ (GPS™), məlumat dəstini təhlil etdi və primerlər hazırladı və bu yeni koronavirus üçün tam spesifik araşdırma etdi. Zəhmət olmasa, beynəlxalq səviyyədə dərc edilmiş GPS™ press-relizinə baxmaq üçün növbəti linki yoxlayın.

Pamplonada qeyd olunan XXIV Simpozium AVEDILA-nın icmalı - Noyabr 2019

XXIV Simposio AVEDILA, 7-8 noyabr 2019-cu il tarixlərində Pamplona, genetik PCR həlləri™ "GPS™ Mycoplasmas Contagious Agalactia dtec-qPCR Siguiendo la Norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005 üçün daxili paneldə təsdiqləmə." təqdim edəcək.

18-21 sentyabr 2019-cu il tarixlərində Çexoslovakiya Mikrobiologiya Cəmiyyətinin 28-ci Konqresi, Dr Martinez-Murcia dəvət olunmuş məruzəçi kimi "Cinsin P hylogenetic analizi" plenar iclaslarında çıxış edəcəkdir. Listeria üçün qPCR üsullarının yenilikləri L. monocytogenes qidada aşkarlanması ".

GPS ™ əməkdaşlıq edən qurum kimi iştirak edir Baytarlıq Laboratoriya Diaqnozu üzrə Ən Yaxşı Elmi Nəşr üçün “AVEDILA 2019 Mükafatı”, tərəfindən çağırıldı AVEDILA (Laborator Diaqnozda Mütəxəssis Baytarlar Birliyi).

06 Çərşənbə, Fevral 2019

HƏBS-VƏRİM: Vərəm üçün dəqiq, sürətli, möhkəm və iqtisadi diaqnostika texnologiyaları

İspan texnologiyasına əsaslanan şirkət Genetik Analiz Strategiyaları SL, GPS™ brendi vasitəsilə Avropa layihəsində iştirak edir "HƏBS-VƏRİM: Vərəm üçün dəqiq, sürətli, möhkəm və iqtisadi diaqnostika texnologiyaları". Layihə Edinburq Universiteti, Heriot Vatt Universiteti, Padua Universiteti, DestiNA Genómica və Optoi şirkətləri ilə birlikdə akademik konsorsiumu bir araya gətirir. Vərəmin diaqnostikası üçün yeni texnologiyaların inkişafının qiymətləndirilməsi nəzərdə tutulur. Bu infeksiyanın yayılmasının yüksək olduğu ölkələrdə Mərkəzi Vərəm Tədqiqatları İnstitutu (Moskva, Rusiya), Milli Vərəm Araşdırmaları İnstitutu (Çennai, Hindistan) və ShanMukha Innovations Pvt. Ltd. ilə sıx əməkdaşlıqda.

Vərəm, növün bakteriyalarının yaratdığı bir xəstəlikdir Mycobacterium tuberculosis, 2016-cı ildə 1,3 milyon insanın həyatına cavabdeh olan ictimai sağlamlıq üçün qlobal təhlükədir və dünyada ölümün doqquzuncu aparıcı səbəbidir. Ümumdünya Səhiyyə Təşkilatı (ÜST) xəstələrin monitorinqini yaxşılaşdırmağa imkan verən yeni diaqnostik metodların inkişafına səbəb olan əməkdaşlıqları həvəsləndirmək məqsədi ilə izləmək üçün marşrut planı hazırlamışdır. Vərəm, üstəlik, bir çox patogenlərdə aşkar edilmiş çoxsaylı antibiotiklərə qarşı müqavimətin qlobal artımından kənarda qalmır. Bu rezistentlərin sürətlə yayılması antibiotiklərin, o cümlədən son çarə olanların effektivliyinə xələl gətirir. Miguel Hernández Universitetinin professoru və direktoru Dr Antonio Martinez-Murcia'ya görə. GPS™, "nəticədə dərmanlara qarşı müqavimət əhali üçün ən dəqiq və qaçılmaz təhlükə hesab olunur".

-nin məqsədi HƏBS-VƏR Layihə, sürətli diaqnostikada effektiv fəaliyyətə imkan verən molekulyar zondların və optik cihazların inkişafıdır Mycobacterium tuberculosis eləcə də onun antibiotiklərə qarşı müqavimətinin olması. Vərəmə qarşı müalicə alan xəstələrin monitorinqinə imkan verən və onun təkamülünü müəyyən edən sınaqların inkişafı məsələsinə toxunulacaq.

15-16 Noyabr 2018-ci il tarixlərində Qranadada XXIII Simposio AVEDILA Dr Martinez-Murcia "Pişik lösemi virusunun aşkarlanması üçün möhkəm qPCR testinin dizaynı üçün ekzogen və endogen pişik lösemi virus ardıcıllığının təhlili" təqdim edəcək.

13 Cümə axşamı, Sentyabr 2018

"QPCR ilə patogenin aşkarlanması üçün yeməyə hazır qidaların sürətli sınağı: nümunələrdən eyni gündə nəticələrə qədər." tərəfindən təqdim olunacaq Dr. Martinez-Murcia 8-9 noyabr 2018-ci il tarixlərində Malagada keçirilən II Qida Faktoru Konfransında əsas məruzəçi kimi.

İyulun 9-dan 11-dək Brightonda "İnfeksiyaya Pasport - Səyahət və İstirahət Yollarının İnfeksiyaları" adlı İllik Tətbiqi Mikrobiologiya Konfransı 2018, burada genetik PCR həlləri™ sərgidə iştirak edəcək və poster təqdim edəcək.

12 Bazar ertəsi, Mart 2018 17:00

genetik PCR həlləri™ Beynəlxalq İnsan və Heyvan Mikologiyası Cəmiyyətinin 20-ci Konqresində fəal iştirak edəcək (İŞAM) növbəti 30-4 iyul 2018-ci il tarixlərində Amsterdamda.

8 Cümə axşamı, Mart 2018 14:30

Dr. Martinez-Murcia elmi komitənin tərkibində olacaq və məruzə edəcək 'UNE/EN ISO/IEC 17025:2005-dən sonra GPS™ CanAur dtec-qPCR Testinin daxili yoxlanışı.' 24-25 oktyabr tarixlərində (İspaniya) Ətraf Mühit, Sənaye və Tətbiqi Mikrobiologiya üzrə VIII Beynəlxalq Konfransda.

21 Çərşənbə, Fevral 2018 10:00

PCR bütün baytarlıq diaqnostika laboratoriyaları üçün əvəzsiz hala gəlir. Bu səbəbdən genetik PCR həlləri™ Azərbaycanda heyvan sağlamlığının diaqnostikası üçün reagentlərin istehsalı şirkəti kimi qeydiyyatdan keçib İspaniyanın Kənd Təsərrüfatı, Balıqçılıq, Qida və Ətraf Mühit Nazirliyi – MAPAMA

19 Çərşənbə, Sentyabr 2017 18:00

genetik PCR həlləri™ l aşkarlama üçün nəzərdə tutulmuş yeni Analiz Kiti Candida auris qPCR tərəfindən. Mikrobların filogenetik müxtəlifliyi və taksonomiyası üzrə 30 illik təcrübə dizayn və təsdiqləmə sahəsində nümayiş etdirilmiş bacarıqlarla birlikdə ən ciddi meyarlara uyğun olaraq real vaxt rejimində mümkün olan ən yaxşı PCR analizini təmin edir.

Candida auris maya kimi böyüyən yeni yaranan göbələkdir və bir neçə növdən biridir Candida insanlarda kandidoza səbəb ola bilən növlər. Bu barədə bir sıra ölkələrin səhiyyə müəssisələri məlumat verib C. auris immun sistemi zəifləmiş xəstəxanaya yerləşdirilən xəstələrdə ağır xəstəliyə səbəb olmuşdur. Qan axınının, mərkəzi sinir sisteminə, böyrəklərə, qaraciyərə, sümüklərə, əzələlərə, oynaqlara, dalaq və ya gözlərə nüfuz edən invaziv kandidoza səbəb ola bilər. Bəzi suşları C. auris antifungal dərmanların hər üç əsas sinfinə davamlıdır. Bu cür çoxlu dərman müqaviməti digər növlərdə daha əvvəl görülməmişdir Candida . Bu səbəbdən müalicə mürəkkəbdir, çünki C. auris başqaları kimi asanlıqla səhv müəyyən edilir Candida növlər.

Laboratoriya Genetic PCR Solutions TM (GPS TM ) sürətli genetik aşkarlanması üçün yeni, “yüksək inklüziv” RT-qPCR dəsti işləyib hazırlayıb. Zika virus.

Keçən cümə günü 19 , laboratoriyalar GPS TM şirkətindən Genetic Analysis Strategies S.L. imkan verən yeni RT-qPCR dəstini işə saldı Zika hər hansı bir nümunədə virusun genetik aşkarlanması. The GPS TM kit artıq bütün dünyada mövcuddur. Sınaq daha əhatəlidir, bütün reagentlər Tª otağında sabitdir və işləməni minimuma endirən MONODOSE formatında xidmət göstərir.

Bu yaxınlarda, Zika virus xəstəliyi – Aedes ağcaqanad dişləmələri ilə ötürülən yeni yaranan virus xəstəliyi – Braziliyada bildirilən ilk hallardan sonra Amerika və Karib dənizində yayılmağa başlayıb. Virusun gəlişi anormal kiçik başlı körpələrin doğulmasının və Guillain-Barré sindromu hallarının kəskin artması ilə əlaqələndirildi. Zika virusu infeksiyası ilə anadangəlmə qüsurlar və nevroloji sindromlar arasında səbəb-nəticə əlaqəsi müəyyən edilməmişdir, lakin ciddi şəkildə şübhələnir. Amerika regionunda Zika virusu xəstəliyinin yayılması davam etdikcə, Zika virusuna yoluxmuş səyahətçilərin Avropaya daxil olma riski artır. Bir sıra Avropa ölkələrində Zika virusuna yoluxma hallarının xaricdən gətirildiyi bildirilir.

2016-cı il fevralın 1-də Ümumdünya Səhiyyə Təşkilatı (ÜST) Zika virusunun yayılmasını beynəlxalq narahatlıq doğuran ictimai səhiyyə fövqəladə halı elan etdi.

29 yanvar tarixli hesabat Vektor yoluxan xəstəliklər şöbəsi, İnkişaf etməkdə olan və Zoonoz Yoluxucu Xəstəliklər Milli Mərkəzi, CDC , Göstərilmiş: " Zika virusu üçün heç bir kommersiya testi yoxdur ” və “ əlaqəli flaviviruslara qarşı çarpaz reaksiya verən antikorlar səbəbindən seroloji analizlər müsbət ola bilər “.

Bir neçə həftədən elm adamları GPS TM aşkar etmək üçün yeni spesifik primerlər və zondlar hazırlamışlar Zika ictimai verilənlər bazasında (NCBI) bu günə qədər saxlanılan bütün yeni genomik ardıcıllıqları nəzərə alaraq virus. Nəticə etibarı ilə, beynəlxalq jurnallarda bu günə qədər dərc edilmiş testlərlə əlaqədar testin spesifikliyi (xüsusilə də inklüzivlik) təkmilləşdirilmişdir. Kalibrləmə, təxmini kəmiyyət üçün istifadə ediləcək standart məlum nüsxə nömrəsi (daxil edilir) ilə əldə edilə bilər. Kit bir neçə rxn formatında (F100, F300), həm də MONODOSE M60 və M120-də mövcuddur.


DNT-ni birləşdirən boyalar

Real vaxtda PCR üçün ən çox istifadə edilən DNT bağlayıcı boya SYBR ® Green-dir, o, qeyri-spesifik olaraq ikiqat zəncirli DNT-yə (dsDNA) bağlanır. SYBR ® Green məhlulda sərbəst olduqda az flüoresans nümayiş etdirir, lakin dsDNA ilə bağlandıqda onun flüoresansı 1000 dəfəyə qədər artır (Şəkil 1). Buna görə də, reaksiyadan gələn ümumi flüoresan siqnalı mövcud dsDNA miqdarı ilə mütənasibdir və hədəf gücləndirildikdə və daha çox PCR məhsulu yığıldıqca artır. Hədəf gücləndirilməsi DNT primerləri tükənənə qədər eksponent olaraq davam etdikcə, flüoresan siqnal da eksponent olaraq artır və real vaxt gücləndirmə əyrilərinin ekstrapolyasiyası ilə orijinal şablon kəmiyyətinin hesablanması üçün əsas yaradır.

Şək. 1. SYBR ® Boya molekulları dsDNA-ya bağlandıqda yaşıl flüoresanlıq kəskin şəkildə artır.

DNT-ni bağlayan boyalar doymayan və ya doymuş kimi təsnif edilə bilər. Doymuş boyalar &mdash, məsələn, SYBR ® Green &mdash müəyyən (doyma) konsentrasiyadan yuxarı istifadə edildikdə PCR reaksiyalarını maneə törədir. Doymayan boyalar &mdash, məsələn, EvaGreen &mdash PCR-ni maneə törətmir və dsDNA-dakı bütün boş bağlama yerlərinin boya ilə bağlanmasını təmin etmək üçün kifayət qədər yüksək konsentrasiyada istifadə edilə bilər. Bununla belə, DNT denaturasiyası zamanı müşahidə olunan daha diskret siqnal dəyişikliyinə görə yüksək ayırdetmə ərimə analizlərində istifadə üçün doymuş boyalara üstünlük verilir (bax: Yüksək Rezolyutsiyalı Ərimə (HRM)).

dsDNA bağlayan boyalardan istifadənin üstünlükləri arasında sadə PCR primer dizaynı (yalnız iki ardıcıllıqla xüsusi DNT primerinə ehtiyac var, ona görə də zond dizaynına ehtiyac yoxdur), çoxlu zondlara ehtiyac olmadan çoxlu geni tez sınaqdan keçirmək imkanı (məsələn, mikroarray eksperimentində bir çox gendən gen ifadə məlumatlarının təsdiqi), problardan daha aşağı ilkin qiymət və gücləndirmə reaksiyasının spesifikliyini yoxlamaq üçün ərimə əyrisi analizini yerinə yetirmək imkanı.

DNT-ni bağlayan boyaların əsas çatışmazlığı onların DNT-ni bağlayan boyaların bütün dsDNT-lərə bağlanması spesifikliyinin olmamasıdır. Nəticədə, PCR primer-dimerləri kimi real vaxt rejimində PCR reaksiyasında qeyri-spesifik məhsulların olması ümumi floresansa kömək edir və kəmiyyətin dəqiqliyini azaldır. Bundan əlavə, DNT-ni birləşdirən boyalar multipleks reaksiyalar üçün istifadə edilə bilməz, çünki məsələn, eyni reaksiya qarışığında müxtəlif PCR primerlərindən istifadə edərək, hədəf genlə birlikdə nəzarət genini gücləndirərkən, müxtəlif məhsullardan gələn flüoresan siqnalları ayırd etmək olmur. Beləliklə, SYBR ® Green istifadə edərək real vaxtda PCR analizlərində çoxlu geni araşdırmaq üçün kəmiyyətin müəyyən edilməsində səhv mənbəyi yarada bilən ayrı-ayrı borularda müxtəlif PCR primer cütləri ilə paralel reaksiya qarışıqları qurmaq lazımdır.


Əlavə Onlayn Resurslar

İnsan Genomu Layihəsi
“DNT Məhkəməsi” adlı bu sayt İnsan Genomu Layihəsi tərəfindən təqdim olunur. O, bu ÇİÇƏKLƏR dərsində əhatə olunan mövzunun hərtərəfli icmalını təqdim edir.

Öyrən.Genetika: Gel Elektroforezi
DNT məhkəmə ekspertizasına dair bu təqdimat Yuta Universitetində Genetika Elmi Tədris Mərkəzinin “Learn.Genetics” tərəfindən təqdim edilmişdir.

Genetika öyrənin
Bu, genetika haqqında öyrənmək üçün geniş çeşidli resurslara keçidlər təqdim edən Learn.Genetics əsas saytıdır.

MIT BLOSSOMS videosu: Polisin şəxsiyyətini müəyyənləşdirmə laboratoriyasına ziyarət
Əlavə videoya baxın: Cinayət yerindəki dəlillərdən DNT-nin necə çıxarıldığını görmək üçün Cambridge, MA-da Polis Təsdiqləmə Laboratoriyasına baş çəkin.


Ekstremal PCR
PCR molekulyar diaqnostikada bir saatdan az müddətdə spesifik DNT fraqmentlərini gücləndirmək və ölçmək qabiliyyətinə malik əsas texnologiyadır. Bu yaxınlarda hazırlanmış Extreme PCR 15-60 saniyə ərzində həyata keçirilə bilər və PCR-nin kinetik hədlərini araşdırarkən hazırlanmışdır.
Klinik Kimyada daha çox məlumat əldə edin

Yüksək Rezolyusiyada Ərimə
Ərimə zamanı yüksək sıxlıqlı məlumatların toplanması və dəqiq temperatur nəzarətindən istifadə olunur ki, PCR məhsulları (amplikonlar) genotipləşə, mutasiyalara görə skan edə və ya birbaşa PCR-dən sonra ardıcıllıq identifikasiyası üçün uyğunlaşdırıla bilsin. Vebinara baxın

Kopya Nömrəsinin Dəyişməsinin Aşkarlanması
Kopya sayı dəyişiklikləri (CNA), DNT bölmələrinin nüsxələrində qazanc və ya itki ilə nəticələnən xromosom strukturunda somatik dəyişikliklər xərçəngdə çox yaygındır və xüsusi xərçəng növləri ilə əlaqələndirilir. dNTP məhdud PCR və ərimə əyri analizi ilə surət sayı dəyişikliyini aşkar etmək mümkündür.

Yüksək Sürətli Ərimə
Son işlərdə ərimə sürətinin, amplikonun ölçüsünün və analiz metodunun kiçik amplikonun genotiplənməsinə təsirləri təfərrüatları ilə izah olunur. İki nəşrdə ümumiləşdirərək belə qənaətə gəlirik daha sürətli dərəcələr ərimə təhlilini yaxşılaşdırır, necə ki, daha sürətli dərəcələr PCR-ni yaxşılaşdırır.


DNT zədələnməsinin ümumi növləri

DNT polimerazları tərəfindən dəqiq replikasiyaya təsir edən bir çox ümumi DNT zədələnməsi növləri vardır (5). Bundan əlavə, DNT zədəsinin dərəcəsi və spektri nümunə mənbəyindən və onun məruz qaldığı mühitin növündən asılıdır. Bəzi zərər növləri hər yerdə mövcuddur və potensial olaraq bütün çıxarılan DNT-də ola bilər, digər növ zərərlər isə müəyyən mənbəyə məruz qalmanın nəticəsidir (Cədvəl 1-ə baxın). Fizioloji şəraitdə DNT-də ən labil bağ bazanı dezoksiriboza onurğasına bağlayan N-qlikosil bağıdır.

Bu, eyni şəraitdə onurğadakı fosfodiester bağının ən az sabit olduğu RNT ilə fərqlidir. N-qlikosil bağının hidrolizi əsasın itirilməsi ilə nəticələnir ki, apurinik/apirimidinik (AP) yerini tərk edir, özü də nəticədə nickə parçalanır. Çünki reaktiv növ H2O, bütün saxlanılan DNT nümunələrində AP sahələri gözlənilir. Bura liyofilləşdirilmiş nümunələr də daxildir, çünki H.-nin son qabığını çıxarmaq çox çətindir2DNT-yə dərhal bitişik olan molekullar.

Metabolik aktiv şəraitdə hər gün bir insan hüceyrə genomunda təxminən 2000-10000 AP sahəsinin əmələ gəldiyi təxmin edilir (5). Bu nisbət nümunədən nümunəyə, xüsusən də cinayət yerindən götürülmüş nümunələrdə dəyişəcək, çünki ətraf mühitə məruz qalma növü fərqli olacaq.

DNT nümunəsində AP sahələrinin olması iki əsas səbəbə görə problemlidir. Birincisi, genetik məlumat itirilir, çünki AP sahəsi DNT replikasiyası zamanı daxil olan nukleotidlə əsas cüt təşkil edə bilmir. İkincisi, tipik PCR polimerazaları AP yerində dayanaraq sonrakı replikasiyanın qarşısını alır (6). Kifayət qədər AP yerləri varsa, gücləndirmə və ya ardıcıllıq reaksiyaları sadəcə uğursuz olacaq. AP saytlarının nicklərə parçalanması problemi daha da gücləndirir, çünki nəticədə DNT-nin parçalanmasına səbəb olur.

Hidrolitik DNT zədələnməsi

Fizioloji şəraitdə baş verən digər ümumi DNT zədələnməsi urasil əmələ gətirmək üçün sitozinin hidrolitik deaminasiyasıdır (5). Qədim DNT adlanan çox köhnə nümunələrdən çıxarılan DNT üzrə ardıcıllıq tədqiqatları müəyyən etmişdir ki, bu, məlumatların təhlilini çətinləşdirən əsas zərərdir (7,8). Sitozin deaminasiyası, AP sahəsinin formalaşması kimi, hidroliz nəticəsində yaranır və çox güman ki, bir çox mənbələrdən çıxarılan DNT-də mövcuddur. Maraqlıdır ki, depurinasiyadan fərqli olaraq, tək zəncirli DNT ilə müqayisədə iki zəncirli DNT-də sitozinin deaminasiya sürəti yavaşlayır.

Gücləndirmə və ya ardıcıllaşma reaksiyasında deaminasiya edilmiş sitozinin təsiri polimerazadan asılıdır. Bəzi polimerazlar (məsələn, Taq DNT Polimeraz) guaninin əvəzinə urasillə qarşı-qarşıya bir adenin qalığını daxil edərək deaminasiya edilmiş sitozini (yəni urasil) effektiv şəkildə keçə bilir. Bu, polimerazın 100% dəqiq olmasına baxmayaraq, mutasiyaya uğramış qız zəncirini yaradır. Alternativ olaraq, arxeal polimerazlar (məsələn, Vent, Pfu, 9°N DNT Polimerazları) daxil olmaqla ümumi sübut oxuyan polimerazlar DNT şablonlarında rast gəlinən deoksiurasildə dayanırlar (9). Bu polimerazaların aktiv yerində deaminasiya olunmuş sitozini xüsusi olaraq tanıyan bir bağlayıcı cib var (10). Bu, zərərin qız ipində qalıcı bir mutasiya yaratmasının qarşısını alır. Sitosinin dezaminasiyası PCR və ya mutagen DNT məhsullarının inhibəsi ilə nəticələnə bildiyindən, bu, DNT ardıcıllığının vacib olduğu üsullarda xüsusilə vacib məsələdir. Bunun əksinə olaraq, dəqiq ardıcıllıqdan daha çox amplikon uzunluğuna əsaslanan metodlar (yəni insanın identifikasiyasında istifadə olunan qısa tandem təkrarları) sitozin deaminasiyasının mutagen təsirindən təsirlənmir.

DNT-nin oksidləşdirici zədələnməsi

DNT zədələnməsinin üçüncü və ümumi növü oksidləşmədir. Hidrolitik zədələnmə vəziyyətində olduğu kimi, əksər DNT nümunələri oksidləşməyə həssasdır, çünki saxlama zamanı oksigenə məruz qalırlar. Baza modifikasiyalarının bir çox növləri oksidləşmə ilə yaradılır, lakin guaninin 8-okso-guaninə çevrilməsi ən çox yayılmışlardan biridir (5). 8-okso-guanin adeninlə əsas cütləşə bilər və buna görə də mutagen məhsuldur. Bu cür zədələnmələr mitoxondriyalarda üstünlük təşkil edir və qocalma prosesində amillərdən biri ola bilər (11). Oksidləşdirici zərərin miqdarını müəyyən edən tədqiqatlarda göstərilmişdir ki, DNT ekstraksiya prosesinin özü bu modifikasiyanı təqdim edə bilər və buna görə də diqqətlə nəzərdən keçirilməlidir (12).

DNT zədələnməsinin digər növləri

Digər zərər növləri yalnız müəyyən hallarda üstünlük təşkil edir. DNT-protein və ya DNT-DNT çarpaz əlaqələri çoxlu sayda saxlanılan nümunənin genetik tədqiqini bloklayan ixtisaslaşdırılmış, lakin vacib zədə növüdür. Həm muzeydə, həm də tibbi tədqiqat icmalarında çoxlu sayda nümunələr ya formalin (formaldehid) içərisində saxlanılır, ya da müəyyən bir nöqtədə formalinə məruz qalır. Formalinlə induksiya edilən çarpaz əlaqə struktur morfologiyasını effektiv şəkildə qoruyur, lakin bu, sonrakı DNT analizi üçün son dərəcə zərərlidir, çünki çarpaz bağlanmış əsaslar polimerazaları dayandırır və DNT-DNT keçidləri denaturasiyanı maneə törədə bilər. Bundan əlavə, formalin məhlullarının pH-ı qarışqa turşusunun əmələ gəlməsi, AP sahəsinin əmələ gəlmə sürətinin artması və sonrakı parçalanma səbəbindən zamanla aşağı düşür (13).

Yalnız müəyyən hallarda baş verən digər yaxşı öyrənilmiş lezyonlar pirimidin dimerləridir (14). Bunlar DNT UV işığına məruz qaldıqda əmələ gəlir və DNT polimerazlarını dayandırmaqda çox təsirlidir.

In conclusion, there is a wealth of DNA sequence information contained in degraded samples however, extracting that information is sometimes difficult. Whether the major difficulty is the efficacy of DNA extraction, the presence of PCR inhibitors, or the extent of DNA damage has not been fully determined. It is most likely a case in which the most prevalent problem varies with the sample and techniques that address all three possibilities are needed. Studies determining what types of damage are present in degraded samples and new methodologies to overcome them will hopefully make previously hidden information accessible.

Source of DNA Potential Damage Şərhlər İstinadlar
Ancient DNA abasic sites, deaminated cytosine, oxidized bases, fragmentation, nicks Cytosine deamination has been reported to be the most prevalent cause of sequencing artifacts in ancient DNA. Gilbert, M.T. və b. (2007) Nuc. Acid Res., 35, 1&ndash10. Hofreiter, M. et al. (2001) Nuc. Acid Res., 29, 4793.
Environmental DNA fragmentation, nicks (plasmid or genomic) Nicks and fragmentation can increase the formation of artifactual chimeric genes during amplification. Qiu, X. et al. (2001) Appl. Envir. Microbiol., 67, 880.
Source of Damage
Exposure to Ionizing Radiation abasic sites, oxidized bases, fragmentation, nicks Ionizing radiation is used to sterilize samples. Sutherland, B.M. və b. (2000) Biochemistry, 39, 8026.
Exposure to Heat fragmentation, nicks, abasic sites, oxidized bases, deaminated cytosine, cyclopurine lesions Heating DNA accelerates the hydrolytic and oxidative reactions in aqueous solutions. Bruskov, V.I. (2002) Nuc. Acids Res., 30, 1354.
Phenol/Chloroform Extraction oxidized bases Guanine is more sensitive to oxidation than the other bases and forms 8-oxo-G. 8-oxo-G can base pair with A making this damage potentially mutagenic. Finnegan, M.T. (1995) Biochem. Soc. Trans., 23, 403S.
Exposure to Light (UV) thymine dimers, (cyclobutane pyrimidine dimers) pyrimidine (6&ndash4) photo products UV trans-illumination to visualize DNA causes thymine dimer formation. Cadet, J. et al. (2005) Mutat. Res., 571, 3&ndash17. Pfeifer, G.P. və b. (2005) Mutat. Res., 571, 19&ndash31.
Mechanical Shearing fragmentation, nicks Normal DNA manipulations such as pipetting or mixing can shear or nick DNA.
Dessication fragmentation, nicks, oxidized bases Mandrioli, M. et al. (2006) Entomol. Exp. App., 120, 239.
Storage in Aqueous Solution abasic sites, oxidized bases, deaminated cytosine, nicks, fragmentation Long term storage in aqueous solution causes the accumulation of DNA damage. Lindahl, T. et al. (1972) Biochemistry, 11, 3610 and 3618.
Exposure to Formalin DNA-DNA crosslinks, DNA- protein crosslinks Formaldehyde solution that has not been properly buffered becomes acidic, increasing abasic site formation. Workshop on recovering DNA from formalin preserved biological samples. (2006) The National Academies Press.

Note: The extent of damage caused by exposure to different reagents can vary, and its importance will depend on how the DNA is being used.

Click here for a list of DNA repair enzymes suitable for a variety of damaged DNA offered by NEB. Many of these recombinant enzymes can be produced on a large scale and are available for customized solutions.

View a table on some possible DNA samples and the impact of the damage they may undergo.


Amplification-Based DNA Analysis Methods

Various methods can be used for obtaining sequences of DNA, which are useful for studying disease-causing organisms. With the advent of rapid sequencing technology, our knowledge base of the entire genomes of pathogenic organisms has grown phenomenally. We start with a description of the polymerase chain reaction, which is not a sequencing method but has allowed researchers and clinicians to obtain the large quantities of DNA needed for sequencing and other studies. The polymerase chain reaction eliminates the dependence we once had on cells to make multiple copies of DNA, achieving the same result through relatively simple reactions outside the cell.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Most methods of DNA analysis, such as restriction enzyme digestion and agarose gel electrophoresis, or DNA sequencing require large amounts of a specific DNA fragment. In the past, large amounts of DNA were produced by growing the host cells of a genomic library. However, libraries take time and effort to prepare and DNA samples of interest often come in minute quantities. The polymerase chain reaction (PCR) permits rapid amplification in the number of copies of specific DNA sequences for further analysis (see Figure 8). One of the most powerful techniques in molecular biology, PCR was developed in 1983 by Kary Mullis while at Cetus Corporation. PCR has specific applications in research, forensic, and clinical laboratories, including:

  • determining the sequence of nucleotides in a specific region of DNA
  • amplifying a target region of DNA for cloning into a plasmid vector
  • identifying the source of a DNA sample left at a crime scene
  • analyzing samples to determine paternity
  • comparing samples of ancient DNA with modern organisms
  • determining the presence of difficult to culture, or unculturable, microorganisms in humans or environmental samples

PCR is an in vitro laboratory technique that takes advantage of the natural process of DNA replication. The heat-stable DNA polymerase enzymes used in PCR are derived from hyperthermophilic prokaryotes. Taq DNA polymerase, commonly used in PCR, is derived from the Termus aquaticus bacterium isolated from a hot spring in Yellowstone National Park. DNA replication requires the use of primers for the initiation of replication to have free 3ʹ-hydroxyl groups available for the addition of nucleotides by DNA polymerase. However, while primers composed of RNA are normally used in cells, DNA primers are used for PCR. DNA primers are preferable due to their stability, and DNA primers with known sequences targeting a specific DNA region can be chemically synthesized commercially. These DNA primers are functionally similar to the DNA probes used for the various hybridization techniques described earlier, binding to specific targets due to complementarity between the target DNA sequence and the primer.

PCR occurs over multiple cycles, each containing three steps: denaturasiya, annealing, and extension. Machines called thermal cyclers are used for PCR these machines can be programmed to automatically cycle through the temperatures required at each step (see Figure 1 in Modern Applications of Microbial Genetics). First, double-stranded template DNA containing the target sequence is denatured at approximately 95 °C. The high temperature required to physically (rather than enzymatically) separate the DNA strands is the reason the heat-stable DNA polymerase is required. Next, the temperature is lowered to approximately 50 °C. This allows the DNA primers complementary to the ends of the target sequence to anneal (stick) to the template strands, with one primer annealing to each strand. Finally, the temperature is raised to 72 °C, the optimal temperature for the activity of the heat-stable DNA polymerase, allowing for the addition of nucleotides to the primer using the single-stranded target as a template. Each cycle doubles the number of double-stranded target DNA copies. Typically, PCR protocols include 25–40 cycles, allowing for the amplification of a single target sequence by tens of millions to over a trillion.

Natural DNA replication is designed to copy the entire genome, and initiates at one or more origin sites. Primers are constructed during replication, not before, and do not consist of a few specific sequences. PCR targets specific regions of a DNA sample using sequence-specific primers. In recent years, a variety of isothermal PCR amplification methods that circumvent the need for thermal cycling have been developed, taking advantage of accessory proteins that aid in the DNA replication process. As the development of these methods continues and their use becomes more widespread in research, forensic, and clinical labs, thermal cyclers may become obsolete.

PCR Variations

Several later modifications to PCR further increase the utility of this technique. Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) is used for obtaining DNA copies of a specific mRNA molecule. RT-PCR begins with the use of the reverse transcriptase enzyme to convert mRNA molecules into cDNA. That cDNA is then used as a template for traditional PCR amplification. RT-PCR can detect whether a specific gene has been expressed in a sample. Another recent application of PCR is real-time PCR, başqa adla quantitative PCR (qPCR). Standard PCR and RT-PCR protocols are not quantitative because any one of the reagents may become limiting before all of the cycles within the protocol are complete, and samples are only analyzed at the end. Because it is not possible to determine when in the PCR or RT-PCR protocol a given reagent has become limiting, it is not possible to know how many cycles were completed prior to this point, and thus it is not possible to determine how many original template molecules were present in the sample at the start of PCR. In qPCR, however, the use of fluorescence allows one to monitor the increase in a double-stranded template during a PCR reaction as it occurs. These kinetics data can then be used to quantify the amount of the original target sequence. The use of qPCR in recent years has further expanded the capabilities of PCR, allowing researchers to determine the number of DNA copies, and sometimes organisms, present in a sample. In clinical settings, qRT-PCR is used to determine viral load in HIV-positive patients to evaluate the effectiveness of their therapy.

DNA Sequencing

A basic sequencing technique is the chain termination methodkimi də tanınır dideoxy method və ya Sanger DNA sequencing method, developed by Frederick Sanger in 1972. The chain termination method involves DNA replication of a single-stranded template with the use of a DNA primer to initiate synthesis of a complementary strand, DNA polymerase, a mix of the four regular deoxynucleotide (dNTP) monomers, and a small proportion of dideoksinukleotidlər (ddNTPs), each labeled with a molecular beacon. The ddNTPs are monomers missing a hydroxyl group (–OH) at the site at which another nucleotide usually attaches to form a chain (Figure 9). Every time a ddNTP is randomly incorporated into the growing complementary strand, it terminates the process of DNA replication for that particular strand. This results in multiple short strands of replicated DNA that are each terminated at a different point during replication. When the reaction mixture is subjected to gel electrophoresis, the multiple newly replicated DNA strands form a ladder of differing sizes. Because the ddNTPs are labeled, each band on the gel reflects the size of the DNA strand when the ddNTP terminated the reaction.

Figure 9. A dideoxynucleotide is similar in structure to a deoxynucleotide, but is missing the 3ʹ hydroxyl group (indicated by the shaded box). When a dideoxynucleotide is incorporated into a DNA strand, DNA synthesis stops.

In Sanger’s day, four reactions were set up for each DNA molecule being sequenced, each reaction containing only one of the four possible ddNTPs. Each ddNTP was labeled with a radioactive phosphorus molecule. The products of the four reactions were then run in separate lanes side by side on long, narrow PAGE gels, and the bands of varying lengths were detected by autoradiography. Today, this process has been simplified with the use of ddNTPs, each labeled with a different colored fluorescent dye or fluorochrome (Figure 10), in one sequencing reaction containing all four possible ddNTPs for each DNA molecule being sequenced (Figure 11). These fluorochromes are detected by fluorescence spectroscopy. Determining the fluorescence color of each band as it passes by the detector produces the nucleotide sequence of the template strand.

Figure 10. Frederick Sanger’s dideoxy chain termination method is illustrated, using ddNTPs tagged with fluorochromes. Using ddNTPs, a mixture of DNA fragments of every possible size, varying in length by only one nucleotide, can be generated. The DNA is separated on the basis of size and each band can be detected with a fluorescence detector. Figure 11. Click for a larger image. This diagram summarizes the Sanger sequencing method using fluorochrome-labeled ddNTPs and capillary gel electrophoresis.

Since 2005, automated sequencing techniques used by laboratories fall under the umbrella of növbəti nəsil ardıcıllığı, which is a group of automated techniques used for rapid DNA sequencing. These methods have revolutionized the field of molecular genetics because the low-cost sequencers can generate sequences of hundreds of thousands or millions of short fragments (25 to 600 base pairs) just in one day. Although several variants of next generation sequencing technologies are made by different companies (for example, 454 Life Sciences’ pyrosequencing and Illumina’s Solexa technology), they all allow millions of bases to be sequenced quickly, making the sequencing of entire genomes relatively easy, inexpensive, and commonplace. In 454 sequencing (pyrosequencing), for example, a DNA sample is fragmented into 400–600-bp single-strand fragments, modified with the addition of DNA adapters to both ends of each fragment. Each DNA fragment is then immobilized on a bead and amplified by PCR, using primers designed to anneal to the adapters, creating a bead containing many copies of that DNA fragment. Each bead is then put into a separate well containing sequencing enzymes. To the well, each of the four nucleotides is added one after the other when each one is incorporated, pyrophosphate is released as a byproduct of polymerization, emitting a small flash of light that is recorded by a detector. This provides the order of nucleotides incorporated as a new strand of DNA is made and is an example of synthesis sequencing. Next generation sequencers use sophisticated software to get through the cumbersome process of putting all the fragments in order. Overall, these technologies continue to advance rapidly, decreasing the cost of sequencing and increasing the availability of sequence data from a wide variety of organisms quickly.

The National Center for Biotechnology Information houses a widely used genetic sequence database called GenBank where researchers deposit genetic information for public use. Upon publication of sequence data, researchers upload it to GenBank, giving other researchers access to the information. The collaboration allows researchers to compare newly discovered or unknown sample sequence information with the vast array of sequence data that already exists.

View an animation about 454 sequencing to deepen your understanding of this method.

Using a NAAT to Diagnose a C. difficile İnfeksiya

Javier, an 80-year-old patient with a history of heart disease, recently returned home from the hospital after undergoing an angioplasty procedure to insert a stent into a cardiac artery. To minimize the possibility of infection, Javier was administered intravenous broad-spectrum antibiotics during and shortly after his procedure. He was released four days after the procedure, but a week later, he began to experience mild abdominal cramping and watery diarrhea several times a day. He lost his appetite, became severely dehydrated, and developed a fever. He also noticed blood in his stool. Javier’s wife called the physician, who instructed her to take him to the emergency room immediately.

The hospital staff ran several tests and found that Javier’s kidney creatinine levels were elevated compared with the levels in his blood, indicating that his kidneys were not functioning well. Javier’s symptoms suggested a possible infection with Clostridium difficile, a bacterium that is resistant to many antibiotics. The hospital collected and cultured a stool sample to look for the production of toxins A and B by C. difficile, but the results came back negative. However, the negative results were not enough to rule out a C. difficile infection because culturing of C. difficile and detection of its characteristic toxins can be difficult, particularly in some types of samples. To be safe, they proceeded with a diagnostic nucleic acid amplification test (NAAT). Currently NAATs are the clinical diagnostician’s gold standard for detecting the genetic material of a pathogen. In Javier’s case, qPCR was used to look for the gene encoding C. difficile toxin B (tcdB). When the qPCR analysis came back positive, the attending physician concluded that Javier was indeed suffering from a C. difficile infection and immediately prescribed the antibiotic vankomisin, to be administered intravenously. The antibiotic cleared the infection and Javier made a full recovery.

Figure 12. A gel showing PCR products of various Clostridium difficile suşlar. Javier’s sample is shown at the bottom note that it matches ribotype 27 in the reference set. (credit: modification of work by American Society for Microbiology)

Because infections with C. difficile were becoming widespread in Javier’s community, his sample was further analyzed to see whether the specific strain of C. difficile could be identified. Javier’s stool sample was subjected to ribotypingrepetitive sequence-based PCR (rep-PCR) analysis. In ribotyping, a short sequence of DNA between the 16S rRNA and 23S rRNA genes is amplified and subjected to restriction digestion (Figure 12). This sequence varies between strains of C. difficile, so restriction enzymes will cut in different places. In rep-PCR, DNA primers designed to bind to short sequences commonly found repeated within the C. difficile genome were used for PCR. Following restriction digestion, agarose gel electrophoresis was performed in both types of analysis to examine the banding patterns that resulted from each procedure (Figure 13). Rep-PCR can be used to further subtype various ribotypes, increasing resolution for detecting differences between strains. The ribotype of the strain infecting Javier was found to be ribotype 27, a strain known for its increased virulence, resistance to antibiotics, and increased prevalence in the United States, Canada, Japan, and Europe. [1]

  • How do banding patterns differ between strains of C. difficile?
  • Why do you think laboratory tests were unable to detect toxin production directly?

Bu haqda düşünün

  • How is PCR similar to the natural DNA replication process in cells? How is it different?
  • Compare RT-PCR and qPCR in terms of their respective purposes.
  • In chain-termination sequencing, how is the identity of each nucleotide in a sequence determined?

Əsas anlayışlar və xülasə

  • Finding a gene of interest within a sample requires the use of a single-stranded DNT probu labeled with a molecular beacon (typically radioactivity or fluorescence) that can hybridize with a complementary single-stranded nucleic acid in the sample.
  • Agaroz gel elektroforezi allows for the separation of DNA molecules based on size.
  • Məhdudiyyət fraqmentinin uzunluğu polimorfizmi(RFLP) analysis allows for the visualization by agarose gel electrophoresis of distinct variants of a DNA sequence caused by differences in restriction sites.
  • Southern blot analysis allows researchers to find a particular DNA sequence within a sample whereas northern blot analysis allows researchers to detect a particular mRNA sequence expressed in a sample.
  • Microarray technology is a nucleic acid hybridization technique that allows for the examination of many thousands of genes at once to find differences in genes or gene expression patterns between two samples of genomic DNA or cDNA,
  • Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) allows for the separation of proteins by size, especially if native protein charges are masked through pretreatment with SDS.
  • Polimeraza zəncirvari reaksiya allows for the rapid amplification of a specific DNA sequence. Variations of PCR can be used to detect mRNA expression (reverse transcriptase PCR) or to quantify a particular sequence in the original sample (real-time PCR).
  • Although the development of Sanger DNA sequencing was revolutionary, advances in növbəti nəsil ardıcıllığı allow for the rapid and inexpensive sequencing of the genomes of many organisms, accelerating the volume of new sequence data.

Çoxlu seçim

Which technique is used to separate protein fragments based on size?

  1. polyacrylamide gel electrophoresis
  2. Southern blot
  3. agarose gel electrophoresis
  4. polimeraza zəncirvari reaksiya

[reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=�″]Answer a. Polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate protein fragments based on size.[/hidden-answer]

Which technique uses restriction enzyme digestion followed by agarose gel electrophoresis to generate a banding pattern for comparison to another sample processed in the same way?

[reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=�″]Answer c. RFLP uses restriction enzyme digestion followed by agarose gel electrophoresis to generate a banding pattern for comparison to another sample processed in the same way.[/hidden-answer]

All of the following techniques involve hybridization between single-stranded nucleic acid molecules istisna olmaqla:

  1. Southern blot analysis
  2. RFLP analysis
  3. northern blot analysis
  4. microarray analysis

[reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=�″]Answer b. RFLP analysis does not involve hybridization between single-stranded nucleic acid molecules.[/hidden-answer]

Boşluğu doldurun

The __________ blot technique is used to find an RNA fragment within a sample that is complementary to a DNA probe.
[reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=�″]The northern blot technique is used to find an RNA fragment within a sample that is complementary to a DNA probe.[/hidden-answer]

The PCR step during which the double-stranded template molecule becomes single-stranded is called _____________.
[reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=�″]The PCR step during which the double-stranded template molecule becomes single-stranded is called denaturasiya.[/hidden-answer]

The sequencing method involving the incorporation of ddNTPs is called __________.
[reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=�″]The sequencing method involving the incorporation of ddNTPs is called Sanger sequencing, dideoxy method, or chain termination method.[/hidden-answer]

Doğru yalan

In agarose gel electrophoresis, DNA will be attracted to the negative electrode.

[reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=�″]False[/hidden-answer]

Bu haqda düşünün

  1. Why is it important that a DNA probe be labeled with a molecular beacon?
  2. When separating proteins strictly by size, why is exposure to SDS first required?
  3. Why must the DNA polymerase used during PCR be heat-stable?
  4. What is the advantage of microarray analysis over northern blot analysis in monitoring changes in gene expression?
  5. What is the difference between reverse transcriptase PCR (RT-PCR) and real-time quantitative PCR (qPCR)?
  6. Suppose you are working in a molecular biology laboratory and are having difficulty performing the PCR successfully. You decide to double-check the PCR protocol programmed into the thermal cycler and discover that the annealing temperature was programmed to be 65 °C instead of 50 °C, as you had intended. What effects would this mistake have on the PCR reaction? Refer to Figure 8.
  1. Patrizia Spigaglia, Fabrizio Barbanti, Anna Maria Dionisi, and Paola Mastrantonio. "Clostridium difficile Isolates Resistant to Fluoroquinolones in Italy: Emergence of PCR Ribotype 018." Journal of Clinical Microbiology 48 yox. 8 (2010): 2892–2896. &crarr