Məlumat

T-vektorun yaradılması

T-vektorun yaradılması


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən ilk dəfə TA klonlaşdırılması üzərində işləyirəm və bəzi mövcud plazmid magistrallarını T-vektorlarına çevirməliyəm. Mən əlavələrimi dA-quyruqlamaq üçün Klenow fraqmentindən (3' -> 5' exo-) istifadə edirəm. Bənzər bir reaksiya qurulmuş vektorlarımı dT-quyruqlamaq üçün bu Klenow fraqmentindən istifadə edə bilməməyimin hər hansı bir səbəbi varmı? Hər hansı bir məlumat üçün əvvəlcədən təşəkkür edirik!


Şəxsən mən tax DNT polimerazadan əlavələrimi A aşmaq üçün istifadə edərdim, xüsusən də siz PCR əlavəni gücləndirirsinizsə. Doğma olaraq bütün amplikonların sonunda A çıxıntısı buraxır. Burada etməli olduğunuz tək şey reaksiyanın sonunda bir az Taq əlavə etmək və 15 dəqiqə 72 dərəcədə inkubasiya etməkdir. $^circ$C, demək olar ki, hər hansı bir PCR tamponunda və bir çox məhdudlaşdırıcı ferment tamponlarında işləyəcək.

Ümumiyyətlə, bu vektorlarda T çıxıntısı var, lakin bu, Taq-ın demək olar ki, yeganə polimeraza olduğu zamanın mirasıdır, ona görə də T ilə əlavə və A ilə vektor ola bilməz.

Ümumi bir qeyd olaraq, tez-tez bu günlərdə əvvəlcədən hazırlanmış uyğun TA klonlama vektorunu almaq daha asandır (və daha ucuzdur (vaxtınızın dəyərini nəzərə aldıqda və s.) + daha sürətli), onlar yüksək etibarlıdır və hər dəfə işləməlidir, Bu, mütləq evdə hazırlananlar haqqında deyə biləcəyiniz bir şey deyil.

Başqa bir seçim, iş axınınıza uyğundursa, primerlərinizə məhdudiyyət saytları əlavə etmək və PCR ilə əlavəni gücləndirməkdir. Daha sonra gücləndirilmiş insert və vektoru seçdiyiniz məhdudlaşdırma fermenti ilə həzm edə və istiqamətli klonlaşdırma əldə edə bilərsiniz (burada əlavəniz həmişə eyni oriyentasiyada olur, xüsusilə də protein ifadəsi üçün faydalıdır). Bu, həmçinin qısa teqlər (məsələn, FLAG, HA, V5) daxil etmək, çərçivə tənzimləmələri etmək və hətta ardıcıllığın uclarını dəyişmək kimi işlər görməyə imkan verir.


PRESAT-vektoru: Struktur proteomika üçün həll olunan zülal domenlərinin yüksək məhsuldarlıqlı skrininqi üçün asimmetrik T-vektoru

Molekulyar Biofizika Bölməsi, İnteqrasiya Elmləri Məktəbi, Yokohama Şəhər Universiteti, 1-7-29 Suehirocho, Tsurumi, Yokohama, Kanagava 230-0045, Yaponiya faks: 81-45-508-7361. Bu müəllifin daha çox məqaləsini axtarın

İnteqrasiya Elmləri üzrə Lisans Məktəbi, Yokohama Şəhər Universiteti, Yokohama, Kanagava 230-0045, Yaponiya

Elm və Mühəndislik Məktəbi, Ehime Universiteti, Matsuyama, Ehime 790–8577, Yaponiya

İnteqrasiya Elmləri üzrə Lisans Məktəbi, Yokohama Şəhər Universiteti, Yokohama, Kanagava 230-0045, Yaponiya

İnteqrasiya Elmləri üzrə Lisans Məktəbi, Yokohama Şəhər Universiteti, Yokohama, Kanagava 230-0045, Yaponiya

İnteqrasiya Elmləri üzrə Lisans Məktəbi, Yokohama Şəhər Universiteti, Yokohama, Kanagava 230-0045, Yaponiya

Molekulyar Biofizika Bölməsi, İnteqrasiya Elmləri Məktəbi, Yokohama Şəhər Universiteti, 1-7-29 Suehirocho, Tsurumi, Yokohama, Kanagava 230-0045, Yaponiya faks: 81-45-508-7361. Bu müəllifin daha çox məqaləsini axtarın

Mücərrəd

PCR ilə gücləndirilmiş cDNA fraqmentlərinin faktiki olaraq istənilən füzyon protein ifadə vektoruna klonlaşdırılması üçün sürətli bir istiqamətli üsul təsvir edilmişdir. PRESAT-vektor klonlama adlanan metod PCR məhsulunun məhdudlaşdırıcı endonükleaz həzmini tələb etməyən T-vektor texnikasına əsaslanır. Sonradan, bağlanmış plazmid məhsullarının yeni ORF seçim metodunu tətbiq etdik. Bu ikinci addım, zülal ifadəsinin sonrakı tədqiqatları üçün bakteriya sahibinə çevrilməzdən əvvəl yanlış oriyentasiyada ORF ehtiva edən plazmidləri aradan qaldıran məhdudlaşdırıcı endonükleaz müalicəsini əhatə edir. Bu seçimə nail olmaq üçün biz ifadə olunacaq zülalın C terminalına uyğun gələn “arxa” PCR primerinin 5′ ardıcıllığını fərdiləşdirdik. Koloniyalar yalnız >90% səmərəliliklə istənilən oriyentasiyanın bağlanmış məhsullarını saxlayırdı. Bu üsul GST füzyon ifadə sisteminə tətbiq edilir və ifadə kitabxanasından həll olunan zülallar üçün HTS sistemi sınaqdan keçirilmişdir.

Fayl adı Təsvir
Goda_Supp.pdf277.9 KB Goda və başqaları üçün Elektron Əlavə Material (ESM). (2003) başlıqlı, “PRESAT-vektor. Struktur zülallar üçün həll olunan zülal domenlərinin yüksək ötürmə qabiliyyətinin yoxlanılması üçün asimmetrik T-vektoru”.

Diqqət edin: Nəşriyyatçı müəlliflər tərəfindən verilən hər hansı dəstəkləyici məlumatın məzmununa və ya funksionallığına görə məsuliyyət daşımır. İstənilən sorğu (çatışmayan məzmundan başqa) məqalə üçün müvafiq müəllifə ünvanlanmalıdır.


IMC kompüterdə klonlaşdırma təcrübəsi əməliyyatlarını yerinə yetirə bilməsi ilə xarakterizə olunur. Bu halda, xüsusi məlumatlara ehtiyac yoxdur və GenBank və ya EMBL kimi ictimai verilənlər bazasından əldə edilə bilən DNT ardıcıllığı məlumatlarını olduğu kimi klonlaşdırmaq mümkündür. Klonlaşdırma üçün məhdudlaşdırıcı fermentin həzmi, PCR primerinin dizaynı, PCR gücləndirilməsi və ligasyonu qeyd edilmiş ardıcıllığı dəyişmədən həyata keçirilə bilər. Bütün əldə edilən klonlama məhsulları GenBank / EMBL formatında çıxarılır. Primer məlumatı DNT ardıcıllığında yapışdırıldığı və saxlandığı üçün Primer idarəsi üçün də faydalıdır.

Bu, həqiqətən kəsə / bağlaya bilən bir klonlama funksiyasıdır.

silisium klonlama təcrübəsi mümkündür.

Bu, görünməz molekulyar biologiya təcrübələrini başa düşməyə kömək edəcək. O, molekulyar biologiya təcrübələrinə kömək etmək və simulyasiya etmək üçün istifadə edilə bilər.

Siz ixtiyari Vektor / Plazmid qura bilərsiniz.

Vektor daxiletmə yoxlaması üçün optimal məhdudlaşdırıcı fermentləri sadalayacağıq və gel elektroforezinin nəticələrini simulyasiya edəcəyik.

  • Məhdudiyyət fermentinin müalicəsi (məhdudiyyət fermentinin xəritəsi, məhdudlaşdırıcı fermentin həzm fraqmentinin yaradılması, daxiletmə yoxlaması üçün optimal məhdudlaşdırıcı ferment namizəd siyahısı və s.)
  • PCR primer dizaynı,
  • Xüsusi xüsusiyyətlərin qarşısını almaq üçün astar dizaynı,
  • PCR replikasiyası (annotasiya daxil olmaqla),
  • Bütün genləri gücləndirmək üçün toplu primer dizaynı,
  • Primer idarə ligasyonu, özünü bağlama,
  • Əsas fraqmentin son formasının uyğunluğunun yoxlanılması
  • Plazmid xəritəsinin yaradılması (Sahə üfürmə funksiyası daxil edin) (Layout üslubuna uyğunluq)
  • Təsvir edilən annotasiya ilə klonlama DNT terminalına məhdudlaşdırıcı fermentin tanınması sahəsinin əlavə edilməsi
  • DNT terminalının kövrəkləşməsi, fosforlaşma (defosforilasiya
  • Annotasiya edilmiş əsas ardıcıllığın ixtiyari rayon çıxarılması

Alt kateqoriyalar

Silikonda klonlama 1

Siliko klonlama funksiyasında IMC-dən istifadə edərək, PC və ya Mac-də davamlı klonlama təcrübəsi mümkündür.

Genomik DNT ardıcıllığının restriksiya fermenti ilə həzmi, fraqmentin gel elektroforezi, açılmış vektora bağlanması və s. ardıcıl olaraq həyata keçirilə bilər.

Məhdudiyyət fermenti 12

IMC-nin məhdudlaşdırıcı ferment funksiyası ilə orijinal DNT əsas ardıcıllığına annotasiya (Xüsusiyyət) əlavə edilərsə, saxlanılan annotasiya ilə parçalana bilər.

Əgər bir xüsusiyyət məhdudlaşdırıcı ferment tərəfindən bölünürsə, onun xüsusiyyətinin özü miras alınır, lakin bəzi hallarda xüsusiyyət açarı avtomatik olaraq dəyişdirilə bilər.

Restriksiya fermenti ilə həzm olunan fraqmentlərin terminal forması düzgün saxlanılır. Bunu etməklə, parçalar arasında bağlama aparıldıqda ligasyonun mümkün olub olmadığını yoxlayırıq.

E. coli-də metilasiya sahəsinin məhdudlaşdırıcı fermentin həzminə təsir edib-etmədiyini yoxlamaq olar.

Tez-tez istifadə olunan məhdudlaşdırıcı fermentləri dəst kimi qeydiyyata almaq da mümkündür.

Yeni təqdim edilmiş məhdudlaşdırıcı fermentləri qeydiyyata almaq və ya artıq istifadə olunmayan məhdudlaşdırıcı fermentləri silmək də mümkündür.

Məhdudiyyət fermentinin idarə edilməsi

  • Qismən dəst seçimi,
  • Növə görə filtrləmə
    • Tanınmış əsasların sayının fərqləndirilməsi
    • Palindromik
    • Hamar və çıxıntılı uclar arasındakı fərq
    • DAM / DCM-nin mövcudluğu / olmaması
    • Kəsmə nöqtələrinin sayından asılı olaraq fərq

    Restriksiya fermentinin tanınması saytının axtarış funksiyası

    • Axtarış sahəsi seçimi,
    • Tanınma saytı axtarışı,
    • Tanınma saytı siyahısı ekranı,
    • Məhdudiyyət xəritəsi ekranı,
    • Çox ardıcıllıqdan kollektiv axtarış

    Primer Dizaynı 14

    IMC müxtəlif PCR Primer dizayn üsullarına malikdir.

    Nukleotid ardıcıllığını sadəcə ardıcıllıq zolağına sürükləmək və onu primer kimi qeyd etmək imkanı

    Seçilmiş ərazinin daxilində və xaricində gücləndirmək üçün xüsusiyyət zolağında və primerlərdə xüsusiyyətləri dizayn etmək imkanı

    • Xüsusiyyət zolaqlarının seçilmiş xüsusiyyətləri daxil olmaqla, daxil edilmiş məhsulları gücləndirmək üçün primer dizaynı
    • Xüsusiyyət zolağının seçilmiş genomik bölgəsini ehtiva edən və ya ehtiva edən məhsulu gücləndirmək üçün primer dizaynı

    Eyni anda çoxlu sayda sahəni gücləndirən primerlərin layihələndirilməsi funksiyası (İterate Design funksiyası ilə: layihələndirilməsi mümkün olmayan sahə qalmayana qədər dizaynı təkrarlamaq funksiyasıdır)

    • Batch PCR Primer Design Genomda müəyyən xüsusiyyət açarı ilə bütün xüsusiyyətləri gücləndirmək üçün toplu PCR primer dizaynı
    • Bütün genomu əhatə edən PCR Primer Dizaynı PCR məhsulunun bütün genomu və ya PCR məhsulunun üst-üstə düşməsi ilə böyük genomik bölgəni tamamilə üst-üstə düşən PCR primer dizaynı
    • Sequencing Primer Design: Bir kapilyar sequencer ilə örtülə bilməyən DNT fraqmentlərinin ardıcıllaşdırılması üçün ardıcıl primer dizaynı
      istinad

    Aşağıdakılar, gen klasterinin dizaynı kimi birdən çox DNT fraqmentinin klonlanması üçün bir qrup primerlərin dizaynı funksiyasıdır. Dizayndan klonlamaya qədər siz klonlanmış məhsulları IMC-yə yükləyə bilərsiniz.

    • In-Fusion Design Ver.1: In-Fusion Klonlama üçün primer dizayn funksiyası
    • In-Fusion Design & Build Ver.2: In-Fusion Klonlaşdırma üçün primer dizayn funksiyası
    • In-Fusion Design & Build Ver. 3: Vektor ardıcıllığına daxil ediləcək DNT fraqmentlərini ataraq gen qruplarını dizayn etmək və qurmaq bacarığı
    • Batch Gen Cluster Design & Build: klasteri təşkil edən gen dəstlərini əvəz etməklə çoxsaylı gen qruplarını layihələndirmək və qurmaq bacarığı
    • Kombinator Dizayn və Quraşdırma: Dizaynı kombinativ şəkildə birləşdirmək və gen klasterini təşkil edən bir fraqment yaratmaq bacarığı

    PCR reaksiyası 1

    IMC-nin PCR funksiyasında qeydiyyatdan keçmiş primer dəstinin astarlama yeri genom bazası ardıcıllığından axtarılır. Hər iki primerin genomda astarlanma yeri varsa, PCR primerlər arasında sıxılmış bölgəni gücləndirir.

    Bu vəziyyətdə adenin 1 əsas ilə çıxıntı edə bilər. TA klonlanması üçün istifadə olunur.

    Şablon DNT ardıcıllığına annotasiya verildikdə annotasiya gücləndirilmiş PCR məhsulunda da miras alınır (Xüsusiyyət).

    Çox şablon DNT ardıcıllığı üzərində PCR həyata keçirmək də mümkündür.

    Bağlama 3

    • Liqasiya molekulyar klonlaşdırmanı həyata keçirmək üçün vacib bir təcrübədir. IMC məhsulların yaradılması üçün faktiki klonlaşdırma təcrübələrində olduğu kimi bir-biri ilə şərh edilmiş nukleotid ardıcıllıqları da daxil olmaqla müxtəlif nukleotid ardıcıllıqlarını birləşdirir. Bütün annotasiyalar ligasiya məhsullarına da uyğun şəkildə daxil edilir və onların məhsulları IMC-nin bir çox funksiyalarından, eləcə də orijinal baza ardıcıllığından istifadə etməklə təhlil edilə bilər.
    • Əgər terminal ardıcıllığı bir-birini tamamlayırsa, onları bir əsas ardıcıllıqla birləşdirin.
    • 5-ə qədər fraqment seqmenti bağlana bilər.
    • Siz bütün mümkün ligasiya ardıcıllıqlarını yarada bilərsiniz.
      • 7.24 və sonrakı versiyalarda ligasiya məhsulunun tam tamamlayıcı ardıcıllığı ayrıca məhsul kimi sayılır.
      • Bu məhdudlaşdırıcı fermentlərdən istifadə edərkən gel elektroforez nümunəsini də göstərir.

      • Bağlama məhsulu kimi yaradılan əsas ardıcıllıq orijinal əsas ardıcıllıqla eyni şəkildə təhlil edilə bilər.
      • IMC-də məhdudlaşdırıcı fermentlə parçalanmış ardıcıllıqlar üçün terminal statusunu göstərən xüsusi Xüsusiyyət Açarları və Kvalifikatorlar yaradılır.

      Bridge Contigs 0

      PCR məhsullarının ardıcıllığı bir qrup kontig ardıcıllığı üçün axtarıldıqda və PCR məhsulu iki kontig arasında körpü qurduqda, kontigləri bir ardıcıllıqla birləşdirin.

      Plazmid xəritəsi 1

      Plazmid Xəritəsinin yaradılması üçün Plazmid Xəritə Baxıcısına baxın.

      Gel Elektroforez 0

      DNT ardıcıllığı həzm edildikdə və məhdudlaşdırma fermenti ilə parçalandıqda, PCR gücləndirildikdə, bağlanma həmin məhsulların gel elektroforezinin nəticəsi kimi göstərilə bilər.

      Fragment Son Modifikasiyası 0

      Siz DNT fraqment ardıcıllığının uclarını dəyişdirə bilərsiniz.

      Hazırda IMC tərəfindən təmin edilən terminal modifikasiya funksiyaları aşağıdakılardır.

      Molekulyar bioloji müalicə

      • Kütlənmə (T4 DNT Polimeraz tərəfindən kütləşmə, Mung Bean Nukleazı ilə kütləmə)
      • Fosforlaşma
      • Defosforilasiya
      • PCR məhsulunda adenin çıxması

      Molekulyar olmayan bioloji müalicə

      • Çıxıntılı timin ilə ardıcıllığın istehsalı (T-Vektor)
      • Restriksiya fermentinin tanınması ardıcıllığının əlavə edilməsi

      Check 0 daxil etmək üçün RE dəstini tapın

      Yerləşdiriləcək DNT fraqmentinin hər iki ucu eyni məhdudlaşdırıcı fermentlərlə parçalanırsa və ya bağlama ilə küt uclara malikdirsə və s., daxiletmənin oriyentasiyasını göstərmək üçün optimal məhdudlaşdırıcı ferment namizədi gel elektroforez diaqramı ilə göstərilir.

      Homoloji rekombinasiya 0

      Genom dizayn funksiyasında, homoloji rekombinasiya üçün homoloji qolu homoloji şəkildə rekombinasiya ediləcək bölgədən və daxiletmə ardıcıllığından hazırlanmışdır.

      Bu funksiya insert ardıcıllığını dizayn edilmiş homoloji qolu ilə genomda yenidən birləşdirmək üçün istifadə olunur.

      Pseudo Klonlama 0

      Molekulyar biologiyadan asılı olmayaraq, məlumat manipulyasiyası ilə əsas ardıcıllığın işlənməsi


      Nəticələr

      Vektor dizaynı

      Biz donor və akseptor plazmidlərə birləşdirilən tənzimləyici elementləri təmsil edən DNT kolleksiyası yaratmışıq. Transfeksiyanın effektivliyini optimallaşdırmaq üçün bu DNT elementlərinin ölçüsü minimuma endirildi. Stabil hüceyrə xətlərinin yaradılması üçün seçilə bilən markerlər təqdim edildi və tənzimləyici elementlər arasındakı keçidlər isteğe bağlı yüksək məhsuldarlıqlı klonlaşdırma və mövcud ifadə kasetlərinin səmərəli təkrar istifadəsi üçün standartlaşdırıldı. Multigen ifadəli plazmidin qurulması yalnız üç sadə addımdan ibarətdir (Şəkil 1). Əvvəlcə səkkiz fraqment bir addımda qəbuledici və ya donor plazmidinə yığıldı. Bu addım yalnız tamamilə yeni xüsusiyyətlərə malik ifadə vektoru (məsələn, yeni promouter və ya etiket) qurulduqda tələb olunur. Tikintinin ətraflı icmalı, eləcə də hazırda mövcud vektorlar Əlavə Şəkillər S1, S2 və S3-də verilmişdir. İkincisi, maraq geninin seçdiyi klonlama üsulu ilə akseptor və ya donora daxil edilib, tək zülal üçün ifadə vektoruna gətirib çıxarıb. PCDNA və ya pEGFP əsaslı vektorlardan mövcud ifadə kasetləri standartlaşdırılmış primerlərlə PCR ilə asanlıqla köçürülə bilər (Əlavə Şəkil S4). Nəhayət, Cre vasitəçiliyi ilə rekombinasiya istifadə edildi in vitro donor və qəbuledici vektorları multiifadəli plazmiddə toplamaq, sonra transformasiya etmək E. coli və antibiotiklərin müvafiq kombinasiyası ilə seçim. Hazırda biz dörd müstəqil antibiotik müqavimət geninə malik səkkiz donor vektor yaratdıq. Onlar beşə qədər ifadə kasetinə malik plazmid verən bir qəbuledici vektorla birləşdirilə bilər (Əlavə Şəkil S5). Bu plazmid massivi asanlıqla genişləndirilə bilər reklam lib əlavə antibiotik müqavimət markerləri tətbiq etməklə. Əlavə ifadə kasetləri xüsusi bölgədəki unikal I-CeuI homing-endonukleaz yerindən istifadə edərək hər bir donor vektoruna daxil edilə bilər (Əlavə Şəkil S6).

      (a) Uyğun tənzimləyici elementlərin kitabxanası yaradıldı. Bir fraqment üçün bir neçə sətir mövcud variasiyaları göstərir. (b) Bu tənzimləyici elementlər kolleksiyasından donor və akseptor plazmidləri yaradılır. (c) Maraqlanan genlər donor və ya akseptor vektoruna daxil edilir və arzu olunan genlər üçün ifadə vektorlarına səbəb olur. (d) Birdən dördə qədər donor vektoru bir addımda və ya iterativ prosesdə bir qəbuledici vektora birləşdirilir. (e) Plazmidlər müvafiq antibiotiklərlə seçilir və həzm məhdudlaşdırılması ilə təsdiqlənir. (f) Plazmidlər daha sonra məməlilərin hüceyrələrini transfeksiya etmək üçün istifadə olunur. Ölçək çubuğu, 50 μm.

      Tək plazmiddən beş zülalın homojen ifadəsi

      Sistemimizi təsdiqləmək üçün fərdi valideyn ifadə vektorları ilə birgə transfektsiya edilmiş hüceyrələrlə beş flüoresan zülalını kodlayan MultiLabel plazmidi ilə müvəqqəti transfeksiya edilmiş HEK293 hüceyrələrini müqayisə etdik. Co-transfeksiya bir və ya bir neçə zülalın ifadəsi olmayan bir çox hüceyrə də daxil olmaqla, hüceyrələrin qeyri-homogen bir qarışığına səbəb oldu (Şəkil 2a). Bunun əksinə olaraq, MultiLabel ilə transfeksiya edilmiş hüceyrələr beş flüoresan zülalın hamısını oxşar səviyyələrdə səmərəli şəkildə ifadə etdilər (Şəkil 2b). Tək hüceyrə səviyyəsində ifadə səviyyələrinin kəmiyyəti fərdi zülalların ifadə səviyyələri arasında sabit əlaqəni ortaya qoydu (Əlavə Şəkil S7).

      (a) HEK293 hüceyrələri hər birində tək bir flüoresan zülal üçün ifadə kasetindən ibarət olan beş plazmidin qarışığı ilə müvəqqəti transfeksiya edildi və ya (b) flüoresan zülallar üçün beş ifadə kasetindən ibarət tək MultiLabel plazmid. 2, 3 və 4 ifadə kasetləri ilə nümunələr, həmçinin ifadə səviyyələrinin kəmiyyəti üçün Əlavə Şəkil S7-ə baxın. (c) Stabil hüceyrə xətlərinin əmələ gəlməsi. PAE hüceyrələri subcellular markerlər üçün beş ifadə kasetindən ibarət xəttiləşdirilmiş plazmidlə transfeksiya edildi və sonra G418 ilə seçildi. EBFP2-Nuc/EBFP2 nüvə lokalizasiyası siqnalı ilə mTFP1-FYVE/mTFP1 ilə PI-3-P bağlayan FYVE domeni EYFP-Tubulin/EYFP mitoxondrial lokalizasiya ilə Mito-dsRed/dsRed ilə birləşdirilib Plum-PLCPδfu/PH PLCδ-nin PI-4,5-P2 bağlayan plekstrin homologiya sahəsi. Əlavə Film 1 bu hüceyrə xəttinin vaxtaşırı filmini göstərir. Tərəzi çubuqları, 50 μm.

      Sabit hüceyrə xətlərinin yaradılması

      Biz məməlilərin genomlarına rekombinasiyaya əsaslanan inteqrasiya üçün Flp-In kasetini və təsadüfi inteqrasiya üçün seçmək üçün G418 müqavimət genini ehtiva edən qəbuledici plazmidlər yaratdıq (Əlavə Şəkil S3-ə baxın). Flp-In sistemi müəyyən edilmiş 9 mövqedə (Invitrogen tərəfindən paylanmış) transgenin tək nüsxəsinin rekombinasiya əsaslı inteqrasiyasına imkan verir. Buna görə də bu sistem hüceyrə bioloji analizində bir sıra mutantları sınamaq üçün çox faydalıdır. Flp-In xanalarına effektiv FRT əsaslı inteqrasiya 15 kb-dən kiçik dairəvi MultiLabel konstruksiyaları ilə baş verdi. Daha böyük MultiLabel plazmidlərinin inteqrasiyası üçün unikal homing-endonukleaz yerində (pSI-AKR7 və AAL6 Əlavə Şəkil S3-də I-SceI) parçalanaraq multigen konstruksiyasını xəttiləşdirdik. Yalnız belə xəttiləşdirilmiş plazmidlərin transfeksiyası eyni vaxtda bir neçə transgeni ifadə edən hüceyrə xətlərinin yaranmasına imkan verdi (Şəkil 2c). Əlavə Film 1 flüoresan teqləri olan beş hüceyrəaltı markerləri (EBFP2-Nuc, mTFP1-FYVE, EYFP-Tubulin, Mito-dsRed və Plum-PLCδ-PH) ifadə edən bu hüceyrə xəttinin vaxtaşırı filmidir. İnteqrasiya effektivliyini artırmaq üçün daha sonra iki eukaryotik seçim markeri ilə qəbuledici vektor (pSI-AKR8) yaratdıq. I-SceI ilə pSI-AKR8-ə əsaslanan montajın həzmi hər iki ucunda seçim markerləri olan xətti fraqmentə gətirib çıxarır (Əlavə Şəkil S8). Yalnız bütün fraqmenti bütün ifadə kasetləri və yan müqavimət markerləri ilə birləşdirən hüceyrələr G418 və zeosin ilə seçimdən sağ çıxa biləcəklər.

      Keçici transfeksiya edilmiş hüceyrələrin biokimyəvi analizi

      Beş flüoresan zülalını kodlayan 21 kb konstruktun transfeksiya səmərəliliyi HEK293 hüceyrələrində təxminən 20% və Porcine aorta endotelial və ya COS hüceyrələrində 1-5% təşkil etmişdir. Məsələn, reseptor tirozin kinazları və əlaqəli zülalları kodlayan 20-25 kb konstruksiyaların ifadə səviyyələri biokimyəvi analiz üçün kifayət idi. Daha sonra ifadə nisbətlərinin qəbuledici-donor1-donor2 və qəbuledici-donor2-donor1 konstruksiyaları üçün eyni olub-olmaması ilə maraqlandıq. SNX5–SNX1–EGFR (1.0/1.4/0.3) ilə SNX5–EGFR–SNX1 (1.0/1.5/0.3) konstruksiyasının nisbi ifadə səviyyələrini müqayisə etdik. Eyni şəkildə, SNX5–SNX2–EGFR (1.0/1.2/0.7) ilə SNX5–EGFR–SNX2 (1.0/1.2/0.8) transfeksiya edilmiş hüceyrələrlə müqayisəsi bütün zülallar üçün oxşar ifadə nisbətlərini göstərdi (Şəkil 3). Buna görə montajın ardıcıllığı ifadə üçün vacib deyil.

      Bütün konstruksiyalar myc-SNX5 (hər dörd konstruksiyada qəbuledici), EGFR (Donor1) və myc-SNX1 və ya myc-SNX2 (donor2) kodlaşdırır. İfadə kasetləri aşağıdakı ardıcıllıqla düzülür: SNX5–SNX1–EGFR (zolaq 2), SNX5–EGFR–SNX1 (zolaq 3), SNX5–SNX2–EGFR (zolaq 4) və SNX5–EGFR–SNX2 (zolaq 5). Transfeksiya edilməmiş hüceyrələrdən lizatlar 1-ci zolağa yüklənmişdir. Transfeksiyanın effektivliyi western blotlama ilə biokimyəvi analiz üçün kifayətdir. İfadə kasetinin fərqli sırası (SNX5–SNX1–EGFR və SNX5–EGFR–SNX1) nisbi ifadə səviyyələrinə heç bir təsir göstərmir. Molekulyar çəkilər kDa ilə göstərilir.

      Çoxlu zülalları ifadə edən hüceyrələr normal fiziologiya göstərir

      Nəhayət, biz floresan etiketli sensorları kodlayan bir sıra plazmidlərdən istifadə edərək hüceyrə bioloji analizində MultiLabel sistemini təsdiq etdik. Rab sensorları kiçik GTPases Rab5, Rab4 və Rab11 və ya Rab5, Rab4 və Rab7 ifadə edir. Bu zülallar endosom bölməsində 10 müxtəlif veziküllərlə əlaqələndirilir. Fosfoinositid (PI) sensoru PI-3-P (FYVE domeni), PI-4,5-P2 (PLCδ-PH) və PI-3,4,5-P3 (BTK-PH) 11-ni tanıyır. Epidermal böyümə faktoru reseptorunu (EGFR) endogen şəkildə ifadə edən COS hüceyrələri bu sensor konstruksiyalarla keçici olaraq transfeksiya edildi və sonra flüoresan etiketli EGF (EGF-Alexa647) ilə stimullaşdırıldı. Hüceyrələrin EGF-Alexa647 ilə stimullaşdırılmasından iyirmi dəqiqə sonra EGFR PI-3-P, Rab5 və Rab4 ilə birgə lokallaşdırıldı və reseptorun gözlənildiyi kimi daxililəşdirildiyini göstərdi. Rab11 ilə kiçik birgə lokalizasiya müşahidə edildi (endosomların təkrar emal edilməsi). Bundan əlavə, EGF-nin yaratdığı plazma membranının PI-3,4,5-P3 üçün müsbət fırlanmaları müşahidə edilmişdir (Şəkil 4a,b). mCitrine-Rab5, mCherry-Rab7 və mTFP1-Rab4 ilə transfeksiya edilmiş EGF-stimullaşdırılmış COS hüceyrəsinin vaxtaşırı seriyası Şəkil 4c-də göstərilmişdir. EGFR əvvəlcə yalnız Rab5 (erkən endosomlar), daha sonra isə Rab5 və Rab7 (gec endosomlar) ilə birgə lokallaşdırıldı. EGF əsasən veziküllərin içərisində, Rab zülalları isə veziküllərin membranında tapıldı. Çox vaxt yalnız veziküllərin alt bölmələri Rab zülalları üçün müsbət idi. Bu nəticələr, bu sensorlar eyni vaxtda ifadə edildikdə hüceyrələrin normal fiziologiyasının pozulmadığını göstərir.

      COS hüceyrələri müvəqqəti olaraq konstruktiv kodlaşdırma ilə transfeksiya edildi (a) üç müxtəlif fosfoinositid bağlayan zülal və ya (b) üç müxtəlif Rab zülalı və sonra 20 dəqiqə ərzində EGF-Alexa647 ilə stimullaşdırıldı. Bu zaman EGFR erkən endosomlarda PI-3-P bağlayan FYVE domeni (oxlar) ilə birgə lokallaşdırılmışdır. Bundan əlavə, plazma membranında EGF-nin yaratdığı fırıldaqlar PI-3,4,5-P3 (BTK-PH) və PI-4,5-P2 (PLCδ-PH) (ox başları) üçün müsbət olmuşdur. Rab sensorunu ifadə edən hüceyrələrdə EGFR əsasən Rab5 və Rab4 (oxlar) ilə birgə lokallaşdırılmışdır. (c) COS hüceyrələri keçici olaraq mCitrine-Rab5, mTFP1-Rab4 və mCherry-Rab7 kodlayan MultiLabel plazmidi ilə transfeksiya edilmişdir. Hüceyrələr EGF-Alexa647 ilə stimullaşdırıldı və 45 dəqiqə ərzində nəzarət edildi. Gözlənildiyi kimi, EGF əlavə edildikdən qısa müddət sonra Rab5-müsbət veziküllərdə tapıldı (T=8/T=16, oxlar). Daha sonra Rab7-müsbət veziküllərdə (ox ucları) da tapıldı. Tərəzi çubuqları, 50 μm (a, b) 5 μm (c).


      Funksiya

      • Bir neçə fayl paralel olaraq göstərilə bilər.
      • ABI, SCF format faylına uyğundur.
      • O, əsas xüsusiyyət xəritəsindən ayrı bir pəncərədə göstərilir.
      • İz dalğa formasına baxan pəncərənin ölçüsü dəyişdirilə bilər.
      • Siz hər dalğa formasının ekran mövqeyini sürükləyərək dəyişə bilərsiniz.
      • İz dalğa formasının ekran çərçivəsinin hündürlüyünü dəyişə bilərsiniz.
      • Ekranın rəngini bazaya görə dəyişə bilərsiniz.
      • Hər bir dalğa forması müstəqil olaraq üfüqi olaraq sürüşdürilə bilər.
      • Hər bir iz dalğa formasının mövqeyi uyğunlaşdırılıbsa, siz bir-birinə kilidlənərək yana doğru sürüşdürə bilərsiniz.
      • Sürgü ilə iz dalğasının enini və hündürlüyünü sərbəst dəyişə bilərsiniz.
      • Siz axtarışdan sonra məhdudlaşdırıcı fermentin tanınması saytlarını axtara və ardıcıllığı vurğulaya bilərsiniz.
      • Siz həmçinin Trace Mapping icra nəticəsindən başlaya bilərsiniz.

      Etiketləmə və rəngləmə 0

      Təsvir Pəncərə 2

      Təsvir pəncərəsi funksiyanın Kvalifikatoruna dəyərlər daxil etmək və redaktə etmək üçün pəncərədir.

      Xüsusiyyətə sağ klikləməklə işə salınır və siz bu xüsusiyyət üçün bütün Kvalifikatorları redaktə edə bilərsiniz.

      Xüsusiyyətin yerini dəyişdirin.

      Xüsusiyyətin aid olduğu Xüsusiyyət Açarını dəyişdirin.

      Amin turşusu ardıcıllığı profilinə baxıcı 2

      Bu, amin turşusu ardıcıllığının ikincil quruluşu kimi profilləri paralel olaraq göstərən bir görüntüləyicidir. Ümumi profil dizaynı və ekranı, motiv nümayişi və s. mümkündür.

      Çoxsaylı Alignment Viewer 1

      Çoxlu uyğunlaşdırma görüntüleyicisi DNT ardıcıllığının və amin turşusu ardıcıllığının çoxsaylı düzülməsini göstərmək üçün pəncərədir.

      Çoxlu uyğunlaşdırma görüntüləyicisi homoloji axtarış nəticəsi dialoqundan və s. işə salına bilər.


      PGP-B2E, Sürətli və Ucuz Gen Klonlaması üçün Rekombinant Uyğun TA/TB-Liqasiya Vektoru

      DNT klonlaşdırılması həyat elminin müxtəlif sahələri üçün əsas addımdır və bu proseduru sadələşdirmək üçün çoxlu cəhdlər edilmişdir. Bu araşdırmada biz əsas klonların sürətli və sərfəli qurulması üçün iki ümumi təyinatlı plazmid (pGP), pGP-XB2E və pGP-B2E haqqında məlumat veririk. The BciVI və XcmI parçalanma sahələri plazmid xəttiləşdirmə səmərəliliyini yoxlamaq üçün pGP-XB2E-də nəzərdə tutulmuşdur. Plazmid istifadə edərək daha yaxşı linearizasiya səmərəliliyinə malikdir BciTövsiyə olunan ferment konsentrasiyasının yalnız onda biri ilə 10 dəqiqə ərzində 2 μg plazmidi demək olar ki, tamamilə həzm edə bilən VI. pGP-XB2E-ni daha da optimallaşdırmaq üçün yeni plazmid pGP-B2E, XcmMən dekolte yeri dizayn edildi. Bu vektor 1812 bp-ə qədər PCR məhsullarının klonlanması üçün yüksək effektivdir və koloniyaların sayı pGP-XB2E-dən təxminən beş dəfə idi. TA klonlamasına əlavə olaraq, primerdə T ilə bitən küt uclu PCR məhsulları A-quyruq müalicəsi (Vərəm klonlaması) olmadan T-vektor pGP-B2E ilə müsbət əlaqələndirilə bilər. Bundan əlavə, giriş vektoru olaraq, pGP-B2E çərçivə dəyişikliyi mutasiyaları olmadan şlüz rekombinasiya reaksiyası üçün də uyğun idi. Ümumiyyətlə, bu vektor əsas molekulyar klonlaşdırma üçün universal, sürətli və qənaətcil bir üsul təqdim edir.

      Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


      Todd, A. E., Orengo, C. A. & amp Thornton, J. M. Struktur baxımdan zülal super ailələrində funksiyanın təkamülü. J. Mol. Biol. 307, 1113–1143 (2001).

      Gerlt, J. A. və Babbitt, P. C. Mexanik cəhətdən müxtəlif ferment super ailələri: katalizin təkamülündə kimyanın əhəmiyyəti. Curr. Rəy. Kimya. Biol. 2, 607–612 (1998).

      Friedmann, D. R. & Marmorstein, R. Qeyri-histon protein asetiltransferaza fermentlərinin strukturu və mexanizmi. FEBS J. 280, 5570–5581 (2013).

      Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M. & Henrissat, B. 2013-cü ildə karbohidrat aktiv fermentlər bazası (CAZy). Nuklein turşuları Res. 42, D490–D495 (2014).

      Li, T. və başqaları. Lizin (K)-asetil-transferaza spesifik asetilləşmə yerlərinin xarakteristikası və proqnozlaşdırılması. Mol. Hüceyrə. Proteomika. 11, M111.011080 (2012).

      Lim, E.-K. və b. A-da qlikosiltransferazaların multigen ailəsində substratın tanınmasının təkamülürabidopsis. Qlikobiologiya 13, 139–145 (2003).

      Modolo, L. V. və başqaları. Model paxlalılarda (izo) flavonoid qlikosilasiyasına funksional genomik yanaşma Medicago truncatula. Bitki Mol. Biol. 64, 499–518 (2007).

      Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J. & amp Withers, S. G. Glikosiltransferazlar: strukturlar, funksiyalar və mexanizmlər. Annu. Rev. Biochem. 77, 521–555 (2008).

      Cartwright, A. M., Lim, E.-K., Kleanthous, C. & Bowles, D. J. Arabidopsis thaliana'nın iki qlikosiltransferazı ilə regiospesifik qlükozilləşmənin kinetik təhlili: yeni fəaliyyətlərin tətbiqi üçün domen dəyişdirilməsi. J. Biol. Kimya. 283, 15724–15731 (2008).

      Todd, A. E., Orengo, C. A. & amp Thornton, J. M. Enzim aktiv sahələrinin plastikliyi. Trendlər. Biokimya. Sci. 27, 419–426 (2002).

      Gloster, T. M. Struktur baxımdan qlikosiltransferazaların anlaşılmasında irəliləyişlər. Curr. Rəy. Struktur. Biol. 28, 131–141 (2014).

      Harper, K. C. və Sigman, M. S. Eksperimental dizayn və sterik parametrlər prinsiplərindən istifadə edərək asimmetrik katalizator performansının proqnozlaşdırılması və optimallaşdırılması. Proc. Natl. akad. Sci. ABŞ 108, 2179–2183 (2011).

      Kries, H., Blomberg, R. & Hilvert, D. De novo fermentləri hesablama dizaynı ilə. Curr. Rəy. Kimya. Biol. 17, 221–228 (2013).

      Yang, M., Brazier, M., Edwards, R. & Davis, B. G. Multisubstrate fermentlər üçün yüksək məhsuldarlıqlı kütlə-spektrometriya monitorinqi: glikosiltransferazaların kinetik parametrlərinin və katalitik fəaliyyətlərinin müəyyən edilməsi. Kimbiokimya 6, 346–357 (2005).

      Flint, J. et al. Mannosilqliserat sintazasının struktur diseksiyası və yüksək məhsuldarlıqlı skrininqi. Nat. Struktur. Mol. Biol. 12, 608–614 (2005).

      Yang, M., Davies, G. J. & Davis, B. G. Flavonoid qlikozidlərin sintezi üçün qlikosintaz katalizatoru. Angew. Kimya. Int. Edn Engl. 46, 3885–3888 (2007).

      Backus, K. M. və başqaları. Qeyri-təbii trehaloza analoqlarının müxbir kimi qəbulu Mycobacterium tuberculosis. Nat. Kimya. Biol. 7, 228–235 (2011).

      Offen, W. et al. Flavonoid qlükoziltransferazanın strukturu bitkinin təbii məhsulunun modifikasiyası üçün əsasları ortaya qoyur. EMBO J. 25, 1396–1405 (2006).

      Brazier-Hicks, M. et al. Bitkilərdə ksenobiotik maddələr mübadiləsində iştirak edən bifunksional N- və O-qlükoziltransferazanın xarakteristikası və mühəndisliyi. Proc. Natl. akad. Sci. ABŞ 104, 20238–20243 (2007).

      McLeod, M. C. et al. Alkaloiddən ilham alan kitabxanalarla kimyəvi məkanı araşdırın. Nat. Kimya. 6, 133–140 (2014).

      Li, Y., Baldauf, S., Lim, E. K. və Bowles, D. J. UDP-qlikosiltransferaza multigen ailəsinin filogenetik təhlili Arabidopsis thaliana. J. Biol. Kimya. 276, 4338–4343 (2001).

      Breiman, L., Friedman, J. H., Olshen, R. A. & Stone, C. J. Təsnifat və Reqressiya Ağacıs (Wadsworth & Brooks, Monterey, CA, 1984).

      Kotera, M., Goto, S. & Kanehisa, M. Ferment məlumatlarının standartlaşdırılması üçün proqnozlaşdırıcı genomik və metabolomik analiz. Perspektiv. Sci. 1, 24–32 (2014).

      Sánchez-Rodriguez, A. et al. Bakterial qlikosiltransferazaların substrat siniflərini müəyyən etmək üçün şəbəkə əsaslı yanaşma. BMC Genomics 15, 349 (2014).

      Smith, T. F. & Waterman, M. S. Ümumi molekulyar ardıcıllığın müəyyən edilməsi. J. Mol. Biol. 147, 195–197 (1981).

      Shao, H. et al. Çoxfunksiyalı triterpen/flavonoid qlikosiltransferazanın kristal strukturları Medicago truncatula. Bitki hüceyrəsi 17, 3141–3154 (2005).

      Modolo, L. V. və başqaları. Qlikosiltransferaza UGT78G1-in kristal strukturları (izo) flavonoidlərin qlikosilasiyası və deqlikosilasiyası üçün molekulyar əsasları aşkar edir. J. Mol. Biol. 392, 1292–1302 (2009).

      Yang, M. et al. Makrolid qlikosiltransferazaların genişliyinin araşdırılması: poliketid antibiotikin in vitro remodelyasiyası aktiv bakterial udulma yaradır və potensialı artırır. J. Am. Kimya. Soc. 127, 9336–9337 (2005).

      Venturelli, S. et al. Pan-HDAC inhibitoru kimi resveratrol insan mənşəli hepatoblastoma hüceyrələrində histon [düzəliş edilmiş] zülalların asetilasiya vəziyyətini dəyişir. PLoS BİR 8, e73097 (2013).

      Kjaer, T. N. və başqaları. Resveratrol dövran edən androgen prekursorlarının səviyyəsini azaldır, lakin testosteron, dihidrotestosteron, PSA səviyyələri və ya prostat həcminə heç bir təsiri yoxdur: orta yaşlı kişilərdə 4 aylıq randomizə edilmiş sınaq. Prostat vəzi 75, 1255–1263 (2015).

      Turner, R. S. və başqaları. Alzheimer xəstəliyi üçün resveratrolun randomizə edilmiş, ikiqat kor, plasebo nəzarətli sınağı. Nevrologiya 85, 1383–1391 (2015).

      Tomé-Carneiro, J. et al. Resveratrol və klinik sınaqlar: in vitro tədqiqatlardan insan sübutlarına keçid. Curr. Əczaçılıq. Des. 19, 6064–6093 (2013).

      Pandey, R. P. və başqaları. Yeni resveratrol qlükozid və qlikozid törəmələrinin fermentativ biosintezi. Tətbiq. Ətraf. Mikrobiol. 80, 7235–7243 (2014).

      Weis, M., Lim, E.-K., Bruce, N. & Bowles, D. Aromatik birləşmələrin regioselektiv qlükozilasiyası: biokatalizatorları müəyyən etmək üçün rekombinant qlikosiltransferaza kitabxanasının skrininqi. Angew. Kimya. Int. Ed. ingilis. 45, 3534–3538 (2006).

      Burns, J., Yokota, T., Ashihara, H., Lean, M. E. & Crozier, A. Bitki qidaları və resveratrolun bitki mənşəli mənbələri. J. Aqric. Qida. Kimya. 50, 3337–3340 (2002).

      Heide, L. Aminokumarinlər: biosintez və biologiya. Nat. Prod. Rep. 26, 1241–1250 (2009).

      Peneff, C. et al. UDPGlc(Gal)NAc ilə komplekslərdə iki insan pirofosforilaz izoformasının kristal strukturları: ferment oliqomerik birləşməsində və aktiv sahə arxitekturasında alternativ olaraq birləşdirilmiş əlavənin rolu. EMBO J. 20, 6191–6202 (2001).

      Unligil, U. M. et al. Dovşan N-asetilqlükozaminiltransferaza I-nin rentgen kristal quruluşu: katalitik mexanizm və yeni bir protein superfamiliyası. EMBO J. 19, 5269–5280 (2000).

      Pearson, W. R. Protein funksiyasının proqnozlaşdırılması: problemlər və tələlər. Curr. Protok. Bioinformatika 51, 12.1 –4.12.8 (2015).

      Tyagi, S. & amp Pleiss, J. Silisiumda biokimyəvi profilləşdirmə: böyük ferment ailələrinin substrat xüsusiyyətlərinin proqnozlaşdırılması. J. Biotexnol. 124, 108–116 (2006).

      Zhao, S. et al. Struktur və genom kontekstindən istifadə etməklə yeni fermentlərin və metabolik yolların kəşfi. Təbiət 502, 698–702 (2013).

      Nembri, S., Grisoni, F., Consonni, V. & Todeschini, R. Sitokrom P450-dərman qarşılıqlı təsirinin silisium proqnozunda: CYP3A4 və CYP2C9 üçün QSAR. Int. J. Mol. Sci. 17, E914 (2016).

      Dong, D., Ako, R., Hu, M. & Wu, B. QSAR modelləşdirməsi və homoloji fermentlərin təhlili vasitəsilə insan UDP-qlükuronosiltransferazlarının substrat seçiciliyini anlamaq. Ksenobiotika 42, 808–820 (2012).

      Wang, T., Yuan, X. S., Wu, M.-B., Lin, J.-P. & Yang, L.-R. Yeni dərman kəşfi üçün çoxölçülü QSAR-ın inkişafı: biz hara gedirik? Ekspert rəyi. Narkotik Discov. 12, 769–784 (2017).

      Hüquq, V. et al. DrugBank 4.0: dərman maddələr mübadiləsinə yeni işıq salır. Nuklein turşuları Res. 42, D1091–D1097 (2014).

      Udayakumar, M. et al. PMDB: bitki metabolome verilənlər bazası: metabolomik yanaşma. Med. Kimya. Res. 21, 47–52 (2012).

      Schmid, J., Heider, D., Wendel, N. J., Sperl, N. & amp Sieber, V. Bakterial glikosiltransferazlar: təbii məhsulların hazırlanması istiqamətində çox müxtəlif ferment sinfinin çətinlikləri və imkanları. Ön. Mikrobiol. 7, 182 (2016).

      Osmani, S. A., Bak, S. & Møller, B. L. Substrate specificity of plant UDP-dependent glycosyltransferases predicted from crystal structures and homology modeling. Fitokimya 70, 325–347 (2009).

      Davies, G. J., Planas, A. & Rovira, C. Conformational analyses of the reaction coordinate of glycosidases. Acc. Kimya. Res. 45, 308–316 (2012).

      Newton, M. S. et al. Structural and functional innovations in the real-time evolution of new (βα)8 barrel enzymes. Proc. Natl. akad. Sci. ABŞ 114, 4727–4732 (2017).

      Roy, A., Kucukural, A. & Zhang, Y. I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction. Nat. Protok. 5, 725–738 (2010).

      Mackenzie, P. I. et al. Nomenclature update for the mammalian UDP glycosyltransferase (UGT) gene superfamily. Pharmacogenet. Genomika 15, 677–685 (2005).

      Lim, E.-K. və b. Identification of glucosyltransferase genes involved in sinapate metabolism and lignin synthesis in Arabidopsis. J. Biol. Kimya. 276, 4344–4349 (2001).

      Berthold, M. R. et al. in Data Anal., Mach. Learn.Appl.: Proc. 31st Annu. Konf. Gesellschaft für Klassifikation e.V., Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, March 79, 2007 (eds. Preisach, C. et al.) 319–326 (Springer, Berlin, 2008).

      Sauer, W. H. B. & Schwarz, M. K. Molecular shape diversity of combinatorial libraries: a prerequisite for broad bioactivity. J. Chem. Inf. Hesablama. Sci. 43, 987–1003 (2003).

      Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. & Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nuklein turşuları Res. 25, 4876–4882 (1997).

      Sievers, F. et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Sistem. Biol. 7, 539 (2011).

      Rice, P., Longden, I. & Bleasby, A. EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trendlər Genet. 16, 276–277 (2000).

      Johnson, S. C. Hierarchical clustering schemes. Psychometrika 32, 241–254 (1967).

      Kohavi, R. A study of cross-validation and bootstrap for accuracy estimation and model selection. in IJCAI’95 Proc. 14th Int. Joint Conf. Artif. Intel. Cild. 2, 1137–1143 (Morgan Kaufmann, San Francisco, 1995).

      Matthews, B. W. Comparison of the predicted and observed secondary structure of T4 phage lysozyme. Biokim. Biofiz. Akta 405, 442–451 (1975).

      Pearson, W. R. Selecting the right similarity-scoring matrix. Curr. Protok. Bioinformatika 43, 5.1–3.5.9 (2013).

      Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, W. G. & Cowtan, K. Coot-un xüsusiyyətləri və inkişafı. Akta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 486–501 (2010).

      Learmonth, D. A. Novel convenient synthesis of the 3‐O‐β‐D‐ and 4′‐O β‐D‐glucopyranosides of trans‐resveratrol. Sint. Kommun. 34, 1565–1575 (2004).


      Mücərrəd

      Virus-induced gene silencing (VIGS) showed several advantages to identify gene functions such as short experimental cycle, more broad hosts, etc. In this study, the feasibility and efficiency of employing Barley stripe mosaic virus (BSMV)-based VIGS system to evaluate Fusarium head blight (FHB) resistance were explored in wheat. With variable conditions tested, it showed that the maximal silencing efficiency 78% on spike was obtained when the recombinant BSMV was inoculated on flag leaf at flagging stage. However, the plant may reduce its own immunity to FHB when inoculated with BSMV. To induce this impact, different Fusarium graminearum strains were tested and SF06-1 strain was selected for FHB resistance evaluation. Using this system, TaAOC, TaAOS,TaOPR3 involved in jasmonic acid (JA) signaling pathway were identified to positively regulate FHB resistance, which was underpinned by the results when silencing TaAOS in wheat by stable transgenic plants.


      İçindəkilər

      Like most artificial neural networks, SOMs operate in two modes: training and mapping. "Training" builds the map using input examples (a competitive process, also called vector quantization), while "mapping" automatically classifies a new input vector.

      The visible part of a self-organizing map is the map space, which consists of components called nodes or neurons. The map space is defined beforehand, usually as a finite two-dimensional region where nodes are arranged in a regular hexagonal or rectangular grid. [8] Each node is associated with a "weight" vector, which is a position in the input space that is, it has the same dimension as each input vector. While nodes in the map space stay fixed, training consists in moving weight vectors toward the input data (reducing a distance metric) without spoiling the topology induced from the map space. Thus, the self-organizing map describes a mapping from a higher-dimensional input space to a lower-dimensional map space. Once trained, the map can classify a vector from the input space by finding the node with the closest (smallest distance metric) weight vector to the input space vector.

      The goal of learning in the self-organizing map is to cause different parts of the network to respond similarly to certain input patterns. This is partly motivated by how visual, auditory or other sensory information is handled in separate parts of the cerebral cortex in the human brain. [9]

      The weights of the neurons are initialized either to small random values or sampled evenly from the subspace spanned by the two largest principal component eigenvectors. With the latter alternative, learning is much faster because the initial weights already give a good approximation of SOM weights. [10]

      The network must be fed a large number of example vectors that represent, as close as possible, the kinds of vectors expected during mapping. The examples are usually administered several times as iterations.

      The training utilizes competitive learning. When a training example is fed to the network, its Euclidean distance to all weight vectors is computed. The neuron whose weight vector is most similar to the input is called the best matching unit (BMU). The weights of the BMU and neurons close to it in the SOM grid are adjusted towards the input vector. The magnitude of the change decreases with time and with the grid-distance from the BMU. The update formula for a neuron v with weight vector Wv(s) edir

      where s is the step index, t an index into the training sample, u is the index of the BMU for the input vector D(t), α(s) is a monotonically decreasing learning coefficient Θ(u, v, s) is the neighborhood function which gives the distance between the neuron u and the neuron v in step s. [11] Depending on the implementations, t can scan the training data set systematically (t is 0, 1, 2. T-1, then repeat, T being the training sample's size), be randomly drawn from the data set (bootstrap sampling), or implement some other sampling method (such as jackknifing).

      The neighborhood function Θ(u, v, s) (also called function of lateral interaction) depends on the grid-distance between the BMU (neuron u) and neuron v. In the simplest form, it is 1 for all neurons close enough to BMU and 0 for others, but the Gaussian and mexican-hat [12] functions are common choices, too. Regardless of the functional form, the neighborhood function shrinks with time. [9] At the beginning when the neighborhood is broad, the self-organizing takes place on the global scale. When the neighborhood has shrunk to just a couple of neurons, the weights are converging to local estimates. In some implementations, the learning coefficient α and the neighborhood function Θ decrease steadily with increasing s, in others (in particular those where t scans the training data set) they decrease in step-wise fashion, once every T steps.

      This process is repeated for each input vector for a (usually large) number of cycles λ. The network winds up associating output nodes with groups or patterns in the input data set. If these patterns can be named, the names can be attached to the associated nodes in the trained net.

      During mapping, there will be one single qalib neuron: the neuron whose weight vector lies closest to the input vector. This can be simply determined by calculating the Euclidean distance between input vector and weight vector.

      While representing input data as vectors has been emphasized in this article, any kind of object which can be represented digitally, which has an appropriate distance measure associated with it, and in which the necessary operations for training are possible can be used to construct a self-organizing map. This includes matrices, continuous functions or even other self-organizing maps.

      Variables Edit

      These are the variables needed, with vectors in bold,

      Alqoritm Redaktəsi

      1. Randomize the node weight vectors in a map
      2. Randomly pick an input vector D ( t ) (t)>
      3. Traverse each node in the map
        1. Use the Euclidean distance formula to find the similarity between the input vector and the map's node's weight vector
        2. Track the node that produces the smallest distance (this node is the best matching unit, BMU)
        1. W v ( s + 1 ) = W v ( s ) + θ ( u , v , s ) ⋅ α ( s ) ⋅ ( D ( t ) − W v ( s ) ) (s+1)=W_(s)+ heta (u,v,s)cdot alpha (s)cdot (D(t)-W_(s))>
        1. Randomize the map's nodes' weight vectors
        2. Traverse each input vector in the input data set
          1. Traverse each node in the map
            1. Use the Euclidean distance formula to find the similarity between the input vector and the map's node's weight vector
            2. Track the node that produces the smallest distance (this node is the best matching unit, BMU)
            1. W v ( s + 1 ) = W v ( s ) + θ ( u , v , s ) ⋅ α ( s ) ⋅ ( D ( t ) − W v ( s ) ) (s+1)=W_(s)+ heta (u,v,s)cdot alpha (s)cdot (D(t)-W_(s))>

            SOM Initialization Edit

            Selection of a good initial approximation is a well-known problem for all iterative methods of learning neural networks. Kohonen [13] used random initiation of SOM weights. Recently, principal component initialization, in which initial map weights are chosen from the space of the first principal components, has become popular due to the exact reproducibility of the results. [14]

            Careful comparison of the random initiation approach to principal component initialization for one-dimensional SOM (models of principal curves) demonstrated that the advantages of principal component SOM initialization are not universal. The best initialization method depends on the geometry of the specific dataset. Principal component initialization is preferable (in dimension one) if the principal curve approximating the dataset can be univalently and linearly projected on the first principal component (quasilinear sets). For nonlinear datasets, however, random initiation performs better. [15]

            Fisher's Iris Flower Data Edit

            Consider an n×m array of nodes, each of which contains a weight vector and is aware of its location in the array. Each weight vector is of the same dimension as the node's input vector. The weights may initially be set to random values.

            Now we need input to feed the map. Colors can be represented by their red, green, and blue components. Consequently, we will represent colors as vectors in the unit cube of the free vector space over ℝ generated by the basis:

            R = <255, 0, 0> G = <0, 255, 0> B = <0, 0, 255>

            compares the results of training on the data sets [Note 1]

            threeColors = [255, 0, 0], [0, 255, 0], [0, 0, 255] eightColors = [0, 0, 0], [255, 0, 0], [0, 255, 0], [0, 0, 255], [255, 255, 0], [0, 255, 255], [255, 0, 255], [255, 255, 255]

            and the original images. Note the striking resemblance between the two.

            Similarly, after training a 40×40 grid of neurons for 250 iterations with a learning rate of 0.1 on Fisher's Iris, the map can already detect the main differences between species.

            There are two ways to interpret a SOM. Because in the training phase weights of the whole neighborhood are moved in the same direction, similar items tend to excite adjacent neurons. Therefore, SOM forms a semantic map where similar samples are mapped close together and dissimilar ones apart. This may be visualized by a U-Matrix (Euclidean distance between weight vectors of neighboring cells) of the SOM. [5] [6] [17]

            The other way is to think of neuronal weights as pointers to the input space. They form a discrete approximation of the distribution of training samples. More neurons point to regions with high training sample concentration and fewer where the samples are scarce.

            SOM may be considered a nonlinear generalization of Principal components analysis (PCA). [18] It has been shown, using both artificial and real geophysical data, that SOM has many advantages [19] [20] over the conventional feature extraction methods such as Empirical Orthogonal Functions (EOF) or PCA.

            Originally, SOM was not formulated as a solution to an optimisation problem. Nevertheless, there have been several attempts to modify the definition of SOM and to formulate an optimisation problem which gives similar results. [21] For example, Elastic maps use the mechanical metaphor of elasticity to approximate principal manifolds: [22] the analogy is an elastic membrane and plate.


            Tips and FAQ

            If you are not concerned with transformation efficiency (such as when you have a tube of plasmid DNA and just need to transform bacteria so that you can grow up more of the plasmid) you can save a lot of time by shortening or skipping many steps and will still get enough colonies for your next step. Remember that each of these shortcuts will reduce the efficiency of the transformation, so when higher efficiency is needed follow the complete protocol.

            • Thaw the competent cells in your hand instead of on ice
            • Reduce step 4 from 20 - 30 mins to 2 mins on ice before heat-shock

            Shorten or skip the outgrowth (for Ampicillin resistance it is ok to completely skip the outgrowth, for the other antibiotics it is a good idea to outgrow for at least 20-30 mins)

            Chemically competent cells are fast and easy to use, but are less efficient at taking up larger plasmids. If you need to transform large plasmids, it is a good idea to use electro-competent cells. Instead of relying on the heat-shock to cause the cells to take up the DNA, an electro-magnetic field is applied to the cell/DNA mixture to induce membrane permeability. To do this you will need to have access to an electroporator and the appropriate cuvettes. Follow the manufacturer's instructions for each.

            Check that you are plating on an LB Agar plate containing the correct antibiotic. The resistance gene on your plasmid must match the antibiotic on the plate. You should also add a positive control (many companies include a positive control plasmid with their competent cells) to ensure that your transformation procedure is working.

            Although it may be counter-intuitive, you will often get higher transformation efficiencies with less DNA, especially when using highly competent cells. If you used 100-1000 ng of total DNA in a ligation you will often get more colonies if you use 1 μl of a 1:5 or 1:10 dilution rather than 1 μl directly.


            Videoya baxın: The Big Numbers Song (Dekabr 2022).